JP3833352B2 - Method for producing α-1,3-1,4-glucan - Google Patents

Description

で表される共重合体であって、式(I) 中のｍ／ｎが２．４以上２．９以下であり、分子量が１万以上１０００万以下である前記共重合体である。ここでいう共重合体は、ランダム共重合体およびブロック共重合体の双方を含む。
【０００９】
さらに、本発明はオウレオバシディウム属に属し、α−１，３−１，４−グルカン生産能を有する微生物をを培地中で培養し、該培養液からα−１，３−１，４−グルカンを採取することを特徴とする請求項１記載の共重合体の製造方法である。
さらに、本発明は請求項１記載の共重合体をα−アミラーゼで分解して、Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコースを製造する方法である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明に用いる、オウレオバシディウム（Aureobasidium ）属に属する微生物としては、該微生物を変異させて得られる変異株のうちα−１，３−１，４−グルカン生産能を有する変異株である。
【００１１】
この変異株を得るための親株として用いるオウレオバシディウム（Aureobasidium ）属に属する微生物としては、特に限定しないが、例えばオウレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pullulans ）を用いることができる。そして、その例としてオウレオバシディウム・プルランスATCC9348株、ATCC3092株、ATCC433023株、IFO4466株、IFO6353株あるいはIFO7757株を用いることができる。
【００１２】
突然変異処理としては公知の方法を用いることができるが、ＵＶ照射若しくはγ線照射による方法、または変異剤により化学的処理する方法を用いることが好ましい。変異剤としては公知のもの、例えばニトロソグアニジン、エチジウムブロミド、メタスルホン酸エチルまたは亜硝酸ナトリウムなどが用いられる。
【００１３】
本発明において用いるオウレオバシディウム属に属する微生物の変異株とは、オウレオバシディウム属に属する微生物を突然変異処理して得られる、実質的にメラニン色素を産生せず、α−１，３−１，４−グルカンを生産する変異株をいう。かかる菌株は、オウレオバシディウム属に属する微生物を突然変異処理し、実質的にメラニン色素を産生しない菌株を選別し、その中からα−１，３−１，４−グルカンを生産する変異株を選別することにより得ることができる。この変異株の具体的菌株はとしては、オウレオバシディウム・プルランスＡＰＷ−１が挙げらる。
【００１４】
本発明で使用する菌株の培養に使用する培地は、炭素源、窒素源、リン、カリウム、マグネシウム等の炭素化合物、窒素化合物、無機塩などの必要な栄養成分を適宜含有する液体培地である。炭素源としてはグルコース、スクロース、キシロース、マンノース、フルクトースなどを使用する。窒素源としては硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、アンモニウムなどを使用し、無機塩としてはリン酸カリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄などを使用する。
培養は、温度０℃〜６０℃、好ましくは１０℃〜４０℃にて、１〜１０日間、好ましくは２〜５日間、通気下で行う。培養液中の溶存酸素量には特に制限はないが、１０％以上にすることが好ましく、特に１５％以上に保つことがα−１，３−１，４−グルカンの生産量を増加させるうえで好ましい。
【００１５】
本発明の培養においては、培地を攪拌しながら培養を行う。攪拌回転数は菌の生育とグルカンの生産が増大するに従い、増加させる方法を採用するのが好ましい。この方法により溶存酸素量を通常１０％以上に保つことができる。培養液の攪拌翼としては、トルクの大きな攪拌翼を使用することが好ましく、例えば、ヘリカルリボン翼、マックスブレンド翼、フルゾーン翼、アンカー翼などを用いることが好ましい。このような攪拌翼を使用することにより、グルカンの生産に従い培養液の粘度が増加しても攪拌が可能となる。攪拌回転数と通気量を調整することによって溶存酸素濃度を１５％以上に保持して培養を行うこともできる。
【００１６】
本発明においては培養中のｐＨを５．５以下、好ましくは４．０〜５．５の範囲に制御する。より好ましくはｐＨを４．５〜５．０に制御する。本発明の変異株を上記範囲内のｐＨで培養することによりプルランやβ−１，３−１，６−グルカンの生産が著しく抑制されるため、実質的にα−１，３−１，４−グルカンのみが生産される。ｐＨが５．５より大きくなるとプルランやβ−１，３−１，６−グルカンなどの他の生産物が生産されるようになる。またｐＨが４．０より低くなるとα−１，３−１，４−グルカンの生産が減少する。なお、培養中は培地のｐＨの変動を抑えることが好ましく、ｐＨの変動値を好ましくは±０．２以内、より好ましくは±０．１以内に制御する。
【００１７】
培養終了後、遠心分離や濾過などの分離手段を用いて培養液から菌体を除去し、培養上清からα−１，３−１，４−グルカンを採取する。採取方法は特に限定されないが、培養上清に有機溶媒を加えて沈殿させる方法を用いることが好ましい。有機溶媒としては特に制限はないが、例えぱメタノール、エタノール、イソプロパノールなどのアルコール類、アセトンなどのケトン類、アセトニトリルなどのニトリル類等を用いることが好ましい。また培養上清を透析することによってα−１，３−１，４−グルカンのみを含む液体として、溶液状態で使用することや、水分を蒸発乾固することによって固形物として得ることもできる。
【００１８】
本発明の方法により得られるα−１，３−１，４−グルカンは、次式で示される共重合体である。ここでいう共重合体には、ランダム共重合体およびブロック共重合体の双方が含まれる。
【００１９】
【化３】

【００２０】
そして、このα−１，３−１，４−グルカンは、α−１，４結合：α−１，３結合の比（すなわち、ｍ：ｎの比）が２．４〜２．９：１、特に２．５〜２．８：１であり、α−１，４結合の比率が大きいという特徴を有しており、新規な化合物である。
そして、このα−１，３−１，４−グルカンは以下の理化学的性質を有する。
１）平均分子量 １万〜１，０００万（ゲル濾過法による測定）
２）比旋光度［α］Ｄ２５＝＋１８０−２６０°（Ｌ＝１，Ｃ＝１．０ in ０．５Ｎ ＮａＯＨ）
３）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル
i)δ値７９ ppm、８３ ppm、１００ ppm付近にシグナルを有する
ii)δ値７９ ppmのシグナル強度が８３ ppmのシグナル強度の２，４〜２．９倍である。
iii)δ値７９ ppmおよび８３ ppmのシグナルが数本に分裂している。
【００２１】
さらに、本発明のα−１，３−１，４−グルカンは、好ましくは、α−１，３結合が２以上連続する部位を有さない。
本発明のα−１，３−１，４−グルカンから調製されたフィルムは従来公知のプルランフィルムやその他の多糖フィルムと比較して耐酸性に優れており、また、このα−１，３−１，４−グルカンは、透明で、生体に無害で、酸素透過率の低い水溶性フィルムの原料として優れた特性を有している。この特性を利用して薬物を小腸まで到達させるための保護フィルムやカプセルとしての用途や食品、化粧品、農業用としての包装フィルムとしての広い範囲での用途が期待される。
また、本発明のα−１，３−１，４−グルカンはα−アミラーゼで分解することにより３糖のオリゴ糖であるＯ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコースを製造することができる。この３糖のオリゴ糖は甘味料、機能性食品、医薬品または化粧品などの原材料として有用なオリゴ糖である。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕
オウレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pullulans ）をポテトデキストロース寒天斜面培地で培養して保存菌株とし、表１に示す組成を有する液体培地Ａ１０mLを試験管に入れたものに接種して、２８℃で一夜培養した。
【００２３】
【表１】

【００２４】
該培養液１mLを集菌し、０．２ mol／L 酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）１mLで２回洗浄後、０．０４重量％のＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを含む０．２ mol／L 酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）を調製し、該溶液中に３０℃で６０分間静置して突然変異を行った。次に、この変異処理液を集菌し、０．２ mol／L 酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）で洗浄した後、寒天培地（表２に示す組成を有する液体培地Ｂに寒天を１．５重量％添加したもの）上に塗布して２８℃で２〜３日間培養後、さらに４〜１０℃の低温中に１〜２日静置した。
【００２５】
【表２】

【００２６】
低温に静置するとほとんどの菌株は緑黒色のコロニーを形成するが、無色あるいは着色の少ないコロニーを選択した。この選択したコロニーについて５００mL容の坂口フラスコ中で培地Ａ２００mLを用いて、３０℃、１２０ｒｐｍで４日間振とう培養した後にα−１，３−１，４−グルカン量を次のようにして重量法（および比旋光度法）により測定した。培養液５mLを採取し、１０mLの水を加えてよく攪拌して均一化した後、20,000×ｇでの遠心分離により菌体を除去した培養上清に同量のエタノールを添加することによってグルカンを沈殿させた。該沈殿物をスパチュラでかき集め、あらかじめ重量を測定しておいたマイクロチューブに入れて、凍結遠心濃縮機（東京理科機械製、CVE-200D型）を用いて恒量となるまで乾燥した。こうして得られた沈殿物の重量を測定した。その結果を表３に示す。
【００２７】
【表３】

【００２８】
ここで取得した変異株をオウレオバシディウム・プルランスＡＰＷ−１と命名した。そして、この変異株は工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５０９６として寄託している。
〔実施例２〕
表４に示す組成の培地を調製し、ｐＨ５．０に調整した。
【００２９】
【表４】

【００３０】
次に、実施例１で得られた変異株を２〜３白金耳を掻き取り、試験管中に入れた上記培地１０mLに植菌し、２５℃、１２０ｒｐｍで往復振とう培養を３日間行い、さらに５００mL容の坂口フラスコを用いて同様の培地２００mL中に２重量％になるように植菌して３０℃，１２０ｒｐｍで３０時問振とう培養した。次いで、２段のディスクタービン翼付き５Ｌ容小型発酵槽中の同様の培地２．５Ｌに、該フラスコ培養液を１０重量％となるように植菌して、通気量１ｖｖｍ、攪拌回転数を２００ｒｐｍから６００ｒｐｍまで徐々に上げて溶存酸素量を１５％以上に保持し、２８℃で４日間培養した。培養の間、５ mol／L 酢酸、アルカリとして炭酸ナトリウムを用いて、ｐＨを５．０±０．１に調整して培養を行った。
【００３１】
培養後、約１．５Ｌの水を加え、遠心分離機を用いて菌体を取り除いた。次いで、得られた培養上清を、１２０℃、２０分間オートクレーブにより加熱滅菌した。その後、同量のエタノールを加えて室温で数時間攪拌した。得られた沈殿物を遠心分離機にかけて分取し、得られたα−１，３−１，４−グルカンの収量は１５ｇ／Ｌであった。得られたα−１，３−１，４−グルカンのＤＭＳＯ溶液中での¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１に示す。
【００３２】
通常グルカンの１位の炭素は、１００〜１０５ ppm に検出され、この結合様式により数 ppmシフトする（α型では１００ ppm付近にβ型では１０３ ppm付近に検出される）。本サンプルの場合、１００ ppm付近に数本のシグナルが観察されていることから、α型のグルコース残基で構成されていることがわかった。７９ ppmおよぴ８３ ppmシグナルは、その特徴的な化学シフトから、それぞれα−１，４結合の４位の炭素、α−１，３結合の３位の炭素に帰属できる。すなわち、本実施例で生産したグルカンの構造は、式（Ｉ）に示したα−１，３−１，４グルカンと推定される。７９ ppmおよぴ８３ ppmシグナル強度から、式（Ｉ）のｍ／ｎの値は平均で２．７５と算出された。７９ ppmおよぴ８３ ppmのシグナルが数本に分裂している理由は、連続するα−１，４結合のユニット数が異なる部位が混在するためと考えられる。つまりα−１，４結合とα−１，３結合の比が２．７５：１であることを示した。
【００３３】
また分子量を以下の条件でのゲル濾過法により測定した。

その結果、分子量は約１００万であった。比旋光度［α］Ｄ２５は＋２２０。（Ｌ＝１，Ｃ＝１．６ in ０．５ＮＮａＯＨ）であった。
【００３４】
〔実施例３〕
実施例２で得られたα−１，３−１，４−グルカン５mgに豚の膵臓由来のα−アミラーゼ（Typel A phenylmethylsulfonyl fluoride 処理）を３mg加え、５０mmol／L 酢酸緩衝液（ｐＨ５．８）１．０mL中、２５℃で３０時間分解させた。反応液を減圧下で濃縮乾固し、５０％アセトニトリル水溶液１．５mLを添加して未反応生成物のグルカンを沈殿させて取り除いた。該溶液にさらに９０％アセトニトリル水溶液１．０mLを加えることによって単糖と３糖を分離して薄層クロマトグラフ（ＴＬＣ、薄層：シリカゲル、展開溶媒：８０％アセトニトリル、発色法：２０％硫酸噴霧（加熱発色））で３糖と推定されるスポットを示すサンプルについて、 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＵＮＩＴＹplus600 型（米国バリアン社製）、６００ＭＨｚ、溶媒：重水／ＤＭＳＯ（20mg/0.6mL）、温度：室温）、２Ｄ−ＴＯＣＳＹ（スピンロック、混合時間：１２０ｍｓ、出力：６ＫＨｚ、観測幅：６０００Ｈｚ、データサイズ：５１２×５１２、繰り返し時間：２ｓｅｃ）およぴＨＳＱＣ with ＰＦＧ（観測幅： ¹Ｈ ４０００Ｈｚ、¹³Ｃ １８０００Ｈｚ、データサイズ：５１２×１Ｋ、繰り返し時間：３ｓｅｃ、Ｊ（Ｃ−Ｈ）：１４０Ｈｚ）分析を行った。 ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２に示す。
その結果、３糖はα−１，３−結合およぴα−１，４−結合からなる式(II)に示されるオリゴ糖であることがわかった。
また、このサンプルはマススペクトルにより式(II)に示される３糖であることを確認した。
【００３５】
【化４】

【００３６】
以上のことから、実施例２で生産したα−１，３−１，４−グルカンからα−アミラーゼ分解によって生じたオリゴ糖は３糖のみであり、その構造も式(II)に示した構造を有するもののみであったことが確認された。これにより、本発明のα−１，３−１，４−グルカンの結合様式においてα−１，３−結合が２個以上連続した箇所はないことが明らかとなった。
【００３７】
【発明の効果】
本発明により、透明で、生体に無害で、酸素透過率の低い水溶性フィルムの原料として有用な新規なα−１，３−１，４−グルカンを提供する。また、この化合物の微生物を用いた製造法を提供する。さらに、この新規なα−１，３−１，４−グルカンを原料として３糖のオリゴ糖であるＯ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコースを製造する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】α−１，３−１，４−グルカンの¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２】α−１，３−１，４−グルカンをα−アミラーゼで分解した生成物の ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to α-1,3-1,4-glucan, a method for producing the same, and O-α-D-glucopyranosyl- (1 → 3) -O-α from the α-1,3-1,4-glucan. The present invention relates to a method for producing D-glucopyranosyl- (1 → 4) -D-glucose.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, as α-1,3-1,4-glucan, Nigeran produced by microorganisms Aspergillus niger and Penicillium expansum belonging to the genus Aspergillus are known (Reese, ET & M. Mandels, Can. J. Microbiol., 10, 103-114 (1964), Tung, KK & JH Nordin, Biochem. Biophys. Res. Commun., 28, 519-524 (1967), Bobitt, TF & JH Nordin, Mycologia, 70, 1201-1211 (1978)). In this glucan, glucose is alternately connected by α-1,3-bonds and α-1,4-bonds. However, since Nigellan is a glucan that accumulates in the cells of the producing bacteria, it is suitable for industrial production because it requires an extraction operation to separate glucan and is difficult to produce in large quantities. It was not.
[0003]
In addition, erucinane in which maltotriose and maltotetraose are α-1,3-bonded by a culture method using a microorganism belonging to the genus Ersinoe, that is, polymerized by two or three α-1,4-linkages. Glucans polymerized by linking sugars or tetrasaccharides with α-1,3-linkages are also known (Misaki, A., Y. Tsumuraya & S. Takaya, Agr. Bio. Chem., 42 491-493, Tsumuraya, Y., A. Misaki, S. Takaya & M. Torii, Carbohydr. Res., 66, 53-65 (1978)).
[0004]
As other α-glucan, pullulan in which a trisaccharide polymerized by two α-1,4 bonds is polymerized by α-1,6 bonds is known (Bender, H., J. Lehmann & K. Wallenfels). , Biochim. Biophys. Acta, 36, 309-316 (1959)). Pullulan is produced from microorganisms belonging to the genus Aureobasidium and is industrially produced as an edible film, a transparent polymer material that is harmless to the living body and easy to process, and a strong acid- and alkali-resistant adhesive. ing.
On the other hand, there is no report that α-1,3-1,4-glucan was produced from microorganisms belonging to Aureobasidium.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a novel α-1,3-1,4-glucan, a method for producing the compound using a microorganism, and O-α-D-glucopyranosyl from α-1,3-1,4-glucan. It is to provide a method for producing-(1 → 3) -O-α-D-glucopyranosyl- (1 → 4) -D-glucose.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies on a method for producing α-1,3-1,4-glucan using microorganisms belonging to the genus Orebobasidium that have no safety problems, the present inventors have found that Α-1,3-1,4-glucan is produced by culturing a mutant obtained by mutating a microorganism belonging to the genus Dium under predetermined conditions, and α-1 obtained. , 3-1,4-glucan has been found to have a novel structure, and the present invention has been completed.
[0007]
Further, the present invention decomposes α-1,3-1,4-glucan obtained by the above method with α-amylase to thereby produce O-α-D-glucopyranosyl- (1) which is a trisaccharide oligosaccharide. → 3) It has also been found that -O-α-D-glucopyranosyl- (1 → 4) -D-glucose can be produced.
That is, the present invention provides the formula
[Chemical 2]

The m / n in the formula (I) is 2.4 or more and 2.9 or less, and the molecular weight is 10,000 or more and 10 million or less. The copolymer here includes both a random copolymer and a block copolymer.
[0009]
Furthermore, the present invention belongs to the genus Aureobasidium, and a microorganism having an ability to produce α-1,3-1,4-glucan is cultured in a medium, and α-1,3-1, The method for producing a copolymer according to claim 1, wherein 4-glucan is collected.
Furthermore, this invention decomposes | disassembles the copolymer of Claim 1 with (alpha) -amylase, O- (alpha) -D-glucopyranosyl- (1-> 3) -O- (alpha) -D-glucopyranosyl- (1-> 4)- A method for producing D-glucose.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention is described in detail below.
The microorganism belonging to the genus Aureobasidium used in the present invention is a mutant having an ability to produce α-1,3-1,4-glucan among mutants obtained by mutating the microorganism. is there.
[0011]
The microorganism belonging to the genus Aureobasidium used as a parent strain for obtaining this mutant strain is not particularly limited, and for example, Aureobasidium pullulans can be used. For example, Aureobasidium pullulans ATCC9348, ATCC3092, ATCC433023, IFO4466, IFO6353, or IFO7757 can be used.
[0012]
As the mutation treatment, a known method can be used, but a method using UV irradiation or γ-ray irradiation, or a method of chemically treating with a mutation agent is preferably used. As the mutation agent, known ones such as nitrosoguanidine, ethidium bromide, ethyl metasulfonate or sodium nitrite are used.
[0013]
The mutant strain of the microorganism belonging to the genus Aureobasidium used in the present invention is obtained by mutation treatment of a microorganism belonging to the genus Aureobasidium, which does not substantially produce a melanin pigment and is α-1. , 3-1,4-glucan. Such a strain is obtained by mutating a microorganism belonging to the genus Aureobasidium, selecting a strain that does not substantially produce a melanin pigment, and producing an α-1,3-1,4-glucan therefrom. It can be obtained by selecting the strain. Specific examples of the mutant strain include Aureobasidium pullulans APW-1.
[0014]
The medium used for culturing the strain used in the present invention is a liquid medium appropriately containing necessary nutrient components such as a carbon source, a nitrogen source, a carbon compound such as phosphorus, potassium, and magnesium, a nitrogen compound, and an inorganic salt. As the carbon source, glucose, sucrose, xylose, mannose, fructose and the like are used. Sodium nitrate, ammonium nitrate, ammonium or the like is used as the nitrogen source, and potassium phosphate, potassium chloride, magnesium sulfate, iron sulfate or the like is used as the inorganic salt.
Culturing is performed at a temperature of 0 ° C. to 60 ° C., preferably 10 ° C. to 40 ° C. for 1 to 10 days, preferably 2 to 5 days under aeration. Although there is no restriction | limiting in particular in the amount of dissolved oxygen in a culture solution, It is preferable to make it 10% or more, and especially in order to increase the production amount of (alpha) -1,3-1,4-glucan to keep 15% or more. Is preferable.
[0015]
In the culture of the present invention, the culture is performed while stirring the medium. It is preferable to employ a method of increasing the number of revolutions of stirring as the growth of bacteria and the production of glucan increase. By this method, the amount of dissolved oxygen can usually be maintained at 10% or more. As the stirring blade for the culture solution, it is preferable to use a stirring blade having a large torque. For example, a helical ribbon blade, a max blend blade, a full zone blade, an anchor blade, or the like is preferably used. By using such a stirring blade, stirring is possible even if the viscosity of the culture solution increases as glucan is produced. It is also possible to carry out the culture while maintaining the dissolved oxygen concentration at 15% or more by adjusting the number of stirring rotations and the amount of aeration.
[0016]
In the present invention, the pH during the cultivation is controlled to 5.5 or less, preferably in the range of 4.0 to 5.5. More preferably, the pH is controlled to 4.5 to 5.0. Since the production of pullulan and β-1,3-1,6-glucan is remarkably suppressed by culturing the mutant strain of the present invention at a pH within the above range, α-1,3-1,4 is substantially suppressed. -Only glucan is produced. When the pH is higher than 5.5, other products such as pullulan and β-1,3-1,6-glucan are produced. Moreover, when pH becomes lower than 4.0, the production of α-1,3-1,4-glucan decreases. During the culture, it is preferable to suppress the fluctuation of the pH of the medium, and the fluctuation value of the pH is preferably controlled within ± 0.2, more preferably within ± 0.1.
[0017]
After completion of the culture, the cells are removed from the culture solution using a separation means such as centrifugation or filtration, and α-1,3-1,4-glucan is collected from the culture supernatant. The collection method is not particularly limited, but it is preferable to use a method in which an organic solvent is added to the culture supernatant for precipitation. The organic solvent is not particularly limited, but for example, alcohols such as methanol, ethanol and isopropanol, ketones such as acetone, and nitriles such as acetonitrile are preferably used. In addition, the culture supernatant can be used as a liquid containing only α-1,3-1,4-glucan by dialysis, or obtained as a solid by evaporating and drying the water.
[0018]
Α-1,3-1,4-glucan obtained by the method of the present invention is a copolymer represented by the following formula. The copolymer here includes both a random copolymer and a block copolymer.
[0019]
[Chemical 3]

[0020]
The α-1,3-1,4-glucan has an α-1,4 bond: α-1,3 bond ratio (that is, a ratio of m: n) of 2.4 to 2.9: 1. In particular, it is 2.5 to 2.8: 1 and is characterized by a high ratio of α-1,4 bonds, and is a novel compound.
The α-1,3-1,4-glucan has the following physicochemical properties.
1) Average molecular weight 10,000 to 10 million (measured by gel filtration method)
2) Specific rotation [α] D25 = + 180-260 ° (L = 1, C = 1.0 in 0.5N NaOH)
3) ¹³ C-NMR spectrum
i) δ value 79 ppm, 83 ppm, with signal around 100 ppm
ii) The signal intensity at a δ value of 79 ppm is 2,4 to 2.9 times the signal intensity at 83 ppm.
iii) Signals with a δ value of 79 ppm and 83 ppm are split into several.
[0021]
Furthermore, the α-1,3-1,4-glucan of the present invention preferably does not have a site where two or more α-1,3 bonds are continuous.
The film prepared from the α-1,3-1,4-glucan of the present invention is excellent in acid resistance as compared with a conventionally known pullulan film and other polysaccharide films, and this α-1,3- 1,4-glucan is transparent, harmless to living organisms, and has excellent characteristics as a raw material for water-soluble films with low oxygen permeability. Utilization of this characteristic is expected to be used as a protective film or capsule for allowing a drug to reach the small intestine, and as a packaging film for food, cosmetics and agriculture.
Further, the α-1,3-1,4-glucan of the present invention is decomposed by α-amylase to thereby produce O-α-D-glucopyranosyl- (1 → 3) -0-α-, which is a trisaccharide oligosaccharide. D-glucopyranosyl- (1 → 4) -D-glucose can be produced. This trisaccharide oligosaccharide is an oligosaccharide useful as a raw material for sweeteners, functional foods, pharmaceuticals or cosmetics.
[0022]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to these.
[Example 1]
Aureobasidium pullulans was cultured on a potato dextrose agar slant medium to make a stock strain, and inoculated into a test tube with 10 mL of liquid medium A having the composition shown in Table 1, and at 28 ° C. Cultured overnight.
[0023]
[Table 1]

[0024]
1 mL of the culture solution was collected and washed twice with 1 mL of 0.2 mol / L acetate buffer (pH 5.6), and 0.04% by weight of N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine was then added. A 0.2 mol / L acetate buffer solution (pH 5.6) containing the solution was prepared, and mutation was performed by allowing it to stand in the solution at 30 ° C. for 60 minutes. Next, the mutation treatment solution was collected and washed with 0.2 mol / L acetate buffer (pH 5.6), and then agar was added to the agar medium (liquid medium B having the composition shown in Table 2). (Weight% added) and coated at 28 ° C. for 2-3 days, and then allowed to stand still at a low temperature of 4-10 ° C. for 1-2 days.
[0025]
[Table 2]

[0026]
Most strains formed greenish-black colonies when allowed to stand at low temperatures, but colorless or less colored colonies were selected. The selected colonies were cultured with shaking in a 500 mL Sakaguchi flask using 200 mL of medium A at 30 ° C. and 120 rpm for 4 days, and then the α-1,3-1,4-glucan content was determined by the weight method as follows. (And specific rotation method). Collect 5 mL of the culture solution, add 10 mL of water, mix well, homogenize, and add glucan to the culture supernatant after removing the cells by centrifugation at 20,000 × g. Precipitated. The precipitate was collected with a spatula, placed in a microtube that had been weighed in advance, and dried using a freezing centrifugal concentrator (manufactured by Tokyo Science Machinery Co., Ltd., CVE-200D type) to a constant weight. The weight of the precipitate thus obtained was measured. The results are shown in Table 3.
[0027]
[Table 3]

[0028]
The mutant strain obtained here was named Aureobasidium pullulans APW-1. This mutant strain is deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Higashi 1-chome 1-3, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture) under the accession number FERM P-15096.
[Example 2]
A medium having the composition shown in Table 4 was prepared and adjusted to pH 5.0.
[0029]
[Table 4]

[0030]
Next, 2 to 3 platinum loops of the mutant strain obtained in Example 1 were scraped off, inoculated into 10 mL of the medium placed in a test tube, and subjected to reciprocal shaking culture at 25 ° C. and 120 rpm for 3 days. Furthermore, using a 500 mL Sakaguchi flask, it was inoculated to 200 wt.% In the same medium and cultured at 30 ° C. and 120 rpm for 30 hours. Next, the flask culture solution was inoculated into 2.5 L of the same medium in a 5-L small fermenter equipped with two stages of disk turbine blades, with an aeration rate of 1 vvm and a stirring speed of 200 rpm. The amount of dissolved oxygen was kept at 15% or more by gradually increasing from 600 rpm to 600 rpm, and cultured at 28 ° C. for 4 days. During the culture, the culture was performed using 5 mol / L acetic acid and sodium carbonate as the alkali, and adjusting the pH to 5.0 ± 0.1.
[0031]
After culturing, about 1.5 L of water was added, and the cells were removed using a centrifuge. Subsequently, the obtained culture supernatant was sterilized by heating in an autoclave at 120 ° C. for 20 minutes. Thereafter, the same amount of ethanol was added and stirred at room temperature for several hours. The resulting precipitate was collected by centrifugation and the yield of α-1,3-1,4-glucan obtained was 15 g / L. FIG. 1 shows a ¹³ C-NMR spectrum of the obtained α-1,3-1,4-glucan in a DMSO solution.
[0032]
Normally, the carbon at the 1-position of glucan is detected at 100 to 105 ppm, and this binding mode shifts several ppm (detected at around 100 ppm for α form and around 103 ppm for β form). In the case of this sample, several signals were observed in the vicinity of 100 ppm, indicating that it was composed of an α-type glucose residue. The 79 ppm and 83 ppm signals can be attributed to the carbon at the 4-position of the α-1,4 bond and the carbon at the 3-position of the α-1,3 bond, respectively, due to its characteristic chemical shift. That is, the structure of the glucan produced in this example is presumed to be α-1,3-1,4 glucan represented by the formula (I). From the 79 and 83 ppm signal intensities, the m / n value of formula (I) was calculated to be 2.75 on average. The reason why the signals of 79 ppm and 83 ppm are split into several is considered to be due to a mixture of sites having different numbers of consecutive α-1,4 bonds. That is, the ratio of α-1,4 bonds to α-1,3 bonds was 2.75: 1.
[0033]
The molecular weight was measured by gel filtration under the following conditions.

As a result, the molecular weight was about 1 million. Specific rotation [α] D25 is +220. (L = 1, C = 1.6 in 0.5N NaOH).
[0034]
Example 3
3 mg of α-amylase (typel A phenylmethylsulfonyl fluoride treatment) derived from porcine pancreas was added to 5 mg of α-1,3-1,4-glucan obtained in Example 2, and 50 mmol / L acetate buffer (pH 5.8). Decompose in 30 mL at 25 ° C. in 1.0 mL. The reaction solution was concentrated to dryness under reduced pressure, and 1.5 mL of 50% acetonitrile aqueous solution was added to precipitate and remove the unreacted product glucan. Further, 1.0 mL of 90% acetonitrile aqueous solution was added to the solution to separate monosaccharide and trisaccharide, and thin layer chromatograph (TLC, thin layer: silica gel, developing solvent: 80% acetonitrile, color development method: 20% sulfuric acid spray) for a sample showing a spot that is estimated to be (heating color development)) in 3 sugar, ¹ H-NMR (UNITYplus600 (manufactured USA Varian), 600 MHz, solvent: heavy water /DMSO(20mg/0.6ML), temperature: room temperature) 2D-TOCSY (spin lock, mixing time: 120 ms, output: 6 KHz, observation width: 6000 Hz, data size: 512 × 512, repetition time: 2 sec) and HSQC with PFG (observation width: ¹ H 4000 Hz, ¹³ C 18000 Hz, data size: 512 × 1K, repetition time: 3 sec, J (C−H): 140 Hz) analysis I went. ^{The 1} H-NMR spectrum is shown in FIG.
As a result, it was found that the trisaccharide is an oligosaccharide represented by the formula (II) composed of α-1,3-bond and α-1,4-bond.
This sample was confirmed to be a trisaccharide represented by the formula (II) by mass spectrum.
[0035]
[Formula 4]

[0036]
From the above, the oligosaccharide produced by α-amylase degradation from α-1,3-1,4-glucan produced in Example 2 is only trisaccharide, and the structure thereof is the structure shown in formula (II). It was confirmed that it was only what has. This revealed that there was no place where two or more α-1,3-bonds continued in the α-1,3-1,4-glucan binding mode of the present invention.
[0037]
【The invention's effect】
The present invention provides a novel α-1,3-1,4-glucan that is transparent, harmless to a living body, and useful as a raw material for a water-soluble film having low oxygen permeability. Moreover, the manufacturing method using the microorganisms of this compound is provided. Furthermore, O-α-D-glucopyranosyl- (1 → 3) -0-α-D-glucopyranosyl- (1) which is a trisaccharide oligosaccharide using the novel α-1,3-1,4-glucan as a raw material. → 4) A method for producing -D-glucose is provided.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a ¹³ C-NMR spectrum of α-1,3-1,4-glucan.
FIG. 2 is a diagram showing a ¹ H-NMR spectrum of a product obtained by decomposing α-1,3-1,4-glucan with α-amylase.

Claims (3)

It belongs to the genus Aureobasidium and has the following formula (I) :

(In the formula (I) , m / n is 2.4 or more and 2.9 or less)
And a microorganism having an α-1,3-1,4-glucan production ability having a molecular weight of 10,000 to 10,000,000 is cultured in a medium, and two or more α-1,3 bonds are continuously generated from the culture solution. The method for producing α-1,3-1,4-glucan is characterized by collecting α-1,3-1,4-glucan that does not have a site to perform.   2. The method according to claim 1, wherein the microorganism is Aureobasidium pullulans APW-1 (FERM P-15096). The α-1,3-1,4-glucan produced by the method according to claim 1 or 2 that does not have two or more consecutive α-1,3 bonds is decomposed with α-amylase, and O A method for producing -α-D-glucopyranosyl- (1 → 3) -O-α-D-glucopyranosyl- (1 → 4) -D-glucose.

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