JP3873181B2

JP3873181B2 - Osteoarthritis treatment

Info

Publication number: JP3873181B2
Application number: JP2000185645A
Authority: JP
Inventors: 浩之青野; 美和高井
Original assignee: Santen Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Santen Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-06-21
Filing date: 2000-06-21
Publication date: 2007-01-24
Anticipated expiration: 2020-06-21
Also published as: JP2001064168A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はメルカプトアシルシステイン誘導体を有効成分とする変形性関節症治療剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
変形性関節症（Osteoarthritis、ＯＡ）は、加齢による関節局所での軟骨の退行性変性や、機械的ストレスによる進行性の分解を伴う関節の破壊と骨軟骨の増殖性変化を特徴とする疾患である。
【０００３】
変形性関節症の疾患の場は関節局所、主に荷重関節に限定される。リウマチ疾患のような全身性の自己免疫疾患とは異なり、変形性関節症の関節液は非炎症性である。また、その末梢血には異常所見をほとんど認めず、一般に赤沈値、ＣＲＰ値は正常で、リウマチ因子は陰性である。
【０００４】
変形性関節症の病因に関してはこれまでの研究により種々の可能性が示唆されている。
【０００５】
その１つは加齢に伴って、軟骨細胞の減少、部分的なコンドロムコイド（chondromucoid 、軟骨粘素）の軟化、軟骨基質水分の減少、コラーゲン網目様構造変化により軟骨本来の機能低下を引き起こすこと、さらに軟骨細胞で重要な役割を担っているトランスフォーミンググロスファクタ−β（TGF-β）に対する軟骨細胞の感受性低下によるコラーゲン合成の低下に起因する（Arthritis Rheum., 40, 1275-1281 (1997) ）。
【０００６】
一方、関節のアンバランスや種々の原因による軟骨細胞への機械的ストレスやインターロイキン-1β（IL-1β）等のサイトカインによって、軟骨細胞からマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の産生が亢進し、このＭＭＰによってマトリックスを分解し軟骨変性を引き起こす。実際、変形性関節症患者の軟骨組織や実験的軟骨細胞からのＭＭＰ産生が変形性関節症の主な成因であることが考えられている。特に、ＭＭＰ−１およびＭＭＰ−８はコラーゲンを分解するのみならず、コラーゲンを完全分解する種々のゲラチナーゼの活性化を引き起こすことが知られている。さらに、ＭＭＰ−３は軟骨組織で重要な役割を担っているプロテオグリカン、コラーゲンおよびリンク蛋白に対して分解活性を有し、変形性関節症患者ならびにモデル動物でも、このＭＭＰ−３が強発現していることが報告されている（Osteoarthr. Car., 6, 286-294 (1998) ）。
【０００７】
さらに３つ目の病因としてストレス、サイトカイン、酸化窒素（ＮＯ）等による軟骨細胞のアポトーシスによる軟骨細胞死が変形性関節症に関与することが最近報告されている（Arthritis Rheuma., 41, 284-289 (1998) ）。
【０００８】
本発明の有効成分であるメルカプトアシルシステイン誘導体は医薬として種々の作用があることが報告されている。例えば、喀痰溶解作用（特公昭５６−５３８８号公報）、抗リウマチ作用（特公昭６０−１１８８８号公報）、白内障治療作用（特公昭６２−１３９２２号公報）、肝障害抑制作用（特公昭６３−１３９６４号公報）、ブドウ膜炎治療作用（特開平２−９６５２１号公報）、糖尿病治療作用（特開平４−１５４７２１号公報）、骨粗鬆症治療作用（特開平４−１５４７２２号公報）、腎疾患治療作用（特開平４−３４２５２４号公報）、シスチン尿症治療作用（特開平５−１８６３４１号公報）、炎症性腸疾患治療作用（特開平７−２２３９４４号公報）、遅延型アレルギー抑制作用（特開平１０−１５８１６０号公報）、血管内皮増殖因子阻害作用（特開平１０−３２４６２５号公報）、角膜新生血管増殖抑制作用（特開平１１−７１２２７２号公報）などである。そのうちでもブシラミンは既に医薬品として市販されており、医薬としての有用性は既に実証されている。しかしながら、変形性関節症に対する作用についての報告はなされていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
この医薬として有用なメルカプトアシルシステイン誘導体について、さらに新たな薬理作用を見いだすことは非常に興味ある課題であった。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者等はメルカプトアシルシステイン誘導体の新たな薬理作用を見いだすために、関節軟骨に対する作用として、軟骨細胞のＭＭＰ−３産生およびプロテオグリカンの分解に対する作用を検討した。その結果、メルカプトアシルシステイン誘導体は、ＭＭＰ−３産生抑制作用およびプロテオグリカン分解抑制作用を有しており、ＭＭＰが関与する疾患、特に変形性関節症の治療剤として有用であることを見いだした。さらに、変形性関節症患者においては、関節拘縮が生じ、関節の可動域が減少することが知られている。そこで、この関節拘縮に対するメルカプトアシルシステイン誘導体の効果をウサギ固定関節拘縮モデルを用いて評価した。その結果、このウサギ固定関節拘縮モデルにおいても良好な改善効果が見出された。
【００１１】
本発明は、下記一般式［Ｉ］で表わされる化合物またはその塩類（以下、本化合物とする）を有効成分とする変形性関節症治療剤を提供するものである。
【００１２】
【化２】

［式中、Ａは低級アルキレン基を示す。］
【００１３】
上記で規定した基をさらに詳しく説明すると、低級アルキレンとは、メチレン、エチレン、（ジメチル）メチレン、（ジエチル）メチレン等の１〜６個の炭素原子を有する直鎖または分枝のアルキレンを示す。
【００１４】
本化合物における塩類とは医薬として許容される塩であれば特に制限はなく、ナトリウム、カリウム、カルシウム等のアルカリ金属またはアルカリ土類金属との塩；アンモニウム塩；ジエチルアミン、トリエタノールアミン等の有機アミンとの塩などが挙げられる。また、本化合物は水和物の形態をとっていてもよい。本化合物にはジアステレオ異性体および光学異性体が存在するが、それらはすべて本発明に含まれる。光学活性な原料を用いると単一のジアステレオ異性体および光学異性体が得られるが、ラセミ体を原料として用いた場合には、汎用される方法、例えば光学分割剤等を用いる方法により各異性体を分離することができる。
【００１５】
本化合物のうち、特に好ましい例としては、下記式[II]で表わされるブシラミンが挙げられる。
【００１６】
【化３】

【００１７】
本化合物の関節軟骨に対する作用に関して、詳細については実施例の項で述べるが、本化合物がＭＭＰ−３産生抑制作用およびプロテオグリカン分解抑制作用を有することを認めた。本化合物は、ＭＭＰが関与する疾患、特に変形性関節症の治療剤として有用であることが示唆された。
【００１８】
また、変形性関節症患者においては、関節拘縮が生ずる。そこでウサギ固定関節拘縮モデルを用いて、その関節可動域に対する本化合物の改善効果について検討したところ、明らかな改善効果が認められた。
【００１９】
従来の技術の項で記載したように、本化合物はリウマチ治療剤として有用であることは既に知られているが、変形性関節症は、加齢による関節局所での軟骨の退行性変性や、機械的ストレスによる進行性の分解を伴う関節の破壊と骨軟骨の増殖性変化を特徴とする疾患であり、リウマチ疾患のような全身性の自己免疫疾患とは異なる。変形性関節症の関節液は非炎症性であり、その末梢血には異常所見をほとんど認めず、一般に赤沈値、ＣＲＰ値が正常で、リウマチ因子が陰性であることも、変形性関節症がリウマチ疾患とは異なる点である。
【００２０】
薬物の投与方法としては、活性体そのものを投与する方法と共に、生体内で分解し、活性体に変換される形、即ちプロドラッグの形で本化合物を投与する方法も汎用されている。本化合物は、分子中に１つのカルボキシル基および２つのチオール基を含むが、これを活性体そのもので投与できると共に、生体内で活性体に変換され得る適切な保護基で保護された形態、いわゆるプロドラッグの形で投与されてもよい。
【００２１】
本化合物は経口でも、非経口でも投与することができる。投与剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、注射剤等が挙げられ、汎用されている技術を用いて本化合物を製剤化することができる。例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等の経口剤であれば、乳糖、結晶セルロース、デンプン、植物油等の増量剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換ヒドロキシプロピルメチルセルロース等の崩壊剤、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マクロゴール、シリコン樹脂等のコーティング剤、ゼラチン皮膜等の皮膜剤などを必要に応じて加えて、本化合物を製剤化すればよい。
【００２２】
本化合物の投与量は症状、年令、剤型等によって適宜選択できるが、経口剤であれば通常１日当り０．１〜５０００ｍｇ、好ましくは１〜１０００ｍｇを１回または数回に分けて投与すればよい。
【００２３】
以下に薬理試験の結果を示すが、これは本発明をよりよく理解するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００２４】
【実施例】
［薬理試験］
１．軟骨細胞のＭＭＰ−３産生およびプロテオグリカンの分解に対する作用
本化合物の有用性を調べるべく、Noseらの報告（J. Rheumatology, 24, 550-554 (1997) ）に準じて、ウサギ膝関節大腿骨端から分離した軟骨細胞を用いて、IL-1β処理後のＭＭＰ−３産生およびプロテオグリカンの分解に対する本化合物の作用を検討した。
【００２５】
ＭＭＰ−３産生に対する作用はＭＭＰ−３活性を測定することにより、プロテオグリカンの分解に対する作用はプロテオグリカンの分解物であるグリコサミノグリカン（glycosaminoglycan 、ＧＡＧ）を測定することにより、それぞれ行った。
【００２６】
（実験方法）
軟骨細胞の調製
雄性日本白色ウサギの膝関節大腿骨の骨端を摘出した。
【００２７】
その骨端の膝蓋面軟骨を薄切し、細片したのち、酵素処理によって組織を融解して、軟骨細胞を調製した。
【００２８】
培地Ａの調製
α−ケトグルタール酸（５μｇ／ｍｌ）、Ｌ−アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）、ラクトアルブミン水解物（０．２ｍｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含む哺乳類細胞培養基本培地Ｄ−ＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium、Gibco 社製）を調製した（以下培地Ａという）。
【００２９】
被験化合物溶液の調製
被験化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した後（１×１０^−１Ｍ）、この溶液に、IL-1β（１ｎｇ／ｍｌ）を含む培地Ａ（以下培地Ｂという）を加えて、被験化合物が所定の濃度になるように希釈し、被験化合物溶液を調製した。
【００３０】
コントロール群には上記培地Ｂを、未処理群には培地Ａを用いて各々実験を行った。
【００３１】
効果測定試験
ウシ胎児血清（１０％）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＤ−ＭＥＭで培養した軟骨細胞を２４穴プレートに播種（１×１０^５ cells ／well）し、コンフルエントになるまで培養した。
【００３２】
培地を被験化合物溶液（５００μｌ／well）に交換することにより、IL-1βおよび被験化合物の添加を行った。３７℃、９５％空気・５％ＣＯ_２の条件下で２日間培養した。
【００３３】
培養上清を回収し、ＭＭＰ−３アッセイKit （ヤガイ社製）を用いて上清中のＭＭＰ−３活性の測定を行った。
【００３４】
また、Farndaleらの方法（Biochim. Biophys. Acta, 883, 173-177 (1986) ）に準じて、上清中ＧＡＧ濃度の測定を行った。
【００３５】
ＭＭＰ−３産生に対する作用は、被験化合物の所定濃度におけるＭＭＰ−３産生抑制率（％）で示す。
【００３６】
【式１】

Ａ：コントロール群のＭＭＰ−３活性
Ｂ：被験化合物溶液処理群のＭＭＰ−３活性
Ｃ：未処理群のＭＭＰ−３活性
【００３７】
プロテオグリカンの分解に対する作用については、被験化合物の所定濃度におけるプロテオグリカン分解抑制率（％）で示す。
【００３８】
【式２】

Ｄ：コントロール群のＧＡＧ濃度
Ｅ：被験化合物溶液処理群のＧＡＧ濃度
Ｆ：未処理群のＧＡＧ濃度
【００３９】
（結果）
表１に試験結果の一例として、被験化合物の所定濃度におけるＭＭＰ−３産生抑制率（％）を示す。
【００４０】
【表１】

表中の数値は３例の平均値を示す。
【００４１】
表２に試験結果の一例として、被験化合物の所定濃度におけるプロテオグリカン分解抑制率（％）を示す。
【００４２】
【表２】

表中の数値は３例の平均値を示す。
【００４３】
表１及び表２から分かるように、ブシラミンはIL-1β刺激によるＭＭＰ−３産生およびプロテオグリカン分解に対する抑制作用を示すことが認められる。
【００４４】
２．膝関節可動域の改善効果
本化合物の変形性関節症に対するin vivo における効果を調べるため、ウサギ固定関節拘縮モデルを用い、膝関節可動域の改善効果について検討した。
【００４５】
（実験方法）
被験化合物溶液の調製
被験化合物を１％メチルセルロース水溶液に懸濁し、所望の濃度の被験化合物溶液を調製した。
【００４６】
試験方法
ペントバルビタールナトリウム（２５ｍｇ／ｋｇ）麻酔下、ＮＺＷ系ウサギ（１３週齢、体重２．９７〜３．２７ｋｇ）の右後肢膝関節をギブス包帯で伸展位にギブス固定した。被験化合物（投与液量１０ｍ１／ｋｇ）を４週間経口投与し、同ウサギを２９日目に放血致死させた後、膝関節可動域を測定した。尚、コントロールには、被験化合物の代わりに１％メチルセルロース水溶液（１０ｍｌ／ｋｇ）を用い同様の実験を行った。
【００４７】
測定方法
膝関節可動域は、ウサギの肢関節に４００ｇの荷重を垂直にかけた時に得られる最大屈曲角と最大伸展角の差から求めた。
【００４８】
（結果）
表３に試験結果の一例として、被験化合物の所定濃度における関節可動域（度）を示す。尚、本試験の被験化合物としてブシラミンを用いた。
【００４９】
【表３】

表中の数値は１０例の平均値を示す。
【００５０】
表３から分かるように、ブシラミンを投与した場合、ウサギ膝関節可動域は本試験の投与量の範囲において用量依存的に改善されることが見出された。
【００５１】
【発明の効果】
上記の薬理試験の結果から、本化合物はＭＭＰ−３産生抑制作用、プロテオグリカン分解抑制作用および関節拘縮に対する改善効果を有しており、ＭＭＰが関与する疾患、特に変形性関節症の治療剤として有用であることが期待される。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a therapeutic agent for osteoarthritis comprising a mercaptoacylcysteine derivative as an active ingredient.
[0002]
[Prior art]
Osteoarthritis (OA) is a disease characterized by degenerative degeneration of the cartilage at the joint locality due to aging, joint destruction accompanied by progressive degradation due to mechanical stress, and proliferative change of osteochondral. It is.
[0003]
The field of osteoarthritis disease is limited to local joints, mainly load joints. Unlike systemic autoimmune diseases such as rheumatic diseases, osteoarthritic joint fluid is non-inflammatory. In addition, almost no abnormal findings are observed in the peripheral blood, and in general, the erythema level and CRP level are normal, and the rheumatoid factor is negative.
[0004]
Previous studies have suggested various possibilities for the pathogenesis of osteoarthritis.
[0005]
One of them is that with aging, chondrocytes decrease, partial chondromucoid (chondromucoid) softening, cartilage matrix water decrease, collagen network-like structural changes cause deterioration of the original function of cartilage. Furthermore, it is caused by a decrease in collagen synthesis due to decreased sensitivity of chondrocytes to transforming growth factor-β (TGF-β), which plays an important role in chondrocytes (Arthritis Rheum., 40 , 1275-1281 (1997) ).
[0006]
On the other hand, the production of matrix metalloproteinase (MMP) from chondrocytes is enhanced by mechanical stress on chondrocytes due to joint imbalance and various causes, and cytokines such as interleukin-1β (IL-1β). Decomposes the matrix and causes cartilage degeneration. In fact, MMP production from cartilage tissue and experimental chondrocytes of osteoarthritis patients is considered to be the main cause of osteoarthritis. In particular, MMP-1 and MMP-8 are known not only to degrade collagen, but also to activate various gelatinases that completely degrade collagen. Furthermore, MMP-3 has a degrading activity against proteoglycan, collagen and link protein, which play an important role in cartilage tissue, and this MMP-3 is strongly expressed in osteoarthritis patients and model animals. (Osteoarthr. Car., 6 , 286-294 (1998)).
[0007]
Furthermore, it has been recently reported that chondrocyte death due to apoptosis of chondrocytes caused by stress, cytokines, nitric oxide (NO), etc. is involved in osteoarthritis as a third etiology (Arthritis Rheuma., 41 , 284-). 289 (1998)).
[0008]
It has been reported that mercaptoacylcysteine derivatives, which are active ingredients of the present invention, have various actions as pharmaceuticals. For example, sputum dissolving action (Japanese Patent Publication No. 56-5388), anti-rheumatic action (Japanese Patent Publication No. 60-11888), cataract treatment action (Japanese Patent Publication No. Sho 62-13922), liver disorder inhibiting action (Japanese Patent Publication No. Sho 63- 13964), uveitis therapeutic action (JP-A-2-96521), diabetes therapeutic action (JP-A-4-154721), osteoporosis therapeutic action (JP-A-4-154722), renal disease therapeutic action (JP-A-4-342524), cystinuria therapeutic action (JP-A-5-186341), inflammatory bowel disease therapeutic action (JP-A-7-223944), delayed type allergy inhibitory action (JP-A-10-10) 158160), vascular endothelial growth factor inhibitory action (JP-A-10-324625), corneal neovascularization inhibitory action (JP-A-11-7122) 2 No.) and the like. Among them, bucillamine has already been marketed as a pharmaceutical and its usefulness as a pharmaceutical has already been demonstrated. However, there has been no report on the effect on osteoarthritis.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
Finding a new pharmacological action for this mercaptoacylcysteine derivative useful as a pharmaceutical was a very interesting subject.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
In order to find a new pharmacological action of the mercaptoacylcysteine derivative, the present inventors examined the action on chondrocyte MMP-3 production and proteoglycan degradation as an action on articular cartilage. As a result, the mercaptoacylcysteine derivative has an MMP-3 production inhibitory action and a proteoglycan degradation inhibitory action, and is found to be useful as a therapeutic agent for diseases involving MMP, particularly osteoarthritis. Furthermore, it is known that joint contracture occurs in osteoarthritis patients and the range of motion of the joint decreases. Therefore, the effect of mercaptoacylcysteine derivatives on this joint contracture was evaluated using a rabbit fixed joint contracture model. As a result, a good improvement effect was also found in this rabbit fixed joint contracture model.
[0011]
The present invention provides a therapeutic agent for osteoarthritis comprising a compound represented by the following general formula [ I ] or a salt thereof (hereinafter referred to as the present compound) as an active ingredient.
[0012]
[Chemical 2]

[Wherein, A represents a lower alkylene group. ]
[0013]
The group defined above will be described in more detail. The lower alkylene is a linear or branched alkylene having 1 to 6 carbon atoms such as methylene, ethylene, (dimethyl) methylene, (diethyl) methylene and the like.
[0014]
The salt in this compound is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable salt; a salt with an alkali metal or alkaline earth metal such as sodium, potassium or calcium; an ammonium salt; an organic amine such as diethylamine or triethanolamine And a salt thereof. Moreover, this compound may take the form of the hydrate. This compound has diastereoisomers and optical isomers, all of which are included in the present invention. When optically active raw materials are used, single diastereoisomers and optical isomers can be obtained. However, when racemates are used as raw materials, each isomer is obtained by a widely used method such as a method using an optical resolving agent. The body can be separated.
[0015]
Among these compounds, particularly preferred examples include bucillamine represented by the following formula [II].
[0016]
[Chemical 3]

[0017]
The details of the action of the present compound on articular cartilage are described in the Examples section, but it was confirmed that the present compound has an MMP-3 production inhibitory action and a proteoglycan degradation inhibitory action. This compound was suggested to be useful as a therapeutic agent for diseases involving MMP, particularly osteoarthritis.
[0018]
In patients with osteoarthritis, joint contracture occurs. Thus, when the improvement effect of the present compound on the joint range of motion was examined using a rabbit fixed joint contracture model, a clear improvement effect was recognized.
[0019]
As described in the section of the prior art, this compound is already known to be useful as a therapeutic agent for rheumatism, but osteoarthritis is a degenerative degeneration of cartilage in the joint local area due to aging, This disease is characterized by joint destruction accompanied by progressive degradation due to mechanical stress and proliferative changes in osteochondral, and is different from systemic autoimmune diseases such as rheumatic diseases. The joint fluid of osteoarthritis is non-inflammatory, and there are almost no abnormal findings in its peripheral blood. Generally, erythema and CRP levels are normal, and rheumatoid factor is negative. This is different from rheumatic diseases.
[0020]
As a method for administering a drug, a method of administering the present compound in a form that is decomposed in vivo and converted into an active form, that is, a prodrug form, is commonly used, in addition to a method of administering the active form itself. The present compound contains one carboxyl group and two thiol groups in the molecule, which can be administered as the active substance itself, and is protected in a form protected with an appropriate protective group that can be converted into the active substance in vivo. It may be administered in the form of a prodrug.
[0021]
The compound can be administered either orally or parenterally. Examples of the dosage form include tablets, capsules, granules, powders, injections and the like, and the present compound can be formulated using a widely used technique. For example, for oral preparations such as tablets, capsules, granules, powders, etc., fillers such as lactose, crystalline cellulose, starch, vegetable oil, lubricants such as magnesium stearate, talc, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, etc. Addition of binders, carboxymethylcellulose calcium, low-substituted hydroxypropylmethylcellulose and other disintegrants, hydroxypropylmethylcellulose, macrogol, silicone resin and other coating agents, gelatin film and other coating agents as needed, and formulation of this compound You just have to.
[0022]
The dose of this compound can be appropriately selected according to symptoms, age, dosage form, etc., but for oral preparations, it is usually 0.1-5000 mg per day, preferably 1-1000 mg per day or divided into several doses. That's fine.
[0023]
Although the result of a pharmacological test is shown below, this is for better understanding of the present invention and does not limit the scope of the present invention.
[0024]
【Example】
[Pharmacological test]
1. Effects of chondrocytes on MMP-3 production and proteoglycan degradation In order to examine the usefulness of this compound, according to a report by Nose et al. (J. Rheumatology, 24 , 550-554 (1997)) The effect of this compound on the production of MMP-3 and the degradation of proteoglycan after IL-1β treatment was examined using chondrocytes isolated from the above.
[0025]
The action on MMP-3 production was carried out by measuring the activity of MMP-3, and the action on the degradation of proteoglycan was carried out by measuring glycosaminoglycan (GAS), which is a degradation product of proteoglycan.
[0026]
(experimental method)
Preparation of chondrocytes The epiphysis of the knee joint femur of male Japanese white rabbit was extracted.
[0027]
The patella cartilage at the epiphysis was sliced and sliced, and the tissue was thawed by enzyme treatment to prepare chondrocytes.
[0028]
Preparation of Medium A α-ketoglutaric acid (5 μg / ml), L-ascorbic acid (50 μg / ml), lactalbumin hydrolyzate (0.2 mg / ml), penicillin (100 U / ml) and streptomycin (100 μg / ml) A mammalian cell culture basic medium D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, manufactured by Gibco) was prepared (hereinafter referred to as medium A).
[0029]
Preparation of test compound solution After dissolving the test compound in dimethyl sulfoxide (DMSO) (1 x 10 ^-1 M), medium A containing IL-1β (1 ng / ml) (hereinafter, medium B) was added to this solution. And the test compound was diluted to a predetermined concentration to prepare a test compound solution.
[0030]
Experiments were performed using the above-mentioned medium B for the control group and medium A for the untreated group.
[0031]
Effect measurement test Chondrocytes cultured in D-MEM supplemented with fetal bovine serum (10%), penicillin (100 U / ml) and streptomycin (100 μg / ml) were seeded in a 24-well plate (1 × 10 ^5). cells / well) and cultured until confluent.
[0032]
IL-1β and a test compound were added by exchanging the medium with a test compound solution (500 μl / well). The cells were cultured for 2 days under conditions of 37 ° C., 95% air and 5% CO ₂ .
[0033]
The culture supernatant was collected, and MMP-3 activity in the supernatant was measured using an MMP-3 assay Kit (manufactured by Yagai).
[0034]
Further, according to the method of Farndale et al. (Biochim. Biophys. Acta, 883 , 173-177 (1986)), the GAG concentration in the supernatant was measured.
[0035]
The effect on MMP-3 production is indicated by the MMP-3 production inhibition rate (%) at a predetermined concentration of the test compound.
[0036]
[Formula 1]

A: MMP-3 activity in control group B: MMP-3 activity in test compound solution treatment group C: MMP-3 activity in untreated group
About the effect | action with respect to the decomposition | disassembly of proteoglycan, it shows by the proteoglycan degradation inhibition rate (%) in the predetermined density | concentration of a test compound.
[0038]
[Formula 2]

D: GAG concentration in control group E: GAG concentration in test compound solution treated group F: GAG concentration in untreated group
(result)
Table 1 shows the MMP-3 production inhibition rate (%) at a predetermined concentration of the test compound as an example of the test result.
[0040]
[Table 1]

The numerical value in a table | surface shows the average value of 3 examples.
[0041]
Table 2 shows the proteoglycan degradation inhibition rate (%) at a predetermined concentration of the test compound as an example of the test result.
[0042]
[Table 2]

The numerical value in a table | surface shows the average value of 3 examples.
[0043]
As can be seen from Tables 1 and 2, it is recognized that bucillamine exhibits an inhibitory action on IL-1β-stimulated MMP-3 production and proteoglycan degradation.
[0044]
2. Improvement effect of knee joint range of motion In order to investigate the in vivo effect of this compound on osteoarthritis, we examined the improvement effect of knee joint range of motion using a rabbit fixed joint contracture model.
[0045]
(experimental method)
Preparation <br/> test compound of the test compound solution were suspended in 1% methylcellulose aqueous solution, to prepare a test compound solution of the desired concentration.
[0046]
Test method Under anesthesia with pentobarbital sodium (25 mg / kg), the right hind leg knee joint of a NZW rabbit (13 weeks old, body weight 2.97-3.27 kg) was casted in an extended position with a cast bandage. A test compound (dosage volume 10 ml / kg) was orally administered for 4 weeks, and the rabbit was lethal on the 29th day, and then the range of motion of the knee joint was measured. For the control, the same experiment was performed using a 1% methylcellulose aqueous solution (10 ml / kg) instead of the test compound.
[0047]
Measurement method The range of motion of the knee joint was determined from the difference between the maximum flexion angle and the maximum extension angle obtained when a load of 400 g was vertically applied to the limb joint of a rabbit.
[0048]
(result)
Table 3 shows the joint range of motion (degree) at a predetermined concentration of the test compound as an example of the test result. In addition, bucillamine was used as a test compound in this test.
[0049]
[Table 3]

The numerical value in a table | surface shows the average value of 10 examples.
[0050]
As can be seen from Table 3, when bucillamine was administered, the range of motion of the rabbit knee joint was found to improve in a dose-dependent manner within the dose range of this study.
[0051]
【The invention's effect】
From the results of the above pharmacological tests, this compound has an MMP-3 production inhibitory effect, a proteoglycan degradation inhibitory effect and an improvement effect on joint contracture, and is used as a therapeutic agent for diseases involving MMP, particularly osteoarthritis. Expected to be useful.

Claims

A therapeutic agent for osteoarthritis comprising a compound represented by the following general formula [ I ] or a salt thereof as an active ingredient.

[ Wherein , A represents an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms . ]

A is - C (CH ₃₎ ₂ - osteoarthritis therapeutic agent according to claim 1, wherein represented by.