JP3864044B2 - ATP inspection method by bioluminescence - Google Patents

Description

【０００４】
しかしながら、上記蛍光発光の測定では、発光の安定性が悪く、発光が非常に短時間に消失するという欠点を有しており、感度と精度を獲得するため、反応時間の厳密な制御と、短時間で消失する発光を捕らえるための特別なルミノメータの使用を必要とする問題点がある。
【０００５】
そこで、特開平8-47399号公報には、「ルシフェラーゼにより発生する生物発光を測定する方法において、ポリリン酸化合物又はその塩、及びスルフヒドリル化合物の共存下で生物発光反応を行う」ことを特徴とする技術が開示されている。これにより、生物発光の増強という新規な効果を得られ、一般的なルミノメータの使用により生物発光反応の測定が可能で、普及率が高まるという効果がある。特開平8-47399号でのポリリン酸化合物とは３個程度のリン酸基が結合した化合物である。
【０００６】
しかしながら、上記特開平8-47399に開示される方法は、ＡＴＰの新たな再生系がないため、ＡＴＰが消費されるに従い、経時的に発光が減衰する欠点を有する。従って、発光量をそのまま減衰することがなく安定に持続するためには、基質濃度、酸素濃度、ＰＨ、温度の検討を余儀なくされる。
【０００７】
ところで、特開平9-234099号には、以下の反応式で示される生物発光法によるサイクリックＡＭＰの定量法が開示されている。
【化２】

【０００８】
この方法は、サイクリックＡＭＰをサイクリック３’,５’−ヌクレオチドホスホジエステラ−ゼで加水分解して反応系にＡＭＰを生成せしめる（反応１）と、マグネシウムイオン、アデニレートキナーゼ存在下で、該ＡＭＰを微量のＡＴＰと反応させてＡＤＰに変換せしめる（反応２）と、マグネシウムイオン、ホスホエノールピルビン酸の存在下で、該ＡＤＰをピルビン酸キナーゼと反応させて、ＡＴＰ及びピルビン酸に変換せしめる（反応３）と、ルシフェリン、マグネシウムイオン（又は他の金属イオン）及び溶存酸素の存在下で、ＡＴＰをルシフェラーゼと反応させ発光を生成せしめる（反応４）と、（反応４）で生成した発光量を測定することによりサイクリックＡＭＰを定量する方法（METHODS
IN ENZYMOLOGY 38,62-65;1974）を特徴としている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、この方法は、サイクリックＡＭＰから変換されたＡＭＰを、ＡＤＰに変換し、さらに該ＡＤＰをホスホエノールピルビン酸の存在下でピルビン酸キナーゼの反応によりＡＴＰとするため、以下のような問題点があった。すなわち、以下の構造式で示されるホスホエノールピルビン酸は、１分子にリン酸基が１個しか含まれておらず、ＡＤＰからＡＴＰへの変換が不十分となり、ＡＴＰを大量に再生するにはホスホエノールピルビン酸を大量に補給しなければならなかった。このようにホスホエノールピルビン酸を大量に補給するのは、不経済であった。
【００１０】
【化３】

【００１１】
また、ホスホエノールピルビン酸は熱に非常に弱く分解されやすい性質があり、炊飯工場などで炊きあがったばかりのご飯を被検査物とする場合（例えば、品温が摂氏６０〜７０℃程度の被検査物に対し、耐熱性の酵素を用いて測定するとよい。）、ホスホエノールピルビン酸を含む試薬を被検査物に投与すると、リン酸基が分解されてＡＤＰからＡＴＰへの変換が不十分となることがある。つまり、ＡＴＰによる蛍光発光の安定性が悪く、発光が非常に短時間に消失する虞（おそれ）がある。
【００１２】
さらに、被検査物中には、複数種類の細菌が存在するが、この細菌中にホスホエノールピルビン酸を分解する酵素が存在すると、リン酸基が補給されず、ＡＤＰからＡＴＰへの変換が不十分となる虞がある。
【００１３】
ところで、ＡＴＰの再生反応系を利用して安価にＡＴＰを製造する方法としては、特公昭５３−５７５２や、再公表特許ＷＯ９８／４８０３１に開示されたものが知られている。
【００１４】
特公昭５３−５７５２のＡＴＰの製造法は、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ポリリン酸、ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）及びアデニル酸キナーゼ（ＡＤＫ）を含有する溶液を反応せしめることを特徴とするものである。
【００１５】
これにより、ＡＤＰ１分子とポリリン酸をＰＰＫの存在下で反応させてＡＴＰ１分子を生成せしめ、該ＡＴＰ１分子とＡＭＰ１分子をＡＤＫの存在下で反応させてＡＤＰ２分子を生成せしめた後、該ＡＤＰ２分子から再びＰＰＫの存在下でポリリン酸との反応によってＡＴＰ２分子を生成せしめることができるというものである。
【００１６】
しかしながら、上記特公昭５３−５７５２の製造法では、少量のＡＤＰが存在して初めてＡＴＰの再生反応系が確立されるものである。つまり、微量のＡＴＰの存在を検出し、清浄度を検査したり、食物の鮮度を測定することに応用できるものではなかった。
【００１７】
一方、再公表特許ＷＯ９８／４８０３１のＡＴＰの製造法は、ＡＭＰにＰＰＫ、ＡＤＫ及びポリリン酸を作用せしめることを特徴とするものである。
【００１８】
これにより、ＡＴＰを使用する酵素反応系において、高価なＡＴＰを添加するのではなく、安価なＡＭＰからＡＴＰが製造され、或いは、消費されたＡＴＰを効率的に再生されるものである。
【００１９】
このＡＴＰの製造法においては、ＡＴＰの添加の有無に関わらず、安価なＡＭＰからＡＴＰが製造されるという反応であるので、微量ＡＴＰの存在を検出し、清浄度を検査したり、食物の鮮度を測定することに応用できるものではない。
【００２０】
本発明は、上記問題点にかんがみ、ＡＴＰの再生反応系を利用して微量ＡＴＰの存在を検出し、食品工場などで目に見えない微生物を検出して清浄度を検査したり、食肉、鮮魚、野菜など食物の鮮度を測定することに応用できる生物発光によるアデニンヌクレオチドの検出方法を提供することを技術的課題とする。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため本発明は、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）をルシフェラーゼ及び溶存酸素の存在下でルシフェリンと反応させてＡＭＰ（アデノシン一リン酸）及び発光を生成せしめ、生成した発光量を測定することによりＡＴＰを検出する方法において、被検査物中に存在する微量の汚れ由来ＡＴＰを、ルシフェラーゼ及び溶存酸素の存在下でルシフェリンと反応させてＡＭＰ及び発光を生成せしめる第１反応と、該第１反応で生成した前記ＡＭＰを、ＡＤＫ（アデニレイトキナーゼ）の存在下で前記ＡＴＰと反応させてＡＤＰ（アデノシン二リン酸）を生成させる第２反応と、該第２反応で生成した前記ＡＤＰを、ポリリン酸合成酵素であるＰＰＫ（ポリリン酸キナーゼ）の存在下で、化学合成により生成されたポリリン酸化合物であってリン酸基数 n が１０〜１００個直鎖状に重合したポリリン酸（ poly Ｐ n ； n ＝１０〜１００）又はバクテリア由来のポリリン酸化合物であってリン酸基数 n が１０〜１０００個直鎖状に重合したポリリン酸（ poly Ｐ n ； n ＝１０〜１０００）と反応させてＡＴＰとリン酸基数ｎが１つ減少したポリリン酸（polyＰn-1）を生成させる第３反応とからなり、前記第１反応から第３反応を繰り返し実行させることにより、前記第１反応によって消費されたＡＴＰを前記第２反応及び第３反応によって再生させ、前記第１反応による発光量を持続させて該発光量を計測するものである。
【００２２】
これにより、ＡＤＰからＡＴＰに変換せしめるＡＴＰの再生反応系においてポリリン酸化合物及びポリリン酸合成酵素（下記[化４]に示すようにポリリン酸とＡＤＰが存在する場合ＡＴＰを合成し、ＡＤＰが存在せずにＡＴＰが過剰に存在する場合ポリリン酸を合成する性質をもつ。）を添加して反応させるので、ＡＴＰの再生反応系を利用して生物発光の光量の増強効果を得るとともに、発光時間を持続させるので、微量のＡＴＰであってもその存在を検出し、食品工場などで目に見えない微生物を検出して清浄度を検査したり、食肉、鮮魚、野菜など食物の鮮度を測定することに応用できる生物発光によるＡＴＰの検査方法の提供が可能となる。
【００２３】
また、前記ポリリン酸化合物は、化学合成により生成されたポリリン酸化合物であって、少なくとも１０〜１００個のリン酸基（ＰＯ３基）が直鎖状に重合したものを用いるとよい。これにより、ポリリン酸化合物の１分子中にリン酸基が少なくとも１０〜１００個含まれているので、ＡＤＰからＡＴＰへの変換が容易に行われ、ＡＴＰを再生する際の補給が少量となり経済的になる。さらに、ポリリン酸化合物が熱にさらされた場合であっても、リン酸基が直鎖状に重合しているので、耐熱性があり、品温が摂氏６０〜７０℃程度の被検査物に対しても測定が可能となる。そして、リン酸基が直鎖状に重合しているため、細菌中に存在する酵素によっても分解されにくい。
【００２４】
そして、前記ポリリン酸化合物として、バクテリア由来のポリリン酸化合物を用いる場合には、少なくとも１０〜１０００個のリン酸基が直鎖状に重合したものを用いると、少なくとも１０〜１０００個のリン酸基が直鎖状に重合しているので、耐熱性、耐菌性が向上する。
【００２５】
さらに、前記ポリリン酸化合物は、ポリリン酸合成酵素の触媒作用により、ＡＴＰから生合成すれば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化合物を安価に生成することが可能となる。
【００２６】
また、前記ポリリン酸合成酵素は、不純物を除去して精製したもの、特に、酵素に由来するＡＴＰ及びＡＤＰを除去すると、酵素に由来するＡＴＰによるＡＴＰ再生反応系の増幅は除去され、微量の汚れ由来ＡＴＰの存在があって初めてＡＴＰ再生反応系の増幅が行われるので、清浄度検査の精度がより向上する。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態を説明する。まず、本発明の生物発光反応の測定法は次の反応式で表される。
【００２８】
【化４】

【００２９】
上記反応において、（１）のようにＡＴＰ、ルシフェラーゼ、溶存酸素（図示せず）及び酵素の失活抑制を目的としたマグネシウムイオンなど金属イオン（図示せず）に、ルシフェリンを作用させると、ＡＭＰ、ピロリン酸、オキシルルシフェリン、炭酸ガス（図示せず）及び光を生成する第１反応（２）が行われ、このルシフェラーゼにより発生する光を測定することで、汚れの指標成分であるＡＴＰを検出し、食品工場などの清浄度判定をすることができる。
【００３０】
次に、生成されるＡＭＰからＡＴＰへの新たな再生系であるが、汚れ由来ＡＴＰと生成されるＡＭＰとをアデニレートキナーゼ（ＡＤＫ）の存在下で反応させてＡＤＰに変換せしめる第２反応（３）と、酵素の失活抑制を目的としたマグネシウムイオンなど金属イオン（図示せず）、ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）の存在下で、前記ＡＤＰをポリリン酸化合物（ polyP ｎ）と反応させて、ＡＴＰ及びポリリン酸化合物（polyPｎ-１）に変換せしめる第３反応（４）とからなる。
【００３１】
この反応の要点について以下に述べる。まず、反応（１）によりＡＴＰが消費されて、発光し、反応（２）でＡＭＰが生成するが、このＡＭＰは反応（３）によりＡＤＰに変換された後、反応（４）ではＡＤＰがＡＴＰに再生される。そして、このＡＴＰは再び反応（１）に供され、ＡＴＰが消費されて発光する。ＡＴＰのうち、汚れ由来ＡＴＰは反応（３）に供され（５）、ＡＭＰからＡＤＰの変換に利用される。以下、ＡＴＰの消費系となる反応（１）（２）と、ＡＴＰの再生系となる反応（３）（４）（５）とが同時に連続的に繰り返し行われる。このＡＴＰの消費系とＡＴＰの再生系において生成する発光は、生物発光の光量の増強効果を得るとともに、発光時間を持続させることができ、１０分間以上にわたって安定であり、１時間以上経過後も殆ど減衰することなく安定であることが確認されている。
【００３２】
ところで、前記ＡＴＰの再生系となる反応のうち、ＡＤＰからＡＴＰに変換せしめる第３反応（４）においては、ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）の存在下で、ポリリン酸化合物（polyPｎ）と前記ＡＤＰとを反応させると、ポリリン酸化合物からリン酸基が１個消費されて、ＡＴＰ及びポリリン酸化合物（polyPｎ-１）に変換せしめる。このとき、ポリリン酸化合物としては、化学合成により生成されたポリリン酸化合物であって、少なくとも１０以上のリン酸基が直鎖状に重合したものでなければ、反応に寄与しない。
【００３３】
つまり、ポリリン酸化合物（polyPｎ）として１０≦ｎ≦１００のものを用いると、１分子中にリン酸基が少なくとも１０〜１００個含まれているから、ＡＤＰからＡＴＰへ変換する際に、リン酸基が不足することはなく変換がスムーズに行われる。このため、リン酸基の供給が少量となり経済的になる。
【００３４】
さらに、ポリリン酸化合物が熱にさらされた場合であっても、リン酸基が直鎖状に重合しているので、耐熱性があり、品温が摂氏６０〜７０℃程度の被検査物に対しても測定が可能となる。そして、リン酸基が直鎖状に重合しているため、細菌中に存在する酵素であっても分解されにくい。
【００３５】
例えば、本発明で用いられるポリリン酸化合物（polyP_n）は、以下の構造式によって表される。ここで（polyPｎ）は１０≦ｎ≦１００の範囲が好ましい。
【００３６】
【化５】

【００３７】
前記ポリリン酸化合物は、バクテリア由来のポリリン酸化合物の場合には、少なくとも１０〜１０００個のリン酸基が直鎖状に重合したものを用いると、１０〜１０００個のリン酸基が重合しているので、耐熱性、耐菌性が向上する。
【００３８】
ポリリン酸合成酵素の触媒作用により、ＡＴＰから生合成すれば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化合物を安価に生成することが可能となる。例えば、以下の反応式に示すようにポリリン酸化合物を、ＡＴＰから生合成する。
【００３９】
【化６】

【００４０】
上記反応式によるポリリン酸化合物の生合成は、例えば、特開平5-153993号公報などに開示された従来のポリリン酸の製造方法を利用すればよい。本実施形態では、ポリリン酸合成酵素を触媒として、ポリリン酸合成酵素とＡＴＰと酵素の失活抑制を目的としたマグネシウムなどの金属イオンとを反応させ、ポリリン酸化合物を生合成する。本実施形態に使用されるポリリン酸合成酵素はポリリン酸化合物を生合成し得るものであればよい。
【００４１】
なお、本実施の形態においては、ＡＴＰの検査方法を主として述べたが、ＡＴＰ単独の検査に限定されることはなく、ＡＤＰやＡＭＰの混合物などの検査方法に応用されるものである。これにより、食肉、鮮魚、野菜など食物の鮮度を測定することにも応用することができる。
【００４２】
【実施例１】
ＡＴＰ再生反応系あり（本発明）と、ＡＴＰ再生反応系なし（従来技術）とを比較するため、以下の条件で発光の経時的変化を調べた。
【００４３】
Ｉ．ＡＴＰ再生反応系ありの場合
（イ）ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）1000Ｕ（ユニット）
（ロ）アデニレートキナーゼ（ＡＤＫ）22000Ｕ（ユニット）
（ハ）ポリリン酸化合物（PolyP）260μＭ（濃度）
（ニ）ＡＴＰ1.65μＭ（濃度）
小計 ２５μｌ（容量）
（ホ）バイオルミネエッセンスキット２５μｌ（容量）
（べーリンガーマンハイム社製）
合計 ５０μｌ（容量）
上記（イ）〜（ハ）の再生反応系に必要な試料と、（ニ）の被検査物となるＡＴＰとを容量が２５μｌとなるように混合する。そして、この混合物を、温度３７℃の条件の下、（ホ）のバイオルミネエッセンス（ルシフェリン、ルシフェラーゼを主成分とする生物発光試薬）２５μｌと反応させ、生成する発光量をルミノメータ（アマシャムファルマシアバイオテック社製）にて測定し、発光の経時的変化を調べた。発光量の測定は、反応開始後１００分間にわたって、反応させ、１０分間隔で発光量を測定する方法により行った。
【００４４】
ＩＩ．ＡＴＰ再生反応系なしの場合
再生反応が起こらないように上記（ロ）の試料を除いた試料と、上記（二）の被検査物となるＡＴＰとを容量が２５μｌとなるように混合する。そして、この混合物を、上記（ホ）のバイオルミネエッセンス（ルシフェリン、ルシフェラーゼを主成分とする生物発光試薬）２５μｌと反応させ、生成する発光量をルミノメータ（アマシャムファルマシアバイオテック社製）にて測定し、発光の経時的変化を調べた。発光量の測定は、上記と同様の方法により行った。
【００４５】
上記Ｉ．の結果及びＩＩ．の結果を図１に示す。この結果から、ＡＴＰ再生反応なしの場合、反応の初期に発光量がピークに達し、１０分経過後には１／３に減少し、以下、経時的に徐々に減少する。従って、従来の測定法では精巧なルミノメータが必要となることが分かる。これに対し、ＡＴＰ再生反応系ありの本発明の場合、反応後２０分経過後は発光量が１０倍にも達し、発光量が増強されるとともに、高水準のまま、減衰することなく長時間（３０分以上）安定していることが分かる。従って、本発明では、精巧なルミノメータを用いれば、わずかな量のＡＴＰでも検出することができ、食品検査、衛生検査の精度を向上することが可能である。一方、食品検査、衛生検査において、従来のＡＴＰの検出範囲内で基準を満たしてあれば、高価な高精度ルミノメータを使用するのではなく、安価でかつ簡単なルミノメータによりＡＴＰを検出することができる。
【００４６】
上記ＡＴＰ再生反応の実施例においては、（二）のＡＴＰ（１．６５μＭ濃度）の混入により初めてＡＴＰ酸再生反応が起こることが分かる。つまり、微量の汚れ由来ＡＴＰが存在して初めてＡＴＰ再生反応が起こるのである。しかしながら、上記[化６]に示すように、ポリリン酸合成酵素には、酵素に由来するＡＴＰやＡＤＰが混入されており、ＡＴＰやＡＤＰを除去した純粋なポリリン酸合成酵素であれば、微量の汚れ由来ＡＴＰが存在なくしてはＡＴＰ再生反応が起こらないのである。これを以下の実施例により証明する。
【００４７】
【実施例２】
まず、ポリリン酸合成酵素の精製とＡＤＰの除去を行う。
Ｉ．ポリリン酸合成酵素の精製（ＰＰＫ［１］）工程
(1).まず、大腸菌MV1184(pBC10:ppk)を培養する。
(2).本培養を開始して、2.5時間後にIPTGを0.5mM添加してポリリン酸合成酵素を誘導する。
(3).2時間後集菌して60mlのTris/HCL+sucroseバッファーに懸濁する。
(4).これを-80℃で凍結し、一晩かけて氷上で融解させる。
(5).次に、250μg/lリゾチームを加えて溶菌させる。
(6).超音波処理を行う。
(7).DNase70units/μl，Rnase10mg/lを10μl加える。
(8).高速遠心で未破砕菌体を除去する。
(9).上澄の液量をはかり、それに対して0.2g/lの硫酸アンモニウムを加える。
(10).遠心にて酵素を沈殿させ、リン酸緩衝液を加えて溶解させる。
(11).0.2μmのフィルターで微粒子を除き、疎水クロマトグラフィー（Phenyl Separose HP）、イオン交換クロマトグラフィー（MonoS5/5）にて精製する。
(12).SDS-PAGE上でほぼ単一のバンドが得られる。
【００４８】
ＩＩ．ポリリン酸合成酵素からのＡＤＰの除去（ＰＰＫ［２］）工程
(1).Ｉ．により精製した大腸菌ポリリン酸キナーゼ200μl（５×１０^３units,12μg）を0.1mMのポリリン酸と混合し、37℃で10分保温する（酵素に結合しているＡＤＰがＡＴＰへ変換され、遊離する）。
(2).精製したポリリン酸分解酵素（５×１０^５units）を加えて、37℃で10分保温する（残りのポリリン酸を除去する、このステップがないとポリリン酸合成酵素がカラムから溶出されない）。
(3).スマートシステム（MonoS）を使って精製する。
【００４９】
上記の精製されたポリリン酸合成酵素（ＰＰＫ［１］）を用いて、以下の条件でＡＴＰ添加(+ATP)と、ＡＴＰ無添加(-ATP)の発光の経時的変化を調べた（図２(a)参照）。
【００５０】
Ｉ．精製ポリリン酸合成酵素（ＰＰＫ［１］）を使用した場合の条件
（イ）ＰＰＫ［１］120Ｕ（ユニット）
（ロ）ＡＤＫ90Ｕ（ユニット）
（ハ）PolyP900μＭ（濃度）
（ニ）ＡＭＰ600μＭ（濃度）
（ホ）＋ＡＴＰ0.165μＭ（濃度）
【００５１】
図２(a)を参照してＡＴＰ添加(+ATP)と、ＡＴＰ無添加(-ATP)とを比較すると、ＡＴＰ添加(+ATP)のほうが発光強度が強いことが分かる。
【００５２】
さらに、ＡＤＰが除去されたポリリン酸合成酵素（ＰＰＫ［２］）を用いて、以下の条件でＡＴＰ添加(+ATP)と、ＡＴＰ無添加(-ATP)の発光の経時的変化を調べた（図２(b)参照）。
【００５３】
ＩＩ．ＡＤＰが除去された精製ポリリン酸合成酵素（ＰＰＫ［２］）を使用した場合の条件
（イ）ＰＰＫ［２］120Ｕ（ユニット）
（ロ）ＡＤＫ90Ｕ（ユニット）
（ハ）PolyP900μＭ（濃度）
（ニ）ＡＭＰ60μＭ（濃度）
（ホ）＋ＡＴＰ0.165μＭ（濃度）
【００５４】
図２(b)を参照してＡＴＰ添加(+ATP)と、ＡＴＰ無添加(-ATP)とを比較すると、ＡＴＰ添加(+ATP)の方が格段に発光強度が強いことが分かる。
【００５５】
図２(a)及び図２(b)を参照すれば、ＡＴＰ無添加(-ATP)のＡＴＰ再生反応系はポリリン酸合成酵素に由来するＡＴＰにより行われるのであって、反応系が増幅して行われることはない。したがって、ポリリン酸合成酵素から酵素に由来するＡＴＰ及びＡＤＰの混入をできる限り減らし、精製度を向上すれば、ＡＴＰ再生反応系が引き起こされないと推測される。
【００５６】
一方、ポリリン酸合成酵素から酵素に由来するＡＴＰ及びＡＤＰの混入をできる限り減らしても、どこからかＡＴＰが入ってきてＡＴＰ再生反応系の増幅が起こることが考えられる。また、再生反応系に必要なＡＭＰについては、市販のＡＭＰであれば少量のＡＤＰが含まれており、それを予め精製して、取り除いてあるが、それでも不十分である可能性がある。そこで、実施例３では、ＡＤＰが除去された精製ポリリン酸合成酵素（ＰＰＫ［２］）を使用し、ポリリン酸(PolyP)及びＡＭＰの濃度を減少させて、その発光強度を比較してみた。
【００５７】
【実施例３】
ＡＴＰ再生反応系に及ぼす基質濃度の比較
条件Ｉ．（図３(a)参照）
（イ）ＰＰＫ［２］120Ｕ（ユニット）
（ロ）ＡＤＫ90Ｕ（ユニット）
（ハ）PolyP900μＭ（濃度）
（ニ）ＡＭＰ600μＭ（濃度）
（ホ）＋ＡＴＰ0.165μＭ（濃度）
【００５８】
条件ＩＩ．（図３(b)参照）
（イ）ＰＰＫ［２］120Ｕ（ユニット）
（ロ）ＡＤＫ90Ｕ（ユニット）
（ハ）PolyP900μＭ（濃度）
（ニ）ＡＭＰ60μＭ（濃度）
（ホ）＋ＡＴＰ0.165μＭ（濃度）
【００５９】
条件ＩＩＩ．（図３(c)参照）
（イ）ＰＰＫ［２］120Ｕ（ユニット）
（ロ）ＡＤＫ90Ｕ（ユニット）
（ハ）PolyP90μＭ（濃度）
（ニ）ＡＭＰ600μＭ（濃度）
（ホ）＋ＡＴＰ0.165μＭ（濃度）
【００６０】
図３(a)(b)(c)を参照すれば、図３(b)はＡＴＰ無添加でＡＴＰ再生反応の増幅が起こっていないことが分かる。以上よりポリリン酸合成酵素から酵素に由来するＡＴＰ及びＡＤＰの混入をできる限り減らし、精製度を向上すれば、外部からＡＴＰが添加されなければＡＴＰ再生反応系が引き起こされないことが証明される。
【００６１】
【発明の効果】
以上のように本発明によれば、ＡＭＰを微量の汚れ由来ＡＴＰとＡＤＫ存在下で反応させてＡＤＰに変換せしめ、次いで、該ＡＤＰを、ポリリン酸合成酵素の存在下でポリリン酸化合物と反応させてＡＴＰに変換せしめるＡＴＰの再生反応系を備えるので、従来よりも発光が長く継続する。ＡＴＰのルシフェラーゼ反応の際にポリリン酸化合物を添加させる方法（特開平8-47399）ではポリリン酸合成酵素が存在しないので全くこの効果は得られない。また、特開平8-47399で使われるポリリン酸「３つ程度のリン酸基が結合したもの」では、たとえ酵素が存在しても再生系は成立しない。本発明は、ＡＤＰからＡＴＰに変換せしめるＡＴＰの再生反応系において、ポリリン酸化合物及びポリリン酸合成酵素を添加して反応させるので、生物発光の光量の増強効果を得るとともに、発光時間を持続させることのできる生物発光によるＡＴＰの検査方法を提供することが可能となる。
【００６２】
また、前記ポリリン酸化合物は、化学合成により生成されたポリリン酸化合物であって、少なくとも１０〜１００個のリン酸基が直鎖状に重合したものを用いるとよい。これにより、ポリリン酸化合物の１分子中にリン酸基が少なくとも１０〜１００個含まれているので、ＡＤＰからＡＴＰへの変換が容易に行われ、ＡＴＰを再生する際の補給が少量となり経済的になる。さらに、ポリリン酸化合物が熱にさらされた場合であっても、リン酸基が直鎖状に重合しているので、耐熱性があり、品温が摂氏６０〜７０℃程度の被検査物に対しても測定が可能となる。そして、リン酸基が直鎖状に重合しているため、細菌中に存在する酵素によっても分解されにくい。
【００６３】
そして、前記ポリリン酸化合物は、バクテリア由来のポリリン酸化合物であって、少なくとも１０〜１０００個のリン酸基が直鎖状に重合したものを用いると、少なくとも１０〜１０００個のリン酸基が直鎖状に重合しているので、耐熱性、耐菌性が向上する。
【００６４】
さらに、前記ポリリン酸化合物は、ポリリン酸合成酵素の触媒作用により、ＡＴＰから生合成すれば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化合物を安価に生成することが可能となる。
【００６５】
また、前記ポリリン酸合成酵素は、不純物を除去して精製したもの、特に、酵素に由来するＡＴＰ及びＡＤＰを除去すると、酵素に由来するＡＴＰによるＡＴＰ再生反応系の増幅は除去され、微量の汚れ由来ＡＴＰの存在があって初めてＡＴＰ再生反応系の増幅が行われるので、清浄度検査の精度がより向上する。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＴＰ濃度が1.65μＭの場合における本発明と従来のものとの相対発光量の経時的変化を示す。
【図２】精製されたポリリン酸合成酵素（ＰＰＫ［１］）及びＡＤＰが除去されたポリリン酸合成酵素（ＰＰＫ［２］）を用いて、ＡＴＰ添加(+ATP)と、ＡＴＰ無添加(-ATP)の発光の経時的変化を調べた図である。
【図３】ＡＴＰ再生反応系に及ぼす基質濃度について発光の経時的変化を調べた比較図である。[0001]
[Technical field to which the invention belongs]
The present invention relates to a method for testing ATP produced in animal / plant metabolism / synthesis systems. For example, ATP (adenosine triphosphate) is measured by bioluminescence to detect invisible microorganisms in food factories. Thus, it can be applied to inspecting the cleanliness and measuring the freshness of food such as meat, fresh fish and vegetables.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, it has been known that when ATP , which is an indicator component of dirt, is reacted with an enzyme serving as a catalyst (for example, firefly luciferase), fluorescence is emitted.
[0003]
[Chemical 1]

[0004]
However, the measurement of the fluorescence emission has the disadvantage that the emission stability is poor and the emission disappears in a very short time, and in order to obtain sensitivity and accuracy, strict control of reaction time and short There is a problem that requires the use of a special luminometer to capture the luminescence that disappears over time.
[0005]
Therefore, JP-A-8-47399 is characterized in that, in a method for measuring bioluminescence generated by luciferase, a bioluminescence reaction is performed in the presence of a polyphosphate compound or a salt thereof and a sulfhydryl compound. Technology is disclosed. As a result, a novel effect of enhancing bioluminescence can be obtained, and a bioluminescence reaction can be measured by using a general luminometer. The polyphosphate compound in JP-A-8-47399 is a compound in which about 3 phosphate groups are bonded.
[0006]
However, the method disclosed in JP-A-8-47399 does not have a new ATP regeneration system, and therefore has a drawback that light emission attenuates over time as ATP is consumed. Therefore, in order to maintain the light emission amount without being attenuated as it is, the substrate concentration, oxygen concentration, PH, and temperature must be studied.
[0007]
JP-A-9-234099 discloses a cyclic AMP quantification method by a bioluminescence method represented by the following reaction formula.
[Chemical 2]

[0008]
In this method, cyclic AMP is hydrolyzed with cyclic 3 ′, 5′-nucleotide phosphodiesterase to generate AMP in the reaction system (reaction 1). In the presence of magnesium ion and adenylate kinase , When AMP is reacted with a small amount of ATP to be converted to ADP (reaction 2), the ADP is reacted with pyruvate kinase in the presence of magnesium ion and phosphoenolpyruvate to convert to ATP and pyruvate ( In the presence of reaction 3), luciferin, magnesium ions (or other metal ions) and dissolved oxygen, ATP reacts with luciferase to generate luminescence (reaction 4), and the amount of luminescence generated in (reaction 4) Method for quantifying cyclic AMP by measuring (METHODS
IN ENZYMOLOGY 38,62-65; 1974).
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
However, this method converts AMP converted from cyclic AMP into ADP, and further converts the ADP into ATP by the reaction of pyruvate kinase in the presence of phosphoenolpyruvate. was there. That is, phosphoenolpyruvate represented by the following structural formula contains only one phosphate group in one molecule, and conversion from ADP to ATP becomes insufficient, so that ATP can be regenerated in large quantities. A large amount of phosphoenolpyruvate had to be replenished. It was uneconomical to supply a large amount of phosphoenolpyruvate in this way.
[0010]
[Chemical 3]

[0011]
In addition, phosphoenolpyruvate is very weak to heat and easily decomposed, and when the just-cooked rice is used as a test object (for example, a test object whose temperature is about 60 to 70 ° C.) In contrast, when a reagent containing phosphoenolpyruvate is administered to an object to be inspected, the phosphate group is decomposed and conversion from ADP to ATP becomes insufficient. There is. That is, the stability of the fluorescence emission by ATP is poor, and there is a possibility that the emission may disappear in a very short time.
[0012]
Furthermore, there are multiple types of bacteria in the test object, but if an enzyme that degrades phosphoenolpyruvate is present in these bacteria, phosphate groups are not replenished, and conversion from ADP to ATP is not possible. May be sufficient.
[0013]
By the way, as a method for producing ATP at low cost by using an ATP regeneration reaction system, those disclosed in Japanese Patent Publication No. 53-5752 and republished patent WO 98/48031 are known.
[0014]
The method for producing ATP described in JP-B-53-5752 is characterized by reacting a solution containing AMP, ADP, polyphosphate, polyphosphate kinase (PPK) and adenylate kinase (ADK) .
[0015]
As a result, ADP1 molecule and polyphosphoric acid are reacted in the presence of PPK to generate ATP1 molecule, and ATP1 molecule and AMP1 molecule are reacted in the presence of ADK to generate ADP2 molecule. is that can be produced with ATP2 molecules by reaction with polyphosphoric acid again in the presence of a PPK.
[0016]
However, according to the production method of JP-B-53-5752, the ATP regeneration reaction system is established only when a small amount of ADP is present. In other words, it could not be applied to detecting the presence of a small amount of ATP, examining the cleanliness, or measuring the freshness of food.
[0017]
On the other hand, the method for producing ATP of the republished patent WO 98/48031 is characterized in that PPK, ADK and polyphosphoric acid are allowed to act on AMP.
[0018]
Thereby, in an enzyme reaction system using ATP, expensive ATP is not added, but ATP is produced from inexpensive AMP, or consumed ATP is efficiently regenerated.
[0019]
This ATP production method is a reaction in which ATP is produced from inexpensive AMP regardless of whether or not ATP is added. Therefore, the presence of a trace amount of ATP is detected, the cleanliness is examined, and the freshness of food. It cannot be applied to the measurement.
[0020]
In view of the above problems, the present invention detects the presence of trace amounts of ATP using an ATP regeneration reaction system, detects invisible microorganisms in food factories, etc., and checks the cleanliness, meat, fresh fish Another object of the present invention is to provide a method for detecting adenine nucleotides by bioluminescence that can be applied to measure the freshness of foods such as vegetables.
[0021]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present invention reacts ATP (adenosine triphosphate) with luciferase in the presence of luciferase and dissolved oxygen to produce AMP (adenosine monophosphate) and luminescence, and measures the amount of luminescence produced. and a method for detecting the ATP, the first reaction allowed to generate the dirt from ATP traces present in the object to be inspected in, it is reacted with luciferin AMP and emission in the presence of luciferase and dissolved oxygen by, said said AMP produced in 1 reaction, ADK a second reaction to form is reacted with the ATP in the presence of (adenylate late kinase) ADP (adenosine diphosphate), the ADP produced in the second reaction and in the presence of PPK polyphosphoric acid synthase (polyphosphate kinase), polyphosphate compounds produced by chemical synthesis There are polyphosphoric acid phosphate groups n is polymerized to 10 to 100 linear (poly P n; n = 10~100 ) or a polyphosphoric acid compound from bacterial phosphate groups n is 10 to 1000 linear and a third reaction to form a; (n = 10~1000 poly P n ) and by reacting ATP and phosphate groups n is one decreased polyphosphoric acid (polyPn-1), a chain in polymerized polyphosphoric acid by repeatedly executing the third reaction from the first reaction, the regenerated by the second reaction of ATP consumed and third reaction by first reacting, emitting light by sustained light emission amount by the first reaction The amount is measured.
[0022]
As a result, in the ATP regeneration reaction system for converting ADP to ATP, polyphosphate compound and polyphosphate synthase (when polyphosphate and ADP are present as shown in [Chemical Formula 4], ATP is synthesized and ADP is not present. If ATP is present in excess, it has the property of synthesizing polyphosphoric acid.) And is allowed to react. Therefore, the ATP regeneration reaction system is used to obtain the effect of enhancing the amount of bioluminescence, and the emission time is reduced. Persistently detect the presence of even a small amount of ATP, detect invisible microorganisms in food factories, etc., and check the cleanliness, or measure the freshness of food such as meat, fresh fish, and vegetables It is possible to provide an ATP inspection method using bioluminescence that can be applied to the above.
[0023]
The polyphosphoric acid compound may be a polyphosphoric acid compound produced by chemical synthesis and having at least 10 to 100 phosphoric acid groups (PO3 groups) polymerized in a linear form. As a result, since at least 10 to 100 phosphate groups are contained in one molecule of the polyphosphate compound, conversion from ADP to ATP is easily performed, and replenishment when ATP is regenerated is economical. become. Furthermore, even when the polyphosphoric acid compound is exposed to heat, since the phosphoric acid group is polymerized in a linear form, it has heat resistance and is suitable for an object to be inspected having a product temperature of about 60 to 70 ° C. Measurement can also be performed. And since the phosphate group is polymerized in a straight chain, it is difficult to be decomposed even by an enzyme present in bacteria.
[0024]
Then, as the polyphosphoric acid compound, in the case of using a polyphosphoric acid compound from bacteria, the use of at least in 10-1000 phosphate groups have been polymerized to linear, at least 10 to 1000 phosphate groups Since it is polymerized in a straight chain, the heat resistance and bacteria resistance are improved.
[0025]
Furthermore, if the polyphosphate compound is biosynthesized from ATP by the catalytic action of polyphosphate synthase, the yield of the polyphosphate compound can be improved and the polyphosphate compound can be produced at a low cost.
[0026]
The polyphosphate synthase is purified by removing impurities, particularly when ATP and ADP derived from the enzyme are removed, amplification of the ATP regeneration reaction system by the ATP derived from the enzyme is removed, and a small amount of dirt is collected. Since the ATP regeneration reaction system is amplified only in the presence of the origin ATP, the accuracy of the cleanliness inspection is further improved.
[0027]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
An embodiment of the present invention will be described. First, the bioluminescent reaction measurement method of the present invention is represented by the following reaction formula.
[0028]
[Formula 4]

[0029]
In the above reaction, the ATP, luciferase as (1), dissolved oxygen (not shown) and metal ions such as magnesium ions for the purpose of inactivation inhibition of the enzyme (not shown), when allowed to act luciferin , AMP, pyrophosphate, oxyluciferin, carbon dioxide (not shown), and the first reaction (2) for generating light is performed, and the light generated by this luciferase is measured, so that ATP which is an index component of dirt The cleanliness of food factories can be determined.
[0030]
Next, a new regeneration system from generated AMP to ATP, a second reaction in which soil-derived ATP and generated AMP are reacted in the presence of adenylate kinase (ADK) to convert to ADP. (3) In the presence of metal ions such as magnesium ions (not shown) and polyphosphate kinase (PPK) for the purpose of inhibiting enzyme deactivation , the ADP is reacted with a polyphosphate compound ( polyP n). , ATP and a third reaction (4) for conversion into a polyphosphate compound (polyPn-1).
[0031]
The main points of this reaction are described below. First, ATP is consumed by reaction (1) and emits light, and AMP is generated by reaction (2). After this AMP is converted to ADP by reaction (3), ADP is converted to ATP in reaction (4). To be played. And this ATP is again used for reaction (1), ATP is consumed, and it light-emits. Of ATP, soil-derived ATP is subjected to reaction (3) (5) and used for the conversion of AMP to ADP. Hereinafter, reactions (1) and (2), which are ATP consumption systems, and reactions (3), (4), and (5), which are ATP regeneration systems, are simultaneously and repeatedly performed. The luminescence generated in the ATP consumption system and the ATP regeneration system has the effect of enhancing the amount of bioluminescence, can sustain the luminescence time, is stable for 10 minutes or more, and is stable after 1 hour or more. It has been confirmed that it is stable with almost no attenuation.
[0032]
Meanwhile, among the reactions to be reproduced system of the ATP, in the third reaction (4) of converting the ADP into ATP, in the presence of a polyphosphate kinase (PPK), a polyphosphoric acid compound (PolyPn) and the ADP When reacted, one phosphate group is consumed from the polyphosphate compound and converted into ATP and a polyphosphate compound (polyPn-1). In this case, the polyphosphoric acid compound is a polyphosphoric acid compound produced by chemical synthesis and does not contribute to the reaction unless at least 10 or more phosphoric acid groups are polymerized in a linear form.
[0033]
That is, when used as a 10 ≦ n ≦ 100 as polyphosphoric acid compound (polyPn), because phosphoric acid group in a molecule contain at least 10 to 100, when converting ADP to ATP, phosphoric acid There is no shortage of groups and the conversion is done smoothly. For this reason, the supply of phosphate groups becomes small and economical.
[0034]
Furthermore, even when the polyphosphoric acid compound is exposed to heat, since the phosphoric acid group is polymerized in a linear form, it has heat resistance and is suitable for an object to be inspected having a product temperature of about 60 to 70 ° C. Measurement can also be performed. And since the phosphate group is polymerized linearly, even an enzyme present in bacteria is difficult to be degraded.
[0035]
For example, the polyphosphate compound (polyP _n ) used in the present invention is represented by the following structural formula. Here, (polyPn) is preferably in the range of 10 ≦ n ≦ 100.
[0036]
[Chemical formula 5]

[0037]
In the case of a polyphosphate compound derived from bacteria , when the polyphosphate compound is a polymer in which at least 10 to 1000 phosphate groups are linearly polymerized, 10 to 1000 phosphate groups are polymerized. As a result, heat resistance and bacteria resistance are improved.
[0038]
When biosynthesized from ATP by the catalytic action of polyphosphate synthase, the yield of polyphosphate compound can be improved and the polyphosphate compound can be produced at low cost. For example, as shown in the following reaction formula, a polyphosphate compound is biosynthesized from ATP.
[0039]
[Chemical 6]

[0040]
Biosynthesis of the polyphosphoric acid compound by the above reaction formula may be performed using, for example, a conventional method for producing polyphosphoric acid disclosed in JP-A-5-153993. In the present embodiment, polyphosphate synthase is used as a catalyst to react polyphosphate synthase, ATP, and metal ions such as magnesium for the purpose of inhibiting the deactivation of the enzyme to biosynthesize a polyphosphate compound. The polyphosphate synthase used in the present embodiment may be anything that can biosynthesize a polyphosphate compound.
[0041]
In the present embodiment has been described primarily an inspection method of ATP, is not limited to ATP alone test are those applied to the inspection process, such as a mixture of ADP and AMP. Thereby, it can apply also to measuring the freshness of foods, such as meat, fresh fish, and vegetables.
[0042]
[Example 1]
In order to compare the presence of the ATP regeneration reaction system (invention) and the absence of the ATP regeneration reaction system (prior art), the change in luminescence with time was examined under the following conditions.
[0043]
I. With ATP regeneration reaction system (a) Polyphosphate kinase (PPK) 1000 U (unit)
(B) Adenylate kinase (ADK) 22000U (unit)
(C) Polyphosphate compound (PolyP) 260μM (concentration)
(D) ATP1.65μM (concentration)
Subtotal 25 μl (volume)
(E) Bioluminescence Essence Kit 25 μl (volume)
(Bellinger Mannheim)
Total 50μl (volume)
The sample necessary for the regeneration reaction system of (A) to (C) above and ATP to be the test object of (D) are mixed so that the volume becomes 25 μl. Then, this mixture was reacted with 25 μl of the bioluminescent essence (luciferin, luciferase as a main component) of (e) under the condition of a temperature of 37 ° C., and the amount of luminescence produced was determined by a luminometer (Amersham Pharmacia Biotech). And the change with time of light emission was examined. The amount of luminescence was measured by a method of reacting for 100 minutes after starting the reaction and measuring the amount of luminescence at 10-minute intervals.
[0044]
II. In the case of no ATP regeneration reaction system The sample excluding the sample (b) is mixed with the ATP to be inspected (2) so that the regeneration reaction does not occur so that the volume becomes 25 μl. Then, this mixture is reacted with 25 μl of the bioluminescent essence (luciferin, luciferase as a main component) of (e) above, and the amount of luminescence produced is measured with a luminometer (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech). The change in luminescence over time was examined. The amount of luminescence was measured by the same method as described above.
[0045]
I. above. Results and II. The results are shown in FIG. From this result, when there is no ATP regeneration reaction, the amount of luminescence reaches a peak at the beginning of the reaction, decreases to 1/3 after 10 minutes, and gradually decreases with time. Therefore, it can be seen that the conventional measurement method requires an elaborate luminometer. On the other hand, in the case of the present invention with an ATP regeneration reaction system, the amount of luminescence reaches 10 times after the lapse of 20 minutes after the reaction, the amount of luminescence is enhanced, and remains at a high level for a long time without decay. It turns out that it is stable (more than 30 minutes). Therefore, in the present invention, if a sophisticated luminometer is used, even a small amount of ATP can be detected, and the accuracy of food inspection and hygiene inspection can be improved. On the other hand, in food inspection and hygiene inspection, ATP can be detected by an inexpensive and simple luminometer, instead of using an expensive high-precision luminometer, as long as the standard is satisfied within the conventional ATP detection range. .
[0046]
In the examples of the ATP regeneration reaction, it can be seen that the ATP acid regeneration reaction occurs only when (2) ATP (1.65 μM concentration) is mixed. In other words, it is the first time the ATP re-raw reaction takes place if there is dirt derived from ATP trace amounts. However, as shown in the above [Chemical Formula 6], ATP and ADP derived from the enzyme are mixed in the polyphosphate synthase, and if it is a pure polyphosphate synthase from which ATP or ADP has been removed, a trace amount is required. The ATP regeneration reaction does not occur without the ATP from the soil. This is demonstrated by the following example.
[0047]
[Example 2]
First, polyphosphate synthase is purified and ADP is removed.
I. Polyphosphate synthase purification (PPK [1]) process
(1) First, E. coli MV1184 (pBC10: ppk) is cultured.
(2) After 2.5 hours from the start of the main culture, 0.5 mM IPTG is added to induce polyphosphate synthase.
(3) After 2 hours, the cells are collected and suspended in 60 ml of Tris / HCL + sucrose buffer.
(4). Freeze it at -80 ° C and thaw on ice overnight.
(5) Next, 250 μg / l lysozyme is added to lyse.
(6) Perform sonication.
(7) Add DNase70units / μl, Rnase10mg / l 10μl.
(8) Remove unbroken cells by high-speed centrifugation.
(9). Weigh the supernatant and add 0.2 g / l ammonium sulfate to it.
(10) Precipitate the enzyme by centrifugation and dissolve it by adding phosphate buffer.
(11) Fine particles are removed with a 0.2 μm filter and purified by hydrophobic chromatography (Phenyl Separose HP) and ion exchange chromatography (MonoS5 / 5).
(12) An almost single band is obtained on SDS-PAGE.
[0048]
II. ADP removal from polyphosphate synthase (PPK [2])
(1) .I. 200 μl (5 × 10 ³ units, 12 μg) of Escherichia coli polyphosphate kinase purified by the above procedure is mixed with 0.1 mM polyphosphate and incubated at 37 ° C. for 10 minutes (ADP bound to the enzyme is converted to ATP and released. ).
(2). Add purified polyphosphate-degrading enzyme (5 × 10 ⁵ units) and incubate at 37 ° C. for 10 minutes (removing the remaining polyphosphate. Without this step, polyphosphate synthase will elute from the column) Not)
(3). Purify using Smart System (MonoS).
[0049]
Using the above-described purified polyphosphate synthase (PPK [1]), the time-dependent change in luminescence of ATP added (+ ATP) and no ATP added (-ATP) was examined under the following conditions (FIG. 2). (See (a)).
[0050]
I. Conditions when using purified polyphosphate synthase (PPK [1]) (b) PPK [1] 120 U (unit)
(B) ADK90U (unit)
(C) PolyP900μM (concentration)
(D) AMP 600 μM (concentration)
(E) + ATP 0.165 μM (concentration)
[0051]
When comparing ATP addition (+ ATP) with no ATP addition (-ATP) with reference to FIG. 2A, it can be seen that the emission intensity is stronger when ATP is added (+ ATP).
[0052]
Furthermore, using polyphosphate synthase from which ADP was removed (PPK [2]), the temporal change in luminescence with ATP added (+ ATP) and without ATP added (-ATP) was examined under the following conditions ( (See FIG. 2 (b)).
[0053]
II. Conditions when using purified polyphosphate synthase (PPK [2]) from which ADP has been removed (a) PPK [2] 120 U (unit)
(B) ADK90U (unit)
(C) PolyP900μM (concentration)
(D) AMP 60 μM (concentration)
(E) + ATP 0.165 μM (concentration)
[0054]
Referring to ATP added to FIG 2 (b) and (+ ATP), is compared with the ATP no addition (-ATP), it can be seen much luminous intensity towards the ATP addition (+ ATP) is strong.
[0055]
Referring to FIG. 2 (a) and FIG. 2 (b), the ATP-free (-ATP) ATP regeneration reaction system is performed by ATP derived from polyphosphate synthase, and the reaction system is amplified. Never done. Therefore, it is presumed that an ATP regeneration reaction system is not caused if the contamination of ATP and ADP derived from the enzyme from polyphosphate synthase is reduced as much as possible and the degree of purification is improved.
[0056]
On the other hand, even if the contamination of ATP and ADP derived from the enzyme from polyphosphate synthase is reduced as much as possible, it is considered that ATP enters from somewhere and amplification of the ATP regeneration reaction system occurs. As for the AMP necessary for the regeneration reaction system, a small amount of ADP is contained in a commercially available AMP, which has been purified and removed in advance, but it may still be insufficient. Therefore, in Example 3, purified polyphosphate synthase (PPK [2]) from which ADP was removed was used, the concentrations of polyphosphate (PolyP) and AMP were decreased, and the luminescence intensity was compared.
[0057]
[Example 3]
Comparative conditions of substrate concentration on ATP regeneration reaction system (See Fig. 3 (a))
(B) PPK [2] 120U (unit)
(B) ADK90U (unit)
(C) PolyP900μM (concentration)
(D) AMP 600 μM (concentration)
(E) + ATP 0.165 μM (concentration)
[0058]
Condition II. (See Fig. 3 (b))
(B) PPK [2] 120U (unit)
(B) ADK90U (unit)
(C) PolyP900μM (concentration)
(D) AMP 60 μM (concentration)
(E) + ATP 0.165 μM (concentration)
[0059]
Condition III. (See Fig. 3 (c))
(B) PPK [2] 120U (unit)
(B) ADK90U (unit)
(C) PolyP90μM (concentration)
(D) AMP 600 μM (concentration)
(E) + ATP 0.165 μM (concentration)
[0060]
Referring to FIGS. 3 (a), 3 (b) and 3 (c), FIG. 3 (b) shows that no ATP regeneration reaction is amplified without ATP. From the above, it is proved that if ATP and ADP derived from the enzyme from polyphosphate synthase are reduced as much as possible and the degree of purification is improved, an ATP regeneration reaction system will not be caused unless ATP is added from the outside.
[0061]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, AMP is reacted with a trace amount of soil-derived ATP in the presence of ADK to convert it to ADP, and then the ADP is reacted with a polyphosphate compound in the presence of polyphosphate synthase. Therefore, the ATP regeneration reaction system that converts the ATP into ATP is provided, so that the luminescence continues longer than before. In the method of adding a polyphosphate compound in the luciferase reaction of ATP (Japanese Patent Laid-Open No. 8-47399), this effect cannot be obtained at all because no polyphosphate synthase is present. In addition, in the case of polyphosphoric acid “having about three phosphate groups bonded” used in JP-A-8-47399, a regeneration system is not established even if an enzyme is present. In the ATP regeneration reaction system for converting ADP to ATP, the present invention adds and reacts a polyphosphate compound and a polyphosphate synthase, so that the effect of enhancing the amount of bioluminescence is obtained and the luminescence time is maintained. It is possible to provide a method for inspecting ATP using bioluminescence.
[0062]
The polyphosphoric acid compound may be a polyphosphoric acid compound produced by chemical synthesis and having at least 10 to 100 phosphoric acid groups polymerized in a linear form. As a result, since at least 10 to 100 phosphate groups are contained in one molecule of the polyphosphate compound, conversion from ADP to ATP is easily performed, and replenishment when ATP is regenerated is economical. become. Furthermore, even when the polyphosphoric acid compound is exposed to heat, since the phosphoric acid group is polymerized in a linear form, it has heat resistance and is suitable for an object to be inspected having a product temperature of about 60 to 70 ° C. Measurement can also be performed. And since the phosphate group is polymerized in a straight chain, it is difficult to be decomposed even by an enzyme present in bacteria.
[0063]
The polyphosphate compound is a bacterial-derived polyphosphate compound, and when at least 10 to 1000 phosphate groups are linearly polymerized, at least 10 to 1000 phosphate groups are directly converted. Since it is polymerized in a chain form, the heat resistance and bacteria resistance are improved.
[0064]
Furthermore, if the polyphosphate compound is biosynthesized from ATP by the catalytic action of polyphosphate synthase, the yield of the polyphosphate compound can be improved and the polyphosphate compound can be produced at a low cost.
[0065]
The polyphosphate synthase is purified by removing impurities, particularly when ATP and ADP derived from the enzyme are removed, amplification of the ATP regeneration reaction system by the ATP derived from the enzyme is removed, and a small amount of dirt is collected. Since the ATP regeneration reaction system is amplified only in the presence of the origin ATP, the accuracy of the cleanliness inspection is further improved.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows changes with time in relative light emission between the present invention and a conventional one when the ATP concentration is 1.65 μM.
[FIG. 2] Using purified polyphosphate synthase (PPK [1]) and ADP-removed polyphosphate synthase (PPK [2]), ATP added (+ ATP) and no ATP added (− It is the figure which investigated the time-dependent change of luminescence of (ATP).
FIG. 3 is a comparative diagram in which changes in luminescence over time are examined for the substrate concentration affecting the ATP regeneration reaction system.

Claims (1)

In a method for detecting ATP by measuring ATP (adenosine monophosphate) and luminescence by reacting ATP (adenosine triphosphate) with luciferin in the presence of luciferase and dissolved oxygen to generate AMP (adenosine monophosphate) and luminescence.
Dirt from ATP traces present in the object to be inspected in a first reaction and which allowed to generate AMP and emission is reacted with luciferin in the presence of luciferase and dissolved oxygen,
It said AMP produced in the first reaction and a second reaction to form the ADK is reacted with the ATP in the presence of (Adenylate rate kinase) and ADP (adenosine diphosphate),
The ADP produced in the second reaction is a polyphosphate compound produced by chemical synthesis in the presence of PPK (polyphosphate kinase), which is a polyphosphate synthase, and has a phosphate group number n of 10-100. Polyphosphoric acid polymerized in a chain ( poly P n ; n = 10 to 100) or a polyphosphoric acid compound derived from bacteria and having a phosphoric acid group number n of 10 to 1000 and polymerized linearly ( poly P n ; n = 10 to 1000) to produce ATP and polyphosphoric acid (polyPn-1) in which the number of phosphate groups n is reduced by one, and a third reaction,
By repeatedly executing the third reaction from the first reaction, the regenerated by the second reaction of ATP consumed and third reaction by first reacting, emitting light by sustained light emission amount by the first reaction A method for inspecting ATP by bioluminescence characterized by measuring the amount.

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