JP3896482B2

JP3896482B2 - Method for producing differentiated cells

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Publication number: JP3896482B2
Application number: JP2002293130A
Authority: JP
Inventors: 亨今村; 理鈴木
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2002-10-07
Filing date: 2002-10-07
Publication date: 2007-03-22
Anticipated expiration: 2022-10-07
Also published as: JP2004121159A; WO2004031373A1; AU2003272916A1

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血管内皮由来細胞から各種細胞への分化能力を有する細胞又は各種細胞に分化した細胞を作製する方法、及び該方法により作製された分化細胞に関する。また本発明は、血管内皮由来細胞を各種細胞への分化能力を有する細胞又は各種細胞に分化した細胞に分化させる方法、及びその分化を調節する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
組織補填等の再生医療や遺伝子治療など、先端的医療におけるヒト分化細胞の必要性は極めて高い。また、ヒトの生体分子生産に用いうる分化細胞の必要性も高い。しかし、このような必要性を満たす細胞を供給するには、原理的及び現実的な困難性がある。すなわち、必要とされる細胞が生存中の他人又は死亡直後の他人から供与される場合、あるいは、必要とされる細胞として他人の細胞から作出された胎生幹細胞を用いる場合には、倫理的な問題、細胞の数が不足する問題、免疫的に拒絶される問題などの複数の困難性が存在する。そのため、上述したような問題を解決し、必要なヒト分化細胞を作製する方法を開発することが、当技術分野において大きな課題となっている。
【０００３】
上述したような分化細胞を得る方法に関して、現在までにいくつかの報告がある。例えば、ウシ生体由来の血管内皮細胞が平滑筋細胞に分化することが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、この系においてはごく少量（約０．０１〜０．０３％）しか分化細胞を得ることはできず、実際的な使用には不十分である。
【０００４】
また、マウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）から、血管内皮細胞と平滑筋細胞に分化する能力を有する幹細胞が分離されている（非特許文献２）が、ＥＳ細胞をヒトの医療に応用するには制約が多く、現時点で現実的ではない。
【０００５】
さらに、ウシ大動脈由来血管内皮細胞が、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）ファミリー、特にＴＧＦ−β１の刺激によって平滑筋類似の細胞に分化したことが報告されている（非特許文献３）。しかし、この系においては平滑筋細胞のごく初期の分化段階の細胞のみが得られているにすぎない。従って、完全に分化した平滑筋細胞を得るには、まだ不十分なものであり、ヒトの再生医療には利用できないと考えられる。
従って、動物、特にヒトの分化細胞を、大量かつ簡便に作製する手法が望まれていた。
【０００６】
【非特許文献１】
Frid, M.G. et al.，Circulation Research（USA），2002年，第90巻，ｐ．1189-1196
【非特許文献２】
Yamashita, J. et al.，Nature（UK），2000年，第408巻，ｐ．92-96
【非特許文献３】
Arciniegas, E. et al.，Journal of cell science（UK），1992年，第103巻，ｐ．521-529
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、動物の分化細胞を大量かつ簡便に作製する手法、及び細胞の分化を調節する手法に関する。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、初代ヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞をあらかじめ増殖因子の１種であるＦＧＦとウシ胎児血清で刺激した状態で単層培養して増殖させ、次いでＦＧＦを除きウシ胎児血清のみで刺激した状態で培養を続けた結果、細胞の形態が著しく変化することに着目し、この細胞の形態変化と細胞分化との関連性について明らかにするため、各種細胞分化マーカーの発現を解析したところ、平滑筋細胞、骨芽細胞及び脂肪細胞に特異的に認められる遺伝子発現が上昇することを見出した。従って本発明者は、血管内皮由来細胞を増殖因子添加培地中で培養した後に、増殖因子不含培地中で培養することにより、各種細胞に分化可能な細胞を作製することができるという知見を得、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、分化細胞の作製方法であって、以下の工程：
（ａ）血管内皮由来細胞を増殖因子を含む培地中で培養する工程、及び
（ｂ）培養した細胞の培地から増殖因子を除き、又は上記の増殖因子活性を阻害した状態で、さらに細胞を培養する工程、
を含み、他の種の細胞への分化能力を有する細胞及び／又は他の種の細胞に分化した細胞を得ることを特徴とする、上記作製方法である。
【００１０】
上記作製方法において、血管内皮由来細胞としては、臍帯静脈血管内皮由来細胞を用いることが好ましい。また血管内皮由来細胞は、哺乳動物、特にヒトから採取されたものであることが好ましい。
【００１１】
また上記作製方法において、増殖因子は繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーに属する因子とすることができる。この繊維芽細胞増殖因子としては、酸性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１）が挙げられるが、それに限定されるものではない。
さらに上記作製方法において、他の種の細胞としては、平滑筋細胞、骨芽細胞及び脂肪細胞が挙げられる。
【００１２】
また本発明は、上記作製方法により得られる分化細胞である。
本発明はまた、上記作製方法に従って培養した細胞を、さらに増殖因子添加培地中で培養し、血管内皮細胞に再分化させることを特徴とする、血管内皮細胞の作製方法である。
【００１３】
さらに本発明は、血管内皮由来細胞を分化させる方法であって、以下の工程：
（ａ）血管内皮由来細胞を増殖因子を含む培地中で培養する工程、及び
（ｂ）培養した細胞の培地から増殖因子を除き、または上記の増殖因子活性を阻害した状態で、さらに細胞を培養する工程、
を含み、他の種の細胞への分化能力を有する細胞及び／又は他の種の細胞に分化した細胞を得ることを特徴とする、上記分化方法である。
【００１４】
上記分化方法において、増殖因子が繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーに属する因子とすることができる。この繊維芽細胞増殖因子としては酸性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１）が挙げられる。
上記分化方法において、他の種の細胞としては、平滑筋細胞、骨芽細胞及び脂肪細胞が挙げられるが、それに限定されるものではない。
【００１５】
また上記分化方法の工程（ｂ）において、増殖因子不含培地に別の因子を添加することにより、細胞の分化を増強させる又は抑制することができる。ここで例えば別の因子としてトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）ファミリーに属する因子又はＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害物質を用いた場合には、細胞の分化が増強される。トランスフォーミング増殖因子βとしてはアクチビンＡが挙げられる。またＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害物質としてはＰＤ９８０５９が挙げられる。さらに例えば別の因子としてトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）阻害物質を用いた場合には、細胞の分化が抑制される。トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）阻害物質としてはアクチビン結合タンパク質及びｓｍａｄ７タンパク質が挙げられる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、分化細胞の作製方法及び血管内皮由来細胞を分化させる方法に係るものであり、血管内皮由来細胞を増殖因子を含む培地中で培養し、その後、培養した細胞を増殖因子を含まない培地中で培養することにより、又は増殖因子活性を阻害した状態でさらに培養することにより、分化細胞（すなわち、他の種の細胞への分化能力を有する細胞及び／又は他の種の細胞に分化した細胞）を得ることを特徴とするものである。
【００１７】
１．血管内皮由来細胞の調製
本発明においては血管内皮由来細胞を培養し、分化細胞を得る。本発明において「血管内皮由来細胞」とは、血管の内壁を酵素処理又は物理的処理することにより剥離する細胞を指し、例えば、静脈内皮由来細胞（臍帯静脈内皮由来細胞等）などが挙げられる。
【００１８】
上述した細胞の供与源は、動物であれば特に限定されるものではなく、例えば哺乳動物、特にヒトが好ましい。上述した細胞の調製方法は、当技術分野で周知の細胞単離法に従えばよく、特に限定されるものではない。
【００１９】
例えば臍帯静脈内皮由来細胞は、出生時に入手可能となる臍帯の静脈内皮をトリプシン液処理することにより、液内に剥がれ落ちる細胞の集団中に含まれるものとして採取することができる。
【００２０】
２．細胞培養
上記「１．血管内皮由来細胞の調製」に記載のように得られた細胞は、最初に増殖因子存在下にて培養する。ここで増殖因子存在下とは、物質的に解明された増殖因子を培養液に添加すること、及び増殖因子活性を有する血清などを添加することを指す。本発明において「増殖因子」とは、細胞・組織・臓器・個体などの数・重量・体積などを増加させる作用を有するタンパク質を指し、限定するものではないが、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）（例えばＴＧＦ−β等）などが挙げられる。本発明においては、増殖因子としてＦＧＦを用いることが好ましく、このＦＧＦとしては、例えば酸性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１又はａＦＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２又はｂＦＧＦ）、角質細胞増殖因子（ＦＧＦ−７又はＫＧＦ）などが知られている。特にＦＧＦ−１又はＦＧＦ−２を用いることが好ましい。
【００２１】
細胞培養に使用する培地としては、血管内皮由来細胞を培養するために一般的に使用されている培地であれば特に限定されるものではなく、例えば、Ｍ１９９培地（Ｓｉｇｍａ製）、ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ製）、ＭＣＤＢ培地（Ｓｉｇｍａ製）、ＭＣＤＢ１５１培地（Ｓｉｇｍａ製）などが挙げられる。
【００２２】
培地に添加する増殖因子濃度は、使用する増殖因子により異なり、当業者であれば適宜設定することが可能である。例えばＦＧＦを用いる場合には、ＦＧＦ濃度は、約１０〜３ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約５ｎｇ／ｍｌとする。
【００２３】
培地には、血管内皮由来細胞を培養するために適切なその他の成分を添加してもよい。例えば、ウシ胎児血清、ヘパリン、カナマイシン（抗生物質）などを添加することが当技術分野で公知である。
【００２４】
培養条件は、血管内皮由来細胞を培養するための当業者に公知の条件を採用することができ、例えば、約３７℃にて、約１０〜４０日間、好ましくは１４〜３５日間にわたり細胞を培養する。
【００２５】
好ましい実施形態においては、血管内皮由来細胞を、ＦＧＦ−１（５ｎｇ／ｍｌ）及びヘパリン（１０μｇ／ｍｌ）又はＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍｌ）を含むウシ胎児血清（１５％）添加Ｍ１９９培地で、３７℃にて細胞密度がsubconfluentの状態になるまで単層培養する。増殖因子存在下にて、血管内皮由来細胞は血管内皮細胞の性質を有したまま増殖をくり返す。
【００２６】
続いて、上述のように増殖因子含有培地中で培養した細胞を、増殖因子を除去した培地中又は増殖因子活性を阻害した状態で培養する。増殖因子活性の阻害は、増殖因子とその受容体との結合阻害剤、増殖因子又はその受容体に結合する中和抗体、増殖因子の特異的吸収剤、増殖因子の細胞内シグナル伝達の阻害剤などを用いて行うことができるが、これ以外の方法によってもよい。このような増殖因子活性の阻害は当業者に周知であり、上述した結合阻害剤、中和抗体、特異的吸収剤及び細胞内シグナル伝達阻害剤なども当業者であれば適宜選択することができる。培養期間は、約４日〜３週間、好ましくは２〜３週間である。またその他の培養条件は、上記培養条件と同様である。
【００２７】
本発明者は、上述したように培養した血管内皮由来細胞は、増殖因子を除去した培地中又は増殖因子活性を阻害した状態で長期間培養した後、平滑筋細胞、骨芽細胞及び脂肪細胞に特異的なマーカー遺伝子を発現する細胞に変化することを確認した（実施例２〜４、８及び９参照）。従って本発明により、血管内皮由来細胞を分化させて、他の種の細胞への分化能力を有する細胞及び／又は他の種の細胞に分化した細胞を得ることができる。
【００２８】
３．分化細胞
以上のように、本発明の培養技術により、血管内皮由来細胞を分化させて分化細胞を作製することができる。本発明において「分化細胞」とは、他の種の細胞への分化能力を有する細胞、及び他の種の細胞に分化した細胞を指す。ここで「他の種の細胞」とは、血管内皮細胞以外の細胞を指し、限定するものではないが、平滑筋細胞、骨芽細胞及び脂肪細胞などが挙げられる。また「他の種の細胞への分化能力を有する細胞」とは、作製した細胞が、他の種の細胞としての性質・機能を有しているが、なおも分化前の血管内皮由来細胞の性質・機能を有しているものを指す。一方「他の種の細胞に分化した細胞」とは、作製した細胞が、他の種の細胞としての性質・機能のみを有し、分化前の血管内皮由来細胞の性質・機能は保持していないものを指す。
【００２９】
本発明に従ってＦＧＦ不含培地において３週間培養した細胞は、エンドセリン−１（ＥＴ−１）の刺激により収縮することから、平滑筋細胞としての機能を有していると考えられた（実施例６参照）。またこの細胞は、平滑筋細胞マーカー及び血管内皮細胞マーカーの両者を示すことから（実施例２及び３参照）、これらの細胞は、平滑筋細胞への分化能力を有する細胞といえる。
【００３０】
血管内皮由来細胞（例えばヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞）を、増殖因子（好ましくはＦＧＦ）添加培地中で培養した場合、その増殖能が非常に高いことから、本発明に従って、他の種の細胞への分化能力を有する細胞及び他の種の細胞に分化した細胞を簡便かつ大量に作製することが可能となる。従って、その分化細胞を用いることにより、再生医療などにおいて有用な細胞を大量に得ることができる。また本発明において最も好ましい血管内皮由来細胞である臍帯静脈血管内皮由来細胞は、液体窒素中に長期保存可能であることから、出生時に臍帯静脈血管内皮由来細胞を採取しておけば、将来的に何らかの病的原因により各種細胞（例えば平滑筋細胞、骨芽細胞及び脂肪細胞）の再生が必要になった際に保存細胞を取り出して、増殖及び分化させて使用することができる。その結果、自己から取り出した細胞を分化させた後に体内に戻すことができるため、免疫学的な問題が少ないことが期待される。
【００３１】
４．分化の調節
（１）血管内皮細胞への再分化
本発明により分化した細胞を、再度増殖因子添加培地中で培養することにより、血管内皮細胞に再分化させることができる。この際、用いる増殖因子は、ＦＧＦ−１又はＦＧＦ−２を用いることができるが、それ以外の増殖因子であっても、血管内皮細胞への再分化を誘導可能な活性を有するものであれば用いることができる。
【００３２】
このように一度他の種の細胞に分化した細胞を血管内皮細胞に再分化させることにより達成される効果・利点としては以下のものがある：
・再生医療などの目的のために最初に十分な量として準備した分化細胞よりも実際には多くの分化細胞が必要であると判断された場合には、分化細胞を上記再分化操作により血管内皮細胞に戻してから必要な量が得られるまで培養・増殖させ、その後、再度分化細胞に誘導して用いることが可能である。この場合、分化細胞を増殖させるよりも、血管内皮細胞を増殖させたほうが増殖率がよく、また培養も簡便である。
・動脈硬化などの生体の疾病として、血管内皮細胞が平滑筋細胞などの他の種の細胞に分化して不利益な性質を有することになる可能性が考えられるが、本発明に従って他の種の細胞の性質を有する細胞を血管内皮細胞に再分化させることができれば、疾病の治療（改善）に役立つものと期待される。
【００３３】
（２）分化の増強及び抑制
本発明に従って増殖因子不含培地中で培養する工程において、他の種々の因子を添加することにより、細胞の分化を増強又は抑制することが可能である。
【００３４】
例えば、他の因子としてトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）に属する因子又はＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害物質を使用した場合には、血管内皮由来細胞から他の種の細胞を誘導可能な細胞への分化を増強することができる。ＴＧＦ−βファミリーに属する因子としては、限定するものではないが、アクチビン、骨形成因子（ＢＭＰ）などが挙げられる。本発明においては、アクチビン、特にアクチビンＡを用いることが好ましい。
ＭＥＫ阻害物質としては、限定するものではないが、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２６などが挙げられる。
【００３５】
また例えば、他の因子としてＴＧＦ−β阻害物質を使用した場合には、分化を抑制することができる。ＴＧＦ−β阻害物質としては、その阻害作用機構に限定されることはなく、例えばアクチビン結合タンパク質、Ｓｍａｄ７タンパク質、アクチビン中和抗体などが挙げられる。本発明においては、アクチビン結合タンパク質として特にフォリスタチン、及びＳｍａｄ７タンパク質を用いることが好ましい。
【００３６】
上述したように、他の種の細胞への分化を調節することにより達成される効果・利点としては以下のものがある：
・再生医療などの目的で、分化した細胞の性質と分化前の細胞の性質の両者を有するような中等度の分化細胞が必要であると判断されるような場合には、本発明に従って分化を調節する技術が有効であると考えられる。
・動脈硬化などの生体の疾病として、血管内皮細胞が平滑筋細胞などの他の種の細胞に分化して不利益な性質を有することになる可能性が考えられるが、本発明に従って他の種の細胞への分化を調節することができれば、疾病の予防・治療（改善）に役立つものと期待される。
【００３７】
【実施例】
本発明を以下の実施例により具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
【００３８】
〔実施例１〕ヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞の培養
ヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞（ＨＵＶＥ−ＤＣ）は、既に報告されているＨＵＶＥＣ単離手法により単離した（Imamura, T., and Mitsui, Y. (1987) Exp. Cell Res. 172, 92-100）。すなわち、ヒト臍帯静脈血管内壁を洗浄後、０．２５％トリプシン含有リン酸緩衝溶液を注入し、室温にて１５分静置することにより内皮細胞を細胞壁より剥離させ回収した。
【００３９】
上記の通り単離した細胞をＩ型コラーゲンで被覆したプラスチック製培養ディッシュ中に接種し、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｆｉｌｔｒｏｎ）を添加し、５ｎｇ／ｍｌＦＧＦ−１及び１０μｇ／ｍｌヘパリン（Ｓｉｇｍａ）を添加した又は添加しないＭ１９９培地（Ｓｉｇｍａ）中で培養した。
全実施例における細胞分化実験では、いずれも一度ＦＧＦ添加培地で細胞を培養し、subconfluentの状態まで増殖させた後にＦＧＦ無添加培地にて培養した。
【００４０】
ここで使用したＦＧＦ−１は遺伝子組換え手法により作製したものであり、この組換えＦＧＦ−１は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞においてｐＥＴ−３ｃ系（Imamura, T. et al., (1990) Science 249, 1567-1570）を利用して発現させた。また得られたＦＧＦ−１は、ヘパリン−セファロースアフィニティークロマトグラフィーにより均質に精製することにより調製した（Imamura, T. et al. (1990) Science 249, 1567-1570）。ヘパリン（Ｓｉｇｍａ製）の添加は、ＦＧＦ−１活性の最適化のために行い、細胞の分化に影響はなかった。得られた細胞を以下の試験において使用した。
【００４１】
〔実施例２〕免疫細胞化学試験
本実施例においては、実施例１において培養した細胞を用いて免疫細胞化学試験を行った。
実施例１において培養した細胞を、血管内皮細胞マーカーであるフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）に対するポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ製）、及び平滑筋細胞マーカーであるカルポニンに対するモノクローナル抗体（クローンｈＣＰ）（Ｓｉｇｍａ製）を一次抗体として用いて二重標識し、その後、それぞれテキサスレッドコンジュゲートロバ抗ウサギＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）及びＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）を用いて二次標識した。続いて、共焦点レーザー走査顕微鏡（Carl Zeiss, Jena, Germany）を用いてシグナルを検出した。
【００４２】
結果を図１ａ及びｂに示す。図１ａは、ＦＧＦ添加（＋）およびＦＧＦ除去後３週目（−）のヒト臍帯静脈内皮由来細胞の顕微鏡像を示す。ＦＧＦ除去後３週目には平らで大きな細胞が出現していることがわかる。また図１ｂは、ＦＧＦ添加（＋）およびＦＧＦ除去後３週目（−）のヒト臍帯静脈内皮由来細胞を、それぞれ血管内皮細胞マーカーである抗ｖＷＦ抗体（赤）、及び平滑筋細胞マーカーである抗塩基性カルポニン抗体（緑）で同時染色した像を示す。ＦＧＦ除去後３週目において、両者の平滑筋細胞マーカーを発現している細胞が確認できた。
【００４３】
〔実施例３〕平滑筋細胞マーカー及び血管内皮細胞マーカーの発現確認（ＲＴ−ＰＣＲ／サザンブロット分析）
本実施例においては、実施例１において培養した細胞を用いて、平滑筋細胞マーカーの発現を、ＲＴ−ＰＣＲ／サザンブロット法を利用して調べた。
【００４４】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ／サザンブロット分析を、既に記載されている通りに行った（Ozawa, K. et al. (1997) Brain Res. Protocol 1, 211-216）。簡単に説明すると、細胞からＩｓｏｇｅｎ（Nippon Gene）を用いて総ＲＮＡを単離した後、１μｇのサンプルを、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（GIBCO BRL）を製造業者の説明書に従って用いて逆転写した。４％の逆転写混合物を用いて、試験遺伝子のｃＤＮＡ断片を、その直線状部分をAmpliTaq Gold（PE Applied Biosynthesis）を用いてＰＣＲにより増幅した。使用した平滑筋細胞マーカー及び血管内皮細胞マーカーに特異的なプライマーを表１に示す。表中、血管内皮細胞マーカーである「ｖＷＦ」はフォンウィルブランド因子、「ＰＥＣＡＭ−１」は血小板／血管内皮細胞固着分子を表し、平滑筋細胞マーカーである「ＳＭ２２α」はアクチン結合タンパク質、「ＰＧＥＳ」はプロスタグランジンＥ合成酵素、「カルポニン」はアクチン結合タンパク質を表す。「ＧＡＰＤＨ」は、内部標準として用いた。また、プライマー配列の項目の「Ｆ」及び「Ｒ」はそれぞれフォワードプライマー及びリバースプライマーを表す。サイクルの項目に記載の数値は、当該プライマーセットを用いて行うＰＣＲサイクル数を表し、また断片の項目に記載の数値は、ＰＣＲにより得られる断片長を表す。
【００４５】
【表１】

【００４６】
続いて、ＰＣＲ産物のアリコートを１．０％アガロースゲル上で分離させ、それをＨｙｂｏｎｄＮ＋膜（Amersham-Pharmacia）にトランスファーした。続いてこの膜を、ジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰ（DIG-High Prime, Roche）により標識した対応するｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ＮＩＨＩｍａｇｅソフトウエア（version 1.62）を用いてシグナルを可視化、統合、及び定量した。
【００４７】
結果を図２ａ〜ｄに示す。図２ａ及びｂは、各平滑筋細胞マーカー（ａ）及び各血管内皮細胞マーカー（ｂ）の発現を示す。またこの結果をグラフ化したものがそれぞれ図２ｃ及びｄである。図２ａ及びｃより、ＦＧＦ除去後１〜２週経過後の細胞においては、平滑筋細胞マーカーの発現が経時的に上昇していることがわかる。
【００４８】
〔実施例４〕ヒト臍帯静脈内皮由来細胞の細胞クローンを用いた試験
本実施例においては、ヒト臍帯静脈内皮由来細胞の細胞クローンを培養し、平滑筋細胞に分化する能力について試験した。
【００４９】
ヒト臍帯静脈内皮由来細胞の細胞クローンＣＬ１及びＣＬ１４は、実施例１と同様にＦＧＦ添加培地で培養した後、ＦＧＦ無添加培地で２週間培養した。その後、実施例２と同様に血管内皮細胞マーカーに対する抗体と平滑筋細胞マーカーに対する抗体とを用いて同時染色した。また、実施例３と同様に平滑筋細胞マーカーであるカルポニン遺伝子の発現を調べた。
【００５０】
その結果を図３ａ〜ｃに示す。図３ａは、血管内皮細胞マーカーに対する抗体と平滑筋細胞マーカーに対する抗体とを用いた染色結果であり、この写真から、ＣＬ１４細胞においては平滑筋細胞マーカーのみが確認された。また図３ｂ及びｃは、カルポニン遺伝子の発現を経時的に調べた結果を示し、ＣＬ１細胞及びＣＬ１４細胞の両者においてカルポニンの有意な発現増大が確認されたが、細胞クローンごとに、平滑筋細胞分化能力に差があることが判明した。
【００５１】
〔実施例５〕内皮細胞への再分化
本実施例においては、実施例２及び３において確認した、分化した平滑筋細胞から再度内皮細胞を分化させることを確認した。
【００５２】
実施例１と同様の条件下にて、ヒト臍帯静脈内皮由来細胞をＦＧＦ無添加培地で４日間培養した後、さらにＦＧＦ添加培地又はＦＧＦ無添加培地において４日間培養した。その後、実施例３と同様の手法にて細胞からｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ／サザンブロット法で平滑筋細胞特異的マーカー遺伝子（カルポニン及びＳＭ２２α）の発現を調べた。
【００５３】
結果を図４に示す。図４において、各平滑筋細胞のマーカーの発現は、ＦＧＦ除去後（−）に経時的（４日、８日）に増加したが、ＦＧＦ除去後４日目にＦＧＦを再度添加しさらに４日間培養したもの（＋）については、各マーカー遺伝子の発現はＦＧＦ除去前のレベル近くにまで減少していた。すなわち、ＦＧＦ除去により平滑筋細胞に分化した細胞が、再度ＦＧＦを添加することによって、再び内皮細胞に分化したことがわかった。
【００５４】
〔実施例６〕平滑筋細胞の収縮
本実施例においては、ＦＧＦ除去培養したヒト臍帯静脈内皮由来細胞の収縮能を試験した。
【００５５】
最初に、ＦＧＦ−１＋ヘパリンの存在下又は不在下にて、Ｉ型コラーゲンで被覆したプラスチック製培養ディッシュ上でヒト臍帯静脈内皮由来細胞を３週間培養した後、その細胞を１０ｍＭ８−ブロモ−ｃＧＭＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ製）と共に３７℃にて２０分間インキュベートして弛緩させ、２４ウエルプレート上でコラーゲンゲル中に包理した。この際、ゲル中の８−ブロモ−ｃＧＭＰの最終濃度は１ｍＭであった（０．７５ｍｌゲル／ウエル中、２．４×１０⁵細胞）。
【００５６】
コラーゲンゲルは、Cellmatrix type I-P（０．３％ブタＩ型コラーゲン；Nitta-gelatin Corp., Osaka, Japan）を製造業者の指示に従って用いて調製した。簡単に説明すると、１０×Ｍ１９９培地、１×Ｍ１９９培地中の細胞懸濁液、重炭酸バッファー、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、及びCellmatrix type I-P溶液を、１：１：１：１．５：５．５の比率で混合し、ウエルに注入して、重合させた。得られるＳＭＣ封入ゲルを、０．５ｍｌの１５％ＦＢＳ含有Ｍ１９９で被覆した。ゲルがウエルの底から分離する１７時間の時点までゲルをインキュベートした後、エンドセリン（ＥＴ−１；ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ製）（２５０ｎＭ）を３０分毎に培養物に添加した。定量に関しては、各ゲル片を５００μｌの培養液を含む１．５ｍｌマイクロチューブに移し、遠心し、その体積を測定した。
【００５７】
その計測結果を図５に示す。図５は、ＦＧＦ添加（Ｆ）又は無添加（Ｄ）で培養した細胞のＥＴ−１刺激による収縮率をグラフとして示している。ＦＧＦ除去後３週目のヒト臍帯静脈内皮由来細胞は、ＥＴ−１刺激により、約２０％のゲル収縮を引き起こしている。図中、星印はスチューデントのＴ試験にてｐ値＜０．０５で有意差があることを示す。この結果から、ＦＧＦ除去後３週目のヒト臍帯静脈内皮由来細胞の中には、平滑筋細胞の特徴を有する細胞が含まれていることがわかる。
【００５８】
〔実施例７〕分化の調節
本実施例においては、ヒト臍帯静脈内皮由来細胞の平滑筋細胞への分化の調節について試験した。
【００５９】
（１）ＴＧＦ−βファミリーによる分化増強
ヒト臍帯静脈内皮由来細胞を実施例１と同様にＦＧＦ添加又は無添加で７日間培養した。またこれらの細胞に対し、ＴＧＦ−βファミリーに属する増殖因子の１種であるアクチビンＡ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．製）１００μｇ／ｍｌを投与し、その作用を調べた。実施例３と同様に、平滑筋細胞マーカー遺伝子（カルポニン、ＳＭ２２α）及び血管内皮細胞マーカー遺伝子（ｖＷＦ）の発現をＲＴ−ＰＣＲ／サザンブロット法により調べた。また実施例２と同様に、ＦＧＦ除去後のヒト臍帯静脈内皮由来細胞を抗ｖＷＦ抗体及び抗カルポニン抗体で同時染色した。
【００６０】
結果を図６ａ及びｂに示す。図６ａは、ＦＧＦ添加（＋）又はＦＧＦ無添加（−）、及びアクチビンＡ添加（＋）又は無添加（−）で７日間培養した後の各マーカー遺伝子の発現を示している。図６ｂは、抗ｖＷＦ抗体及び抗カルポニン抗体で同時染色した細胞の写真を示す。これらの結果から、アクチビンＡが、ヒト臍帯静脈内皮由来細胞のＦＧＦ除去後の平滑筋細胞への分化を増強することがわかる。
【００６１】
（２）アクチビン結合タンパク質による分化抑制
ヒト臍帯静脈内皮由来細胞を実施例１と同様にＦＧＦ添加又は無添加で５日間培養した。またこれらの細胞に対し、アクチビンＡの阻害剤であるアクチビン結合タンパク質の１種であるフォリスタチン（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．製）１μｇ／ｍｌを投与し、その作用を調べた。実施例３と同様に、平滑筋細胞マーカー遺伝子（カルポニン、ＳＭ２２α）、血管内皮細胞マーカー遺伝子（ｖＷＦ）、及び内部標準（ＧＡＰＤＨ）の発現をＲＴ−ＰＣＲ／サザンブロット法により調べた。
【００６２】
結果を図７に示す。図７は、ＦＧＦ添加（＋）又はＦＧＦ無添加（−）、及びフォリスタチン添加（＋）又は無添加（−）で５日間培養した後の各マーカー遺伝子の発現を示している。これらの結果から、フォリスタチンが、ヒト臍帯静脈内皮由来細胞のＦＧＦ除去後の平滑筋細胞への分化を抑制することがわかる。
【００６３】
（３）ＴＧＦ−βファミリー阻害物質による分化抑制
ヒト臍帯静脈内皮由来細胞に、アデノウイルスベクターを用いて、ＴＧＦ−βファミリーの細胞内情報伝達経路の阻害物質であるｓｍａｄ７を強制発現させた。具体的に説明すると、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下にてＦＬＡＧ−エピトープ（Nakao, A. et al. (1997) Nature 389, 631-635）とライゲートしたマウスＳｍａｄ７ｃＤＮＡを有する組換えＥ１欠失アデノウイルスベクター（ＡｄＣＭＶ−Ｓｍａｄ７）を作製し、既に記載されている手法（Fujii, M. et al. (1999) Mol. Biol. Cell 10, 3801-3813；Nakao, A. et al. (1999) J. Clin. Invest. 104, 5-11.）に従って精製した。すなわち、２９３細胞に上記ベクターを導入後、その培養上清中に発現される組換えＳｍａｄ７タンパク質を精製し利用した。
【００６４】
上述のように作製したＳｍａｄ７発現細胞及び非発現細胞を、実施例１と同様にＦＧＦ除去培地中で７日間培養した後、実施例２と同様に血管内皮細胞マーカー（ｖＷＦ）及び平滑筋細胞マーカー（カルポニン）で同時染色した。
【００６５】
結果を図８に示す。図８は、Ｓｍａｄ７発現細胞（１及び３）と、Ｓｍａｄ７非発現細胞（２及び４）の写真を示す。これらの結果から、Ｓｍａｄ７が、ヒト臍帯静脈内皮由来細胞のＦＧＦ除去後の平滑筋細胞への分化を抑制することがわかる。
【００６６】
（４）ＭＥＫ依存的分化及び分化抑制の解除
ヒト臍帯静脈内皮由来細胞をＦＧＦ無添加培地中で４日間培養した後、さらにＦＧＦ添加又は無添加で４日間培養した。またこれらの細胞に対し、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤の１種であるＰＤ９８０５９（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）５０μｇ／ｍｌを投与し、その作用を調べた。実施例３と同様に、平滑筋細胞マーカー遺伝子（カルポニン、ＳＭ２２α）及び内部標準（ＧＡＰＤＨ）の発現をＲＴ−ＰＣＲ／サザンブロット法により調べた。
【００６７】
結果を図９に示す。図９は、ＦＧＦ無添加で４日間培養（４）したもの、及びＦＧＦ添加（８＋）又はＦＧＦ無添加（８−）でさらに４日間培養したもの、並びにＰＤ９８０５９添加で培養した後（右端のレーン）の各マーカー遺伝子の発現を示している。各平滑筋細胞マーカーの発現は、ＦＧＦ除去後に経時的（４日、８日）に増加したが、ＦＧＦ除去後４日目にＦＧＦを再度添加し、さらに４日間培養したもの（８（＋））については、各平滑筋細胞マーカーの発現はＦＧＦ除去前のレベル近くまで減少していた。このＦＧＦ再添加による各平滑筋細胞マーカーの発現減少は、ＰＤ９８０５９の投与によって阻害された（右端のレーン）。これらの結果から、ＦＧＦによる平滑筋細胞への分化抑制作用は、ＭＥＫ依存的に起こることがわかり、ＭＥＫ阻害剤の投与によって、平滑筋細胞への分化抑制が解除され、分化が増強されることがわかる。
【００６８】
〔実施例８〕骨芽細胞への分化
本実施例においては、ヒト臍帯静脈内皮由来細胞から骨芽細胞への分化を確認した。
【００６９】
ヒト臍帯静脈内皮由来細胞は、実施例１と同様にＦＧＦ添加培地で培養した後、ＦＧＦ無添加培地で３週間培養した。その後、血管内皮細胞マーカーであるウサギポリクローナル抗ｖＷＦ抗体（Ｄａｋｏ製）、及び骨芽細胞マーカーであるヤギポリクローナル抗アルカリホスファターゼ抗体（ＣｏｒｔｅｘＢｉｏｃｈｅｍ，Ｉｎｃ．）を一次抗体として用いて二重標識し、その後、それぞれテキサスレッドコンジュゲートロバ抗ウサギＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）及びＦＩＴＣコンジュゲートロバ抗ヤギＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて二次標識した。続いて、共焦点レーザー走査顕微鏡（Carl Zeiss, Jena, Germany）を用いてシグナルを検出した。
【００７０】
その結果を図１０に示す。図１０は、ＦＧＦ添加（＋）及びＦＧＦ除去後３週目（−）のヒト臍帯静脈内皮由来細胞を、抗ｖＷＦ抗体と抗アルカリホスファターゼ抗体とを用いて染色した結果を示す。この写真から、ＦＧＦ除去後３週目に骨芽細胞のマーカーを発現する細胞が確認できた。従って、ヒト臍帯静脈内皮由来細胞から、骨芽細胞を誘導する分化細胞が得られることがわかった。
【００７１】
〔実施例９〕脂肪細胞への分化
本実施例においては、ヒト臍帯静脈内皮由来細胞から脂肪細胞への分化を確認した。
【００７２】
ヒト臍帯静脈内皮由来細胞は、実施例１と同様にＦＧＦ添加培地で培養した後、ＦＧＦ無添加培地で０〜３週間培養した。その後、実施例３と同様に、脂肪細胞特異的マーカー遺伝子（リポプロテインリパーゼ）の発現をＲＴ−ＰＣＲ／サザンブロット法により調べた。リポプロテインリパーゼ遺伝子増幅用のプライマーセットを以下に示す：
F: GAGATTTCTCTGTATGGCACC（配列番号１３）
R: CTGCAAATGAGACACTTTCTC（配列番号１４）
上記プライマーセットを用いてＰＣＲを３６サイクル行った場合には、得られる断片は２７６ｂｐとなる。その後の操作は、実施例３と同様に行った。
【００７３】
その結果を図１１に示す。図１１は、ＦＧＦ除去後０〜３週目のヒト臍帯静脈内皮由来細胞におけるリポプロテインリパーゼの発現を示す。この結果から、ヒト臍帯静脈内皮由来細胞は、ＦＧＦ除去後に経時的に脂肪細胞を誘導する分化細胞に分化することがわかった。
【００７４】
【発明の効果】
本発明により、他の種の細胞への分化能力を有する細胞及び他の種の細胞に分化した細胞を大量に作製することが可能となる。従って、そのような分化細胞を作製することにより、再生医療などにおいて有用な細胞を大量かつ簡便に得ることができる。また本発明において最も好ましい血管内皮由来細胞である臍帯静脈血管内皮由来細胞は、液体窒素中に長期保存可能であることから、出生時に臍帯静脈血管内皮由来細胞を採取しておけば、将来的に何らかの病的原因により各種細胞（例えば平滑筋細胞、骨芽細胞及び脂肪細胞）の再生が必要になった際に保存細胞を取り出して、増殖及び分化させて使用することができる。従って、本発明を利用することにより、自己から取り出した細胞を分化させた後に体内に戻すことができるため、再生医療において重要な免疫学的問題が少ないことが期待される。
【００７５】
【配列表】

【００７６】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１〜１４：合成オリゴヌクレオチド
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＦＧＦ除去前と除去後におけるヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞の形態を示す。ａ：ＦＧＦ添加（＋）及びＦＧＦ除去後３週目（−）の細胞の位相差顕微鏡像を示す。ｂ：ａの細胞を抗ｖＷＦ抗体（赤）及び抗塩基性カルポニン抗体（緑）で同時染色した像を示す。
【図２】図２は、ＦＧＦ除去前と除去後のヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞における平滑筋細胞特異的マーカー（ａ及びｃ）並びに血管内皮細胞マーカー(ｂ及びｄ)の発現を経時的に示す。
【図３】図３は、クローン化されたヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞の各集団におけるＦＧＦ除去後２週目における細胞を抗ｖＷＦ抗体（赤）及び抗塩基性カルポニン抗体（緑）で同時染色した像（ａ）、並びに血管内皮細胞マーカー及び平滑筋細胞マーカーの発現（ｂ及びｃ）を経時的に示す。
【図４】図４は、ＦＧＦ除去後の平滑筋細胞特異的マーカーの発現が、ＦＧＦの再投与によって抑制される様子を示す。
【図５】図５は、分化後のヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞がエンドセリン−１の投与により、平滑筋細胞として収縮する様子を示す。
【図６】図６は、ＴＧＦ−βファミリーに属するアクチビンＡが、ヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞の平滑筋細胞分化に与える影響を示す。
ａ：ＦＧＦ添加（＋）又は無添加（−）、及びアクチビンＡ添加（＋）又は無添加（−）で培養した細胞における各平滑筋細胞マーカー遺伝子及び各血管内皮細胞マーカー遺伝子の発現を示す。
ｂ：ａの細胞を抗ｖＷＦ抗体及び抗カルポニン抗体で同時染色した像を示す。
【図７】図７は、アクチビンＡの阻害物質であるフォリスタチンがヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞の平滑筋細胞分化に与える影響を示す。
【図８】図８は、アクチビンＡの阻害物質であるＳｍａｄ７がヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞の平滑筋細胞分化に与える影響を示す。
【図９】図９は、ＭＥＫ阻害物質であるＰＤ９８０５９がヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞の平滑筋細胞分化に与える影響を示す。
【図１０】図１０は、ＦＧＦ除去前（＋）と除去後（−）でのヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞を、血管内皮細胞マーカーに対する抗体（抗ｖＷＦ抗体）（赤）及び骨芽細胞特異的マーカーに対する抗体（抗アルカリホスファターゼ抗体）（緑）で同時染色した写真を示す。
【図１１】図１１は、ＦＧＦ除去後０〜３週間におけるヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞の脂肪細胞特異的マーカー遺伝子（リポプロテインリパーゼ）の発現を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing a cell capable of differentiating from a vascular endothelium-derived cell into various cells or a cell differentiated into various cells, and a differentiated cell produced by the method. The present invention also relates to a method for differentiating vascular endothelium-derived cells into cells having the ability to differentiate into various cells or cells differentiated into various cells, and a method for regulating the differentiation.
[0002]
[Prior art]
The need for human differentiated cells in advanced medicine, such as regenerative medicine such as tissue replacement and gene therapy, is extremely high. There is also a high need for differentiated cells that can be used for human biomolecule production. However, there are fundamental and practical difficulties in supplying cells that meet these needs. In other words, when the required cells are donated by a surviving or immediately after death, or when using embryonic stem cells made from other cells as the required cells, there is an ethical problem. There are multiple difficulties, such as the problem of insufficient number of cells, the problem of immune rejection. Therefore, it is a big problem in this technical field to solve the above-mentioned problems and to develop a method for producing necessary human differentiated cells.
[0003]
There have been several reports to date regarding methods for obtaining differentiated cells as described above. For example, it has been reported that bovine living body-derived vascular endothelial cells differentiate into smooth muscle cells (Non-patent Document 1). However, in this system, only a very small amount (about 0.01 to 0.03%) of differentiated cells can be obtained, which is insufficient for practical use.
[0004]
In addition, stem cells having the ability to differentiate into vascular endothelial cells and smooth muscle cells have been isolated from mouse embryonic stem cells (ES cells) (Non-patent Document 2). To apply ES cells to human medicine There are many restrictions and it is not realistic at this time.
[0005]
Furthermore, it has been reported that bovine aorta-derived vascular endothelial cells differentiated into smooth muscle-like cells by stimulation of transforming growth factor β (TGF-β) family, particularly TGF-β1 (Non-patent Document 3). However, in this system, only cells in the very early differentiation stage of smooth muscle cells are obtained. Therefore, it is still insufficient to obtain fully differentiated smooth muscle cells, and it is considered that it cannot be used for human regenerative medicine.
Therefore, there has been a demand for a technique for easily and easily producing differentiated cells of animals, particularly humans.
[0006]
[Non-Patent Document 1]
Frid, MG et al., Circulation Research (USA), 2002, Vol. 90, p. 1189-1196
[Non-Patent Document 2]
Yamashita, J. et al., Nature (UK), 2000, 408, p. 92-96
[Non-Patent Document 3]
Arciniegas, E. et al., Journal of cell science (UK), 1992, Vol. 103, p. 521-529
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention relates to a technique for producing a large number of animal differentiated cells in a simple manner and a technique for regulating cell differentiation.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have conducted monolayer culture of primary human umbilical vein vascular endothelium-derived cells in a state stimulated in advance with one kind of growth factor, FGF and fetal bovine serum. As a result of continuing the culture in the state stimulated with fetal bovine serum alone except for FGF, the relationship between the cell morphology and cell differentiation was clarified. Therefore, when the expression of various cell differentiation markers was analyzed, it was found that gene expression specifically recognized in smooth muscle cells, osteoblasts and adipocytes was increased. Therefore, the present inventor has obtained the knowledge that cells that can be differentiated into various cells can be produced by culturing vascular endothelium-derived cells in a growth factor-containing medium and then culturing in a growth factor-free medium. The present invention has been completed.
[0009]
That is, the present invention is a method for producing differentiated cells, which comprises the following steps:
(A) culturing vascular endothelium-derived cells in a medium containing a growth factor; and
(B) a step of further culturing the cell in a state where the growth factor is removed from the culture medium of the cultured cell or the above growth factor activity is inhibited,
A cell having the ability to differentiate into cells of other species and / or cells differentiated into cells of other species.
[0010]
In the above production method, it is preferable to use umbilical vein vascular endothelium-derived cells as vascular endothelium-derived cells. The vascular endothelium-derived cells are preferably collected from mammals, particularly humans.
[0011]
In the above production method, the growth factor can be a factor belonging to the fibroblast growth factor (FGF) family. Examples of this fibroblast growth factor include, but are not limited to, acidic fibroblast growth factor (FGF-1).
Furthermore, in the above production method, other types of cells include smooth muscle cells, osteoblasts and adipocytes.
[0012]
Moreover, this invention is a differentiated cell obtained by the said preparation method.
The present invention is also a method for producing vascular endothelial cells, wherein the cells cultured according to the above production method are further cultured in a growth factor-added medium and redifferentiated into vascular endothelial cells.
[0013]
Furthermore, the present invention is a method for differentiating vascular endothelium-derived cells, comprising the following steps:
(A) culturing vascular endothelium-derived cells in a medium containing a growth factor; and
(B) a step of further culturing the cells in a state where the growth factor is removed from the culture medium of the cultured cells or the above growth factor activity is inhibited;
And a cell having the ability to differentiate into cells of other species and / or cells differentiated into cells of other species.
[0014]
In the differentiation method, the growth factor can be a factor belonging to the fibroblast growth factor (FGF) family. Examples of the fibroblast growth factor include acidic fibroblast growth factor (FGF-1).
In the differentiation method described above, other types of cells include, but are not limited to, smooth muscle cells, osteoblasts, and adipocytes.
[0015]
In addition, in the step (b) of the differentiation method, cell differentiation can be enhanced or suppressed by adding another factor to the growth factor-free medium. Here, for example, when a factor belonging to the transforming growth factor β (TGF-β) family or a MAP kinase kinase (MEK) inhibitor is used as another factor, cell differentiation is enhanced. Activin A is an example of transforming growth factor β. Moreover, PD98059 is mentioned as a MAP kinase kinase (MEK) inhibitor. Further, for example, when a transforming growth factor β (TGF-β) inhibitor is used as another factor, cell differentiation is suppressed. Transforming growth factor β (TGF-β) inhibitors include activin binding protein and smad7 protein.
[0016]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present invention relates to a method for producing differentiated cells and a method for differentiating vascular endothelium-derived cells. The vascular endothelium-derived cells are cultured in a medium containing a growth factor, and then the cultured cells do not contain a growth factor. Differentiation into differentiated cells (ie, cells having the ability to differentiate into cells of other species and / or cells of other species, by culturing in a medium or by further culturing in a state in which growth factor activity is inhibited. Cell).
[0017]
1. Preparation of vascular endothelium-derived cells
In the present invention, vascular endothelium-derived cells are cultured to obtain differentiated cells. In the present invention, “vascular endothelium-derived cells” refers to cells that are peeled off by enzymatic treatment or physical treatment of the inner wall of blood vessels, and examples include venous endothelium-derived cells (umbilical vein endothelium-derived cells, etc.).
[0018]
The cell source is not particularly limited as long as it is an animal. For example, mammals, particularly humans are preferable. The method for preparing cells described above may be in accordance with cell isolation methods well known in the art, and is not particularly limited.
[0019]
For example, umbilical vein endothelium-derived cells can be collected as contained in a population of cells that fall into the liquid by treating the venous endothelium of the umbilical cord that is available at birth with a trypsin solution.
[0020]
2. Cell culture
The cells obtained as described in “1. Preparation of vascular endothelium-derived cells” are first cultured in the presence of growth factors. Here, in the presence of a growth factor refers to adding a growth factor that has been elucidated materially to a culture solution and adding serum having growth factor activity or the like. In the present invention, the term “growth factor” refers to a protein having an action of increasing the number, weight, volume, etc. of cells, tissues, organs, individuals, etc., but is not limited to fibroblast growth factor (FGF). , Epidermal growth factor (EGF), transforming growth factor (TGF) (eg, TGF-β, etc.) and the like. In the present invention, it is preferable to use FGF as a growth factor. Examples of the FGF include acidic fibroblast growth factor (FGF-1 or aFGF), basic fibroblast growth factor (FGF-2 or bFGF), Keratinocyte growth factor (FGF-7 or KGF) is known. It is particularly preferable to use FGF-1 or FGF-2.
[0021]
The medium used for cell culture is not particularly limited as long as it is a medium generally used for culturing vascular endothelium-derived cells. For example, M199 medium (manufactured by Sigma), DMEM medium (Sigma) Manufactured), MCDB medium (manufactured by Sigma), MCDB151 medium (manufactured by Sigma) and the like.
[0022]
The concentration of the growth factor added to the medium varies depending on the growth factor used and can be appropriately set by those skilled in the art. For example, when FGF is used, the FGF concentration is about 10 to 3 ng / ml, preferably about 5 ng / ml.
[0023]
Other ingredients suitable for culturing vascular endothelium-derived cells may be added to the medium. For example, it is known in the art to add fetal bovine serum, heparin, kanamycin (antibiotics) and the like.
[0024]
The culture conditions may be those known to those skilled in the art for culturing vascular endothelium-derived cells. For example, the cells are cultured at about 37 ° C. for about 10 to 40 days, preferably 14 to 35 days. To do.
[0025]
In a preferred embodiment, the vascular endothelium-derived cells are in M199 medium supplemented with fetal calf serum (15%) containing FGF-1 (5 ng / ml) and heparin (10 μg / ml) or FGF-2 (5 ng / ml), Monolayer culture at 37 ° C. until cell density is subconfluent. In the presence of a growth factor, vascular endothelium-derived cells repeat proliferation while maintaining the properties of vascular endothelial cells.
[0026]
Subsequently, the cells cultured in the growth factor-containing medium as described above are cultured in the medium from which the growth factor has been removed or in a state in which the growth factor activity is inhibited. Inhibition of growth factor activity includes growth factor-receptor binding inhibitor, growth factor or neutralizing antibody binding to the receptor, growth factor specific absorber, growth factor intracellular signaling inhibitor However, other methods may be used. Such inhibition of growth factor activity is well known to those skilled in the art, and the above-described binding inhibitor, neutralizing antibody, specific absorbent, intracellular signal transduction inhibitor and the like can be appropriately selected by those skilled in the art. . The culture period is about 4 days to 3 weeks, preferably 2 to 3 weeks. Other culture conditions are the same as the above culture conditions.
[0027]
The present inventor confirmed that the vascular endothelium-derived cells cultured as described above were cultured in a medium in which growth factors were removed or in a state where growth factor activity was inhibited for a long period of time, and then transformed into smooth muscle cells, osteoblasts and adipocytes. It confirmed that it changed into the cell which expresses a specific marker gene (refer Examples 2-4, 8 and 9). Therefore, according to the present invention, vascular endothelium-derived cells can be differentiated to obtain cells having the ability to differentiate into other types of cells and / or cells differentiated into other types of cells.
[0028]
3. Differentiated cells
As described above, differentiated cells can be produced by differentiating vascular endothelium-derived cells by the culture technique of the present invention. In the present invention, “differentiated cells” refer to cells having the ability to differentiate into cells of other species and cells differentiated into cells of other species. Here, “cells of other species” refer to cells other than vascular endothelial cells, and include, but are not limited to, smooth muscle cells, osteoblasts, and fat cells. In addition, “cells capable of differentiating into other types of cells” means that the prepared cells have the properties and functions of other types of cells, but are still different from those of vascular endothelium-derived cells before differentiation. It refers to those that have properties and functions. On the other hand, “cells differentiated into cells of other species” means that the prepared cells have only properties and functions as cells of other species, and retain the properties and functions of vascular endothelium-derived cells before differentiation. It refers to something that is not.
[0029]
The cells cultured for 3 weeks in the FGF-free medium according to the present invention contracted by stimulation with endothelin-1 (ET-1), and thus were considered to have a function as smooth muscle cells (Example 6). reference). Moreover, since this cell shows both a smooth muscle cell marker and a vascular endothelial cell marker (refer Example 2 and 3), it can be said that these cells are the cells which have the differentiation ability to a smooth muscle cell.
[0030]
Since vascular endothelium-derived cells (for example, human umbilical vein vascular endothelium-derived cells) are cultured in a growth factor (preferably FGF) -added medium, their proliferation ability is very high. It is possible to easily and in large quantities produce cells that have the ability to differentiate into cells and cells that have differentiated into other types of cells. Therefore, a large amount of cells useful in regenerative medicine can be obtained by using the differentiated cells. In addition, since the umbilical vein vascular endothelium-derived cells, which are the most preferred vascular endothelium-derived cells in the present invention, can be stored in liquid nitrogen for a long time, if umbilical vein vascular endothelium-derived cells are collected at the time of birth, When various cells (for example, smooth muscle cells, osteoblasts, and adipocytes) need to be regenerated due to some pathological cause, the preserved cells can be taken out and proliferated and differentiated for use. As a result, since the cells taken out from the self can be differentiated and returned to the body, it is expected that there are few immunological problems.
[0031]
4). Regulation of differentiation
(1) Redifferentiation into vascular endothelial cells
Cells differentiated according to the present invention can be redifferentiated into vascular endothelial cells by culturing again in a growth factor-added medium. In this case, FGF-1 or FGF-2 can be used as the growth factor to be used, but other growth factors can be used as long as they have an activity capable of inducing redifferentiation into vascular endothelial cells. Can be used.
[0032]
The effects and advantages achieved by redifferentiating cells once differentiated into other types of cells into vascular endothelial cells include the following:
・ If it is judged that more differentiated cells are actually needed than the differentiated cells initially prepared as a sufficient amount for the purpose of regenerative medicine, etc., the differentiated cells are vascularized by the above redifferentiation operation. After returning to the cells, the cells can be cultured and grown until the required amount is obtained, and then induced to differentiated cells again. In this case, the proliferation rate is better when the vascular endothelial cells are grown than when the differentiated cells are grown, and the culture is also simple.
-As a biological disease such as arteriosclerosis, vascular endothelial cells may be differentiated into other types of cells such as smooth muscle cells and have disadvantageous properties. If cells having the above properties can be redifferentiated into vascular endothelial cells, it is expected to be useful for treatment (improvement) of diseases.
[0033]
(2) Enhancement and suppression of differentiation
In the step of culturing in a growth factor-free medium according to the present invention, it is possible to enhance or suppress cell differentiation by adding other various factors.
[0034]
For example, when a factor belonging to transforming growth factor β (TGF-β) or a MAP kinase kinase (MEK) inhibitor is used as another factor, a cell capable of inducing other types of cells from vascular endothelium-derived cells Differentiation into can be enhanced. Factors belonging to the TGF-β family include, but are not limited to, activin, bone morphogenetic factor (BMP), and the like. In the present invention, activin, particularly activin A is preferably used.
Examples of the MEK inhibitor include, but are not limited to, PD98059, U0126, and the like.
[0035]
For example, when a TGF-β inhibitor is used as another factor, differentiation can be suppressed. The TGF-β inhibitor is not limited to its inhibitory action mechanism, and examples thereof include activin binding protein, Smad7 protein, and activin neutralizing antibody. In the present invention, it is particularly preferable to use follistatin and Smad7 protein as activin-binding proteins.
[0036]
As mentioned above, the effects and benefits achieved by regulating differentiation into other types of cells include:
・ For the purpose of regenerative medicine, etc., when it is judged that moderately differentiated cells having both the properties of differentiated cells and the properties of cells before differentiation are necessary, differentiation according to the present invention is performed. It is thought that the technology to adjust is effective.
-As a biological disease such as arteriosclerosis, vascular endothelial cells may be differentiated into other types of cells such as smooth muscle cells and have disadvantageous properties. If the differentiation of cells into cells can be regulated, it is expected to be useful for the prevention / treatment (improvement) of diseases.
[0037]
【Example】
The present invention will be specifically described by the following examples. However, the technical scope of the present invention is not limited by these examples.
[0038]
[Example 1] Culture of human umbilical vein vascular endothelium-derived cells
Human umbilical vein vascular endothelium-derived cells (HUVE-DC) were isolated by the previously reported HUVEC isolation procedure (Imamura, T., and Mitsui, Y. (1987) Exp. Cell Res. 172, 92- 100). That is, after washing the inner wall of the human umbilical vein blood vessel, a phosphate buffer solution containing 0.25% trypsin was injected and allowed to stand at room temperature for 15 minutes, whereby endothelial cells were detached from the cell wall and collected.
[0039]
Cells isolated as described above are inoculated into a plastic culture dish coated with type I collagen, 15% fetal bovine serum (FBS; Filtron) is added, and 5 ng / ml FGF-1 and 10 μg / ml heparin (Sigma) are added. ) In M199 medium (Sigma) with or without addition.
In all cell differentiation experiments in all Examples, the cells were cultured once in an FGF-added medium, grown to a subconfluent state, and then cultured in an FGF-free medium.
[0040]
The FGF-1 used here was prepared by a genetic recombination technique, and this recombinant FGF-1 was expressed in the pET-3c system (Imamura, T. et al., (1990) in E. coli BL21 (DE3) pLysS cells. ) Science 249, 1567-1570). Moreover, the obtained FGF-1 was prepared by carrying out the homogeneous purification by heparin-sepharose affinity chromatography (Imamura, T. et al. (1990) Science 249, 1567-1570). The addition of heparin (manufactured by Sigma) was performed to optimize FGF-1 activity and did not affect cell differentiation. The resulting cells were used in the following tests.
[0041]
[Example 2] Immunocytochemistry test
In this example, an immunocytochemical test was performed using the cells cultured in Example 1.
Cells cultured in Example 1 were treated with a polyclonal antibody against von Willebrand factor (vWF), a vascular endothelial cell marker (manufactured by Dako), and a monoclonal antibody (clone hCP) against calponin, a smooth muscle cell marker (manufactured by Sigma). Double labeling was used as the primary antibody, followed by secondary labeling using Texas Red conjugate donkey anti-rabbit IgG (Amersham) and FITC conjugated goat anti-mouse IgG (Amersham), respectively. Subsequently, the signal was detected using a confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany).
[0042]
The results are shown in FIGS. 1a and b. FIG. 1a shows a microscopic image of human umbilical vein endothelium-derived cells 3 weeks after FGF addition (+) and FGF removal (−). It can be seen that flat and large cells appear 3 weeks after FGF removal. Also, FIG. 1b shows human umbilical vein endothelium-derived cells 3 weeks after FGF addition (+) and FGF removal (−), anti-vWF antibody (red), which is a vascular endothelial cell marker, and smooth muscle cell marker, respectively. The image co-stained with an anti-basic calponin antibody (green) is shown. At 3 weeks after FGF removal, cells expressing both smooth muscle cell markers could be confirmed.
[0043]
[Example 3] Confirmation of expression of smooth muscle cell marker and vascular endothelial cell marker (RT-PCR / Southern blot analysis)
In this example, the cells cultured in Example 1 were used to examine the expression of smooth muscle cell markers using RT-PCR / Southern blotting.
[0044]
Semi-quantitative RT-PCR / Southern blot analysis was performed as previously described (Ozawa, K. et al. (1997) Brain Res. Protocol 1, 211-216). Briefly, after isolating total RNA from cells using Isogen (Nippon Gene), 1 μg sample was reverse transcribed using M-MLV reverse transcriptase (GIBCO BRL) according to manufacturer's instructions. . Using a 4% reverse transcription mixture, a cDNA fragment of the test gene was amplified by PCR using AmpliTaq Gold (PE Applied Biosynthesis). Table 1 shows primers specific to the smooth muscle cell marker and vascular endothelial cell marker used. In the table, “vWF” which is a vascular endothelial cell marker represents von Willebrand factor, “PECAM-1” represents a platelet / vascular endothelial cell adhesion molecule, “SM22α” which is a smooth muscle cell marker represents actin-binding protein, “PGES” "Represents a prostaglandin E synthase, and" calponin "represents an actin-binding protein. “GAPDH” was used as an internal standard. In addition, “F” and “R” in the item of primer sequence represent a forward primer and a reverse primer, respectively. The numerical value described in the item of the cycle represents the number of PCR cycles performed using the primer set, and the numerical value described in the item of the fragment represents the fragment length obtained by PCR.
[0045]
[Table 1]

[0046]
Subsequently, an aliquot of the PCR product was separated on a 1.0% agarose gel and transferred to a Hybond N + membrane (Amersham-Pharmacia). Subsequently, this membrane was hybridized with a corresponding cDNA probe labeled with digoxigenin-labeled dUTP (DIG-High Prime, Roche). Signals were visualized, integrated and quantified using NIH Image software (version 1.62).
[0047]
The results are shown in FIGS. Figures 2a and b show the expression of each smooth muscle cell marker (a) and each vascular endothelial cell marker (b). Further, graphs of the results are shown in FIGS. 2c and d, respectively. 2a and c show that the expression of the smooth muscle cell marker increases with time in the cells 1 to 2 weeks after the removal of FGF.
[0048]
[Example 4] Test using cell clones of human umbilical vein endothelium-derived cells
In this example, cell clones of human umbilical vein endothelium-derived cells were cultured and tested for their ability to differentiate into smooth muscle cells.
[0049]
Cell clones CL1 and CL14 of human umbilical vein endothelium-derived cells were cultured in an FGF-added medium in the same manner as in Example 1, and then cultured in an FGF-free medium for 2 weeks. Thereafter, in the same manner as in Example 2, co-staining was performed using an antibody against a vascular endothelial cell marker and an antibody against a smooth muscle cell marker. Moreover, the expression of the calponin gene which is a smooth muscle cell marker was investigated similarly to Example 3.
[0050]
The results are shown in FIGS. FIG. 3a is a staining result using an antibody against a vascular endothelial cell marker and an antibody against a smooth muscle cell marker. From this photograph, only the smooth muscle cell marker was confirmed in CL14 cells. FIGS. 3b and 3c show the results of examining the expression of the calponin gene over time, and a significant increase in the expression of calponin was confirmed in both CL1 cells and CL14 cells. It turns out that there is a difference in ability.
[0051]
[Example 5] Redifferentiation into endothelial cells
In this example, it was confirmed that endothelial cells were differentiated again from the differentiated smooth muscle cells confirmed in Examples 2 and 3.
[0052]
Under the same conditions as in Example 1, human umbilical vein endothelium-derived cells were cultured in a medium without FGF for 4 days, and further cultured in a medium with or without FGF added for 4 days. Thereafter, mRNA was extracted from the cells in the same manner as in Example 3, and the expression of smooth muscle cell-specific marker genes (calponin and SM22α) was examined by RT-PCR / Southern blotting.
[0053]
The results are shown in FIG. In FIG. 4, the expression of the marker of each smooth muscle cell increased with time (4 days, 8 days) after the removal of FGF (4 days, 8 days), but FGF was added again on the 4th day after the removal of FGF for another 4 days. As for the cultured one (+), the expression of each marker gene was reduced to a level near the level before FGF removal. That is, it was found that cells differentiated into smooth muscle cells by FGF removal differentiated into endothelial cells again by adding FGF again.
[0054]
[Example 6] Contraction of smooth muscle cells
In this example, the contractility of human umbilical vein endothelium-derived cells cultured after FGF removal was tested.
[0055]
First, human umbilical vein endothelium-derived cells were cultured for 3 weeks on a plastic culture dish coated with type I collagen in the presence or absence of FGF-1 + heparin, and then the cells were treated with 10 mM 8-bromo-cGMP. Incubated with CALBIOCHEM at 37 ° C. for 20 minutes for relaxation and embedded in a collagen gel on a 24-well plate. At this time, the final concentration of 8-bromo-cGMP in the gel was 1 mM (2.4 × 10 4 in 0.75 ml gel / well). ^Five cell).
[0056]
The collagen gel was prepared using Cellmatrix type IP (0.3% porcine type I collagen; Nitta-gelatin Corp., Osaka, Japan) according to the manufacturer's instructions. Briefly, cell suspension, bicarbonate buffer, fetal bovine serum (FBS), and Cellmatrix type IP solution in 10 × M199 medium, 1 × M199 medium, 1: 1: 1: 1.5: 5 Mixed at a ratio of .5 and poured into wells to polymerize. The resulting SMC encapsulated gel was coated with 0.5 ml of M199 containing 15% FBS. After incubating the gel to the 17 hour point when the gel separated from the bottom of the well, endothelin (ET-1; manufactured by CALBIOCHEM) (250 nM) was added to the culture every 30 minutes. For quantification, each gel piece was transferred to a 1.5 ml microtube containing 500 μl of culture solution, centrifuged, and its volume was measured.
[0057]
The measurement results are shown in FIG. FIG. 5 is a graph showing the contraction rate of cells cultured with FGF added (F) or non-added (D) by ET-1 stimulation. Human umbilical vein endothelium-derived cells 3 weeks after FGF removal cause about 20% gel contraction by ET-1 stimulation. In the figure, an asterisk indicates that there is a significant difference at a p-value <0.05 in Student's T test. From this result, it can be seen that cells having characteristics of smooth muscle cells are contained in human umbilical vein endothelium-derived cells 3 weeks after FGF removal.
[0058]
[Example 7] Regulation of differentiation
In this example, the regulation of differentiation of human umbilical vein endothelium-derived cells into smooth muscle cells was tested.
[0059]
(1) Enhanced differentiation by TGF-β family
Human umbilical vein endothelium-derived cells were cultured for 7 days with or without FGF in the same manner as in Example 1. Furthermore, 100 μg / ml of activin A (R & D Systems, Inc.), which is a kind of growth factor belonging to the TGF-β family, was administered to these cells, and the action was examined. As in Example 3, the expression of smooth muscle cell marker gene (calponin, SM22α) and vascular endothelial cell marker gene (vWF) was examined by RT-PCR / Southern blotting. Similarly to Example 2, human umbilical vein endothelium-derived cells after FGF removal were co-stained with anti-vWF antibody and anti-calponin antibody.
[0060]
The results are shown in FIGS. 6a and b. FIG. 6a shows the expression of each marker gene after culturing for 7 days with FGF added (+) or without FGF (−), and with activin A added (+) or without (−). FIG. 6b shows a photograph of cells co-stained with anti-vWF antibody and anti-calponin antibody. From these results, it can be seen that activin A enhances differentiation of human umbilical vein endothelium-derived cells into smooth muscle cells after FGF removal.
[0061]
(2) Inhibition of differentiation by activin-binding protein
Human umbilical vein endothelium-derived cells were cultured for 5 days with or without FGF in the same manner as in Example 1. In addition, 1 μg / ml of follistatin (manufactured by R & D Systems, Inc.), which is a kind of activin binding protein that is an inhibitor of activin A, was administered to these cells, and the action was examined. As in Example 3, the expression of smooth muscle cell marker gene (calponin, SM22α), vascular endothelial cell marker gene (vWF), and internal standard (GAPDH) was examined by RT-PCR / Southern blotting.
[0062]
The results are shown in FIG. FIG. 7 shows the expression of each marker gene after culturing for 5 days with FGF added (+) or without FGF (−), and with follistatin added (+) or without (−). From these results, it can be seen that follistatin suppresses differentiation of human umbilical vein endothelium-derived cells into smooth muscle cells after FGF removal.
[0063]
(3) Suppression of differentiation by TGF-β family inhibitors
In human umbilical vein endothelium-derived cells, smad7, which is an inhibitor of the intracellular signal transduction pathway of the TGF-β family, was forcibly expressed using an adenovirus vector. Specifically, a recombinant E1-deleted adeno having mouse Smad7 cDNA ligated with a FLAG-epitope (Nakao, A. et al. (1997) Nature 389, 631-635) under the control of a cytomegalovirus promoter. A viral vector (AdCMV-Smad7) was prepared and the method already described (Fujii, M. et al. (1999) Mol. Biol. Cell 10, 3801-3813; Nakao, A. et al. (1999) J Clin. Invest. 104, 5-11.). That is, after introducing the above vector into 293 cells, the recombinant Smad7 protein expressed in the culture supernatant was purified and used.
[0064]
Smad7-expressing cells and non-expressing cells prepared as described above were cultured in an FGF-removed medium for 7 days in the same manner as in Example 1, and then vascular endothelial cell marker (vWF) and smooth muscle cell marker as in Example 2. Co-stained with (calponin).
[0065]
The results are shown in FIG. FIG. 8 shows photographs of Smad7 expressing cells (1 and 3) and Smad7 non-expressing cells (2 and 4). These results indicate that Smad7 suppresses differentiation of human umbilical vein endothelium-derived cells into smooth muscle cells after FGF removal.
[0066]
(4) Release of MEK-dependent differentiation and differentiation suppression
Human umbilical vein endothelium-derived cells were cultured in an FGF-free medium for 4 days, and further cultured for 4 days with or without FGF. In addition, PD98059 (manufactured by CALBIOCHEM), 50 μg / ml, which is a kind of MAP kinase kinase (MEK) inhibitor, was administered to these cells, and the action was examined. As in Example 3, the expression of the smooth muscle cell marker gene (calponin, SM22α) and internal standard (GAPDH) was examined by RT-PCR / Southern blotting.
[0067]
The results are shown in FIG. FIG. 9 shows those cultured for 4 days without FGF (4), cultured for 4 days with FGF added (8+) or without FGF (8−), and cultured with PD98059 added (rightmost lane). ) Shows the expression of each marker gene. The expression of each smooth muscle cell marker increased with time after FGF removal (4th and 8th days), but FGF was added again on the 4th day after FGF removal and further cultured for 4 days (8 (+)). ), The expression of each smooth muscle cell marker decreased to near the level before FGF removal. This decrease in the expression of each smooth muscle cell marker by FGF re-addition was inhibited by the administration of PD98059 (rightmost lane). From these results, it can be seen that the inhibitory effect of FGF on differentiation into smooth muscle cells occurs in a MEK-dependent manner, and administration of MEK inhibitors releases the inhibition of differentiation into smooth muscle cells and enhances differentiation. I understand.
[0068]
[Example 8] Differentiation into osteoblasts
In this example, differentiation from human umbilical vein endothelium-derived cells to osteoblasts was confirmed.
[0069]
Human umbilical vein endothelium-derived cells were cultured in an FGF-added medium in the same manner as in Example 1, and then cultured in an FGF-free medium for 3 weeks. Thereafter, a rabbit polyclonal anti-vWF antibody (manufactured by Dako) which is a vascular endothelial cell marker and a goat polyclonal anti-alkaline phosphatase antibody (Cortex Biochem, Inc.) which is an osteoblast marker are double-labeled using a primary antibody, and then Secondary labeling with Texas Red conjugate donkey anti-rabbit IgG (Amersham) and FITC conjugated donkey anti-goat IgG (Amersham), respectively. Subsequently, the signal was detected using a confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany).
[0070]
The result is shown in FIG. FIG. 10 shows the results of staining human umbilical vein endothelium-derived cells with FGF addition (+) and 3 weeks after FGF removal (−) using anti-vWF antibody and anti-alkaline phosphatase antibody. From this photograph, cells expressing an osteoblast marker were confirmed 3 weeks after FGF removal. Therefore, it was found that differentiated cells that induce osteoblasts can be obtained from human umbilical vein endothelium-derived cells.
[0071]
[Example 9] Differentiation into adipocytes
In this example, differentiation from human umbilical vein endothelium-derived cells to adipocytes was confirmed.
[0072]
Human umbilical vein endothelium-derived cells were cultured in an FGF-added medium in the same manner as in Example 1, and then cultured in an FGF-free medium for 0 to 3 weeks. Thereafter, in the same manner as in Example 3, the expression of an adipocyte-specific marker gene (lipoprotein lipase) was examined by RT-PCR / Southern blotting. The primer set for amplification of the lipoprotein lipase gene is shown below:
F: GAGATTTCTCTGTATGGCACC (SEQ ID NO: 13)
R: CTGCAAATGAGACACTTTCTC (SEQ ID NO: 14)
When PCR is performed for 36 cycles using the above primer set, the resulting fragment is 276 bp. Subsequent operations were performed in the same manner as in Example 3.
[0073]
The result is shown in FIG. FIG. 11 shows the expression of lipoprotein lipase in human umbilical vein endothelium-derived cells 0 to 3 weeks after FGF removal. From this result, it was found that human umbilical vein endothelium-derived cells differentiate into differentiated cells that induce adipocytes over time after FGF removal.
[0074]
【The invention's effect】
The present invention makes it possible to produce a large amount of cells having the ability to differentiate into cells of other species and cells differentiated into cells of other species. Therefore, by producing such differentiated cells, cells useful in regenerative medicine can be easily obtained in large quantities. In addition, since the umbilical vein vascular endothelium-derived cells, which are the most preferred vascular endothelium-derived cells in the present invention, can be stored in liquid nitrogen for a long time, if umbilical vein vascular endothelium-derived cells are collected at the time of birth, When various cells (for example, smooth muscle cells, osteoblasts, and adipocytes) need to be regenerated due to some pathological cause, the preserved cells can be taken out and proliferated and differentiated for use. Therefore, by utilizing the present invention, cells extracted from the self can be differentiated and then returned to the body, so that it is expected that there are few important immunological problems in regenerative medicine.
[0075]
[Sequence Listing]

[0076]
[Sequence Listing Free Text]
SEQ ID NOs: 1-14: synthetic oligonucleotides
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the morphology of human umbilical vein vascular endothelium-derived cells before and after FGF removal. a: Phase contrast microscopic images of cells added with FGF (+) and 3 weeks after FGF removal (-). b: shows an image of cells in a co-stained with anti-vWF antibody (red) and anti-basic calponin antibody (green).
FIG. 2 shows the expression of smooth muscle cell-specific markers (a and c) and vascular endothelial cell markers (b and d) in human umbilical vein vascular endothelium-derived cells before and after FGF removal over time. Show.
FIG. 3 shows simultaneous staining of cells at 2 weeks after FGF removal in each population of cloned human umbilical vein endothelial cells with anti-vWF antibody (red) and anti-basic calponin antibody (green). The image (a) and the expression (b and c) of the vascular endothelial cell marker and smooth muscle cell marker are shown over time.
FIG. 4 shows how the expression of a smooth muscle cell-specific marker after FGF removal is suppressed by re-administration of FGF.
FIG. 5 shows how differentiated human umbilical vein vascular endothelium-derived cells contract as smooth muscle cells by administration of endothelin-1.
FIG. 6 shows the effect of activin A belonging to the TGF-β family on smooth muscle cell differentiation of human umbilical vein vascular endothelium-derived cells.
a: Expression of each smooth muscle cell marker gene and each vascular endothelial cell marker gene in cells cultured with FGF added (+) or non-added (-), and activin A added (+) or non-added (-).
b: shows an image of cells in a co-stained with anti-vWF antibody and anti-calponin antibody.
FIG. 7 shows the effect of follistatin, an activin A inhibitor, on smooth muscle cell differentiation of human umbilical vein vascular endothelium-derived cells.
FIG. 8 shows the effect of Smad7, an activin A inhibitor, on smooth muscle cell differentiation of human umbilical vein vascular endothelium-derived cells.
FIG. 9 shows the effect of PD98059, a MEK inhibitor, on smooth muscle cell differentiation of human umbilical vein vascular endothelium-derived cells.
FIG. 10 shows human umbilical vein vascular endothelium-derived cells before (+) and after (-) removal of FGF, antibody against vascular endothelial cell marker (anti-vWF antibody) (red) and osteoblast-specificity. The photograph which co-stained with the antibody (anti-alkaline phosphatase antibody) (green) with respect to a specific marker is shown.
FIG. 11 shows the expression of an adipocyte-specific marker gene (lipoprotein lipase) in human umbilical vein vascular endothelium-derived cells at 0 to 3 weeks after FGF removal.

Claims

A method for producing differentiated cells, comprising the following steps:
(A) a step of culturing vascular endothelium-derived cells in a medium containing fibroblast growth factor, and (b) removing fibroblast growth factor from the culture medium of cultured cells, or the fibroblast growth factor activity described above Further culturing cells in the inhibited state,
And a cell having the ability to differentiate into a cell selected from the group consisting of smooth muscle cells, osteoblasts and adipocytes , and / or a cell selected from the group consisting of smooth muscle cells, osteoblasts and adipocytes A production method as described above, characterized in that a cell differentiated into two is obtained.

The production method according to claim 1, wherein the vascular endothelium-derived cells are umbilical vein vascular endothelium-derived cells.

The production method according to claim 1 or 2, wherein the vascular endothelium-derived cells are collected from a mammal.

The production method according to claim 3, wherein the mammal is a human.

The production method according to any one of claims 1 to 4 , wherein the fibroblast growth factor is acidic fibroblast growth factor (FGF-1).

A vascular endothelial cell, characterized in that a cell cultured according to the production method according to any one of claims 1 to 5 is further cultured in a fibroblast growth factor-added medium and redifferentiated into a vascular endothelial cell. Manufacturing method.

A method for differentiating vascular endothelium-derived cells, comprising the following steps:
(A) a step of culturing vascular endothelium-derived cells in a medium containing fibroblast growth factor, and (b) removing fibroblast growth factor from the culture medium of cultured cells, or the fibroblast growth factor activity described above Further culturing cells in the inhibited state,
And a cell having the ability to differentiate into a cell selected from the group consisting of smooth muscle cells, osteoblasts and adipocytes , and / or a cell selected from the group consisting of smooth muscle cells, osteoblasts and adipocytes A method for differentiating the cells according to the above, wherein the cells are differentiated into cells.

The differentiation method according to claim 7 , wherein the fibroblast growth factor is acidic fibroblast growth factor (FGF-1).

In step (b), by adding a factor and / or MAP kinase kinase (MEK) inhibitors belong to the transforming growth factor β (TGF-β) family fibroblast growth factor-free medium, the smooth muscle cells it is intended to enhance the differentiation, according to claim 7 or 8 differentiation methods of description.

The differentiation method according to claim 9 , wherein the transforming growth factor β is activin A.

The differentiation method according to claim 9 , wherein the MAP kinase kinase (MEK) inhibitor is PD98059.

In step (b), by adding a transforming growth factor β (TGF-β) inhibitors to fibroblast growth factor-free medium, and suppresses the differentiation of smooth muscle cells, according to claim 7 or 8 The differentiation method described.

The differentiation method according to claim 12 , wherein the transforming growth factor β (TGF-β) inhibitor is activin-binding protein or smad7 protein.