JP3883512B2 - 微細流路の側壁に形成されたｍｏｓｆｅｔよりなる物質検出用チップ、これを含む物質検出装置、及び物質検出装置を利用した物質検出方法 - Google Patents
微細流路の側壁に形成されたｍｏｓｆｅｔよりなる物質検出用チップ、これを含む物質検出装置、及び物質検出装置を利用した物質検出方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
技術分野
本発明は微細流路の側壁に形成されたＭＯＳＦＥＴ（Ｍｅｔａｌ−Ｏｘｉｄｅ−Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｆｉｅｌｄ−Ｅｆｆｅｃｔ−Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）で構成された物質検出用チップ及びこれを含む物質検出装置に関する。また、本発明は前記物質検出用装置を利用した物質検出方法、具体的には物質プローブの固定化や物質プローブとターゲット試料との結合程度を定量的に検出する方法に関する。また、本発明は前記物質検出用装置にヒーター及び温度センサーが同時に装着された温度制御−検出部を含む核酸突然変異分析装置及びこれを利用した核酸突然変異分析方法に関する。
【０００２】
背景技術
ゲノムプロジェクトの完成によって人間のＤＮＡ序列が知られるにつれて各遺伝子の機能及びこれらによりコーディングされた蛋白質に対する研究がより活発になると共に、バイオ物質を容易に検出できるバイオセンサーの必要性が増大しつつある。
【０００３】
電気的な信号を使用してバイオ物質を検出できるバイオセンサーは、米国特許第４，２３８，７５７号公報、第４，７７７，０１９号公報、第５，４３１，８８３号公報及び第５，８２７，４８２号公報に開示されている。米国特許第４，２３８，７５７号公報は特定の抗体に対して反応する抗原を具備するように設計された一般のソース及びドレーンで構成されたＦＥＴについて開示している。このＦＥＴを使用してドレーン電流の変化を経時的に観察して溶液中抗原の濃度を測定する。
【０００４】
米国特許第４，７７７，０１９号公報は、ソース及びドレーン領域にドーピングされており、ゲートがソース及びドレーン領域にわたって形成されており、測定しようとするヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチドがゲート上に結合された形のＦＥＴについて開示している。
【０００５】
米国特許第５，４３１，８８３号公報は、化学種と反応して伝導性に変わる性質を有する有機絶縁物質であるフタロシアニン薄膜がゲート及びドレーンを連結する構造のＦＥＴについて開示している。
【０００６】
米国特許第５，８２７，４８２号公報は、相異なる結合の感度を増大させるようにゲートに分子受容体が結合されている２つのＦＥＴが並列に連結されたバイオセンサーについて開示している。
【０００７】
ところで、公知のバイオセンサーはいずれも通常的なＦＥＴ、すなわち、基板表面にソース、ドレーン及びチャンネル層が形成された平面的なＦＥＴで構成されていてセンサーの高集積化に限界がある。また、バイオ物質プローブを特定領域にのみ選択的に付着し難いため、ＦＥＴ製作時に別の製作装置を使用してプローブをＦＥＴに結合させねばならない。しかし、このように付着させたプローブは付着力が弱いためにターゲット分子の結合を高い感度で測定できない短所がある。そして、プローブを結合して結合されたかどうかを確認するのに相当時間がかかるので、ターゲット分子を検出するまでの所要時間が長い。
【０００８】
したがって、センサーの高集積化が容易でプローブを堅く付着させることができ、その付着如何を容易にインサイチュで確認することができ、ターゲット分子の結合を高い感度で測定できる新しいバイオセンサーの必要性が増大しつつある。
【０００９】
バイオチップとは、基質上に分析しようとするＤＮＡ、蛋白質などの生分子プローブを高密度で付着したチップであり、サンプル内の遺伝子の発現様相、遺伝子欠陥、蛋白質分布、反応様相などを分析できる。バイオチップは、プローブの付着形態によって固体基質上に付着されたマイクロアレイチップと微細チャンネル上に付着されたラップオンアチップ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）とに分けることができ、プローブの種類によってＤＮＡチップ、蛋白質チップに分けることができる。
【００１０】
現在、ＤＮＡチップ市場の大部分を占めているものは、スポッティングあるいは光石版印刷術方法で製作されたチップである。これは、二重螺旋構造の分離された一側のプローブＤＮＡだけを特定材料上に化学的な結合を利用して付着した後、ターゲットＤＮＡと反応をさせるための装置である。このようなＤＮＡチップを製作する時、プローブＤＮＡの固定化は商品の正確性及び再現性に莫大な影響をおよぼすのでより正確に制御されねばならないが、現在までの技術では正確に定量化する方法を提示できない。
【００１１】
従来に使われるスポッティングチップや、光石版印刷術チップはその製造方法によりプローブの量をある程度の体積で制御可能であるが、商品化されて病気の診断などの目的に使用するには正確性及び再現性が落ちる。特に、特定ＤＮＡの発現などを観察するような場合にはより正確なプローブＤＮＡの固定化が必要である。現在このような方法は必要であるが、製作に関する技術的問題及びコストに対する負担のため現在まで提案されていない。
【００１２】
これに、本発明者は前記従来の技術の問題点を乗り越えるために鋭意研究努力した結果、ＤＮＡチップに内蔵されたＭＯＳＦＥＴ型センサーを利用してセンサーに流れる電圧及び電流の特性を測定することによってプローブＤＮＡの固定化及び混成化を正確に検出できることを確認して、本発明を完成するようになった。これにより、別の製作コストが要らなくて商用化が可能であり、プローブＤＮＡの固定化及び混成化を同時に測定できるＤＮＡチップの製作が可能になった。
【００１３】
核酸の単一塩基変移（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）は、個人と個人間のＤＮＡに存在する単一塩基対の差であって、ＤＮＡ序列多型性のうち最も多く存在する形態である（約１個／１ｋｂ）。このようなＳＮＰは個々人の疾病に対する敏感性差の原因になるので、遺伝疾患の診断、治療及び予防に効果的に利用できる。したがって、遺伝子から個人差、人種間差と疾病に対する敏感性差をもたらす部分であるＳＮＰを速くかつ簡便に捜し出す方法が必要になっている。
【００１４】
ＳＮＰを感知し出すためには、温度によるＤＮＡ二重線構造の分離による観察が最も普遍化している。約９６℃以上の温度では二重線をなしているＤＮＡの水素結合がいずれも切れて分離される。このような特性を利用して突然変異されたＤＮＡ塩基序列を明らかにすることができるが、相異なる装備及び機械を使用せねばならず、正確でかつ精密な温度制御によるＤＮＡの分離をリアルタイムで測定する技術は非常に難しい状況である。
【００１５】
米国特許第６，１７１，８５０号公報（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｅｓ）では、熱交換器を使用して各々反応器の内部及び外部で直接温度を制御した。反応システムは加熱器と一つ以上の熱交換器とで構成されている。しかし、このシステムではただいくつかの反応器の温度制御についてのみ言及されており、熱交換器を含んでいてＤＮＡの感知及び流路上での特性を期待し難い。
【００１６】
米国特許第６，１７４，６７５号公報（Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｃｕｒｒｅｎｔ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｆｌｕｉｄ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏ−ｃｈａｎｎｅｌｓ）では流路に直接電気制御式加熱器及び冷却器を装着している色々な形態の加熱器を示した。しかし、この特許ではＰＣＲ等に使われる温度制御装置だけを開示するだけで温度によるＤＮＡ二重線構造の分離を検出する装置については全く言及されていない。
【００１７】
米国特許第５，６８３，６５７号（ＤＮＡ ｍｅｌｔｏｍｅｔｅｒ）では、温度が一定に維持されてバッファ溶液を運搬できる温度調節チャンバ、チャンバの温度制御のための加熱と冷却手段、そして、Ｔｍの温度で分離された二重線構造のＤＮＡを蛍光物質で表示して検出する手段で構成された核酸分析装置を開示している。しかし、この装置はＤＮＡ検出手段が温度調節チャンバと別途に存在して構成が複雑であり、かつ検出時間が遅延される問題点があった。
【００１８】
これに、本発明者は二重線構造で形成されているＤＮＡは温度が上昇するにつれて２本に分けられるという原理を利用して小型の装置上に多様な温度制御及びＤＮＡ検出が可能なシステムを構築してＤＮＡの突然変異（ＳＮＰ）測定装置を完成した。本発明によれば、ＤＮＡが分離されたかどうかを流路に直接製作された検出装置を通じてリアルタイムで判別できる。
【００１９】
発明の開示
本発明が解決しようとする技術的課題は、高集積化が容易であり、プローブの結合及びターゲット分子の結合をインサイチュで短時間に確認できる物質検出用チップを提供することにある。
【００２０】
本発明が解決しようとする他の技術的課題は、前記物質検出用チップを含む物質検出装置を提供することにある。
【００２１】
本発明が解決しようとするさらに他の技術的課題は、物質検出用チップの製造方法を提供することにある。
【００２２】
本発明が解決しようとするさらに他の技術的課題は、物質検出装置を使用して物質プローブの固定化を定量的に検出する方法を提供することにある。
【００２３】
本発明のさらに他の課題は、物質検出装置を使用してプローブ及びターゲット試料の結合程度を定量的に検出する方法を提供することにある。
【００２４】
本発明のさらに他の課題は、流路に直接温度制御装置及び検出装置を微細加工することによって正確でかつ精密な温度制御による突然変異ＤＮＡの検出をリアルタイムで行える新しい核酸突然変異分析装置を提供することにある。
また、本発明の課題は、前記核酸突然変異分析装置を利用してＳＮＰを効果的に検出できる方法を提供することにある。
【００２５】
前記技術的課題を達成するための本発明による物質検出用チップは半導体基板、前記基板表面に形成され、物質試料の通路になる微細流路と、前記微細流路の側壁に、前記微細流路の流路断面方向にくぼむように設けられた凹部の側壁と前記微細流路の側壁とから成る角部に形成されたＭＯＳＦＥＴを含む。
【００２６】
本発明で、微細流路の側壁とは、微細流路の側壁だけでなくコーナー（ｃｏｎｖｅｘ ｃｏｒｎｅｒ）も含むことと意図される。
【００２７】
望ましくは、前記ＭＯＳＦＥＴのゲート電極は金（Ａｕ）薄膜で形成され、前記ゲート電極の表面にはチオール基が付着された物質プローブが自己組み立て単層法により付着される。
【００２８】
さらに他の技術的課題を達成するための本発明による物質検出用チップの製造方法によれば、まず、半導体基板表面に酸化膜を形成する。次いで、前記基板表面をエッチングして微細流路と当該微細流路の側壁に連なり前記微細流路の流路断面方向にくぼむ凹部とを形成した後、前記微細流路の側壁及び前記凹部の側壁に不純物をドーピングして不純物領域を形成し、前記基板をエッチング液に処理して前記微細流路の側壁及び前記凹部の側壁に形成された不純物領域の一部を除去して前記微細流路の側壁と前記凹部の側壁から成る角部にＭＯＳＦＥＴのチャンネル領域を定義する。次いで、前記チャンネル領域上に酸化膜を形成した後、前記チャンネル領域上に金（Ａｕ）よりなるゲート電極を形成して物質検出用チップを完成する。
【００２９】
望ましくは、前記チャンネル領域を定義する段階は、前記角部に沿って選択的に不純物領域が除去されることにより実行される。
【００３０】
そして、前記チャンネル領域を定義する段階は、前記基板に逆バイアスを印加して電流の変化を感知してエッチング終了点を選択することが望ましい。
【００３１】
前記他の技術的課題を達成するための本発明による物質検出用装置は、基板と、前記基板表面に形成された物質試料ローディング部と、一端が前記物質試料ローディング部と連結されて前記物質試料の通路になる少なくとも一つ以上の微細流路と、前記微細流路の他端に連結されて物質プローブが付着されるＭＯＳＦＥＴ型センサーとを含む。
【００３２】
望ましくは、前記ＭＯＳＦＥＴ型センサーは本発明による物質検出用チップを使用する。この場合、物質検出用チップは物質検出用キットと別途に製作された後、前記物質検出用キットの微細流路の末端に位置した物質検出用チップ設置部に装着されるものが望ましい。
【００３３】
さらに他の技術的課題を達成するための本発明による物質検出方法によれば、まず、物質検出装置用キット基板表面に形成された物質試料ローディング部に物質プローブを提供し、前記物質プローブが、一端が前記ローディング部と連結された前記キットの流路に沿って移動して前記流路の他端に連結された物質検出用チップの微細流路を通過しながら前記微細流路の側壁に形成されているＭＯＳＦＥＴのゲート電極上面に結合させる。次いで、前記ゲート電極にかかる電圧及び電流特性を測定する。引続き、前記ローディング部にターゲット試料を提供し、前記ターゲット試料が前記キットの流路に沿って移動して前記流路の他端に連結された物質検出用チップの微細流路を通過しながら前記プローブと反応させる。最後に前記ゲート電極にかかる電圧及び電流特性を測定してプローブ結合後に測定した電圧及び電流特性との差を感知してターゲット物質を検出する。
【００３４】
望ましくは、プローブがゲート電極に結合された後、前記試料ローディング部に洗浄液を提供して前記ゲート電極に結合されていない前記物質プローブを除去する段階をさらに具備し、ターゲット物質がプローブに結合された後、前記試料ローディング部に洗浄液を提供して前記プローブと反応しないターゲット試料を除去する。
【００３５】
本発明において、前記物質プローブまたはターゲット物質は核酸、蛋白質、酵素基質、補助因子またはオリゴサッカリドが使われる。望ましくは、前記核酸は単一線ＤＮＡ、単一線ＲＮＡまたは単一線ＰＮＡであり、前記蛋白質は細胞膜受容体に対する作用子、細胞膜受容体に対する拮抗子、トキシン、ウイルスエピトープ、ホルモン、ペプチド、酵素またはモノクローナル抗体である。より望ましくは、前記物質プローブは単一線核酸であり、前記ターゲット物質は前記プローブと混成化される単一線核酸である。
【００３６】
本発明による物質検出用チップは高集積化が容易であり、プローブ及びターゲット分子の結合をインサイチュで確認できる長所がある。
【００３７】
本発明のまた他の目的を達成するために、本発明は、本発明による物質検出用装置の物質試料ローディング部に物質プローブを提供する段階と、前記物質プローブを微細流路に沿って移してＭＯＳＦＥＴ型センサーのゲート電極上面に結合させる段階と、前記ゲート電極にかかる電圧及び電流の特性を測定する段階とを含む物質プローブの固定化を定量的に検出する方法を提供する。
【００３８】
さらに本発明の他の目的を達成するために、本発明は、（ａ）本発明による物質検出用装置の物質試料ローディング部に物質プローブを提供する段階と、（ｂ）前記物質プローブを微細流路に沿って移してＭＯＳＦＥＴ型センサーのゲート電極上面に結合させる段階と、（ｃ）前記ゲート電極にかかる電圧及び電流の特性を測定する段階と、（ｄ）前記物質試料ローディング部にターゲット試料物質を提供する段階と、（ｅ）前記ターゲット試料物質を微細流路に沿って移してＭＯＳＦＥＴ型センサーのゲート電極上面に結合された物質プローブに結合させる段階と、（ｆ）前記ゲート電極にかかる電圧及び電流の特性を測定して前記（ｃ）段階で測定した電圧と電流の特性と比較する段階とを含む物質プローブとターゲット試料との結合程度を定量的に検出する方法を提供する。
【００３９】
このように、本発明によれば、物質検出装置に内蔵されたＭＯＳＦＥＴ型センサーを利用してセンサーのゲート電極上面にかかる電圧及び電流の特性を測定することによってプローブの固定化だけでなく、プローブ及びターゲット試料の混成化も定量的に検出できる。特に、ＤＮＡチップの場合、プローブ核酸（単一線ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ）の固定化だけでなく、プローブ核酸とターゲット核酸との混成化程度も定量的に検出できる。
【００４０】
本発明の他の目的を達成するために、本発明では温度によるＤＮＡの分離及びそれによる検出のために流体が流れる流路（微細加工チャンネル）に直接ヒーター、温度センサー、及びＤＮＡ検出センサー（ＭＯＳＦＥＴ型）をビルトインで同時に製作する。これによれば、ヒーター及び温度センサーでＤＮＡにおよぶ温度を制御しながら同時にＤＮＡ検出器でＤＮＡが二重線構造であるか、単一線構造であるかをリアルタイムで判別できる。
【００４１】
具体的には、本発明、基板と、前記基板表面に形成されたサンプルローディング部と、前記サンプルローディング部と直接連結され、サンプルの流入通路になる微細加工チャンネルと、前記微細加工チャンネル内に一つ以上の核酸固定のＭＯＳＦＥＴ型センサーとヒーター及び温度センサーが同時に装着された温度制御−検出部とを含む核酸突然変異分析装置を提供する。
【００４２】
望ましくは、前記ヒーター及び温度センサーは、前記ＭＯＳＦＥＴ型センサーと近接して位置してそのＭＯＳＦＥＴ型センサー上に付着された核酸に影響を及ぼす温度を制御し、前記ＭＯＳＦＥＴ型センサーは、その上に付着された核酸のＴｍ温度で変性された二重線核酸または復元された二重線核酸を検出することを特徴とする。
【００４３】
本発明においては、二重線核酸の分離前後の電荷変化を調べるためのセンサーとしてＭＯＳＦＥＴトランジスタを利用した。
【００４４】
望ましくは、本発明のＭＯＳＦＥＴ型トランジスタは微細加工流路の側壁のコーナーに位置することを特徴とする。現在まで製作されたＦＥＴを利用したバイオ分子センサーはいずれも平面上に製作された。しかし、本発明で製作したバイオ分子センサーは、バルク微細加工及び拡散を利用した３次元ＭＯＳＦＥＴ形態であり、主に微細加工流路のコーナーに位置する。このような構造のバイオ分子センサーは核酸が流れる流路に直接位置して検出時間を画期的に短縮させるだけでなく、検出器が占める空間を大福縮めることができて狭い空間により多くのセンサーを装着できるという長所を有している。ここでコーナーとは、微細流路の側壁に、微細流路の流路断面方向にくぼむように設けられた凹部の側壁と微細流路の側壁とから成る角部のことである。
【００４５】
本発明において、ＭＯＳＦＥＴ型トランジスタはソース及びドレーン領域に金薄膜が形成され、その金表面にＳＡＭ（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ）方法で固定化されたチオール基がついた核酸を有することを特徴とする。本発明で、センサーはソース及びドレーンの両端子を有して両端子の表面に薄い酸化膜が覆われ、その上にＡｕを付着させればＭＯＳ（Ｍｅｔａｌ−Ｏｘｉｄｅ−Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）の構造を形成するようになる。また、Ａｕと酸化膜との間に高い選択性を有して核酸分子が吸着されるように核酸分子の端部にチオールを付着させる。チオールを付着させた核酸分子はＳＡＭ（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ）法で金表面に吸着される。ＳＡＭは基質表面上に自発的に付着されて規則的によく整列された有機単分子膜という意味で、基質と有機分子との直接的な化学結合を利用するために外部の他の製作装置を必要としない。いままで製作されたバイオ分子センサーはバイオ分子を特定領域にのみ付着させ難く、付着力も弱い短所を有している。しかし、本発明で使用するＳＡＭ方法を利用したチオール基置換されたバイオ分子の金に対する選択的な吸着方法はこのような問題点を解決するだけでなく、センサーの表面に直接付着されるので反応前後の電荷量変化も容易に分かる。
【００４６】
本発明において、ＭＯＳＦＥＴ型トランジスタに固定化された核酸は単一線ＤＮＡ、単一線ＲＮＡまたは単一線ＰＮＡであることを特徴とする。これら単一線（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ、ｓｓ）核酸はサンプルローディング部に注入されたターゲット核酸と混成化するプローブとしての役割をする。前記ＭＯＳＦＥＴセンサーには相異なる塩基序列の核酸が付着されることが望ましい。
【００４７】
本発明において、ヒーターは温度制御−検出部の温度を高める機能をし、温度センサーはヒーターの動作を制御する機能をする。このようなヒーター及び温度センサーは、前記ＭＯＳＦＥＴセンサー上に付着された核酸に影響を及ぼす温度を効果的に制御するために、そのＭＯＳＦＥＴセンサーに近接して位置することが望ましい。
【００４８】
さらに他の目的を達成するために、本発明は、ＭＯＳＦＥＴ型センサーの表面金属に単一線核酸プローブを固定化させる段階と、固定化されたプローブと反応するターゲット核酸をサンプルローディング部に注入し、微細加工チャンネルの流路に沿ってＭＯＳＦＥＴ型センサーに移動させる段階と、ターゲット核酸を前記ＭＯＳＦＥＴ型センサーの核酸プローブと混成化させる段階と、二重線核酸を単一線に分離するために温度を段々上昇させる段階と、ＭＯＳＦＥＴ型センサーのゲートにかかる電圧及び電流特性を測定する段階とを含むことを特徴とする核酸の突然変異を分析する方法を提供する。
【００４９】
これは、低温で核酸を混成化した後、温度を上昇させながら突然変異を検知する方法であって、微細加工された流路に製作された温度制御装置及び検出装置は正確でかつ精密な温度制御により核酸の突然変異をリアルタイムで分析できる。
【００５０】
これと選択的に、本発明は、ＭＯＳＦＥＴ型センサーの表面金属に単一線核酸プローブを固定化させる段階と、固定化されたプローブと反応するターゲット核酸をサンプルローディング部に注入し、微細加工チャンネルの流路に沿ってＭＯＳＦＥＴ型センサーに移す段階と、ターゲット核酸と核酸プローブとの混成化防止に効果的な温度に維持させる段階と、単一線核酸を二重線にするために温度を徐々に下降させる段階と、ＭＯＳＦＥＴ型センサーのゲートにかかる電圧及び電流特性を測定する段階とを含むことを特徴とする核酸の突然変異を分析する方法を提供する。
【００５１】
これは、高温で核酸を変性させた後、温度を下降させながら突然変異を検知する方法である。
【００５２】
本発明による核酸突然変異分析装置及び方法は、核酸突然変異、特に核酸のＳＮＰの検出に効果的に利用できる。ＤＮＡは二重線構造よりなっており、これは温度が約９６℃以上になれば２線に分かれる。２線が互いに各々完壁に塩基対が合えば、相対的に高温で変性され、そのうち合わない塩基対があれば相対的に低い温度で変性される。このような原理にＭＥＭＳ技術を合わせて相異なる温度に調節できる超小型温度制御装置及び検出装置を共に構成したシステムを製作する。このようなシステムを利用してそれぞれのＭＯＳＦＥＴ型トランジスタに、核酸の塩基配列を一つずつ異に配置させればそれぞれの温度制御装置で何℃で変性されたかが分かり、これを利用して核酸の単一塩基突然変異などを分析できる。
【００５３】
図面の簡単な説明
図１は、本発明の一実施例による物質検出装置の斜視図であり、
図２は、本発明の一実施例による物質検出用チップの上面図であり、
図３は、図２に示された物質検出用チップ（ＭＯＳＦＥＴ型センサー）のうち一つの斜視図であり、
図４は、図２に示されたチップのＩ−Ｖ特性を示すグラフであり、
図５ないし図９は、本発明の一実施例による物質検出用チップの製造工程を段階別に示す斜視図であり、
図１０は、物質検出用チップのゲート電極に物質プローブがどのように結合されるかを示す概略図であり、
図１１は、本発明の一実施例であって、スポッティングあるいは光石版印刷術方法で付着されたプローブＤＮＡの検出装置の概略図であり、
図１２は、本発明の一実施例であって、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの混成化検出装置の概略図であり、
図１３は、微細加工チャンネル内の底面に温度制御−検出部を含む本発明の核酸突然変異分析装置を概略的に示す図面であり、
図１４は、微細加工チャンネル内の側壁に核酸固定のＭＯＳＦＥＴ型トランジスタを備え、微細加工チャンネル内の上面にヒーター及び温度センサーを備える温度制御−検出部を含む本発明の核酸分析装置を概略的に示す図面であり、
図１５は、本発明のＭＯＳＦＥＴトランジスタの製作過程を示す図面であり、
図１６は、本発明によってバイオチップに固定されたプローブＤＮＡの量による電流フローの変化を測定したグラフであり、
図１７は、本発明によってプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの混成化による電流フロー変化を測定したグラフである。
【００５４】
発明を実施するための最良の態様
以下、本発明による物質検出用チップ、これを含む物質検出用装置、物質検出用チップの製造方法及び物質検出用装置を利用した物質の検出方法について説明する。しかし、本発明は以下で開示される実施例に限定されず、相異なる多様な形態で具現され、ただ、本実施例は本発明の開示を完全にし、通常の知識を有する者に本発明の範ちゅうを完全に知らせるために提供されるものである。図面で各膜の厚さは説明の便宜のために誇張されて図示され、各図面で同一参照符号は同一部材を示す。
【００５５】
図１は、本発明の一実施例による物質検出用装置の斜視図である。
【００５６】
物質検出用装置は、物質検出用キット１０、及びこのキット１０に設置される物質検出用チップ（図示せず）で構成される。物質検出用キット１０は基板１５の表面に少なくとも一つ以上の物質試料ローディング部２０を具備し、前記物質試料ローディング部２０は流路３０を通じて物質検出用チップ設置部４０と連結されている。流路３０の幅及び深さは物質試料が毛細管現象により流動できる程度の大きさである。
【００５７】
図面符号５０は試料提供機構を、図面符号５５は試料を示す。
【００５８】
図示していないが、キット１０は、物質検出用チップ設置部４０に設置される物質検出用チップ（図示せず）と電気的な信号を交換できる各種電気設備を具備している。
【００５９】
本実施例では物質検出用チップが別に分離されて必要な場合にのみキット１０に設置または分離できる場合を説明したが、必要に応じて前記キットと一体型に物質検出用チップが形成されることもある。
【００６０】
図２は、前記物質検出用キットの設置部（図１の４０）に設置される本発明の一実施例による物質検出用チップの上面図である。
【００６１】
図１に示されたキット１０の物質試料ローディング部２０と一端が結合された流路３０の他端と連結される微細流路３０’が形成されており、微細流路３０’の反対側には物質試料排出口６０が形成されている。表面にはソース電極１５０Ｓ、ドレーン電極１５０Ｄ、及びゲート電極１５０Ｇが形成されており、ソース／ドレーン電極１５０Ｓ、１５０Ｄと連結された配線１５０が形成されている。
【００６２】
図２に示された物質検出用チップのうち一つの斜視図である図３を参考として本発明の一実施例による物質検出用チップの構造をより詳細に説明する。
【００６３】
半導体基板１００の表面に物質試料の微細流路１０５が形成されており、前記微細流路１０５の側壁に４つのＭＯＳＦＥＴが形成されている。本発明の物質検出用チップには少なくとも一つ以上のＭＯＳＦＥＴを含めうる。ＭＯＳＦＥＴは、微細流路１０５の側壁に不純物をドーピングして形成したソース領域１２０Ｓ及びドレーン領域１２０Ｄと、ソース／ドレーン領域１２０Ｓ、１２０Ｄにより微細流路１０５のコーナー側壁部分に定義されたチャンネル領域１３０とで構成される。ゲート絶縁膜１３２を介在してチャンネル領域１３０上にゲート電極１５０Ｇが形成されている。ゲート電極１５０Ｇは、物質検出のためのプローブが自己組み立て単層法により結合されるように金薄膜で形成されることが望ましい。そして、基板１００の表面には、ソース領域１２０Ｓ及びドレーン領域１２０Ｄをソース電極１５０Ｓ及びドレーン電極１５０Ｄと連結させるための配線１４０が形成されている。
ここでコーナー側壁部分とは、図３に示すように、微細流路１０５の側壁１０５１に、微細流路１０５の流路断面方向にくぼむように設けられた凹部１０５２の側壁１０５３と微細流路１０５の側壁１０５１とから成る角部（以下この角部を四角コーナー１０５５と称する）のことである。
【００６４】
図３に示されている物質検出用チップのＩ−Ｖ特性曲線が図４に示されている。図４のグラフから本発明の一実施例による物質検出用チップが正常的なＭＯＳＦＥＴの電気的特性を有していることが分かる。
【００６５】
以下、図５ないし図９を参照して図３に示されている物質検出用チップの製造工程を説明する。
【００６６】
まず図５のように、半導体基板１００上にシリコン酸化膜１０２を１．５ないし２．０(ｍの厚さに形成する。半導体基板１００は結晶方向が（１００）であるｎ−型シリコン基板を使用することが望ましい。
【００６７】
次いで、図６に示されたように、写真エッチング工程を使用して基板１００の表面に少なくとも一つ以上の四角コーナー１０５５を有するように、微細流路１０５とそれに連なる凹部１０５２を形成する。少なくとも一つ以上の四角コーナー１０５５を具備せねばならない理由は後続工程で説明する。本実施例では、ａ−ａ’方向の流路１０５は長く形成し、この流路１０５に連なり微細流路の流路断面方向であるｂ−ｂ’方向にくぼむ凹部１０５２は少なくとも一つ以上の四角コーナー１０５５が形成されるに適した程度の長さに形成したが、両方向の流路が全部必要な場合にはｂ−ｂ’方向の凹部１０５２も長く形成して交差路の形に形成できることはもちろんである。
【００６８】
引き続き、図７Ａに示されたように、基板１００の全面に不純物イオンをドーピングする。不純物イオンはＰ型不純物を使用する。例えば、ボロンを使用する場合、ドーピング濃度を約１０１６／ｃｍ２ないし１０１８／ｃｍ２としてドーピングを実施する。注入条件（温度及び時間）を調節した後、酸化膜の厚さによる除去時間を利用して流路１０５の側壁１０５１及び凹部１０５２の側壁１０５３にのみ不純物イオンがドーピングされ、流路１０５の底面にはドーピングされないようにすることができる。引き続き、拡散工程を経れば図７Ａの一部拡大断面図である図７Ｂのように流路１０５の側壁１０５１及び凹部１０５２の側壁１０５３にのみ不純物が広がった領域１１０が形成される。
【００６９】
図７Ｂの結果物に湿式エッチング液を処理してエッチング工程を実施する。湿式エッチング液にはＴＭＡＨ溶液を使用することが望ましい。この時、エッチングは流路１０５の四角コーナー１０５５部分でのみ選択的に行われて図８Ａのように不純物領域が一部オープンされた領域１３０が四角コーナー１０５５部分に形成される。その結果、流路１０５の側壁にソース領域１２０Ｓ、ドレーン領域１２０Ｄ及びチャンネル領域１３０が完成される。
【００７０】
四角コーナー１０５５部分でのみ選択的にエッチングが行われる理由は図８Ｂに示されたようにエッチング液に露出される各領域の結晶方向が異なるからである。すなわち、流路１０５の底面は元のシリコン基板の結晶方向である（１００）面である一方、エッチングにより形成された流路１０５の側壁の結晶方向は（１１１）面になる。したがって、（１１１）面が集まる四角コーナー１０５５で選択的に所定角度でエッチングが行われる。
【００７１】
不純物領域１１０がオープンされてチャンネル領域１３０が形成されたかどうかは、基板に逆バイアスを加えながらエッチングを行えば容易に分かる。不純物領域１１０がショートされている時には逆バイアスを加えれば電流が流れないが、エッチングが行われてコーナー領域で不純物領域１１０がオープンされればその瞬間電流が流れ始める。したがって、電流の変化量でエッチング終了点を容易に選択できる。
【００７２】
最後に図９に示されているように、ソース領域１２０Ｓ、ドレーン領域１２０Ｄ及びチャンネル領域１３０が形成されている基板全面にゲート絶縁膜１３２を形成し、ゲート電極１５０Ｇを形成する。ゲート絶縁膜１３２はシリコン酸化膜で３００ないし８００Åの厚さで形成し、ゲート電極１５０Ｇはプローブが容易に高密度で結合されるように金薄膜で形成する。望ましくは、金薄膜で構成されたゲート電極１５０Ｇがゲート絶縁膜１３２によく付着されるように金薄膜の形成前にクロム薄膜を先に形成し、金薄膜を形成してパターニングすることによってゲート電極１５０Ｇを完成することが望ましい。以後、通常の工程を経てソース／ドレーン領域１２０Ｓ、１２０Ｄと連結された配線１４０及びソース／ドレーン電極１５０Ｓ、１５０Ｄを形成して物質検出用チップを完成する。
【００７３】
本発明による物質検出用装置を使用して物質を検出する方法を図１及び図３を参考として説明する。
【００７４】
まず、物質検出用チップの表面をピラン（ｐｉｒａｎｈａ）溶液（Ｈ2ＳＯ4：Ｈ2Ｏ＝３：１）で洗浄した後、脱イオン水で洗浄した後、窒素ガスで乾燥させてＵＶオゾンを使用してチップ表面の有機物質を除去する。キットの表面も同じ方法で洗浄する。
【００７５】
洗浄が完了すれば、図１に示されているキット１０の物質検出用チップ設置部４０に図３に示されている物質検出用チップを設置する。次いで、物質試料ローディング部（図１の２０）に物質プローブ試料（図１の５５）を提供する。物質プローブ試料には、末端にチオール基が結合された物質プローブ試料を使用する。物質プローブ試料が前記ローディング部（図１の２０）と連結された流路（図１の３０）に沿って毛細管現象により移動して前記流路と連結された物質検出用チップの微細流路（図３の１０５）を通過しながら、前記微細流路の側壁に形成されているＭＯＳＦＥＴのゲート電極１５０Ｇの上面に自己組み立て単層法により結合される。プローブがゲート電極１５０Ｇの表面に結合された状態が図１０に示されている。自己組み立て単層法は、金薄膜にチオール基をリンカとしてプローブを金ゲート電極１５０Ｇの上面に結合させる方法であり、図１０で２１０はチオール基を、２２０はプローブを各々示す。このように自己組み立て単層法により金ゲート電極１５０Ｇにチオール基２１０をリンカとして選択的にプローブが付着される場合、図１０に示されたように、非常に緻密でかつよく整列された状態にプローブを結合させることができ、その結合力が強くて後続工程でターゲット分子との反応時にも非常に安定した状態を維持できる。
【００７６】
プローブには、検出しようとするターゲット物質に対応する核酸、蛋白質、酵素基質、補助因子またはオリゴサッカリドが使われうる。核酸には、単一線ＤＮＡ、単一線ＲＮＡまたは単一線ＰＮＡが使われ、蛋白質には、細胞膜受容体に対する作用子、細胞膜受容体に対する拮抗子、トキシン、ウイルスエピトープ、ホルモン、ペプチド、酵素またはモノクローナル抗体などを挙げられる。
【００７７】
プローブの結合が完了すれば前記ゲート電極にかかる電圧及び電流特性を測定する。
【００７８】
次いで、前記ローディング部（図１の２０）に検出しようとするターゲット試料を提供する。ターゲット試料は、生体から分離した試料や合成された試料を全部通称する。ターゲット試料がローディング部（図１の２０）と連結された前記流路（図１の３０）に沿って移動して前記流路と連結された物質検出用チップの微細流路（図３の１０５）を通過しながら前記プローブ（図１０の２２０）と反応するようにする。
【００７９】
最後に前記ゲート電極１５０Ｇにかかる電圧及び電流特性を測定して前記プローブ結合後に測定した電圧と電流特性との差異点を感知してターゲット物質が結合されたかどうかを検出する。
【００８０】
検出が完了され、他のターゲット物質を検出しようとする場合にはプローブを金ゲート電極１５０Ｇから分離する。前記ピラン溶液（Ｈ2ＳＯ4：Ｈ2Ｏ＝３：１）で洗浄して、プローブをゲート電極１５０Ｇから分離できる。
【００８１】
次いで、前記で新しく検出しようとするターゲット試料に対応するプローブを使用して前の工程と同じ工程を経てターゲット試料を検出する。
【００８２】
すなわち、本発明によって金ゲート電極１５０Ｇの上面にプローブを結合させる自己組み立て単層法によれば、プローブの付着、分離及び再付着が非常に容易である。すなわち、優秀な再現性を有しているため、本発明による検出装置は多様なプローブを容易に使用できるという長所がある。
【００８３】
本発明でＭＯＳＦＥＴ型センサーは、図３のように微細加工チャンネルの側壁に形成されるだけでなく、一般的な平板バイオチップの表面下に内蔵されることもある。図１１は、ＤＮＡチップの表面下に内蔵されたＭＯＳＦＥＴ型センサーを利用してＤＮＡチップにある程度のＤＮＡが付着されているかを測定するための検出システムを示している。ここで、Ａ）はスポッティングまたは光石版印刷術方法で製作されたＤＮＡチップを示し、Ｂ）は一スポットだけを拡大した領域を示し、Ｃ）はソース領域２５０Ｓ及びドレーン領域２５０Ｄと金薄膜が蒸着されたゲート領域２５０Ｇとを含むＭＯＳＦＥＴ型センサーの構造を示す。
【００８４】
図１２は、スポッティングされた各領域でプローブＤＮＡ及びターゲットＤＮＡがいかほど反応したかを測定するためのシステムである。ここで、Ａ）は単一線ＤＮＡがチップ上の金領域（すなわち、ＭＯＳＦＥＴ型センサーの表面）にのみ付着された形態を示し、Ｂ）はプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとが混成化された形態を示す。
【００８５】
スポッティングチップあるいは光石版印刷術チップを製作する基板は一般的にガラスが使われる。しかし、本発明ではシリコンウェーハを使用することが望ましい。シリコンウェーハはガラスと比較して非常に優秀な機械的特性だけでなく電気的特性も有しているので、ＤＮＡの付着及び検出システム製作時にも優秀な特性を示す。プローブＤＮＡの端部にチオールを置換させればシリコンウェーハ上にパターニングされた金領域にだけ特定的に付着させうる。
【００８６】
図１３は、本発明の核酸突然変異分析装置の一例であり、ＭＯＳＦＥＴ型センサー３００、加熱器４００及び温度センサー５００を同時に含む温度制御−検出部が微細加工チャンネル内の底面に装着された場合を概略的に示した図面である。矢印は流体が流れる方向を表示し、螺旋形はＤＮＡ線を表示する。（ａ）はＤＮＡ線が互いに合う状態を示し、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は合わない状態を示す。
【００８７】
図１４は、本発明の核酸突然変異分析装置の他の一例であり、温度制御−検出部のうち電極３００Ｅ及び金ゲート３００Ｇを含むＭＯＳＦＥＴ型センサーは微細加工チャンネル内の側壁やコーナーに装着され、ヒーター４００’及び温度センサー５００’は微細加工チャンネル内の上面に装着された場合を概略的に示した図面である。
【００８８】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は単に本発明を例示するためのものであるため、本発明の範囲がこれら実施例により制限されると解釈されない。
【００８９】
＜実施例１＞ 物質検出装置または核酸突然変異分析装置の製造
（１）微細加工チャンネルの製造
本発明装置の本体は一般的に微細組立技術に適した方法及び材料を使用して組み立てできる。例えば、本発明装置の本体は多様なポリマー材料で射出成形された部分またはシリコン、ガラスなどの結晶性基質よりなる多数の平面膜を含むことができる。シリカ、ガラスまたはシリコンのような結晶性基質の場合に、装置内のウェル及び多様なチャンネルを生成するためにエッチング、ミリング、ドリリングなどを使用できる。半導体産業分野に使われる微細組み立て技術をこれら材料や方法に適用できる。これら技術は、例えば、電気沈着、低圧蒸着、光石版印刷術、エッチング、レーザードリリングなどを含む。
【００９０】
光石版印刷術を利用した基板のエッチングが本発明の微細組み立てに特に適している。例えば、第１基板をフォトレジストで重畳させ、石版印刷術マスクを通じて電磁気光線を照射してフォトレジストを装置のチャンバ及び／またはチャンネルと同じパターンで露出させ、露出された基板をエッチングして所望のウェル及びチャンネルを生成した後、他の平面膜を第１基板上に覆って結合させる。一般的に望ましいフォトレジストは、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）及びその誘導体と、ポリ（オレフィンスルホン）のような電子ビームレジストなどを含む。
【００９１】
望ましくは、本発明の本体は射出成形されたプラスチックの部分とエッチングされたシリカまたはシリコン平面膜の部分とが組合わせられてなることもある。例えば、本発明のサンプルローディング部は射出成形技術により形成される一方、微細加工チャンネルと温度制御検出部とは平面ガラス、シリカまたはシリコンチップまたは基板上でエッチングにより微細に組み立てられる。
【００９２】
（２）ＤＮＡ検出部の製造
図１５は、前記微細加工チャンネルのコーナーに設置されるＤＮＡ検出センサー（ＭＯＳＦＥＴトランジスタ）の製作過程を順番に示したものである。
【００９３】
まず、サンプルローディング部に注入された核酸は微細流路を通じてセンサーの検出部位まで移動した後、ＤＮＡ検出センサーにより検出される。検出部のセンサーはｎ型シリコン基板を利用して湿式エッチングした後、エッチングされた側壁にボロンを拡散させてｐ型シリコン領域を作る。再び湿式シリコンエッチングを利用して連結されているボロン領域を切断すればソース及びドレーンが形成される。ＭＯＳＦＥＴ構造を形成するためにソース及びドレーン領域に薄い乾式酸化膜を成長させ、酸化膜上に金酸化膜に対する付着特性を高めるためにクロムを付着させ、その上に金を付着させる。センサーの表面に核酸ブロー部を固定させるために核酸の端部にチオール基を置換させる。チオール基を有する核酸はＳＡＭ方法を通じてセンサー表面に存在する金領域にのみ選択的に結合される。したがって、ＭＯＳＦＥＴ型ＤＮＡセンサー上に金薄膜を形成し、その上に核酸を付着させることによって検出センサーを製作できる。特に金薄膜上に付着されたチオールＳＡＭ膜は薄膜の製造が容易であり、かつ再現性があり、チオールの他側の反応器を多様に変えて応用性を最大限にすることができる。また他のＳＡＭ薄膜に比べて相対的により緻密でよく整列された薄膜を得ることができ、その結合力が強くてＳＡＭ薄膜形成後の多様な反応にも安定的であるために多く使われている。
【００９４】
（３）温度制御部の製造
本発明では微細加工チャンネル内に、ＤＮＡ検出部（ＭＯＳＦＥＴ型トランジスタ）上に付着された核酸に影響を及ぼす温度を制御するためにヒーター及び温度センサーを内蔵させる。
【００９５】
ヒーターには、当業界に製造方法が知られた薄膜抵抗性ヒーターなどを使用できる。このヒーターは微細加工チャンネル内の底面、上面または内部に電源と連結された金属フィルムを塗布することによって製造できる。また、温度センサーには、温度依存性電動機力（Ｅｌｅｃｔｒｏｍｏｔｉｖｅ Ｆｏｒｃｅ、ＥＭＦ）を生成するバイメタル接合を有するサーモカップル、温度比例の電気抵抗を有する材料を含む抵抗性サーモメータ、サーミスター、ＩＣ温度センサー、石英サーモメータなどを使用できる。
【００９６】
＜実施例２＞ プローブＤＮＡの固定化の定量的測定
プローブＤＮＡの固定化を定量的に測定するために、図３に示されているチップを図１に示されているキット１０のチップ設置部４０に設置した後、電圧を印加した状態で、相異なる含量（２０μｌ、４０μｌ、８０μｌ及び１６０μｌ）の５’末端にチオール基が置換された合成プローブＤＮＡ（５’−チオール−ＧＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣ−３’）を注入した後、経時的な電流値の変化を測定した。
【００９７】
実験結果、図１６に示されたように、センサーに注入されたプローブＤＮＡの量が多くなるにつれてセンサーのドレーンとソースとの間を流れる電流値が比例的に増加することが分かる。すなわち、（Ａ）プローブＤＮＡの量が２０μｌである場合に電流値は１４ｕＡであり、（Ｂ）プローブＤＮＡの量が４０μｌである場合に電流値は１７ｕＡであり、（Ｃ）プローブＤＮＡの量が８０μｌである場合に電流値は２０ｕＡであった。（Ｄ）ただし、ＤＮＡの量が８０μｌ以上になればこれ以上電流値が増加しなかった。
【００９８】
したがって、センサーのゲート電極にかかる電流値を測定することによってＤＮＡチップに固定化されたプローブＤＮＡの量を定量的に検出できる。また、ＤＮＡチップに付着されたプローブＤＮＡの量を定量的に測定すればより正確な反応程度が分かり、ターゲットＤＮＡと反応する時にも反応程度を正確に測定できる基本データを確保できる。
【００９９】
＜実施例３＞ プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの混成化の定量的測定
プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの混成化を定量的に測定するために、図３に示されているラップオンアチップに電圧を印加した状態で、５’末端にチオール基が置換された合成プローブＤＮＡ（５’−チオール−ＧＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣ−３’）とこれと相補的なターゲットＤＮＡとを順次に注入しながら経時的な電流値の変化を測定した。
【０１００】
具体的に、図３に示されているチップを図１に示されているキット１０のチップ設置部４０に設置した後、チップに電圧を印加して流れる電流を測定した。次いで、キット１０の試料ローディング部２０にまず燐酸バッファ緩衝液を注入した。緩衝液の注入と同時にチップに流れる電流を持続的に測定した。その結果、図１７のＡ領域のように緩衝液の注入後に電流が増加した。約３０分間電流のフローを観察して電流が安定化した後、５’末端にチオール基が置換された１５ｂｐの合成ＤＮＡ（５’−チオール−ＧＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣ−３’）プローブを試料ローディング部２０に提供した。ＤＮＡプローブの提供後、図１７のＢ領域のように電流が減少した。これは金薄膜よりなるゲート電極（図３の１５０Ｇ）表面にプローブＤＮＡが自己組み立て単層法により結合されたことを示すことが分かる。すなわち、プローブＤＮＡの結合をインサイチュで確認することができた。引続き、電流の変化を観察して電流が十分に減少したと判断される時点、すなわち、約３時間経過後に試料ローディング部２０に脱イオン水を提供して未付着されたＤＮＡプローブ及び燐酸緩衝液を除去した。次いで、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの混成化に最適の環境を提供するために、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液を試料ローディング部２０に提供した後、約１時間電流のフローを観察した。引続き、図１７のＣ地点に該当する時点でプローブＤＮＡと相補的なターゲットＤＮＡを試料ローディング部２０に提供した後、電流を測定した。ターゲットＤＮＡの提供後、図１７に示されているようにチップに流れる電流が減少した。これにより、ターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡとが混成化されたことをインサイチュで確認できた。
【０１０１】
産業上の利用可能性
本発明による物質検出用チップは微細流路の側壁に形成されたＭＯＳＦＥＴで構成される。ＭＯＳＦＥＴが微細流路の側壁に形成されているために物質検出用チップの高集積化が容易である。本発明による物質検出用チップを利用し、自己組み立て単層法を使用する場合にプローブがゲート電極の表面に直接吸着されるためにインサイチュでプローブの結合を確認でき、プローブにターゲット分子が結合されているかどうかもインサイチュで検出できる。また、ＭＯＳＦＥＴを高集積化するために検出感度を高めうる長所がある。一方、自己組み立て単層法を使用するためにプローブの結合が堅くてかつ緻密なので安定した検出結果を得ることができ、自己組み立て単層法の再現性により多様なプローブを使用して多様なターゲット物質を検出できる。
【０１０２】
また、本発明によれば、バイオチップに内蔵されたＭＯＳＦＥＴ型センサーを利用してバイオチップ上に固定化されたプローブの量を定量的に測定できるだけでなく、プローブとターゲット試料との結合程度も定量的に測定できる。特に、ＤＮＡチップの場合、ＭＯＳＦＥＴ型センサーを利用してプローブＤＮＡの固定化及びターゲットＤＮＡとの混成化を同時に正確に検出できることによって、別の製作コストが要らず、商用化が可能なＤＮＡチップの製作が可能になる。
【０１０３】
また、本発明によれば、流体が流れる流路に直接ヒーター、温度センサー及びＤＮＡ検出センサーをビルトインで同時に製作することによって温度による核酸の変性現象をリアルタイムで判別でき、多種の核酸の突然変異、特に核酸のＳＮＰを効果的に検出できる。
【０１０４】
すなわち、従来に突然変異になったＤＮＡ塩基序列を調べるためには温度によるＤＮＡ二重線構造の分離及び観察のために相異なる装備及び機械を使用せねばならず、正確でかつ精密な温度制御によるＤＮＡの分離をリアルタイムで測定することが非常に難しかったが、本発明によれば、微細加工された流路に製作された温度制御装置及び検出装置が微細加工された流路にＤＮＡを注入するだけで正確でかつ精密な温度制御による突然変異ＤＮＡの検出をリアルタイムで行える。また、温度分布は微細領域でさらに正確に現れるためにもっと正確な特性を得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の一実施例による物質検出装置の斜視図である。
【図２】 本発明の一実施例による物質検出用チップの上面図である。
【図３】 図２に示された物質検出用チップ（ＭＯＳＦＥＴ型センサー）のうち一つの斜視図である。
【図４】 図２に示されたチップのＩ−Ｖ特性を示すグラフである。
【図５】 本発明の一実施例による物質検出用チップの製造工程を段階別に示す斜視図である。
【図６】 図５に続き、本発明の一実施例による物質検出用チップの製造工程を段階別に示す斜視図である。
【図７】 図６に続き、本発明の一実施例による物質検出用チップの製造工程を段階別に示す斜視図である。
【図８】 図７に続き、本発明の一実施例による物質検出用チップの製造工程を段階別に示す斜視図である。
【図９】 図８に続き、本発明の一実施例による物質検出用チップの製造工程を段階別に示す斜視図である。
【図１０】 物質検出用チップのゲート電極に物質プローブがどのように結合されるかを示す概略図である。
【図１１】 本発明の一実施例であって、スポッティングあるいは光石版印刷術方法で付着されたプローブＤＮＡの検出装置の概略図である。
【図１２】 本発明の一実施例であって、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの混成化検出装置の概略図である。
【図１３】 微細加工チャンネル内の底面に温度制御−検出部を含む本発明の核酸突然変異分析装置を概略的に示す図面である。
【図１４】 微細加工チャンネル内の側壁に核酸固定のＭＯＳＦＥＴ型トランジスタを備え、微細加工チャンネル内の上面にヒーター及び温度センサーを備える温度制御−検出部を含む本発明の核酸分析装置を概略的に示す図面である。
【図１５】 本発明のＭＯＳＦＥＴトランジスタの製作過程を示す図面である。
【図１６】 本発明によってバイオチップに固定されたプローブＤＮＡの量による電流フローの変化を測定したグラフである。
【図１７】 本発明によってプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの混成化による電流フロー変化を測定したグラフである。
技術分野
本発明は微細流路の側壁に形成されたＭＯＳＦＥＴ（Ｍｅｔａｌ−Ｏｘｉｄｅ−Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｆｉｅｌｄ−Ｅｆｆｅｃｔ−Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）で構成された物質検出用チップ及びこれを含む物質検出装置に関する。また、本発明は前記物質検出用装置を利用した物質検出方法、具体的には物質プローブの固定化や物質プローブとターゲット試料との結合程度を定量的に検出する方法に関する。また、本発明は前記物質検出用装置にヒーター及び温度センサーが同時に装着された温度制御−検出部を含む核酸突然変異分析装置及びこれを利用した核酸突然変異分析方法に関する。
【０００２】
背景技術
ゲノムプロジェクトの完成によって人間のＤＮＡ序列が知られるにつれて各遺伝子の機能及びこれらによりコーディングされた蛋白質に対する研究がより活発になると共に、バイオ物質を容易に検出できるバイオセンサーの必要性が増大しつつある。
【０００３】
電気的な信号を使用してバイオ物質を検出できるバイオセンサーは、米国特許第４，２３８，７５７号公報、第４，７７７，０１９号公報、第５，４３１，８８３号公報及び第５，８２７，４８２号公報に開示されている。米国特許第４，２３８，７５７号公報は特定の抗体に対して反応する抗原を具備するように設計された一般のソース及びドレーンで構成されたＦＥＴについて開示している。このＦＥＴを使用してドレーン電流の変化を経時的に観察して溶液中抗原の濃度を測定する。
【０００４】
米国特許第４，７７７，０１９号公報は、ソース及びドレーン領域にドーピングされており、ゲートがソース及びドレーン領域にわたって形成されており、測定しようとするヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチドがゲート上に結合された形のＦＥＴについて開示している。
【０００５】
米国特許第５，４３１，８８３号公報は、化学種と反応して伝導性に変わる性質を有する有機絶縁物質であるフタロシアニン薄膜がゲート及びドレーンを連結する構造のＦＥＴについて開示している。
【０００６】
米国特許第５，８２７，４８２号公報は、相異なる結合の感度を増大させるようにゲートに分子受容体が結合されている２つのＦＥＴが並列に連結されたバイオセンサーについて開示している。
【０００７】
ところで、公知のバイオセンサーはいずれも通常的なＦＥＴ、すなわち、基板表面にソース、ドレーン及びチャンネル層が形成された平面的なＦＥＴで構成されていてセンサーの高集積化に限界がある。また、バイオ物質プローブを特定領域にのみ選択的に付着し難いため、ＦＥＴ製作時に別の製作装置を使用してプローブをＦＥＴに結合させねばならない。しかし、このように付着させたプローブは付着力が弱いためにターゲット分子の結合を高い感度で測定できない短所がある。そして、プローブを結合して結合されたかどうかを確認するのに相当時間がかかるので、ターゲット分子を検出するまでの所要時間が長い。
【０００８】
したがって、センサーの高集積化が容易でプローブを堅く付着させることができ、その付着如何を容易にインサイチュで確認することができ、ターゲット分子の結合を高い感度で測定できる新しいバイオセンサーの必要性が増大しつつある。
【０００９】
バイオチップとは、基質上に分析しようとするＤＮＡ、蛋白質などの生分子プローブを高密度で付着したチップであり、サンプル内の遺伝子の発現様相、遺伝子欠陥、蛋白質分布、反応様相などを分析できる。バイオチップは、プローブの付着形態によって固体基質上に付着されたマイクロアレイチップと微細チャンネル上に付着されたラップオンアチップ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）とに分けることができ、プローブの種類によってＤＮＡチップ、蛋白質チップに分けることができる。
【００１０】
現在、ＤＮＡチップ市場の大部分を占めているものは、スポッティングあるいは光石版印刷術方法で製作されたチップである。これは、二重螺旋構造の分離された一側のプローブＤＮＡだけを特定材料上に化学的な結合を利用して付着した後、ターゲットＤＮＡと反応をさせるための装置である。このようなＤＮＡチップを製作する時、プローブＤＮＡの固定化は商品の正確性及び再現性に莫大な影響をおよぼすのでより正確に制御されねばならないが、現在までの技術では正確に定量化する方法を提示できない。
【００１１】
従来に使われるスポッティングチップや、光石版印刷術チップはその製造方法によりプローブの量をある程度の体積で制御可能であるが、商品化されて病気の診断などの目的に使用するには正確性及び再現性が落ちる。特に、特定ＤＮＡの発現などを観察するような場合にはより正確なプローブＤＮＡの固定化が必要である。現在このような方法は必要であるが、製作に関する技術的問題及びコストに対する負担のため現在まで提案されていない。
【００１２】
これに、本発明者は前記従来の技術の問題点を乗り越えるために鋭意研究努力した結果、ＤＮＡチップに内蔵されたＭＯＳＦＥＴ型センサーを利用してセンサーに流れる電圧及び電流の特性を測定することによってプローブＤＮＡの固定化及び混成化を正確に検出できることを確認して、本発明を完成するようになった。これにより、別の製作コストが要らなくて商用化が可能であり、プローブＤＮＡの固定化及び混成化を同時に測定できるＤＮＡチップの製作が可能になった。
【００１３】
核酸の単一塩基変移（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）は、個人と個人間のＤＮＡに存在する単一塩基対の差であって、ＤＮＡ序列多型性のうち最も多く存在する形態である（約１個／１ｋｂ）。このようなＳＮＰは個々人の疾病に対する敏感性差の原因になるので、遺伝疾患の診断、治療及び予防に効果的に利用できる。したがって、遺伝子から個人差、人種間差と疾病に対する敏感性差をもたらす部分であるＳＮＰを速くかつ簡便に捜し出す方法が必要になっている。
【００１４】
ＳＮＰを感知し出すためには、温度によるＤＮＡ二重線構造の分離による観察が最も普遍化している。約９６℃以上の温度では二重線をなしているＤＮＡの水素結合がいずれも切れて分離される。このような特性を利用して突然変異されたＤＮＡ塩基序列を明らかにすることができるが、相異なる装備及び機械を使用せねばならず、正確でかつ精密な温度制御によるＤＮＡの分離をリアルタイムで測定する技術は非常に難しい状況である。
【００１５】
米国特許第６，１７１，８５０号公報（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｅｓ）では、熱交換器を使用して各々反応器の内部及び外部で直接温度を制御した。反応システムは加熱器と一つ以上の熱交換器とで構成されている。しかし、このシステムではただいくつかの反応器の温度制御についてのみ言及されており、熱交換器を含んでいてＤＮＡの感知及び流路上での特性を期待し難い。
【００１６】
米国特許第６，１７４，６７５号公報（Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｃｕｒｒｅｎｔ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｆｌｕｉｄ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏ−ｃｈａｎｎｅｌｓ）では流路に直接電気制御式加熱器及び冷却器を装着している色々な形態の加熱器を示した。しかし、この特許ではＰＣＲ等に使われる温度制御装置だけを開示するだけで温度によるＤＮＡ二重線構造の分離を検出する装置については全く言及されていない。
【００１７】
米国特許第５，６８３，６５７号（ＤＮＡ ｍｅｌｔｏｍｅｔｅｒ）では、温度が一定に維持されてバッファ溶液を運搬できる温度調節チャンバ、チャンバの温度制御のための加熱と冷却手段、そして、Ｔｍの温度で分離された二重線構造のＤＮＡを蛍光物質で表示して検出する手段で構成された核酸分析装置を開示している。しかし、この装置はＤＮＡ検出手段が温度調節チャンバと別途に存在して構成が複雑であり、かつ検出時間が遅延される問題点があった。
【００１８】
これに、本発明者は二重線構造で形成されているＤＮＡは温度が上昇するにつれて２本に分けられるという原理を利用して小型の装置上に多様な温度制御及びＤＮＡ検出が可能なシステムを構築してＤＮＡの突然変異（ＳＮＰ）測定装置を完成した。本発明によれば、ＤＮＡが分離されたかどうかを流路に直接製作された検出装置を通じてリアルタイムで判別できる。
【００１９】
発明の開示
本発明が解決しようとする技術的課題は、高集積化が容易であり、プローブの結合及びターゲット分子の結合をインサイチュで短時間に確認できる物質検出用チップを提供することにある。
【００２０】
本発明が解決しようとする他の技術的課題は、前記物質検出用チップを含む物質検出装置を提供することにある。
【００２１】
本発明が解決しようとするさらに他の技術的課題は、物質検出用チップの製造方法を提供することにある。
【００２２】
本発明が解決しようとするさらに他の技術的課題は、物質検出装置を使用して物質プローブの固定化を定量的に検出する方法を提供することにある。
【００２３】
本発明のさらに他の課題は、物質検出装置を使用してプローブ及びターゲット試料の結合程度を定量的に検出する方法を提供することにある。
【００２４】
本発明のさらに他の課題は、流路に直接温度制御装置及び検出装置を微細加工することによって正確でかつ精密な温度制御による突然変異ＤＮＡの検出をリアルタイムで行える新しい核酸突然変異分析装置を提供することにある。
また、本発明の課題は、前記核酸突然変異分析装置を利用してＳＮＰを効果的に検出できる方法を提供することにある。
【００２５】
前記技術的課題を達成するための本発明による物質検出用チップは半導体基板、前記基板表面に形成され、物質試料の通路になる微細流路と、前記微細流路の側壁に、前記微細流路の流路断面方向にくぼむように設けられた凹部の側壁と前記微細流路の側壁とから成る角部に形成されたＭＯＳＦＥＴを含む。
【００２６】
本発明で、微細流路の側壁とは、微細流路の側壁だけでなくコーナー（ｃｏｎｖｅｘ ｃｏｒｎｅｒ）も含むことと意図される。
【００２７】
望ましくは、前記ＭＯＳＦＥＴのゲート電極は金（Ａｕ）薄膜で形成され、前記ゲート電極の表面にはチオール基が付着された物質プローブが自己組み立て単層法により付着される。
【００２８】
さらに他の技術的課題を達成するための本発明による物質検出用チップの製造方法によれば、まず、半導体基板表面に酸化膜を形成する。次いで、前記基板表面をエッチングして微細流路と当該微細流路の側壁に連なり前記微細流路の流路断面方向にくぼむ凹部とを形成した後、前記微細流路の側壁及び前記凹部の側壁に不純物をドーピングして不純物領域を形成し、前記基板をエッチング液に処理して前記微細流路の側壁及び前記凹部の側壁に形成された不純物領域の一部を除去して前記微細流路の側壁と前記凹部の側壁から成る角部にＭＯＳＦＥＴのチャンネル領域を定義する。次いで、前記チャンネル領域上に酸化膜を形成した後、前記チャンネル領域上に金（Ａｕ）よりなるゲート電極を形成して物質検出用チップを完成する。
【００２９】
望ましくは、前記チャンネル領域を定義する段階は、前記角部に沿って選択的に不純物領域が除去されることにより実行される。
【００３０】
そして、前記チャンネル領域を定義する段階は、前記基板に逆バイアスを印加して電流の変化を感知してエッチング終了点を選択することが望ましい。
【００３１】
前記他の技術的課題を達成するための本発明による物質検出用装置は、基板と、前記基板表面に形成された物質試料ローディング部と、一端が前記物質試料ローディング部と連結されて前記物質試料の通路になる少なくとも一つ以上の微細流路と、前記微細流路の他端に連結されて物質プローブが付着されるＭＯＳＦＥＴ型センサーとを含む。
【００３２】
望ましくは、前記ＭＯＳＦＥＴ型センサーは本発明による物質検出用チップを使用する。この場合、物質検出用チップは物質検出用キットと別途に製作された後、前記物質検出用キットの微細流路の末端に位置した物質検出用チップ設置部に装着されるものが望ましい。
【００３３】
さらに他の技術的課題を達成するための本発明による物質検出方法によれば、まず、物質検出装置用キット基板表面に形成された物質試料ローディング部に物質プローブを提供し、前記物質プローブが、一端が前記ローディング部と連結された前記キットの流路に沿って移動して前記流路の他端に連結された物質検出用チップの微細流路を通過しながら前記微細流路の側壁に形成されているＭＯＳＦＥＴのゲート電極上面に結合させる。次いで、前記ゲート電極にかかる電圧及び電流特性を測定する。引続き、前記ローディング部にターゲット試料を提供し、前記ターゲット試料が前記キットの流路に沿って移動して前記流路の他端に連結された物質検出用チップの微細流路を通過しながら前記プローブと反応させる。最後に前記ゲート電極にかかる電圧及び電流特性を測定してプローブ結合後に測定した電圧及び電流特性との差を感知してターゲット物質を検出する。
【００３４】
望ましくは、プローブがゲート電極に結合された後、前記試料ローディング部に洗浄液を提供して前記ゲート電極に結合されていない前記物質プローブを除去する段階をさらに具備し、ターゲット物質がプローブに結合された後、前記試料ローディング部に洗浄液を提供して前記プローブと反応しないターゲット試料を除去する。
【００３５】
本発明において、前記物質プローブまたはターゲット物質は核酸、蛋白質、酵素基質、補助因子またはオリゴサッカリドが使われる。望ましくは、前記核酸は単一線ＤＮＡ、単一線ＲＮＡまたは単一線ＰＮＡであり、前記蛋白質は細胞膜受容体に対する作用子、細胞膜受容体に対する拮抗子、トキシン、ウイルスエピトープ、ホルモン、ペプチド、酵素またはモノクローナル抗体である。より望ましくは、前記物質プローブは単一線核酸であり、前記ターゲット物質は前記プローブと混成化される単一線核酸である。
【００３６】
本発明による物質検出用チップは高集積化が容易であり、プローブ及びターゲット分子の結合をインサイチュで確認できる長所がある。
【００３７】
本発明のまた他の目的を達成するために、本発明は、本発明による物質検出用装置の物質試料ローディング部に物質プローブを提供する段階と、前記物質プローブを微細流路に沿って移してＭＯＳＦＥＴ型センサーのゲート電極上面に結合させる段階と、前記ゲート電極にかかる電圧及び電流の特性を測定する段階とを含む物質プローブの固定化を定量的に検出する方法を提供する。
【００３８】
さらに本発明の他の目的を達成するために、本発明は、（ａ）本発明による物質検出用装置の物質試料ローディング部に物質プローブを提供する段階と、（ｂ）前記物質プローブを微細流路に沿って移してＭＯＳＦＥＴ型センサーのゲート電極上面に結合させる段階と、（ｃ）前記ゲート電極にかかる電圧及び電流の特性を測定する段階と、（ｄ）前記物質試料ローディング部にターゲット試料物質を提供する段階と、（ｅ）前記ターゲット試料物質を微細流路に沿って移してＭＯＳＦＥＴ型センサーのゲート電極上面に結合された物質プローブに結合させる段階と、（ｆ）前記ゲート電極にかかる電圧及び電流の特性を測定して前記（ｃ）段階で測定した電圧と電流の特性と比較する段階とを含む物質プローブとターゲット試料との結合程度を定量的に検出する方法を提供する。
【００３９】
このように、本発明によれば、物質検出装置に内蔵されたＭＯＳＦＥＴ型センサーを利用してセンサーのゲート電極上面にかかる電圧及び電流の特性を測定することによってプローブの固定化だけでなく、プローブ及びターゲット試料の混成化も定量的に検出できる。特に、ＤＮＡチップの場合、プローブ核酸（単一線ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ）の固定化だけでなく、プローブ核酸とターゲット核酸との混成化程度も定量的に検出できる。
【００４０】
本発明の他の目的を達成するために、本発明では温度によるＤＮＡの分離及びそれによる検出のために流体が流れる流路（微細加工チャンネル）に直接ヒーター、温度センサー、及びＤＮＡ検出センサー（ＭＯＳＦＥＴ型）をビルトインで同時に製作する。これによれば、ヒーター及び温度センサーでＤＮＡにおよぶ温度を制御しながら同時にＤＮＡ検出器でＤＮＡが二重線構造であるか、単一線構造であるかをリアルタイムで判別できる。
【００４１】
具体的には、本発明、基板と、前記基板表面に形成されたサンプルローディング部と、前記サンプルローディング部と直接連結され、サンプルの流入通路になる微細加工チャンネルと、前記微細加工チャンネル内に一つ以上の核酸固定のＭＯＳＦＥＴ型センサーとヒーター及び温度センサーが同時に装着された温度制御−検出部とを含む核酸突然変異分析装置を提供する。
【００４２】
望ましくは、前記ヒーター及び温度センサーは、前記ＭＯＳＦＥＴ型センサーと近接して位置してそのＭＯＳＦＥＴ型センサー上に付着された核酸に影響を及ぼす温度を制御し、前記ＭＯＳＦＥＴ型センサーは、その上に付着された核酸のＴｍ温度で変性された二重線核酸または復元された二重線核酸を検出することを特徴とする。
【００４３】
本発明においては、二重線核酸の分離前後の電荷変化を調べるためのセンサーとしてＭＯＳＦＥＴトランジスタを利用した。
【００４４】
望ましくは、本発明のＭＯＳＦＥＴ型トランジスタは微細加工流路の側壁のコーナーに位置することを特徴とする。現在まで製作されたＦＥＴを利用したバイオ分子センサーはいずれも平面上に製作された。しかし、本発明で製作したバイオ分子センサーは、バルク微細加工及び拡散を利用した３次元ＭＯＳＦＥＴ形態であり、主に微細加工流路のコーナーに位置する。このような構造のバイオ分子センサーは核酸が流れる流路に直接位置して検出時間を画期的に短縮させるだけでなく、検出器が占める空間を大福縮めることができて狭い空間により多くのセンサーを装着できるという長所を有している。ここでコーナーとは、微細流路の側壁に、微細流路の流路断面方向にくぼむように設けられた凹部の側壁と微細流路の側壁とから成る角部のことである。
【００４５】
本発明において、ＭＯＳＦＥＴ型トランジスタはソース及びドレーン領域に金薄膜が形成され、その金表面にＳＡＭ（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ）方法で固定化されたチオール基がついた核酸を有することを特徴とする。本発明で、センサーはソース及びドレーンの両端子を有して両端子の表面に薄い酸化膜が覆われ、その上にＡｕを付着させればＭＯＳ（Ｍｅｔａｌ−Ｏｘｉｄｅ−Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）の構造を形成するようになる。また、Ａｕと酸化膜との間に高い選択性を有して核酸分子が吸着されるように核酸分子の端部にチオールを付着させる。チオールを付着させた核酸分子はＳＡＭ（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ）法で金表面に吸着される。ＳＡＭは基質表面上に自発的に付着されて規則的によく整列された有機単分子膜という意味で、基質と有機分子との直接的な化学結合を利用するために外部の他の製作装置を必要としない。いままで製作されたバイオ分子センサーはバイオ分子を特定領域にのみ付着させ難く、付着力も弱い短所を有している。しかし、本発明で使用するＳＡＭ方法を利用したチオール基置換されたバイオ分子の金に対する選択的な吸着方法はこのような問題点を解決するだけでなく、センサーの表面に直接付着されるので反応前後の電荷量変化も容易に分かる。
【００４６】
本発明において、ＭＯＳＦＥＴ型トランジスタに固定化された核酸は単一線ＤＮＡ、単一線ＲＮＡまたは単一線ＰＮＡであることを特徴とする。これら単一線（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ、ｓｓ）核酸はサンプルローディング部に注入されたターゲット核酸と混成化するプローブとしての役割をする。前記ＭＯＳＦＥＴセンサーには相異なる塩基序列の核酸が付着されることが望ましい。
【００４７】
本発明において、ヒーターは温度制御−検出部の温度を高める機能をし、温度センサーはヒーターの動作を制御する機能をする。このようなヒーター及び温度センサーは、前記ＭＯＳＦＥＴセンサー上に付着された核酸に影響を及ぼす温度を効果的に制御するために、そのＭＯＳＦＥＴセンサーに近接して位置することが望ましい。
【００４８】
さらに他の目的を達成するために、本発明は、ＭＯＳＦＥＴ型センサーの表面金属に単一線核酸プローブを固定化させる段階と、固定化されたプローブと反応するターゲット核酸をサンプルローディング部に注入し、微細加工チャンネルの流路に沿ってＭＯＳＦＥＴ型センサーに移動させる段階と、ターゲット核酸を前記ＭＯＳＦＥＴ型センサーの核酸プローブと混成化させる段階と、二重線核酸を単一線に分離するために温度を段々上昇させる段階と、ＭＯＳＦＥＴ型センサーのゲートにかかる電圧及び電流特性を測定する段階とを含むことを特徴とする核酸の突然変異を分析する方法を提供する。
【００４９】
これは、低温で核酸を混成化した後、温度を上昇させながら突然変異を検知する方法であって、微細加工された流路に製作された温度制御装置及び検出装置は正確でかつ精密な温度制御により核酸の突然変異をリアルタイムで分析できる。
【００５０】
これと選択的に、本発明は、ＭＯＳＦＥＴ型センサーの表面金属に単一線核酸プローブを固定化させる段階と、固定化されたプローブと反応するターゲット核酸をサンプルローディング部に注入し、微細加工チャンネルの流路に沿ってＭＯＳＦＥＴ型センサーに移す段階と、ターゲット核酸と核酸プローブとの混成化防止に効果的な温度に維持させる段階と、単一線核酸を二重線にするために温度を徐々に下降させる段階と、ＭＯＳＦＥＴ型センサーのゲートにかかる電圧及び電流特性を測定する段階とを含むことを特徴とする核酸の突然変異を分析する方法を提供する。
【００５１】
これは、高温で核酸を変性させた後、温度を下降させながら突然変異を検知する方法である。
【００５２】
本発明による核酸突然変異分析装置及び方法は、核酸突然変異、特に核酸のＳＮＰの検出に効果的に利用できる。ＤＮＡは二重線構造よりなっており、これは温度が約９６℃以上になれば２線に分かれる。２線が互いに各々完壁に塩基対が合えば、相対的に高温で変性され、そのうち合わない塩基対があれば相対的に低い温度で変性される。このような原理にＭＥＭＳ技術を合わせて相異なる温度に調節できる超小型温度制御装置及び検出装置を共に構成したシステムを製作する。このようなシステムを利用してそれぞれのＭＯＳＦＥＴ型トランジスタに、核酸の塩基配列を一つずつ異に配置させればそれぞれの温度制御装置で何℃で変性されたかが分かり、これを利用して核酸の単一塩基突然変異などを分析できる。
【００５３】
図面の簡単な説明
図１は、本発明の一実施例による物質検出装置の斜視図であり、
図２は、本発明の一実施例による物質検出用チップの上面図であり、
図３は、図２に示された物質検出用チップ（ＭＯＳＦＥＴ型センサー）のうち一つの斜視図であり、
図４は、図２に示されたチップのＩ−Ｖ特性を示すグラフであり、
図５ないし図９は、本発明の一実施例による物質検出用チップの製造工程を段階別に示す斜視図であり、
図１０は、物質検出用チップのゲート電極に物質プローブがどのように結合されるかを示す概略図であり、
図１１は、本発明の一実施例であって、スポッティングあるいは光石版印刷術方法で付着されたプローブＤＮＡの検出装置の概略図であり、
図１２は、本発明の一実施例であって、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの混成化検出装置の概略図であり、
図１３は、微細加工チャンネル内の底面に温度制御−検出部を含む本発明の核酸突然変異分析装置を概略的に示す図面であり、
図１４は、微細加工チャンネル内の側壁に核酸固定のＭＯＳＦＥＴ型トランジスタを備え、微細加工チャンネル内の上面にヒーター及び温度センサーを備える温度制御−検出部を含む本発明の核酸分析装置を概略的に示す図面であり、
図１５は、本発明のＭＯＳＦＥＴトランジスタの製作過程を示す図面であり、
図１６は、本発明によってバイオチップに固定されたプローブＤＮＡの量による電流フローの変化を測定したグラフであり、
図１７は、本発明によってプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの混成化による電流フロー変化を測定したグラフである。
【００５４】
発明を実施するための最良の態様
以下、本発明による物質検出用チップ、これを含む物質検出用装置、物質検出用チップの製造方法及び物質検出用装置を利用した物質の検出方法について説明する。しかし、本発明は以下で開示される実施例に限定されず、相異なる多様な形態で具現され、ただ、本実施例は本発明の開示を完全にし、通常の知識を有する者に本発明の範ちゅうを完全に知らせるために提供されるものである。図面で各膜の厚さは説明の便宜のために誇張されて図示され、各図面で同一参照符号は同一部材を示す。
【００５５】
図１は、本発明の一実施例による物質検出用装置の斜視図である。
【００５６】
物質検出用装置は、物質検出用キット１０、及びこのキット１０に設置される物質検出用チップ（図示せず）で構成される。物質検出用キット１０は基板１５の表面に少なくとも一つ以上の物質試料ローディング部２０を具備し、前記物質試料ローディング部２０は流路３０を通じて物質検出用チップ設置部４０と連結されている。流路３０の幅及び深さは物質試料が毛細管現象により流動できる程度の大きさである。
【００５７】
図面符号５０は試料提供機構を、図面符号５５は試料を示す。
【００５８】
図示していないが、キット１０は、物質検出用チップ設置部４０に設置される物質検出用チップ（図示せず）と電気的な信号を交換できる各種電気設備を具備している。
【００５９】
本実施例では物質検出用チップが別に分離されて必要な場合にのみキット１０に設置または分離できる場合を説明したが、必要に応じて前記キットと一体型に物質検出用チップが形成されることもある。
【００６０】
図２は、前記物質検出用キットの設置部（図１の４０）に設置される本発明の一実施例による物質検出用チップの上面図である。
【００６１】
図１に示されたキット１０の物質試料ローディング部２０と一端が結合された流路３０の他端と連結される微細流路３０’が形成されており、微細流路３０’の反対側には物質試料排出口６０が形成されている。表面にはソース電極１５０Ｓ、ドレーン電極１５０Ｄ、及びゲート電極１５０Ｇが形成されており、ソース／ドレーン電極１５０Ｓ、１５０Ｄと連結された配線１５０が形成されている。
【００６２】
図２に示された物質検出用チップのうち一つの斜視図である図３を参考として本発明の一実施例による物質検出用チップの構造をより詳細に説明する。
【００６３】
半導体基板１００の表面に物質試料の微細流路１０５が形成されており、前記微細流路１０５の側壁に４つのＭＯＳＦＥＴが形成されている。本発明の物質検出用チップには少なくとも一つ以上のＭＯＳＦＥＴを含めうる。ＭＯＳＦＥＴは、微細流路１０５の側壁に不純物をドーピングして形成したソース領域１２０Ｓ及びドレーン領域１２０Ｄと、ソース／ドレーン領域１２０Ｓ、１２０Ｄにより微細流路１０５のコーナー側壁部分に定義されたチャンネル領域１３０とで構成される。ゲート絶縁膜１３２を介在してチャンネル領域１３０上にゲート電極１５０Ｇが形成されている。ゲート電極１５０Ｇは、物質検出のためのプローブが自己組み立て単層法により結合されるように金薄膜で形成されることが望ましい。そして、基板１００の表面には、ソース領域１２０Ｓ及びドレーン領域１２０Ｄをソース電極１５０Ｓ及びドレーン電極１５０Ｄと連結させるための配線１４０が形成されている。
ここでコーナー側壁部分とは、図３に示すように、微細流路１０５の側壁１０５１に、微細流路１０５の流路断面方向にくぼむように設けられた凹部１０５２の側壁１０５３と微細流路１０５の側壁１０５１とから成る角部（以下この角部を四角コーナー１０５５と称する）のことである。
【００６４】
図３に示されている物質検出用チップのＩ−Ｖ特性曲線が図４に示されている。図４のグラフから本発明の一実施例による物質検出用チップが正常的なＭＯＳＦＥＴの電気的特性を有していることが分かる。
【００６５】
以下、図５ないし図９を参照して図３に示されている物質検出用チップの製造工程を説明する。
【００６６】
まず図５のように、半導体基板１００上にシリコン酸化膜１０２を１．５ないし２．０(ｍの厚さに形成する。半導体基板１００は結晶方向が（１００）であるｎ−型シリコン基板を使用することが望ましい。
【００６７】
次いで、図６に示されたように、写真エッチング工程を使用して基板１００の表面に少なくとも一つ以上の四角コーナー１０５５を有するように、微細流路１０５とそれに連なる凹部１０５２を形成する。少なくとも一つ以上の四角コーナー１０５５を具備せねばならない理由は後続工程で説明する。本実施例では、ａ−ａ’方向の流路１０５は長く形成し、この流路１０５に連なり微細流路の流路断面方向であるｂ−ｂ’方向にくぼむ凹部１０５２は少なくとも一つ以上の四角コーナー１０５５が形成されるに適した程度の長さに形成したが、両方向の流路が全部必要な場合にはｂ−ｂ’方向の凹部１０５２も長く形成して交差路の形に形成できることはもちろんである。
【００６８】
引き続き、図７Ａに示されたように、基板１００の全面に不純物イオンをドーピングする。不純物イオンはＰ型不純物を使用する。例えば、ボロンを使用する場合、ドーピング濃度を約１０１６／ｃｍ２ないし１０１８／ｃｍ２としてドーピングを実施する。注入条件（温度及び時間）を調節した後、酸化膜の厚さによる除去時間を利用して流路１０５の側壁１０５１及び凹部１０５２の側壁１０５３にのみ不純物イオンがドーピングされ、流路１０５の底面にはドーピングされないようにすることができる。引き続き、拡散工程を経れば図７Ａの一部拡大断面図である図７Ｂのように流路１０５の側壁１０５１及び凹部１０５２の側壁１０５３にのみ不純物が広がった領域１１０が形成される。
【００６９】
図７Ｂの結果物に湿式エッチング液を処理してエッチング工程を実施する。湿式エッチング液にはＴＭＡＨ溶液を使用することが望ましい。この時、エッチングは流路１０５の四角コーナー１０５５部分でのみ選択的に行われて図８Ａのように不純物領域が一部オープンされた領域１３０が四角コーナー１０５５部分に形成される。その結果、流路１０５の側壁にソース領域１２０Ｓ、ドレーン領域１２０Ｄ及びチャンネル領域１３０が完成される。
【００７０】
四角コーナー１０５５部分でのみ選択的にエッチングが行われる理由は図８Ｂに示されたようにエッチング液に露出される各領域の結晶方向が異なるからである。すなわち、流路１０５の底面は元のシリコン基板の結晶方向である（１００）面である一方、エッチングにより形成された流路１０５の側壁の結晶方向は（１１１）面になる。したがって、（１１１）面が集まる四角コーナー１０５５で選択的に所定角度でエッチングが行われる。
【００７１】
不純物領域１１０がオープンされてチャンネル領域１３０が形成されたかどうかは、基板に逆バイアスを加えながらエッチングを行えば容易に分かる。不純物領域１１０がショートされている時には逆バイアスを加えれば電流が流れないが、エッチングが行われてコーナー領域で不純物領域１１０がオープンされればその瞬間電流が流れ始める。したがって、電流の変化量でエッチング終了点を容易に選択できる。
【００７２】
最後に図９に示されているように、ソース領域１２０Ｓ、ドレーン領域１２０Ｄ及びチャンネル領域１３０が形成されている基板全面にゲート絶縁膜１３２を形成し、ゲート電極１５０Ｇを形成する。ゲート絶縁膜１３２はシリコン酸化膜で３００ないし８００Åの厚さで形成し、ゲート電極１５０Ｇはプローブが容易に高密度で結合されるように金薄膜で形成する。望ましくは、金薄膜で構成されたゲート電極１５０Ｇがゲート絶縁膜１３２によく付着されるように金薄膜の形成前にクロム薄膜を先に形成し、金薄膜を形成してパターニングすることによってゲート電極１５０Ｇを完成することが望ましい。以後、通常の工程を経てソース／ドレーン領域１２０Ｓ、１２０Ｄと連結された配線１４０及びソース／ドレーン電極１５０Ｓ、１５０Ｄを形成して物質検出用チップを完成する。
【００７３】
本発明による物質検出用装置を使用して物質を検出する方法を図１及び図３を参考として説明する。
【００７４】
まず、物質検出用チップの表面をピラン（ｐｉｒａｎｈａ）溶液（Ｈ2ＳＯ4：Ｈ2Ｏ＝３：１）で洗浄した後、脱イオン水で洗浄した後、窒素ガスで乾燥させてＵＶオゾンを使用してチップ表面の有機物質を除去する。キットの表面も同じ方法で洗浄する。
【００７５】
洗浄が完了すれば、図１に示されているキット１０の物質検出用チップ設置部４０に図３に示されている物質検出用チップを設置する。次いで、物質試料ローディング部（図１の２０）に物質プローブ試料（図１の５５）を提供する。物質プローブ試料には、末端にチオール基が結合された物質プローブ試料を使用する。物質プローブ試料が前記ローディング部（図１の２０）と連結された流路（図１の３０）に沿って毛細管現象により移動して前記流路と連結された物質検出用チップの微細流路（図３の１０５）を通過しながら、前記微細流路の側壁に形成されているＭＯＳＦＥＴのゲート電極１５０Ｇの上面に自己組み立て単層法により結合される。プローブがゲート電極１５０Ｇの表面に結合された状態が図１０に示されている。自己組み立て単層法は、金薄膜にチオール基をリンカとしてプローブを金ゲート電極１５０Ｇの上面に結合させる方法であり、図１０で２１０はチオール基を、２２０はプローブを各々示す。このように自己組み立て単層法により金ゲート電極１５０Ｇにチオール基２１０をリンカとして選択的にプローブが付着される場合、図１０に示されたように、非常に緻密でかつよく整列された状態にプローブを結合させることができ、その結合力が強くて後続工程でターゲット分子との反応時にも非常に安定した状態を維持できる。
【００７６】
プローブには、検出しようとするターゲット物質に対応する核酸、蛋白質、酵素基質、補助因子またはオリゴサッカリドが使われうる。核酸には、単一線ＤＮＡ、単一線ＲＮＡまたは単一線ＰＮＡが使われ、蛋白質には、細胞膜受容体に対する作用子、細胞膜受容体に対する拮抗子、トキシン、ウイルスエピトープ、ホルモン、ペプチド、酵素またはモノクローナル抗体などを挙げられる。
【００７７】
プローブの結合が完了すれば前記ゲート電極にかかる電圧及び電流特性を測定する。
【００７８】
次いで、前記ローディング部（図１の２０）に検出しようとするターゲット試料を提供する。ターゲット試料は、生体から分離した試料や合成された試料を全部通称する。ターゲット試料がローディング部（図１の２０）と連結された前記流路（図１の３０）に沿って移動して前記流路と連結された物質検出用チップの微細流路（図３の１０５）を通過しながら前記プローブ（図１０の２２０）と反応するようにする。
【００７９】
最後に前記ゲート電極１５０Ｇにかかる電圧及び電流特性を測定して前記プローブ結合後に測定した電圧と電流特性との差異点を感知してターゲット物質が結合されたかどうかを検出する。
【００８０】
検出が完了され、他のターゲット物質を検出しようとする場合にはプローブを金ゲート電極１５０Ｇから分離する。前記ピラン溶液（Ｈ2ＳＯ4：Ｈ2Ｏ＝３：１）で洗浄して、プローブをゲート電極１５０Ｇから分離できる。
【００８１】
次いで、前記で新しく検出しようとするターゲット試料に対応するプローブを使用して前の工程と同じ工程を経てターゲット試料を検出する。
【００８２】
すなわち、本発明によって金ゲート電極１５０Ｇの上面にプローブを結合させる自己組み立て単層法によれば、プローブの付着、分離及び再付着が非常に容易である。すなわち、優秀な再現性を有しているため、本発明による検出装置は多様なプローブを容易に使用できるという長所がある。
【００８３】
本発明でＭＯＳＦＥＴ型センサーは、図３のように微細加工チャンネルの側壁に形成されるだけでなく、一般的な平板バイオチップの表面下に内蔵されることもある。図１１は、ＤＮＡチップの表面下に内蔵されたＭＯＳＦＥＴ型センサーを利用してＤＮＡチップにある程度のＤＮＡが付着されているかを測定するための検出システムを示している。ここで、Ａ）はスポッティングまたは光石版印刷術方法で製作されたＤＮＡチップを示し、Ｂ）は一スポットだけを拡大した領域を示し、Ｃ）はソース領域２５０Ｓ及びドレーン領域２５０Ｄと金薄膜が蒸着されたゲート領域２５０Ｇとを含むＭＯＳＦＥＴ型センサーの構造を示す。
【００８４】
図１２は、スポッティングされた各領域でプローブＤＮＡ及びターゲットＤＮＡがいかほど反応したかを測定するためのシステムである。ここで、Ａ）は単一線ＤＮＡがチップ上の金領域（すなわち、ＭＯＳＦＥＴ型センサーの表面）にのみ付着された形態を示し、Ｂ）はプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとが混成化された形態を示す。
【００８５】
スポッティングチップあるいは光石版印刷術チップを製作する基板は一般的にガラスが使われる。しかし、本発明ではシリコンウェーハを使用することが望ましい。シリコンウェーハはガラスと比較して非常に優秀な機械的特性だけでなく電気的特性も有しているので、ＤＮＡの付着及び検出システム製作時にも優秀な特性を示す。プローブＤＮＡの端部にチオールを置換させればシリコンウェーハ上にパターニングされた金領域にだけ特定的に付着させうる。
【００８６】
図１３は、本発明の核酸突然変異分析装置の一例であり、ＭＯＳＦＥＴ型センサー３００、加熱器４００及び温度センサー５００を同時に含む温度制御−検出部が微細加工チャンネル内の底面に装着された場合を概略的に示した図面である。矢印は流体が流れる方向を表示し、螺旋形はＤＮＡ線を表示する。（ａ）はＤＮＡ線が互いに合う状態を示し、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は合わない状態を示す。
【００８７】
図１４は、本発明の核酸突然変異分析装置の他の一例であり、温度制御−検出部のうち電極３００Ｅ及び金ゲート３００Ｇを含むＭＯＳＦＥＴ型センサーは微細加工チャンネル内の側壁やコーナーに装着され、ヒーター４００’及び温度センサー５００’は微細加工チャンネル内の上面に装着された場合を概略的に示した図面である。
【００８８】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は単に本発明を例示するためのものであるため、本発明の範囲がこれら実施例により制限されると解釈されない。
【００８９】
＜実施例１＞ 物質検出装置または核酸突然変異分析装置の製造
（１）微細加工チャンネルの製造
本発明装置の本体は一般的に微細組立技術に適した方法及び材料を使用して組み立てできる。例えば、本発明装置の本体は多様なポリマー材料で射出成形された部分またはシリコン、ガラスなどの結晶性基質よりなる多数の平面膜を含むことができる。シリカ、ガラスまたはシリコンのような結晶性基質の場合に、装置内のウェル及び多様なチャンネルを生成するためにエッチング、ミリング、ドリリングなどを使用できる。半導体産業分野に使われる微細組み立て技術をこれら材料や方法に適用できる。これら技術は、例えば、電気沈着、低圧蒸着、光石版印刷術、エッチング、レーザードリリングなどを含む。
【００９０】
光石版印刷術を利用した基板のエッチングが本発明の微細組み立てに特に適している。例えば、第１基板をフォトレジストで重畳させ、石版印刷術マスクを通じて電磁気光線を照射してフォトレジストを装置のチャンバ及び／またはチャンネルと同じパターンで露出させ、露出された基板をエッチングして所望のウェル及びチャンネルを生成した後、他の平面膜を第１基板上に覆って結合させる。一般的に望ましいフォトレジストは、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）及びその誘導体と、ポリ（オレフィンスルホン）のような電子ビームレジストなどを含む。
【００９１】
望ましくは、本発明の本体は射出成形されたプラスチックの部分とエッチングされたシリカまたはシリコン平面膜の部分とが組合わせられてなることもある。例えば、本発明のサンプルローディング部は射出成形技術により形成される一方、微細加工チャンネルと温度制御検出部とは平面ガラス、シリカまたはシリコンチップまたは基板上でエッチングにより微細に組み立てられる。
【００９２】
（２）ＤＮＡ検出部の製造
図１５は、前記微細加工チャンネルのコーナーに設置されるＤＮＡ検出センサー（ＭＯＳＦＥＴトランジスタ）の製作過程を順番に示したものである。
【００９３】
まず、サンプルローディング部に注入された核酸は微細流路を通じてセンサーの検出部位まで移動した後、ＤＮＡ検出センサーにより検出される。検出部のセンサーはｎ型シリコン基板を利用して湿式エッチングした後、エッチングされた側壁にボロンを拡散させてｐ型シリコン領域を作る。再び湿式シリコンエッチングを利用して連結されているボロン領域を切断すればソース及びドレーンが形成される。ＭＯＳＦＥＴ構造を形成するためにソース及びドレーン領域に薄い乾式酸化膜を成長させ、酸化膜上に金酸化膜に対する付着特性を高めるためにクロムを付着させ、その上に金を付着させる。センサーの表面に核酸ブロー部を固定させるために核酸の端部にチオール基を置換させる。チオール基を有する核酸はＳＡＭ方法を通じてセンサー表面に存在する金領域にのみ選択的に結合される。したがって、ＭＯＳＦＥＴ型ＤＮＡセンサー上に金薄膜を形成し、その上に核酸を付着させることによって検出センサーを製作できる。特に金薄膜上に付着されたチオールＳＡＭ膜は薄膜の製造が容易であり、かつ再現性があり、チオールの他側の反応器を多様に変えて応用性を最大限にすることができる。また他のＳＡＭ薄膜に比べて相対的により緻密でよく整列された薄膜を得ることができ、その結合力が強くてＳＡＭ薄膜形成後の多様な反応にも安定的であるために多く使われている。
【００９４】
（３）温度制御部の製造
本発明では微細加工チャンネル内に、ＤＮＡ検出部（ＭＯＳＦＥＴ型トランジスタ）上に付着された核酸に影響を及ぼす温度を制御するためにヒーター及び温度センサーを内蔵させる。
【００９５】
ヒーターには、当業界に製造方法が知られた薄膜抵抗性ヒーターなどを使用できる。このヒーターは微細加工チャンネル内の底面、上面または内部に電源と連結された金属フィルムを塗布することによって製造できる。また、温度センサーには、温度依存性電動機力（Ｅｌｅｃｔｒｏｍｏｔｉｖｅ Ｆｏｒｃｅ、ＥＭＦ）を生成するバイメタル接合を有するサーモカップル、温度比例の電気抵抗を有する材料を含む抵抗性サーモメータ、サーミスター、ＩＣ温度センサー、石英サーモメータなどを使用できる。
【００９６】
＜実施例２＞ プローブＤＮＡの固定化の定量的測定
プローブＤＮＡの固定化を定量的に測定するために、図３に示されているチップを図１に示されているキット１０のチップ設置部４０に設置した後、電圧を印加した状態で、相異なる含量（２０μｌ、４０μｌ、８０μｌ及び１６０μｌ）の５’末端にチオール基が置換された合成プローブＤＮＡ（５’−チオール−ＧＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣ−３’）を注入した後、経時的な電流値の変化を測定した。
【００９７】
実験結果、図１６に示されたように、センサーに注入されたプローブＤＮＡの量が多くなるにつれてセンサーのドレーンとソースとの間を流れる電流値が比例的に増加することが分かる。すなわち、（Ａ）プローブＤＮＡの量が２０μｌである場合に電流値は１４ｕＡであり、（Ｂ）プローブＤＮＡの量が４０μｌである場合に電流値は１７ｕＡであり、（Ｃ）プローブＤＮＡの量が８０μｌである場合に電流値は２０ｕＡであった。（Ｄ）ただし、ＤＮＡの量が８０μｌ以上になればこれ以上電流値が増加しなかった。
【００９８】
したがって、センサーのゲート電極にかかる電流値を測定することによってＤＮＡチップに固定化されたプローブＤＮＡの量を定量的に検出できる。また、ＤＮＡチップに付着されたプローブＤＮＡの量を定量的に測定すればより正確な反応程度が分かり、ターゲットＤＮＡと反応する時にも反応程度を正確に測定できる基本データを確保できる。
【００９９】
＜実施例３＞ プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの混成化の定量的測定
プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの混成化を定量的に測定するために、図３に示されているラップオンアチップに電圧を印加した状態で、５’末端にチオール基が置換された合成プローブＤＮＡ（５’−チオール−ＧＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣ−３’）とこれと相補的なターゲットＤＮＡとを順次に注入しながら経時的な電流値の変化を測定した。
【０１００】
具体的に、図３に示されているチップを図１に示されているキット１０のチップ設置部４０に設置した後、チップに電圧を印加して流れる電流を測定した。次いで、キット１０の試料ローディング部２０にまず燐酸バッファ緩衝液を注入した。緩衝液の注入と同時にチップに流れる電流を持続的に測定した。その結果、図１７のＡ領域のように緩衝液の注入後に電流が増加した。約３０分間電流のフローを観察して電流が安定化した後、５’末端にチオール基が置換された１５ｂｐの合成ＤＮＡ（５’−チオール−ＧＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣ−３’）プローブを試料ローディング部２０に提供した。ＤＮＡプローブの提供後、図１７のＢ領域のように電流が減少した。これは金薄膜よりなるゲート電極（図３の１５０Ｇ）表面にプローブＤＮＡが自己組み立て単層法により結合されたことを示すことが分かる。すなわち、プローブＤＮＡの結合をインサイチュで確認することができた。引続き、電流の変化を観察して電流が十分に減少したと判断される時点、すなわち、約３時間経過後に試料ローディング部２０に脱イオン水を提供して未付着されたＤＮＡプローブ及び燐酸緩衝液を除去した。次いで、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの混成化に最適の環境を提供するために、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液を試料ローディング部２０に提供した後、約１時間電流のフローを観察した。引続き、図１７のＣ地点に該当する時点でプローブＤＮＡと相補的なターゲットＤＮＡを試料ローディング部２０に提供した後、電流を測定した。ターゲットＤＮＡの提供後、図１７に示されているようにチップに流れる電流が減少した。これにより、ターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡとが混成化されたことをインサイチュで確認できた。
【０１０１】
産業上の利用可能性
本発明による物質検出用チップは微細流路の側壁に形成されたＭＯＳＦＥＴで構成される。ＭＯＳＦＥＴが微細流路の側壁に形成されているために物質検出用チップの高集積化が容易である。本発明による物質検出用チップを利用し、自己組み立て単層法を使用する場合にプローブがゲート電極の表面に直接吸着されるためにインサイチュでプローブの結合を確認でき、プローブにターゲット分子が結合されているかどうかもインサイチュで検出できる。また、ＭＯＳＦＥＴを高集積化するために検出感度を高めうる長所がある。一方、自己組み立て単層法を使用するためにプローブの結合が堅くてかつ緻密なので安定した検出結果を得ることができ、自己組み立て単層法の再現性により多様なプローブを使用して多様なターゲット物質を検出できる。
【０１０２】
また、本発明によれば、バイオチップに内蔵されたＭＯＳＦＥＴ型センサーを利用してバイオチップ上に固定化されたプローブの量を定量的に測定できるだけでなく、プローブとターゲット試料との結合程度も定量的に測定できる。特に、ＤＮＡチップの場合、ＭＯＳＦＥＴ型センサーを利用してプローブＤＮＡの固定化及びターゲットＤＮＡとの混成化を同時に正確に検出できることによって、別の製作コストが要らず、商用化が可能なＤＮＡチップの製作が可能になる。
【０１０３】
また、本発明によれば、流体が流れる流路に直接ヒーター、温度センサー及びＤＮＡ検出センサーをビルトインで同時に製作することによって温度による核酸の変性現象をリアルタイムで判別でき、多種の核酸の突然変異、特に核酸のＳＮＰを効果的に検出できる。
【０１０４】
すなわち、従来に突然変異になったＤＮＡ塩基序列を調べるためには温度によるＤＮＡ二重線構造の分離及び観察のために相異なる装備及び機械を使用せねばならず、正確でかつ精密な温度制御によるＤＮＡの分離をリアルタイムで測定することが非常に難しかったが、本発明によれば、微細加工された流路に製作された温度制御装置及び検出装置が微細加工された流路にＤＮＡを注入するだけで正確でかつ精密な温度制御による突然変異ＤＮＡの検出をリアルタイムで行える。また、温度分布は微細領域でさらに正確に現れるためにもっと正確な特性を得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の一実施例による物質検出装置の斜視図である。
【図２】 本発明の一実施例による物質検出用チップの上面図である。
【図３】 図２に示された物質検出用チップ（ＭＯＳＦＥＴ型センサー）のうち一つの斜視図である。
【図４】 図２に示されたチップのＩ−Ｖ特性を示すグラフである。
【図５】 本発明の一実施例による物質検出用チップの製造工程を段階別に示す斜視図である。
【図６】 図５に続き、本発明の一実施例による物質検出用チップの製造工程を段階別に示す斜視図である。
【図７】 図６に続き、本発明の一実施例による物質検出用チップの製造工程を段階別に示す斜視図である。
【図８】 図７に続き、本発明の一実施例による物質検出用チップの製造工程を段階別に示す斜視図である。
【図９】 図８に続き、本発明の一実施例による物質検出用チップの製造工程を段階別に示す斜視図である。
【図１０】 物質検出用チップのゲート電極に物質プローブがどのように結合されるかを示す概略図である。
【図１１】 本発明の一実施例であって、スポッティングあるいは光石版印刷術方法で付着されたプローブＤＮＡの検出装置の概略図である。
【図１２】 本発明の一実施例であって、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの混成化検出装置の概略図である。
【図１３】 微細加工チャンネル内の底面に温度制御−検出部を含む本発明の核酸突然変異分析装置を概略的に示す図面である。
【図１４】 微細加工チャンネル内の側壁に核酸固定のＭＯＳＦＥＴ型トランジスタを備え、微細加工チャンネル内の上面にヒーター及び温度センサーを備える温度制御−検出部を含む本発明の核酸分析装置を概略的に示す図面である。
【図１５】 本発明のＭＯＳＦＥＴトランジスタの製作過程を示す図面である。
【図１６】 本発明によってバイオチップに固定されたプローブＤＮＡの量による電流フローの変化を測定したグラフである。
【図１７】 本発明によってプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの混成化による電流フロー変化を測定したグラフである。
Claims (18)
- 半導体基板と、
前記基板表面に形成され、物質試料の通路になる微細流路と、
前記微細流路の側壁に、前記微細流路の流路断面方向にくぼむように設けられた凹部の側壁と前記微細流路の側壁とから成る角部に形成されたＭＯＳＦＥＴとを含む物質検出装置用チップ。 - 前記ＭＯＳＦＥＴのゲート電極は金薄膜で形成されたことを特徴とする請求項１に記載の物質検出装置用チップ。
- 前記ゲート電極の表面にはチオール基が付着された物質プローブが自己組み立て単層法により付着されていることを特徴とする請求項２に記載の物質検出装置用チップ。
- 前記物質試料は核酸、蛋白質、酵素基質、補助因子、またはオリゴサッカリドであることを特徴とする請求項１に記載の物質検出装置用チップ。
- 前記核酸は単一線ＤＮＡ、単一線ＲＮＡ、または単一線ＰＮＡであることを特徴とする請求項４に記載の物質検出装置用チップ。
- 前記蛋白質は、細胞膜受容体に対する作用子、細胞膜受容体に対する拮抗子、トキシン、ウイルスエピトープ、ホルモン、ペプチド、酵素またはモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項４に記載の物質検出装置用チップ。
- 半導体基板表面に酸化膜を形成する段階と、
前記基板表面をエッチングして微細流路と当該微細流路の側壁に連なり前記微細流路の流路断面方向にくぼむ凹部とを形成する段階と、
前記微細流路の側壁及び前記凹部の側壁に不純物をドーピングして不純物領域を形成する段階と、
前記基板をエッチング液に処理して前記微細流路の側壁及び前記凹部の側壁に形成された不純物領域の一部を除去して前記微細流路の側壁と前記凹部の側壁から成る角部にＭＯＳＦＥＴのチャンネル領域を定義する段階と、
前記チャンネル領域上に酸化膜を形成する段階と、
前記チャンネル領域上に金よりなるゲート電極を形成する段階とを含むことを特徴とする物質検出用チップの製造方法。 - 前記チャンネル領域を定義する段階は、前記角部に沿って選択的に不純物領域が除去されることにより実行される段階であることを特徴とする請求項７に記載の物質検出用チップの製造方法。
- 前記チャンネル領域を定義する段階は、前記基板に逆バイアスを印加して電流の変化を感知してエッチング終了点を選択する段階であることを特徴とする請求項７に記載の物質検出用チップの製造方法。
- 基板と、
前記基板表面に形成された物質試料ローディング部と、
一端が前記物質試料ローディング部と連結されて前記物質試料の通路になる少なくとも一つ以上の微細流路と、
前記微細流路の他端に連結されて物質プローブが付着されるＭＯＳＦＥＴ型センサーとを含み、
前記ＭＯＳＦＥＴ型センサーは請求項１ないし請求項６のうちいずれか１項のチップよりなる物質検出用装置。 - 請求項１０の物質検出用装置の物質試料ローディング部に物質プローブを提供する段階と、
前記物質プローブを微細流路に沿って移してＭＯＳＦＥＴ型センサーのゲート電極上面に結合させる段階と、
前記ゲート電極にかかる電圧及び電流の特性を測定する段階とを含む物質プローブの固定化を定量的に検出する方法。 - （ａ）請求項１０の物質検出用装置の物質試料ローディング部に物質プローブを提供する段階と、
（ｂ）前記物質プローブを微細流路に沿って移してＭＯＳＦＥＴ型センサーのゲート電極上面に結合させる段階と、
（ｃ）前記ゲート電極にかかる電圧及び電流の特性を測定する段階と、
（ｄ）前記物質試料ローディング部にターゲット試料物質を提供する段階と、
（ｅ）前記ターゲット試料物質を微細流路に沿って移してＭＯＳＦＥＴ型センサーのゲート電極上面に結合された物質プローブに結合させる段階と、
（ｆ）前記ゲート電極にかかる電圧及び電流の特性を測定して前記（ｃ）段階で測定した電圧と電流の特性と比較する段階とを含む物質プローブとターゲット試料との結合程度を定量的に検出する方法。 - プローブ核酸とターゲット核酸との混成化程度を定量的に検出することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
- 基板と、
前記基板表面に形成されたサンプルローディング部と、
前記サンプルローディング部と直接連結され、サンプルの流入通路になる微細加工チャンネルと、
前記微細加工チャンネル内に一つ以上の核酸固定のＭＯＳＦＥＴ型センサー、ヒーター及び温度センサーが同時に装着された温度制御−検出部とを含み、
前記ＭＯＳＦＥＴ型センサーは請求項１ないし請求項６のうちいずれか１項のチップよりなる核酸突然変異分析装置。 - 前記ヒーター及び温度センサーは、前記ＭＯＳＦＥＴ型センサーと近接して位置してそのＭＯＳＦＥＴ型センサー上に付着された核酸に影響を及ぼす温度を制御し、前記ＭＯＳＦＥＴ型センサーは、その上に付着された核酸のＴｍ温度で変性された二重線核酸または復元された二重線核酸を検出することを特徴とする請求項１４に記載の核酸突然変異分析装置。
- ＭＯＳＦＥＴ型センサーの表面金属に単一線核酸プローブを固定化させる段階と、
固定化されたプローブと反応するターゲット核酸をサンプルローディング部に注入し、微細加工チャンネルの流路に沿ってＭＯＳＦＥＴ型センサーに移動させる段階と、
ターゲット核酸を前記ＭＯＳＦＥＴ型センサーの核酸プローブと混成化させる段階と、
二重線核酸を単一線に分離するために温度を段々上昇させる段階と、
ＭＯＳＦＥＴ型センサーのゲートにかかる電圧及び電流特性を測定する段階とを含み、
前記ＭＯＳＦＥＴ型センサーは請求項１ないし請求項６のうちいずれか１項のチップよりなることを特徴とする核酸の突然変異を分析する方法。 - ＭＯＳＦＥＴ型センサーの表面金属に単一線核酸プローブを固定化させる段階と、
固定化されたプローブと反応するターゲット核酸をサンプルローディング部に注入し、微細加工チャンネルの流路に沿ってＭＯＳＦＥＴ型センサーに移す段階と、
ターゲット核酸と核酸プローブとの混成化防止に効果的な温度に維持させる段階と、
単一線核酸を二重線にするために温度を徐々に下降させる段階と、
ＭＯＳＦＥＴ型センサーのゲートにかかる電圧及び電流特性を測定する段階とを含み、
前記ＭＯＳＦＥＴ型センサーは請求項１ないし請求項６のうちいずれか１項のチップよりなることを特徴とする核酸の突然変異を分析する方法。 - 核酸のＳＮＰを検出することを特徴とする請求項１６または請求項１７に記載の方法。
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