JP3853445B2 - Campylobacter selective separation medium - Google Patents

Description

【０００８】
バツラー ＪＰらは、１９７９年にキャンピロバクターの選択分離用培地を開発し、さらに１９８３年にそれを改良したバツラー培地を発表した(Goossens H, De Boeck, Butzler JP : A new selective medium for the isolation of Campylobacter jejuni from human faeces, Eur J Clin Microbiol, 2, 389-394, 1983)（特公平６−２０４８号）。
バツラー培地は、コロンビア寒天培地を基礎培地とし、選択剤としてグラム陽性菌を抑制するリファンピシンを、グラム陰性菌を抑制するセフォペラゾンとコリスチンを、そして真菌を抑制するアンフォテリシンＢを含有する。
【０００９】
【化２】

【００１０】
更にブレザー ＭＪらは、１９７９年にブレザー培地を発表した(Blaser MJ, et al.: Campylobacter enteritis:Clinical and Epidemiological Fetures, Annals Internal Medicine, 91, 179-185, 1979)。
ブレザー培地は、ブルセラ寒天培地を基礎培地とし、選択剤としてグラム陽性菌を抑制するバンコマイシン、グラム陰性菌を抑制するトリメトプリムとポリミキシンＢ・セファロシン、真菌を抑制するアンフォテリシンＢを含むことを特徴とする。
【００１１】
【化３】

【００１２】
しかしながら、スキロー培地は、全てのキャンピロバクターの発育は良いが、常在する腸内細菌に対する抑制が不十分であり、シュウドモナスをはじめとする多くの菌が発育し、目的とするキャンピロバクターの分離を妨げる。また真菌に有効な選択剤を含まないため真菌に対する抑制力を持たない。
バツラー培地は、抗真菌剤が含まれている為に真菌に対する抑制力が優れ、またセフォペラゾンによってシュウドモナスに対する抑制力も優れる。ただしセフォペラゾンによってC.fetusの増殖が抑制されることがある。
ブレザー培地は、スキロー培地の改良型であり真菌も抑制するが、セファロシンの作用でC.fetusが抑制されることがある。更にシュウドモナスに対する抑制力が劣る。（メデイヤサークル,33,9-15,1988）
【００１３】
選択剤の使用は選択分離用培地のみならず輸送用培地においても重要である。通常、腸内細菌等を含む検査材料の輸送には、一般的な培地として、キャリーブレアー等の輸送用培地が使用される。輸送用培地に求められる培地性能としては、輸送中に検査材料中の目的菌が死滅しないこと、あるいは分離を妨害する他の微生物が不必要に繁殖しないことが必要である。ところが公知の選択剤をキャリーブレア培地のような一般的な輸送用培地に添加した場合、一部のキャンピロバクターが感受性を持つために生存できない場合がある。他方、選択剤を用いないで輸送を行うと、キャンピロバクターの生存は可能かもしれないが分離を妨害する微生物の繁殖スピードが早いので結果的に分離が困難となる可能性が有る。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、従来のキャンピロバクター選択分離用培地には一長一短があり、常在菌の発育を抑制し、目的とするキャンピロバクターのみを選択的に分離培養する培地の提供が望まれていた
特にキャンピロバクター検査の主な検査材料は、大腸菌等の常在菌の塊とも言える糞便である。その中から目的とするキャンピロバクターを検出する為には、常在菌に対しては極めて抑制力が強く、且つキャンピロバクターの発育へは影響が少ない、選択性能の優れた選択剤を含有するキャンピロバクター選択分離用培地が必要である。
【００１５】
本発明は以上のような課題に鑑み、その課題を解決するためになされたものである。その目的は、常在菌の発育を抑制し、キャンピロバクターを選択的に分離培養する培地、つまり選択性能の優れた選択剤を含有するキャンピロバクター選択分離用培地と、これらの培地によるキャンピロバクター分離方法を提供することである。加えてキャンピロバクターの輸送に有用な培地の提供を目的とするものである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
以上のような課題を解決すべく本発明者らは、種々の選択剤を用いて感受性試験を行ない鋭意研究を行った結果、キャンピロバクターの発育や生存を妨げることなく、常在細菌を抑制する選択剤を見出し本発明を完成した。
【００１７】
本発明は、キャンピロバクター属細菌の発育を抑制せず、シュウドモナス属細菌の発育を抑制する選択剤を含むキャンピロバクター選択分離用培地である。本発明で分離の対象とするキャンピロバクターは、キャンピロバクター フェータス(Campylobacter fetus)、キャンピロバクター ジェジュニ(Campyrobacter jejuni)、およびキャンピロバクター コーリ (Campyrobacter coli)等の病原性のものである。これらの病原性キャンピロバクターの中で、C.fetusは公知の選択剤では発育を抑制されることがある。したがってC.fetusの発育をも保証する本発明の選択剤は新規なものである。
【００１８】
本発明の選択分離用培地における選択剤としては、ピペラシリン、セフピラミド、セフタジジム、セフピミゾールの群から選択される少なくとも１種類の抗生物質を挙げられる。これらの抗生物質は塩の形で用いることもできる。また本発明の選択剤は、単独で添加しても良いし複数を組み合わせてもよい。本発明の選択剤の使用濃度は、たとえば次のような濃度範囲を示すことができる。
ピペラシリン：３．１３〜２５mg/l
セフピラミド：３．１３〜２５mg/l
セフタジジム：０．７８〜６．２５mg/l
セフピミゾール：６．２５〜５０mg/l
【００１９】
これらの新規な選択剤に加えて、付加的に公知の選択剤を加えることにより、より完全なキャンピロバクター選択分離用培地とすることができる。公知の選択剤には、バンコマイシン、ポリミキシンＢ、トリメトプリム、そしてアンフォテリシンＢがある。これらの選択剤を本発明の選択剤と組み合わせることにより、シュウドモナスのみならず、グラム陽性細菌や真菌類等の生育を抑え、キャンピロバクターの分離を容易に行うことができる。公知の選択剤はそれぞれ次の濃度で加えると良い。
トリメトプリム：２．５〜１０ mg/L、
ポリミキシンＢ：２，５００〜１０，０００ IU/L、
バンコマイシン：５〜２０ mg/L、
アンフォテリシンＢ：１〜４ mg/L、
【００２０】
本発明の選択剤を必要に応じて公知の選択剤とともに適当な培地に添加することによりキャンピロバクター選択分離用培地とする事ができる。培地には、少なくとも分離対象であるキャンピロバクターの生育を十分に支持する組成を持つ培地が用いられる。具体的には、基礎培地に血液を加えた血液寒天培地が用いられる。血液としてはウマ脱繊維素血液、ウマ脱繊維素溶血液、ヒツジ脱繊維素血液、ヒツジ脱繊維素溶血液等が用いられる。基礎培地としてはキャンピロバクター寒天培地、コロンビア寒天培地、ブルセラ寒天培地、普通寒天培地、ブレインハートインフュージョン寒天培地、およびハートインフュージョン寒天培地等が挙げられる。
【００２１】
一例としてキャンピロバクター寒天培地の一般的な組成を示す。
【化４】

【００２２】
本発明の選択分離用培地は、基礎培地を溶解して高圧蒸気滅菌後、選択剤を血液とともに無菌的に加えることによって調製される。本発明の選択分離用培地は、予め必要な選択剤を添加した状態で流通させることもできる。あるいは、必要量の選択剤だけを別に包装した添加剤を用意しておき、これを利用して用時調製することもできる。
【００２３】
本発明は、前記キャンピロバクター選択分離用培地を用いたキャンピロバクターの分離方法をも提供する。キャンピロバクターの存在が疑われる糞便などの検査材料を本発明の選択分離用培地に接種し、培養後に培地上に生育するコロニーを分離することによりキャンピロバクターを容易に分離することができる。検査材料としては、糞便の他、食品や調理施設から採取したスワブ等の食中毒検査にあたって調査が必要となる検査材料を示すことができる。キャンピロバクターは好気培養や絶対嫌気培養では発育しないので、通常微好気条件下（１０%ＣＯ₂、１０%Ｏ₂、８０%Ｎ₂混合ガス条件下）３５〜３７℃または４２〜４５℃で培養される。このような培養条件は、キャンピロパックのような市販の培養キットを利用すると容易に実現することができる。
【００２４】
また本発明は上記選択剤を加えた輸送用培地を提供する。輸送用培地の形態は、液体、半流動、固形のどの形態でも使用可能である。しかし、キャンピロバクターが微好気的環境を好むことを考えると半流動培地が本発明の輸送用培地には好ましい。半流動培地とは、ゲル化剤として０．３−０．５%の寒天を利用したものである。流動性を維持しているので、培地表面から試料を埋めこむとそのまま培地中に包まれた状態になる。このような特徴により、半流動培地では培地中にサンプルを固定することができると同時に空気との接触状態も容易に制御することができる。つまり培地表面からの距離により好気的環境、微好気的環境、嫌気的環境を選択可能となる。
本発明の輸送用培地を構成する選択剤以外の成分は、たとえば先に例示した選択分離培地のための基礎培地と同じもの（寒天濃度は半流動とする）を利用することができる。
【００２５】
また、本発明は上記薬剤を加えた保存用培地でもあり、キャンピロバクターの培養と同時に保存も兼ねる場合に適する。液体培地、半流動培地（寒天培地）、斜面培地（寒天培地）等のいずれでも可能であり、キャンピロバクターを含む材料を培養後、低温あるいは凍結保存する。常在菌の増殖が抑制されるので保存が良好に行われる。
【００２６】
【作用】
本発明の選択剤は、公知の技術では分離が困難であったシュウドモナスとキャンピロバクターの分離を可能とする。以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明する。
【００２７】
【実施例】
実施例１ 抗菌剤の選択
種々の抗菌性薬剤の文献記載の抗菌スペクトルを検討し、キャンピロバクターが耐性で、かつ常在細菌、特にシュウドモナス属菌が感受性を示すと思われる以下に示す１０種類の抗生物質を選出した。シュウドモナスは、常在細菌の中でもその発育を抑制することが困難とされている代表的な菌種である。
【００２８】
これらの抗生物質についてキャンピロバクターとシュウドモナスの感受性試験を行ない、キャンピロバクターが耐性で、シュウドモナスが感受性の薬剤をスクリーニングした。感受性試験は、ミュラーヒントンＳヒツジ寒天培地‘栄研’（組成は下記のとおり）に菌を塗抹し、微好気的培養を行い、三濃度ディスク法で実施した。シュウドモナスは３７℃で２４時間好気的培養、キャンピロバクターは３７℃で４８時間微好気的培養した。
【００２９】
１）使用培地
【化５】

【００３０】
２）使用薬剤（１０薬剤）
実験に使用した薬剤は以下の１０薬剤である。

【００３１】
３）使用菌株
実験に用いた菌株を以下に示す。
キャンピロバクター：
C.jejuni（３０株）
C.coli（８株）
C.fetus（２株）
シュウドモナス：
Pseudomonas aeruginosa（１株）
【００３２】
４）結果
表１に実験の結果を示した。結果は阻止円の大きさにより判定した。１０薬剤のうち、ピペラシリン、セフピラミド、セフタジジム、セフピミゾールの４薬剤はシュウドモナスが感受性でかつキャンピロバクターは耐性を示し、本発明の目的に合致すると判定した。その他のカルベニシリン、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフメノキシム、セフスロジン、セフトリアキソンの６薬剤は、シュウドモナスが感受性であるが、キャンピロバクターの一部の菌も感受性を示し、本発明には不適当と考えられた。
【００３３】
【表１】

【００３４】
実施例２ 最少発育阻止濃度（ＭＩＣ）
実施例１で選択したピペラシリン、セフピラミド、セフタジジム、およびセフピミゾールの４薬剤について、寒天平板希釈法により各種細菌におけるＭＩＣ値を求めた。常在菌としては、シュウドモナス、大腸菌、プロテウス、クレブシエラ、セラチアを用いた。
１）使用培地
上記４薬剤ピペラシリン（ＰＩＰＣ）、セフピラミド（ＣＰＭ）、セフタジジム（ＣＡＺ）、およびセフピミゾール（ＣＰＩＺ）各々０〜１００mg/Lを、スキロー培地（組成は下記のとおり）に添加して各薬剤のＭＩＣ値を測定した。
【化６】

【００３５】
２）使用菌株
臨床検体より分離し凍結保存された以下の菌株をソイビーンカゼインダイジェストブイヨン培地（ＳＣＤ培地）で前培養し、菌量をキャンピロバクターはマックファーランドNo.1×１０^-2に、その他の細菌はマックファーランド No.1原液に調整して接種した。培養条件は、キャンピロバクターは３７℃で４８時間微好気培養、その他の細菌は３７℃で２４時間好気培養とした。発育を完全に阻止した最少薬剤濃度をその薬剤のＭＩＣ値（μg/ml）とした
使用菌株
キャンピロバクター：
Campylobacter jejuni（３０株） 菌株ＣＪ１〜３０
Campylobacter coli（８株） 菌株ＣＣ１〜８
Campylobacter fetus（２株） 菌株ＣＦ１〜２
シュウドモナス：
Pseudomonas aeruginosa（５株） 菌株ＰＡ１〜５
大腸菌：
Escherichia coli（２株） 菌株ＥＣ１〜２
プロテウス：
Proteus mirabilis（２株） 菌株ＰＭ１〜２
Proteus vulgaris（２株） 菌株ＰＶ１〜２
クレブシエラ：
Klebsiella pneumoniae （４株） 菌株ＫＰ１〜４
セラチア：
Serratia marcescens（３株） 菌株ＳＭ１〜３
【００３６】
２）結果
結果は表２（C.jejuniとC.coli）、表３（C.fetus、Ps.aerginosa、E.coli、P.mirabilis、P.vulgaris、K.pneumoniae、およびS.marcescens）、そして表４に示す。表２と表３の各菌株毎のＭＩＣ値、並びに表４のＭＩＣ分布から、本発明に使用可能な各薬剤の濃度範囲が求められる。例えばＰＩＰＣは３．１３mg/L以上で常在菌の発育を抑制し、５０mg/L以上の濃度でキャンピロバクター菌のどれかの発育を抑制した。従って常在菌の発育を抑制し、目的菌を発育させる使用可能濃度範囲はピペラシリンでは３．１３〜２５mg/L、セフピラミドでは３．１３〜２５mg/L、セフタジジムでは０．７８〜６．２５mg/L、そしてセフピミゾールでは６．２５〜５０mg/Lとなった。
各薬剤ごとのカットオフ値（抑制菌を完全に抑えて、かつ目的菌を抑制しない最適な薬剤濃度）として、ピペラシリン（１２．５mg/L）、セフピラミド（６．２５mg/L）、セフタジジム（１．５６mg/L）、セフピミゾール（２５mg/L）を設定した。
【００３７】
【表２】

【００３８】
【表３】

【００３９】
【表４】

【００４０】
実施例３ 選択剤添加培地の性能確認
実施例２の培地にピペラシリン、セフピラミド、セフタジジム、およびセフピミゾールの各々を加えてキャンピロバクターの発育能、常在菌の抑制能を従来の培地と比較し、培地性能を確認した。各薬剤の添加量は実施例２で求めたカットオフ値に相当する量を添加した。接種した微生物と培養条件は実施例２と同じである。また操作は以下のとおりである。
すなわち、各菌株の前培養後の希釈前の原液を１０⁰とし（菌数は約１０⁸個/ml）、滅菌生理食塩水で１０^-1〜１０^-6まで１０倍連続希釈して、各希釈菌液の０．０２mlをミスラー法にて各平板培地Ａ〜Ｆに接種し培養した。各薬剤の選択性をキャンピロバクターおよび常在菌の発育に対する培地の抑制力で評価した。
【００４１】
１）使用培地
被検培地Ａ：実施例２の培地
被検培地Ｂ：培地Ａ１，０００mlにピペラシリン１２．５mgを添加。
被検培地Ｃ：培地Ａ１，０００mlにセフピラミド６．２５mgを添加。
被検培地Ｄ：培地Ａ１，０００mlにセフタジジム１．５６mgを添加。
被検培地Ｅ：培地Ａ１，０００mlにセフピミゾール２５mgを添加。
対照培地Ｆ：培地Ａから全ての抗菌剤を除いた組成。
【００４２】
２）結果
培養成績を表５に示す。表中の発育乗数の数値は各菌株が発育を示した最終希釈倍数を表わす。抑制力は対照培地Ｆに対する各培地の抑制力の強さの差を表わし、培地の抑制力は次式で算出した。
対照培地（Ｆ）の発育乗数−被検培地（Ａ〜Ｅ）の発育乗数＝培地の抑制力
例えば、対照培地（Ｆ）の発育乗数が−６で被検培地の発育乗数が−２であれば、被検培地の抑制力は−４となり、対照培地Ｆに対して被検培地の発育菌数は１／１０，０００であることを示す。言い換えれば発育乗数で４の差は、発育菌数では１０，０００倍異なることを意味する。また、被検培地の抑制力が０のときは対照培地（Ｆ）と同等の発育であり、菌の発育が抑制されていないことを示す。
【００４３】
表５の結果より、抗菌剤を含まない培地Ｆではすべての菌種が１０^-6濃度で発育した。公知の選択剤としてバンコマイシン、ポリミキシンＢ、トリメトプリム、アンフォテリシンＢを含む培地Ａではキャンピロバクターの発育は３菌種とも１０^-6と良好であった。しかし、発育を抑えたい常在菌には発育する菌と発育が抑制される菌があり、特にシュウドモナス（ＰＡ１−５）、プロテウス・ブルガリス（ＰＶ１−２）、セラチア（ＳＭ１−２）は発育が顕著であった。
これに対し本発明の選択剤としてピペラシリン（１２．５mg/L）、セフピラミド（６．２５mg/L）、セフタジジム（１．５６mg/L）、あるいはセフピミゾール（２５mg/L）を加えた培地Ｂ〜Ｅは、キャンピロバクターに対しては発育を抑制すること無く、培地Ａとの比較で常在菌に対して１０〜１０，０００倍の抑制力を示した。培地Ａにおいて顕著な発育が見られたシュウドモナス、プロテウス ブルガリス、セラチアにおいてもその発育を１０倍以上抑制した。
【００４４】
【表５】

【００４５】
【発明の効果】
特定の選択剤を含有した本発明の選択分離用培地は、キャンピロバクターの発育を抑制することなく、常在菌を強く抑制することが可能な優れた特異的選択性を有する。特に公知の選択剤では発育を抑制されることの有ったC.fetusも、本培地では良好に発育し、確実に分離することが可能である。このため、糞便のように種々の菌が混在する臨床材料から、２４〜４８時間の培養で目的とするキャンピロバクターの検出が可能となる。本培地の提供により食中毒などの保菌者からの菌検出が容易となり、且つ検出率を向上させることができ、医療並びに環境衛生に寄与することができる。
【００４６】
本発明はキャンピロバクターの輸送に有用な新規な培地も提供する。上述の選択剤を含んだ本発明の輸送用培地は、輸送中において共存する常在菌の発育を抑制しつつ、目的であるキャンピロバクターの生存を保証しその検出率を向上させることが可能である。同じような効果は、輸送用培地をキャンピロバクターの保存に用いた場合にも期待できる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a medium for selective separation of Campylobacter.
Campylobacter was discovered in 1913 as a bacterium causing bacterial diarrhea in livestock and humans. It is a gram-negative, monofilamentous spiral fungus, catalase-positive, microaerobic species and catalase-negative, anaerobic. It consists of two bacterial species. (Latest Medical Dictionary, pp 266, Ishiyaku Publishing, 1987). Among them, Campylobacter fetus, Campyrobacter jejuni, and Campyrobacter coli are known as pathogenic bacteria that infect humans. In particular, C. jejuni is known to be orally infected and cause acute enterocolitis with transient bacteremia.
[0002]
Therefore, when a Campylobacter infection is suspected, it is necessary to separate Campylobacter using a patient's stool sample or the like as a test material for a definitive diagnosis. Isolates are also required for drug susceptibility testing to select antimicrobial agents for treatment. A medium for selective separation of Campylobacter is used at this time. The selective separation medium is a generic name for media devised so that only microorganisms to be separated can grow as much as possible. When using a test material that may contain a large amount of a wide range of microorganisms such as a stool sample, the selection performance of the selective separation medium is important. In general, a medium supplemented with an antibacterial compound that acts as a selective agent on the coexisting microorganisms but does not affect the growth of the target microorganism is used as the selective separation medium. Is done. We also know how to use a selective separation medium that is necessary by preparing an additive that contains the necessary amount of special nutrients that promote the growth of the selective agent and the microorganism to be separated in advance and mixing it with a general basal medium. It has been.
[0003]
By the way, inspection materials such as feces must generally be transported to an inspection facility after collection. However, microaerobic or anaerobic microorganisms such as Campylobacter can not obtain correct test results because the number of viable bacteria decreases rapidly in a normal aerobic transportation environment. In transporting such microorganisms, a transport medium capable of maintaining the number of bacteria as much as possible is required. If other bacterial species propagate during transportation, this may result in interference with the separation of microorganisms to be separated, so that a selective agent may be required in the transportation medium. The transport medium can also be used as a storage medium for the microorganism.
[0004]
[Prior art]
As mentioned earlier, it is a well-known fact that Campylobacter is the causative agent of bacterial diarrhea. However, many resident bacteria are contained in the stool of diarrhea patients, and in order to isolate and culture the target Campylobacter from among them, a selective separation medium containing various drugs as a selective agent is used. Must be used. For example, the following intestinal bacteria or fungi exist as resident bacteria that interfere with the isolation culture of Campylobacter.
Glucose fermentation gram-negative bacilli
Escherichia coli
Proteus vulgaris
Proteus mirabilis
Klebsiella pneumoniae
Serratia marcescens and other glucose non-fermenting gram-negative bacilli
Gram-positive cocci such as Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Streptococcus faecalis etc. Gram-positive bacilli etc.
Lactobacillus acidophilus
Bacillus sp.
Candida albicans
Other yeasts, etc. [0005]
Conventionally, various antibacterial agents have been used as selective agents for separating Campylobacter from these resident bacteria. For example, bacitracin, amphotericin B, trimethoprim, vancomycin, polymyxin B sulfate, rifampicin, colistin, cefoperazone and the like are used as selective agents, and various media for Campylobacter have been developed. Specific examples of typical Campylobacter genus selective separation media are listed below.
[0006]
In 1977, Skilow MB devised skilow media (Skirrow MB: Campylobacter enteritis: A new disease, Brit Med J, 2, 2-11, 1977).
The skilow medium is characterized by containing Campylobacter agar medium as a basal medium and containing vancomycin that suppresses gram-positive bacteria as a selective agent, and polymyxin B and trimethoprim that suppress gram-negative bacteria.
[0007]
[Chemical 1]

[0008]
Butler JP et al. Developed a medium for selective isolation of Campylobacter in 1979, and announced a modified Butler medium in 1983 (Goossens H, De Boeck, Butzler JP: A new selective medium for the isolation). of Campylobacter jejuni from human faeces, Eur J Clin Microbiol, 2, 389-394, 1983) (Japanese Patent Publication No. 6-2048).
The Battler medium uses a Columbia agar medium as a basal medium, and contains rifampicin that suppresses Gram-positive bacteria, cefoperazone and colistin that suppress Gram-negative bacteria, and amphotericin B that suppresses fungi as selective agents.
[0009]
[Chemical 2]

[0010]
Furthermore, Blazer MJ et al. Published a blazer medium in 1979 (Blaser MJ, et al .: Campylobacter enteritis: Clinical and Epidemiological Fetures, Annals Internal Medicine, 91, 179-185, 1979).
The blazer medium is characterized in that a brucella agar medium is used as a basic medium, and vancomycin that suppresses Gram-positive bacteria, trimethoprim that suppresses Gram-negative bacteria, polymyxin B / cephalosin, and amphotericin B that suppresses fungi are used as selection agents.
[0011]
[Chemical 3]

[0012]
However, Skillo's medium is good for all Campylobacter growth, but it is not enough to suppress the intestinal bacteria, and many fungi such as Pseudomonas grow and the target Campylobacter Prevent separation. Moreover, since it does not contain an effective selective agent for fungi, it does not have a suppressive power against fungi.
The Battler medium contains an antifungal agent and thus has excellent inhibitory power against fungi, and cefoperazone also has excellent inhibitory power against Pseudomonas. However, cefoperazone may inhibit the growth of C. fetus.
The blazer medium is an improved version of the skilow medium and suppresses fungi, but C. fetus may be suppressed by the action of cephalosin. Furthermore, the suppressive power against Pseudomonas is inferior. (Media Circle, 33, 9-15, 1988)
[0013]
The use of selective agents is important not only in selective separation media but also in transport media. Usually, a transport medium such as a carry brare is used as a general medium for transport of a test material containing intestinal bacteria and the like. As the medium performance required for the transport medium, it is necessary that the target bacteria in the test material are not killed during transport, or other microorganisms that interfere with separation are not propagated unnecessarily. However, when a known selection agent is added to a general transport medium such as carry-blair medium, some campylobacters may not be able to survive because of their sensitivity. On the other hand, when transport is carried out without using a selective agent, although Campylobacter may be viable, the propagation speed of microorganisms that impede separation is high, and as a result, separation may be difficult.
[0014]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, conventional Campylobacter selective separation media have advantages and disadvantages, and it is desired to provide a culture medium that suppresses the growth of resident bacteria and selectively isolates and cultures only the target Campylobacter. In particular, the main test material for the Campylobacter test is feces which can be said to be a mass of resident bacteria such as E. coli. In order to detect the target Campylobacter, it contains a selective agent with excellent selection performance that has extremely strong suppressive power against resident bacteria and has little effect on the growth of Campylobacter. A medium for selective separation of Campylobacter is necessary.
[0015]
In view of the above problems, the present invention has been made to solve the problems. The purpose is to suppress the growth of resident bacteria and selectively isolate and culture Campylobacter, that is, a Campylobacter selective separating medium containing a selective agent with excellent selection performance, and a Campylobacter selective separating medium. It is to provide a Pyrobacter separation method. In addition, the purpose is to provide a medium useful for transport of Campylobacter.
[0016]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present inventors conducted susceptibility tests using various selection agents, and as a result, conducted research on the suppression of resident bacteria without impeding the growth and survival of Campylobacter. The inventors have found a selective agent to complete the present invention.
[0017]
The present invention is a medium for selective separation of Campylobacter comprising a selective agent that does not inhibit the growth of Campylobacter bacteria and suppresses the growth of Pseudomonas bacteria. The Campylobacter to be separated in the present invention is pathogenic such as Campylobacter fetus, Campyrobacter jejuni, and Campyrobacter coli. Among these pathogenic campylobacters, C. fetus may be inhibited from growth with known selective agents. Therefore, the selective agent of the present invention that guarantees the growth of C. fetus is also novel.
[0018]
Examples of the selective agent in the selective separation medium of the present invention include at least one antibiotic selected from the group of piperacillin, cefpiramide, ceftazidime, and cefpimizole. These antibiotics can also be used in the form of salts. Moreover, the selective agent of this invention may be added independently and may combine multiple. The use concentration of the selective agent of the present invention can indicate the following concentration range, for example.
Piperacillin: 3.13-25 mg / l
Cefpyramide: 3.13-25 mg / l
Ceftazidime: 0.78 to 6.25 mg / l
Cefupimole: 6.25-50 mg / l
[0019]
In addition to these novel selective agents, a known complete selective agent can be added to provide a more complete Campylobacter selective separation medium. Known selection agents include vancomycin, polymyxin B, trimethoprim, and amphotericin B. By combining these selective agents with the selective agent of the present invention, growth of not only Pseudomonas but also Gram-positive bacteria and fungi can be suppressed, and Campylobacter can be easily separated. Known selective agents may be added at the following concentrations.
Trimethoprim: 2.5-10 mg / L,
Polymyxin B: 2,500 to 10,000 IU / L,
Vancomycin: 5-20 mg / L,
Amphotericin B: 1-4 mg / L,
[0020]
A selective medium for Campylobacter can be obtained by adding the selective agent of the present invention to a suitable medium together with a known selective agent as necessary. As the medium, a medium having a composition that sufficiently supports at least the growth of Campylobacter to be separated is used. Specifically, a blood agar medium in which blood is added to a basal medium is used. As blood, equine defibrinated blood, equine defibrinated blood, sheep defibrinated blood, sheep defibrinated blood, and the like are used. Examples of the basal medium include Campylobacter agar medium, Columbia agar medium, Brucella agar medium, ordinary agar medium, brain heart infusion agar medium, heart infusion agar medium, and the like.
[0021]
As an example, the general composition of Campylobacter agar is shown.
[Formula 4]

[0022]
The selective separation medium of the present invention is prepared by dissolving a basal medium, autoclaving and then aseptically adding a selective agent together with blood. The selective separation medium of the present invention can be distributed in a state where a necessary selective agent is added in advance. Alternatively, an additive in which only a necessary amount of a selective agent is separately packaged is prepared and can be prepared at the time of use.
[0023]
The present invention also provides a method for separating Campylobacter using the Campylobacter selective separation medium. Campylobacter can be easily separated by inoculating a test medium such as stool suspected of having Campylobacter on the selective separation medium of the present invention and separating colonies that grow on the medium after culture. As inspection materials, in addition to feces, inspection materials that need to be investigated in food poisoning inspections such as swabs collected from foods and cooking facilities can be shown. Campylobacter does not grow in aerobic culture or absolute anaerobic culture, so it is usually 35-37 ° C. or 42-45 under slightly aerobic conditions (10% CO ₂ , 10% O ₂ , 80% N ₂ mixed gas conditions). Incubate at ℃. Such a culture condition can be easily realized by using a commercially available culture kit such as a Campyro pack.
[0024]
The present invention also provides a transport medium to which the above selective agent is added. As the form of the transport medium, any form of liquid, semi-fluid, and solid can be used. However, considering that Campylobacter prefers a microaerobic environment, a semi-fluid medium is preferred for the transport medium of the present invention. A semi-fluid culture medium uses 0.3-0.5% agar as a gelling agent. Since the fluidity is maintained, when the sample is embedded from the surface of the medium, it is wrapped in the medium as it is. With such a feature, in the semi-fluid medium, the sample can be fixed in the medium, and at the same time, the contact state with air can be easily controlled. That is, an aerobic environment, a microaerobic environment, and an anaerobic environment can be selected according to the distance from the medium surface.
As the components other than the selective agent constituting the transport medium of the present invention, for example, the same basal medium as described above for the selective separation medium (the agar concentration is semi-fluid) can be used.
[0025]
Further, the present invention is also a preservation medium to which the above-mentioned drug is added, and is suitable for the case where the preservation is performed simultaneously with the cultivation of Campylobacter. Any of liquid medium, semi-fluid medium (agar medium), slant medium (agar medium) and the like can be used. After culturing a material containing Campylobacter, it is stored at a low temperature or frozen. Since the growth of resident bacteria is suppressed, preservation is performed well.
[0026]
[Action]
The selective agent of the present invention enables separation of Pseudomonas and Campylobacter, which was difficult to separate by known techniques. Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples.
[0027]
【Example】
Example 1 Selection of Antibacterial Agents The antibacterial spectrum described in the literature of various antibacterial agents was examined, and 10 types shown below, which Campylobacter is resistant and resident bacteria, particularly Pseudomonas sp. Antibiotics were selected. Pseudomonas is a representative species that is considered difficult to suppress its growth among resident bacteria.
[0028]
These antibiotics were tested for susceptibility to Campylobacter and Pseudomonas, and Campylobacter was resistant and Pseudomonas sensitive. The susceptibility test was carried out using the three-concentration disc method by smearing bacteria on Mueller Hinton S sheep agar medium “Eiken” (composition is as follows), performing microaerobic culture. Pseudomonas was aerobically cultured at 37 ° C for 24 hours, and Campylobacter was slightly aerobically cultured at 37 ° C for 48 hours.
[0029]
1) Medium used [Chemical formula 5]

[0030]
2) Drugs used (10 drugs)
The following 10 drugs were used in the experiment.

[0031]
3) The strains used in the strain experiments are shown below.
Campylobacter:
C.jejuni (30 shares)
C.coli (8 shares)
C.fetus (2 shares)
Pseudomonas:
Pseudomonas aeruginosa (1 share)
[0032]
4) Results Table 1 shows the results of the experiment. The result was judged by the size of the inhibition circle. Of the 10 drugs, 4 drugs, piperacillin, cefpiramide, ceftazidime, and cefpimizole, were sensitive to Pseudomonas and resistant to Campylobacter, and were judged to meet the purpose of the present invention. Six other drugs, carbenicillin, cefotaxime, ceftizoxime, cefmenoxime, cefsulodin, and ceftriaxone, are sensitive to Pseudomonas, but some fungi of Campylobacter were also considered to be inappropriate for the present invention. .
[0033]
[Table 1]

[0034]
Example 2 Minimum Growth Inhibitory Concentration (MIC)
For the four drugs selected in Example 1, piperacillin, cefpiramide, ceftazidime, and cefpimizole, MIC values in various bacteria were determined by the agar plate dilution method. As the resident bacteria, Pseudomonas, E. coli, Proteus, Klebsiella, and Serratia were used.
1) Medium used The above four drugs piperacillin (PIPC), cefpiramide (CPM), ceftazidime (CAZ), and cefpimizole (CPIZ) 0-100 mg / L each are added to a skilow medium (composition is as follows) to each drug. The MIC value of was measured.
[Chemical 6]

[0035]
2) Strains The following strains that were isolated from clinical specimens and cryopreserved were pre-cultured in soy bean casein digest broth medium (SCD medium), and the amount of Campylobacter was set to Macfarland No. 1 × 10 ^-2 Other bacteria were inoculated in the McFarland No. 1 stock solution. The culture conditions were Campylobacter aerobic culture at 37 ° C. for 48 hours, and other bacteria aerobic culture at 37 ° C. for 24 hours. Strain Campylobacter strain used with the minimum drug concentration that completely prevented growth as the MIC value (μg / ml) of the drug:
Campylobacter jejuni (30 strains) Strain CJ1-30
Campylobacter coli (8 strains) Strain CC1-8
Campylobacter fetus (2 strains) Strain CF1-2
Pseudomonas:
Pseudomonas aeruginosa (5 strains) Strain PA1-5
E. coli:
Escherichia coli (2 strains) Strain EC1-2
Proteus:
Proteus mirabilis (2 strains) Strain PM1-2
Proteus vulgaris (2 strains) Strain PV1-2
Klebsiella:
Klebsiella pneumoniae (4 strains) Strain KP1-4
Serratia:
Serratia marcescens (3 strains) Strain SM1-3
[0036]
2) Results are shown in Table 2 (C. jejuni and C. coli), Table 3 (C. fetus, Ps. Aerginosa, E. coli, P. mirabilis, P. vulgaris, K. pneumoniae, and S. marcescens), And it shows in Table 4. From the MIC value for each strain in Tables 2 and 3 and the MIC distribution in Table 4, the concentration range of each drug that can be used in the present invention is determined. For example, PIPC suppressed the growth of resident bacteria at a concentration of 3.13 mg / L or higher, and suppressed the growth of any of Campylobacter bacteria at a concentration of 50 mg / L or higher. Therefore, the range of usable concentrations that suppress the growth of resident bacteria and grow the target bacteria is 3.13 to 25 mg / L for piperacillin, 3.13 to 25 mg / L for cefpiramide, and 0.78 to 6.25 mg / L for ceftazidime. With L and cefpimizole, it was 6.25 to 50 mg / L.
The cut-off values for each drug (optimum drug concentration that completely suppresses the suppressive bacteria and does not suppress the target bacteria) include piperacillin (12.5 mg / L), cefpiramide (6.25 mg / L), ceftazidime (1 .56 mg / L) and cefpimizole (25 mg / L) were set.
[0037]
[Table 2]

[0038]
[Table 3]

[0039]
[Table 4]

[0040]
Example 3 Confirmation of performance of selective agent-added medium Piperacillin, cefpiramide, ceftazidime, and cefpimizole were added to the medium of Example 2 to compare the growth ability of Campylobacter and the ability to suppress resident bacteria compared to the conventional medium. The medium performance was confirmed. The amount of each drug added was equivalent to the cut-off value determined in Example 2. The inoculated microorganism and the culture conditions are the same as in Example 2. The operation is as follows.
Namely, a stock solution before dilution before after culture of each strain was 10 ⁰ (number of bacteria about ¹⁰⁸ cells ^{/ ml), 10 -1 ~10 -6} 10 fold serially diluted up with sterile saline, the 0.02 ml of the diluted bacterial solution was inoculated into each plate medium A to F by the Mysler method and cultured. The selectivity of each drug was evaluated by the inhibitory power of the medium against the growth of Campylobacter and resident bacteria.
[0041]
1) Medium used Test medium A: Medium test medium B of Example 2 12.5 mg of piperacillin was added to 1,000 ml of medium A.
Test medium C: 6.25 mg of cefpiramide was added to 1,000 ml of medium A.
Test medium D: 1.56 mg of ceftazidime was added to 1,000 ml of medium A.
Test medium E: 25 mg of cefpimizole was added to 1,000 ml of medium A.
Control medium F: Composition obtained by removing all antibacterial agents from medium A.
[0042]
2) Results Culture results are shown in Table 5. The numerical value of the growth multiplier in the table represents the final dilution factor at which each strain showed growth. The inhibitory power represents the difference in the strength of the inhibitory power of each medium relative to the control medium F, and the inhibitory power of the medium was calculated by the following equation.
Growth multiplier of control medium (F)-Growth multiplier of test medium (AE) = Medium inhibitory capacity For example, the growth multiplier of control medium (F) is -6 and the growth multiplier of test medium is -2. For example, the suppressive power of the test medium is −4, and the growth number of the test medium is 1 / 10,000 relative to the control medium F. In other words, a difference of 4 in the growth multiplier means that the number of growth bacteria is 10,000 times different. Moreover, when the inhibitory power of a test culture medium is 0, it is growth equivalent to a control culture medium (F), and it shows that the growth of a microbe is not suppressed.
[0043]
From the results shown in Table 5, all the bacterial species grew at a concentration of 10 ^{−6 in} medium F containing no antibacterial agent. In medium A containing vancomycin, polymyxin B, trimethoprim, and amphotericin B as known selection agents, the growth of Campylobacter was good at 10 ^-6 for all three bacterial species. However, the resident bacteria that want to suppress the growth include those that grow and those that are inhibited from growth, especially Pseudomonas (PA1-5), Proteus vulgaris (PV1-2), Serratia (SM1-2) Was remarkable.
On the other hand, culture media B to E supplemented with piperacillin (12.5 mg / L), cefpiramide (6.25 mg / L), ceftazidime (1.56 mg / L), or cefpimizole (25 mg / L) as selective agents of the present invention. Showed a 10 to 10,000-fold inhibitory power against resident bacteria in comparison with Medium A without inhibiting growth against Campylobacter. Also in Pseudomonas, Proteus bulgaris, and Serratia where remarkable growth was observed in the medium A, the growth was suppressed 10 times or more.
[0044]
[Table 5]

[0045]
【The invention's effect】
The selective separation medium of the present invention containing a specific selective agent has excellent specific selectivity capable of strongly suppressing resident bacteria without suppressing the growth of Campylobacter. In particular, C. fetus, whose growth has been suppressed with known selective agents, can grow well in this medium and can be reliably separated. For this reason, the target Campylobacter can be detected from a clinical material in which various bacteria are mixed, such as feces, by culturing for 24 to 48 hours. The provision of this medium facilitates detection of bacteria from carriers such as food poisoning, can improve the detection rate, and can contribute to medical care and environmental sanitation.
[0046]
The present invention also provides a novel medium useful for the transport of Campylobacter. The transport medium of the present invention containing the above-mentioned selective agent can guarantee the survival of the target Campylobacter and improve its detection rate while suppressing the growth of resident bacteria that coexist during transport. It is. A similar effect can be expected when the transport medium is used for the preservation of Campylobacter.

Claims (10)

  Campylobacter selective separation medium containing cefpimizole as a selective agent that does not inhibit the growth of Campylobacter spp. But suppresses the growth of Pseudomonas spp.   The medium for selective separation of Campylobacter according to claim 1, wherein the concentration of cefpimizole is 6.25 to 50 mg / L. The medium for selective separation of Campylobacter according to claim 1 , further comprising at least one antibiotic selected from piperacillin, cefpiramide, and ceftazidime as a selective agent. 4. The medium for selective separation of Campylobacter according to claim 3, wherein the concentration of each selective agent is in the following range: 3.13 to 25 mg / L
Cefpyramide: 3.13-25 mg / L
Ceftazidime: 0.78 to 6.25 mg / L The medium for selective separation of Campylobacter according to claims 1 to 4, further comprising any antibacterial agent selected from trimethoprim, polymyxin B, vancomycin, and amphotericin B as a selective agent.   The medium for selective separation of Campylobacter according to claims 1 to 5, wherein the genus Campylobacter is Campylobacter fetus, Campylobacter jejuni, and Campylobacter coli. A method for separating Campylobacter comprising the following steps a) -b): a) inoculating a sample of Campylobacter selective separation medium of claim 1 with a sample suspected of the presence of Campylobacter b) growing on the medium To separate colonies   Campylobacter transport medium containing cefpimizole as a selective agent that does not suppress the growth of Campylobacter bacteria and suppresses the growth of Pseudomonas bacteria   The medium for transporting Campylobacter according to claim 8, which is a semi-fluid medium.   A method for transporting Campylobacter, characterized by embedding a sample in a semi-fluid medium containing cefpimizole as a selective agent that does not inhibit the growth of Campylobacter spp. And suppresses the development of Pseudomonas spp.