JP3869471B2

JP3869471B2 - Method for specific measurement of HDL cholesterol and composition for measurement

Info

Publication number: JP3869471B2
Application number: JP53792297A
Authority: JP
Inventors: 三知夫濱; 健司風早; ほずみ土屋; 満直田中
Original assignee: 株式会社三菱化学ヤトロン
Priority date: 1996-04-22
Filing date: 1997-04-22
Publication date: 2007-01-17
Anticipated expiration: 2017-04-22
Also published as: WO1997040376A1

Description

技術分野
本発明は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールの特異的測定方法及び測定用組成物に関する。
背景技術
血漿又は血清中の各リピドフラクション中に含有されるコレステロールは、近年アテローム性動脈硬化症や心筋梗塞の危険度を示す診断材料として重要視されている。血清のリピドフラクションはそれぞれ脂質複合体粒子としての大きさが異なり、比重の差を利用した分離法である超遠心法に従って、カイロミクロン、超低密度リポプロテイン（Ｖｅｒｙｌｏｗｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；以下ＶＬＤＬとも称する）、低密度リポプロテイン（Ｌｏｗｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；以下ＬＤＬとも称する）、及び高密度リポプロテイン（Ｈｉｇｈｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；以下ＨＤＬとも称する）の４種類に分別されている。各リピドフラクションは、アポリポタンパク質と脂質とに大別され、脂質は更に遊離型コレステロール、エステル型コレステロール、トリグリセリド、及びリン脂質から構成されている。このため、コレステロールの測定は遊離型とエステル型の両者について行われている。
日常的な臨床検査では、自動分析装置を使用して酵素法による総コレステロールの測定が広く行われているが、リピドフラクションについては、試料の前処理（分画・分離操作）を行うことが必要なため、酵素法による自動分析測定（自動化）の普及が遅れていた。この試料の前処理としては、種々の沈殿法が行われており、例えば、リンタングステン酸とマグネシウムイオン、デキストランサルフェートとマグネシウムイオン、ヘパリンとカルシウムイオン若しくはマンガンイオン（Ｍ．Ｂｕｒｓｔｅｉｎ及びＨ．Ｒ．Ｓｃｈｏｌｎｉｃｋ，Ａｄｖ．ＬｉｐｉｄＲｅｓ．，１１，６７，１９７３；並びにＧ．Ｒ．Ｗａｒｎｉｃｋｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２５，５９６，１９７９）、又はポリエチレングリコールを添加してＬＤＬ等を沈殿させて遠心操作によって上澄み液を被検試料とする方法が繁用されている。詳細には、沈殿剤としてリンタングステン酸とマグネシウムイオンを使った場合、これらを含む溶液に試料（血清や血漿）を加え、ＨＤＬ以外のリピドフラクションを不溶性の複合体とする。これを遠心分離することによって沈殿を除き、ＨＤＬを含む上清を回収する。分画されたＨＤＬは総コレステロール測定用の酵素試薬で自動分析システムによる測定が可能となる。
また、免疫法（Ｃ−Ｃ．Ｈｅｕｃｋ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３１，２５２，１９８５）においても沈殿剤としてアポリポタンパク質Ｂ（ＨＤＬには含まれない）に対する抗体を試料（血清や血漿）を加え、ＨＤＬ以外のリピドフラクションを沈殿させる。以下同様に分画した後、はじめて上清中のＨＤＬ含有コレステロールの測定を行うことができる。このように、従来の方法ではいずれも多くの工程と時間とを要するという欠点があった。
最近、これらの分画操作を必要としない測定法について報告が出されている（例えば、特公平６−１６７２０号、特公平７−３４７６０号、又は特開昭５８−１６５８００号各公報）。すなわち、従来より用いられている総コレステロール測定のための酵素法としては、コレステロールエステラーゼによりコレステロールエステルを加水分解し、この酵素反応生成物であるコレステロールに、コレステロールオキシダーゼを作用させ、溶存酸素を使って酸化反応を行わせて生成される過酸化水素を、適当な被酸化性発色剤の存在下でペルオキシダーゼ反応により発色させて比色定量したり、あるいは、前記のコレステロールオキシダーゼによる酸化反応の際に消費される溶存酸素量を酸素電極で測定する方法が知られていた。
例えば、前記の各特許公報の記載によれば、前記の反応系において胆汁酸塩と共に非イオン系のポリエチレンオキシド基含有界面活性剤の存在がコレステロールエステラーゼの活性発現に重要であり、この界面活性剤が存在しないと活性を発現しないとされている。また、胆汁酸塩については、すでに当該酵素の精製の中で活性発現への関与が明らかとなっている（Ｊ．Ｈｙｎｎｅｔａｌ．，ＪＢＣ，２４４，１９３７，１９６９；及びＫ．Ｂ．Ｃａｌａｍｅｅｔａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１６８，５７，１９７５）。そして、特公平６−１６７２０号公報には、この胆汁酸塩には、脂質が豊富で比較的わずかなタンパク質を有するリポタンパク質である乳び脂粒、ＶＬＤＬ、及びＬＤＬのみを溶かし、その中に含有されるコレステロールを酵素反応に関与させる効果があるため、ＨＤＬコレステロールの測定にさきがけて、これを反応させ、次いで前記の界面活性剤を添加し、ＨＤＬフラクション中に含有されるコレステロールと酵素とを反応させることによって、ＨＤＬコレステロールを特異的に分別測定する方法が記載されている。すなわち、まずはじめにＨＤＬ以外のリピドフラクションを反応させ、次いで、ＨＤＬフラクションと反応させて両者の差を読み取っている。
また、特公平７−３４７６０号公報には、前記と同様の系において、更に、コレステロールエステラーゼとして膵臓由来のコレステロールエステラーゼを使用する方法が記載されている。この方法では、ＬＤＬフラクション中に含有されるコレステロールの遊離がまず行われるので、測定シグナルは、はじめはＬＤＬフラクションのコレステロール含量に比例するが、反応開始から一定時間を経過した後の或る時間内（例えば、反応開始から２分経過後〜１５分経過後までの時間内）での吸光度変化量に限り、ＨＤＬコレステロール濃度に比例する特徴的な反応経過を示す。更に、抗ＬＤＬ抗体を反応系へ添加しておくことにより、ＬＤＬやＶＬＤＬの主要構成タンパク質であるアポリポタンパク質Ｂと前記抗体との間に抗原抗体反応による複合体を形成させ、当該酵素との反応を阻害することで総合的にＨＤＬフラクションに対する特異性を向上させる工夫を行っている。
しかし、これらの方法は試薬へ新たに抗体を添加したり、反応時間が２０分以上必要であるなど、製造コストや測定操作上、日常使われている自動分析機への対応が不十分なものであった。
他方、Ｈ．Ｓｕｇｉｕｃｈｉら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４１，７１７，１９９５）は自動分析機へ適応した新しい方法について報告している。すなわち、使用する当該酵素（コレステロールエステラーゼ、及びコレステロールオキシダーゼ）にポリエチレングリコールを結合させ、化学修飾して高分子化した酵素を用いるものである。更に、前記の高分子化酵素に加えて、種々のリピドフラクションと親和性があるとされるシクロデキストリン誘導体（具体的には、硫酸化α−シクロデキストリン）を共存させることで、ＨＤＬ以外のリピドフラクションに対して複合体を形成させることができることが記載されている。この複合体は、前記高分子化酵素による反応を受けにくいため、ＨＤＬフラクションを特異的に測定することができる。しかし、このような手段を採用した場合、酵素の修飾は新たな工程の増加と、酵素標品の精製度の管理や化学修飾の程度差による酵素活性変動の抑制と管理、更には修飾酵素の安定性の維持等、新たな問題点を付随することになる。
本発明者等は、現在の臨床検査試験では、迅速で簡便な手段である自動分析装置による測定が主流である点に鑑み、ＨＤＬコレステロールの測定方法において、試料（血清又は血漿）の遠心操作を行うことなく、簡便な操作で、且つ高精度の測定結果が得られる方法の開発を目的として、鋭意研究を重ねた結果、ＨＤＬコレステロールの測定方法において利用する酵素（コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ）とリピドフラクション含有コレステロールとの反応に関して、ＨＤＬフラクションのコレステロールとの反応には影響しないが、ＬＤＬ及びＶＬＤＬフラクションのコレステロールとの反応を阻害する化合物が存在することを見出し、これらの化合物を用いることにより、試料（血清又は血漿）の遠心操作を行うことなく簡便な操作で、ＨＤＬコレステロールを高精度に測定することができることを見出した。本発明は、こうした知見に基づくものである。
発明の開示
従って、本発明は、生体試料と、膵臓由来のコレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼと、胆汁酸又はその塩とを、アルブミンが存在する条件下で接触させ、前記生体試料中の高密度リポタンパク質コレステロールと前記各酵素との酵素反応により消費される化合物又は生成される化合物を測定することを特徴とする、高密度リポタンパク質コレステロールの測定方法に関する。
また、本発明は、生体試料中の高密度リポタンパク質コレステロールと、コレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼとを接触させ、前記コレステロールと前記各酵素との酵素反応により消費される化合物又は生成される化合物を測定して、高密度リポタンパク質コレステロールを特異的に定量するための試薬組成物であって、アルブミンと、胆汁酸又はその塩と、前記コレステロールエステラーゼとして膵臓由来のコレステロールエステラーゼとを含有することを特徴とする試薬組成物にも関する。
【図面の簡単な説明】
図１は、被検試料としてＬＤＬフラクションを使用した場合の、コール酸ナトリウム又はアルブミン添加効果を、酵素とＬＤＬとの反応経時変化で示すグラフである。
図２は、本発明による、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、及び正常プール血清の吸光度の経時変化を示すグラフである。
図３は、本発明の試薬組成物とプール血清とを５分間反応させた後の反応混合物のクロマトグラムである。
図４は、本発明の試薬組成物とプール血清とを１０分間反応させた後の反応混合物のクロマトグラムである。
図５は、本発明と従来法（沈殿法）とのＨＤＬコレステロール測定値の相関を示すグラフである。
図６は、被検試料としてＬＤＬフラクションを使用した場合の、アルブミン添加効果を、酵素とＬＤＬとの反応経時変化で示すグラフである。
図７は、被検試料として血清を使用した場合における、アルブミン添加効果を、吸光度の経時変化で示すグラフである。
図８は、本発明による補助ブロッカー含有試薬組成物とプール血清とを５分間反応させた後の反応混合物のクロマトグラムである。
図９は、アルブミンを含まない補助ブロッカー含有試薬組成物とプール血清とを５分間反応させた後の反応混合物のクロマトグラムである。
図１０は、本発明（補助ブロッカー存在下）と従来法（沈殿法）とのＨＤＬコレステロール測定値の相関を示すグラフである。
図１１は、本発明（乾式測定系）と従来法（沈殿法）とのＨＤＬコレステロール測定値の相関を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
本発明においては、生体試料として、特に哺乳動物（特にヒト）の血清又は血漿をそのまま用いることができる。すなわち、血清又は血漿を、遠心操作などにより分画処理したり、抗体で処理する必要がない。
本発明においては、前記の生体試料をコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼと接触させる際に、それらの酵素とＨＤＬコレステロールとの反応には影響しないが、ＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールとの反応を阻害する化合物、すなわちブロッカーとして、アルブミンを用いる。
本発明において、被検試料が血液（血清又は血漿）由来の場合には、被検試料内に既にアルブミンが含まれている。しかしながら、試料由来のアルブミン濃度が、測定系、すなわち、試薬と試料とを混合させて測定を実施する系において、０．０１重量％以下の場合には、本発明による効果を十分に得ることができない。一方、試料由来のアルブミン濃度が十分に高い場合には、特に人為的に添加する必要はないが、更にアルブミンを添加しても何ら問題はない。
また、被検試料として、アルブミンを含まない精製リピドフラクションや他の生体液試料（例えば、ずい液又は組織抽出液）を用いる場合には、アルブミンを添加して共存させることが必要である。このようにアルブミンを添加する場合のアルブミン濃度は、好ましくは０．０１〜２０重量％、より好ましくは０．０３〜１０重量％である。添加するアルブミンの由来は特に限定されず、例えば、ウシ、ヒト、ヒツジ、ウマ等の哺乳動物由来の他、遺伝子工学的に産生されたものも使用することができる。
本発明において用いることのできるコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼは、特に限定されず、微生物由来あるいは哺乳動物由来の酵素等を用いることができ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等を結合させて化学修飾した酵素、又は化学修飾していない酵素のいずれも用いることができる。なお、本発明者の見出したところでは、本発明において化学修飾していない酵素を用いる場合、特に化学修飾していないコレステロールエステラーゼを用いる場合には、その酵素の由来によって反応性が異なる。好ましくは、コレステロールエステラーゼとしては、ウシ又はブタ等の哺乳動物の膵臓由来のものを選択する方が効果的である。また、コレステロールオキシダーゼとしては、例えば、ストレプトマイセス属又はノカルディヤ属の微生物由来のコレステロールオキシダーゼを用いることができる。それらの酵素の添加量も特に限定されないが、測定系において、例えば、好ましくは０．０５ｕ／ｍｌ〜９０ｕ／ｍｌ、より好ましくは０．１ｕ／ｍｌ〜２０ｕ／ｍｌである。
膵臓由来のコレステロールエステラーゼを用いる場合には、胆汁酸又はその塩を同時に用いるのが好ましい。その濃度は、測定系において、好ましくは０．０５〜４ｍＭ、より好ましくは０．１５〜１．５ｍＭである。前記胆汁酸又はその塩の種類は、特に限定されることはないが、胆汁酸としては、例えば、コール酸、タウロコール酸、グリココール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、又はリトコール酸などを挙げることができ、その塩としては、例えば、ナトリウム塩などを挙げることができる。水溶性が高い点で、胆汁酸塩、例えば、コール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、又はデオキシコール酸ナトリウムを使用することが好ましい。
また、本発明においては、補助ブロッカーとして、好ましくは、一般式（Ｉ）：
Ａ−（ＣＨ₂）ｎ−ＣＨ₃ （Ｉ）
（式中、Ａはグルコシド基、チオグルコシド基、シュークロースオキシカルボニル基、又はＮ−メチルグルカミドカルボニル基であり、ｎは４〜１０の整数である）で表される化合物、又は一般式（II）：
Ｂ−ＣＨ₂−ＣＨ（Ｒ¹）−ＣＨ₂−ＳＯ₃ ^- （II）
〔式中、Ｂは３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ基であり、Ｒ¹は水素原子又はヒドロキシ基である〕で表される化合物の少なくとも１種を共存させることができる。
前記一般式（Ｉ）で表される化合物において、Ａがグルコシド基又はチオグルコシド基である場合には、ｎは好ましくは４〜９、より好ましくは５〜８である。グルコシド基は、好ましくはグルコピラノシド基、より好ましくはβ−Ｄ−グルコピラノシド基である。チオグルコシド基も、好ましくはチオグルコピラノシド基、より好ましくはβ−Ｄ−チオグルコピラノシド基である。Ａがグルコシド基である場合の化合物としては、具体的には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド（以下、ｎ−ＯＤＧとも称する）及びｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコシド（以下、ｎ−ＨＤＧとも称する）を挙げることができる。また、Ａがチオグルコシド基である場合の化合物としては、具体的には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド（以下、ｎ−ＯＴＧとも称する）及びｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド（以下、ｎ−ＨＴＧとも称する）を挙げることができる。
前記一般式（Ｉ）で表される化合物において、Ａがシュークロースオキシカルボニル基である場合には、ｎは好ましくは６〜１０、より好ましくは７〜９であり、この場合の化合物としては、具体的には、シュークロースモノカプレート（以下、ＳＭ−１０００とも称する）を挙げることができる。
前記一般式（Ｉ）で表される化合物において、ＡがＮ−メチルグルカミドカルボニル基である場合には、ｎは好ましくは５〜９である。ＡがＮ−メチルグルカミドカルボニル基である場合の化合物としては、具体的には、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（以下、ＭＥＧＡ−８とも称する）、ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド（以下、ＭＥＧＡ−９とも称する）、及びデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（以下、ＭＥＧＡ−１０とも称する）を挙げることができる。
前記一般式（II）で表される化合物としては、具体的には、３−〔（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスルホネート（以下、ＣＨＡＰＳとも称する）及び３−〔（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（以下、ＣＨＡＰＳＯとも称する）を挙げることができる。
本発明においては、補助ブロッカー、すなわち、前記一般式（I）で表される化合物又は前記一般式（II）で表される化合物を単独で、又は２種以上を任意に組み合わせて用いることができる。
本発明において、補助ブロッカーは、水溶液として用いるのが好ましい。水溶液中の補助ブロッカーの濃度は、測定系において、好ましくは０．０１〜２．０重量％、好ましくは０．０２〜１．０重量％、より好ましくは０．０３〜０．５重量％である。補助ブロッカーの濃度が０．０１重量％より少ないと、ＬＤＬ及びＶＬＤＬフラクションのコレステロールとの酵素反応に対する阻害効果が見られず、正確な測定を行うことができない。逆に、２．０重量％を越える濃度では、フラクションのコレステロールとの酵素反応に対する特異性が全く見られなくなり、また補助ブロッカーの溶解性の点においても不都合である。
本発明によれば、被検試料（例えば、血清又は血漿）について測定前に予め遠心分離等の分画操作を行わなくても、アルブミン（ブロッカー）の存在下で、被検試料（例えば、血清又は血漿）と酵素とを接触（共存）させることによって、被検試料中のＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールと酵素との反応を阻害するとともに、ＨＤＬコレステロールと酵素との反応を阻害せずに進行させ、コレステロールと前記各酵素との酵素反応により消費される化合物（例えば、酸素）又は生成される化合物（例えば、過酸化水素）を、公知の手段により検出し、ＨＤＬコレステロールを定量することができる。例えば、過酸化水素を検出する場合には、適当な被酸化性発色剤及びペルオキシダーゼの存在下に生成するＨ₂Ｏ₂を発色させて、分光学的に比色測定することができる。
Ｈ₂Ｏ₂は、公知の方法で、例えば、適用な被酸化性発色剤の存在下にペルオキシダーゼの反応により発色させることができる。被酸化性発色剤としては、３−ハイドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢＡ）やＮ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＥＳＰＴ）と４−アミノアンチピリン（４−ＡＰ）が好適であり、例えば、ＨＴＩＢＡやＥＳＰＴは０．１ｍＭ〜５ｍＭの濃度範囲で、そして４−ＡＰは０．０５ｍＭ〜２ｍＭの濃度範囲で適宜含有させることができる。自動分析装置による測定では、波長５１０ｎｍ（ＨＴＩＢＡを使用する場合）、又は５４６ｎｍ（ＥＳＰＴを使用する場合）における吸光度を測定すればよい。
本発明によるＨＤＬコレステロール測定用試薬組成物は、膵臓由来のコレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼと、アルブミンと、胆汁酸又はその塩とを含有する。本発明による測定用試薬組成物は、場合により、更に、補助ブロッカーとして前記一般式（Ｉ）又は前記一般式（II）で表される化合物の１種又はそれ以上を含有することもできる。
本発明による測定用試薬組成物は、好ましくは、膵臓由来のコレステロールエステラーゼ０．０５〜９０ｕ／ｍｌ、より好ましくは０．０５〜１０ｕ／ｍｌと、コレステロールオキシダーゼ０．０５〜９０ｕ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜２０ｕ／ｍｌと、アルブミン０．０１〜２０重量％、より好ましくは０．０２〜１０重量％と、胆汁酸又はその塩０．０５〜４ｍＭ、より好ましくは０．１５〜１．５ｍＭと、場合により前記補助ブロッカー０．０１〜２．０重量％、より好ましくは０．０３〜０．５重量％を含有することができる。
本発明の測定用試薬組成物は、単一試薬として構成・使用することもできるし、現在汎用されている自動分析装置に合わせて、２試薬系にもすることができる。２試薬系の場合、例えば、アルブミン、あるいはアルブミン及び補助ブロッカー１種又はそれ以上の化合物を、それぞれ単独又は共存して第一試薬あるいは第二試薬のどちらにも含ませることができ、第二試薬にコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ（及び場合により胆汁酸又はその塩）を含有させることができる。単一試薬、並びに第一試薬及び第二試薬の緩衝剤としては、例えば、グッド緩衝液（例えば、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、又はＢｉｓ−Ｔｒｉｓなど）、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液、又はイミダゾール緩衝液等を使用することができる。緩衝液の濃度は、好ましくは５〜１０００ｍＭ、より好ましくは５〜５００ｍＭ、最も好ましくは１０〜２００ｍＭである。また、それらの緩衝液のｐＨは、好ましくは４．５〜８．０、より好ましくはＬＤＬのコレステロール及びＶＬＤＬのコレステロールと酵素との阻害が良好なｐＨ５．５〜７．５の範囲内で適宜選択することができる。
本発明による試薬組成物を用いて、ＨＤＬコレステロールを測定する場合の反応系を模式的に示せば以下のとおりである。
〔特異性の規定〕

〔酵素反応及び発色反応）

自動分析装置による測定では、本発明による液状の試薬組成物を用いて、主に前記反応式（２）で生成するＨ₂Ｏ₂を比色法によって測定し、多検体処理を行うことができる。本発明は、これら溶液中での反応だけでなく、例えば、濾紙試験片などによる乾式測定系（ドライケミストリー）でも同様に用いることができる。すなわち、自動分析機による多検体処理とは別に、簡易測定法として個別の検査要求に対して、本発明を利用することができる。本発明を、ポリスチレン等の透明試験片による乾式測定系に適用し、反射式デンシトメトリ法による測定を行う場合には、適当な緩衝液中に調製した本発明による液状単一試薬組成物を、通常の透明試験片に含浸させ、乾燥させる常法によって製造することができる。また、展開層、試薬層及び反射層を含む乾式分析用要素は、試薬層に本発明による単一試薬組成物を含有させる常法によって製造することができる。更に、血液中の血球成分の分離膜あるいは分離層を別に設けた乾式分析用要素を用いると、血清用分離機器や血漿用分離機器を備えていない施設でも、血液をそのまま試料として直接に測定することができる。
本発明を実施する場合には、生成するＨ₂Ｏ₂は、直接に白金電極を用いるか、フェロセンなどの適当なメディエーターとペルオキシダーゼの存在下に反応させることにより、あるいは直接コレステロールオキシダーゼ反応時にフェロシアン化カリウムなどの適当なメディエーターを介して、生成する酸化電流の変化量を電気化学的に測定することもできる。他方、酵素反応により消費される化合物、例えば、前記反応式（２）で消費される酸素（溶存酸素）を、従来公知の方法、例えば、酸素電極で測定することもできる。また、酵素反応により生成される化合物としては、前記の過酸化水素以外にも、例えば、前記反応式（２）の生成物であるΔ４−コレステン−３−オンを適当な方法で測定してもよい。
以下の説明に限定されるものではないが、本発明においては、ＨＤＬコレステロールの測定方法において利用する酵素（コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ）とリピドフラクション含有コレステロールとの反応に際して、アルブミン、及び胆汁酸又はその塩の１種以上並びに場合により共存することのできる前記補助ブロッカーが、直接にリピドフラクションのアポリポタンパク質に親和性を示すか、あるいは間接的にリピドフラクションのコレステロールと酵素との反応時に酵素と相互作用するものと考えられる。
すなわち、各リピドフラクションは、脂質とアポリポタンパク質とからなる脂質複合体となっているが、その脂質構成比の違いとアポリポタンパク質のタイプ（Ａ−１、Ａ−１、Ｂ−１００、Ｂ−４８、Ｃ、又はＥなど）の差による物理化学的性質及び量的（各フラクション中に含まれる量）な違いによって識別される。ＨＤＬフラクションとＬＤＬ及びＶＬＤＬフラクションとの間で最も大きく異なるアポリポタンパク質のタイプ（前者がＡ−１又はＡ−２であり、後者がＢ−１００、Ｃ又はＥである）の違いが明らかなため、従来、アポリポタンパク質に対する抗体を用いる方法も開発されてきた。この従来法はアポリポタンパク質Ｂ及びＣに対する抗体を試料に混和し、免疫複合体を形成させることが特徴である。この免疫複合体は酵素反応阻害を惹起するため、次に酵素を加えるとＨＤＬコレステロールのみが酵素と反応するので、ＨＤＬコレステロールのみを測定することができる。しかし、免疫複合体を形成することができる抗体の反応性を一定に維持することは難しく、また免疫複合体自体の濁りが著しいため、コレステロール測定のための比色定量に際して誤差が大きくなるという欠点があった。
前記の特公平７−３４７６０号公報では、抗ＬＤＬ抗体や抗アポリポタンパク質Ｂ抗体を使用し、胆汁酸群の界面活性剤と非イオン系界面活性剤及びコレステロールオキシダーゼの存在下に、膵臓由来のコレステロールエステラーゼによる反応の特異性を向上させる方法が開示されている。これらの抗体の使用は付加的とされているが、免疫複合体を形成する限り同様の不都合が生じる。抗体を使わない場合の反応条件の設定内容は、本発明の一部と類似しているが、アルブミン及び場合により胆汁酸又はその塩が共存することによる酵素反応特性の違いは、本質的なものであり、両発明が異なる反応機構によるものであることは、以下の説明により明らかである。
特公平６−１６７２０号公報によれば、まずはじめにＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールと、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼとの反応が、胆汁酸塩の存在下で進む。次いで非イオン系のポリエチレンオキシド基含有界面活性剤の添加によってＨＤＬコレステロールとの反応がはじまるため、これら２相の反応で得られる吸光度変化の差を求めることにより、ＨＤＬコレステロール量を測定することができるものとされている。
また、特公平７−３４７６０号公報の開示内容によれば、胆汁酸群の界面活性剤と非イオン系界面活性剤の共存下に、前記特公平６−１６７２０号公報と同様に酵素反応は２相で経過することが示されている。まずはじめにＬＤＬコレステロールとの反応が進み、ＨＤＬコレステロールとの反応は、時間的に遅れて開始する。このため、好適に選択した、例えば、反応開始後２〜１５分の範囲内で、所定の時間域での吸光度変化はＨＤＬコレステロール濃度に比例するものとされている。
これに対して、本発明においては、アルブミン、及び胆汁酸又はその塩、更に場合により１種以上の補助ブロッカーを共存させることにより、ＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールと、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼとが反応しない条件が存在し、したがって、反応開始から任意の時間における変化量は、全てＨＤＬコレステロール濃度に依存するということが判明した。本発明では、特にアルブミンと胆汁酸又はその塩と膵臓由来のコレステロールエステラーゼとの共存によって目的を達成することができる。膵臓由来のコレステロールエステラーゼは、その活性発現に胆汁酸又はその塩が必須であることはすでに述べたとおりである。この反応特異性は、例えば、血清から分離精製された各リピドフラクションとの反応性を比較することで簡単に調べることができる。また、より正確には、予め各リピドフラクションを分離することなく血清との反応を調べるために、反応液体クロマトグラフィー法を用いることにより、直接に検証することができる。酵素とＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールとの反応は、胆汁酸又はその塩の濃度に依存して変化し、濃度が高いほど反応が早い。
他方、一定濃度の胆汁酸又はその塩の存在下にアルブミンを添加すると、アルブミン濃度依存的に酵素反応は抑制を受けるが、酵素とＨＤＬコレステロールとの反応では抑制されないことがわかった。このように酵素反応に特異性を付与することができるアルブミンの効果は、他のタンパク質などでは認められない非常に特異的な性質であって、この性質は種を越えて維持されている。これら胆汁酸又はその塩による濃度依存的な酵素の活性化反応と、アルブミン濃度依存的なＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールに対する酵素活性抑制効果とは、相反する類似の挙動を示すことから、この現象は、酵素とＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールとの反応において、両者が競合的に働く相互作用部位の存在を示唆している。
本発明においては、酵素反応は、ＨＤＬコレステロール特異的に進行するため、１相で経過し、最も反応速度が大きい反応開始直後からＨＤＬコレステロール濃度依存的な反応変化量が得られる。従って、この点で、本発明は、前記公報記載の従来法における反応特性には見られない優れた性質を有することが理解される。また、好適には更に１種以上の補助ブロッカーが共存させることにより、例えば、使用可能なｐＨ条件を弱アルカリ側へ拡大させたり、使用アルブミン量を減少させることができる。当然のことながら、好適な条件からはずれる場合には、特異性も減少し、ＨＤＬコレステロールに次いでＬＤＬコレステロールとＶＬＤＬコレステロールとの反応が遅れて進行を始めることが、明らかであった。特に測定の迅速性が問われるドライケミストリーによる簡易検査では、１分以内数秒単位での計測が望まれるため、１液仕様で反応開始と同時に特異性が発揮できることは、本発明と従来法との間に本質的差異を認めるに十分な原理の違いが明らかである。
実施例
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。以下の実施例においては、特に断わらない限り、コレステロールエステラーゼとして膵臓由来のコレステロールエステラーゼを用いた。
実施例１：超遠心法によるリピドフラクションの分画
超遠心法による脂質フラクションの分画は、工藤明生等（動脈硬化，６，３９，１９７８）の方法に準じて行った。具体的には、プール血清１６ｍｌへ、ＥＤＴＡナトリウム塩１６ｍｇ、ショ糖４ｇ、臭化カリウム３．２ｇ、及び塩化ナトリウム０．８ｇを加え溶解した。これとは別に３種類の比重液を作成した。すなわち、比重１．２１の比重液は、ショ糖２０ｇ、臭化カリウム１５ｇ、及び塩化ナトリウム５ｇを精製水１００ｍｌに溶解して調製した。比重１．０６３の比重液は、比重１．２１の前記比重液３０ｍｌと精製水７０ｍｌを混和して調製した。また比重１．００６の比重液は、ショ糖２．５ｇを精製水９７．５ｍｌに溶解して調製した。
１０ｍｌ容量の遠心管に上記の処理血清１．９ｍｌを入れ、この上層に比重１．２１の比重液０．８ｍｌを注射器で静かに重層し、遠心管を１０℃で５００００ｒｐｍにて２０時間遠心した。遠心処理終了後、最上層部には比重１．２１以下の全てのリピドフラクションが集まるが、この最上層部の上に更に比重１．０６３の比重液１．６ｍｌと比重１．００６の比重液２ｍｌとを重層した。
この遠心管を５００００ｒｐｍで４時間更に遠心し、各リピドフラクションを回収した。
各画分は生理的食塩水に一夜透析した後（冷蔵下）、冷蔵保存した。
実施例２：コール酸ナトリウムによる活性化反応とアルブミンによる抑制効果
１ｍＭ−ＥＳＰＴ、０．５ｍＭ−４−ＡＰ、５μｇ／ｍｌペルオキシダーゼ、１ｕ／ｍｌコレステロールオキシダーゼ、及び０．２５ｕ／ｍｌコレステロールエステラーゼを含む４０ｍＭ−Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．２）（以下、緩衝液Ｘと称する）１．０ｍｌを３７℃で５分間加温した。この緩衝液Ｘに実施例１で調製したＬＤＬフラクション１０μｌを添加し、発色の経時変化を波長５４６ｎｍで記録した。結果を図１に示す（図１の曲線ａ）。吸光度の変化はほとんど観察されなかった。
次に、前記緩衝液Ｘの代わりに、前記緩衝液Ｘに更に０．７５ｍＭコール酸ナトリウムを含む緩衝液（以下、緩衝液Ｙと称する）を用いて同様の測定を実施した。結果を図１の曲線ｂで示す。吸光度の変化が観察され、酵素とＬＤＬフラクション中のコレステロールとの反応は、コール酸ナトリウムで活性化されることがわかった。
続いて、前記緩衝液Ｘの代わりに、前記緩衝液Ｙに更に０．８％牛アルブミンを含む緩衝液（以下、緩衝液Ｚと称する）を用いて同様の測定を実施した。結果を図１の曲線ｃで示す。吸光度の変化はほとんどなく、酵素とＬＤＬフラクション中のコレステロールとの反応は、アルブミンの添加によって抑制されることがわかった。
実施例３：反応経時変化
緩衝液Ｚ１．０ｍｌを３７℃で５分間加温した。この緩衝液Ｚに、試料として、実施例１で調製したＨＤＬフラクション２０μｌ、ＬＤＬフラクション１０μｌ、ＶＬＤＬフラクション１０μｌ、又は正常プール血清１０μｌをそれぞれ加え、波長５４６ｎｍでの吸光度変化を記録した。
結果を図２に示す。図２において、「ＨＤＬ」は試料としてＨＤＬフラクションを使用した場合の結果を示し、「ＬＤＬ」は試料としてＬＤＬフラクションを使用した場合の結果、「ＶＬＤＬ」は試料としてＶＬＤＬフラクションを使用した場合の結果、そして「血清」は試料として正常プール血清を使用した場合の結果をそれぞれ示す。ＨＤＬフラクションに比べ、ＬＤＬフラクション及びＶＬＤＬフラクションのコレステロールに対する反応阻害が明らかであった。
実施例４：反応液体クロマトグラフィー法による血清リピドフラクションとの反応特異性
（１）酵素反応液の調製
１．３ｍＭ−ＥＳＰＴを含む４０ｍＭ−Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．２）０．７５ｍｌ（以下、Ａ溶液と称する）に、試料としてプール血清１０μｌを加え、３７℃で５分間加温した。この溶液に、２ｍＭ−４−ＡＰ、２０μｇ／ｍｌペルオキシダーゼ、１．６％牛アルブミン、３ｍＭコール酸ナトリウム、４ｕ／ｍｌコレステロールオキシダーゼ、及び１ｕ／ｍｌコレステロールエステラーゼを含む４０ｍＭ−Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．２）０．２５ｍｌ（以下、Ｂ溶液と称する）を添加した。Ｂ溶液を添加してから３７℃で５分間加温した後に、又は１０分間加温した後に、更に１Ｍトリスヒドロキシメタン水溶液７０μｌを添加して酵素反応を終了させることにより、反応混合液Ｍ１（すなわち、Ｂ溶液を添加してから５分間加温したもの）及び反応混合液Ｍ２（すなわち、Ｂ溶液を添加してから１０分間加温したもの）を得た。これとは別に、酵素反応前のコントロールとして、Ｂ溶液０．２５ｍｌに１Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液７０μｌを先に加え、反応停止させてから、Ａ溶液０．７５ｍｌを添加したもの（反応混合液Ｍｃ）を調製した。これらの反応混合液を、以下に示す反応液体クロマトグラフィーにより分析した。各分析には前記反応混合液１００μｌを用いた。
（２）反応液体クロマトグラフィーによる分析
Ｗ．Ｍａｒｚら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３９／１１，２２７６−２２８１，１９９３）の方法に従い、酵素反応前後の血清中リピドフラクションの挙動を調べた。すなわち、ゲル濾過用カラム（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６カラム：ファルマシア）を用いて、０．２Ｍ−ＮａＣｌを含む０．１Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を溶出液として０．３ｍｌ／分の流速で試料を分離した。次に、分離したリピドフラクションを、７０μｌ／分の流速で流れている総コレステロール測定用酵素試薬（ヤトロン製）と合流させ、３７℃の恒温槽中で５分間加温した後、波長５８０ｎｍで吸光度変化を記録した。図３に、反応混合液Ｍ１のクロマトグラム〔曲線（ａ）〕及び酵素反応前のコントロールである反応混合液Ｍｃのクロマトグラム〔曲線（ｃ）〕を、図４に、反応混合液Ｍ２のクロマトグラム〔曲線（ｂ）〕及び酵素反応前のコントロールである反応混合液Ｍｃのクロマトグラム〔曲線（ｃ）〕を示す。なお、図４には、試料プール血清を精製水に換えて、反応混合液Ｍ１と同様に操作し調製した試薬盲検例のクロマトグラム〔曲線（ｄ）〕も併せて示す。
各フラクションの溶出位置は、予め、実施例１で調製した各リピドフラクションを前記溶出液で１００倍希釈したものを、試料として注入し、その結果から決定した。各リピドフラクションは、脂質複合体としての大きさにしたがい、高分子量のＶＬＤＬから溶出され、続いてＬＤＬ、ＨＤＬの順序でピークが出現した。
こうして得られたピークは、各リピドフラクション中に含有されている総コレステロール量を示しているため、被検試料での酵素反応の結果、認められた各ピークの変化は、各リピドフラクションに対する特異性と反応量とを直接示している。図３に示すように、５分間の酵素反応では、ＨＤＬのピークだけが消失したのに対し、図４に示すように、１０分間の反応では、更にＶＬＤＬ及びＬＤＬのピークも減少を始めることが判明した。従って、本発明においては、ＨＤＬコレステロールが特異的に反応した後、ＬＤＬコレステロールやＶＬＤＬコレステロールが反応を始めることが明らかであった。
実施例５：実検体の測定
本発明の試薬組成物として、１．３ｍＭ−ＥＳＰＴを含む４０ｍＭ−Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．２）〔＝試薬１〕２２５μｌと、２ｍＭ−４−ＡＰ、２０μｇ／ｍｌペルオキシダーゼ、１．６％牛アルブミン、３ｍＭコール酸ナトリウム、４ｕ／ｍｌコレステロールオキシダーゼ、及び１ｕ／ｍｌコレステロールエステラーゼを含む４０ｍＭ−Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．２）７５μｌ〔＝試薬２〕との２試薬系の構成をとる試薬組成物を使用し、試料３μｌを用いる条件で、自動分析装置を使って測定した。試薬１との反応時間は５分間で、続く試薬２との反応時間も５分間とし、主波長５４６ｎｍ及び副波長７００ｎｍで測定を行った。血清検体１０例は、予め沈殿法（第一化学製）による測定を実施し、比較対照した。また、両測定法での標準物質としては、脂質測定用標準血清（福祉・医療技術振興会製）を用いた。
両測定法の相関関係を図５に示した。本発明方法は、従来から常用されている沈殿法と良好な相関性を示し、本発明方法によるＨＤＬコレステロールの測定が正確であることが確認された。
実施例６：補助ブロッカーの相対反応性
１ｍＭ−ＥＳＰＴを含む４０ｍＭ−Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）０．７５ｍｌに、実施例１で分画した各リピドフラクション（各１０μｌ）をそれぞれ加え、３７℃で５分間加温した。これに２ｍＭ−４−ＡＰと以下の表１に示す各補助ブロッカーの０．２％水溶液、２０μｇ／ｍｌペルオキシダーゼ、０．０９％牛アルブミン、１．７ｕ／ｍｌコレステロールエステラーゼ、及び４ｕ／ｍｌコレステロールオキシダーゼを含む４０ｍＭ−Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）０．２５ｍｌを添加し、波長５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。
各リピドフラクションに対するｎ−ＯＴＧの反応性を１００％として、各化合物の相対反応性を求めた。結果を表１に示す。なお、ＶＬＤＬとＬＤＬに対する表示値は反応阻害率である。表１に示すとおり、本実施例による条件下では、他の化合物もＶＬＤＬ及びＬＤＬに対してはｎ−ＯＴＧと同程度の阻害率を有することがわかった。他方、ＨＤＬに対する反応特異性が認められることから、本発明方法において適応可能であることが確認された。

実施例７：アルブミン添加効果
（１）ＬＤＬフラクションとの反応の場合
１．３ｍＭ−ＥＳＰＴを含む４０ｍＭ−ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）０．７５ｍｌに、試料として実施例１で調製したリピドフラクションＬＤＬ１０μｌを加え、３７℃で５分間加温した。これに３ｍＭコール酸ナトリウム、２ｍＭ−４−ＡＰ、０．３％アルブミン、２０μｇ／ｍｌペルオキシダーゼ、０．２％ｎ−ＯＴＧ、１．７ｕ／ｍｌコレステロールエステラーゼ、及び４ｕ／ｍｌコレステロールオキシダーゼを含む４０ｍＭ−ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）０．２５ｍｌを添加し、波長５４６ｎｍでの吸光度変化を記録した。また、対照試験として、アルブミンを添加しないこと以外は、前記と同様の操作を実施し、その吸光度（波長５４６ｎｍ）変化も記録した。それらの結果を図６に示す。図６において、「添加」はアルブミンを添加した場合を示し、「無添加」はアルブミンを添加しなかった場合を示す。酵素とＬＤＬフラクションのコレステロールとの反応が、アルブミンの添加により、効率よく阻害されていることが確認された。
（２）血清との反応の場合
０．０８％牛アルブミン、０．０５％ｎ−ＯＴＧ、１ｍＭ−ＥＳＰＴ、０．５ｍＭ−４−ＡＰ、５μｇ／ｍｌペルオキシダーゼ、０．７５ｍＭコール酸ナトリウム、０．１３ｕ／ｍｌコレステロールエステラーゼ、及び１ｕ／ｍｌのコレステロールオキシダーゼを含む４０ｍＭ−Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．８）１．０ｍｌを３７℃で５分間加温した。これに予め、総コレステロール値（ヤトロン製，酵素法）とＨＤＬコレステロール値（第一化学製，沈殿法）とを測定した血清３例（血清Ａ〜血清Ｃ）について、それぞれ１０μｌを加え、波長５４６ｎｍでの吸光度変化を記録した。また、同じ血清について、前記緩衝液の代わりに、前記緩衝液から牛アルブミンを除いた溶液を用いて、同様に記録した。また、血清を精製水に代えて、試薬盲検例も記録した。
結果を図７に示す。予め測定した血清の総コレステロール値及びＨＤＬコレステロール値は、それぞれ、血清Ａが２００ｍｇ／ｄｌ及び６６ｍｇ／ｄｌ；血清Ｂが１９８ｍｇ／ｄｌ及び９３ｍｇ／ｄｌ；そして血清Ｃが１０９ｍｇ／ｄｌ及び３８ｍｇ／ｄｌであった。図７において、曲線（１）〜（３）はアルブミン無添加の場合であり、曲線（４）〜（７）はアルブミン添加の場合である。曲線（１）及び（５）は、血清Ａの結果であり、曲線（２）及び（４）は、血清Ｂの結果である。また、曲線（３）及び（６）は、血清Ｃの結果である。曲線（７）は、試薬盲検例である。アルブミンを添加した条件では、反応開始からＨＤＬコレステロール値にしたがって吸光度変化を示すことが明らかであった。
実施例８：補助ブロッカーを使用した条件での、反応液体クロマトグラフィー法による血清リピドフラクションとの反応特異性
１．３ｍＭ−ＥＳＰＴを含む４０ｍＭ−Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．８）（以下、Ｄ溶液と称する）０．７５ｍｌに、試料としてプール血清１０μｌを加え、３７℃で５分間加温した。これに２ｍＭ−４−ＡＰ、２０μｇ／ｍｌペルオキシダーゼ、０．２％ｎ−ＯＴＧ、０．３６％牛アルブミン、３ｍＭコール酸ナトリウム、４ｕ／ｍｌコレステロールオキシダーゼ、及び０．５ｕ／ｍｌコレステロールエステラーゼを含む４０ｍＭ−Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．８）（以下、Ｅ溶液と称する）０．２５ｍｌを添加し、５分間加温した。これに１Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液７０μｌを添加して反応を止め、反応混合液Ｍ３を得た。また、前記Ｅ溶液の代わりに、Ｅ溶液から牛アルブミンを除いた溶液を使用して同様の操作を実施し、反応混合液Ｍ４を得た。更に、酵素反応前のコントロールとして、Ｅ溶液０．２５ｍｌへ１Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液７０μｌを先に加え、反応停止させてから、Ｄ溶液０．７５ｍｌを添加したもの（反応混合液Ｍｏ）を調製した。
各反応混合液は、実施例４に示した反応液体クロマトグラフィー法により分析した。図８に、反応混合液Ｍ３のクロマトグラム〔曲線（ａ）〕及び酵素反応前のコントロールである反応混合液Ｍｏのクロマトグラム〔曲線（ｃ）〕を、反応混合液Ｍ４のクロマトグラム〔曲線（ｂ）〕及び酵素反応前のコントロールである反応混合液Ｍｏのクロマトグラム〔曲線（ｃ）〕を図９に示す。なお、図８には、試料としてプール血清を精製水に換えて反応混合液Ｍ３と同様に操作し調製した試薬盲検例のクロマトグラム〔曲線（ｄ）〕も併せて示す。
アルブミンを添加した時の反応では、ＨＤＬのピークだけが消失したのに対し、アルブミン無添加の反応では、更にＶＬＤＬ及びＬＤＬのピークも減少を始めることが判明した。従って、補助ブロッカー存在下においても、アルブミンの添加は、ＬＤＬコレステロールやＶＬＤＬコレステロールと酵素との反応を抑制し、ＨＤＬコレステロールとのみ特異的に反応させていることが明らかであった。
実施例９：補助ブロッカーを使った場合の実検体の測定
本発明の試薬組成物として、１．３ｍＭ−ＥＳＰＴを含む４０ｍＭ−Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）〔＝試薬１〕２２５μｌと、２ｍＭ−４−ＡＰ、２０μｇ／ｍｌペルオキシダーゼ、０．２％ｎ−ＯＴＧ、０．０９％牛アルブミン、３ｍＭコール酸ナトリウム、４ｕ／ｍｌコレステロールオキシダーゼ、及び１ｕ／ｍｌコレステロールエステラーゼを含む４０ｍＭ−Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）〔＝試薬２〕７５μｌとの２試薬系の構成をとる試薬組成物を用い、試料３μｌを用いる条件で、自動分析装置を使って測定した。試薬１との反応時間は５分間で、続く試薬２との反応時間も５分間とし、主波長５４６ｎｍ及び副波長７００ｎｍで測定を行った。血清検体７６例は、予め沈殿法（第一化学製）による測定を実施し、比較対照した。また、両測定法での標準物質としては、脂質測定用標準血清（福祉・医療技術振興会製）を用いた。両測定法の相関関係を図１０に示す。本発明方法は、従来から常用されている沈殿法と良好な相関性を示し、本発明方法によるＨＤＬコレステロールの測定が正確であることが確認された。
実施例１０：乾式測定系での実検体の測定
本発明の試薬組成物として、５ｍＭＥＳＰＴ，２ｍＭ４−ＡＰ，１ｍｇ／ｍｌペルオキシダーゼ，４％牛アルブミン，３ｍＭコール酸ナトリウム，１．４ｕ／ｍｌコレステロールオキシダーゼ、及び０．７６ｕ／ｍｌコレステロールエステラーゼを含む４０ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．２）を使用し、透明基材（ポリスチレン製）上に前記試薬組成物２０μｌをスポットし、乾燥させた。試料５μｌを乾燥試薬組成物上にのせて、８分間アルミニウムブロック上で３７℃に加温した。発色物は、反射式デンシトメーター分析により測定した。血清検体１９例は、予め沈殿法（第一化学製）による測定を行い、比較対照した。また、両測定法での標準物質としては、脂質測定用標準血清（福祉・医療技術振興会製）を用いた。両測定法の相関関係を図１１に示した。本発明法は、従来から常用されている沈殿法と傾き＝０．９７及び切片＝−６．１ｍｇ／ｄｌ，相関係数＝０．９０２と良好な相関性を示し、本発明方法によるＨＤＬコレステロールの測定が正確であることが確認された。
産業上の利用可能性
試料（血清又は血漿）の遠心操作を行うことなく、簡便な操作で、ＨＤＬコレステロールの高精度の測定を行うことができる。
以上、本発明を特定の態様に関して説明したが、当業者に自明の変形は本発明に含まれる。Technical field
The present invention relates to a specific method for measuring high density lipoprotein (HDL) cholesterol and a composition for measurement.
Background art
In recent years, cholesterol contained in each lipid fraction in plasma or serum has been regarded as important as a diagnostic material indicating the risk of atherosclerosis and myocardial infarction. Serum lipid fractions are different in size as lipid complex particles, and in accordance with ultracentrifugation, which is a separation method utilizing the difference in specific gravity, chylomicron, very low density lipoprotein (hereinafter also referred to as VLDL) ), Low density lipoprotein (hereinafter also referred to as LDL), and high density lipoprotein (hereinafter also referred to as HDL). Each lipid fraction is roughly classified into apolipoprotein and lipid, and lipid is further composed of free cholesterol, ester cholesterol, triglyceride, and phospholipid. For this reason, cholesterol is measured for both free and ester types.
In routine clinical tests, automatic cholesterol analyzers are widely used to measure total cholesterol, but the lipid fraction requires sample pretreatment (fractionation / separation). Therefore, the spread of automatic analysis measurement (automation) by the enzyme method was delayed. As the pretreatment of this sample, various precipitation methods are performed, for example, phosphotungstic acid and magnesium ion, dextran sulfate and magnesium ion, heparin and calcium ion or manganese ion (M. Burstein and HR Scholnick). , Adv. Lipid Res., 11, 67, 1973; and GR Warnick et al., Clin. Chem., 25, 596, 1979), or adding polyethylene glycol to precipitate LDL or the like and centrifuging. Thus, a method using the supernatant as a test sample is frequently used. Specifically, when phosphotungstic acid and magnesium ions are used as the precipitating agent, a sample (serum or plasma) is added to a solution containing them, and the lipid fraction other than HDL is made into an insoluble complex. The precipitate is removed by centrifugation, and the supernatant containing HDL is recovered. The fractionated HDL is an enzyme reagent for measuring total cholesterol and can be measured by an automatic analysis system.
In addition, in the immunization method (CC Heuck, Clin. Chem., 31, 252, 1985), an antibody against apolipoprotein B (not included in HDL) as a precipitant is added as a sample (serum or plasma), Precipitate lipid fractions other than HDL. Thereafter, after fractionation in the same manner, HDL-containing cholesterol in the supernatant can be measured for the first time. As described above, all of the conventional methods have a drawback of requiring many steps and time.
Recently, there have been reports on measurement methods that do not require such fractionation operations (for example, JP-B-6-16720, JP-B-7-34760, or JP-A-58-165800). That is, as an enzyme method for measuring total cholesterol conventionally used, a cholesterol ester is hydrolyzed by cholesterol esterase, cholesterol oxidase is allowed to act on cholesterol, which is the enzyme reaction product, and dissolved oxygen is used. The hydrogen peroxide produced by the oxidation reaction is colored by the peroxidase reaction in the presence of a suitable oxidizable color former for colorimetric determination or consumed during the oxidation reaction with cholesterol oxidase. A method for measuring the amount of dissolved oxygen with an oxygen electrode has been known.
For example, according to the description of each of the above patent publications, the presence of a nonionic polyethylene oxide group-containing surfactant together with a bile salt in the reaction system is important for the expression of cholesterol esterase activity. If it is not present, it is said that the activity is not expressed. In addition, regarding bile salts, the involvement in the expression of activity has already been clarified in the purification of the enzyme (J. Hynn et al., JBC, 244, 1937, 1969; and KB Calamet et al.). al., Arch. Biochem. Biophys., 168, 57, 1975). And in Japanese Patent Publication No. 6-16720, this bile salt dissolves only milk fat particles, VLDL and LDL, which are lipoproteins rich in lipids and having relatively few proteins, Since there is an effect of causing the contained cholesterol to participate in the enzyme reaction, before the measurement of HDL cholesterol, this is reacted, then the above-mentioned surfactant is added, and the cholesterol and enzyme contained in the HDL fraction are added. A method for specifically fractionating and measuring HDL cholesterol by reacting is described. That is, first, lipid fractions other than HDL are reacted, and then reacted with HDL fractions to read the difference between the two.
Japanese Examined Patent Publication No. 7-34760 discloses a method of using a pancreatic cholesterol esterase as a cholesterol esterase in the same system as described above. In this method, since the cholesterol contained in the LDL fraction is first released, the measurement signal is initially proportional to the cholesterol content of the LDL fraction, but within a certain time after a certain time has elapsed from the start of the reaction. For example, a characteristic reaction course proportional to the HDL cholesterol concentration is shown only for the amount of change in absorbance within the time period from 2 minutes to 15 minutes after the start of the reaction. Furthermore, by adding an anti-LDL antibody to the reaction system, a complex by an antigen-antibody reaction is formed between apolipoprotein B, which is a main constituent protein of LDL and VLDL, and the antibody, and the reaction with the enzyme. Ingeniously improving the specificity for the HDL fraction by inhibiting the HDL.
However, these methods are not sufficient for automated analyzers used daily due to manufacturing costs and measurement operations, such as adding new antibodies to the reagents and requiring a reaction time of 20 minutes or more. Met.
On the other hand, H.C. Sugiuchi et al. (Clin. Chem., 41, 717, 1995) report a new method adapted to an automated analyzer. That is, an enzyme obtained by binding polyethylene glycol to the enzyme to be used (cholesterol esterase and cholesterol oxidase) and chemically modifying the enzyme is used. Furthermore, in addition to the above-mentioned polymerizing enzyme, a cyclodextrin derivative (specifically, sulfated α-cyclodextrin) that has affinity for various lipid fractions is allowed to coexist so that lipids other than HDL can be used. It is described that a complex can be formed for the fraction. Since this complex is less susceptible to the reaction by the polymerizing enzyme, the HDL fraction can be specifically measured. However, when such a method is adopted, the modification of the enzyme increases the number of new steps, controls the purity of the enzyme preparation, controls and controls the fluctuation of enzyme activity due to the difference in the degree of chemical modification, and further New problems such as maintaining stability will accompany.
In view of the fact that measurement by an automatic analyzer, which is a quick and simple means, is the mainstream in current clinical laboratory tests, the present inventors have performed centrifugation of a sample (serum or plasma) in a method for measuring HDL cholesterol. As a result of intensive research for the purpose of developing a method capable of obtaining high-precision measurement results with simple operation without performing, the enzymes (cholesterol esterase and cholesterol oxidase) and lipids used in the HDL cholesterol measurement method Regarding the reaction with cholesterol containing fractions, it has been found that there are compounds that do not affect the reaction of HDL fractions with cholesterol but inhibit the reaction of LDL and VLDL fractions with cholesterol. (Serum or plasma) centrifugation Ukoto not a simple operation, found that it is possible to measure the HDL cholesterol with high accuracy. The present invention is based on these findings.
Disclosure of the invention
Accordingly, the present invention provides a biological sample, cholesterol esterase derived from pancreas, cholesterol oxidase, and bile acid or a salt thereof in contact with albumin in a condition where albumin is present, and high-density lipoprotein cholesterol in the biological sample. The present invention relates to a method for measuring high density lipoprotein cholesterol, comprising measuring a compound consumed or produced by an enzyme reaction with each of the enzymes.
Further, the present invention is to measure a compound consumed or produced by an enzymatic reaction between the cholesterol and each enzyme by contacting high density lipoprotein cholesterol, cholesterol esterase and cholesterol oxidase in a biological sample. A reagent composition for specifically quantifying high-density lipoprotein cholesterol, comprising albumin, bile acid or a salt thereof, and pancreatic cholesterol esterase as the cholesterol esterase It also relates to a reagent composition.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the effect of adding sodium cholate or albumin as the reaction time-dependent change between an enzyme and LDL when an LDL fraction is used as a test sample.
FIG. 2 is a graph showing the time course of absorbance of HDL, LDL, VLDL, and normal pool serum according to the present invention.
FIG. 3 is a chromatogram of the reaction mixture after reacting the reagent composition of the present invention with pooled serum for 5 minutes.
FIG. 4 is a chromatogram of the reaction mixture after reacting the reagent composition of the present invention with pooled serum for 10 minutes.
FIG. 5 is a graph showing the correlation of measured HDL cholesterol values between the present invention and the conventional method (precipitation method).
FIG. 6 is a graph showing the effect of adding albumin in the case where the LDL fraction is used as a test sample as a change with time of the reaction between the enzyme and LDL.
FIG. 7 is a graph showing the albumin addition effect as a change in absorbance over time when serum is used as a test sample.
FIG. 8 is a chromatogram of the reaction mixture after reacting the auxiliary blocker-containing reagent composition according to the present invention with pooled serum for 5 minutes.
FIG. 9 is a chromatogram of the reaction mixture after reacting the auxiliary blocker-containing reagent composition not containing albumin with the pooled serum for 5 minutes.
FIG. 10 is a graph showing the correlation of measured HDL cholesterol values between the present invention (in the presence of an auxiliary blocker) and the conventional method (precipitation method).
FIG. 11 is a graph showing the correlation of measured HDL cholesterol values between the present invention (dry measurement system) and the conventional method (precipitation method).
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In the present invention, the serum or plasma of mammals (particularly humans) can be used as it is as a biological sample. That is, it is not necessary to fractionate serum or plasma by centrifugation or the like or to treat with antibodies.
In the present invention, when the biological sample is brought into contact with cholesterol esterase and cholesterol oxidase, the reaction between these enzymes and HDL cholesterol is not affected, but is a compound that inhibits the reaction with LDL cholesterol and VLDL cholesterol, Albumin is used as a blocker.
In the present invention, when the test sample is derived from blood (serum or plasma), albumin is already contained in the test sample. However, when the concentration of albumin derived from a sample is 0.01% by weight or less in a measurement system, that is, a system that performs measurement by mixing a reagent and a sample, the effect of the present invention can be sufficiently obtained. Can not. On the other hand, when the concentration of albumin derived from the sample is sufficiently high, it is not particularly necessary to add artificially, but there is no problem even if albumin is further added.
Further, when using a purified lipid fraction not containing albumin or another biological fluid sample (for example, a pancreatic juice or a tissue extract) as a test sample, it is necessary to add albumin to coexist. The albumin concentration in the case of adding albumin is preferably 0.01 to 20% by weight, more preferably 0.03 to 10% by weight. The origin of the albumin to be added is not particularly limited, and for example, those derived from mammals such as cows, humans, sheep, and horses, and those produced by genetic engineering can be used.
Cholesterol esterase and cholesterol oxidase that can be used in the present invention are not particularly limited, and microorganism-derived or mammal-derived enzymes, etc. can be used. Enzymes chemically modified by binding polyethylene glycol (PEG) or the like, or Any enzyme not chemically modified can be used. As found by the present inventors, when an enzyme that is not chemically modified is used in the present invention, particularly when cholesterol esterase that is not chemically modified is used, the reactivity varies depending on the origin of the enzyme. Preferably, it is more effective to select a cholesterol esterase derived from the pancreas of a mammal such as a cow or pig. Further, as the cholesterol oxidase, for example, cholesterol oxidase derived from microorganisms belonging to the genus Streptomyces or Nocardia can be used. The addition amount of these enzymes is also not particularly limited, but in the measurement system, for example, it is preferably 0.05 u / ml to 90 u / ml, more preferably 0.1 u / ml to 20 u / ml.
When pancreatic cholesterol esterase is used, it is preferable to use bile acid or a salt thereof simultaneously. The concentration is preferably 0.05 to 4 mM, more preferably 0.15 to 1.5 mM in the measurement system. The type of the bile acid or a salt thereof is not particularly limited. Examples of the bile acid include cholic acid, taurocholic acid, glycocholic acid, chenodeoxycholic acid, deoxycholic acid, and lithocholic acid. Examples of the salt thereof include sodium salt. In view of high water solubility, it is preferable to use bile salts such as sodium cholate, sodium glycocholate, or sodium deoxycholate.
In the present invention, the auxiliary blocker is preferably represented by the general formula (I):
A- (CH₂N-CH_Three (I)
In the formula, A is a glucoside group, a thioglucoside group, a sucroseoxycarbonyl group, or an N-methylglucamide carbonyl group, and n is an integer of 4 to 10, or a general formula ( II):
B-CH₂-CH (R¹) -CH₂-SO_Three ^- (II)
[Wherein B is a 3- (3-colamidopropyl) dimethylammonio group, R¹Is a hydrogen atom or a hydroxy group], at least one compound represented by
In the compound represented by the general formula (I), when A is a glucoside group or a thioglucoside group, n is preferably 4 to 9, and more preferably 5 to 8. The glucoside group is preferably a glucopyranoside group, more preferably a β-D-glucopyranoside group. The thioglucoside group is also preferably a thioglucopyranoside group, more preferably a β-D-thioglucopyranoside group. Specific examples of compounds in the case where A is a glucoside group include n-octyl-β-D-glucoside (hereinafter also referred to as n-ODG) and n-heptyl-β-D-glucoside (hereinafter referred to as n-). Also referred to as HDG). Moreover, as a compound in case A is a thioglucoside group, specifically, n-octyl-β-D-thioglucoside (hereinafter also referred to as n-OTG) and n-heptyl-β-D-thioglucoside (Hereinafter also referred to as n-HTG).
In the compound represented by the general formula (I), when A is a sucroseoxycarbonyl group, n is preferably 6 to 10, more preferably 7 to 9. In this case, Specifically, sucrose monocap plate (hereinafter also referred to as SM-1000) can be used.
In the compound represented by the general formula (I), when A is an N-methylglucamide carbonyl group, n is preferably 5 to 9. Specific examples of the compound when A is an N-methylglucamide carbonyl group include octanoyl-N-methylglucamide (hereinafter also referred to as MEGA-8), nonanoyl-N-methylglucamide (hereinafter referred to as MEGA). -9) and decanoyl-N-methylglucamide (hereinafter also referred to as MEGA-10).
Specific examples of the compound represented by the general formula (II) include 3-[(3-colamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (hereinafter also referred to as CHAPS) and 3-[( 3-Colamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxy-1-propanesulfonate (hereinafter also referred to as CHAPSO).
In the present invention, the auxiliary blocker, that is, the compound represented by the general formula (I) or the compound represented by the general formula (II) can be used alone or in any combination of two or more. .
In the present invention, the auxiliary blocker is preferably used as an aqueous solution. The concentration of the auxiliary blocker in the aqueous solution is preferably 0.01 to 2.0% by weight, preferably 0.02 to 1.0% by weight, more preferably 0.03 to 0.5% by weight in the measurement system. is there. If the concentration of the auxiliary blocker is less than 0.01% by weight, an inhibitory effect on the enzymatic reaction of LDL and VLDL fractions with cholesterol is not observed, and accurate measurement cannot be performed. On the other hand, when the concentration exceeds 2.0% by weight, the specificity of the fraction to the enzyme reaction with cholesterol is not seen at all, and the solubility of the auxiliary blocker is also inconvenient.
According to the present invention, a test sample (eg, serum) can be obtained in the presence of albumin (blocker) without subjecting the test sample (eg, serum or plasma) to fractionation such as centrifugation before measurement. Or plasma) and the enzyme are brought into contact (coexistence), thereby inhibiting the reaction between the LDL cholesterol and VLDL cholesterol in the test sample and the enzyme, and proceeding without inhibiting the reaction between the HDL cholesterol and the enzyme, HDL cholesterol can be quantified by detecting a compound (for example, oxygen) consumed by an enzyme reaction between cholesterol and each enzyme or a compound (for example, hydrogen peroxide) to be produced by a known means. For example, when hydrogen peroxide is detected, H produced in the presence of a suitable oxidizable color former and peroxidase.₂O₂The color can be developed and spectrocolorimetrically measured.
H₂O₂Can be developed by a known method, for example, by peroxidase reaction in the presence of an applicable oxidizable color former. Examples of oxidizable color formers include 3-hydroxy-2,4,6-triiodobenzoic acid (HTIBA), N-ethyl-N-sulfopropyl-m-toluidine (ESPT) and 4-aminoantipyrine (4-AP). For example, HTIBA and ESPT can be appropriately contained in a concentration range of 0.1 mM to 5 mM, and 4-AP can be appropriately contained in a concentration range of 0.05 mM to 2 mM. In the measurement by the automatic analyzer, the absorbance at a wavelength of 510 nm (when using HTIBA) or 546 nm (when using ESPT) may be measured.
The reagent composition for HDL cholesterol measurement according to the present invention contains pancreatic cholesterol esterase, cholesterol oxidase, albumin, and bile acid or a salt thereof. The reagent composition for measurement according to the present invention may optionally further contain one or more compounds represented by the general formula (I) or the general formula (II) as an auxiliary blocker.
The reagent composition for measurement according to the present invention is preferably 0.05 to 90 u / ml of cholesterol esterase derived from pancreas, more preferably 0.05 to 10 u / ml, and more preferably 0.05 to 90 u / ml of cholesterol oxidase. Is 0.1 to 20 u / ml, albumin is 0.01 to 20% by weight, more preferably 0.02 to 10% by weight, and bile acid or a salt thereof is 0.05 to 4 mM, more preferably 0.15 to 1. 0.5 mM and optionally the auxiliary blocker 0.01 to 2.0% by weight, more preferably 0.03 to 0.5% by weight.
The reagent composition for measurement of the present invention can be configured and used as a single reagent, or can be made into a two-reagent system in accordance with currently used automatic analyzers. In the case of a two-reagent system, for example, albumin, or albumin and one or more auxiliary blocker compounds can be included in either the first reagent or the second reagent, either alone or in combination, Can contain cholesterol esterase and cholesterol oxidase (and optionally bile acids or salts thereof). Examples of the single reagent and the buffer for the first reagent and the second reagent include Good buffer (for example, BES, HEPES, PIPES, or Bis-Tris), phosphate buffer, acetate buffer, Tris buffer, and the like. Liquid, imidazole buffer, or the like can be used. The concentration of the buffer is preferably 5 to 1000 mM, more preferably 5 to 500 mM, and most preferably 10 to 200 mM. In addition, the pH of these buffers is preferably 4.5 to 8.0, more preferably within the range of pH 5.5 to 7.5 in which inhibition of LDL cholesterol and VLDL cholesterol and enzyme is good. You can choose.
A reaction system for measuring HDL cholesterol using the reagent composition according to the present invention is schematically shown as follows.
(Specificity specification)

[Enzyme reaction and color reaction]

In the measurement by the automatic analyzer, H generated mainly by the reaction formula (2) using the liquid reagent composition according to the present invention.₂O₂Can be measured by a colorimetric method to perform multi-analyte processing. The present invention can be used not only for reactions in these solutions, but also for dry measurement systems (dry chemistry) using, for example, filter paper test pieces. That is, the present invention can be used for individual examination requests as a simple measurement method, apart from multi-sample processing by an automatic analyzer. When the present invention is applied to a dry measurement system using a transparent test piece such as polystyrene and measurement is performed by a reflection densitometry method, the liquid single reagent composition according to the present invention prepared in an appropriate buffer solution is usually used. The transparent test piece can be impregnated and dried by a conventional method. In addition, a dry analytical element including a spreading layer, a reagent layer, and a reflective layer can be produced by a conventional method in which the reagent layer contains the single reagent composition according to the present invention. Furthermore, when a dry analysis element with a separate membrane or separation layer for blood cell components in blood is used, blood is directly measured directly as a sample even in facilities that do not have serum separation equipment or plasma separation equipment. be able to.
When practicing the present invention, the produced H₂O₂Changes in the oxidation current generated by using a platinum electrode directly or by reacting with an appropriate mediator such as ferrocene in the presence of peroxidase, or via an appropriate mediator such as potassium ferrocyanide during direct cholesterol oxidase reaction The amount can also be measured electrochemically. On the other hand, a compound consumed by an enzyme reaction, for example, oxygen consumed by the reaction formula (2) (dissolved oxygen) can be measured by a conventionally known method, for example, an oxygen electrode. Moreover, as a compound produced | generated by an enzyme reaction, (DELTA) 4-cholesten-3-one which is a product of the said Reaction formula (2) other than the said hydrogen peroxide, for example can also be measured by an appropriate method. Good.
Although not limited to the following description, in the present invention, in the reaction of enzymes (cholesterol esterase and cholesterol oxidase) used in the method for measuring HDL cholesterol and lipid fraction-containing cholesterol, albumin and bile acid or its The auxiliary blocker that can coexist with one or more of the salts and optionally has direct affinity for the apolipoprotein of the lipid fraction or indirectly interact with the enzyme during the reaction of the cholesterol of the lipid fraction with the enzyme It is thought to do.
That is, each lipid fraction is a lipid complex composed of a lipid and an apolipoprotein, but the difference in lipid composition ratio and the type of apolipoprotein (A-1, A-1, B-100, B-48). , C, or E), and the difference in physicochemical properties and quantity (amount contained in each fraction). Because the difference in the type of apolipoprotein that differs most significantly between the HDL fraction and the LDL and VLDL fractions (the former is A-1 or A-2 and the latter is B-100, C or E) is clear, Conventionally, a method using an antibody against apolipoprotein has also been developed. This conventional method is characterized in that antibodies against apolipoproteins B and C are mixed with a sample to form an immune complex. Since this immune complex causes inhibition of enzyme reaction, only HDL cholesterol reacts with the enzyme when the enzyme is added next, so that only HDL cholesterol can be measured. However, it is difficult to keep the reactivity of antibodies capable of forming immune complexes constant, and the turbidity of the immune complex itself is significant, so that the error in colorimetric determination for cholesterol measurement increases. was there.
In the above Japanese Patent Publication No. 7-34760, anti-LDL antibody or anti-apolipoprotein B antibody is used, and cholesterol derived from pancreas is present in the presence of bile acid group surfactant, nonionic surfactant and cholesterol oxidase. A method for improving the specificity of the esterase reaction is disclosed. Although the use of these antibodies is additive, similar disadvantages arise as long as immune complexes are formed. The settings of the reaction conditions when no antibody is used are similar to those of the present invention, but the difference in enzyme reaction characteristics due to the coexistence of albumin and possibly bile acids or salts thereof is essential. It is clear from the following explanation that both inventions are based on different reaction mechanisms.
According to Japanese Patent Publication No. 6-16720, the reaction of LDL cholesterol and VLDL cholesterol with cholesterol esterase and cholesterol oxidase first proceeds in the presence of bile salts. Next, since the reaction with HDL cholesterol starts by adding a nonionic polyethylene oxide group-containing surfactant, the amount of HDL cholesterol can be measured by determining the difference in absorbance change obtained by these two-phase reactions. It is supposed to be.
Also, according to the disclosure of Japanese Patent Publication No. 7-34760, the enzyme reaction is 2 in the coexistence of a bile acid group surfactant and a nonionic surfactant as in the above Japanese Patent Publication No. 6-16720. It has been shown to elapse in phase. First, the reaction with LDL cholesterol proceeds, and the reaction with HDL cholesterol starts with a time delay. For this reason, it is supposed that the absorbance change in a predetermined time range is proportional to the HDL cholesterol concentration within a suitably selected range of, for example, 2 to 15 minutes after the start of the reaction.
In contrast, in the present invention, LDL cholesterol and VLDL cholesterol do not react with cholesterol esterase and cholesterol oxidase by coexisting albumin and bile acids or salts thereof, and optionally one or more auxiliary blockers. It was found that the conditions exist and therefore the amount of change at any time from the start of the reaction is all dependent on the HDL cholesterol concentration. In the present invention, the object can be achieved by the coexistence of albumin, bile acid or salt thereof and pancreatic cholesterol esterase. As described above, the cholesterol esterase derived from the pancreas requires bile acid or a salt thereof for its activity expression. This reaction specificity can be easily examined, for example, by comparing the reactivity with each lipid fraction separated and purified from serum. More precisely, in order to examine the reaction with serum without separating each lipid fraction in advance, it can be directly verified by using a reaction liquid chromatography method. The reaction of the enzyme with LDL cholesterol and VLDL cholesterol varies depending on the concentration of bile acid or its salt, and the higher the concentration, the faster the reaction.
On the other hand, it was found that when albumin was added in the presence of a constant concentration of bile acid or a salt thereof, the enzyme reaction was inhibited depending on the albumin concentration, but not inhibited by the reaction between the enzyme and HDL cholesterol. Thus, the effect of albumin capable of imparting specificity to the enzyme reaction is a very specific property that is not recognized by other proteins and the like, and this property is maintained across species. The concentration-dependent enzyme activation reaction by these bile acids or salts thereof and the enzyme activity inhibitory effect on albumin concentration-dependent LDL cholesterol and VLDL cholesterol show similar and opposite behaviors. In the reaction of the enzyme with LDL cholesterol and VLDL cholesterol, it suggests the existence of an interaction site where both work competitively.
In the present invention, since the enzyme reaction proceeds in a HDL cholesterol-specific manner, it proceeds in one phase, and a reaction change amount dependent on the HDL cholesterol concentration can be obtained immediately after the start of the reaction with the highest reaction rate. Therefore, in this respect, it is understood that the present invention has excellent properties not found in the reaction characteristics in the conventional method described in the above publication. Further, preferably, the coexistence of one or more auxiliary blockers can, for example, expand the usable pH condition to the weak alkali side or reduce the amount of albumin used. Of course, it was clear that when deviating from the preferred conditions, the specificity also decreased and the reaction of HDL cholesterol followed by LDL cholesterol and VLDL cholesterol started to progress. In particular, in a simple test using dry chemistry, which requires rapid measurement, measurement in units of several seconds within one minute is desired. The difference in principle is clear enough to recognize the essential difference between them.
Example
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but these do not limit the scope of the present invention. In the following examples, pancreatic cholesterol esterase was used as cholesterol esterase unless otherwise specified.
Example 1: Fractionation of lipid fraction by ultracentrifugation
The fractionation of lipid fractions by ultracentrifugation was performed according to the method of Kudo Akio et al. (Arteriosclerosis, 6, 39, 1978). Specifically, 16 mg of pooled serum was dissolved by adding 16 mg of EDTA sodium salt, 4 g of sucrose, 3.2 g of potassium bromide, and 0.8 g of sodium chloride. Separately, three types of specific gravity liquids were prepared. That is, a specific gravity liquid having a specific gravity of 1.21 was prepared by dissolving 20 g of sucrose, 15 g of potassium bromide, and 5 g of sodium chloride in 100 ml of purified water. A specific gravity liquid with a specific gravity of 1.063 was prepared by mixing 30 ml of the specific gravity liquid with a specific gravity of 1.21 and 70 ml of purified water. A specific gravity liquid having a specific gravity of 1.006 was prepared by dissolving 2.5 g of sucrose in 97.5 ml of purified water.
1.9 ml of the above-mentioned treated serum was put into a 10 ml capacity centrifuge tube, and 0.8 ml of a specific gravity liquid having a specific gravity of 1.21 was gently overlaid on the upper layer with a syringe, and the centrifuge tube was centrifuged at 50000 rpm at 10 ° C. for 20 hours. . After completion of the centrifugation, all lipid fractions having a specific gravity of 1.21 or less are collected in the uppermost layer portion, and 1.6 ml of a specific gravity solution having a specific gravity of 1.063 and a specific gravity solution of a specific gravity of 1.006 are further collected on the uppermost layer portion. 2 ml was overlaid.
The centrifuge tube was further centrifuged at 50000 rpm for 4 hours, and each lipid fraction was collected.
Each fraction was dialyzed overnight against physiological saline (under refrigeration) and then stored refrigerated.
Example 2: Activation reaction by sodium cholate and inhibitory effect by albumin
40 mM-Bis-Tris buffer (pH 6.2) containing 1 mM-ESPT, 0.5 mM-4-AP, 5 μg / ml peroxidase, 1 u / ml cholesterol oxidase, and 0.25 u / ml cholesterol esterase (hereinafter, buffer solution) 1.0 ml) was warmed at 37 ° C. for 5 minutes. To this buffer X, 10 μl of the LDL fraction prepared in Example 1 was added, and the color change with time was recorded at a wavelength of 546 nm. The results are shown in FIG. 1 (curve a in FIG. 1). Little change in absorbance was observed.
Next, instead of the buffer solution X, a similar measurement was performed using a buffer solution (hereinafter referred to as buffer solution Y) containing 0.75 mM sodium cholate in the buffer solution X. The result is shown by curve b in FIG. A change in absorbance was observed, indicating that the reaction between the enzyme and cholesterol in the LDL fraction was activated by sodium cholate.
Subsequently, the same measurement was performed using a buffer solution (hereinafter referred to as buffer solution Z) containing 0.8% bovine albumin in the buffer solution Y instead of the buffer solution X. The result is shown by curve c in FIG. There was almost no change in absorbance, and it was found that the reaction between the enzyme and cholesterol in the LDL fraction was suppressed by the addition of albumin.
Example 3: Time course of reaction
Buffer Z 1.0 ml was warmed at 37 ° C. for 5 minutes. To this buffer Z, 20 μl of the HDL fraction prepared in Example 1, 10 μl of the LDL fraction, 10 μl of the VLDL fraction, or 10 μl of normal pooled serum were added as samples, and the change in absorbance at a wavelength of 546 nm was recorded.
The results are shown in FIG. In FIG. 2, “HDL” indicates the result when the HDL fraction is used as the sample, “LDL” indicates the result when the LDL fraction is used as the sample, and “VLDL” indicates the result when the VLDL fraction is used as the sample. "Serum" shows the results when normal pooled serum was used as a sample. Compared with the HDL fraction, inhibition of the reaction of the LDL and VLDL fractions against cholesterol was evident.
Example 4: Reaction specificity with serum lipid fraction by reaction liquid chromatography
(1) Preparation of enzyme reaction solution
10 μl of pooled serum as a sample was added to 0.75 ml (hereinafter referred to as “A solution”) of 40 mM-Bis-Tris buffer solution (pH 6.2) containing 1.3 mM-ESPT, and heated at 37 ° C. for 5 minutes. To this solution was added a 40 mM Bis-Tris buffer (pH 6) containing 2 mM 4-AP, 20 μg / ml peroxidase, 1.6% bovine albumin, 3 mM sodium cholate, 4 u / ml cholesterol oxidase, and 1 u / ml cholesterol esterase. .2) 0.25 ml (hereinafter referred to as B solution) was added. After adding the solution B and warming at 37 ° C. for 5 minutes or after warming for 10 minutes, 70 μl of 1M trishydroxymethane aqueous solution is further added to terminate the enzyme reaction, whereby the reaction mixture M1 (that is, , B solution was added and heated for 5 minutes) and reaction mixture M2 (that is, the solution was heated for 10 minutes after addition of solution B) was obtained. Separately, as a control before the enzyme reaction, 70 μl of 1M trishydroxymethylaminomethane aqueous solution was first added to 0.25 ml of solution B, the reaction was stopped, and 0.75 ml of solution A was added (reaction mixture) Mc) was prepared. These reaction mixtures were analyzed by reaction liquid chromatography shown below. For each analysis, 100 μl of the reaction mixture was used.
(2) Analysis by reaction liquid chromatography
W. According to the method of Marz et al. (Clin. Chem., 39/11, 2276-2281, 1993), the behavior of lipid fraction in the serum before and after the enzymatic reaction was examined. That is, using a gel filtration column (Superose 6 column: Pharmacia), a 0.1 M phosphate buffer solution (pH 7.4) containing 0.2 M NaCl was used as an eluent to prepare a sample at a flow rate of 0.3 ml / min. separated. Next, the separated lipid fraction was combined with an enzyme reagent for measuring total cholesterol (manufactured by Yatron) flowing at a flow rate of 70 μl / min, heated for 5 minutes in a constant temperature bath at 37 ° C., and absorbance at a wavelength of 580 nm. Changes were recorded. FIG. 3 shows a chromatogram [curve (a)] of the reaction mixture M1 and a chromatogram [curve (c)] of the reaction mixture Mc as a control before the enzyme reaction, and FIG. 4 shows a chromatogram of the reaction mixture M2. 2 shows a gram [curve (b)] and a chromatogram [curve (c)] of a reaction mixture Mc which is a control before the enzyme reaction. FIG. 4 also shows a chromatogram [curve (d)] of a reagent-blind example prepared by changing the sample pool serum to purified water and operating in the same manner as the reaction mixture M1.
The elution position of each fraction was determined in advance by injecting each lipid fraction prepared in Example 1 100-fold with the eluate as a sample. Each lipid fraction was eluted from the high molecular weight VLDL according to the size of the lipid complex, and then peaks appeared in the order of LDL and HDL.
Since the peak thus obtained indicates the total cholesterol content in each lipid fraction, the change in each peak observed as a result of the enzyme reaction in the test sample is specific for each lipid fraction. And the reaction amount are shown directly. As shown in FIG. 3, only the HDL peak disappears in the 5-minute enzyme reaction, whereas in the 10-minute reaction, the VLDL and LDL peaks also start to decrease as shown in FIG. found. Therefore, in the present invention, it was clear that LDL cholesterol and VLDL cholesterol start to react after HDL cholesterol reacts specifically.
Example 5: Measurement of a real sample
As a reagent composition of the present invention, 225 μl of 40 mM Bis-Tris buffer (pH 6.2) [= reagent 1] containing 1.3 mM ESPT, 2 mM-4-AP, 20 μg / ml peroxidase, 1.6% Reagent having a two-reagent system configuration with bovine albumin, 3 mM sodium cholate, 4 u / ml cholesterol oxidase, and 40 μm Bis-Tris buffer (pH 6.2) 75 μl [= reagent 2] containing 1 u / ml cholesterol esterase The composition was used and measured using an automatic analyzer under conditions using 3 μl of sample. The reaction time with the reagent 1 was 5 minutes, and the subsequent reaction time with the reagent 2 was also 5 minutes. Ten serum specimens were previously measured by the precipitation method (Daiichi Kagaku) and compared for comparison. In addition, as a standard substance in both measurement methods, a standard serum for lipid measurement (manufactured by Welfare and Medical Technology Promotion Association) was used.
The correlation between both measurement methods is shown in FIG. The method of the present invention showed a good correlation with the conventionally used precipitation method, and it was confirmed that the measurement of HDL cholesterol by the method of the present invention was accurate.
Example 6: Relative reactivity of auxiliary blocker
Each lipid fraction (10 μl of each) fractionated in Example 1 was added to 0.75 ml of 40 mM Bis-Tris buffer (pH 7.0) containing 1 mM ESPT, and heated at 37 ° C. for 5 minutes. To this, 0.2 mM aqueous solution of 2 mM-4-AP and each auxiliary blocker shown in Table 1 below, 20 μg / ml peroxidase, 0.09% bovine albumin, 1.7 u / ml cholesterol esterase, and 4 u / ml cholesterol oxidase 0.25 ml of 40 mM Bis-Tris buffer solution (pH 7.0) containing was added, and the absorbance at a wavelength of 546 nm was measured.
The relative reactivity of each compound was determined by setting the reactivity of n-OTG to each lipid fraction as 100%. The results are shown in Table 1. The displayed values for VLDL and LDL are reaction inhibition rates. As shown in Table 1, under the conditions according to the present example, it was found that other compounds also had an inhibition rate comparable to that of n-OTG for VLDL and LDL. On the other hand, since the reaction specificity for HDL was observed, it was confirmed that the method can be applied in the method of the present invention.

Example 7: Effect of adding albumin
(1) In case of reaction with LDL fraction
10 μl of the lipid fraction LDL prepared in Example 1 as a sample was added to 0.75 ml of 40 mM BES buffer (pH 7.0) containing 1.3 mM ESPT, and the mixture was heated at 37 ° C. for 5 minutes. 40 mM- containing 3 mM sodium cholate, 2 mM-4-AP, 0.3% albumin, 20 μg / ml peroxidase, 0.2% n-OTG, 1.7 u / ml cholesterol esterase, and 4 u / ml cholesterol oxidase 0.25 ml of BES buffer (pH 7.0) was added, and the change in absorbance at a wavelength of 546 nm was recorded. As a control test, the same operation as described above was performed except that albumin was not added, and the change in absorbance (wavelength 546 nm) was also recorded. The results are shown in FIG. In FIG. 6, “added” indicates the case where albumin is added, and “no addition” indicates the case where albumin is not added. It was confirmed that the reaction between the enzyme and cholesterol in the LDL fraction was efficiently inhibited by the addition of albumin.
(2) In case of reaction with serum
0.08% bovine albumin, 0.05% n-OTG, 1 mM ESPT, 0.5 mM-4-AP, 5 μg / ml peroxidase, 0.75 mM sodium cholate, 0.13 u / ml cholesterol esterase, and 1 u / 1.0 ml of 40 mM Bis-Tris buffer (pH 6.8) containing ml of cholesterol oxidase was heated at 37 ° C. for 5 minutes. 10 μl of each of three sera (serum A to serum C) whose total cholesterol level (manufactured by Yatron, enzymatic method) and HDL cholesterol level (manufactured by Daiichi Kagaku, precipitation method) were previously measured was added to this, and the wavelength was 546 nm. The absorbance change at was recorded. Moreover, it recorded similarly about the same serum using the solution remove | excluding bovine albumin from the said buffer solution instead of the said buffer solution. In addition, reagent-blind cases were also recorded instead of serum with purified water.
The results are shown in FIG. Serum total cholesterol and HDL cholesterol levels measured in advance are: serum A at 200 mg / dl and 66 mg / dl; serum B at 198 mg / dl and 93 mg / dl; and serum C at 109 mg / dl and 38 mg / dl, respectively. there were. In FIG. 7, curves (1) to (3) are cases where no albumin was added, and curves (4) to (7) were cases where albumin was added. Curves (1) and (5) are the results for serum A, and curves (2) and (4) are the results for serum B. Curves (3) and (6) are the results for serum C. Curve (7) is a blinded reagent example. Under conditions where albumin was added, it was clear that the absorbance changed according to the HDL cholesterol value from the start of the reaction.
Example 8: Specificity of reaction with serum lipid fraction by reaction liquid chromatography method under conditions using auxiliary blocker
10 μl of pooled serum was added as a sample to 0.75 ml of 40 mM Bis-Tris buffer (pH 6.8) (hereinafter referred to as D solution) containing 1.3 mM ESPT, and the mixture was heated at 37 ° C. for 5 minutes. 40 mM containing 2 mM-4-AP, 20 μg / ml peroxidase, 0.2% n-OTG, 0.36% bovine albumin, 3 mM sodium cholate, 4 u / ml cholesterol oxidase, and 0.5 u / ml cholesterol esterase -0.25 ml of Bis-Tris buffer solution (pH 6.8) (hereinafter referred to as E solution) was added and warmed for 5 minutes. The reaction was stopped by adding 70 μl of 1M trishydroxymethylaminomethane aqueous solution to obtain a reaction mixture M3. Further, the same operation was carried out using a solution obtained by removing bovine albumin from the E solution instead of the E solution, thereby obtaining a reaction mixture M4. Furthermore, as a control before the enzyme reaction, 70 μl of 1M trishydroxymethylaminomethane aqueous solution was first added to 0.25 ml of E solution, the reaction was stopped, and 0.75 ml of D solution was added (reaction mixture Mo). Prepared.
Each reaction mixture was analyzed by the reaction liquid chromatography method shown in Example 4. FIG. 8 shows a chromatogram [curve (a)] of the reaction mixture M3 and a chromatogram [curve (c)] of the reaction mixture Mo which is a control before the enzyme reaction, and a chromatogram [curve ( b)] and a chromatogram [curve (c)] of the reaction mixture Mo which is a control before the enzyme reaction is shown in FIG. FIG. 8 also shows a chromatogram [curve (d)] of a reagent-blind example prepared by operating in the same manner as in the reaction mixture M3 by replacing the pooled serum with purified water as a sample.
It was found that in the reaction when albumin was added, only the HDL peak disappeared, whereas in the reaction without albumin, the VLDL and LDL peaks also began to decrease. Therefore, even in the presence of an auxiliary blocker, it was clear that the addition of albumin suppressed the reaction of LDL cholesterol or VLDL cholesterol with the enzyme and caused the reaction specifically with HDL cholesterol only.
Example 9: Measurement of a real sample using an auxiliary blocker
As a reagent composition of the present invention, 40 mM-Bis-Tris buffer (pH 7.0) containing 1.3 mM-ESPT (pH 7.0) [= reagent 1] 225 μl, 2 mM-4-AP, 20 μg / ml peroxidase, 0.2% 40 mM-Bis-Tris buffer (pH 7.0) [= reagent 2] containing 75 μl of n-OTG, 0.09% bovine albumin, 3 mM sodium cholate, 4 u / ml cholesterol oxidase, and 1 u / ml cholesterol esterase Using a reagent composition having a two-reagent system configuration, measurement was performed using an automatic analyzer under conditions using 3 μl of a sample. The reaction time with the reagent 1 was 5 minutes, and the subsequent reaction time with the reagent 2 was also 5 minutes. For 76 serum specimens, measurement by the precipitation method (Daiichi Kagaku) was performed in advance and compared. In addition, as a standard substance in both measurement methods, a standard serum for lipid measurement (manufactured by Welfare and Medical Technology Promotion Association) was used. The correlation between both measurement methods is shown in FIG. The method of the present invention showed a good correlation with the conventionally used precipitation method, and it was confirmed that the measurement of HDL cholesterol by the method of the present invention was accurate.
Example 10: Measurement of a real sample in a dry measurement system
As a reagent composition of the present invention, 40 mM containing 5 mM ESPT, 2 mM 4-AP, 1 mg / ml peroxidase, 4% bovine albumin, 3 mM sodium cholate, 1.4 u / ml cholesterol oxidase, and 0.76 u / ml cholesterol esterase Using Bis-Tris buffer (pH 6.2), 20 μl of the reagent composition was spotted on a transparent substrate (made of polystyrene) and dried. A 5 μl sample was placed on the dry reagent composition and warmed to 37 ° C. on an aluminum block for 8 minutes. Color development was measured by reflection densitometer analysis. Nineteen serum samples were previously measured by the precipitation method (Daiichi Kagaku) and compared for comparison. In addition, as a standard substance in both measurement methods, a standard serum for lipid measurement (manufactured by Welfare and Medical Technology Promotion Association) was used. The correlation between both measurement methods is shown in FIG. The method of the present invention shows a good correlation with the conventionally used precipitation method, the slope = 0.97, the intercept = −6.1 mg / dl, and the correlation coefficient = 0.902. It was confirmed that the measurement was accurate.
Industrial applicability
It is possible to measure HDL cholesterol with high accuracy by a simple operation without performing a centrifugation operation on a sample (serum or plasma).
While the present invention has been described with respect to particular embodiments, modifications obvious to those skilled in the art are encompassed by the present invention.

Claims

A biological sample, cholesterol esterase derived from pancreas, cholesterol oxidase, and bile acid or a salt thereof are contacted under conditions where albumin is present, and the enzyme of high density lipoprotein cholesterol in the biological sample and each of the enzymes A method for measuring high-density lipoprotein cholesterol, comprising measuring a compound consumed or produced by a reaction.

The method according to claim 1, wherein the method is carried out under a condition where albumin is present in an amount of 0.01% by weight or more of the entire measurement system.

The method according to claim 2, wherein albumin is added as a reagent.

Furthermore, the general formula (I):
_{A- (CH 2) n-CH} 3 (I)
In the formula, A is a glucoside group, a thioglucoside group, a sucroseoxycarbonyl group, or an N-methylglucamide carbonyl group, and n is an integer of 4 to 10, or a general formula ( II):
B—CH ₂ —CH (R ¹ ) —CH ₂ —SO ₃ ^— (II)
[Wherein B is a 3- (3-colamidopropyl) dimethylammonio group, and R ¹ is a hydrogen atom or a hydroxy group], and at least one compound represented by The method as described in any one of.

The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the biological sample is serum or plasma.

A high density lipoprotein cholesterol, cholesterol esterase, and cholesterol oxidase in a biological sample are brought into contact with each other, and a compound consumed or produced by an enzymatic reaction between the cholesterol and each of the enzymes is measured. A reagent composition for specifically quantifying protein cholesterol, comprising albumin, bile acid or a salt thereof, and pancreatic cholesterol esterase as the cholesterol esterase.

The liquid composition containing pancreatic-derived cholesterol esterase, cholesterol oxidase, albumin, bile acid or a salt thereof, and a buffer solution.

The composition according to claim 6, comprising a liquid first reagent containing albumin and a buffer solution and a liquid second reagent containing pancreatic cholesterol esterase, cholesterol oxidase and a buffer solution.

Furthermore, the general formula (I):
_{A- (CH 2) n-CH} 3 (I)
In the formula, A is a glucoside group, a thioglucoside group, a sucroseoxycarbonyl group, or an N-methylglucamide carbonyl group, and n is an integer of 4 to 10, or a general formula ( II):
B—CH ₂ —CH (R ¹ ) —CH ₂ —SO ₃ ^— (II)
8 or 7 containing at least one compound represented by the formula: wherein B is a 3- (3-collamidopropyl) dimethylammonio group and R ¹ is a hydrogen atom or a hydroxy group. The composition described

The composition of Claim 8 which contains at least 1 sort (s) of the compound represented by the said general formula (I), or the compound represented by general formula (II) in a 1st reagent and / or a 2nd reagent.

A dry analytical element comprising a reagent region impregnated with a composition containing pancreatic cholesterol esterase, cholesterol oxidase, albumin, bile acid or a salt thereof, and a buffer and dried.