JP3833183B2

JP3833183B2 - Hybridoma, monoclonal antibody, measurement method and immunoassay reagent

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Publication number: JP3833183B2
Application number: JP2003096045A
Authority: JP
Inventors: 好昭内田; 義裕倉野
Original assignee: Fujirebio Inc
Current assignee: Fujirebio Inc
Priority date: 1997-10-15
Filing date: 2003-03-31
Publication date: 2006-10-11
Anticipated expiration: 2018-10-15
Also published as: JP2003270247A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アポ蛋白の１種であるアポＢ−４８（ＡｐｏＢ−４８）を特異的に認識するモノクローナル抗体、これを産生するハイブリドーマ、これを利用するアポＢ−４８及び／又はアポＢ−４８含有リポ蛋白の測定に関する。アポＢ−４８は、ヒト血中にあって高脂血症と密接に関連しているリポ蛋白の構成蛋白であり、その測定は、高脂血症や動脈硬化症の診断及び治療に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
動脈硬化症は、典型的な現代病の一つとして、その効果的な診断法及び治療法の確立が待望されている。動脈硬化症の病因の一つとして、体内を循環する血液中に存在するリポ蛋白のうち、血管内壁へのコレステロールの沈着を促進する種々のリポ蛋白が増加し、又は、当該コレステロールの沈着を防止する種々のリポ蛋白が減少することが挙げられている。そこで、これらのリポ蛋白の血中量を測定し、高脂血症や動脈硬化症の診断及び治療に役立てることが望まれている。
【０００３】
高脂血症に関与する代表的なリポ蛋白としては、カイロミクロン（ＣＭ）、ＣＭの血中での中間代謝産物であるカイロミクロンレムナント（ＣＭレムナント）、超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、ＶＬＤＬの血中での中間代謝産物である超低比重リポ蛋白レムナント（ＶＬＤＬレムナント）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）等が知られている。
【０００４】
脂質代謝の面からは、例えば、ＣＭレムナントやＶＬＤＬレムナント〔これらはレムナント様リポ蛋白（ｒｅｍｎａｎｔ−ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓ；ＲＬＰ）と呼ばれている〕、及び、ＬＤＬ等は、コレステロールを血管壁に運び込むリポ蛋白であり、これらの血中濃度を減少させることが動脈硬化症の治療に直結することとなる。また、例えば、ＨＤＬは、動脈硬化巣からコレステロールを引き抜く機能を有することから、その血中濃度を上昇させることが動脈硬化症の治療に役立つこととなる。
【０００５】
これらのうち、ＲＬＰは、食後高脂血症の動脈硬化病変発現に関与していることが指摘され、動脈硬化症の危険因子の一つとして重要と考えられ始めている。ＲＬＰを構成する部分蛋白（アポ蛋白）として、アポＣ、アポＥ、アポＡ−Ｉ、アポＢ−１００、アポＢ−４８等が知られている。
【０００６】
ＲＬＰの血中濃度測定方法の一つとして、現在、ＲＬＰ−Ｃ（ｒｅｍｎａｎｔｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）測定法が知られている。このＲＬＰ−Ｃ法は、抗アポＡ−Ｉモノクローナル抗体と抗アポＢ−１００モノクローナル抗体とを固相化して混合ゲルを調製し、これと検体とを反応させ、これらの抗体に結合したリポ蛋白を遠心除去し、上清中に存在する結合しなかったリポ蛋白の量をコレステロールの量として測定するものである。
【０００７】
アポＡ−Ｉは、ＣＭ、ＨＤＬの主要なアポ蛋白として存在し、アポＢ−１００は、ＶＬＤＬ、ＶＬＤＬレムナント、ＬＤＬの主要なアポ蛋白として存在するものである。従って、理論的には、Ａ−Ｉモノクローナル抗体には、ＣＭとＨＤＬとが結合し、抗アポＢ−１００モノクローナル抗体には、ＶＬＤＬとＶＬＤＬレムナントとＬＤＬとが結合するので、上述したＲＬＰ−Ｃ測定法によれば、これらのリポ蛋白が結合されて除去される。
【０００８】
ＲＬＰ−Ｃ測定法に用いられる抗アポＢ−１００モノクローナル抗体は、アポＢ−１００の２２９１番目から２３１８番目のアミノ酸領域を特異的に認識し、アポＢ−１００の２１５２番目までのアミノ酸配列からなるアポＢ−４８を認識することがないので、アポＢ−４８をアポ蛋白として含有するがアポＢ−１００をアポ蛋白として含有しないリポ蛋白が、ＲＬＰ−Ｃ測定法の対象となる。
【０００９】
しかしながら、ＲＬＰ−Ｃ測定法は、吸着除去操作が必須であり、作業が煩雑であると同時に、完全な吸着が行われる必要があり、測定状況により測定値にばらつきを生じる等の欠点があった。
【００１０】
アポＢ−４８は、ＣＭ、ＣＭレムナントにアポ蛋白として含有されている。ＣＭは、食後速やかにリポ蛋白リパーゼによりＣＭレムナントに変換され、ＣＭレムナントは、肝臓に存在するレムナントリセプターにより肝臓に取り込まれることとなる。従って、空腹時等においては、血中にＣＭは存在しないこととなるので、アポＢ−４８を特異的に認識することができるモノクローナル抗体を得ることができれば、このような時期の血液を検体とすることにより、ＣＭレムナントのみの量を直接測定することができることとなる。このことにより、より確実な高脂血症の診断が可能となり、従って、動脈硬化症の診断及び治療に役立たせることができることとなる。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
上記の現状に鑑み、本発明は、アポＢ−４８を特異的に認識することができるモノクローナル抗体を取得し、これにより、正確かつ簡易に動脈硬化症の危険因子の量を測定し、診断及び治療方法を提供することを目的とするものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、アポＢ−４８由来ペプチドを哺乳動物に免疫することにより得られるリンパ球と、ミエローマ細胞とを、融合することによってハイブリドーマを樹立し、これを培養することによりアポＢ−４８を特異的に認識することができるモノクローナル抗体を取得することに成功し、本発明を完成した。以下に本発明を詳述する。
【００１３】
本発明は、アポＢ−４８を特異的に認識することができるモノクローナル抗体を取得する方法を確立することにより初めて成立した発明である。当該方法は、本発明者らが抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを初めて樹立したことにより確立されたものである。
【００１４】
アポＢ−４８は、アポＢ−１００のアミノ酸配列の一部と同一のアミノ酸配列を有するペプチドであり、アポＢ−１００のアミノ酸配列もアポＢ−４８のアミノ酸配列も、すでに公知である〔ネイチャー（Nature）３２３巻、７３８頁。１９８６年１０月〕。また、抗アポＢ−４８特異抗血清も、既に公知である〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem., ）、２６５巻、１５号、８３５８頁、１９９０年。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem., ）、２６７巻、２号、１１７５頁、１９９２年。クリニカル・サイエンス（Clinical Science）、８５巻、５２１頁、１９９３年等〕。
【００１５】
しかしながら、アポＢ−４８のみに特異的に反応するモノクローナル抗体については、これまで取得されたとの報告はなく、文献（臨床検査。４０巻、９号（１９９６年）、１０２５頁、左欄下から８行）には、アポＢ−４８のみに特異的に反応する抗体の産生は理論上困難である旨が記載されている。本発明に係る抗アポＢ−４８モノクローナル抗体は、これらの従来の考え方を、根本から覆すものである。
【００１６】
以下に本発明に係るハイブリドーマの樹立方法について説明する。本発明においては、まず、アポＢ−４８由来のペプチドを合成する。アポＢ−４８由来のペプチドは、好ましくはアポＢ−４８のＣ−末端から２０個のアミノ酸配列、より好ましくは１０個のアミノ酸配列、更に好ましくは６個のアミノ酸配列を含むペプチドである。本発明においては、例えば、既に公知のアポＢ−４８のアミノ酸配列のうち、Ｃ−末端から数えて４個のアミノ酸配列に相当するペプチドのＮ−末端にシステインを結合させたCys Thr Tyr Met Ile を合成する（以下、本明細書において、このペプチドを「Ｃ４」という）。このようなアミノ酸配列の合成は、公知のペプチド合成装置を用いることにより極めて容易に行うことができる。
【００１７】
同様にして、アポＢ−４８のアミノ酸配列のうち、Ｃ−末端から数えて５個のアミノ酸配列、及び、６個のアミノ酸配列についても合成する（それぞれ、「Ｃ５」及び「Ｃ６」という）。これらのペプチドは、常法に従って精製することができる。その後、これらのペプチドとヘモシアニン等との複合体を合成する。
【００１８】
一方、食後２時間を経過したヒトから採取した血液をプールし、このヒト血清を遠心分離操作することにより、ＶＬＤＬフラクション、ＬＤＬフラクションを取得し、スクリーニング等の抗原とする。
【００１９】
一方、抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、上記方法により合成したＣ４−ＫＬＨ、Ｃ５−ＫＬＨ及びＣ６−ＫＬＨ複合体を哺乳動物に免疫し、そのリンパ球とミエローマ細胞とを融合することにより樹立することができる。
【００２０】
例えば、ＢＡＬＢ／Ｃマウス等の哺乳動物に、フロイント完全アジュバントでエマルジョン化したＣ４−ＫＬＨ、Ｃ５−ＫＬＨ及びＣ６−ＫＬＨ複合体のアポＢ−４８由来ペプチドを免疫し、当該動物の血清の一部を用い、ウエスタンブロッティング（ＷＢ）法にてネイティブアポＢ−４８に反応する抗体の確認を行う。ＷＢ法で最も濃いバンドが確認された免疫動物に、遊離の複合体を静脈内投与し、その３〜４日後に当該動物から脾臓を取り出し脾細胞を調製する。
【００２１】
別途、培地で培養していたミエローマ細胞と上記の脾細胞とを混合し、公知の手法により細胞融合を行う。融合した細胞は、例えば、培地に浮遊した後、培養プレート等に分注し、培養する。培養した細胞について、ＶＬＤＬフラクションを抗原として、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等を行った後、泳動した抗原をニトロセルロース膜に転写し、転写膜をブロッキングした後、短冊状に細く切り、これと培養プレートの一部を１グループとしてプールした培養液を入れて反応させる。その後、洗浄用緩衝液で５分間の振盪洗浄を行った後、ＰＯＤ標識抗マウスイムノグロブリン抗体を入れ、反応させ、アポＢ−４８に相当する位置のバンドの確認を行う。
【００２２】
バンドが見られた場合、抗体を産生しているウエルの選択を行う。目的の抗体を産生しているウエルの細胞は、限界希釈法によりクローニングを行いクローン化する。抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を産生する細胞は、大量に培養しマウス腹腔に投与し、抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を含む腹水を回収する。更にプロテインＡ−セファロース等を用い、腹水より抗体を精製しモノクローナル抗体を得る。
【００２３】
後に実施例で詳述するように、上記の方法により、本発明者らは、抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を取得することに成功し、モノクローナル抗体Ｂ４８−１５１と命名した。また、このモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１を産生する細胞をハイブリドーマＢ４８−１５１と命名した。ハイブリドーマＢ４８−１５１は、工業技術院生命工学工業技術研究所〔あて名；日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−００４６）〕に、識別表示Ｂ４８−１５１、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−６４７３（原寄託日；平成９年７月４日、ブダペスト条約に基づく寄託への移管請求；平成１０年８月２６日）として寄託した。
【００２４】
得られた抗アポＢ−４８モノクローナル抗体の反応特異性は、例えば、ＣＭ、ＶＬＤＬ及びＬＤＬフラクションを抗原としたＷＢ法で確認することができる。抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから得られる抗アポＢ−４８モノクローナル抗体は、アポＢ−４８を特異的に認識することができ、かつ、アポＢ−１００とは全く反応しないものであり、極めて良好に、検体中のアポＢ−４８及び／又はアポＢ−４８含有リポ蛋白を検出するのに利用することができる。上記アポＢ−４８含有リポ蛋白とは、リポ蛋白であって、そのアポ蛋白のアミノ酸配列中にアポＢ−４８と同一のアミノ酸配列を含有するものを意味し、このようなアポＢ−４８含有リポ蛋白も、アポＢ−４８と同様に、アポＢ−４８を特異的に認識することができる本発明の抗アポＢ−４８モノクローナル抗体により特異的に認識されうるものである。
【００２５】
更にまた、上記抗アポＢ−４８モノクローナル抗体の反応特異性は、ＥＬＩＳＡ測定法によっても確認することができる。抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから得られる抗アポＢ−４８モノクローナル抗体は、後の実施例で詳述するように、これを固相としたＥＬＩＳＡ測定法においてアポＢ−４８を特異的に認識することできることが明らかであり、従来用いられていたＷＢ法等の膜固定による測定方法ばかりでなく、固相ＥＬＩＳＡ法にも応用することができるものである。
【００２６】
本発明の抗アポＢ−４８モノクローナル抗体は、いわゆるサンドイッチアッセイ法にも適用することができる。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡを行うため、ＥＬＩＳＡプレートに希釈した抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を入れ、放置して吸着させた後、マスキングを行い、洗浄後に、適切に調製したアポＢ−４８を抗原として入れて反応させる。
【００２７】
反応特異性を確認するため、アポＢ−１００を同様の方法にて抗原として測定する。洗浄後、標識抗ヒトアポＢ抗体を入れ、反応させた後、洗浄し、基質を入れて放置後、吸収波長を測定する等して反応量を測定することにより、アポＢ−４８が特異的に認識されることを確認することができる。
【００２８】
本発明の抗アポＢ−４８モノクローナル抗体は、血清を直接検体とするアッセイ法に適用することもできる。例えば、上記したＥＬＩＳＡ法をヒト血清を検体として適用することによりアポＢ−４８の測定を行うことができる。
【００２９】
本発明のモノクローナル抗体を用いたアポＢ−４８及び／又はアポＢ−４８含有リポ蛋白の測定は、本発明のモノクローナル抗体をヒト由来の種々の検体に適用することにより行うことができる。上記検体としては、ヒト由来の種々の体液を挙げることができ、例えば、血清及び血漿等を挙げることができる。これらの検体に対する測定方法もまた、本発明の一つである。
【００３０】
上記検体は、アポＢ−４８のエピトープを露出させるような処理を行うことが好ましい。本発明のモノクローナル抗体のエピトープは、アポＢ−４８のＣ末端部分であるが、この部分は生体液中では露出していないので免疫反応を行った際モノクローナル抗体が結合しにくいと考えられるため、エピトープを露出させるような処理を行うことによって、モノクローナル抗体への結合を容易にする必要がある。上記エピトープを露出させる処理は、測定前に行ってもよく、又は、測定と同時に行ってもよい。
【００３１】
上記エピトープを露出させるような処理としては、例えば、検体を界面活性剤で処理する方法や、凍結融解を繰り返す方法等を挙げることができる。検体を界面活性剤で処理する方法としては、第３０回日本動脈硬化学会総会抄録集〔平成１０年６月１１日、１２日開催、帝京大学内科、筑波記念病院内科、木下誠ら、１３３頁、「アポ蛋白Ｂ４８含有リポ蛋白の測定法の開発」〕には、アポＢ−４８を特異的に認識するモノクローナル抗体を作成し、それを用いたＥＬＩＳＡプレートに２％ＳＤＳを含むＰＢＳで希釈した血清を添加して、アポＢ−４８を測定することが記載されている。しかし、本発明においては、２％ＳＤＳ中では血清中のアポＢ−４８の測定を行うことはできず、ＳＤＳは界面活性剤として好ましくない。
【００３２】
本発明において、上記界面活性剤は、非イオン性界面活性剤が好ましく、ＳＤＳでは逆に免疫反応を阻害するため好ましくない。より好ましくは、トライトンＸ−１００、トライトンＸ−１１４、ツィーン−２０、ＮＰ−４０である。上記界面活性剤は、単独でも、混合しても用いることができる。実際の使用においては、エピトープ露出効果は高いが室温では溶けにくい界面活性剤（トライトンＸ−１１４等）を用いる場合には、免疫反応を阻害せず溶けやすい界面活性剤（ツィーン−２０等）を混合して使用することが好ましい。
【００３３】
本発明において、界面活性剤は、エピトープを露出させるために用いるものであるが、一般に界面活性剤は免疫反応を阻害するので、エピトープの露出効果と免疫反応の阻害作用とのバランスによって使用濃度を適宜選択することができる。上記界面活性剤は、検体とモノクローナル抗体との免疫反応を行う際の溶液に共存させることもでき、０．０１〜２％、好ましくは、０．０２〜０．５％の濃度で使用する。上記界面活性剤の処理溶液及び処理時間としては特に限定されず、例えば、通常免疫反応を行う際に用いる緩衝液中において、４〜４０℃で５分〜４８時間行うことができる。
【００３４】
本発明においては、検体を凍結融解を繰り返すことによって、リポ蛋白の構造を破壊し、エピトープを露出させることも可能である。上記凍結融解は、１回以上行えば、その効果が得られる。
【００３５】
本発明のモノクローナル抗体を用いたアポＢ−４８及び／又はアポＢ−４８含有リポ蛋白の測定方法を用いることにより、アポＢ−４８及び／又はアポＢ−４８含有リポ蛋白を測定する免疫測定試薬を製造することができ、このような免疫測定試薬もまた、本発明の一つである。このような免疫測定試薬として、例えば、本発明のモノクローナル抗体を結合させたゼラチン粒子やラテックス粒子等を含有させた凝集免疫測定試薬は、通常の公知の方法により製造することができる。また、同様にして、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）試薬、ＥＬＩＳＡ試薬、放射免疫測定法（ＲＩＡ）試薬を、固相として、例えば、ポリスチレン等のポリマー、ガラスビーズ、磁性粒子、マイクロプレート、イムノクロマトグラフィー用濾紙、グラスフィルター等を用いることにより、通常の公知の方法により製造することができる。
【００３６】
【実施例】
以下に、実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
実施例１アポＢ−４８由来ペプチドの合成
アポＢ−４８のＣ−末端から４残基のアミノ酸配列に相当する部分に、そのＮ−末端にシステインを結合したペプチドを合成した（以下、本明細書中では「Ｃ４」という。配列表の配列番号１に示す）。また、アポＢ−４８のＣ−末端から５残基のアミノ酸配列に相当する部分に、そのＮ−末端にシステインを結合したペプチドを合成した（以下、本明細書中では「Ｃ５」という。配列表の配列番号２に示す）。更に、アポＢ−４８のＣ−末端から６残基のアミノ酸配列に相当する部分に、そのＮ−末端にシステインを結合したペプチドを合成した（以下、本明細書中では「Ｃ６」という。配列表の配列番号３に示す）。
【００３７】
合成には、島津製作所製多種品目同時固相法自動ペプチド合成装置ＰＳＳＭ−８を用いた。アミノ酸はすべてＬ−体を用い、α−アミノ基は９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）で保護し、システインのβ−スルフヒドリル基とグルタミンのγ−カルボキサミド基はトリチル基で保護し、スレオニンのβ−水酸基とチロシンのフェノール性水酸基はｔ−ブチル基で保護した。
【００３８】
ペプチド合成を開始するための固相担体は、あらかじめＣ−末端イソロイシンが０．６５ｍｍｏｌ／ｇの割合で導入されたＨＭＰイソロイシンレジン（パーキンエルマー社製）３０ｍｇを用いた。縮合には、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェイト、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、及び、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを用いた。Ｆｍｏｃ基の除去には３０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を用い、溶媒はＤＭＦを用い、ＰＳＳＭ−８添付の標準的なプログラムを使用して３種類同時に合成を行った。
【００３９】
合成終了後、得られた保護基を含むペプチド担体を塩化メチレンで洗い、乾燥した。収量は、Ｃ４が４１．０ｍｇ、Ｃ５が４８．４ｍｇ、Ｃ６が５２．６ｍｇであった。上記ペプチド担体を、それぞれ、添加物を含むトリフルオロ酢酸溶液（トリフルオロ酢酸１ｍｌ、水５０μｌ、フェノール７５ｍｇ、チオアニソール５０μｌ、エタンジチオール５０μｌ）で室温２時間処理し、遊離のペプチド鎖を取り出した。ペプチドをジエチルエーテルで沈殿させ、濾取し、水に溶解して凍結乾燥した。こうして得られた粗ペプチドの収量は、Ｃ４が１２．２３ｍｇ、Ｃ５が１６．１７ｍｇ、Ｃ６が１７．０４ｍｇであった。
【００４０】
次に、上記粗ペプチドを逆相高速液体クロマトグラフィで精製した。カラムはコスモシル５Ｃ１８−ＡＲ−３００２０ｍｍＩ．Ｄ．ｘ１５０ｍｍＬ．（ナカライテスク社製）を用い、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル水溶液の１８〜２８％直線濃度勾配で溶出した。凍結乾燥後得られた精製ペプチドの収量は、Ｃ４が７．１２ｍｇ、Ｃ５が１１．７５ｍｇ、Ｃ６が１０．７１ｍｇであった。これらのペプチドは、その一部をプロテインシーケンサ（パーキンエルマー社製、Ｐｒｏｃｉｓｅ４９４）にかけて、その構造を確認した。
【００４１】
実施例２ペプチド−ＫＬＨ複合体の合成
ヘモシアニン（ＫＬＨ）（カルビオケム社製）５ｍｇを４００μｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、ＤＭＦ１００μｌに溶解したＧＭＢＳ（同人化学研究所製）１ｍｇを加え、室温で１時間撹拌した。反応液を１ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）にかけ、同緩衝液で溶出した。はじめの２．５ｍｌを棄て、続く２．０ｍｌを集めた。
【００４２】
これに、実施例１で合成したＣ４約１ｍｇを水１ｍｌに溶解して加え、室温で２時間撹拌した。反応液を透析チューブに移し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に対して一夜透析した。同様の操作をＣ５及びＣ６についても行い、それぞれ約５ｍｌのＫＬＨ複合体溶液を得た。蛋白定量値は、Ｃ４のＫＬＨ複合体（Ｃ４−ＫＬＨ）が７６８μｇ／ｍｌ、Ｃ５のＫＬＨ複合体（Ｃ５−ＫＬＨ）が８６１μｇ／ｍｌ、Ｃ６のＫＬＨ複合体（Ｃ６−ＫＬＨ）が１１４０μｇ／ｍｌであった。
【００４３】
実施例３ヒト血清からのリポ蛋白の調製
食後２時間のヒトプール血清４ｍｌにトリスヒドロキシメチル・アミノメタン１．２１ｇ、塩化ナトリウム９．０ｇ、ＥＤＴＡ２ナトリウム０．３７２ｇを蒸留水１ｌに溶かしｐＨを７．４に調整した溶液（以下、「ｄ＝１．００６溶液」という）を４ｍｌ重層し、ベックマン超高速遠心機で２６０００×ｇにて１時間遠心した。上層部分をカイロミクロン（ＣＭ）フラクションとしてプールし、下層部は更にｄ＝１．００６溶液を重層し、１１４０００×ｇにて２０時間遠心後、上層部分をＶＬＤＬフラクションとしてプールした。更に下層部分は臭化ナトリウム溶液によりｄ＝１．０６３に調整し１１４０００×ｇにて２０時間遠心し、その上清部分をＬＤＬフラクションとしてプールした。それぞれのプール分画を濃縮して、免疫反応の抗原として用いた。
【００４４】
実施例４抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの樹立及び抗アポＢ−４８モノクローナル抗体の調製
抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、実施例２で合成したＣ４−ＫＬＨ、Ｃ５−ＫＬＨ及びＣ６−ＫＬＨをＢＡＬＢ／Ｃマウスに免疫し、その脾臓リンパ球とミエローマ細胞を融合することにより樹立した。
【００４５】
すなわち、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、フロイント完全アジュバントでエマルジョン化したＣ４−ＫＬＨ、Ｃ５−ＫＬＨ及びＣ６−ＫＬＨをそれぞれ２５〜１００μｇ／マウスで免疫し、２〜３週間後、フロイント不完全アジュバントでエマルジョン化した同複合体２５〜１００μｇ／マウスで追加免疫を行った。マウス血清の一部を用い、ウエスタンブロッティング（ＷＢ）法にてネイティブアポＢ−４８に反応する抗体の確認を行った。ＷＢの測定方法は後に示すスクリーニング法と同様の方法にて行った。ＷＢ法で最も濃いバンドが確認されたＣ６−ＫＬＨ免疫マウスに、遊離のＣ６−ＫＬＨ２５〜１００μｇを静脈内投与し、その３〜４日後、マウスから脾臓を取り出し脾細胞を調製した。
【００４６】
前もってＲＰＭＩ−１６４０培地で培養していたマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）と上記の脾細胞とを１：２〜１：５の比率で混合し、ＰＥＧ（ベーリンガー社製）を用い細胞融合を行った。融合した細胞はＨＡＴ培地に浮遊した後、９６ウエル培養プレートに分注し、３７℃二酸化炭素インキュベーターで培養した。
【００４７】
培養した細胞の培養上清をＷＢ法にてスクリーニングした。すなわち、実施例３で調製したＶＬＤＬフラクションを抗原として、３〜１５％グラジエントのＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った後、泳動した抗原をニトロセルロース膜に転写しＷＢ用転写膜を作製した。転写膜をスキムミルクでブロッキングした後、短冊状に細く切った。アキュトランインキュベートトレイ（Accutran Incubation Tray）（Ｓ＆Ｓ社製）の各溝に、短冊状の転写膜と９６ウエル培養プレートの６ウエル分を１グループとしてプールした培養液を入れ、室温で１時間振盪し反応を行った。
【００４８】
０．０５％ツィーン２０を含むＰＢＳ（以下、「洗浄用緩衝液」という）で５分間の振盪洗浄を３回行った後、各溝にＰＯＤ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ダコ社製）を入れ、更に室温で１時間反応させた。同様に、洗浄用緩衝液で４回洗浄後、基質４−クロロナフトール溶液を加え、アポＢ−４８に相当する位置のバンドの確認を行った。
【００４９】
バンドが見られた場合、６ウエルを更に１ウエルづつに分け同様の方法で目的の抗体を産生しているウエルの選択を行った。目的の抗体を産生しているウエルの細胞は、限界希釈法によりクローニングを行いクローン化した。抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を産生する細胞は、大量に培養しマウス腹腔に投与し、抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を含む腹水を回収した。更にプロテインＡ−セファロースを用い、腹水より抗体を精製しモノクローナル抗体を得た。この抗アポＢ−４８モノクローナル抗体をモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１と命名し、このモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１を産生する細胞をハイブリドーマＢ４８−１５１と命名した。
【００５０】
実施例５モノクローナル抗体Ｂ４８−１５１の反応特異性の確認
モノクローナル抗体Ｂ４８−１５１の反応特異性を、ＣＭ、ＶＬＤＬ及びＬＤＬフラクションを抗原としたＷＢ法で確認した。すなわち、実施例３で調製したそれぞれのフラクションを抗原として、３〜１５％グラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、泳動した抗原をニトロセルロース膜に転写しＷＢ用転写膜を作製した。転写膜をスキムミルクでブロッキングした後、抗体との反応を行った。反応にはモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１、コントロールとして抗アポＢ−１００モノクロナール抗体ＭＡＢ０１４（ケミコン社製）及び抗アポＢ山羊抗血清（ケミコン社製）を用いた。更に反応特異性確認のため遊離の免疫ペプチドＣ６による抑制試験も行った。なお、ＷＢ用転写膜の一部は、ＣＣＢ染色により蛋白質位置の確認を行った。
【００５１】
抗体と各種抗原との反応は以下のとおりであった。それぞれの抗体を１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝液（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）を用いて１μｇ／ｍｌの濃度に調整し、抗原転写ＷＢ膜と室温で１時間振盪し反応を行った。洗浄用緩衝液で５分間の振盪洗浄を３回行った後、ＰＯＤ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ダコ社製）を加え、更に室温で１時間反応させた。同様に、洗浄用緩衝液で４回洗浄後、基質４−クロロナフトール溶液を加え、バンドの確認を行った。結果を図１に示す。抑制試験は、ＷＢ膜と抗体との反応時に５μｇ／ｍｌのＣ６を共存させて行った。結果を図２に示す。
【００５２】
図１に示すようにモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１は分子量２０万強のアポＢ−４８に相当する位置にのみバンドを生じ、分子量約５５万のアポＢ−１００相当位置にはバンドは見られなかった。また、図２に示すように、モノクローナル抗体Ｂ４８−１５１のアポＢ−４８に相当する位置のバンドは、Ｃ６の共存で消失した。この結果から、モノクローナル抗体Ｂ４８−１５１は、アポＢ−４８を特異的に認識するモノクローナル抗体であることが明白となった。なお、ＶＬＤＬフラクションでアポＢ−４８に相当するバンドが最も濃く出ているのは、ＶＬＤＬフラクションにＣＭレムナントが含まれているからだと考えられる。
【００５３】
実施例６モノクローナル抗体Ｂ４８−１５１固相ＥＬＩＳＡによるアポＢ−４８の測定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルより抽出調製したアポＢ−４８を抗原としてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。すなわち、実施例５と同様の方法により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動したＶＬＤＬフラクションのアポＢ−４８バンド部分を切り取り、エレクトロエリューター（バイオラッド社製）によりゲルから抽出して抗原を精製した。一方、ヌンク社製ＥＬＩＳＡプレート（マキシソーブ）に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈したモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１を１ウェルに７５μｌづつ入れ、４℃一晩放置して吸着させた後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を１５０μｌ／ウェルづつ入れ、３７℃で５時間放置してマスキングを行った。抗体吸着プレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで５μｇ／ｍｌから２ｎ希釈した精製アポＢ−４８を７５μｌ／ウェルづつ入れ、３７℃で１時間反応させた。
【００５４】
洗浄用緩衝液で３回洗浄後、ＰＯＤ標識抗ヒトアポＢ抗体（ケミコン社製）を７５μｌ／ウェルづつ入れ、３７℃で１時間反応させた。洗浄用緩衝液で充分洗浄し、基質ＡＢＴＳを７５μｌ／ウェルづつ入れ室温で１５分放置後、４０５ｎｍの波長を測定した。反応特異性を確認するため、アポＢ−１００（ケミコン社製）を４０μｇ／ｍｌから同様の希釈方法にて抗原として測定した。結果を図３に示す。図３に示すように、モノクローナル抗体Ｂ４８−１５１を固相としたＥＬＩＳＡでアポＢ−４８が特異的に測定できることが確認された。
【００５５】
実施例７モノクローナル抗体Ｂ４８−１５１固相ＥＬＩＳＡによる血清アポＢ−４８の測定
１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２０倍希釈した血清を検体として、実施例６と同様の方法でアポＢ−４８の測定を行った。検体には、健常者の空腹時及び食後１時間の凍結保存血清の各８例（検体番号１〜８）を用いた。結果を図４に示す。図４に示すように、どの検体も食後１時間でアポＢ−４８が高値となり、ＣＭの挙動と一致することが確認された。
【００５６】
実施例８新鮮血清の界面活性剤処理
固相抗体と新鮮血清との反応時の緩衝液に各種界面活性剤を添加し、モノクローナル抗体Ｂ４８−１５１固相ＥＬＩＳＡでの反応性を検討した。界面活性剤は、陰イオン性界面活性剤としてＳＤＳ（ナカライテスク社製）、デオキシコール酸ナトリウム（和光純薬社製）、非イオン性界面活性剤としてトライトンＸ−１００（ナカライテスク社製）、トライトンＸ−１１４（ナカライテスク社製）、ツィーン−２０（ナカライテスク社製）、ツィーン−８０（ナカライテスク社製）、ＮＰ−４０（シグマ社製）、ＭＥＧＡ−８（同仁化学研究所製）、Ｂｒｉｊ−３５（シグマ社製）を用いた。
【００５７】
ヌンク社製ＥＬＩＳＡプレート（マキシソーブ）にＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈したモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１抗体を７５μｌ／ウェルづつ入れ、４℃一晩放置し吸着させた。次に１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を１５０μｌ／ウェルづつ入れ、３７℃で５時間放置しマスキングを行った。抗体吸着プレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄後、それぞれ２％、０．４％、０．０８％、０．０１６％の濃度で各種界面活性剤を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用い、２０倍希釈した血清を７５μｌ／ウェルづつ入れ、３７℃で１時間反応させた。洗浄用緩衝液で３回洗浄後、ヨシタケらの方法でアルカリフォスファターゼ（以下、Ａｌｐともいう）標識した抗ヒトアポＢ−１００モノクロナール抗体（Ｂ１００−２２８；自家製）を７５μｌ／ウェルづつ入れ、３７℃で１時間反応させた。洗浄用緩衝液で充分洗浄し、基質４−ニトロフェノールリン酸（以下、ｐＮＰＰともいう）を７５μｌ／ウェルづつ入れ３７℃で３０分放置後、４０５ｎｍの波長を測定した。検体には、高脂血清及び空腹時血清を用いた。結果を図５、図６に示す。
【００５８】
図５に示すように、界面活性剤を含まないＰＢＳ（ｐＨ７．４）で血清を希釈した場合は、全く発色が見られず、アポＢ４８Ｃ末エピトープが露出されていないと判断した。界面活性剤を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いた場合は、０．１％付近のトライトンＸ−１００、ツィーン２０、ＮＰ−４０等の非イオン性界面活性剤で強い発色がみられた。これら界面活性剤処理では、アポＢ４８Ｃ末エピトープが露出されたと判断した。これに対し、ＭＥＧＡ−８、Ｂｒｉｊ−３５、ＳＤＳ等の界面活性剤では、発色が弱いかまたはほとんど見られなかった。実施例９の結果も考慮すると、ＭＥＧＡ−８はアポＢ４８Ｃ末エピトープ露出効果が弱く、ＳＤＳ、特に０．１％以上のＳＤＳは免疫反応を阻害し、Ｂｒｉｊ−３５は両方に関与している可能性が考えられた。
【００５９】
実施例９界面活性剤の免疫反応への影響
固相化ペプチドＣ６とモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１との反応時に実施例８と同様の各種界面活性剤を添加し、反応性を検討した。ヌンク社製ＥＬＩＳＡプレート（マキシソーブ）にＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１μｇ／ｍｌの濃度に希釈したペプチドＣ６を７５μｌ／ウェルづつ入れ、４℃一晩放置し吸着させた。次に１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を１５０μｌ／ウェルづつ入れ、３７℃で５時間放置しマスキングを行った。洗浄用緩衝液で３回洗浄後、それぞれ２％、０．４％、０．０８％、０．０１６％の濃度で各種界面活性剤を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用い、２．５μｇ／ｍｌに希釈したモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１を７５μｌ／ウェルづつ入れ、３７℃で１時間反応させた。洗浄用緩衝液で３回洗浄後、ＰＯＤ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ダコ社製）を７５μｌ／ウェルづつ入れ、３７℃で１時間反応させた。洗浄用緩衝液で充分洗浄し、基質ＡＢＴＳを７５μｌ／ウェルづつ入れ室温で１５分放置後、４０５ｎｍの波長を測定した。結果を図７に示す。
【００６０】
図７に示すように、トライトンＸ−１００、ツィーン２０、ＮＰ−４０等の非イオン性界面活性剤では、免疫反応に対する影響はみられなかった。これに対し、Ｂｒｉｊ−３５、ＳＤＳでは、免疫反応に対する影響がみられた。特に、ＳＤＳは、０．１％以上では免疫反応は完全に阻害された。
【００６１】
【発明の効果】
本発明は、上述の構成よりなり、抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を取得することが可能となったので、アポＢ−４８を特異的に認識することにより、簡易で確実な動脈硬化症の診断及び治療が可能となった。
【００６２】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】実施例５で行った本発明に係るＢ４８−１５１モノクローナル抗体の各リポ蛋白フラクションに対する反応を示す図である。
【図２】実施例５で行った本発明に係るＢ４８−１５１モノクローナル抗体の各リポ蛋白フラクションに対する反応の、Ｃ６ペプチドによる抑制を示す図である。
【図３】実施例６で行った本発明に係るＢ４８−１５１モノクローナル抗体を固相としたＥＬＩＳＡ測定法による試験結果を示す図である。
【図４】実施例７で行った本発明に係るＢ４８−１５１モノクローナル抗体を固相としたＥＬＩＳＡ測定法による試験結果を示す図である。
【図５】実施例８で行った、界面活性剤で処理した高脂血清を用いた場合の、本発明に係るＢ４８−１５１モノクローナル抗体を固相としたＥＬＩＳＡ測定法による試験結果を示す図である。Ｔｘ−１００はトライトンＸ−１００、Ｔｘ−１１４はトライトンＸ−１１４、Ｔｗ−２０はツィーン−２０、Ｔｗ−８０はツィーン−８０、Ｄｅｏｘｙ−ｃｈ．はデオキシコール酸ナトリウムを表す。ＰＢＳは界面活性剤を添加せずに試験を行ったことを表す。
【図６】実施例８で行った、界面活性剤で処理した空腹時血清を用いた場合の、本発明に係るＢ４８−１５１モノクローナル抗体を固相としたＥＬＩＳＡ測定法による試験結果を示す図である。
【図７】実施例９で行った本発明に係るＢ４８−１５１モノクローナル抗体を固相としたＥＬＩＳＡ測定法に対する界面活性剤の影響の試験結果を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a monoclonal antibody that specifically recognizes Apo B-48 (ApoB-48), which is a kind of apoprotein, a hybridoma producing the same, Apo B-48 and / or Apo B-48 using the same. It relates to the measurement of contained lipoproteins. Apo B-48 is a component protein of lipoprotein that is closely related to hyperlipidemia in human blood, and its measurement is useful for diagnosis and treatment of hyperlipidemia and arteriosclerosis. is there.
[0002]
[Prior art]
Arteriosclerosis is one of the typical modern diseases, and the establishment of an effective diagnostic method and treatment method is awaited. As one of the causes of arteriosclerosis, among lipoproteins present in blood circulating in the body, various lipoproteins that promote the deposition of cholesterol on the inner wall of blood vessels increase or prevent the deposition of the cholesterol It is mentioned that various lipoproteins are reduced. Therefore, it is desired to measure the amount of these lipoproteins in the blood to be useful for diagnosis and treatment of hyperlipidemia and arteriosclerosis.
[0003]
Representative lipoproteins involved in hyperlipidemia include chylomicron (CM), chylomicron remnant (CM remnant), an intermediate metabolite of CM, ultra-low density lipoprotein (VLDL), and VLDL. Known are low-density lipoprotein remnants (VLDL remnants), low-density lipoproteins (LDL), high-density lipoproteins (HDL), and the like, which are intermediate metabolites in the blood.
[0004]
From the aspect of lipid metabolism, for example, CM remnants and VLDL remnants (these are called remnant-like particles (RLP)), LDL and the like are lipoproteins that carry cholesterol into the vascular wall. Therefore, reducing these blood concentrations directly leads to the treatment of arteriosclerosis. In addition, for example, HDL has a function of extracting cholesterol from arteriosclerotic lesions, and thus increasing its blood concentration is useful for treating arteriosclerosis.
[0005]
Of these, RLP is pointed out to be involved in the development of postprandial hyperlipidemia arteriosclerotic lesions, and is beginning to be considered important as one of the risk factors for arteriosclerosis. Apo C, Apo E, Apo AI, Apo B-100, Apo B-48, etc. are known as partial proteins (Apoprotein) constituting RLP.
[0006]
As one of methods for measuring the blood concentration of RLP, an RLP-C (remnantique particles cholesterol) measurement method is currently known. In this RLP-C method, a mixed gel is prepared by immobilizing an anti-apoA-I monoclonal antibody and an anti-apoB-100 monoclonal antibody, and this is reacted with a sample, and lipoproteins bound to these antibodies are prepared. The amount of unbound lipoprotein present in the supernatant is measured as the amount of cholesterol.
[0007]
ApoA-I exists as a major apoprotein of CM and HDL, and apoB-100 exists as a major apoprotein of VLDL, VLDL remnant, and LDL. Therefore, theoretically, CM and HDL bind to the AI monoclonal antibody, and VLDL, VLDL remnant, and LDL bind to the anti-apo B-100 monoclonal antibody. According to the measurement method, these lipoproteins are bound and removed.
[0008]
The anti-apo B-100 monoclonal antibody used in the RLP-C measurement method specifically recognizes the amino acid region from 2291 to 2318 of Apo B-100 and consists of the amino acid sequence from 2152 of Apo B-100. Since it does not recognize apo B-48, a lipoprotein that contains apo B-48 as an apoprotein but does not contain apo B-100 as an apoprotein is the subject of the RLP-C assay.
[0009]
However, the RLP-C measurement method requires an adsorption removal operation, and the work is complicated, and at the same time, it is necessary to perform complete adsorption, and there are drawbacks such as variations in measurement values depending on measurement conditions. .
[0010]
Apo B-48 is contained in CM and CM remnants as an apoprotein. CM is immediately converted into CM remnant by lipoprotein lipase after meal, and CM remnant is taken into the liver by the remnant receptor present in the liver. Therefore, since CM is not present in the blood in the fasting state or the like, if a monoclonal antibody capable of specifically recognizing apo B-48 can be obtained, blood at such a time is used as a specimen. By doing so, the amount of the CM remnant alone can be directly measured. This makes it possible to more reliably diagnose hyperlipidemia, and thus can be useful for the diagnosis and treatment of arteriosclerosis.
[0011]
[Problems to be solved by the invention]
In view of the above situation, the present invention obtains a monoclonal antibody capable of specifically recognizing apo B-48, thereby accurately and easily measuring the amount of risk factor for arteriosclerosis, The object is to provide a treatment method.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies, the present inventors established hybridomas by fusing lymphocytes obtained by immunizing mammals with apo B-48-derived peptides and myeloma cells, and culturing them. Succeeded in obtaining a monoclonal antibody capable of specifically recognizing apo B-48, thereby completing the present invention. The present invention is described in detail below.
[0013]
The present invention was established for the first time by establishing a method for obtaining a monoclonal antibody capable of specifically recognizing apo B-48. This method was established when the present inventors established for the first time a hybridoma producing an anti-apo B-48 monoclonal antibody.
[0014]
Apo B-48 is a peptide having the same amino acid sequence as part of the amino acid sequence of Apo B-100, and the amino acid sequence of Apo B-100 and the amino acid sequence of Apo B-48 are already known [Nature (Nature) 323, 738. October 1986]. Anti-apo B-48 specific antiserum is also known [J. Biol. Chem., 265, 15, 8358, 1990. Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 267, 2, 1175, 1992. Clinical Science, 85, 521, 1993, etc.].
[0015]
However, there is no report that the monoclonal antibody specifically reacting only with apo B-48 has been obtained so far, from the literature (clinical test. 40, 9 (1996), page 1025, from the lower left column. Line 8) describes that it is theoretically difficult to produce an antibody that specifically reacts only with apo B-48. The anti-apo B-48 monoclonal antibody according to the present invention fundamentally changes these conventional ideas.
[0016]
The method for establishing a hybridoma according to the present invention will be described below. In the present invention, first, a peptide derived from apo B-48 is synthesized. The peptide derived from Apo B-48 is preferably a peptide comprising 20 amino acid sequences from the C-terminus of Apo B-48, more preferably 10 amino acid sequences, and even more preferably 6 amino acid sequences. In the present invention, for example, among already known amino acid sequences of apo B-48, Cys Thr Tyr Met Ile in which cysteine is bound to the N-terminus of a peptide corresponding to 4 amino acid sequences counted from the C-terminus. (Hereinafter, this peptide is referred to as “C4”). Such an amino acid sequence can be synthesized very easily by using a known peptide synthesizer.
[0017]
Similarly, among the amino acid sequences of Apo B-48, 5 amino acid sequences and 6 amino acid sequences counted from the C-terminal are also synthesized (referred to as “C5” and “C6”, respectively). These peptides can be purified according to a conventional method. Thereafter, a complex of these peptides with hemocyanin and the like is synthesized.
[0018]
On the other hand, blood collected from humans who have passed 2 hours after a meal is pooled, and this human serum is centrifuged to obtain VLDL fractions and LDL fractions, which are used as antigens for screening and the like.
[0019]
On the other hand, the hybridoma producing the anti-apo B-48 monoclonal antibody immunizes the mammal with the C4-KLH, C5-KLH and C6-KLH complexes synthesized by the above method, and fuses the lymphocytes with myeloma cells. Can be established.
[0020]
For example, a mammal such as a BALB / C mouse is immunized with an apo B-48-derived peptide of C4-KLH, C5-KLH and C6-KLH complex emulsified with Freund's complete adjuvant, and a part of the serum of the animal The antibody reacting with native apo B-48 is confirmed by Western blotting (WB) method. A free complex is intravenously administered to an immunized animal in which the darkest band is confirmed by the WB method, and 3 to 4 days later, the spleen is taken out from the animal and spleen cells are prepared.
[0021]
Separately, myeloma cells cultured in a medium and the above spleen cells are mixed, and cell fusion is performed by a known technique. For example, the fused cells are suspended in a medium and then dispensed to a culture plate or the like and cultured. The cultured cells were subjected to SDS-PAGE using the VLDL fraction as an antigen, the transferred antigen was transferred to a nitrocellulose membrane, the transfer membrane was blocked, and then cut into strips. The culture solution pooled as one group is added and reacted. Then, after washing with a washing buffer for 5 minutes, a POD-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody is added and reacted to confirm the band at the position corresponding to Apo B-48.
[0022]
If a band is seen, select the well producing the antibody. The cells in the well producing the target antibody are cloned by cloning by limiting dilution. Cells producing the anti-apo B-48 monoclonal antibody are cultured in large quantities and administered to the mouse abdominal cavity, and ascites containing the anti-apo B-48 monoclonal antibody is collected. Further, using a protein A-sepharose or the like, the antibody is purified from ascites to obtain a monoclonal antibody.
[0023]
As described in detail later in the Examples, the present inventors succeeded in obtaining an anti-apo B-48 monoclonal antibody by the above-mentioned method and named it monoclonal antibody B48-151. The cell producing this monoclonal antibody B48-151 was designated as hybridoma B48-151. The hybridoma B48-151 is located in the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology [Address: 1-3-3 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan (zip code 305-0046)], with identification number B48-151 and accession number FERM BP -6473 (original deposit date; July 4, 1997, request for transfer to deposit under the Budapest Treaty; August 26, 1998).
[0024]
The reaction specificity of the obtained anti-apo B-48 monoclonal antibody can be confirmed, for example, by the WB method using CM, VLDL and LDL fractions as antigens. The anti-apo B-48 monoclonal antibody obtained from the hybridoma producing the anti-apo B-48 monoclonal antibody can specifically recognize apo B-48 and does not react with the apo B-100 at all. Yes, it can be used very well to detect apo B-48 and / or apo B-48-containing lipoproteins in a specimen. The apo B-48-containing lipoprotein means a lipoprotein having the same amino acid sequence as Apo B-48 in the amino acid sequence of the apo protein. Lipoprotein, like Apo B-48, can be specifically recognized by the anti-apo B-48 monoclonal antibody of the present invention capable of specifically recognizing Apo B-48.
[0025]
Furthermore, the reaction specificity of the anti-apo B-48 monoclonal antibody can also be confirmed by an ELISA measurement method. The anti-apo B-48 monoclonal antibody obtained from the hybridoma producing the anti-apo B-48 monoclonal antibody is specific to apo B-48 in an ELISA assay using this as a solid phase, as described in detail in the Examples below. It is apparent that the method can be recognized by the solid phase ELISA method as well as the measurement method using the membrane fixation such as the WB method conventionally used.
[0026]
The anti-apo B-48 monoclonal antibody of the present invention can also be applied to a so-called sandwich assay method. For example, to perform a sandwich ELISA, put the diluted anti-apo B-48 monoclonal antibody on an ELISA plate, allow it to stand and adsorb, mask, and after washing, put the appropriately prepared apo B-48 as the antigen. To react.
[0027]
In order to confirm the reaction specificity, Apo B-100 is measured as an antigen by the same method. After washing, a labeled anti-human apo B antibody is added and allowed to react, then washed, put into a substrate and allowed to stand, and then the amount of reaction is measured by measuring the absorption wavelength. It can be confirmed that it is recognized.
[0028]
The anti-apo B-48 monoclonal antibody of the present invention can also be applied to an assay method using serum directly as a specimen. For example, apo B-48 can be measured by applying the above-described ELISA method using human serum as a specimen.
[0029]
Apo B-48 and / or apo B-48-containing lipoproteins using the monoclonal antibody of the present invention can be measured by applying the monoclonal antibody of the present invention to various human-derived specimens. Examples of the specimen include various body fluids derived from humans, such as serum and plasma. Measurement methods for these specimens are also one aspect of the present invention.
[0030]
The specimen is preferably subjected to a treatment that exposes an epitope of Apo B-48. The epitope of the monoclonal antibody of the present invention is the C-terminal part of apo B-48, but since this part is not exposed in the biological fluid, it is considered that the monoclonal antibody is difficult to bind when an immune reaction is performed. It is necessary to facilitate the binding to the monoclonal antibody by performing a treatment that exposes the epitope. The treatment for exposing the epitope may be performed before the measurement or may be performed simultaneously with the measurement.
[0031]
Examples of the treatment for exposing the epitope include a method of treating a specimen with a surfactant and a method of repeating freeze-thawing. As a method of treating a specimen with a surfactant, the 30th Annual Meeting of the Japanese Atherosclerosis Society, Abstracts [June 11 and 12, 1998, Teikyo University Internal Medicine, Tsukuba Memorial Hospital, Makoto Kinoshita et al., Page 133 , "Development of a method for measuring lipoproteins containing apoprotein B48"], a monoclonal antibody specifically recognizing apoB-48 was prepared and diluted with PBS containing 2% SDS on an ELISA plate using the monoclonal antibody. It is described that serum is added to measure apo B-48. However, in the present invention, serum apo B-48 cannot be measured in 2% SDS, and SDS is not preferred as a surfactant.
[0032]
In the present invention, the surfactant is preferably a nonionic surfactant, and SDS is not preferable because it inhibits an immune reaction. More preferred are Triton X-100, Triton X-114, Tween-20, and NP-40. The above surfactants can be used alone or in combination. In actual use, when using a surfactant (Triton X-114, etc.) that has a high epitope exposure effect but is hardly soluble at room temperature, a surfactant (Tween-20, etc.) that is easily soluble without inhibiting the immune reaction is used. It is preferable to use a mixture.
[0033]
In the present invention, a surfactant is used for exposing an epitope. Generally, a surfactant inhibits an immune reaction, so the concentration to be used depends on the balance between the epitope exposure effect and the immune reaction inhibitory effect. It can be selected appropriately. The above-mentioned surfactant can be coexisted in a solution for performing an immune reaction between a specimen and a monoclonal antibody, and is used at a concentration of 0.01 to 2%, preferably 0.02 to 0.5%. The surfactant treatment solution and the treatment time are not particularly limited, and can be carried out, for example, at 4 to 40 ° C. for 5 minutes to 48 hours in a buffer solution usually used for performing an immune reaction.
[0034]
In the present invention, it is possible to destroy the lipoprotein structure and expose the epitope by repeating freeze-thawing of the specimen. If the freeze-thaw is performed once or more, the effect can be obtained.
[0035]
An immunoassay reagent for measuring apo B-48 and / or apo B-48-containing lipoprotein by using the method for measuring apo B-48 and / or apo B-48-containing lipoprotein using the monoclonal antibody of the present invention Such an immunoassay reagent is also one aspect of the present invention. As such an immunoassay reagent, for example, an agglutination immunoassay reagent containing gelatin particles or latex particles to which the monoclonal antibody of the present invention is bound can be produced by a generally known method. Similarly, an enzyme immunoassay (EIA) reagent, an ELISA reagent, and a radioimmunoassay (RIA) reagent are used as solid phases, for example, polymers such as polystyrene, glass beads, magnetic particles, microplates, immunochromatography. By using a filter paper, a glass filter, or the like, it can be produced by an ordinary known method.
[0036]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
Example 1 Synthesis of Apo B-48 Derived Peptide
A peptide in which a cysteine was bonded to the N-terminus of the portion corresponding to the amino acid sequence of 4 residues from the C-terminus of Apo B-48 was synthesized (hereinafter referred to as “C4” in the present specification). As shown in SEQ ID NO: 1). In addition, a peptide in which cysteine was bonded to the N-terminus of the portion corresponding to the amino acid sequence of 5 residues from the C-terminus of Apo B-48 was synthesized (hereinafter referred to as “C5” in this specification). It is shown in SEQ ID NO: 2 in the column table). Furthermore, a peptide in which a cysteine was bonded to the N-terminus of the portion corresponding to the amino acid sequence of 6 residues from the C-terminus of Apo B-48 was synthesized (hereinafter referred to as “C6” in the present specification). It is shown in SEQ ID NO: 3 in the column table).
[0037]
For synthesis, a multi-item simultaneous solid phase method automatic peptide synthesizer PSSM-8 manufactured by Shimadzu Corporation was used. All amino acids are in L-form, the α-amino group is protected with a 9-fluorenylmethoxycarbonyl group (Fmoc group), the β-sulfhydryl group of cysteine and the γ-carboxamide group of glutamine are protected with a trityl group, The β-hydroxyl group of threonine and the phenolic hydroxyl group of tyrosine were protected with a t-butyl group.
[0038]
As a solid phase carrier for initiating peptide synthesis, 30 mg of HMP isoleucine resin (manufactured by PerkinElmer) into which C-terminal isoleucine was introduced at a rate of 0.65 mmol / g in advance was used. For the condensation, 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate, 1-hydroxybenzotriazole and N, N-diisopropylethylamine are used. It was. For removal of the Fmoc group, a 30% piperidine / DMF solution was used, DMF was used as a solvent, and three types of synthesis were simultaneously performed using a standard program attached to PSSM-8.
[0039]
After completion of the synthesis, the obtained peptide carrier containing a protecting group was washed with methylene chloride and dried. The yield was 41.0 mg for C4, 48.4 mg for C5, and 52.6 mg for C6. Each of the above peptide carriers was treated with a trifluoroacetic acid solution containing additives (trifluoroacetic acid 1 ml, water 50 μl, phenol 75 mg, thioanisole 50 μl, ethanedithiol 50 μl) at room temperature for 2 hours, and free peptide chains were taken out. The peptide was precipitated with diethyl ether, collected by filtration, dissolved in water and lyophilized. The yield of the crude peptide thus obtained was 12.23 mg for C4, 16.17 mg for C5, and 17.04 mg for C6.
[0040]
Next, the crude peptide was purified by reverse phase high performance liquid chromatography. The column was Cosmosil 5C18-AR-300 20 mm I.D. D. x150 mmL. (Nacalai Tesque) was used to elute with an 18-28% linear concentration gradient of an acetonitrile aqueous solution containing 0.1% trifluoroacetic acid. The yield of purified peptide obtained after lyophilization was 7.12 mg for C4, 11.75 mg for C5, and 10.71 mg for C6. A part of these peptides was subjected to a protein sequencer (Procise 494, manufactured by Perkin Elmer), and the structure thereof was confirmed.
[0041]
Example 2 Synthesis of peptide-KLH complex
5 mg of hemocyanin (KLH) (manufactured by Calbiochem) was dissolved in 400 μl of 0.1M phosphate buffer (pH 7.5), 1 mg of GMBS (manufactured by Dojin Chemical Laboratories) dissolved in 100 μl of DMF was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour did. The reaction solution was applied to a PD-10 column (manufactured by Pharmacia) equilibrated with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) containing 1 mM EDTA, and eluted with the same buffer. The first 2.5 ml was discarded and the next 2.0 ml was collected.
[0042]
About 1 mg of C4 synthesized in Example 1 was dissolved in 1 ml of water and added thereto, followed by stirring at room temperature for 2 hours. The reaction solution was transferred to a dialysis tube and dialyzed overnight against phosphate buffer (PBS). The same operation was performed for C5 and C6 to obtain about 5 ml of KLH complex solution. The protein quantitative values were 768 μg / ml for C4 KLH complex (C4-KLH), 861 μg / ml for C5 KLH complex (C5-KLH), and 1140 μg / ml for C6 KLH complex (C6-KLH). there were.
[0043]
Example 3 Preparation of Lipoprotein from Human Serum
A solution prepared by dissolving 1.21 g of trishydroxymethylaminomethane, 9.0 g of sodium chloride and 0.372 g of disodium EDTA in 1 l of distilled water in 4 ml of human pool serum 2 hours after a meal to adjust the pH to 7.4 (hereinafter referred to as “d = 4 ml of “1.006 solution” was overlaid and centrifuged at 26000 × g for 1 hour in a Beckman ultra-high speed centrifuge. The upper layer portion was pooled as a chylomicron (CM) fraction, the lower layer portion was further overlaid with a d = 1.006 solution, centrifuged at 114,000 × g for 20 hours, and the upper layer portion was pooled as a VLDL fraction. Further, the lower layer portion was adjusted to d = 1.063 with a sodium bromide solution, centrifuged at 114000 × g for 20 hours, and the supernatant portion was pooled as an LDL fraction. Each pool fraction was concentrated and used as an antigen for immune reaction.
[0044]
Example 4 Establishment of hybridoma producing anti-apo B-48 monoclonal antibody and preparation of anti-apo B-48 monoclonal antibody
Immunizing BALB / C mice with C4-KLH, C5-KLH, and C6-KLH synthesized in Example 2 to hybridomas producing anti-apo B-48 monoclonal antibodies, and fusing the spleen lymphocytes with myeloma cells Established by
[0045]
That is, BALB / C mice were immunized with 25 to 100 μg / mouse of C4-KLH, C5-KLH and C6-KLH emulsified with Freund's complete adjuvant, respectively, and emulsified with Freund's incomplete adjuvant after 2-3 weeks. Booster immunization was performed with 25-100 μg / mouse of the same complex. A part of mouse serum was used to confirm an antibody that reacts with native apo B-48 by Western blotting (WB) method. The method for measuring WB was the same as the screening method described later. C6-KLH immunized mice in which the darkest band was confirmed by the WB method were intravenously administered with 25 to 100 μg of free C6-KLH, and 3 to 4 days later, the spleen was taken out of the mice and spleen cells were prepared.
[0046]
Mouse myeloma cells (P3U1) previously cultured in RPMI-1640 medium and the above spleen cells were mixed at a ratio of 1: 2 to 1: 5, and cell fusion was performed using PEG (Boehringer). The fused cells were suspended in a HAT medium, dispensed into a 96-well culture plate, and cultured in a 37 ° C. carbon dioxide incubator.
[0047]
The culture supernatant of the cultured cells was screened by the WB method. That is, 3-15% gradient SDS polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE) was performed using the VLDL fraction prepared in Example 3 as an antigen, and then the transferred antigen was transferred to a nitrocellulose membrane to form a WB transfer membrane. Produced. The transfer film was blocked with skim milk and then cut into strips. Into each groove of Accuran Incubation Tray (manufactured by S & S), put a culture solution in which strip-like transfer membrane and 6 wells of 96-well culture plate are pooled as a group, and shake at room temperature for 1 hour. Reaction was performed.
[0048]
After washing with PBS containing 0.05% Tween 20 (hereinafter referred to as “washing buffer”) for 5 minutes with shaking, a POD-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody (manufactured by Dako) is placed in each groove. The mixture was further reacted at room temperature for 1 hour. Similarly, the substrate 4-chloronaphthol solution was added after washing 4 times with the washing buffer, and the band corresponding to Apo B-48 was confirmed.
[0049]
When a band was observed, 6 wells were further divided into 1 well, and wells producing the target antibody were selected in the same manner. The cells in the well producing the target antibody were cloned by limiting dilution. Cells producing the anti-apo B-48 monoclonal antibody were cultured in large quantities and administered to the mouse abdominal cavity, and ascites containing the anti-apo B-48 monoclonal antibody was collected. Furthermore, the antibody was purified from ascites using protein A-Sepharose to obtain a monoclonal antibody. This anti-apo B-48 monoclonal antibody was named monoclonal antibody B48-151, and the cell producing this monoclonal antibody B48-151 was named hybridoma B48-151.
[0050]
Example 5 Confirmation of reaction specificity of monoclonal antibody B48-151
The reaction specificity of the monoclonal antibody B48-151 was confirmed by the WB method using CM, VLDL and LDL fractions as antigens. That is, using each fraction prepared in Example 3 as an antigen, 3 to 15% gradient SDS-PAGE was performed, and then the migrated antigen was transferred to a nitrocellulose membrane to prepare a WB transfer membrane. The transfer membrane was blocked with skim milk and then reacted with the antibody. Monoclonal antibody B48-151 was used for the reaction, and anti-apo B-100 monoclonal antibody MAB014 (manufactured by Chemicon) and anti-apo B goat antiserum (manufactured by Chemicon) were used as controls. In addition, an inhibition test with free immune peptide C6 was also conducted to confirm the reaction specificity. In addition, the protein position of a part of the transfer film for WB was confirmed by CCB staining.
[0051]
Reactions between the antibody and various antigens were as follows. Each antibody was adjusted to a concentration of 1 μg / ml using 1% bovine serum albumin (BSA) -containing phosphate buffer (1% BSA-PBS) (pH 7.4), and the antigen-transferred WB membrane and the room temperature for 1 hour. The reaction was carried out with shaking. After washing with washing buffer for 5 minutes with shaking three times, POD-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody (manufactured by Dako) was added, and the mixture was further reacted at room temperature for 1 hour. Similarly, after washing 4 times with the washing buffer, the substrate 4-chloronaphthol solution was added to confirm the band. The results are shown in FIG. The inhibition test was carried out in the presence of 5 μg / ml C6 during the reaction between the WB membrane and the antibody. The results are shown in FIG.
[0052]
As shown in FIG. 1, monoclonal antibody B48-151 produced a band only at a position corresponding to apo B-48 having a molecular weight of slightly over 200,000, and no band was observed at a position corresponding to apo B-100 having a molecular weight of about 550,000 . In addition, as shown in FIG. 2, the band corresponding to the apo B-48 of the monoclonal antibody B48-151 disappeared due to the coexistence of C6. From this result, it was revealed that the monoclonal antibody B48-151 is a monoclonal antibody that specifically recognizes apo B-48. The band corresponding to Apo B-48 is most intense in the VLDL fraction because the CM remnant is included in the VLDL fraction.
[0053]
Example 6 Measurement of Apo B-48 by Monoclonal Antibody B48-151 Solid Phase ELISA
A sandwich ELISA was performed using Apo B-48 extracted and prepared from SDS-PAGE gel as an antigen. That is, by the same method as in Example 5, the apo B-48 band portion of the VLDL fraction run on the SDS-PAGE gel was cut out, extracted from the gel with an electroeluter (Bio-Rad), and the antigen was purified. On the other hand, 75 μl of monoclonal antibody B48-151 diluted to a concentration of 10 μg / ml with PBS (pH 7.4) was added to an NUN ELISA plate (Maxisorb) by 75 μl per well and allowed to stand overnight at 4 ° C. for adsorption. Thereafter, 1% BSA-PBS (pH 7.4) was added in an amount of 150 μl / well and left at 37 ° C. for 5 hours for masking. After washing the antibody adsorption plate 3 times with a washing buffer, purified Apo B-48 diluted with 2% from 5 μg / ml with 1% BSA-PBS was added in an amount of 75 μl / well and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
[0054]
After washing 3 times with washing buffer, 75 μl / well of POD-labeled anti-human apo B antibody (Chemicon) was added and allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. After thoroughly washing with washing buffer, 75 μl / well of substrate ABTS was added and allowed to stand at room temperature for 15 minutes, and then a wavelength of 405 nm was measured. In order to confirm the reaction specificity, Apo B-100 (manufactured by Chemicon) was measured as an antigen from 40 μg / ml by the same dilution method. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 3, it was confirmed that apo B-48 can be specifically measured by ELISA using monoclonal antibody B48-151 as a solid phase.
[0055]
Example 7 Measurement of Serum Apo B-48 by Monoclonal Antibody B48-151 Solid Phase ELISA
Apo B-48 was measured in the same manner as in Example 6 using serum diluted 20-fold with 1% BSA-PBS (pH 7.4) as a specimen. As specimens, 8 cases (specimen numbers 1 to 8) each of cryopreserved serum of a healthy person on the fasting and 1 hour after meal were used. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 4, it was confirmed that in all specimens, Apo B-48 had a high value 1 hour after meal, which was consistent with the CM behavior.
[0056]
Example 8 Surfactant treatment of fresh serum
Various surfactants were added to the buffer solution during the reaction between the solid phase antibody and fresh serum, and the reactivity with the monoclonal antibody B48-151 solid phase ELISA was examined. The surfactant is SDS (manufactured by Nacalai Tesque) as an anionic surfactant, sodium deoxycholate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), Triton X-100 (manufactured by Nacalai Tesque) as a nonionic surfactant, Triton X-114 (manufactured by Nacalai Tesque), Tween-20 (manufactured by Nacalai Tesque), Tween-80 (manufactured by Nacalai Tesque), NP-40 (manufactured by Sigma), MEGA-8 (manufactured by Dojin Chemical Laboratory) Brij-35 (manufactured by Sigma) was used.
[0057]
Monoclonal antibody B48-151 antibody diluted to a concentration of 10 μg / ml with PBS (pH 7.4) was added to an NUN ELISA plate (Maxisorb) at 75 μl / well and allowed to stand overnight at 4 ° C. for adsorption. Next, 1% BSA-PBS (pH 7.4) was added by 150 μl / well and allowed to stand at 37 ° C. for 5 hours for masking. After washing the antibody adsorption plate three times with a washing buffer, PBS (pH 7.4) containing various surfactants at concentrations of 2%, 0.4%, 0.08%, and 0.016%, respectively, Serum diluted 20 times was added by 75 μl / well and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing 3 times with the washing buffer, 75 μl / well of anti-human apo B-100 monoclonal antibody (B100-228; homemade) labeled with alkaline phosphatase (hereinafter also referred to as Alp) by the method of Yoshitake et al. For 1 hour. After thoroughly washing with a washing buffer, substrate 4-nitrophenol phosphate (hereinafter also referred to as pNPP) was added in 75 μl / well and allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes, and then a wavelength of 405 nm was measured. High fat serum and fasting serum were used as specimens. The results are shown in FIGS.
[0058]
As shown in FIG. 5, when serum was diluted with PBS (pH 7.4) containing no surfactant, no color development was observed, and it was determined that the apo B48C end epitope was not exposed. When PBS containing a surfactant (pH 7.4) was used, strong color development was observed with nonionic surfactants such as Triton X-100, Tween 20, and NP-40 in the vicinity of 0.1%. With these surfactant treatments, it was determined that the apo B48C terminal epitope was exposed. In contrast, surfactants such as MEGA-8, Brij-35, and SDS showed weak or almost no color development. Considering the results of Example 9 as well, MEGA-8 has a weak ApoB48C terminal epitope exposure effect, SDS, particularly 0.1% or more of SDS, inhibits the immune reaction, and Brij-35 may be involved in both. Sex was considered.
[0059]
Example 9 Effect of surfactant on immune response
Various surfactants similar to those in Example 8 were added during the reaction between the immobilized peptide C6 and the monoclonal antibody B48-151, and the reactivity was examined. Peptide C6 diluted to a concentration of 1 μg / ml with PBS (pH 7.4) was added to an NUN ELISA plate (Maxisorb) at 75 μl / well, and allowed to stand overnight at 4 ° C. for adsorption. Next, 1% BSA-PBS (pH 7.4) was added by 150 μl / well and allowed to stand at 37 ° C. for 5 hours for masking. After washing three times with a washing buffer, PBS (pH 7.4) containing various surfactants at concentrations of 2%, 0.4%, 0.08%, and 0.016% was used, respectively, and 2.5 μg / Monoclonal antibody B48-151 diluted in ml was added by 75 μl / well and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing 3 times with the washing buffer, 75 μl / well of POD-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody (manufactured by Dako) was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After thoroughly washing with washing buffer, 75 μl / well of substrate ABTS was added and allowed to stand at room temperature for 15 minutes, and then a wavelength of 405 nm was measured. The results are shown in FIG.
[0060]
As shown in FIG. 7, the non-ionic surfactants such as Triton X-100, Tween 20, and NP-40 did not affect the immune response. In contrast, Brij-35 and SDS had an effect on the immune response. In particular, when SDS was 0.1% or more, the immune reaction was completely inhibited.
[0061]
【The invention's effect】
Since the present invention has the above-described configuration and can obtain an anti-apo B-48 monoclonal antibody, it is possible to easily and reliably diagnose arteriosclerosis by specifically recognizing apo B-48. And treatment became possible.
[0062]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the reaction of B48-151 monoclonal antibody according to the present invention to each lipoprotein fraction performed in Example 5.
FIG. 2 is a graph showing the suppression of the reaction of the B48-151 monoclonal antibody according to the present invention to each lipoprotein fraction performed in Example 5 with C6 peptide.
FIG. 3 is a view showing test results obtained by ELISA measurement using the B48-151 monoclonal antibody according to the present invention as a solid phase, conducted in Example 6.
FIG. 4 is a view showing the test results obtained by ELISA measurement using the B48-151 monoclonal antibody according to the present invention as a solid phase, conducted in Example 7.
FIG. 5 is a diagram showing the test results obtained by ELISA measurement using the B48-151 monoclonal antibody according to the present invention as a solid phase when using a high-fat serum treated with a surfactant, performed in Example 8. is there. Tx-100 is Triton X-100, Tx-114 is Triton X-114, Tw-20 is Tween-20, Tw-80 is Tween-80, Deoxy-ch. Represents sodium deoxycholate. PBS represents that the test was conducted without adding a surfactant.
FIG. 6 is a diagram showing the test results obtained by ELISA measurement using the B48-151 monoclonal antibody according to the present invention as a solid phase when using fasting serum treated with a surfactant, as performed in Example 8. is there.
7 is a graph showing the test results of the influence of a surfactant on an ELISA measurement method using a B48-151 monoclonal antibody according to the present invention as a solid phase, performed in Example 9. FIG.

Claims

The specimen is a serum or plasma, after the processing for exposing the epitope by non-ionic surfactants and surfactants selected from sodium deoxycholate, and the serum or plasma, substantially apo B-100 A method for immunoassay of apo B-48 and / or apo B-48-containing lipoprotein, characterized by reacting with a monoclonal antibody that specifically recognizes apo B-48.

The nonionic surfactant is selected from the group consisting of Triton X-100 (registered trademark) , Triton X-114 (registered trademark) , Tween-20 (registered trademark) and NP-40 (registered trademark). The immunoassay method according to claim 1, which is an agent.

The nonionic surfactant is a surfactant selected from the group consisting of Triton X-114 (registered trademark) , Tween-20 (registered trademark), and NP-40 (registered trademark) . Immunoassay method.

The monoclonal antibody is a monoclonal antibody obtained from a hybridoma (deposit number: FERM BP-6473) that does not substantially react with Apo B-100 and produces a monoclonal antibody that specifically recognizes Apo B-48. Item 4. The immunoassay method according to any one of Items 1 to 3.

The immunoassay method according to claim 4, wherein the measurement method is an ELISA method.

A serum or plasma treatment solution containing a nonionic surfactant and / or sodium deoxycholate and a monoclonal that specifically does not react with apo B-100 and specifically recognizes apo B-48 An immunoassay reagent comprising an antibody.

The nonionic surfactant is selected from the group consisting of Triton X-100 (registered trademark) , Triton X-114 (registered trademark) , Tween-20 (registered trademark) and NP-40 (registered trademark). The immunoassay reagent according to claim 6, which is an agent.

The nonionic surfactant is a surfactant selected from the group consisting of Triton X-114 (registered trademark) , Tween-20 (registered trademark), and NP-40 (registered trademark) . Immunoassay reagent.

The immunoassay reagent according to any one of claims 6 to 8, wherein the monoclonal antibody is bound to an ELISA solid phase.