JP3899372B2 - Optical measurement method for multi-stranded nucleic acid - Google Patents

Description

（式中、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³はそれぞれ独立に水素原子又は置換基を示し、Ｒ¹とＲ²及びＲ²とＲ³は互いに結合して環を形成してもよく；Ｑは酸素原子、イオウ原子、−Ｎ(Ｒ²⁴)−、又は−Ｃ(Ｒ²⁴)(Ｒ²⁵)−を示し（Ｒ²⁴及びＲ²⁵はそれぞれ独立にアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を示し、Ｒ²⁴とＲ²⁵は互いに結合して３〜８員の環を形成してもよい）；Ｒ⁶はアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を示すが、Ｒ⁶はＲ¹、Ｒ³、Ｇ、又はＶ₂と結合して環を形成してもよく；Ｒ⁷、Ｒ⁸、及びＲ⁹は水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ハロゲン原子、−ＯＲ¹⁰、−ＳＲ¹¹、又は−Ｎ(Ｒ¹²)(Ｒ¹³)を示すが、Ｒ⁷とＲ⁸、Ｒ⁸とＲ⁹、及びＲ⁷とＲ⁹は互いに結合して環を形成してもよく（Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹、Ｒ¹²、及びＲ¹³はそれぞれ独立にアルキル基、アリール基、アシル基、スルホニル基、又はヘテロ環基を表すが、Ｒ¹²とＲ¹³は互いに結合して環を形成してもよい）；ｎは０、１、２、又は３の整数を示し、ｎが２以上の場合にはそれぞれのＲ⁸又はそれぞれのＲ⁹は同一でも異なっていてもよく；Ｖ¹及びＶ²はそれぞれ独立に−Ｃ(Ｒ⁵)＝又は窒素原子を示し；ｍは０又は１を示し；Ｇは５又は６員環含窒素ヘテロ環を形成するのに必要な原子群を示すが、形成された上記５又は６員環含窒素ヘテロ環はさらに縮合環を有していてもよく；Ｒ⁵は水素原子又は置換基を示す）
から選ばれる上記方法が提供される。
【００１６】
また、別の好ましい態様によれば、多重鎖核酸と相互作用可能な上記化合物が下記一般式（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、及び（ＩＸ）で表される化合物からなる群：
【化５】

（式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁶、Ｑ、及びｎは上記と同義であり、Ｒ⁶はＲ¹、Ｒ³、Ｒ¹⁵、又はＲ¹⁷と結合して環を形成してもよく；Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、Ｒ¹⁶、及びＲ¹⁷はそれぞれ水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アシルアミノ基、スルホニルアミノ基、ヘテロ環基、シアノ基、スルホニル基、スルフィニル基、ニトロ基、スルホ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバモイル基、スルファモイル基、及びメルカプト基からなる群から選ばれる置換基を示すが、Ｒ¹⁴とＲ¹⁵及びＲ¹⁶とＲ¹⁷は互いに結合して５ないし８員の環を形成してもよい）
から選ばれる上記の方法も提供される。
【００１７】
さらに、本発明により、多重鎖核酸の光学的測定方法であって、
(1)下記一般式（Ｉ）における化合物（Ｂ）を多重鎖核酸と接触させる工程、及び
(2)化合物（Ｂ）と多重鎖核酸との相互作用により生成した化合物（Ｃ）の蛍光を測定する工程
【化６】

（式中、双方向の矢印は化学平衡を示し；
化合物（Ａ）は実質的に無蛍光性の化合物を示し；
化合物（Ｂ）は、少なくとも１つの条件下では、実質的に無蛍光性であり、４００〜１０００ｎｍに吸収極大を有さない化合物を示し；
化合物（Ｃ）は、上記の条件下において、化合物（Ｂ）と多重鎖核酸との相互作用により生成し、４００〜１０００ｎｍに吸収極大を有し、かつ上記相互作用によって実質的に蛍光性を発現する化合物を示し；
Ｘは−Ｃ（Ｒ）＝Ｙに結合して色素分子を形成するのに必要な原子団を示し；ＹはＸ−Ｃ（Ｒ）＝と結合して色素分子を形成するのに必要な原子団を示し；Ｒは水素原子又は置換基を示し、Ｘ及び／又はＹと結合して環を形成してもよく；Ｙ’は化合物（Ａ）におけるＣ＝Ｙの二重結合がプロトン化されるように電子の移動を起こした結果として標記される残基を示し；Ｚは酸ＨＺの共役塩基を示し、Ｘ、Ｙ（若しくはＹ’）、又はＲに結合していてもよい）
を含む方法が提供される。
【００１８】
この発明の好ましい態様によれば、化合物（Ａ）が上記一般式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、及び（Ｖ）で表される化合物からなる群から選ばれる上記方法；化合物（Ａ）が上記一般式（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、及び（ＩＸ）で表される化合物からなる群から選ばれる上記方法が提供される。
【００１９】
これらの発明の好ましい態様によれば、溶液状態の多重鎖核酸と相互作用させる工程を含む上記の方法、及び固相担体上に固定された多重鎖核酸と相互作用させる工程を含む上記の方法が提供される。
【００２０】
さらに別の観点からは、本発明により、多重鎖核酸を光学的に測定するための試薬であって、多重鎖核酸と相互作用可能な化合物を含み、該化合物が下記の性質：
(a)多重鎖核酸の非存在下において、少なくとも１つの条件下では水溶液中で実質的に無色かつ無蛍光性の状態で存在することができ、
(b)上記(a)の条件下において多重鎖核酸を存在させた場合に、多重鎖核酸との相互作用によって実質的に有色に変化し、かつ該相互作用によって実質的に蛍光性を発現する
を有する化合物である試薬が提供される。
【００２１】
また、本発明により、多重鎖核酸を光学的に測定するための試薬であって、多重鎖核酸と相互作用可能な化合物を含み、該化合物が下記の性質；
(c)多重鎖核酸の非存在下において水溶液中では非プロトン化状態で実質的に無蛍光性であり、
(d)多重鎖核酸の非存在下において、少なくとも１つの条件下では水溶液中でプロトン化状態において実質的に無色かつ実質的に無蛍光性の状態で存在することができ、及び
(e)上記(d)の条件下において多重鎖核酸を存在させた場合に、多重鎖核酸との相互作用によって実質的に有色に変化し、かつ該相互作用によって実質的に蛍光性を発現する
を有する化合物である試薬が提供される。
これらの試薬に含まれる化合物の好ましい例として、上記一般式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、及び（Ｖ）からなる群から選ばれる化合物、又は上記一般式（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、及び（ＩＸ）からなる群から選ばれる化合物を挙げることができる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、多重鎖核酸を光学的に測定する方法であって、多重鎖核酸と相互作用可能な化合物を多重鎖核酸と接触させる工程を含み、該化合物が下記の性質：
(a)多重鎖核酸の非存在下において、少なくとも１つの条件下では水溶液中で実質的に無色かつ無蛍光性の状態で存在することができ、
(b)上記(a)の条件下において多重鎖核酸を存在させた場合に、多重鎖核酸との相互作用によって実質的に有色に変化し、かつ該相互作用によって実質的に蛍光性を発現する
を有する化合物であることを特徴としている。
【００２３】
本明細書において、「無色」とは４００〜１０００ｎｍ（本明細書において「〜」で表される数値範囲は特に言及しない場合には上限及び下限を含む範囲である）における最大分子吸光係数が０〜８０００未満、好ましくは０〜５０００未満であり、最も好ましくは０〜３０００未満である。また、有色とは４００〜１０００ｎｍにおける最大分子吸光係数が２００００以上、好ましくは３００００以上であり、最も好ましくは４００００以上である。無色状態から有色状態への分子吸光係数の変化率としては５倍以上、好ましくは７倍以上、最も好ましくは１０倍以上である。
【００２４】
本明細書において、「相互作用可能」とは、上記化合物と多重鎖核酸とが親和性を有しており、可逆的な結合によりエネルギーの受け渡しなど何らかの物理化学的な相互作用を行うことができることを意味しているが、この用語はいかなる意味においても限定的に解釈してはらなず、最も広義に解釈する必要がある。「少なくとも１つの条件下では水溶液中で実質的に無色かつ無蛍光性の状態で存在することができる」とは、通常は溶液状態におけるｐＨや塩濃度などの条件が適宜選択された状態において、化合物が上記に定義された性質を有することを意味しており、その条件下以外における性質はいかなるものであってもよい。当業者は溶液のｐＨや塩濃度を通常の方法で適宜選択することにより、化合物が所望の性質を有するか否かを容易に判定することが可能である。
【００２５】
本明細書において、多重鎖核酸とは核酸が相補的配列に由来する相互作用により集合した状態を指している（相互作用による多重鎖核酸の生成過程を「ハイブリダイゼーション」と呼ぶ場合がある）。多重鎖核酸は二本鎖、三本鎖、又は四本鎖などの状態をとることが知られており、本明細書における多重鎖核酸にはこれらの多重鎖も包含される。核酸としてはＤＮＡ又はＲＮＡのほか、これらの化学修飾体が数多く知られており、さらにＰＮＡと呼ばれるポリペプチド鎖を主鎖に有する核酸類縁体なども知られているが、本明細書における多重鎖核酸にはこれらがすべて包含される。本発明においてより好ましく用いられる核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、及びこれらの化学修飾体であり、二本鎖、三本鎖、又は四本鎖の中では二本鎖が好ましい。プローブ核酸と試料核酸とのハイブリダイゼーションにより生成される多重鎖核酸を本明細書において「ハイブリッド多重鎖核酸」と呼ぶ。
【００２６】
本発明の方法に用いる上記の特徴を有する化合物としては、例えば、溶液状態でプロトン化されることによって実質的に無色化する性質を有する色素化合物を用いることができる。例えば、シアニン色素の中には水溶液中でプロトン化を受けて無色化するものがあり、例えば、ベンズイミダカルボシアニン色素類にはこのような性質を有するものが多く存在する。この現象はシアニン色素のメチン鎖炭素上にプロトン化が起こった結果として色素共役系が切断され、無色化したものと考えられる。この場合、シアニン色素は系のプロトン濃度に依存して本来の色素の状態とプロトン化され無色化した状態の平衡にあるものと考えられる。
【００２７】
本発明の方法に好適に用いられる化合物は多重鎖核酸と相互作用可能な色素化合物であって、以下の特徴を有する化合物である。
(c)多重鎖核酸の非存在下において水溶液中では非プロトン化状態で実質的に無蛍光性であり、
(d)多重鎖核酸の非存在下において、少なくとも１つの条件下では水溶液中でプロトン化状態において実質的に無色かつ実質的に無蛍光性の状態で存在することができ、及び
(e)上記(d)の条件下において多重鎖核酸を存在させた場合に、多重鎖核酸との相互作用によって実質的に有色に変化し、かつ該相互作用によって実質的に蛍光性を発現する。
【００２８】
いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、本発明の好ましい態様の原理は、プロトン化により無色化した色素化合物が多重鎖核酸と相互作用し、多重鎖核酸から受け取った相互作用エネルギーによって本来の色素の状態（色素共役系の回復）へと平衡が移動して有色化すること、及び多重鎖核酸が存在しない場合には実質的に無色の状態が保持されることに基づいている。反応系内に１本鎖核酸が存在しても色素と一本鎖核酸との相互作用エネルギーは小さいために実質的に無色の状態が保持されるが、一方、色素と多重鎖核酸との相互作用は十分に大きく、無色化された色素は多重鎖核酸との相互作用により有色の色素へと変化する。その結果、色素に光吸収が起こり蛍光性を発現させることが可能になる。
【００２９】
本発明の好ましい態様として、下記の工程：
(1)下記一般式（Ｉ）における化合物（Ｂ）を多重鎖核酸と接触させる工程、及び
(2)化合物（Ｂ）と多重鎖核酸との相互作用により生成した化合物（Ｃ）の蛍光を測定する工程
を含む方法を例示することができる。
【化７】

式中、双方向の矢印は化学平衡を示し；
化合物（Ａ）は実質的に無蛍光性の化合物を示し；
化合物（Ｂ）は、少なくとも１つの条件下では、実質的に無蛍光性であり、４００〜１０００ｎｍに吸収極大を有さない化合物を示し；
化合物（Ｃ）は、上記の条件下において、化合物（Ｂ）と多重鎖核酸との相互作用により生成し、４００〜１０００ｎｍに吸収極大を有し、かつ上記相互作用によって実質的に蛍光性を発現する化合物を示し；
Ｘは−Ｃ（Ｒ）＝Ｙに結合して色素分子を形成するのに必要な原子団を示し；ＹはＸ−Ｃ（Ｒ）＝と結合して色素分子を形成するのに必要な原子団を示し；Ｒは水素原子又は置換基を示し、Ｘ及び／又はＹと結合して環を形成してもよく；Ｙ’は化合物（Ａ）におけるＣ＝Ｙの二重結合がプロトン化されるように電子の移動を起こした結果として標記される残基を示し；Ｚは酸ＨＺの共役塩基を示し、Ｘ、Ｙ（若しくはＹ’）、又はＲに結合していてもよい。
【００３０】
以下にＸ及びＹにより形成される好ましい基本骨格をそれぞれ（ＤＸ）、（ＤＹ）として列挙するが、本発明の方法に用いられる化合物の範囲はこれらの例に限定されない。（ＤＸ）及び（ＤＹ）で示した構造において、Ａはアルキル基、芳香族基、又は非共有電子対を表し、２つ以上のＡが存在する場合にはそれぞれが同一又は異なっていてもよい（式中、Ａがアルキル基又は芳香族基を表す場合には対イオンやイオン符号は省略して示した）。Ａ’及びＡ”はそれぞれアルキル基又は芳香族基を表す。ｋは０、１又は２の整数を表す。また、水素原子は置換基で置換されていてもよく、可能な場合には縮環構造を形成してもよい。
【００３１】
【化８】

【００３２】
【化９】

【００３３】
【化１０】

【００３４】
【化１１】

【００３５】
多重鎖核酸と相互作用可能な色素化合物であって、(c)多重鎖核酸の非存在下において水溶液中では非プロトン化状態で実質的に無蛍光性であり、(d)多重鎖核酸の非存在下において、少なくとも１つの条件下では水溶液中でプロトン化状態において実質的に無色かつ実質的に無蛍光性の状態で存在することができ、及び(e)上記(d)の条件下において多重鎖核酸を存在させた場合に、多重鎖核酸との相互作用によって実質的に有色に変化し、かつ該相互作用によって実質的に蛍光性を発現する化合物は、下記一般式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、又は（Ｖ）で表される化合物の中から選択されることがより好ましい。
【化１２】

式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³はそれぞれ独立に水素原子又は置換基を表し、Ｒ¹とＲ²及びＲ²とＲ³は可能な場合には互いに結合して環を形成してもよい。Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³が置換基を表す場合、好ましくはハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アシルアミノ基、スルホニルアミノ基、ヘテロ環基、シアノ基、スルホニル基、スルフィニル基、ニトロ基、スルホ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバモイル基、スルファモイル基であり、これらの置換基はさらに置換されていてもよい。これらの置換基の総原子数としては１〜５０が好ましく、１〜３５がより好ましく、１〜２５がさらに好ましい。Ｒ¹とＲ²及びＲ²とＲ³が互いに結合して形成される環は５〜８員環が好ましく、非芳香族又は芳香族の環のいずれであってもよく、炭素環又はヘテロ環のいずれであってもよい。
【００３６】
Ｑは酸素原子、イオウ原子、−Ｎ（Ｒ²⁴）−、又は−Ｃ(Ｒ²⁴)(Ｒ²⁵)−を表す。Ｒ²⁴及びＲ²⁵はそれぞれ独立にアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を表す。Ｒ²⁴とＲ²⁵は互いに結合して３〜８員の環を形成してもよい。Ｒ²⁴及びＲ²⁵が示すアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基はさらに置換されていてもよく、総原子数としては３〜５０が好ましく、３〜３５がより好ましく、３〜２５がさらに好ましい。Ｑとしては酸素原子又はイオウ原子が好ましく、イオウ原子が最も好ましい。Ｒ⁶はアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を表し、これらの置換基はさらに置換されていてもよく、総原子数としては４〜５０が好ましく、４〜３５がより好ましく、４〜２５がさらに好ましい。Ｒ⁶は可能な場合にはＲ¹、Ｒ³、Ｇ、又はＶ₂と結合して環を形成してもよい。
【００３７】
Ｒ⁷、Ｒ⁸、及びＲ⁹は水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ハロゲン原子、−ＯＲ¹⁰、−ＳＲ¹¹、又は−Ｎ(Ｒ¹²)(Ｒ¹³)を示す。Ｒ⁷とＲ⁸、Ｒ⁸とＲ⁹及びＲ⁷とＲ⁹は互いに結合して環を形成してもよく、形成される環は５〜８員環であることが好ましい。Ｒ⁷、Ｒ⁸、及びＲ⁹としては水素原子、アルキル基、又はアリール基が好ましく、水素原子又はアルキル基がより好ましい。Ｒ⁷、Ｒ⁸、及びＲ⁹が水素原子以外の場合はこれらの基はさらに置換基を有していてもよく、総原子数としては１〜３５が好ましく、１〜２５がより好ましく、１〜２０がさらに好ましい。Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹、Ｒ¹²、及びＲ¹³はそれぞれ独立にアルキル基、アリール基、アシル基、スルホニル基、又はヘテロ環基を表す。Ｒ¹²とＲ¹³は互いに結合して環を形成してもよく、形成される環は５〜８員環であることが好ましい。Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹、Ｒ¹²、及びＲ¹³が示すこれらの基はさらに置換されていてもよく、総原子数としては４〜５０が好ましく、４〜３５がより好ましく、４〜２５がさらに好ましい。
【００３８】
ｎは０、１、２又は３の整数を表す。ｎが２以上のときには、繰り返し単位におけるそれぞれのＲ⁸又はそれぞれのＲ⁹は同一又は異なっていてもよい。Ｖ₁及びＶ₂はそれぞれ独立に−ＣＲ⁵＝又は窒素原子を表し、ｍは０又は１を表す。Ｇは５又は６員環含窒素ヘテロ環を形成するのに必要な原子群を表すが、該ヘテロ環はさらに縮合環を有していてもよい。形成される環は５〜８員環であることが好ましい。Ｒ⁵は水素原子又は置換基を表すが、Ｒ⁵が置換基の場合には置換基の例としてはＲ¹、Ｒ²、及びＲ³の例として挙げたものが好ましく、この置換基はさらに置換基を有していてもよく、総原子数としては１〜５０が好ましく、１〜３５がより好ましく、１〜２５がさらに好ましい。
【００３９】
上記の化合物には、核酸との相互作用を強めるためにいずれかの置換基中に１個以上のカチオン性基を有することが好ましい。「カチオン性基」の用語は、カチオンの他にプロトン化によってカチオンになりうるものを含む概念として用いる。カチオン性基の例としては、スルホニウム基、ホスホニウム基、アミノ基、又はアンモニウム基を挙げることができ、アミノ基又はアンモニウム基が最も好ましい。結合位置として好ましいのは、一般式（ＶＩ）ないし（ＩＸ）のＲ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、Ｒ¹⁶、Ｒ¹⁷、又はＲ⁶である。
【００４０】
多重鎖核酸との接触によって蛍光性を発現する化合物の好ましい例として、下記一般式（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）で表される化合物を挙げることができる。
【００４１】
【化１３】

【００４２】
式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁶、Ｑ、及びｎは一般式（ＩＩ）〜（Ｖ）のものと同義である。Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、Ｒ¹⁶、及びＲ¹⁷はそれぞれ水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アシルアミノ基、スルホニルアミノ基、ヘテロ環基、シアノ基、スルホニル基、スルフィニル基、ニトロ基、スルホ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバモイル基、スルファモイル基、及びメルカプト基からなる群から選ばれる置換基を表す。これらの置換基はさらに置換されていてもよく、総原子数としては１〜５０が好ましく、１〜３５がより好ましく、１〜２５がさらに好ましい。Ｒ¹⁴とＲ¹⁵及びＲ¹⁶とＲ¹⁷は互いに結合して５〜８員の環を形成してもよい。形成される環は非芳香族又は芳香族のいずれであってもよく、炭素環又はヘテロ環のいずれであってもよいが、芳香族環であることがより好ましい。
【００４３】
以下、本発明の方法に好適に用いられる化合物の具体例を挙げるが、本発明の方法はこれらの化合物を用いる場合に限定されることはない。
【００４４】
【化１４】

【００４５】
【化１５】

【００４６】
【化１６】

【００４７】
【化１７】

【００４８】
【化１８】

【００４９】
【化１９】

【００５０】
【化２０】

【００５１】
上記化合物は一般にシアニン色素の中の色素塩基として分類されるが、当業界においては一般的な合成法が既知であり、当業者が容易に合成することができる。例えば、米国特許第５，６５６，４４９号、同第５，６５８、７５１号に記載されている方法が好ましく適用可能である。例えば、一般式（ＶＩ）ないし（ＩＸ）で表される化合物においてｎが０であるか１以上であるかによって下記に説明する合成法を採用することにより目的物を容易に製造することが可能である。
【００５２】
＜ｎ＝０の場合＞
メソッド１の目的物は一般式（ＶＩＩ）に相当するものであり、一般式（ＩＸ）に関してもまったく同様の反応が適用できる。式中、Ｐｒｏｔ．は脱保護可能なアルキル基を表し、米国特許第５，６５６，４４９号に記載されているメトキシエトキシメチル基の他にメチルチオメチル基、４−メトキシベンジル基なども使用することができる。色素化反応はジクロロメタンやジメチルホルムアミドなどの非プロトン性溶媒中でトリエチルアミンなどの塩基を用いて行うことができる。色素化反応の後の脱保護反応は用いたＰｒｏｔ．により異なるが、メトキシエトキシメチル基、４−メトキシベンジル基などの場合には酸性で、また４−メトキシベンジル基の場合には酸化的な条件でも脱保護可能である。詳しくは「Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition」Theodora W. Greene, Peter G. M. Wuts（Ｗｉｌｅｙ、１９９９年刊）を参考にすることができる。
【００５３】
メソッド２の目的物は一般式（ＶＩ）に相当するものであり、一般式（ＶＩＩＩ）に関してもまったく同様の反応が適用できる。式中、Ｌは離脱可能な基を表し、ハロゲン原子、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルコキシ基、アリールオキシ基などが好ましく用いられるが、一般的にはアルキルチオ基が用いられる。色素化の反応は米国特許第５，６５６，４４９号に具体的な例が示されているように、ｐ−トルエンスルホン酸などの酸を触媒として用い、ジメチルホルムアミドなどの非プロトン性極性溶媒中、無水酢酸を作用させて合成することができる。
【００５４】
【化２１】

Ｑ＝イオウ原子の場合には、色素の原料となる２−アルキルチオチアゾロピリジン類を合成するために、例えばヘテロサイクルズ（Heterocycles）、１９９３年、１３３頁に記載されているように、対応するチアゾロピリジン−２−チオン類に対し、ジメチルホルムアミド中、炭酸カリウムなどの塩基の存在下でヨウ化メチルを作用させることができる。チアゾロピリジン−２−チオン骨格を合成するためには、２−アミノピリジン類を原料とする以下に挙げた二つの合成ルートを適宜選択することが可能である。
【００５５】
第一の方法として、アミノ基のオルト位が臭素化もしくは塩素化されたアミノピリジン類を１−メチル−２−ピロリドン中、エチルキサントゲン酸カリウムと加熱条件下（１６０〜１７０℃）にて反応させることでチアゾロピリジン−２−チオン類が得られる。またヘテロサイクルズ（Heterocycles）、１９９３年、１３３頁に記載されているように、ピリジン−２−オン類を原料として用い、これを位置選択的に臭素化した後、オキシ塩化リン、アンモニア水を続けて反応させることにより２−アミノ−３−ブロモピリジン類を合成することも可能である。
【００５６】
第二の方法では、ジャーナル・オブ・メディシナルケミストリー（J. Med. Chem.）、１９６７年、１２６頁に記載されているように、まず２−アミノピリジン類に対し、臭素の存在下、チオシアン酸カリウムを反応させることにより２−アミノチアゾロピリジン類を合成する。得られた２−アミノチアゾロピリジン類を常法に従い亜硝酸ナトリウムを作用させてジアゾニウム塩とした後、塩化銅（Ｉ）と反応させることで対応する２−クロロチアゾロピリジンを合成する。さらに２−クロロチアゾロピリジンに対しチオ尿素を反応させ、加水分解することにより目的とするチアゾロピリジン−２−チオン類が得られる。
【００５７】
チアゾロピリジン−２−チオン骨格を合成するための以上の方法は、いずれもアミノピリジン類又はピリジン−２−オン類を原料として用いることができるが、それらに限定されることはなく、アミノキノリン類（具体例としてはケミッシェ・ベリヒテ（Chem. Ber.）、１９５９年、８６９頁に記載）やアミノイソキノリン類（具体例としてはカナディアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Can. J. Chem.）、１９６６年、２４６５頁に記載）、その他のヘテロ原子を含む縮環系化合物（具体例としてはジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、１９９５年、２５４６頁に記載）へも適用可能である。以上の合成工程の出発原料である２−アミノピリジン類のＲ¹、Ｒ²、Ｒ³には種々の置換基を導入することが可能であり、これにより本発明の方法に使用可能な化合物の製造中間体であるチアゾロピリジン−２−チオンへと誘導することができる。
【００５８】
アミノピリジン類の類縁体については、アミノ基のオルト位が臭素化もしくは塩素化されたアミノピリジン類は市販の試薬も数多くあるが、アミノピリジン類をハロゲン化することで容易に合成することができる。アミノピリジン類の臭素化はシンセシス（Synthesis）、２００１年、２１７５頁に詳しく述べられており、２−アミノ体からは３−ブロモ及び３，５−ジブロモ体、３−アミノ体からは２−ブロモ及び２，６−ジブロモ体、４−アミノ体からは３−ブロモ及び３，５−ジブロモ体をそれぞれ反応条件を変えることにより選択的に合成可能である。２−アミノピリジンの塩素化では文献（Zh. Russ. Fiz.-Khim. O-va、１９２８年、６８５頁）に記載のように、塩素を作用させることにより３−クロロ体及び３,５−ジクロロ体が得られる。２−アミノピリジンのヨウ素化では、テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Lett.）、１９９３年、７４９３頁に記載されているようにヨウ素及び過ヨウ素酸を作用させることにより、５−ヨード体が得られる。
【００５９】
Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³のいずれかがハロゲンの場合、置換反応によってさらに誘導体へと変換することができる。Ｒ¹、Ｒ²、又はＲ³が塩素原子の場合、オーストラリアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Aust. J. Chem.）、１９８２年、２０２５頁に記載のように、ナトリウムメトキシドと反応させることによりメトキシ基へと変換できる。また、Recl. Trav. Chim. Pays-Bas、１９５６年、１１８７頁に記載のように、ナトリウムエトキシドと反応させることによりエトキシ基へと変換できる。Org. Prep. Proced. Int.、１９９７年、１１７頁に記載のように、３規定水酸化ナトリウム水溶液と反応させることにより水酸基へと変換できる。
Ｒ¹、Ｒ²、又はＲ³が臭素原子の場合、Bull. Chim. Soc. Fr.、１９９５年、２９０頁に記載のように、ｔ−ブトキシカリウム及びヨウ化カリウムの存在下、２−メルカプトピリジンと反応させることにより２−ピリジルチオ基へと変換できる。Chem.Zentralbl.、１９３６年、１２１９頁に記載のように、硫酸銅の存在下、メチルアミンと反応させることによりメチルアミノ基へと変換することができる。ジャーナル・オブ・オルガノメタリック・ケミストリー（J. Organomet. Chem.）、１９９５年、２５９頁に記載のように、パラジウム触媒の存在下、ビニンルベンゼンと反応させることにより２−アミノ−５−スチリルピリジンへと変換することができる。
【００６０】
Ｒ¹、Ｒ²、又はＲ³がヨウ素原子の場合、オーストラリアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Aust. J. Chem.）、１９９２年、８７７頁に記載のように、水酸化ナトリウム水溶液中、銅紛の存在下、メタンチオールと反応させることによりメチルチオ基へと変換できる。また、オーストラリアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Aust. J. Chem.）、１９９２年、８７７頁に記載のように、水酸化ナトリウム水溶液中、銅紛の存在下、プロパンチオールと反応させることによりプロピルチオ基へと変換できる。ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc）、１９４４年、１４７９頁に記載のように、シアン化銅と反応させることによりシアノ基へと変換することができる。ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、１９９７年、３１０９頁に記載のように、ナトリウム及び銅の存在下、メタノールと反応させることによりメトキシ基へと変換することができる。ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、１９８１年、１５１８頁に記載のように、ナトリウムエチキシド及び銅の存在下、１−プロパノールと反応させることにより１−プロポキシ基へと変換することができる。
【００６１】
Ｒ¹、Ｒ²、又はＲ³がハロゲンの場合は、遷移金属触媒を用いるカップリング反応を利用することによりさらに広い範囲の置換基へと変換することができる。例えばヘテロサイクルズ（Heterocycles）、１９８７年、２７１１頁にあるように、パラジウム触媒を用いる２−アミノ−５−ブロモピリジンとアリールホウ酸類とのカップリング反応によりアリール化することができる。また、例えばジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、２０００年、６７５頁に記載のようにパラジウム触媒を用いる２−アミノ−６−ブロモピリジンとアリールホウ酸類とのカップリング反応によりアリール化することができ、またジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc）、１９９５年、１２４１６頁にあるように２−アミノ−６−ブロモピリジンとアセチレン類とをパラジウム触媒及び銅試薬の存在下で反応させることにより、対応するアセチレン誘導体を得ることができる。
【００６２】
２−アミノピリジン類への他の官能基導入法としては、２−アミノピリジンを混酸によってニトロ化すると、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc）、１９５５年、３１５４頁に記載のようにニトロ基が導入された２−アミノ−５−ニトロピリジンが得られる。２−アミノピリジンを発煙硫酸又は硫酸/三酸化硫黄で処理すると、(Bull. Soc. Chim. Fr.)、１９３９年、７３６頁に記載のようにスルホ基が導入された６−アミノ−ピリジン−３−スルホン酸が得られる。２−アミノピリジンに塩化ベンジルを作用させると、ポリッシュ・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Pol. J. Chem.）、１９８４年、９５９頁に記載のように２−アミノ−５−ベンジルピリジンが得られる。
【００６３】
Ｒ¹、Ｒ²、又はＲ³がカルボキシル基である場合には、ヘテロ環基へと変換することも可能であり、例えばジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、１９９６年、３３７５頁にあるように６−アミノ−ニコチン酸と２−アミノ−ベンゼンチオールとを反応させることにより２−（２−アミノピリジン−５−イル）ベンゾチアゾールが得られる。他のヘテロ環が結合した２−アミノピリジン誘導体としては、３,４'−ビピリジン−６−アミン（Ｒ¹＝Ｒ³＝Ｈ, Ｒ²＝４−ピリジル）は米国特許第４，２７６，２９３号に合成法が記載されている。２−エチル [３,４−ビピリジン]−６−アミン（Ｒ¹＝Ｈ、Ｒ²＝４−ピリジル、Ｒ³＝エチル）は米国特許第４，３１３、９５１号に合成法が記載されている。
【００６４】
ピリジン−２−オン類への置換基導入法も種々知られている。ピリジン−２−オン類は置換基が導入された後にピリジン−２−オン類を２−アミノピリジン類へと容易に変換可能なことから本発明の方法に使用可能な化合物を合成する上で重要である。ピリジン−２−オンとベンゾフェノン類を反応させるとカルボニル基に対する付加反応が進行し、テトラヘドロン（Tetrahedron）、１９８７年、２３４３頁に記載のようにＲ¹が３級アルコールである付加体が得られる。ピリジン−２−オンにアリールアルデヒド類を反応させると、テトラヘドロン(Tetrahedron)、１９８７年、２３４３頁に記載ようにＲ¹が２級アルコールである付加体が得られる。ピリジン−２−オンに二酸化炭素を反応させると、テトラヘドロン(Tetrahedron)、１９８７年、２３４３頁に記載のようにＲ¹がカルボキシル基となる。ピリジン−２−オンにフェニルイソシアナートを反応させると、テトラヘドロン(Tetrahedron)、１９８７年、２３４３頁に記載のようにＲ¹がアニリド基となる。ピリジン−２−オンにフェニルアセチルクロリドを反応させると、テトラヘドロン(Tetrahedron)、１９８７年、２３４３頁に記載ようにＲ¹がフェニルアセチル基となる。ピリジン−２−オンにヨウ化メチルを反応させると、テトラヘドロン(Tetrahedron)、１９８７年、２３４３頁に記載のようにＲ¹がメチル基となる。ピリジン−２−オンにペルオキソ二硫酸カリウムを反応させると、テトラヘドロン(Tetrahedron)、１９９０年、２８９１頁に記載のようにＲ²が水酸基となる。ピリジン−２−オンに臭化ベンジルを反応させると、ケミストリー・レターズ（Chem. Lett.）、１９９６年、３３３頁に記載のようにＲ²がベンジル基となる。
【００６５】
上記にはピリジン環に対してチアゾール環を閉環する手法を説明したが、チアゾール環を先に構築してから後にピリジン環を形成させる合成ルートも可能であり、以下に示すようにさらに多様な誘導体が合成できる。シアノイミドジチオカルボン酸２カリウムは多くの２−アルキルチオ−４−アミノチアゾール類を与える共通中間体であり、これを増炭させることによりチアゾロピリジン類へと誘導することができる。例えばジャーナル・オブ・ヘテロサイクリック・ケミストリー（J. Heterocyclic Chem.）、１９８４年、１３６１頁に記載されている下記合成ルートにより７−ヒドロキシ−２−メチルチオチアゾロ[４,５−ｂ]ピリジン−６−カルボン酸エステルが得られる。さらに同種の反応を利用することによって、文献（J. Prakt. Chem.、１９７９年、２６０頁）に記載のように７−ヒドロキシチアゾロ[４,５−ｂ]ピリドン類が合成できる。
【００６６】
また、同様にチアゾール環から構築する手法として、アミノアセトニトリルを原料に用い、２−メチルチオチアゾロ[５,４−ｂ]ピリジン類を得ることができる。具体的にはジャーナル・オブ・ヘテロサイクリック・ケミストリー（J. Heterocyclic Chem.）に記載の合成ルートが挙げられる。その他にも、縮環系化合物としてチアゾロナフチリジン骨格を以下のように合成できる。中間体である１，６−ナフチリジノン類の合成はジャーナル・オブ・ヘテロサイクリック・ケミストリー（J. Heterocyclic Chem.）、１９９０年、２０８５頁に記載されており、それらからチアゾロナフチリジン類への誘導はヘテロサイクルズ（Heterocycles）、１９９３年、１３３頁に詳しく記載されている。
【００６７】
Ｑが酸素原子の場合、基本的には３位に水酸基を有する２−アミノピリジンを二硫化炭素やチオホスゲン、あるいはキサントゲン酸カリウムを作用させてオキサゾロピリジン−２−チオンへと変換後、チアゾロピリジン類と同様にアルキル化試薬により２位に結合するイオウ原子をアルキル化する方法が一般的である。２−アルキルチオ−オキサゾロピリジン類は、例えばヘテロサイクルズ（Heterocycles）、１９９３年、１３３頁に記載されているように、対応するオキサゾロピリジン−２−チオン類に対し、ジメチルホルムアミド中、炭酸カリウムなどの塩基の存在下でヨウ化メチルを作用させることにより容易に得られる。 オキサゾロピリジン−２−チオン類を合成するためには、まず３−ヒドロキシピリジン類を混酸によってニトロ化し、続いて得られたニトロ体を還元して２−アミノ−３−ヒドロキシピリジン類を合成する。これらの工程については、例えばファーマシューィカル・ブレティン（Pharm. Bull.）に記載のものが知られている。さらに２−アミノ−３−ヒドロキシピリジン類をケミストリー・オブ・ヘテロサイクリック・コンパウウンド（Chem. Heterocycl. Compd.）、１９８１年、４４１頁に記載されているように、２−アミノ−３−ヒドロキシピリジン類に対し、エタノール中、エチルキサントゲン酸カリウムを作用させることにより、オキサゾロピリジン−２−チオン類が合成される。あるいは、ファーマシューティカル・ブレティン（Pharm.Bull.）、１９５７年、４６２５頁に記載されているように、２−アミノ−３−ヒドロキシピリジン類に対し、水酸化カリウムの含水メタノール溶液中、二硫化炭素を作用させることによっても、オキサゾロピリジン−２−チオン類が合成される。
【００６８】
３−ヒドロキシピリジン類のニトロ化には以下の合成例が知られている。３−ヒドロキシ−４−メチルピリジンのニトロ化については、例えばヘテロサイクルズ(Hetereoctcles.)、１９９４年、５２９頁に記載のものが知られている。３−ヒドロキシ−５−メチルピリジンのニトロ化については、例えばジャーナル・オブ・メデジシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、１９８７年、２０３１頁に記載のものが知られている。３−ヒドロキシ−６−メチルピリジンのニトロ化については、例えばジャーナル・オブ・メデジシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、１９８７年、２０３１頁に記載のものが知られている。また４−ヒドロシキイソキノリンも同様にニトロ化することができ、例えばケミカル・ファーマシューティカル・ブレティン（Chem. Pharm. Bull.）、１９５９年、５０１頁に記載のものが知られている。
【００６９】
３−ヒドロキシピリジン類にアミノ基を導入する方法としては、上述のニトロ基の還元以外にも以下に挙げる手法が知られている。３−ヒドロキシ−２−ヨードピリジン類に硫酸銅の存在下でアンモニアを作用させる方法としては、（Rocz. Chem.）、１９３６年、５０２頁に記載のものが知られている。３−ヒドロキシピリジン類にナトリウムアミドを作用させる方法としては、文献（Zh. Prikl. Khim.、１９４９年、１１０３頁）に記載のものが知られている。３−ヒドロキシピリジン−２−カルボン酸アミドに次亜臭素酸ナトリウムを作用させる方法として文献（Biochem. J.、１９５０年、５０６頁）に記載のものが知られている。３−ヒドロキシ−２−フェニルアゾピリジン類にハイドロサルファイトナトリウムを作用させる方法としては、文献（Prace. Minist. Prizem. Chem.、１９５２年、１４頁）に記載のものが知られている。３−ヒドロキシ−２−クロロピリジン類にヒドラジン水和物を作用させる方法としては、ジャーナル・オブ・メデジシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、１９９４年、２４８頁に記載のものが知られている。
【００７０】
Ｑが−Ｎ（Ｒ²⁴）−の場合には、基本的には３位に置換アミノ基を有する２−アミノピリジン誘導体を二硫化炭素やチオホスゲンを用いてイミダゾロピリジン−２−チオンへと変換後、チアゾロピリジン類と同様に２位のイオウ原子をアルキル化する方法が一般的である。３位に置換アミノ基を有する２−アミノピリジン誘導体を得るには、上記Ｑ＝イオウ原子の場合の置換基導入法が参考にできる。Ｑが−Ｃ(Ｒ²⁴)(Ｒ²⁵)−の場合には、まずピロリノ［２，３−ｂ］ピリジン−２−オン骨格を合成したのちに、３位にＲ²⁴及びＲ²⁵に相当する基を導入してジ置換体とし、さらにローソン試薬などを用いて２位のラクタム酸素原子をイオウ原子に変換することにより、合成することができる。
【００７１】
ｎ≧１の場合の合成方法に関して、メソッド３及びメソッド４の目的物は一般式（ＶＩ）に相当するものであり、一般式（ＶＩＩＩ）に関してもまったく同様の反応が適用できる。メソッド３及び４はいずれの方法も好ましく用いることができ、合成中間体や生成色素の収率や精製のしやすさやに応じて適宜選択することができる。ｎ＝０の場合と異なるのは、原料として用いられるアゾロピリジン類の２位がメチル基になっている点である。２−メチル体の合成法については後述する。
【００７２】
【化２２】

【００７３】
ｎ≧１の場合のメチン炭素鎖伸長は、ｎ＝１のときはＮ，Ｎ’−ジフェニルホルムアミジンを、ｎ≧２の場合にはメチン炭素鎖数に応じてビニル基を追加したビニローグ体を用い、無水酢酸などの酸無水物を作用させて行うことができる。反応温度は室温〜１８０℃程度を選択することができ、溶媒としては無水酢酸等の酸無水物を溶媒にすることができるが、種々の非プロトン性溶媒も好ましく用いることができる。これらの反応は当業界においては極めて一般的な方法である。
【００７４】
色素化の反応はプロトン性、非プロトン性の溶媒を用いることができ、単に加熱することによっても色素化が進行する場合もある。好ましくは非プロトン性溶媒中でトリエチルアミンやピリジン類などの塩基を用いて行うことができ、反応温度は室温から１２０℃程度が好ましい。この反応も当業界において極めて一般的な反応であり、上記以外にも種々の反応条件を用いることができる。
【００７５】
式中Ｐｒｏｔ．は脱保護可能なアルキル基を表し、米国特許第５，６５６，４４９号に記載されているメトキシエトキシメチル基の他にメチルチオメチル基、４−メトキシベンジル基なども使用することができる。色素化反応の後の脱保護反応は用いたＰｒｏｔ．により異なるが、メトキシエトキシメチル基、４−メトキシベンジル基などの場合には酸性で、また４−メトキシベンジル基の場合には酸化的な条件でも脱保護可能である。詳しくは「Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition」Theodora W. Greene, Peter G. M. Wuts（Ｗｉｌｅｙ、１９９９年刊）を参考にすることができる。
【００７６】
メソッド５及びメソッド６の目的物は一般式（ＶＩＩ）に相当するものであり、一般式（ＩＸ）に関してもまったく同様の反応が適用できる。ここに示した反応は基本的にはメソッド３とメソッド４と同じである。
【００７７】
【化２３】

２−メチルアゾロピリジン類の合成については、Ｑが酸素原子又は−Ｎ(Ｒ２４)−の場合には、二硫化炭素やチオホスゲンあるいはキサントゲン酸カリウムを用いてアゾロピリジン−２−チオンへと変換する反応の際に、二硫化炭素やチオホスゲンあるいはキサントゲン酸カリウムの変わりに無水酢酸を用いて加熱する方法、オルト酢酸トリエチルなどのオルト酢酸エステル類とパラトルエンスルホン酸などの酸触媒の存在下に加熱することによって合成することができる。この場合、反応温度は１００〜１７０℃が好ましく、通常、反応試剤を溶媒として用いて行うことが好ましい。
【００７８】
Ｑがイオウ原子の場合にはｎ＝０のときの合成法で述べた中間体、２−アミノ−３−ハロピリジン類をオルト酢酸エステル類とパラトルエンスルホン酸などの酸触媒の存在下に加熱して２−アセチルアミノ−３−ハロピリジン類へと変換し、さらに５硫化リンやＬａｗｅｓｓｏｎ’ｓ試薬などを用いて２−チオアセチルアミノ−３−ハロピリジン類としたのち、水素化ナトリウムやｔ−ブトキシカリウムなどの強塩基を作用させて２−メチルチアゾロピリジン類を得ることができる。強塩基を作用させる場合の溶媒はジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル系溶媒などを用いることができる。Ｑが−Ｃ(Ｒ²⁴)(Ｒ²⁵)−の場合には、特開２００１−２７０８６４号やケミカル・レビュー（Chem. Rev.）６３巻、３７３頁（１９６３年）に記載のフィッシャーのインドール合成反応として知られる反応を利用して合成することができる。
【００７９】
含窒素６員環がピリジン環である化合物については非常に多くの合成法が知られているので、当業者は種々の文献を参照しつつ合成が可能である。また、極めて多くの化合物が市販されており容易に入手可能である。含窒素６員環がキノリン環である場合、合成原料となる４−メチルキノリン（レピジン）類と２−メチルキノリン（キナルジン）類について以下に合成法を示す。レピジン類については市販されている２−クロロレピジンと適当な求核剤とを反応させることにより、レピジンの２位に適当な置換基を導入することができる。２−クロロレピジンに１級アミン、２級アミン、環状アミン、アルコール、チオール、チオ尿素、及びフッ化物などを反応させた例が知られている。
【００８０】
１級アミンとの反応では、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、１９４９年、２３２２頁に記載のものがある。２級アミンとの反応では、例えば薬学雑誌（Yakugaku Zasshi）、１９４９年、１３７頁に記載のものがある。環状アミンとの反応では、例えばシンセティック・コミュニケーション（Synth. Commun.）、２０００年、４４７９頁に記載のもの、あるいはジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Chem.）、１９４９年、７７１頁に記載のものが知られている。アルコールとの反応では、例えばジャスタス・リービッヒ・アナーレン・デア・ケミー（Justus Liebigs Ann. Chem.）、１８８６年、１０２頁に記載のもの、あるいはジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Chem.）、１９５１年、１５２９頁に記載のものが知られている。チオールとの反応では、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、１９４８年、４９１頁に記載のものがある。チオ尿素との反応では、例えばケミッシェ・ベリヒテ（Chem.Ber.）、１９２９年、２７３２頁に記載のものが知られている。フッ化物との反応では、例えばフッ化カリウムとの反応が（J. Chem. Res. Synop.）、１９９８年、５８６頁に記載されており、またテトラブチルアンモニウムフルオリドとの反応が（Mutat. Res.）、２０００年、１７３頁に記載されている。また、パラジウム触媒を用いた２−クロロレピジンとアリールホウ酸類とのカップリング反応によりアリール化することも可能であり、例えばテトラヘドロン（Tetrahedron）、１９９２年、８１１７頁に記載のものが知られている。
【００８１】
アニリン類とα,β−エノン類とを環化反応させることにより、レピジンの２位に置換基を導入することも可能である。２,４−ジメチルキノリンの合成としては、例えばジャスタス・リービッヒ・アナーレン・デア・ケミー（Justus Liebigs Ann. Chem.）、１８８７年、７頁に記載のものが知られている。４−メチル−２−フェニルキノリンの合成としては、例えば（J. Prakt. Chem.）、１９２５年、７３頁に記載のものが知られている。
【００８２】
３位に適当な置換基を有するレピジン類の合成については、３位が塩素もしくは臭素の場合は、ともに３−メチルインドールを原料に用いて合成することができる。塩素の場合は、例えばケミッシェ・ベリヒテ（Chem.Ber.）、１８８７年、２５２頁に記載のものが知られている。臭素の場合は、例えばケミッシェ・ベリヒテ（Chem.Ber.）、１８８７年、２６１３頁に記載のものが知られている。上記で得られたハロゲン体はさらに他の置換基への変換が可能である。例えばパラジウム触媒及び塩基の存在下、フェニルホウ酸とカップリングさせることによりアリール化体が合成できる。具体例としてはテトラヘドロン（Tetrahedron）、１９９２年、８１１７頁に記載のものが知られている。また、アニリン類とα,β−エノン類とを環化反応させることにより、レピジンの３位に置換基を導入することも可能である。具体例を以下に示す。２,４−ジメチルキノリンの合成としては、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Chem.）、１９５７年、２７８２頁に記載のものが知られている。
【００８３】
６位に適当な置換基を有するレピジン類は、パラ置換アニリン類と３−ブテン−２−オン類もしくはその合成等価体との環化反応によって容易に合成される。４−フルオロアニリンとの反応では、例えば文献（Mutat. Res.、２０００年、１７３頁）に記載のものが知られている。４−クロロアニリンとの反応では、例えばジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Chem.）、１９５７年、６８２頁に記載のものが知られている。４−ブロモアニリンとの反応では、例えばテトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Lett.）、２０００年、５３１頁に記載のものが知られている。４−メトキシアニリンとの反応では、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、１９４５年、８６頁に記載のものが知られている。４−メチルアニリンとの反応では、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、１９２０年、２３９７頁に記載のものが知られている。４−ジメチルアミノアニリンとの反応では、例えば文献（Bull. Chim. Soc. Fr.、１９２０年、４３４頁）に記載のものが知られている。４−ニトロアニリンとの反応では、例えばジャスタス・リービッヒ・アナーレン・デア・ケミー（Justus Liebigs Ann. Chem.）、１９４８年、１７４頁に記載のものが知られている。４−ベンゾチアゾ−２−イル−アニリンとの反応では、例えば文献（Sog. Prog. Chem.、１９７７年、６２頁）に記載のものが知られている。４−ベンゾヂフェニルホスホノイルアニリンとの反応では、例えばケミストリー・オブ・ヘテロサイクリック・コンパウンド（Chem. Heterocycl. Compd.）、１９８２年、３１５頁に記載のものが知られている。４−アセチルアニリンとの反応では、例えばケミストリー・オブ・ヘテロサイクリック・コンパウンド（Chem. Heterocycl. Compd.）、１９８４年、７６７頁に記載のものが知られている。４−ジエチルスルファミドアニリンとの反応では、例えばケミストリー・オブ・ヘテロサイクリック・コンパウンド（Chem. Heterocycl. Compd.）、１９８４年、７６７頁に記載のものが知られている。
【００８４】
以上の反応で得られるキノリン類をさらに変換することも可能である。６−ブロモ−４−メチルキノリンはパラジウム触媒及び塩基の存在下でホスホン酸ジエステルとのカップリング反応を行うことでホスホン酸誘導体が得られる。具体的には文献（Zh. Obshch. Khim.、１９８６年、２５０３頁）に記載のものが知られている。６−アミノ−４−メチルキノリンを合成するためには、４−ニトロアニリンを原料に用いて合成した４−メチル−６−ニトロキノリンを還元すればよく、例えばジャスタス・リービッヒ・アナーレン・デア・ケミー（Justus Liebigs Ann. Chem.）、１９４８年、１７４頁に記載のものが知られている。
【００８５】
４−メチル−キノリン−６−カルボン酸を合成するためには、４−メチルアニリンを原料に用いて合成した４,６−ジメチルアニリンを酸化すればよく、例えばケミッシェ・ベリヒテ（Chem. Ber.）、１８９０年、２２６５頁に記載のものが知られている。６−（２−ベンゾオオキサゾリル）−４−メチル−キノリンを合成するためには、４−メチル−キノリン−６−カルボン酸に２−アミノフェノールを反応させればよく、例えばジャーナル・オブ・ヘテロサイクリック・ケミストリー（J. Heterocycl. Chem.）、１９７７年、９３７頁に記載のものが知られている。同様に６−（２−ベンゾチアゾリル）−４−メチル−キノリンを合成するためには、４−メチル−キノリン−６−カルボン酸に２−アミノベンゼンチオールを反応させ、４−メチル−６−（２−オキサゾロ[４,５−ｂ]ピリジル）−キノリンを合成するためには、４−メチル−キノリン−６−カルボン酸に２−アミノ−３−ヒドロキシピリジンを反応させ、６−[２−（１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｂ]ピリジル）]−４−メチル−キノリンを合成するためには、４−メチル−キノリン−６−カルボン酸に２,３−ジアミノ−ピリジンを反応させ、６−[２−（１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]ピリジル）]−４−メチル−キノリンを合成するためには、４−メチル−キノリン−６−カルボン酸に３,４−ジアミノ−ピリジンを反応させればよく、これらもすべてジャーナル・オブ・ヘテロサイクリック・ケミストリー（J. Heterocycl. Chem.）、１９７７年、９３７頁に記載のものが知られている。４−メチル−キノリン−６−スルホン酸を合成するためには、４−メチルキノリンを硫酸と反応させればよく、例えばケミッシェ・ベリヒテ（Chem. Ber.）、１８９０年、２６８０頁に記載のものが知られている。
【００８６】
７位に適当な置換基を有するレピジン類は、メタ置換アニリン類と３−ブテン−２−オンもしくはその合成等価体との環化反応によって容易に合成される。３−フルオロアニリンとの反応では、例えば（Mutat. Res.）、２０００年、１７３頁に記載のものが知られている。３−クロロアニリンとの反応では、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、１９４６年、１８５１頁に記載のものが知られている。３−メチルアニリンとの反応では、例えばジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Chem.）、１９５７年、６８２頁に記載のものが知られている。３−アミノフェノールとの反応では、例えばテトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Lett.）、２０００年、５３１頁に記載のものが知られている。
【００８７】
８位に適当な置換基を有するレピジン類は、オルト置換アニリン類と３−ブテン−２−オンもしくはその合成等価体との環化反応によって容易に合成される。２−メトキシアニリンとの反応では、例えば特許ＤＥ ５１８２９１に記載のものが知られている。o−トルイジンとの反応では、例えばジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Chem.）、１９５７年、６８２頁に記載のものが知られている。２−アミノフェノールとの反応では、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、１９４９年、３９８６頁に記載のものが知られている。２−ニトロアニリンとの反応では、例えば日本化学雑誌、１９５８年、４０８頁に記載のものが知られている。またレピジンを混酸で処理することによっても４−メチル−８−ニトロキノリンが得られ、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、１９４７年、３８０頁に記載のものが知られている。２−エチルアニリンとの反応では、例えばテロラヘドロン・アシンメトリー（Tetrahedron Asymmetry）、１９９５年、４１９頁に記載のものが知られている。２−アミノ安息香酸エチルとの反応では、例えば特許ＤＥ ５１８２９１に記載のものが知られており４−メチルキノリン−８−カルボン酸が得られる。４−メチルキノリン−８−カルボン酸は、８位のカルボキシル基をさらに変換することが可能であり、８−（２−ベンゾオキサゾリル）−４−メチルキノリンを合成するためには２−アミノフェノールを反応させ、また８−（２−ベンゾチアゾリル）−４−メチルキノリンを合成するためには２−アミノベンゼンチオールを反応させればよく、例えばジャーナル・オブ・ヘテロサイクリック・ケミストリー（J. Heterocycl. Chem.）、１９７９年、１５７９頁に記載のものが知られている。４−メチル−８−アミノキノリンを合成するためには、４−メチル−８−ニトロキノリンを還元すればよく、例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、１９４６年、１５２４頁に記載のものが知られている。以上の説明はレピジンのモノ置換体の合成について記載したが、より多置換のものを望む場合は、これらの反応を組み合わせることで目的物を合成することができる。
【００８８】
本発明の方法の代表的な実施形態としては以下の（１）及び（２）の２つが挙げられる。
（１）溶液中の多重鎖核酸の測定を行う。
（２）ＤＮＡアレイ形態において、固相担体上のハイブリダイゼーションが起こったスポット（遺伝子）の測定を行う。
本明細書において「測定」という用語は、検出及び定量などを含めて最も広義に解釈しなければならず、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。上記のうち、溶液中の多重鎖核酸核酸の検出及び定量を行う態様は、単に試料溶液中の多重鎖核酸の測定を行う用途の他に、ＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）で代表される核酸増幅法を用いた試料核酸中の標的核酸配列測定方法としても極めて有効であり、本発明の光学的測定方法を好ましく適用できる。
【００８９】
溶液中の多重鎖核酸を測定する場合に、上記の化合物の好ましい濃度は検出対象の多重鎖核酸の濃度によっても異なるが、通常１×１０^-10モル／Ｌないし１×１０^-3モル／Ｌであり、さらに好ましくは１×１０^-9モル／Ｌないし１×１０^-4モル／Ｌであり、５×１０^-8モル／Ｌないし１×１０^-5モル／Ｌが最も好ましい。多重鎖核酸と上記化合物を接触させためには、一般的には、試料核酸の溶液と本発明の化合物の溶液を混合すればよいが、試料核酸の溶液に上記化合物を固体として添加してもよいし、他の媒体に本発明の化合物を吸着させて試料核酸溶液に混合してもよい。上記化合物を多重鎖核酸と接触させて光学的な測定を行う際に、検出用セルを光学的測定を行いながら多重鎖核酸と接触させてもよいし、多重鎖核酸と接触させた後に光学的な検出を行ってもよい。好ましくは多重鎖核酸と上記化合物を接触させた後、０．０１秒〜１０００秒の間に検出を行うことが好ましく、０．１秒〜６００秒の間に検出を行うことが好ましい。
【００９０】
測定を行う際の溶液のｐＨは２．０ないし１０．０が好ましく、３．０ないし９．０がより好ましく、４．０ないし８．０が最も好ましい。ｐＨを調節するために、緩衝液を用いることも好ましい。緩衝液としては「蛋白質・酵素の基礎実験法」（堀尾式一編、南江堂（１９９４年刊））などに詳しく記載されているが、フタル酸水素カリウム−塩酸緩衝液、クエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、コハク酸−水酸化ナトリウム緩衝液、マレイン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液、イミダゾール−塩酸緩衝液、トリエタノールアミン・塩酸−水酸化ナトリウム緩衝液、Ｎ−エチルモルホリン−塩酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシルグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ジエタノールアミン−塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ブリトン−ロビンソン広域緩衝液、ＧＴＡ広域緩衝液などを好ましく用いることができる。緩衝液の濃度は０．１ｍＭないし５００ｍＭが好ましく、０．５ｍＭないし２００ｍＭがより好ましく、１ｍＭないし５０ｍＭがさらに好ましい。プロトン化により無色化する化合物を測定に用いる場合には、プロトン化が生じるｐＨ以下に調整することが好ましい。測定を行う際の溶液は水溶液が好ましく用いられるが、さらにメタノール、エタノール、エチレングリコール、グリセリン又はジエチレングリコールなどのアルコール類やジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド又はスルホランなどの水混和性溶媒も混合して用いることができる。
【００９１】
光学的測定は蛍光検出法が感度の点で好ましい。通常は蛍光光度計で測定することができ、溶液に励起光を通過させて直角方向から蛍光を測定する方法を用いることが好ましいが、反射光を測定するような方法を用いてもよい。また、試料溶液を固相担体上に展開又はスポットしたのちに、乾燥して、あるいは乾燥せずに蛍光レーザースキャナーやＣＣＤ（電荷結合素子）などで測定する方法を採用してもよい。また、測定は１試料ごとに行ってもよいし、９６穴や３８４穴マイクロプレートなどを用いて多数の試料を同時に測定してもよい。
【００９２】
上記（２）のＤＮＡアレイ形態においては、固相担体上のハイブリダイゼーションが起こったスポット（遺伝子）の測定に本発明の方法を好ましく適用することができる。この場合、プローブ核酸は溶液中に存在していてもよいが、固相担体に固定されている方が好ましい。固相担体としては、その表面に凹凸を有する平面性の低いものであってもよい。固相担体の材質は特に限定されないが、例えば、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース類、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織捕物、不織布、減紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物質などを拳げることができる。また、形状としては平板状、球状、ファイバー状、又は棒状等を例示することができるが、特に限定されることはない。固相担体の大きさも特に限定されず、ｎｍオーダーのものからｃｍオーダーのものであってもよい。多孔質物質の細孔の大きさは、２〜１０００ｎｍの範囲にあることが好ましく、２〜５００ｎｍの範囲にあることが特に好ましい。平板プレート状の場合、固相担体の厚さは、１００〜２０００μｍの範囲にあることが好ましい。
【００９３】
固相担体上へのプローブ核酸の固定化法は、核酸断片の種類及び基板の種類に応じて適当な方法を選択することができる（蛋白質・核酸・酵素，Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．１３，２００４−２０１１（１９９８））。例えば、核酸断片がｃＤＮＡやＰＣＲ産物の場合には、ＤＮＡの荷電を利用して、ポリリシン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミン等の陽イオンで表面処理した基板に静電結合させる方法を用いることができる。結合をより強固にするために紫外線を照射する方法も用いることができる。表面処理された基板上に、さらに電荷を有する親水性の高分子物質等からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。また、基板によっては、その基板中に親水性の高分子等を含ませることも可能であり、このような処理を施した基板も好ましく用いることができる。表面処理を行うことによって、疎水性、あるいは親水性に乏しい基板と核酸断片との静電的な相互作用を促進することができる。基板としては、表面処理の容易さと解析の容易さのため、スライドガラスを用いることが好ましい。
【００９４】
合成ヌクレオチドを固定する場合には、基板上で直接合成する方法、あるいは予め末端に共有結合のための官能基を導入したオリゴマーを合成し、表面処理した基板に共有結合させる方法を用いることができる。官能基としてはアミノ基、アルデヒド基、メルカプト基、ビオチン等を挙げることができる。特開２００１−２２８１５２号に記載の方法も好ましく用いることができる。基板としては、ガラスやシリコンを用いることが好ましく、ガラスやシリコンの表面処理には公知のシランカップリング剤を用いることが好ましい。基板上に固定される核酸断片は、後述する検出対象の試料核酸断片であってもよい。以下、基板に固定される核酸断片を塩基配列が既知の核酸断片とし、核酸分析素子に接触させる核酸断片を試料核酸断片として説明する。
【００９５】
ＤＮＡ断片の種類は目的によって二通りに分けることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデータベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以下、「ＰＣＲ産物」という。）。ＰＣＲ法によって増幅しないものも好ましく使用することができる。また、遺伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さらに、塩基配列分析の場合には、４ⁿ（ｎは、塩基の長さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用することが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩基配列決定法によって予めその配列が決定されていることが好ましい。ＤＮＡ断片は、２〜１００量体であることが好ましく、２０〜８０量体であることが特に好ましい。
【００９６】
ＤＮＡ断片の点着は、ＤＮＡ断片を水性媒体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した水性液をスポッター装置等を用いて固相担体表面上に滴下して行うことが好ましい。点着後のＤＮＡ断片の乾燥を防ぐために、ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液中に、高沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質としては、ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液に溶解し得るものであって、試料核酸断片とのハイブリダイゼーションを妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物質であることが好ましい。このような物質としては、グリセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド及び低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げることができる。ポリマーの分子量は１0³〜１０⁵の範囲にあることが好ましい。高沸点の物質としては、グリセリンあるいはエチレングリコールを用いることがさらに好ましく、グリセリンを用いることが特に好ましい。高沸点の物質の濃度は、ＤＮＡ断片の水性液中、０．１〜２容量％の範囲にあることが好ましく、０．５〜１容量％の範囲にあることが特に好ましい。また、同じ目的のために、ＤＮＡ断片を点着した後の固相担体を、９０％以上の湿度及び２５〜５０℃の温度範囲の環境に置くことも好ましい。
【００９７】
ＤＮＡ断片を点着後、紫外線、水素化ホウ素ナトリウムあるいはシッフ試薬による後処理を施してもよい。これらの後処理は、複数の種類を組み合わせて行ってもよく、加熱処理と紫外線処理を組み合わせて行うことが特に好ましい。点着後は、インキュベーションを行うことも好ましい。インキュベート後、未点着のＤＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。
【００９８】
ＤＮＡ断片は、固相担体表面に対して、１０²〜１０⁵種類／ｃｍ²の範囲にあることが好ましい。ＤＮＡ断片の量は、１乃至１０^-15モルの範囲にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。点着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、固相担体表面にドットの形状で固定される。ドットの形状は、ほとんど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要である。ドット間の距離は、０〜１．５ｍｍの範囲にあることが好ましく、１００〜３００μｍの範囲にあることが特に好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５０〜３００μｍの範囲にあることが好ましい。点着する量は、１００ｐＬ〜１μＬの範囲にあることが好ましく、１ｎＬ〜１００ｎＬの範囲にあることが特に好ましい。
【００９９】
上記の工程によって作製されたＤＮＡチップの寿命は、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡチップで数週間、オリゴＤＮＡが固定されてなるオリゴＤＮＡチップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチップは、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多型解析等に利用される。検出原理は、本発明の原理に基づく非標識核酸の光学的検出法である。
【０１００】
本発明の方法を行うにあたっては、他の核酸標織方法と併用して行うことができる。他の標識法としてはＲＩ法と非ＲＩ法（蛍光法、ビオチン法、化学発光法等）とが知られているが、本発明の方法はいずれの方法とも併用することができる。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）を使用することができる。
【０１０１】
試料核酸断片としては、その配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ断片試料を用いることが好ましい。試料核酸断片は、遺伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが好ましい。試料がゲノムの場合には、赤血球を除く任意の組織、サンプルから単離することが好ましい。赤血球を除く任意の組織は、抹消血液りンパ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。試料がｍＲＮＡの場合には、ｍＲＮＡが発現される組織サンプルから抽出することが好ましい。本発明の方法ではｍＲＮＡを直接検出することも可能であるが、逆転写反応により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味する。）を取り込ませて標識ｃＤＮＡを用いることもできる。この場合、ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性のため、ｄＣＴＰを用いることが好ましい。１回のハイブリダイゼーションに必要なｍＲＮＡの量は液量や標識方法によって異なるが、数μｇ以下であることが好ましい。なお、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、試料核酸断片は低分子化しておくことが望ましい。原核生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なため、全ＲＮＡを標識することが好ましい。試料核酸断片は、遺伝子の変異や多型を調べる目的では、適切なプライマー存在下で標的領域のＰＣＲを行って得ることもできる。
【０１０２】
ハイブリダイゼーションは、試料核酸断片を溶解あるいは分散させた水性液を上記で作製したＤＮＡチップ上に展開することによって行うことが好ましい。展開の量は特に限定されないが、通常は１〜１００μＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイゼーションは、例えば、室温〜７０℃の温度範囲で１〜２０時間の範囲で行うことが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝被、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝被、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。ハイブリダイゼーションと同時に上記化合物をハイブリッド多重鎖核酸と接触させて相互作用させる方法を採用する場合には、上記と同じような方法で洗浄を行ってもよいが、特に洗浄を行わずにそのまま光学的測定を行うことも可能であり、そのような態様は好まし方法である。
【０１０３】
ＤＮＡアレイを用いるハイブリダイゼーションの特徴は、試料核酸断片の使用量が非常に少ないことである。そのため、固相担体に固定するＤＮＡ断片の鎖長や試料核酸断片の種類により、ハイブリダイゼーションの最適条件を設定する必要がある。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。一塩基変異の検出には、短時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。
【０１０４】
上記化合物をハイブリッド多重鎖核酸に対して接触させる時の溶媒は特に限定されないが、通常は水又は各種緩衝液のほか、水に混和しうる有機溶媒を適宜用いることができる。水に混和しうる有機溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、エチレングリコール、グリセリンなどが好ましい。また、水又は緩衝液とこれらの有機溶媒とを混合して用いることも好ましい。本発明の多重鎖核酸の測定において、上記化合物の好ましい濃度は検出対象の多重鎖核酸の濃度によっても異なるが、通常１×１０^{-1 0}モル／Ｌ〜１×１０^-3モル／Ｌであり、さらに好ましくは１×１０^-9モル／Ｌ〜１×１０^-4モル／Ｌであり、５×１０^-8モル／Ｌ〜５×１０^-5モル／Ｌが最も好ましい。
【０１０５】
ＤＮＡアレイを用いて上記化合物を多重鎖核酸と接触させる場合には、上記化合物の溶液をアレイ上に展開する方法が最も好ましく用いられるが、ハイブリダイゼーション後のＤＮＡアレイを上記化合物の溶液に浸漬する方法も好ましく用いることができる。また、上記化合物をハイブリダイゼーション時に存在させる方法も採ることができる。上記化合物を多重鎖核酸と接触させて光学的測定を行う際に、好ましくは多重鎖核酸と接触後、０．０１秒〜１０００秒の間に検出を開始することが好ましく、０．１秒〜６００秒の間に検出を開始することが好ましい。
【０１０６】
光学的測定を行うときの上記化合物の溶液のｐＨは２．０〜１０．０が好ましく、３．０〜９．０がより好ましく、４．０〜８．０が最も好ましい。ｐＨを調節するために、緩衝液を用いることも好ましく、緩衝液としては「蛋白質・酵素の基礎実験法」（堀尾式一編、南江堂（１９９４年刊））などに詳しく記載されているが、フタル酸水素カリウム−塩酸緩衝液、クエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、コハク酸−水酸化ナトリウム緩衝液、マレイン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液、イミダゾール−塩酸緩衝液、トリエタノールアミン・塩酸−水酸化ナトリウム緩衝液、Ｎ−エチルモルホリン−塩酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシルグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ジエタノールアミン−塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ブリトン−ロビンソン広域緩衝液、ＧＴＡ広域緩衝液などを好ましく用いることができる。緩衝液の濃度は０．１ｍＭないし５００ｍＭが好ましく、０．５ｍＭないし２００ｍＭがより好ましく、１ｍＭないし５０ｍＭがさらに好ましい。
【０１０７】
上記化合物をハイブリッド多重鎖核酸に接触させた後は、過剰の化合物を除去するために洗浄を行ってもよい。この場合にはハイブリダイゼーション後の洗浄と同様の操作で行うことができる。また、前述したように、本発明の方法では洗浄を行わなくても光学的検出が可能であり、洗浄操作を省略することも好ましい。
【０１０８】
なお、光学的検出は溶液系で多重鎖核酸を検出する場合には、通常の蛍光光度計を用いることもできるが、多数同時検出が可能な点及び感度の点などから蛍光スキャナーを用いて行うことが好ましい。また、蛍光量の測定は、ハイブリダイゼーション後の基板を乾燥させるか、あるいは水性溶媒の存在下に、従来の蛍光レーザースキャナー法によって行ってもよく、あるいは該基板を乾燥させないように基板をカバーガラスで覆い、冷却ＣＣＤ（電荷結合素子）法や蛍光レーザースキャナー法によって行ってもよい。
【０１０９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
［合成例１］色素（Ｄ−１）の合成
（１−１）２−メルカプトオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Chem.）、 ６０巻、５７２１頁（１９９５年）に記載の方法を参考に合成を行った。１０ｇの２−アミノ−３−ヒドロキシピリジン、２０ｇのキサントゲン酸カリウム、２００ｍＬのエタノールを混合し、１５時間還流した。こののち、溶媒を減圧留去し、残さを８０ｍＬの水に溶解し、酢酸を加えると結晶が析出した。この結晶を濾取し、水洗、乾燥を行った。収量１１ｇ
【０１１０】
（１−２）２−メチルチオオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
３．９ｇの原料（２−メルカプトオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジン）をＤＭＦに溶解し、３．０ｇのｔ−ブトキシカリウムを添加した。ついで、２ｍＬのヨウ化メチルを加え、室温で３０分撹拌した。原料がほぼ消失したので、水を加え、酢酸エチルで２回抽出した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去して目的物を油状物として得た。この油状物を放置すると結晶化した。
（１−３）臭化４−（２−カルバモイルエチル）−２−メチルチオオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウムの合成
１ｇの２−メチルチオオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンに３ｇの３−ブロモプロピオン酸アミドを加え、１１０℃で１時間加熱後、冷却し、酢酸エチルを加えて酢酸エチル溶解成分をデカンテーションによって除去した。この操作を３回繰り返したのち、残さはそのまま次の反応に用いた。
【０１１１】
（１−４）１，４−ジメチルキノリニウムパラトルエンスルホナートの合成
１０ｇの４−メチルキノリン（レピジン）、１９．５ｇのパラトルエンスルホン酸メチルを混合し、１５０℃で１時間反応した。酢酸エチルを加えて撹拌すると結晶が析出した。この結晶を濾取し、酢酸エチルで洗浄した。目的物は吸湿性であった。
（１−５）色素（Ｄ−１）の合成
合成例（１−３）で合成した臭化４−（２−カルバモイルエチル）−２−メチルチオオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム１００ｍｇ、合成例（１−４）で合成した１，４−ジメチルキノリニウムパラトルエンスルホナート４０ｍｇをジメチルホルムアミド４ｍＬに溶解し、室温でトリエチルアミン０．５ｍＬを添加した。室温で１時間反応した後、トリエチルアミン０．５ｍＬを添加して８０℃で１時間反応した。反応混合物はそのままシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、黄色の成分を集めて目的物を得た。クロマトグラフィーによる精製を繰り返して目的物２ｍｇを得た。
【０１１２】
［合成例２］色素（Ｄ−２）の合成
（２−１）二臭化４−メチル−１−（３−トリメチルアンモニオプロピル）キノリニウムの合成
５ｇの臭化（３−ブロモプロピル）トリメチルアンモニウム（アルドリッチ社製）と１０ｇの４−メチルキノリンを混合し、１２０℃で３時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて酢酸エチル溶解成分をデカンテーションによって除去した。本操作を３回繰り返したのち、残さはさらに精製することなく次の反応に使用した。
【０１１３】
（２−２）色素（Ｄ−２）の合成
合成例（１−３）で合成した臭化４−（２−カルバモイルエチル）−２−メチルチオオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム１００ｍｇ、合成例（２−１）で合成した二臭化４−メチル−１−（３−トリメチルアンモニオプロピル）キノリニウム５０ｍｇをジメチルホルムアミド５ｍＬに溶解し、室温でトリエチルアミン０．５ｍＬを添加した。室温で１時間反応した後、トリエチルアミン０．５ｍＬを添加して８０℃で１時間反応した。反応混合物に酢酸エチルを添加し、酢酸エチル溶解成分をデカンテーションで除去したのち、残さをメタノールに溶解し、セファデックスＬＨ−２０を用いたカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：メタノール）で３回精製を行い、短いシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：クロロホルム／メタノール＝２／１）で１回精製い、目的物４ｍｇを得た。
【０１１４】
［合成例３］色素（Ｄ−３）の合成
（３−１）二臭化４−（２−（Ｎ−アセチル−Ｎ−フェニルアミノ）ビニル）−１−（３−トリメチルアンモニオプロピル）キノリニウムの合成
合成例（２−１）で合成した二臭化４−メチル−１−（３−トリメチルアンモニオプロピル）キノリニウム５００ｍｇに１，３−ジフェニルホルムアミジン２ｇを加え、無水酢酸１０ｍＬを添加して１２０℃で３時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて酢酸エチル溶解成分を除去した。この操作を３回繰り返し、残さはさらに精製することなく次の反応に使用した。
【０１１５】
（３−２）塩化７−（２−メトキシエトキシメチル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジニウムの合成
（３−２−１）２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７−アザ−２，３，３−トリメチルインドレニン）の合成
２００ｇの２−ヒドラジノピリジンと３００ｍＬのトルエンを混合し、２５０ｇの３−メチル−２−ブタノンをこれに加え、３０分間加熱還流を行った後、溶媒を完全に濃縮し、油状物を得た。この油状物に塩化亜鉛１０ｇを添加し、２１５℃に加熱して５時間反応を行った。冷却後、水４００ｍＬを添加し、クロロホルム３００ｍＬで４回抽出を行い、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。残さを減圧蒸留（１１２−１３５℃／０．２ｍｍＨｇ）し、留出成分をヘキサン１．５リットルを用いて再結晶を行い、目的物を得た。収量７０．０ｇ、収率２３．８％
【０１１６】
（３−２−２）塩化７−（２−メトキシエトキシメチル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジニウムの合成
合成例（３−２−１）で合成した２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１ｇを塩化２−メトキシエトキシメチル３ｇと混合し、９０℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを添加して、デカンテーションによって酢酸エチル溶解成分を除去した。残さはさらに精製することなく次の反応に使用した。
【０１１７】
（３−３）色素（Ｄ−３）の合成
合成例（３−１）で合成した二臭化４−（２−（Ｎ−アセチル−Ｎ−フェニルアミノ）ビニル）−１−（３−トリメチルアンモニオプロピル）キノリニウム５０ｍｇと合成例（３−２）で合成した塩化７−（２−メトキシエトキシメチル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジニウム１００ｍｇをジメチルホルムアミド５ｍＬに溶解し、無水酢酸０．５ｍＬを加えたのち、１ｍＬのトリエチルアミンを添加し室温で２時間反応した。酢酸エチルを加えて酢酸エチル溶解成分をデカンテーションで除去した後、残さをセファデックスＬＨ−２０を用いたカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：メタノール）で精製し、青色の色素（Ｄ−３）の前駆体粗生成物を得た。この前駆体粗生成物に３％の臭化水素酸を加え、２時間８０℃で反応したのち、反応液を減圧留去した。残さをセファデックスＬＨ−２０を用いたカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：メタノール）で３回精製し、さらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：クロロホルム／メタノール＝３／１）で１回精製い目的物を３ｍｇを得た。
【０１１８】
［合成例４］色素（Ｄ−４）の合成
（４−１）２−メチルオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
２−アミノ−３−ヒドロキシピリジン（アルドリッチ社製）１５ｇにオルト酢酸エチル８０ｍＬ、触媒量のパラトルエンスルホン酸一水和物を添加した後に、４時間１２０℃で反応した。冷却後、トリエチルアミン２ｍＬを加えたのち、溶媒を減圧留去し、残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）で精製した。目的物は結晶として得られた。
（４−２）色素（Ｄ−４）の合成
（４−１）で合成した２−メチルオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンを用いて合成例３に示した方法に従って色素（Ｄ−４）を得た。
【０１１９】
［合成例５］色素（Ｄ−５）の合成
（５−１）６−ブロモ−２−メルカプトオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
２−アミノ−５−ブロモ−３−ヒドロキシピリジン４ｇ、キサントゲン酸カリウム８ｇ、エタノール５０ｍＬを混合し、１０時間加熱還流を行った。溶媒を減圧留去し、水４０ｍＬを加えて残さを溶解し、酢酸を加えると結晶が析出した。この結晶を減圧ろ過し、水洗を行い、乾燥した。収量４．０ｇ、収率８１．８％
（５−２）６−ブロモ−２−メチルチオオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
合成例（５−１）で合成した５−ブロモ−２−メルカプトオキサゾロ〔４，５−ｂ〕ピリジン２ｇを１５ｍＬのジメチルホルムアミドを加え、２ｍＬのトリエチルアミンを加えて溶解した。ついで、１ｍＬのヨウ化メチルを加え室温で１時間反応した。反応終了後、水を加え、析出した結晶を減圧ろ過した。水洗、乾燥を行い、目的物を得た。収量２ｇ、収率９４．３％
【０１２０】
（５−３）臭化１−（３−エトキシカルボニルプロピル）−４−メチルキノリニウムの合成
１９．５ｇの４−ブロモ酪酸エチルエステルと１４．３ｇのレピジンを混合し、１３０℃で２時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加え、酢酸エチル溶解成分を除去した。この操作を繰り返し、目的物を油状物として得た。このものはさらに精製を行うことなく次の反応に使用した。
（５−４）色素（Ｄ−５）の合成
合成例（５−２）及び（５−３）で合成した原料を使用して、合成例１に示した方法に従って色素（Ｄ−５）を合成した。
【０１２１】
［合成例６］色素（Ｄ−６）の合成
（６−１）６−メチル−２−メルカプトチアゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、３７巻、２４８頁（１９９４年）に記載の方法に従って合成した。１０ｇの２−アミノ−３−ブロモ−５−メチルピリジン、Ｎ−メチルピロリドン１２０ｍＬ、キサントゲン酸カリウム１６．７ｇを混合し、１７０℃で３．５時間加熱した。反応液は最初黒色となり、次第に赤褐色となった。反応終了後、室温に冷却し、酢酸で酸性にすると目的物結晶（灰黄色）が得られた。結晶を濾取し、水洗、乾燥を行った。収量８．７ｇ、収率８９．２％
【０１２２】
（６−２）６−メチル−２−メチルチオチアゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成２ｇの原料チオールを１０ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、トリエチルアミン２ｍＬを添加した。次に、ヨウ化メチル１．５ｍＬを添加し、室温で３０分反応した。反応液に水１００ｍＬを添加し、析出した結晶を濾取した。水洗を行い、乾燥して目的物を得た。収量１．７ｇ、収率７８．９％
（６−３）色素（Ｄ−６）の合成
合成例（６−２）及び合成例（５−２）で合成した原料を使用して、合成例１に示した方法に従って色素（Ｄ−６）を合成した。
【０１２３】
［合成例７］色素（Ｄ−１５）の合成
（７−１）４−ジメチルアミノ酪酸エチルエステルの合成
２５０ｍＬのジメチルアミン５０％水溶液と２００ｍＬのエタノールを混合し、１０℃以下に保ちながら１２０ｇの４−ブロモ酪酸エチルエステルを滴下した。滴下終了後、室温で２時間反応したのち、５０℃に昇温して２時間反応した。溶媒を半分程度に濃縮し、氷水で冷却しながら水酸化ナトリウムを加えて塩基性とし、酢酸エチル４００ｍＬを加えて抽出を行った。この有機相を４Ｍの塩酸１５０ｍＬで４回抽出を行い、有機相を廃棄した。塩酸抽出液を氷水で冷却し、水酸化ナトリウムを加えて塩基性とし、酢酸エチル２００ｍＬで３回抽出した。有機相を炭酸カリウムで乾燥し、濃縮を行い、目的物を得た。収量４５ｇ
【０１２４】
（７−２）臭化（６−ブロモヘキシル）（３−エトキシカルボニルプロピル）ジメチルアンモニウムの合成
合成例（７−１）で合成した４−ジメチルアミノ酪酸エチルエステル１５ｇに１，６−ジブロモヘキサン５０ｇを混合し、室温で１晩放置した。結晶が析出したので、酢酸エチルを加えて結晶をほぐし、減圧ろ過で目的物を得た。吸湿性結晶。収量２１ｇ
【０１２５】
（７−３）二臭化１−（６−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ヘキシル−４−メチルキノリニウムの合成
８ｇの臭化６−ブロモヘキシルジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニウムと１２ｇのレピジンを混合し、１２５℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて撹拌し、酢酸エチル溶解成分をデカンテーションで除いたのち、メタノールに溶解し、セファデックスＬＨ−２０（溶出液：メタノール）を用いて精製した。油状物、収量６ｇ
（７−４）色素（Ｄ−１５）の合成
合成例（７−３）及び合成例（１−４）で合成した原料を用い、合成例１で示した合成法に従って色素（Ｄ−１５）を合成した。
【０１２６】
［合成例８］色素（Ｄ−１６）の合成
（８−１）５−フルオロ−４−メチルキノリン・パラトルエンスルホン酸塩の合成
オーストラリアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Aust. J. Chem.）、４５巻、１１１９頁（１９９２年）及びジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、６７巻、８６頁（１９４５年）を参考にした。３３．２ｇ（0.225モル）の３−フルオロアニリン塩酸塩、９７．２ｇ（0.36モル）の塩化第二鉄６水和物、３．６ｇの無水塩化亜鉛、１６０ｍＬの９５％エタノールを混合し、水浴下６０〜６５℃で０．１８モルのメチルビニルケトンをゆっくり滴下した。滴下終了後、２時間加熱還流し、一晩放置した。溶媒をほとんど留去し、２５％水酸化ナトリウムでアルカリ性とした。セライトろ過後、酢酸エチルで洗浄し、濾液を分液後、有機相をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、得られた異性体混合物（５−フルオロ−４−メチルキノリンと７−フルオロ−４−メチルキノリン）を蒸留した。５−フルオロ−４−メチルキノリンの比が高い初留成分を酢酸エチルに溶解し、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物のアセトン溶液を加え、氷水冷却すると、５−フルオロ−４−メチルキノリン・パラトルエンスルホン酸塩の結晶が得られた。収量１．７ｇ
また、７−フルオロ−４−メチルキノリンについてもパラトルエンスルホン酸塩の結晶として単離した。
【０１２７】
（８−２）臭化（４−ブロモブチル）（３−エトキシカルボニルプロピル）ジメチルアンモニウムの合成
合成例（７−１）で合成した４−ジメチルアミノ酪酸エチルエステル１５ｇに１，４−ジブロモブタン５０ｇを混合し、室温で１晩放置した。結晶が析出したので、酢酸エチルを加えて結晶をほぐし、減圧ろ過で目的物を得た。収量３０ｇ
（８−３）二臭化１−（４−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ブチル）−５−フルオロ−４−メチルキノリニウムの合成
１ｇの臭化４−ブロモブチルジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニウムと０．１ｇの５−フルオロ−４−メチルキノリン・パラトルエンスルホン酸塩を混合し０．２ｍＬのトリエチルアミンを加えて、１３０℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて撹拌し、酢酸エチル溶解成分をデカンテーションで除いたのち、メタノールに溶解し、セファデックスＬＨ−２０（溶出液：メタノール）を用いて精製した。油状物。
（８−４）色素（Ｄ−１６）の合成
合成例（８−３）及び合成例（６−２）で合成した化合物を原料に合成例１に示した方法と同様の合成法によって色素（Ｄ−１６）を得た。
【０１２８】
［合成例９］色素（Ｄ−１７）の合成
（９−１）５−クロロ−４−メチルキノリンの合成
オーストラリアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Aust. J. Chem.）、４５巻、１１１９頁（１９９２年）及びジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc.）、６７巻、８６頁（１９４５年）を参考にした。４０．０ｇ（0.225モル）の３−クロロアニリン塩酸塩、９７．２ｇ（0.36モル）の塩化第二鉄６水和物、３．６ｇの無水塩化亜鉛、１６０ｍＬの９５％エタノールを混合し、水浴下６０〜６５℃で１２．６ｇ（０．１８モル）のメチルビニルケトンをゆっくり滴下した。滴下終了後、２時間加熱還流し、一晩放置した。溶媒をほとんど留去し、２５％水酸化ナトリウムでアルカリ性とした。セライトろ過後、酢酸エチルで洗浄し、濾液を分液後、有機相は５−クロロ−４−メチルキノリンと７−クロロ−４−メチルキノリンであったので、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝９／１）で精製し、それぞれを分離した。
【０１２９】
（９−２）二臭化１−（４−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ブチル−５−クロロ−４−メチルキノリニウムの合成
１ｇの臭化４−ブロモブチルジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニウム（合成例８−２）と０．１ｇの５−クロロ−４−メチルキノリンを混合し１３０℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて撹拌し、酢酸エチル溶解成分をデカンテーションで除いたのち、メタノールに溶解し、セファデックスＬＨ−２０（溶出液：メタノール）を用いて精製した。油状物。
（９−３）色素（Ｄ−１７）の合成
合成例（９−２）及び合成例（６−２）で合成した化合物を原料に合成例１に示した方法と同様の合成法によって色素（Ｄ−１７）を得た。
【０１３０】
［合成例１０］色素（Ｄ−１８）の合成
（１０−１）４−メチル−１−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−２−オンの合成
１５０ｍＬの濃硫酸にＮ，Ｎ−ジフェニルアセトアセタミド６０ｇを５〜１０℃で少量ずつ添加した。ほぼ完溶したのち、室温とし一晩放置した。反応が完結したので、氷水に注ぎ、酢酸エチル２００ｍＬを加え撹拌すると結晶が析出した。この結晶を濾取、乾燥し、目的物を得た。
（１０−２）４−メチル−１−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−２−チオンの合成
１０ｇの４−メチル−１−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−２−オン（０．０４２５モル）、９ｇのローソン試薬をトルエン中で混合し、加熱還流した。原料消失後、反応液をそのままシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけた。クロロホルムで溶出させ、ヘキサン／酢酸エチルより再結晶した。
【０１３１】
（１０−３）二臭化２−（４−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ブチルチオ−４−メチル−１−フェニルキノリニウムの合成
合成例（１０−２）で合成した４−メチル−１−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−２−チオン０．５ｇと合成例（８−２）で合成した臭化４−ブロモブチルジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニウム１ｇを混合し、１３０℃にて１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加え、酢酸エチル溶解性成分を除去したのち、メタノールに溶解し、セファデックスＬＨ−２０（溶出液：メタノール）を用いて精製した。
（１０−４）色素（Ｄ−１８）の合成
合成例（６−２）及び合成例（１０−３）で合成した原料を使用して、合成例１に示した方法に従って色素（Ｄ−１８）を合成した。
【０１３２】
［合成例１１］色素（Ｄ−１９）の合成
（１１−１）色素（Ｄ−１９）の合成
合成例（７−３）及び合成例（６−２）で合成した化合物を原料として、合成例１に示した方法によって色素（Ｄ−１９）を合成した。
［合成例１２］色素（Ｄ−２３）の合成
（１２−１）３−クロロ−４−メチルキノリンの合成
シンセシス（Synthesis）798頁 (１９７６年)を参考にして合成した。すなわち、３−メチルインドール１．３１ｇ（１０ミリモル）と塩化ベンジルトリメチルアンモニウム５０ｍｇ、及びクロロホルム（エタノールフリー）／ベンゼンの１／１混合液３．２ｍＬを４０℃にて激しく撹拌し、水酸化ナトリウム３ｇ／水６ｍＬの溶液を１５分かけて滴下した。８時間反応を行ったのち、反応混合物を酢酸エチルと水で希釈し、２Ｎ塩酸で抽出した。この酸性溶液を濃厚な水酸化ナトリウムで弱塩基性とし、酢酸エチルで抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去し、粗目的物を得た。さらに短いシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物を得た。
【０１３３】
（１２−２）二臭化１−（６−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ヘキシル−３−クロロ−４−メチルキノリニウムの合成
１ｇの臭化６−ブロモヘキシルジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニウム（合成例７−２）と０．１ｇの３−クロロ−４−メチルキノリン（合成例１２−１）を混合し１３０℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて撹拌し、酢酸エチル溶解成分をデカンテーションで除いたのち、メタノールに溶解し、セファデックスＬＨ−２０（溶出液：メタノール）を用いて精製した。油状物。
（１２−３）色素（Ｄ−２３）の合成
合成例（１２−２）及び合成例（６−２）で合成した化合物を原料として、合成例１の方法に従って色素（Ｄ−２３）を合成した。
【０１３４】
［合成例１３］色素（Ｄ−２５）の合成
（１３−１）２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステルの合成
（１３−１−１）２−ヒドラジノピリジン−５−カルボン酸の合成
５０ｇの６−クロロニコチン酸を３００ｍＬのｎ−ブタノールと混合し、８０ｇのヒドラジン１水和物を添加して、１０時間加熱還流を行った。冷却後、５００ｍＬの希塩酸に注ぎ、析出した結晶を濾取し、水洗、乾燥を行い目的物を得た。収量４４．２ｇ、収率９０．９％
【０１３５】
（１３−１−２）２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸の合成
３０ｇの２−ヒドラジノピリジン−５−カルボン酸と３０ｇの３−メチル−２−ブタノンを混合し、１２０ｍＬのエチレングリコールを添加し、１００℃で１時間反応を行った。減圧下で過剰の３−メチル−２−ブタノンを留去し、ついで加熱を行い５時間還流を行った。冷却後、そのままシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製を行い、ＴＬＣ上で発色液（ｐ−アニスアルデヒド／エタノール／硫酸＝５／９０／５（容量パーセント））によって発色するフラクションを集めた。このフラクションは目的物と目的物のエチレングリコールエステルとの混合物であったため、混合物のまま１Ｎ水酸化ナトリウムで加水分解し、中和後、結晶として目的物を得た。また、約４０％は原料ヒドラジンと３−メチル−２−ブタノンから生成するヒドラゾンとして回収された。収量１．８ｇ、収率４．５％
【０１３６】
（１３−１−３）２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステルの合成
１ｇの２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸、１．５ｇのパラトルエンスルホン酸一水和物、１００ｍＬのエタノールを混合し、加熱を行い、溶媒を少しずつ留去し、エタノールを適宜追加しながら、８時間反応した。冷却後、溶媒を７０％程度留去し、水と酢酸エチルを加えて抽出を行い、炭酸ナトリウム水溶液で有機相を洗浄後、濃縮した。短いカラムでシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、目的物を得た。収量０．８ｇ、収率７０．３％
（１３−２）二臭化４−（２−（Ｎ−アセチル−Ｎ−フェニルアミノ）ビニル）−１−（６−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ヘキシルキノリニウムの合成
合成例（７−３）で合成した二臭化１−（６−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ヘキシル−４−メチルキノリニウムを用いて、合成例（３−１）に示した合成法と同様にして目的物を得た。
【０１３７】
（１３−３）塩化５−エトキシカルボニル−７−（２−メトキシエトキシメチル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジニウムの合成
合成例（１３−１）で合成した２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル０．１ｇを塩化２−メトキシエトキシメチル０．８ｇと混合し、１１０℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを添加して、デカンテーションによって酢酸エチル溶解成分を除去した。残さはさらに精製することなく次の反応に使用した。
（１３−４）色素（Ｄ−２５）の合成
合成例（１３−２）及び合成例（１３−３）で合成した化合物を原料として、合成例（３−３）に示した方法と同様にして色素（Ｄ−２５）を得た。
【０１３８】
［合成例１４］色素（Ｄ−２７）の合成
（１４−１）６−ブロモ−２−メチルチアゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
２５．２ｇの２−アミノ−３，５−ジブロモピリジンを５００ｍＬのアセトニトリルに懸濁し、５０ｍＬの無水酢酸を加えて３時間加熱還流した。冷却後、水を加えて析出した結晶を濾取した。結晶を乾燥後、ジオキサン３００ｍＬに懸濁し、６ｇの水素化ナトリウムを加えて４時間加熱還流した。冷却後、エタノール２０ｍＬを加えた後、溶媒を留去し、残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物を得た。
（１４−２）二臭化１−（４−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ブチル）−４−メチルキノリニウムの合成
１ｇの臭化４−ブロモブチルジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニウムと２ｇの４−メチルキノリン（レピジン）を混合し１３０℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて撹拌し、酢酸エチル溶解成分をデカンテーションで除いた。セファデックスＬＨ−２０（溶出液：メタノール）を用いて精製し、結晶として得た。
【０１３９】
（１４−３）二臭化４−（４−（Ｎ−アセチル−Ｎ−フェニルアミノ）−１，３−ブタジエン−１−イル）−１−（４−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ブチル）−４−メチルキノリニウムの合成
合成例（１４−２）で合成した二臭化１−（４−（ジメチル（３−エトキシカルボニルプロピル）アンモニオ）ブチル）−４−メチルキノリニウム０．５ｇに２ｇのマロンアルデヒドジアニリド塩酸塩を加え、無水酢酸５ｍＬを混合して１１０℃で２時間反応した。冷却後、酢酸エチルを添加して、デカンテーションによって酢酸エチル溶解成分を除去した。残さはさらに精製することなく次の反応に使用した。
（１４−３）色素（Ｄ−２７）の合成
合成例（１４−１）及び（１４−３）に示した化合物を原料として、合成例３と同様の方法で合成した。
【０１４０】
［合成例１５］色素（Ｄ−３５）の合成
（１５−１）５−アセチルアミノ−２−メルカプトオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
（１５−１−１）５−アミノ−３−ベンジルオキシ−２−ニトロピリジンの合成ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Chem）、５７巻、４７８４頁（１９９２年）に記載の方法を参考に合成を行った。すなわち、３−ベンジルオキシ−２−ニトロピリジンに強塩基存在下でＮ，Ｎ−テトラメチレンチオカルバモイルスルフェナミドの窒素アニオンを作用させて合成を行った。
（１５−１−２）５−アセチルアミノ−３−ベンジルオキシ−２−ニトロピリジンの合成
３ｇの５−アミノ−３−ベンジルオキシ−２−ニトロピリジン（合成例１５−１−１）を３０ｍＬの無水酢酸に懸濁し、触媒量の濃硫酸を添加し、７０℃で１時間反応した。反応終了後、反応混合物を氷水に注ぎ、析出した結晶を濾取、乾燥した。この後、さらに短いシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製を行った。
【０１４１】
（１５−１−３）２−アミノ−５−アセチルアミノ−３−ヒドロキシピリジンの合成
１ｇの５−アセチルアミノ−３−ベンジルオキシ−２−ニトロピリジンを５０ｍＬのメタノールを加え、オートクレーブ中で５％活性炭パラジウムを触媒として５０℃で水素添加反応を行った。１晩放置後、触媒を濾別し、溶媒を減圧留去した。生成物はさらに精製せずに次の反応に使用した。
（１５−１−４）５−アセチルアミノ−２−メルカプトオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
合成例（１５−１−３）の生成物に２ｇのキサントゲン酸カリウム、５０ｍＬのエタノールを加えて１５時間加熱還流した。冷却後、溶媒を留去し、水を加えて固形物を溶解したのち、酢酸を添加すると結晶が析出した。この結晶を減圧ろ過し、水洗、乾燥を行い、目的物を得た。
（１５−２）５−アセチルアミノ−２−メチルチオオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
合成例（５−２）の方法に従って合成した。
（１５−３）色素（Ｄ−３５）の合成
合成例（１５−１−４）及び（１５−２）で合成した化合物を原料として、合成例１の方法と同様にして色素（Ｄ−３５）を得た。
【０１４２】
［合成例１６］色素（Ｄ−３７）の合成
（１６−１）５−ブロモ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンの合成
（１６−１−１）５−ブロモ−２−ヒドラジノピリジンの合成
２，５−ジブロモピリジン１２５ｇ、エタノール３５０ｍＬ、包水ヒドラジン２５０ｍＬを混合し、３０時間加熱還流した。エタノールを減圧下で留去し、水を加えて析出した結晶を濾取した。水洗、乾燥を行い、５−ブロモ−２−ヒドラジノピリジン７７ｇを得た。収率７７．６％
（１６−１−２）５−ブロモ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンの合成
５−ブロモ−２−ヒドラジノピリジン７６ｇ、３−メチル−２−ブタノン１００ミリリットルを混合し、１００℃で３０分間反応した。過剰の３−メチル−２−ブタノンを留去したのち、１，４−ブタンジオール１００ミリリットルを加え２４０℃に加熱し、５時間還流した。
反応液を冷却し、そのままシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、ｎｍｒで各フラクションを確認した。目的物を含むフラクションを集め、溶媒を留去したのちヘキサン／酢酸エチルから結晶化し、単褐色結晶として目的物を得た。収量８．５グラム、収率８．８％
【０１４３】
（１６−２）５−フェニル−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンの合成
合成例（１６−１−２）で合成した５−ブロモ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン０．５ｇ、フェニルボロン酸０．３８ｇ及びジメチルホルムアミド７ｍＬを混合し、窒素気流下にてテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム０．０７２ｇ及び炭酸カリウム０．９ｇをこれに加えた。反応混合物を撹拌し、１００℃に加熱し、４時間反応した。反応終了後、クロロホルムで抽出し、濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。溶離液としてクロロホルム／メタノールを用い、目的物はクロロホルム／メタノール＝４／１で溶出した。目的物を含むフラクションを集め濃縮し、目的物を淡黄色固体として得た。収量０．４５ｇ、収率９１％
【０１４４】
（１６−３）塩化７−（２−メトキシエトキシメチル）−５−フェニル−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジニウムの合成
合成例（１６−２）で合成した５−フェニル−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン０．２ｇと１ｇの塩化２−メトキシエトキシメチルを混合し、１００℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて酢酸エチル溶解成分をデカンテーションによって除去した。本操作を３回繰り返したのち、残さはさらに精製することなく次の反応に使用した。
（１６−４）二臭化６−メトキシ−４−メチル−１−（３−トリメチルアンモニオプロピル）キノリニウムの合成
３ｇの臭化（３−ブロモプロピル）トリメチルアンモニウム（アルドリッチ社製）と５ｇの６−メトキシ−４−メチルキノリン（東京化成社製）を混合し、１２０℃で３時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて酢酸エチル溶解成分をデカンテーションによって除去した。本操作を３回繰り返したのち、残さはさらに精製することなく次の反応に使用した。
【０１４５】
（１６−５）二臭化４−（２−（Ｎ−アセチル−Ｎ−フェニルアミノ）ビニル）−６−メトキシ−１−（３−トリメチルアンモニオプロピル）キノリニウムの合成
（１６−４）で合成したキノリニウムに１．５ｇの１，３−ジフェニルホルムアミジンを加え、５ｍＬの無水酢酸を混合して１２０℃で１時間反応した。冷却後、酢酸エチルを加えて酢酸エチル溶解成分をデカンテーションによって除去した。本操作を２回繰り返したのち、残さはさらに精製することなく次の反応に使用した。
（１６−６）色素（Ｄ−３７）の合成
合成例（１６−５）で合成した化合物にジメチルホルムアミド５ｍＬを添加し、１ｍＬの無水酢酸を加えた。さらにこの混合液に合成例（１６−３）で合成した化合物を添加し、室温で均一溶液とした。室温でトリエチルアミンを０．３ｍＬ添加すると色素が生成した。この色素をセファデックスＬＨ−２０を使ったカラムクロマトグラフィーで精製したのち（溶出液：メタノール）、この色素のメタノール溶液に触媒量のピリジニウムパラトルエンスルホン酸塩を加えて、室温で２日間放置した。この溶液を再度セファデックスＬＨ−２０を使ったカラムクロマトグラフィーで精製して色素（Ｄ−３７）を得た。
【０１４６】
［合成例１７］色素（Ｄ−３８）の合成
（１７−１）２−メルカプトオキサゾロ［４，５−ｃ］イソキノリンの合成
（１７−１−１）４−ヒドロキシ−３−ニトロイソキノリンの合成
１０ｇの４−ヒドロキシイソキノリンを８０ｇの濃硫酸に溶解し、２℃で撹拌した。これに１０℃以下に保ちながら、発煙硝酸２．７ｍＬをゆっくり滴下した。そのまま放置し、室温で２時間反応したのち、１Ｋｇの氷水に注ぎ、析出した結晶を濾取した。
（１７−１−２）２−メルカプトオキサゾロ［４，５−ｃ］イソキノリンの合成４ｇの４−ヒドロキシ−３−ニトロイソキノリンに酢酸エチル、水を加え、さらに過剰量のハイドロサルファイトナトリウムを添加して２時間加熱還流した。分液して有機相をとり、水洗後、溶媒を留去した。残さにエタノール、８ｇのキサントゲン酸カリウムを添加し、５時間加熱還流を行った。冷却後、エタノールを留去し、残さを２０ｍＬの水に溶解し、酢酸を少しずつ加えると、結晶が析出した。結晶を濾取し、水洗を行い、乾燥して目的物を得た。
【０１４７】
（１７−２）２−メチルチオオキサゾロ［４，５−ｃ］イソキノリンの合成
２ｇの原料チオールをジメチルホルムアミド１５ｍＬに添加し、２ｍＬのトリエチルアミンを加えて原料を溶解した。ついで、１．５ｍＬのヨウ化メチルを添加し、室温で１時間反応した。水５０ｍＬを添加すると結晶が析出した。この結晶を濾取し、水洗、乾燥を行い、目的物を得た。
（１７−３）色素（Ｄ−３８）の合成
合成例（１７−２）及び合成例（１４−２）で合成した化合物を原料として、合成例３に示した方法と同様にして色素（Ｄ−３８）を合成した。
【０１４８】
［実施例１］溶液系での多重鎖核酸の検出
（試料核酸溶液の調製）
２重鎖核酸としてデオキシリボ核酸ナトリウム，繊維状，サケ精巣製（和光純薬工業（株）製）をｐＨ６．０の２０ｍＭクエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液に溶解し１００μｇ／ｍＬを作製した。さらにこれを１００℃で３０分加熱したのちに氷水で急冷し１本鎖のデオキシリボ核酸を作製した。
【０１４９】
（検出用化合物溶液の調製）
表１に示した化合物をｐＨ４．０の２０ｍＭクエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液に溶解し、５×１０^-5モル／Ｌの溶液を作製した。これらの溶液はいずれも実質的に無色かつ無蛍光であった。比較としてモレキュラー・プローブス社の PicoGreen をｐＨ４．０の２０ｍＭクエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液に溶解し、可視域での光学濃度０．５の溶液を作製した。
（蛍光強度の測定）
試料核酸溶液を１、検出用化合物溶液を１、希釈用緩衝液を８の容量比で混合した溶液を作製し、蛍光光度計を用いて蛍光強度を測定し、その結果を表１に示した。蛍光強度はそれぞれの試料について蛍光励起スペクトルを測定し、強度最大となる波長で励起したときの蛍光強度を示した。
【０１５０】
【表１】

【０１５１】
表１に示した結果より、本発明の方法では２本鎖核酸が存在する場合には高い蛍光収率（蛍光強度／吸光度）が達成されていることがわかる。さらに１本鎖に比較して２本鎖の存在によって蛍光強度が飛躍的に上昇しており、本発明の方法が２本鎖核酸を検出するために極めて優れていることがわかる。
【０１５２】
［実施例２］固相担体上での多重鎖核酸の検出
（１）ＤＮＡ断片固定スライドの作成
２重量％アミノプロピルエトキシシラン（信越化学工業株式会社製）のエタノール溶液に、スライドガラス（２５ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した後に取り出し、エタノールで洗浄後、１１０℃で１０分間乾燥して、シラン化合物被覆スライド（Ａ）を作製した。次いで、このシラン化合物被覆スライド（Ａ）を３質量％化合物ＶＳ−１溶液に１０分間浸した後取り出し、水洗を行い、エタノールで洗浄後、１２０℃で１５分間乾燥して、ＶＳ−１被覆スライド（Ｂ）を作成した。
【０１５３】
【化２４】

（２）ＤＮＡ断片の点着と蛍光強度の測定
３’未端がアミノ基で修飾されたＤＮＡ断片（Ｕ−１：配列番号１）及び同様に３’末端がアミノ基で修飾された上記ＤＮＡ断片の相補鎖（Ｕ−２）を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）に分散させた水性液（１×１０^-5Ｍ）を調製し、上記工程（１）で得たスライド（Ｂ）にこれらを点着した。直ちに点着後のスライドを６０℃、湿度９０％にして１晩放置した。このスライドを０．１質量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）と２×ＳＳＣ（２×ＳＳＣ：ＳＳＣの原液を２倍に希釈した溶液、ＳＳＣ：標準食塩−クエン酸緩衝液）との混合溶液で２回、０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄した。次いで、上記の洗浄後のスライドを０．１Ｍグリシン水溶液（ｐＨ１０）中に１時間３０分浸漬した後、蒸留水で洗浄し、室温で乾燥させ、ＤＮＡ断片が固定されたスライド（Ｃ）を得た。
【０１５４】
上記ＤＮＡ配列（Ｕ−１）と相補的な配列を有する６０ｍｅｒのＤＮＡ（Ｕ−３）をハイブリダイゼーション用溶液（４×ＳＳＣ及び１０質量％のＳＤＳの混合溶液）（２０μＬ）に分散させ、上記で得たスライド（Ｃ）に付与し、表面を顕微鏡用カバーガラスで保護した後、モイスチャンバー内にて６０℃で１０時間インキュベートした。次いで、このスライドを０．１質量％ＳＤＳと２×ＳＳＣとの混合溶液で１０秒間洗浄した後、６００ｒｐｍで２０秒間遠心し、室温で乾燥し、スライド（Ｄ）とした。また、比較用として５’末端をＣｙ３で標識した（Ｕ−３）と同配列の６０ｍｅｒについても同様にしてサンプルを作製し、スライド（Ｅ）とした。それぞれをスライドガラス表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定した。励起波長は５３２ｎｍで行い、検出は５７０ｎｍに極大を有するバンドパスフィルターを通して行った。
【０１５５】
【表２】

【０１５６】
スライド（Ｄ）と同じものを作製し、本発明の方法により化合物２×１０^-5モル／ＬのｐＨ５の２０ｍＭクエン酸／リン酸二ナトリウム緩衝液溶液４０μＬをスライド（Ｄ）に展開した。これらの溶液は調製時点で実質的に無色かつ無蛍光であった。表面を顕微鏡用カバーガラスで保護した後に上記と同様にして蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定した。結果を表３に示す。この結果から、本発明方法によれば標識することなく多重鎖核酸を検出可能なことが明らかである。
【０１５７】
【表３】

【０１５８】
固相担体に固定するオリゴ核酸を配列番号２の核酸（８０ｍｅｒ）、配列番号３の核酸（８０ｍｅｒ）、及び配列番号４の核酸（１００ｍｅｒ）に変更して童謡に実験を行ったところ、上記とほぼ同じ結果が得られ、非標識で多重鎖核酸を検出可能なことがわかった。
【０１５９】
［実施例３］ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの検出
実施例２において、スライドガラス表面に固定した６０ｍｅｒのＤＮＡの代わりに４０ｍｅｒのオリゴデオキシＡを固定し、相補的な配列としてオリゴＵを使用した以外はまったく同様の実験を行ったところ、ハイブリダイゼーションが起こったスポットが検出され、ＲＮＡの検出も標識することなく行うことができることが明らかとなった。
【０１６０】
【配列表】

[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel optical measurement method for multi-stranded nucleic acids. More specifically, the present invention relates to an optical measurement technique for hybrid multi-stranded nucleic acid using a fluorescence measurement method useful in the field of gene analysis.
[0002]
[Prior art]
In recent years, an area where research has been very active is the application of dyes as a method for detecting nucleic acids. A wide variety of dyes have been developed for a wide range of applications, including ethidium bromide, which is used for the purpose of knowing the location of nucleic acids when separating nucleic acids using electrophoresis. Examples include Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 8^th Edition (Molecular Probes, CD-ROM, 2001). In addition, for the purpose of knowing genetic information or obtaining gene expression information of pathological tissue, the nucleic acid extracted from the living body is appropriately treated, labeled with a fluorescent dye, and hybridized with the probe nucleic acid. Thus, a method for detecting the presence or amount of the target nucleic acid has been developed.
[0003]
As a means of obtaining information on a large number of genes and gene expression at once by applying this method, for example, a detection technique called a DNA chip or a DNA array (hereinafter collectively referred to as “DNA array”) has been developed, and has received great attention. Collecting. In this technology, the partial or entire sequence is known on the plane of the solid support, and a large number of nucleic acids having different sequences are aligned and fixed in a dot shape, and the position on the plane corresponds to the sequence of the nucleic acid. (Also called “addressing”). On this plane, a nucleic acid of unknown sequence (one or two kinds of nucleic acids) may be uniformly developed and exposed to hybridization conditions. If a nucleic acid having a sequence complementary to a nucleic acid of unknown sequence is present on the solid phase carrier plane, both form a hybrid and remain on the solid phase plane after washing.
[0004]
At this time, if the hybrid can be detected by any method, it is determined whether or not the sequence to be detected exists in the unknown nucleic acid by contrasting with the position of the hybrid remaining on the solid surface, or Quantification or sequence identification becomes possible. Biological genes have a very low probability of homology of 20 or more base sequences. Therefore, when an appropriate sequence of 20 bases or more is selected as the nucleic acid sequence to be immobilized on the solid phase, the fixed sequence is known. It is possible to have a one-to-one relationship between the nucleic acid and the detection target gene. At present, most known DNA arrays are based on the above principle, and a large number of nucleic acids (sequences corresponding to genes fixed on a solid phase plane) can be obtained by a single treatment. It is possible to obtain quantitative information on the presence or absence of genes (or expressed genes). Thus, DNA array technology is supported by addressing technology and hybridization technology that correlates the homology of nucleic acids.
[0005]
Based on the technique described above, genomic genes can be obtained by cutting genomic genes into appropriate lengths and analyzing them with DNA arrays. In addition to performing amplification for a specific range of sequences using techniques such as PCR, it is possible to know the genome information of individual organisms such as single nucleotide polymorphisms, as well as the gene expression status for each tissue in an individual, It is also possible to know the gene expression state for each time scale of the developmental stage and the developmental stage. This method is generally called gene expression analysis, and is used for knowing the kind and quantitative information of mRNA transcribed from genomic DNA or for the purpose of comparison.
[0006]
The target of analysis using the DNA array is mainly genomic DNA and mRNA. As described above, the DNA array method needs to detect hybrid multi-stranded nucleic acid formed by complementary nucleic acids, but the amount of nucleic acid collected from the living body is very small, and it is suitable for detection. It is hard to say that it is a seed. Therefore, at present, the method most widely used for detection is a method called a nucleic acid labeling method. This method is described in detail in many books and literatures, and there are many similar methods. However, the labeling principle is that a labeled nucleotide is used when creating a copy of a nucleic acid to be detected. The purpose is to incorporate and label a nucleic acid polymer (oligomer) produced by using triphosphate as a raw material for replication. Known labeling methods include direct labeling methods such as RI (radioisotope) and fluorescent dyes, and indirect labeling methods such as biotin and digoxigenin. In the case of RI labeling, radiation detection is performed, in the case of fluorescent dye labeling, fluorescence detection is performed, and in the case of biotin and digoxigenin, detection is performed after appropriate processing so that it can be detected by fluorescence or chemiluminescence. The detection system is designed so that it can be detected with sensitivity.
[0007]
However, two main problems have been pointed out regarding detection of hybrids based on these labeling methods. One is to replicate the nucleic acid used for labeling, that is, in PCR (polymerase chain reaction) and RT (reverse transcription) reactions, the quantitative relative relationship of the original nucleic acid mixture is precisely It may not be reflected. The other is that, except for the RI labeling method, the duplicated gene nucleic acid becomes another chemical species that cannot be accurately replicated due to the binding of the labeling compound. Specific problems in this regard include reduced hybridization efficiency (quantitative decrease) and misrecognition (reduced information quality) based on reduced recognition of probe and sample nucleic acids. , Could be a fundamental problem with labeling.
[0008]
As described above, the labeling method has an essential problem. For this reason, as a method that can solve these problems, there has been proposed a method for detecting a hybrid double-stranded nucleic acid without labeling, that is, without labeling. Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-199898 describes a method of detecting the formation of a hybrid using an intercalator modified with an electrochemically active chemical species by forming a hybrid on an electrode. According to this method, hybrid double strands formed by hybridization in the DNA array method can be detected without labeling, so this method is considered to be a method that can solve the problems of the labeling method. It is done. However, although this method has some advantages such as the miniaturization of the detection apparatus, it is necessary to immobilize the probe nucleic acid on the electrode surface for electrochemical detection, and many simultaneously In order to detect this, it is necessary to prepare a large number of electrodes on a plane and immobilize the probe nucleic acid on each of them, and there are many obstacles to be overcome as a detection method. Further, even in the signal / background ratio, the discrimination between hybrid and non-hybrid (probe single strand) is not always sufficient, and it is difficult to perform quantitative detection.
[0009]
As another method, a method using a fluorescent dye whose fluorescence intensity is increased by interaction with a multi-stranded nucleic acid can be considered. If there is a dye whose fluorescence intensity is low in the interaction with the probe nucleic acid (single strand) and whose fluorescence intensity is remarkably increased by the interaction with the multiple strand formed by hybridization, the hybrid double strand without labeling. Will be detectable. The dye marketed by Molecular Probes under the trade name PicoGreen is said to be able to quantify double-stranded nucleic acids, but it emits considerable fluorescence even when single-stranded nucleic acids are present, so it has a high signal / background ratio. Cannot be expected.
[0010]
In the trace component detection method, since the probe is generally used in an excessive amount with respect to the detection target, in order to detect the hybrid double-stranded nucleic acid without labeling, the probe single-stranded nucleic acid that is present in excess and the high level are detected. A method capable of accurately discriminating the double-stranded nucleic acid formed by hybridization is required, but such a method has not been known so far.
[0011]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a compound that emits a high signal as distinguished from a single strand by interaction with a multi-stranded nucleic acid, and further provides a method for measuring a multi-stranded nucleic acid using such a compound. That is.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors simply controlled the affinity for single-stranded nucleic acid and multi-stranded nucleic acid in order to distinguish single-stranded nucleic acid and multi-stranded nucleic acid strictly. Thus, it has been considered that it is an extremely difficult task to design such that it binds only to a multi-stranded nucleic acid and emits a detectable signal. And based on the idea completely different from the known method, the present inventors have devised the following method. That is, even if the difference in binding between the single-stranded nucleic acid and the multi-stranded nucleic acid is not large, it is substantially colorless when only the single-stranded nucleic acid is present (when no multi-stranded nucleic acid is present). In the case of using a compound that changes color when a multi-stranded nucleic acid is present and emits fluorescence, no light absorption occurs in the case of a single-stranded nucleic acid, and thus fluorescence is not observed. When present, light absorption occurs and fluorescence can be observed. The present inventors have verified the above method, confirmed that this method is an extremely excellent method for measuring multi-stranded nucleic acids, and have completed the present invention.
[0013]
That is, the present invention is a method for optically measuring a multi-stranded nucleic acid, comprising a step of bringing a compound capable of interacting with the multi-stranded nucleic acid into contact with the multi-stranded nucleic acid, wherein the compound has the following properties:
(a) in the absence of multi-stranded nucleic acid, can exist in a substantially colorless and non-fluorescent state in an aqueous solution under at least one condition;
(b) When a multi-stranded nucleic acid is present under the conditions of (a) above, it substantially changes in color due to the interaction with the multi-stranded nucleic acid, and substantially exhibits fluorescence due to the interaction.
A method is provided which is a compound having
[0014]
Further, according to the present invention, there is provided a method for optically measuring a multi-stranded nucleic acid, comprising the step of bringing a compound capable of interacting with the multi-stranded nucleic acid into contact with the multi-stranded nucleic acid, wherein the compound has the following properties;
(c) substantially non-fluorescent in an unprotonated state in aqueous solution in the absence of multi-stranded nucleic acid,
(d) can exist in a substantially colorless and substantially non-fluorescent state in the protonated state in aqueous solution under at least one condition in the absence of multi-stranded nucleic acid; and
(e) When a multi-stranded nucleic acid is present under the conditions of (d) above, it substantially changes in color due to interaction with the multi-stranded nucleic acid, and substantially exhibits fluorescence due to the interaction.
Also provided are methods that are compounds having:
[0015]
According to a preferred aspect of the invention, the compound capable of interacting with a multi-stranded nucleic acid is a group consisting of compounds represented by the following general formulas (II), (III), (IV) and (V):
[Formula 4]

(Wherein R¹, R²And R^ThreeEach independently represents a hydrogen atom or a substituent, and R¹And R²And R²And R^ThreeMay combine with each other to form a ring; Q is an oxygen atom, a sulfur atom, -N (R^{twenty four})-Or -C (R^{twenty four}) (R^{twenty five})-(R^{twenty four}And R^{twenty five}Each independently represents an alkyl group, an aryl group, or a heterocyclic group, and R^{twenty four}And R^{twenty five}May combine with each other to form a 3- to 8-membered ring); R⁶Represents an alkyl group, an aryl group, or a heterocyclic group;⁶Is R¹, R^Three, G, or V₂To form a ring; R⁷, R⁸And R⁹Is a hydrogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, halogen atom, -OR^Ten, -SR¹¹Or -N (R¹²) (R¹³) But R⁷And R⁸, R⁸And R⁹And R⁷And R⁹May combine with each other to form a ring (R^Ten, R¹¹, R¹²And R¹³Each independently represents an alkyl group, an aryl group, an acyl group, a sulfonyl group, or a heterocyclic group,¹²And R¹³May combine with each other to form a ring); n represents an integer of 0, 1, 2, or 3, and when n is 2 or more, each R⁸Or each R⁹May be the same or different; V¹And V²Are each independently -C (R^Five) = Or a nitrogen atom; m represents 0 or 1; G represents a group of atoms necessary to form a 5- or 6-membered nitrogen-containing heterocycle, and includes the formed 5- or 6-membered ring. The nitrogen heterocycle may further have a fused ring; R^FiveRepresents a hydrogen atom or a substituent)
The above method selected from is provided.
[0016]
According to another preferred embodiment, the compound capable of interacting with a multi-stranded nucleic acid is a group consisting of compounds represented by the following general formulas (VI), (VII), (VIII), and (IX):
[Chemical formula 5]

(Wherein R¹, R², R^Three, R⁶, Q, and n are as defined above, and R⁶Is R¹, R^Three, R¹⁵Or R¹⁷To form a ring; R¹⁴, R¹⁵, R¹⁶And R¹⁷Are a hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, aryl group, amino group, hydroxyl group, alkoxy group, aryloxy group, alkylthio group, arylthio group, acylamino group, sulfonylamino group, heterocyclic group, cyano, respectively. A substituent selected from the group consisting of a group, a sulfonyl group, a sulfinyl group, a nitro group, a sulfo group, a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group, an aryloxycarbonyl group, a carbamoyl group, a sulfamoyl group, and a mercapto group,¹⁴And R¹⁵And R¹⁶And R¹⁷May combine with each other to form a 5- to 8-membered ring)
Also provided is the above method selected from:
[0017]
Furthermore, according to the present invention, there is provided an optical measurement method for a multi-stranded nucleic acid,
(1) contacting the compound (B) in the following general formula (I) with a multi-stranded nucleic acid; and
(2) A step of measuring the fluorescence of the compound (C) generated by the interaction between the compound (B) and the multi-stranded nucleic acid
[Chemical 6]

(Where the two-way arrows indicate chemical equilibrium;
Compound (A) represents a substantially non-fluorescent compound;
Compound (B) represents a compound that is substantially non-fluorescent under at least one condition and does not have an absorption maximum at 400-1000 nm;
Compound (C) is generated by the interaction between compound (B) and a multi-stranded nucleic acid under the above conditions, has an absorption maximum at 400 to 1000 nm, and substantially exhibits fluorescence due to the above interaction. Indicates a compound that:
X represents an atomic group necessary for binding to -C (R) = Y to form a dye molecule; Y represents an atom necessary for binding to X-C (R) = to form a dye molecule. R represents a hydrogen atom or a substituent, and may combine with X and / or Y to form a ring; Y ′ represents a protonation of a C═Y double bond in compound (A). And Z represents the conjugate base of the acid HZ, which may be bound to X, Y (or Y ′), or R).
Is provided.
[0018]
According to a preferred embodiment of the present invention, the compound (A) is selected from the group consisting of the compounds represented by the general formulas (II), (III), (IV) and (V); ) Is selected from the group consisting of the compounds represented by general formulas (VI), (VII), (VIII), and (IX).
[0019]
According to a preferred embodiment of these inventions, the above method comprising the step of interacting with a multi-stranded nucleic acid in a solution state, and the above method comprising the step of interacting with a multi-stranded nucleic acid immobilized on a solid support. Provided.
[0020]
From yet another aspect, the present invention includes a reagent for optically measuring a multi-stranded nucleic acid, which comprises a compound capable of interacting with the multi-stranded nucleic acid, wherein the compound has the following properties:
(a) in the absence of multi-stranded nucleic acid, can exist in a substantially colorless and non-fluorescent state in an aqueous solution under at least one condition;
(b) When a multi-stranded nucleic acid is present under the conditions of (a) above, it substantially changes in color due to the interaction with the multi-stranded nucleic acid, and substantially exhibits fluorescence due to the interaction.
A reagent is provided that is a compound having:
[0021]
The present invention also provides a reagent for optically measuring a multi-stranded nucleic acid, comprising a compound capable of interacting with the multi-stranded nucleic acid, wherein the compound has the following properties:
(c) substantially non-fluorescent in an unprotonated state in aqueous solution in the absence of multi-stranded nucleic acid,
(d) can exist in a substantially colorless and substantially non-fluorescent state in the protonated state in aqueous solution under at least one condition in the absence of multi-stranded nucleic acid; and
(e) When a multi-stranded nucleic acid is present under the conditions of (d) above, it substantially changes in color due to interaction with the multi-stranded nucleic acid, and substantially exhibits fluorescence due to the interaction.
A reagent is provided that is a compound having:
Preferred examples of the compounds contained in these reagents include compounds selected from the group consisting of the above general formulas (II), (III), (IV), and (V), or the above general formulas (VI), (VII). , (VIII), and (IX).
[0022]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The method of the present invention is a method for optically measuring a multi-stranded nucleic acid, comprising the step of contacting a compound capable of interacting with the multi-stranded nucleic acid with the multi-stranded nucleic acid, wherein the compound has the following properties:
(a) in the absence of multi-stranded nucleic acid, can exist in a substantially colorless and non-fluorescent state in an aqueous solution under at least one condition;
(b) When a multi-stranded nucleic acid is present under the conditions of (a) above, it substantially changes in color due to the interaction with the multi-stranded nucleic acid, and substantially exhibits fluorescence due to the interaction.
It is the compound which has this.
[0023]
In the present specification, “colorless” means that the maximum molecular extinction coefficient at 400 to 1000 nm (the numerical range represented by “to” in this specification is a range including an upper limit and a lower limit unless otherwise specified) is 0. Is less than 8000, preferably 0 to less than 5000, and most preferably 0 to less than 3000. Further, the term “colored” means that the maximum molecular extinction coefficient at 400 to 1000 nm is 20000 or more, preferably 30000 or more, and most preferably 40000 or more. The change rate of the molecular extinction coefficient from the colorless state to the colored state is 5 times or more, preferably 7 times or more, and most preferably 10 times or more.
[0024]
In this specification, “interactable” means that the compound and the multi-stranded nucleic acid have an affinity, and can perform some physicochemical interaction such as energy transfer by reversible binding. However, this term should not be construed as limiting in any way and should be interpreted in the broadest sense. “Under at least one condition, it can exist in a substantially colorless and non-fluorescent state in an aqueous solution” means that in a state where conditions such as pH and salt concentration in a solution state are appropriately selected, It means that the compound has the properties defined above, and any properties other than those conditions may be used. A person skilled in the art can easily determine whether or not a compound has a desired property by appropriately selecting the pH and salt concentration of a solution by an ordinary method.
[0025]
In this specification, a multi-stranded nucleic acid refers to a state in which nucleic acids are assembled by an interaction derived from a complementary sequence (the process of generating a multi-stranded nucleic acid by the interaction may be referred to as “hybridization”). A multi-stranded nucleic acid is known to be in a double-stranded, triple-stranded, or quadruplex state, and the multi-stranded nucleic acid in the present specification includes these multiple strands. In addition to DNA or RNA, many of these chemically modified substances are known as nucleic acids, and nucleic acid analogs having a polypeptide chain called PNA as the main chain are also known. Nucleic acids include all of these. Nucleic acids that are more preferably used in the present invention are DNA, RNA, and chemically modified products thereof, and double-stranded, triple-stranded, or quadruplexed strands are preferred. A multi-stranded nucleic acid generated by hybridization of a probe nucleic acid and a sample nucleic acid is referred to herein as a “hybrid multi-stranded nucleic acid”.
[0026]
As the compound having the above-described characteristics used in the method of the present invention, for example, a dye compound having a property of becoming substantially colorless by being protonated in a solution state can be used. For example, some cyanine dyes become colorless by being protonated in an aqueous solution. For example, many benzimida carbocyanine dyes have such properties. This phenomenon is thought to be caused by the dye conjugate system being cut and colorless as a result of protonation on the methine chain carbon of the cyanine dye. In this case, the cyanine dye is considered to be in an equilibrium between the original dye state and the protonated and colorless state depending on the proton concentration of the system.
[0027]
The compound suitably used in the method of the present invention is a dye compound capable of interacting with a multi-stranded nucleic acid and has the following characteristics.
(c) substantially non-fluorescent in an unprotonated state in aqueous solution in the absence of multi-stranded nucleic acid,
(d) can exist in a substantially colorless and substantially non-fluorescent state in the protonated state in aqueous solution under at least one condition in the absence of multi-stranded nucleic acid; and
(e) When a multi-stranded nucleic acid is present under the conditions of (d) above, it substantially changes in color due to interaction with the multi-stranded nucleic acid, and substantially exhibits fluorescence due to the interaction. .
[0028]
Without being bound to any particular theory, the principle of the preferred embodiment of the present invention is that the dye compound, which has been decolorized by protonation, interacts with the multi-stranded nucleic acid and depends on the interaction energy received from the multi-stranded nucleic acid. This is based on the fact that the equilibrium shifts to the dye state (recovery of the dye-conjugated system) and coloration, and that the substantially colorless state is maintained in the absence of the multi-stranded nucleic acid. Even if single-stranded nucleic acid is present in the reaction system, the interaction energy between the dye and the single-stranded nucleic acid is small, so that the substantially colorless state is maintained. The action is sufficiently large, and the colorless dye changes into a colored dye through interaction with the multi-stranded nucleic acid. As a result, the dye absorbs light and can exhibit fluorescence.
[0029]
As a preferred embodiment of the present invention, the following steps:
(1) contacting the compound (B) in the following general formula (I) with a multi-stranded nucleic acid; and
(2) A step of measuring the fluorescence of the compound (C) generated by the interaction between the compound (B) and the multi-stranded nucleic acid
Can be exemplified.
[Chemical 7]

Where the two-way arrows indicate chemical equilibrium;
Compound (A) represents a substantially non-fluorescent compound;
Compound (B) represents a compound that is substantially non-fluorescent under at least one condition and does not have an absorption maximum at 400-1000 nm;
Compound (C) is generated by the interaction between compound (B) and a multi-stranded nucleic acid under the above conditions, has an absorption maximum at 400 to 1000 nm, and substantially exhibits fluorescence due to the above interaction. Indicates a compound that:
X represents an atomic group necessary for binding to -C (R) = Y to form a dye molecule; Y represents an atom necessary for binding to X-C (R) = to form a dye molecule. R represents a hydrogen atom or a substituent, and may combine with X and / or Y to form a ring; Y ′ represents a protonation of a C═Y double bond in compound (A). And Z represents the conjugate base of the acid HZ and may be bonded to X, Y (or Y ′), or R.
[0030]
In the following, preferred basic skeletons formed by X and Y are listed as (DX) and (DY), respectively, but the scope of the compounds used in the method of the present invention is not limited to these examples. In the structures represented by (DX) and (DY), A represents an alkyl group, an aromatic group, or a lone pair, and when two or more A's are present, each may be the same or different. (In the formula, when A represents an alkyl group or an aromatic group, the counter ion and the ion code are omitted). A ′ and A ″ each represents an alkyl group or an aromatic group. K represents an integer of 0, 1 or 2. The hydrogen atom may be substituted with a substituent, and if possible, a condensed ring. A structure may be formed.
[0031]
[Chemical 8]

[0032]
[Chemical 9]

[0033]
Embedded image

[0034]
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[0035]
A dye compound capable of interacting with a multi-stranded nucleic acid, (c) substantially non-fluorescent in an unprotonated state in an aqueous solution in the absence of the multi-stranded nucleic acid; In the presence, it can exist in an aqueous solution in a protonated state in a substantially colorless and substantially non-fluorescent state in at least one condition, and (e) multiple under the conditions of (d) above. In the presence of a strand nucleic acid, a compound that changes substantially in color due to interaction with a multi-stranded nucleic acid and that substantially exhibits fluorescence due to the interaction is represented by the following general formulas (II) and (III ), (IV), or (V) is more preferable.
Embedded image

Where R¹, R², R^ThreeEach independently represents a hydrogen atom or a substituent, and R¹And R²And R²And R^ThreeMay combine with each other to form a ring if possible. R¹, R²And R^ThreeIs a halogen atom, alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, aryl group, amino group, hydroxyl group, alkoxy group, aryloxy group, alkylthio group, arylthio group, acylamino group, sulfonylamino group, hetero A cyclic group, a cyano group, a sulfonyl group, a sulfinyl group, a nitro group, a sulfo group, a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group, an aryloxycarbonyl group, a carbamoyl group, and a sulfamoyl group, and these substituents may be further substituted. . The total number of atoms of these substituents is preferably 1 to 50, more preferably 1 to 35, and still more preferably 1 to 25. R¹And R²And R²And R^ThreeThe ring formed by bonding to each other is preferably a 5- to 8-membered ring, which may be a non-aromatic or aromatic ring, and may be either a carbocyclic ring or a heterocyclic ring.
[0036]
Q is an oxygen atom, a sulfur atom, -N (R^{twenty four})-Or -C (R^{twenty four}) (R^{twenty five}) −. R^{twenty four}And R^{twenty five}Each independently represents an alkyl group, an aryl group, or a heterocyclic group. R^{twenty four}And R^{twenty five}May combine with each other to form a 3- to 8-membered ring. R^{twenty four}And R^{twenty five}The alkyl group, aryl group, or heterocyclic group represented by may be further substituted, and the total number of atoms is preferably from 3 to 50, more preferably from 3 to 35, and even more preferably from 3 to 25. Q is preferably an oxygen atom or a sulfur atom, and most preferably a sulfur atom. R⁶Represents an alkyl group, an aryl group, or a heterocyclic group, and these substituents may be further substituted, and the total number of atoms is preferably 4 to 50, more preferably 4 to 35, and further more preferably 4 to 25. preferable. R⁶R if possible¹, R^Three, G, or V₂To form a ring.
[0037]
R⁷, R⁸And R⁹Is a hydrogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, halogen atom, -OR^Ten, -SR¹¹Or -N (R¹²) (R¹³). R⁷And R⁸, R⁸And R⁹And R⁷And R⁹May combine with each other to form a ring, and the formed ring is preferably a 5- to 8-membered ring. R⁷, R⁸And R⁹Is preferably a hydrogen atom, an alkyl group or an aryl group, more preferably a hydrogen atom or an alkyl group. R⁷, R⁸And R⁹When is other than a hydrogen atom, these groups may further have a substituent, and the total number of atoms is preferably 1 to 35, more preferably 1 to 25, and still more preferably 1 to 20. R^Ten, R¹¹, R¹²And R¹³Each independently represents an alkyl group, an aryl group, an acyl group, a sulfonyl group, or a heterocyclic group. R¹²And R¹³May combine with each other to form a ring, and the formed ring is preferably a 5- to 8-membered ring. R^Ten, R¹¹, R¹²And R¹³These groups may be further substituted, and the total number of atoms is preferably 4 to 50, more preferably 4 to 35, and still more preferably 4 to 25.
[0038]
n represents an integer of 0, 1, 2, or 3. When n is 2 or more, each R in the repeating unit⁸Or each R⁹May be the same or different. V₁And V₂Are independently -CR^Five= Represents a nitrogen atom, and m represents 0 or 1. G represents an atomic group necessary for forming a 5- or 6-membered nitrogen-containing heterocycle, and the heterocycle may further have a condensed ring. The ring formed is preferably a 5- to 8-membered ring. R^FiveRepresents a hydrogen atom or a substituent, R^FiveWhen is a substituent, examples of the substituent are R¹, R²And R^ThreeWhat was mentioned as an example of this is preferable, and this substituent may have a substituent further, and 1-50 are preferable as a total number of atoms, 1-35 are more preferable, and 1-25 are more preferable.
[0039]
In order to enhance the interaction with the nucleic acid, the above compound preferably has one or more cationic groups in any substituent. The term “cationic group” is used as a concept including a cation that can be converted into a cation by protonation. Examples of the cationic group include a sulfonium group, a phosphonium group, an amino group, or an ammonium group, and an amino group or an ammonium group is most preferable. As the bonding position, R in the general formulas (VI) to (IX) is preferable.¹, R², R^Three, R¹⁴, R¹⁵, R¹⁶, R¹⁷Or R⁶It is.
[0040]
Preferable examples of the compound that exhibits fluorescence upon contact with a multi-stranded nucleic acid include compounds represented by the following general formulas (VI), (VII), (VIII), and (IX).
[0041]
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[0042]
Where R¹, R², R^Three, R⁶, Q, and n have the same meanings as in general formulas (II) to (V). R¹⁴, R¹⁵, R¹⁶And R¹⁷Are a hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, aryl group, amino group, hydroxyl group, alkoxy group, aryloxy group, alkylthio group, arylthio group, acylamino group, sulfonylamino group, heterocyclic group, cyano, respectively. Represents a substituent selected from the group consisting of a group, a sulfonyl group, a sulfinyl group, a nitro group, a sulfo group, a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group, an aryloxycarbonyl group, a carbamoyl group, a sulfamoyl group, and a mercapto group. These substituents may be further substituted, and the total number of atoms is preferably 1 to 50, more preferably 1 to 35, and still more preferably 1 to 25. R¹⁴And R¹⁵And R¹⁶And R¹⁷May combine with each other to form a 5- to 8-membered ring. The formed ring may be either non-aromatic or aromatic, and may be either a carbocyclic ring or a heterocyclic ring, but is more preferably an aromatic ring.
[0043]
Specific examples of the compound suitably used in the method of the present invention are listed below, but the method of the present invention is not limited to the case of using these compounds.
[0044]
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[0045]
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[0046]
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[0047]
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[0048]
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[0049]
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[0050]
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[0051]
The above compounds are generally classified as dye bases in cyanine dyes, but general synthesis methods are known in the art and can be easily synthesized by those skilled in the art. For example, the methods described in US Pat. Nos. 5,656,449 and 5,658,751 are preferably applicable. For example, the compound can be easily produced by adopting the synthesis method described below depending on whether n is 0 or 1 or more in the compounds represented by the general formulas (VI) to (IX). It is.
[0052]
<When n = 0>
The object of Method 1 corresponds to the general formula (VII), and the same reaction can be applied to the general formula (IX). In the formula, Prot. Represents a deprotectable alkyl group, and in addition to the methoxyethoxymethyl group described in US Pat. No. 5,656,449, a methylthiomethyl group, a 4-methoxybenzyl group, and the like can also be used. The dyeing reaction can be performed using a base such as triethylamine in an aprotic solvent such as dichloromethane or dimethylformamide. The deprotection reaction after the dyeing reaction was carried out using the Prot. However, it can be deprotected under acidic conditions in the case of a methoxyethoxymethyl group, 4-methoxybenzyl group or the like, and in the case of a 4-methoxybenzyl group, even under oxidative conditions. For details, “Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition”, Theodora W. Greene, Peter G. M. Wuts (Wiley, 1999) can be referred to.
[0053]
The target product of Method 2 corresponds to the general formula (VI), and the same reaction can be applied to the general formula (VIII). In the formula, L represents a detachable group, and a halogen atom, an alkylthio group, an arylthio group, an alkoxy group, an aryloxy group, and the like are preferably used, but an alkylthio group is generally used. The dyeing reaction is carried out in an aprotic polar solvent such as dimethylformamide using an acid such as p-toluenesulfonic acid as a catalyst, as shown in U.S. Pat. No. 5,656,449. It can be synthesized by the action of acetic anhydride.
[0054]
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In the case of Q = sulfur atom, in order to synthesize 2-alkylthiothiazolopyridines as a raw material of the dye, the corresponding method is described, for example, as described in Heterocycles, 1993, page 133. Methyl iodide can be allowed to act on thiazolopyridine-2-thiones in dimethylformamide in the presence of a base such as potassium carbonate. In order to synthesize a thiazolopyridine-2-thione skeleton, the following two synthesis routes using 2-aminopyridines as raw materials can be appropriately selected.
[0055]
As a first method, aminopyridines brominated or chlorinated at the ortho position of the amino group are reacted with potassium ethyl xanthate in 1-methyl-2-pyrrolidone under heating conditions (160 to 170 ° C.). As a result, thiazolopyridine-2-thiones can be obtained. Also, as described in Heterocycles, 1993, p. 133, pyridin-2-ones are used as raw materials, and after regioselectively brominating them, phosphorus oxychloride and aqueous ammonia are added. It is also possible to synthesize 2-amino-3-bromopyridines by subsequent reaction.
[0056]
In the second method, as described in Journal of Medicinal Chemistry (J. Med. Chem.), 1967, p. 126, first, 2-aminopyridines are reacted with thiocyanate in the presence of bromine. 2-Aminothiazolopyridines are synthesized by reacting potassium acid. The obtained 2-aminothiazolopyridine is reacted with sodium nitrite according to a conventional method to form a diazonium salt, and then reacted with copper (I) chloride to synthesize the corresponding 2-chlorothiazolopyridine. Further, by reacting 2-chlorothiazolopyridine with thiourea and hydrolyzing, the desired thiazolopyridine-2-thiones can be obtained.
[0057]
Any of the above methods for synthesizing a thiazolopyridine-2-thione skeleton can use aminopyridines or pyridine-2-ones as a raw material, but the present invention is not limited thereto. (Specific examples are Chem. Ber., 1959, p. 869) and aminoisoquinolines (specific examples are Canadian Journal of Chemistry, 1966). Applied to other condensed ring compounds containing heteroatoms (specific examples include Journal of Medicinal Chemistry (1995, page 2546)). Is possible. R of 2-aminopyridines which are starting materials for the above synthesis steps¹, R², R^ThreeIt is possible to introduce various substituents into thioazolopyridine-2-thione, which is an intermediate for producing a compound that can be used in the method of the present invention.
[0058]
Regarding aminopyridines analogs, there are many commercially available reagents for aminopyridines in which the ortho position of the amino group is brominated or chlorinated, but they can be easily synthesized by halogenating aminopyridines. . Bromination of aminopyridines is described in detail in Synthesis, 2001, page 2175, 3-bromo and 3,5-dibromo from 2-amino, 2-bromo from 3-amino. In addition, 3-bromo and 3,5-dibromo compounds can be selectively synthesized from 2,6-dibromo compounds and 4-amino compounds by changing the reaction conditions. In chlorination of 2-aminopyridine, as described in the literature (Zh. Russ. Fiz.-Khim. O-va, 1928, p. 685), by reacting with chlorine, the 3-chloro compound and 3,5- A dichloro form is obtained. In iodination of 2-aminopyridine, 5-iodo is obtained by allowing iodine and periodic acid to act as described in Tetrahedron Lett., 1993, page 7493.
[0059]
R¹, R², R^ThreeWhen any of these is halogen, it can be further converted into a derivative by a substitution reaction. R¹, R²Or R^ThreeCan be converted to a methoxy group by reaction with sodium methoxide as described in Australian Journal of Chemistry (Aust. J. Chem.), 1982, page 2025. Further, as described in Recl. Trav. Chim. Pays-Bas, 1956, p. 1187, it can be converted to an ethoxy group by reacting with sodium ethoxide. As described in Org. Prep. Proced. Int., 1997, p. 117, it can be converted to a hydroxyl group by reacting with a 3N aqueous sodium hydroxide solution.
R¹, R²Or R^ThreeIs a bromine atom, 2-pyridylthio is reacted with 2-mercaptopyridine in the presence of potassium t-butoxy and potassium iodide as described in Bull. Chim. Soc. Fr., page 290, 1995. Can be converted to a group. As described in Chem. Zentralbl., 1936, p. 1219, it can be converted to a methylamino group by reaction with methylamine in the presence of copper sulfate. As described in Journal of Organometallic Chemistry, 1995, page 259, it is reacted with bininylbenzene in the presence of a palladium catalyst to give 2-amino-5-styrylpyridine. Can be converted.
[0060]
R¹, R²Or R^ThreeIs an iodine atom, it reacts with methanethiol in an aqueous sodium hydroxide solution in the presence of copper powder as described in Australian Journal of Chemistry (Aust. J. Chem.), 1992, page 877. Can be converted to a methylthio group. Further, as described in Australian Journal of Chemistry (Aust. J. Chem.), 1992, page 877, propylthiol is reacted with propanethiol in an aqueous sodium hydroxide solution in the presence of copper powder. Can be converted to a group. As described in Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc), 1944, page 1479, it can be converted to a cyano group by reacting with copper cyanide. As described in Journal of Medicinal Chemistry (J. Med. Chem.), 1997, page 3109, it can be converted to a methoxy group by reacting with methanol in the presence of sodium and copper. As described in Journal of Medicinal Chemistry (J. Med. Chem.), 1981, page 1518, by reacting with 1-propanol in the presence of sodium ethoxide and copper to the 1-propoxy group. Can be converted.
[0061]
R¹, R²Or R^ThreeWhen is a halogen, it can be converted into a wider range of substituents by utilizing a coupling reaction using a transition metal catalyst. For example, as described in Heterocycles, 1987, page 2711, arylation can be performed by a coupling reaction of 2-amino-5-bromopyridine and arylboric acids using a palladium catalyst. Further, for example, as described in Journal of Medicinal Chemistry (J. Med. Chem.), 2000, page 675, a coupling reaction between 2-amino-6-bromopyridine and arylboric acids using a palladium catalyst. It can be arylated, and 2-amino-6-bromopyridine and acetylenes can be converted to palladium as described in Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc), 1995, p. 12416. By reacting in the presence of a catalyst and a copper reagent, the corresponding acetylene derivative can be obtained.
[0062]
As another method for introducing a functional group into 2-aminopyridines, nitration of 2-aminopyridine with a mixed acid, for example, Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc), 1955, 2-amino-5-nitropyridine having a nitro group introduced as described on page 3154 is obtained. When 2-aminopyridine is treated with fuming sulfuric acid or sulfuric acid / sulfur trioxide, (Bull. Soc. Chim. Fr.), 1939, p. 736, 6-amino-pyridine- 3-sulfonic acid is obtained. When benzyl chloride is allowed to act on 2-aminopyridine, 2-amino-5-benzylpyridine is obtained as described in Polish Journal of Chemistry (Pol. J. Chem.), 1984, page 959.
[0063]
R¹, R²Or R^ThreeIs a carboxyl group, it can be converted into a heterocyclic group, for example, as described in Journal of Medicinal Chemistry (J. Med. Chem.), 1996, page 3375. 2- (2-Aminopyridin-5-yl) benzothiazole is obtained by reacting amino-nicotinic acid with 2-amino-benzenethiol. Examples of 2-aminopyridine derivatives to which other heterocycles are bonded include 3,4'-bipyridin-6-amine (R¹= R^Three= H, R²= 4-pyridyl) is described in US Pat. No. 4,276,293. 2-ethyl [3,4-bipyridine] -6-amine (R¹= H, R²= 4-pyridyl, R^Three= Ethyl) is described in US Pat. No. 4,313,951.
[0064]
Various methods for introducing substituents into pyridin-2-ones are also known. Since pyridin-2-ones can be easily converted into 2-aminopyridines after the introduction of substituents, they are important in synthesizing compounds that can be used in the method of the present invention. It is. When pyridine-2-one is reacted with benzophenones, an addition reaction to the carbonyl group proceeds, and R as described in Tetrahedron, 1987, p. 2343.¹Adducts are obtained which are tertiary alcohols. Reaction of aryl aldehydes with pyridin-2-one results in R as described in Tetrahedron, 1987, page 2343.¹An adduct is obtained which is a secondary alcohol. When carbon dioxide is reacted with pyridin-2-one, R, as described in Tetrahedron, 1987, page 2343.¹Becomes a carboxyl group. Reaction of phenyl isocyanate with pyridin-2-one results in R as described in Tetrahedron, 1987, page 2343.¹Becomes an anilide group. When phenylacetyl chloride is reacted with pyridin-2-one, R, as described in Tetrahedron, 1987, page 2343.¹Becomes a phenylacetyl group. Reaction of methyl iodide with pyridin-2-one results in R as described in Tetrahedron, 1987, page 2343.¹Becomes a methyl group. Reaction of potassium peroxodisulfate with pyridin-2-one results in R as described in Tetrahedron, 1990, page 2891.²Becomes a hydroxyl group. When benzyl-2-one is reacted with benzyl bromide, R as described in Chem. Lett., 1996, p.333.²Becomes a benzyl group.
[0065]
In the above, the method of closing the thiazole ring with respect to the pyridine ring has been described. However, a synthetic route in which the thiazole ring is first constructed and then the pyridine ring is formed is also possible. Can be synthesized. Dipotassium cyanoimidodithiocarboxylate is a common intermediate that gives many 2-alkylthio-4-aminothiazoles, and can be derived into thiazolopyridines by increasing the amount of carbon. For example, 7-hydroxy-2-methylthiothiazolo [4,5-b] pyridine- is synthesized by the following synthetic route described in Journal of Heterocyclic Chem., 1984, page 1361. 6-carboxylic acid ester is obtained. Furthermore, 7-hydroxythiazolo [4,5-b] pyridones can be synthesized as described in the literature (J. Prakt. Chem., 1979, page 260) by utilizing the same kind of reaction.
[0066]
Similarly, as a method of constructing from a thiazole ring, 2-methylthiothiazolo [5,4-b] pyridine can be obtained using aminoacetonitrile as a raw material. Specifically, the synthetic route described in Journal of Heterocyclic Chemistry (J. Heterocyclic Chem.) Can be mentioned. In addition, a thiazolonaphthyridine skeleton can be synthesized as a condensed ring compound as follows. The synthesis of intermediate 1,6-naphthyridinones is described in J. Heterocyclic Chem., 1990, p. 2085, from which derivatization to thiazolonaphthyridines Is described in detail in Heterocycles, 1993, page 133.
[0067]
When Q is an oxygen atom, basically 2-aminopyridine having a hydroxyl group at the 3-position is converted to oxazolopyridine-2-thione by the action of carbon disulfide, thiophosgene, or potassium xanthate, and then thiazolo. As with pyridines, a method of alkylating a sulfur atom bonded to the 2-position with an alkylating reagent is common. 2-Alkylthio-oxazolopyridines can be prepared by reacting the corresponding oxazolopyridine-2-thiones with potassium carbonate in dimethylformamide, as described, for example, in Heterocycles, 1993, page 133. It can be easily obtained by reacting methyl iodide in the presence of a base such as To synthesize oxazolopyridine-2-thiones, first, 3-hydroxypyridines are nitrated with a mixed acid, and then the obtained nitro compound is reduced to synthesize 2-amino-3-hydroxypyridines. . As for these processes, for example, those described in Pharmaceutical Bulletin (Pharm. Bull.) Are known. Further, 2-amino-3-hydroxypyridines may be converted into 2-amino-3-hydroxypyridines as described in Chem. Heterocycl. Compd., 1981, page 441. Oxazolopyridine-2-thiones are synthesized by allowing potassium ethylxanthate to act on ethanol. Alternatively, as described in Pharmaceutical Bulletin (Pharm. Bull.), 1957, p. 4625, 2-amino-3-hydroxypyridines are disulfide in aqueous methanol solution of potassium hydroxide. Oxazolopyridine-2-thiones are also synthesized by the action of carbon.
[0068]
The following synthesis examples are known for nitration of 3-hydroxypyridines. As for nitration of 3-hydroxy-4-methylpyridine, for example, those described in Hetereoctcles., 1994, p. 529 are known. The nitration of 3-hydroxy-5-methylpyridine is known, for example, as described in Journal of Medicinal Chemistry (J. Med. Chem.), 1987, page 2031. As for nitration of 3-hydroxy-6-methylpyridine, for example, the one described in Journal of Medicinal Chemistry (J. Med. Chem.), 1987, page 2031 is known. Similarly, 4-hydroxyisoquinoline can be nitrated. For example, those described in Chemical Pharmaceutical Bulletin (Chem. Pharm. Bull.), 1959, p.501 are known.
[0069]
As a method for introducing an amino group into 3-hydroxypyridines, the following methods are known in addition to the above-described reduction of the nitro group. As a method for allowing ammonia to act on 3-hydroxy-2-iodopyridines in the presence of copper sulfate, the method described in (Rocz. Chem.), 1936, p. 502 is known. As a method for allowing sodium amide to act on 3-hydroxypyridines, those described in the literature (Zh. Prikl. Khim., 1949, page 1103) are known. As a method for allowing sodium hypobromite to act on 3-hydroxypyridine-2-carboxylic acid amide, one described in the literature (Biochem. J., 1950, page 506) is known. As a method for allowing sodium hydrosulfite to act on 3-hydroxy-2-phenylazopyridines, those described in the literature (Prace. Minist. Prizem. Chem., 1952, page 14) are known. As a method of causing hydrazine hydrate to act on 3-hydroxy-2-chloropyridines, the method described in Journal of Medicinal Chemistry (J. Med. Chem.), 1994, page 248 is known. Yes.
[0070]
Q is -N (R^{twenty four}In the case of)-, basically, a 2-aminopyridine derivative having a substituted amino group at the 3-position is converted to imidazolopyridine-2-thione using carbon disulfide or thiophosgene, and then with thiazolopyridines. Similarly, a method of alkylating a sulfur atom at the 2-position is common. In order to obtain a 2-aminopyridine derivative having a substituted amino group at the 3-position, the substituent introduction method in the case of Q = sulfur atom can be referred to. Q is -C (R^{twenty four}) (R^{twenty five}In the case of)-, first, a pyrrolino [2,3-b] pyridin-2-one skeleton is synthesized, and then R at the 3-position.^{twenty four}And R^{twenty five}Can be synthesized by converting the lactam oxygen atom at the 2-position into a sulfur atom using a Lawson reagent or the like.
[0071]
Regarding the synthesis method in the case of n ≧ 1, the object of Method 3 and Method 4 corresponds to the general formula (VI), and the same reaction can be applied to the general formula (VIII). Any of the methods 3 and 4 can be preferably used, and can be appropriately selected depending on the yield of the synthetic intermediate and the generated dye and ease of purification. The difference from the case of n = 0 is that the 2-position of the azolopyridines used as a raw material is a methyl group. A method for synthesizing the 2-methyl compound will be described later.
[0072]
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[0073]
The methine carbon chain extension when n ≧ 1 is N, N′-diphenylformamidine when n = 1, and the vinylogous body added with a vinyl group according to the number of methine carbon chains when n ≧ 2. It can be performed using an acid anhydride such as acetic anhydride. The reaction temperature can be selected from room temperature to about 180 ° C. As the solvent, an acid anhydride such as acetic anhydride can be used, but various aprotic solvents can also be preferably used. These reactions are very common in the industry.
[0074]
In the dyeing reaction, a protic or aprotic solvent can be used, and the dyeing may proceed by simply heating. Preferably, it can be carried out using a base such as triethylamine or pyridines in an aprotic solvent, and the reaction temperature is preferably from room temperature to about 120 ° C. This reaction is also a very common reaction in the industry, and various reaction conditions other than those described above can be used.
[0075]
In the formula, Prot. Represents a deprotectable alkyl group, and in addition to the methoxyethoxymethyl group described in US Pat. No. 5,656,449, a methylthiomethyl group, a 4-methoxybenzyl group, and the like can also be used. The deprotection reaction after the dyeing reaction was carried out using the Prot. However, it can be deprotected under acidic conditions in the case of a methoxyethoxymethyl group, 4-methoxybenzyl group or the like, and in the case of a 4-methoxybenzyl group, even under oxidative conditions. For details, “Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition”, Theodora W. Greene, Peter G. M. Wuts (Wiley, 1999) can be referred to.
[0076]
The object of method 5 and method 6 corresponds to general formula (VII), and the same reaction can be applied to general formula (IX). The reaction shown here is basically the same as method 3 and method 4.
[0077]
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Regarding the synthesis of 2-methylazolopyridines, when Q is an oxygen atom or -N (R24)-, the reaction is converted to azolopyridine-2-thione using carbon disulfide, thiophosgene or potassium xanthate. In this case, heating is performed using acetic anhydride instead of carbon disulfide, thiophosgene or potassium xanthate, heating in the presence of an orthoacetate such as triethyl orthoacetate and an acid catalyst such as p-toluenesulfonic acid. Can be synthesized. In this case, the reaction temperature is preferably 100 to 170 ° C., and it is usually preferable to use a reaction reagent as a solvent.
[0078]
When Q is a sulfur atom, the intermediate 2-amino-3-halopyridine described in the synthesis method when n = 0 is heated in the presence of an acid catalyst such as orthoacetic acid esters and paratoluenesulfonic acid. And then converted to 2-acetylamino-3-halopyridines, and further converted into 2-thioacetylamino-3-halopyridines using phosphorus pentasulfide or Lawesson's reagent, and then sodium hydride or t-butoxypotassium. 2-methylthiazolopyridines can be obtained by the action of a strong base such as As a solvent for allowing a strong base to act, an ether solvent such as dioxane or tetrahydrofuran can be used. Q is -C (R^{twenty four}) (R^{twenty five}In the case of)-, synthesis is performed using a reaction known as Fischer's indole synthesis reaction described in JP-A No. 2001-270864 and Chemical Review (Chem. Rev.) 63, 373 (1963). be able to.
[0079]
Since a large number of synthesis methods are known for compounds in which the nitrogen-containing 6-membered ring is a pyridine ring, those skilled in the art can synthesize them with reference to various documents. In addition, an extremely large number of compounds are commercially available and can be easily obtained. In the case where the nitrogen-containing 6-membered ring is a quinoline ring, a synthesis method will be described below for 4-methylquinoline (repidine) and 2-methylquinoline (quinaldine) as a raw material for synthesis. With respect to lepidins, an appropriate substituent can be introduced at the 2-position of lepidin by reacting commercially available 2-chlorolepidin with an appropriate nucleophile. An example is known in which 2-chlororepidine is reacted with a primary amine, secondary amine, cyclic amine, alcohol, thiol, thiourea, fluoride, and the like.
[0080]
Examples of the reaction with a primary amine include those described in J. Am. Chem. Soc., 1949, p. 2322. Examples of the reaction with the secondary amine include those described in Yakugaku Zasshi, 1949, p.137. Examples of the reaction with a cyclic amine include those described in Synth. Commun., 2000, p. 4479, or Journal of Organic Chemistry (J. Org. Chem.), 1949, p. 771. Those described in (1) are known. Reactions with alcohols are, for example, those described in Justus Liebigs Ann. Chem., 1886, page 102, or Journal of Organic Chemistry (J. Org. Chem. ), 1951, page 1529 is known. Examples of the reaction with thiol include those described in J. Am. Chem. Soc., 1948, page 491. As the reaction with thiourea, for example, those described in Chem. Ber., 1929, page 2732 are known. In the reaction with fluoride, for example, the reaction with potassium fluoride is described in (J. Chem. Res. Synop.), 1998, page 586, and the reaction with tetrabutylammonium fluoride (Mutat. Res.), 2000, page 173. It is also possible to perform arylation by a coupling reaction of 2-chlorolepidin and arylboric acids using a palladium catalyst. For example, those described in Tetrahedron, 1992, page 8117 are known.
[0081]
It is also possible to introduce a substituent at the 2-position of lepidin by cyclization reaction of anilines and α, β-enones. As the synthesis of 2,4-dimethylquinoline, for example, the one described in Justus Liebigs Ann. Chem., 1887, page 7, is known. As the synthesis of 4-methyl-2-phenylquinoline, for example, (J. Prakt. Chem.), 1925, page 73, is known.
[0082]
Regarding the synthesis of lepidines having a suitable substituent at the 3-position, when the 3-position is chlorine or bromine, both can be synthesized using 3-methylindole as a raw material. In the case of chlorine, for example, those described in Chem. Ber., 1887, page 252 are known. In the case of bromine, for example, those described in Chem. Ber., 1887, page 2613 are known. The halogen compound obtained above can be further converted into other substituents. For example, an arylated product can be synthesized by coupling with phenylboric acid in the presence of a palladium catalyst and a base. Specific examples include those described in Tetrahedron, 1992, page 8117. It is also possible to introduce a substituent at the 3-position of lepidin by cyclization reaction of anilines and α, β-enones. Specific examples are shown below. As the synthesis of 2,4-dimethylquinoline, one described in Journal of Organic Chemistry (J. Org. Chem.), 1957, page 2882 is known.
[0083]
Repidines having an appropriate substituent at the 6-position are easily synthesized by a cyclization reaction between para-substituted anilines and 3-buten-2-ones or a synthetic equivalent thereof. As the reaction with 4-fluoroaniline, for example, those described in the literature (Mutat. Res., 2000, page 173) are known. As the reaction with 4-chloroaniline, for example, the one described in Journal of Organic Chemistry (J. Org. Chem.), 1957, page 682 is known. As the reaction with 4-bromoaniline, for example, those described in Tetrahedron Lett., 2000, page 531 are known. As the reaction with 4-methoxyaniline, for example, the one described in Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc.), 1945, p. 86 is known. As a reaction with 4-methylaniline, for example, the one described in Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc.), P. 2397, 1920 is known. As the reaction with 4-dimethylaminoaniline, for example, those described in literature (Bull. Chim. Soc. Fr., 1920, page 434) are known. As a reaction with 4-nitroaniline, for example, the one described in Justus Liebigs Ann. Chem., 1948, p. 174 is known. As the reaction with 4-benzothiazo-2-yl-aniline, for example, those described in literature (Sog. Prog. Chem., 1977, page 62) are known. Known examples of the reaction with 4-benzodiphenylphosphonoylaniline include those described in Chem. Heterocycl. Compd., P.315, 1982. As the reaction with 4-acetylaniline, for example, the one described in Chem. Heterocycl. Compd., 1984, page 767 is known. As the reaction with 4-diethylsulfamidoaniline, for example, the one described in Chem. Heterocycl. Compd., 1984, page 767 is known.
[0084]
The quinoline obtained by the above reaction can be further converted. 6-Bromo-4-methylquinoline is subjected to a coupling reaction with a phosphonic acid diester in the presence of a palladium catalyst and a base to obtain a phosphonic acid derivative. Specifically, those described in the literature (Zh. Obshch. Khim., 1986, page 2503) are known. In order to synthesize 6-amino-4-methylquinoline, 4-methyl-6-nitroquinoline synthesized using 4-nitroaniline as a raw material may be reduced. For example, Justus Liebig Anarlen der Chemie (Justus Liebigs Ann. Chem.), 1948, page 174 is known.
[0085]
In order to synthesize 4-methyl-quinoline-6-carboxylic acid, it is only necessary to oxidize 4,6-dimethylaniline synthesized using 4-methylaniline as a raw material, for example, Chem. Ber. 1890, page 2265, are known. In order to synthesize 6- (2-benzooxazolyl) -4-methyl-quinoline, 4-methyl-quinoline-6-carboxylic acid may be reacted with 2-aminophenol. Heterocyclic chemistry (J. Heterocycl. Chem.), 1977, page 937 is known. Similarly, to synthesize 6- (2-benzothiazolyl) -4-methyl-quinoline, 4-methyl-quinoline-6-carboxylic acid is reacted with 2-aminobenzenethiol, and 4-methyl-6- (2 To synthesize -oxazolo [4,5-b] pyridyl) -quinoline, 4-methyl-quinoline-6-carboxylic acid is reacted with 2-amino-3-hydroxypyridine and 6- [2- (1H To synthesize imidazo [4,5-b] pyridyl)]-4-methyl-quinoline, 4-methyl-quinoline-6-carboxylic acid is reacted with 2,3-diamino-pyridine, To synthesize 2- (1H-imidazo [4,5-c] pyridyl)]-4-methyl-quinoline, react 4-methyl-quinoline-6-carboxylic acid with 3,4-diamino-pyridine. All of these Naru of Heterocyclic Chemistry (J. Heterocycl. Chem.), 1977 years, has been known those described in 937 pages. In order to synthesize 4-methyl-quinoline-6-sulfonic acid, 4-methylquinoline may be reacted with sulfuric acid, for example, as described in Chem. Ber., 1890, page 2680. It has been known.
[0086]
Repidines having an appropriate substituent at the 7-position are easily synthesized by cyclization reaction of meta-substituted anilines with 3-buten-2-one or a synthetic equivalent thereof. As the reaction with 3-fluoroaniline, for example, (Mutat. Res.), 2000, page 173, is known. As a reaction with 3-chloroaniline, for example, the one described in Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc.), 1946, page 1851 is known. As the reaction with 3-methylaniline, for example, the one described in Journal of Organic Chemistry (J. Org. Chem.), 1957, page 682 is known. As the reaction with 3-aminophenol, for example, those described in Tetrahedron Lett., 2000, page 531 are known.
[0087]
Repidines having an appropriate substituent at the 8-position are easily synthesized by a cyclization reaction between ortho-substituted anilines and 3-buten-2-one or a synthetic equivalent thereof. As the reaction with 2-methoxyaniline, for example, the one described in Patent DE 518291 is known. As the reaction with o-toluidine, for example, the one described in Journal of Organic Chemistry (J. Org. Chem.), 1957, page 682 is known. As the reaction with 2-aminophenol, for example, the one described in Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc.), 1949, page 3986 is known. As the reaction with 2-nitroaniline, for example, the one described in Nihon Kagaku Kagaku, 1958, page 408 is known. 4-Methyl-8-nitroquinoline can also be obtained by treating lepidine with a mixed acid. For example, it is described in Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc.), 1947, p. 380. Things are known. As the reaction with 2-ethylaniline, for example, those described in Tetrahedron Asymmetry, 1995, page 419 are known. In the reaction with ethyl 2-aminobenzoate, for example, the one described in patent DE 518291 is known and 4-methylquinoline-8-carboxylic acid is obtained. 4-Methylquinoline-8-carboxylic acid can further convert the carboxyl group at the 8-position. To synthesize 8- (2-benzoxazolyl) -4-methylquinoline, 2-amino In order to react phenol and synthesize 8- (2-benzothiazolyl) -4-methylquinoline, 2-aminobenzenethiol may be reacted. For example, J. Heterocycl (J. Heterocycl Chem.), 1979, p. 1579 is known. In order to synthesize 4-methyl-8-aminoquinoline, 4-methyl-8-nitroquinoline can be reduced, for example, Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc.), 1946, page 1524 is known. Although the above description has described the synthesis of a mono-substituted product of lepidin, if a more substituted one is desired, the target product can be synthesized by combining these reactions.
[0088]
As typical embodiments of the method of the present invention, there are the following two (1) and (2).
(1) Measure multi-stranded nucleic acid in solution.
(2) In the form of a DNA array, a spot (gene) where hybridization has occurred on a solid phase carrier is measured.
In this specification, the term “measurement” should be interpreted in the broadest sense including detection and quantification, and should not be limitedly interpreted in any way. Among the above, the embodiment for detecting and quantifying a multi-stranded nucleic acid nucleic acid in a solution is not only a use for measuring a multi-stranded nucleic acid in a sample solution, but also a nucleic acid represented by PCR (polymerase chain reaction). It is extremely effective as a method for measuring a target nucleic acid sequence in a sample nucleic acid using an amplification method, and the optical measurement method of the present invention can be preferably applied.
[0089]
When measuring a multi-stranded nucleic acid in a solution, the preferred concentration of the above compound varies depending on the concentration of the multi-stranded nucleic acid to be detected, but is usually 1 × 10.^-TenMol / L to 1 × 10^-3Mol / L, more preferably 1 × 10^-9Mol / L to 1 × 10^-FourMol / L, 5 × 10^-8Mol / L to 1 × 10^-FiveMost preferred is mol / L. In order to bring the multi-stranded nucleic acid into contact with the above compound, generally, the sample nucleic acid solution and the solution of the compound of the present invention may be mixed, but the above compound may be added to the sample nucleic acid solution as a solid. Alternatively, the compound of the present invention may be adsorbed on another medium and mixed with the sample nucleic acid solution. When performing optical measurement by bringing the compound into contact with a multi-stranded nucleic acid, the detection cell may be brought into contact with the multi-stranded nucleic acid while performing optical measurement, or optically after contacting with the multi-stranded nucleic acid. May be detected. Preferably, the detection is performed between 0.01 seconds and 1000 seconds after contacting the multi-stranded nucleic acid and the compound, and the detection is preferably performed between 0.1 seconds and 600 seconds.
[0090]
The pH of the solution at the time of measurement is preferably 2.0 to 10.0, more preferably 3.0 to 9.0, and most preferably 4.0 to 8.0. It is also preferable to use a buffer to adjust the pH. The buffer solution is described in detail in “Basic Protein / Enzyme Experimental Method” (Horio Seiichi, Minamiedo (1994)), etc., but potassium hydrogen phthalate-hydrochloric acid buffer, citric acid-disodium phosphate Buffer, citric acid-sodium citrate buffer, acetic acid-sodium acetate buffer, succinic acid-sodium hydroxide buffer, sodium maleate-sodium hydroxide buffer, phosphate buffer, imidazole-hydrochloric acid buffer, tri Ethanolamine / hydrochloric acid-sodium hydroxide buffer, N-ethylmorpholine-hydrochloric acid buffer, Tris buffer, glycylglycine-sodium hydroxide buffer, diethanolamine-hydrochloric acid buffer, boric acid buffer, briton-robinson broad buffer Liquid, GTA broad-area buffer, and the like can be preferably used. The concentration of the buffer is preferably 0.1 mM to 500 mM, more preferably 0.5 mM to 200 mM, and even more preferably 1 mM to 50 mM. When a compound that becomes colorless by protonation is used for the measurement, it is preferably adjusted to a pH or less at which protonation occurs. The solution used for the measurement is preferably an aqueous solution, but further mixed with an alcohol such as methanol, ethanol, ethylene glycol, glycerin or diethylene glycol or a water miscible solvent such as dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, dimethylacetamide or sulfolane. Can be used.
[0091]
In the optical measurement, a fluorescence detection method is preferable in terms of sensitivity. Usually, it can be measured with a fluorimeter, and it is preferable to use a method in which excitation light is passed through the solution to measure fluorescence from a right angle direction, but a method of measuring reflected light may also be used. Alternatively, a method may be employed in which the sample solution is developed or spotted on a solid phase carrier and then dried or measured without using a fluorescent laser scanner or a CCD (charge coupled device). Further, the measurement may be performed for each sample, or a large number of samples may be simultaneously measured using a 96-hole or 384-hole microplate.
[0092]
In the DNA array form (2) above, the method of the present invention can be preferably applied to the measurement of spots (genes) where hybridization has occurred on a solid phase carrier. In this case, the probe nucleic acid may be present in the solution, but is preferably immobilized on a solid phase carrier. The solid phase carrier may have a low flatness with irregularities on the surface. The material of the solid phase carrier is not particularly limited. For example, glass, cement, ceramics such as ceramics or new ceramics, polyethylene terephthalate, cellulose acetate, polycarbonate of bisphenol A, polystyrene, polymethyl methacrylate, polymers, silicon, activated carbon, Porous materials such as porous glass, porous ceramics, porous silicon, porous activated carbon, woven catch, non-woven fabric, paper reduction, short fiber, membrane filter and the like can be fisted. Further, examples of the shape include a flat plate shape, a spherical shape, a fiber shape, and a rod shape, but are not particularly limited. The size of the solid phase carrier is not particularly limited, and may be from nm order to cm order. The pore size of the porous material is preferably in the range of 2 to 1000 nm, and particularly preferably in the range of 2 to 500 nm. In the case of a flat plate shape, the thickness of the solid support is preferably in the range of 100 to 2000 μm.
[0093]
As a method for immobilizing the probe nucleic acid on the solid phase carrier, an appropriate method can be selected according to the type of the nucleic acid fragment and the type of the substrate (protein, nucleic acid, enzyme, Vol. 43, No. 13, 2004). -2011 (1998)). For example, when the nucleic acid fragment is a cDNA or PCR product, it is possible to use a method of electrostatically binding to a substrate surface-treated with a cation such as polylysine, polyethyleneimine, polyalkylamine or the like using the charge of DNA. . In order to further strengthen the bond, a method of irradiating with ultraviolet rays can also be used. A layer made of a hydrophilic polymer substance having a charge or a layer made of a crosslinking agent may be further provided on the surface-treated substrate. Further, depending on the substrate, it is possible to include a hydrophilic polymer or the like in the substrate, and a substrate subjected to such treatment can also be preferably used. By performing the surface treatment, electrostatic interaction between the hydrophobic or poorly hydrophilic substrate and the nucleic acid fragment can be promoted. As the substrate, it is preferable to use a slide glass for ease of surface treatment and analysis.
[0094]
When immobilizing a synthetic nucleotide, a method of directly synthesizing on a substrate or a method of synthesizing an oligomer in which a functional group for covalent bonding has been previously introduced into a terminal and covalently bonding it to a surface-treated substrate can be used. . Examples of functional groups include amino groups, aldehyde groups, mercapto groups, and biotin. The method described in JP-A-2001-228152 can also be preferably used. As the substrate, glass or silicon is preferably used, and a known silane coupling agent is preferably used for the surface treatment of glass or silicon. The nucleic acid fragment immobilized on the substrate may be a sample nucleic acid fragment to be detected, which will be described later. Hereinafter, the nucleic acid fragment fixed to the substrate will be described as a nucleic acid fragment having a known base sequence, and the nucleic acid fragment to be brought into contact with the nucleic acid analysis element will be described as a sample nucleic acid fragment.
[0095]
There are two types of DNA fragments depending on the purpose. In order to examine gene expression, it is preferable to use cDNA, a part of cDNA, or a polynucleotide such as EST. The functions of these polynucleotides may be unknown, but they are generally amplified by PCR using a cDNA library, genomic library or whole genome as a template based on sequences registered in a database. (Hereinafter referred to as “PCR product”). Those not amplified by the PCR method can also be preferably used. In order to examine gene mutations and polymorphisms, it is preferable to synthesize various oligonucleotides corresponding to mutations and polymorphisms based on known standard sequences and use them. Furthermore, in the case of base sequence analysis, 4ⁿIt is preferable to use a synthesized oligonucleotide (n is the length of the base). The base sequence of the DNA fragment is preferably determined in advance by a general base sequence determination method. The DNA fragment is preferably a 2 to 100 mer, particularly preferably a 20 to 80 mer.
[0096]
In the spotting of DNA fragments, an aqueous solution in which DNA fragments are dissolved or dispersed in an aqueous medium is dispensed into a 96-well or 384-well plastic plate, and the dispensed aqueous solution is used on the surface of a solid support using a spotter device or the like. It is preferable to perform it dropwise. In order to prevent drying of the DNA fragment after spotting, a substance having a high boiling point may be added to an aqueous solution in which the DNA fragment is dissolved or dispersed. The high-boiling substance is a substance that can be dissolved in an aqueous solution in which a DNA fragment is dissolved or dispersed, does not hinder hybridization with a sample nucleic acid fragment, and is not highly viscous. preferable. Examples of such substances include glycerin, ethylene glycol, dimethyl sulfoxide, and low molecular weight hydrophilic polymers. Examples of the hydrophilic polymer include polyacrylamide, polyethylene glycol, sodium polyacrylate, and the like. The molecular weight of the polymer is 10^Three-10^FiveIt is preferable that it exists in the range. As the substance having a high boiling point, it is more preferable to use glycerin or ethylene glycol, and it is particularly preferable to use glycerin. The concentration of the high-boiling substance is preferably in the range of 0.1 to 2% by volume, particularly preferably in the range of 0.5 to 1% by volume in the aqueous DNA fragment solution. For the same purpose, it is also preferable to place the solid phase carrier after spotting the DNA fragment in an environment having a humidity of 90% or more and a temperature range of 25 to 50 ° C.
[0097]
After spotting the DNA fragment, it may be post-treated with ultraviolet light, sodium borohydride or Schiff reagent. These post-treatments may be performed by combining a plurality of types, and it is particularly preferable to perform a combination of heat treatment and ultraviolet treatment. It is also preferable to perform incubation after spotting. After incubation, it is preferable to remove unattached DNA fragments by washing.
[0098]
The DNA fragment is 10²-10^FiveType / cm²It is preferable that it exists in the range. The amount of DNA fragment is 1 to 10^-15It is in the range of moles, and the weight is preferably several ng or less. By spotting, the aqueous solution of DNA fragments is fixed in the form of dots on the surface of the solid support. The shape of the dots is almost circular. The absence of variation in shape is important for quantitative analysis of gene expression and single nucleotide mutation analysis. The distance between the dots is preferably in the range of 0 to 1.5 mm, and particularly preferably in the range of 100 to 300 μm. The size of one dot is preferably in the range of 50 to 300 μm in diameter. The amount to be spotted is preferably in the range of 100 pL to 1 μL, particularly preferably in the range of 1 nL to 100 nL.
[0099]
The lifetime of the DNA chip produced by the above process is several weeks for the cDNA chip to which cDNA is immobilized, and is longer for the oligo DNA chip to which oligo DNA is immobilized. These DNA chips are used for gene expression monitoring, nucleotide sequence determination, mutation analysis, polymorphism analysis, and the like. The detection principle is an optical detection method of unlabeled nucleic acid based on the principle of the present invention.
[0100]
The method of the present invention can be performed in combination with other nucleic acid weaving methods. As other labeling methods, RI method and non-RI method (fluorescence method, biotin method, chemiluminescence method, etc.) are known, but the method of the present invention can be used in combination with any method. As the fluorescent substance, any substance can be used as long as it can bind to the base portion of the nucleic acid, but cyanine dyes (for example, CyDye ™ series Cy3, Cy5 etc.), rhodamine 6G reagent, N-acetoxy-N 2 -acetylamino Fluorene (AAF) or AAIF (iodine derivative of AAF) can be used.
[0101]
As the sample nucleic acid fragment, it is preferable to use a DNA fragment sample or an RNA fragment sample whose sequence and function are unknown. The sample nucleic acid fragment is preferably isolated from a eukaryotic cell or tissue sample for the purpose of examining gene expression. When the sample is a genome, it is preferably isolated from any tissue or sample other than red blood cells. Arbitrary tissues other than red blood cells are preferably peripheral blood lymphocytes, skin, hair, semen and the like. When the sample is mRNA, it is preferably extracted from a tissue sample in which mRNA is expressed. Although it is possible to directly detect mRNA in the method of the present invention, labeled dNTP ("dNTP" is a base consisting of adenine (A), cytosine (C), guanine (G) or thymine (T) by reverse transcription reaction. It is also possible to use labeled cDNA by incorporating deoxyribonucleotides). In this case, dCTP is preferably used as dNTP because of chemical stability. The amount of mRNA required for one hybridization varies depending on the liquid volume and the labeling method, but is preferably several μg or less. When the DNA fragment on the DNA chip is an oligo DNA, it is desirable that the sample nucleic acid fragment has a low molecular weight. In prokaryotic cells, since selective extraction of mRNA is difficult, it is preferable to label total RNA. The sample nucleic acid fragment can also be obtained by PCR of the target region in the presence of an appropriate primer for the purpose of examining gene mutation and polymorphism.
[0102]
Hybridization is preferably performed by spreading an aqueous solution in which a sample nucleic acid fragment is dissolved or dispersed on the DNA chip prepared above. The amount of development is not particularly limited, but usually it is preferably in the range of 1 to 100 μL. Hybridization is preferably performed, for example, in the temperature range of room temperature to 70 ° C. for 1 to 20 hours. After completion of the hybridization, it is preferable to remove the unreacted sample nucleic acid fragment by washing with a mixed solution of a surfactant and a buffer solution. As the surfactant, sodium dodecyl sulfate (SDS) is preferably used. As the buffer solution, a citrate buffer solution, a phosphate buffer solution, a borate buffer solution, a Tris buffer solution, a Good buffer solution, and the like can be used, and it is particularly preferable to use a citrate buffer solution. In the case of adopting a method in which the above compound is brought into contact with the hybrid multi-stranded nucleic acid and interacting simultaneously with the hybridization, washing may be carried out by the same method as described above, but it is not necessary to carry out washing, but optically as it is. Measurements can also be made and such an embodiment is the preferred method.
[0103]
The feature of hybridization using a DNA array is that the amount of sample nucleic acid fragments used is very small. Therefore, it is necessary to set the optimum hybridization conditions according to the chain length of the DNA fragment immobilized on the solid phase carrier and the type of the sample nucleic acid fragment. For analysis of gene expression, it is preferable to perform hybridization for a long time so that low-expressing genes can be sufficiently detected. For detection of single base mutation, it is preferable to perform hybridization for a short time.
[0104]
The solvent for bringing the compound into contact with the hybrid multi-stranded nucleic acid is not particularly limited. Usually, water or various buffer solutions, or an organic solvent miscible with water can be appropriately used. As the organic solvent miscible with water, for example, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, methanol, ethanol, ethylene glycol, glycerin and the like are preferable. Moreover, it is also preferable to mix and use water or a buffer solution and these organic solvents. In the measurement of the multi-stranded nucleic acid of the present invention, the preferred concentration of the above compound varies depending on the concentration of the multi-stranded nucleic acid to be detected, but usually 1 × 10.^{-1 0}Mol / L to 1 × 10^-3Mol / L, more preferably 1 × 10^-9Mol / L to 1 × 10^-FourMol / L, 5 × 10^-8Mol / L to 5 × 10^-FiveMost preferred is mol / L.
[0105]
When contacting the compound with a multi-stranded nucleic acid using a DNA array, the method of spreading the solution of the compound on the array is most preferably used, but the DNA array after hybridization is immersed in the solution of the compound. A method can also be preferably used. In addition, a method in which the above compound is present during hybridization can also be employed. When optical measurement is performed by bringing the compound into contact with a multi-stranded nucleic acid, detection is preferably started between 0.01 seconds and 1000 seconds after contact with the multi-stranded nucleic acid, preferably from 0.1 seconds to It is preferable to start the detection within 600 seconds.
[0106]
The pH of the solution of the above compound when performing optical measurement is preferably 2.0 to 10.0, more preferably 3.0 to 9.0, and most preferably 4.0 to 8.0. In order to adjust the pH, it is also preferable to use a buffer solution. The buffer solution is described in detail in “Basic Experiments for Proteins and Enzymes” (Horio Shikiichi, Nanedo (1994)). Potassium hydrogen phosphate-hydrochloric acid buffer, citric acid-disodium phosphate buffer, citric acid-sodium citrate buffer, acetic acid-sodium acetate buffer, succinic acid-sodium hydroxide buffer, sodium maleate-sodium hydroxide Buffer, phosphate buffer, imidazole-hydrochloric acid buffer, triethanolamine / hydrochloric acid-sodium hydroxide buffer, N-ethylmorpholine-hydrochloric acid buffer, Tris buffer, glycylglycine-sodium hydroxide buffer, diethanolamine -Hydrochloric acid buffer, borate buffer, Briton-Robinson broad buffer, GTA broad buffer, etc. are preferred It is possible to have. The concentration of the buffer is preferably 0.1 mM to 500 mM, more preferably 0.5 mM to 200 mM, and even more preferably 1 mM to 50 mM.
[0107]
After contacting the compound with the hybrid multi-stranded nucleic acid, washing may be performed to remove excess compound. In this case, it can be performed by the same operation as the washing after hybridization. Further, as described above, in the method of the present invention, optical detection is possible without performing cleaning, and it is also preferable to omit the cleaning operation.
[0108]
When detecting multi-stranded nucleic acids in a solution system, an optical fluorometer can be used for optical detection, but a fluorescence scanner is used from the viewpoint of being capable of simultaneous detection and sensitivity. It is preferable. The fluorescence amount may be measured by drying the substrate after hybridization, or by a conventional fluorescent laser scanner method in the presence of an aqueous solvent, or by covering the substrate with a cover glass so as not to dry the substrate. And may be performed by a cooled CCD (charge coupled device) method or a fluorescent laser scanner method.
[0109]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further more concretely, the scope of the present invention is not limited to the following Example.
[Synthesis Example 1] Synthesis of Dye (D-1)
(1-1) Synthesis of 2-mercaptooxazolo [4,5-b] pyridine
The synthesis was performed with reference to the method described in Journal of Organic Chemistry (J. Org. Chem.), 60, 5721 (1995). 10 g of 2-amino-3-hydroxypyridine, 20 g of potassium xanthate, and 200 mL of ethanol were mixed and refluxed for 15 hours. Thereafter, the solvent was distilled off under reduced pressure, the residue was dissolved in 80 mL of water, and acetic acid was added to precipitate crystals. The crystals were collected by filtration, washed with water and dried. Yield 11g
[0110]
(1-2) Synthesis of 2-methylthiooxazolo [4,5-b] pyridine
3.9 g of raw material (2-mercaptooxazolo [4,5-b] pyridine) was dissolved in DMF and 3.0 g of potassium t-butoxy was added. Then 2 mL of methyl iodide was added and stirred at room temperature for 30 minutes. Since the raw material almost disappeared, water was added and extracted twice with ethyl acetate. The organic phase was dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain the desired product as an oil. The oil crystallized on standing.
(1-3) Synthesis of 4- (2-carbamoylethyl) -2-methylthiooxazolo [4,5-b] pyridinium bromide
Add 1 g of 2-methylthiooxazolo [4,5-b] pyridine to 3 g of 3-bromopropionic acid amide, heat at 110 ° C. for 1 hour, cool, add ethyl acetate and decant the ethyl acetate dissolved components. Removed by. After this operation was repeated three times, the residue was used as it was in the next reaction.
[0111]
(1-4) Synthesis of 1,4-dimethylquinolinium p-toluenesulfonate
10 g of 4-methylquinoline (repidine) and 19.5 g of methyl paratoluenesulfonate were mixed and reacted at 150 ° C. for 1 hour. Crystals precipitated when ethyl acetate was added and stirred. The crystals were collected by filtration and washed with ethyl acetate. The target product was hygroscopic.
(1-5) Synthesis of dye (D-1)
100 mg of 4- (2-carbamoylethyl) -2-methylthiooxazolo [4,5-b] pyridinium bromide synthesized in Synthesis Example (1-3), 1,4-synthesized in Synthesis Example (1-4) 40 mg of dimethylquinolinium p-toluenesulfonate was dissolved in 4 mL of dimethylformamide, and 0.5 mL of triethylamine was added at room temperature. After reacting for 1 hour at room temperature, 0.5 mL of triethylamine was added and reacted at 80 ° C. for 1 hour. The reaction mixture was directly subjected to silica gel column chromatography to collect the yellow component to obtain the desired product. Chromatographic purification was repeated to obtain 2 mg of the desired product.
[0112]
[Synthesis Example 2] Synthesis of Dye (D-2)
(2-1) Synthesis of 4-methyl-1- (3-trimethylammoniopropyl) quinolinium dibromide
5 g of (3-bromopropyl) trimethylammonium bromide (Aldrich) and 10 g of 4-methylquinoline were mixed and reacted at 120 ° C. for 3 hours. After cooling, ethyl acetate was added and the ethyl acetate-soluble component was removed by decantation. After repeating this operation three times, the residue was used in the next reaction without further purification.
[0113]
(2-2) Synthesis of dye (D-2)
100 mg of 4- (2-carbamoylethyl) -2-methylthiooxazolo [4,5-b] pyridinium bromide synthesized in Synthesis Example (1-3), 4 dibromide synthesized in Synthesis Example (2-1) -50 mg of methyl-1- (3-trimethylammoniopropyl) quinolinium was dissolved in 5 mL of dimethylformamide, and 0.5 mL of triethylamine was added at room temperature. After reacting for 1 hour at room temperature, 0.5 mL of triethylamine was added and reacted at 80 ° C. for 1 hour. Ethyl acetate was added to the reaction mixture, and the ethyl acetate-soluble component was removed by decantation. The residue was dissolved in methanol, and purified three times by column chromatography (elution solvent: methanol) using Sephadex LH-20. And purified once by short silica gel column chromatography (elution solvent: chloroform / methanol = 2/1) to obtain 4 mg of the desired product.
[0114]
[Synthesis Example 3] Synthesis of Dye (D-3)
(3-1) Synthesis of 4- (2- (N-acetyl-N-phenylamino) vinyl) -1- (3-trimethylammoniopropyl) quinolinium dibromide
To 500 mg of 4-methyl-1- (3-trimethylammoniopropyl) quinolinium dibromide synthesized in Synthesis Example (2-1), 2 g of 1,3-diphenylformamidine was added, and 10 mL of acetic anhydride was added to the mixture at 120 ° C. For 3 hours. After cooling, ethyl acetate was added to remove ethyl acetate-soluble components. This operation was repeated three times, and the residue was used for the next reaction without further purification.
[0115]
(3-2) Synthesis of 7- (2-methoxyethoxymethyl) -2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo [2,3-b] pyridinium chloride
(3-2-1) Synthesis of 2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo [2,3-b] pyridine (7-aza-2,3,3-trimethylindolenine)
200 g of 2-hydrazinopyridine and 300 mL of toluene were mixed, 250 g of 3-methyl-2-butanone was added thereto, and the mixture was heated under reflux for 30 minutes, and then the solvent was completely concentrated to obtain an oily substance. . To this oily substance, 10 g of zinc chloride was added and heated to 215 ° C. for reaction for 5 hours. After cooling, 400 mL of water was added, extraction was performed 4 times with 300 mL of chloroform, and the organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate, and then the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was distilled under reduced pressure (112-135 ° C./0.2 mmHg), and the distillate component was recrystallized using 1.5 liters of hexane to obtain the desired product. Yield 70.0 g, Yield 23.8%
[0116]
(3-2-2) Synthesis of 7- (2-methoxyethoxymethyl) -2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo [2,3-b] pyridinium chloride
1 g of 2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo [2,3-b] pyridine synthesized in Synthesis Example (3-2-1) was mixed with 3 g of 2-methoxyethoxymethyl chloride and reacted at 90 ° C. for 1 hour. did. After cooling, ethyl acetate was added, and ethyl acetate-soluble components were removed by decantation. The residue was used in the next reaction without further purification.
[0117]
(3-3) Synthesis of dye (D-3)
50 mg of 4- (2- (N-acetyl-N-phenylamino) vinyl) -1- (3-trimethylammoniopropyl) quinolinium dibromide synthesized in Synthesis Example (3-1) and Synthesis Example (3-2) ) 100 mg of 7- (2-methoxyethoxymethyl) -2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo [2,3-b] pyridinium chloride synthesized in 1) was dissolved in 5 mL of dimethylformamide, and 0.5 mL of acetic anhydride was added. After that, 1 mL of triethylamine was added and reacted at room temperature for 2 hours. After adding ethyl acetate and removing the ethyl acetate-soluble component by decantation, the residue is purified by column chromatography (elution solvent: methanol) using Sephadex LH-20 to give a precursor of blue dye (D-3) A crude product was obtained. 3% hydrobromic acid was added to the precursor crude product and reacted at 80 ° C. for 2 hours, and then the reaction solution was distilled off under reduced pressure. The residue was purified three times by column chromatography using Sephadex LH-20 (elution solvent: methanol), and further purified once by silica gel column chromatography (elution solvent: chloroform / methanol = 3/1). 3 mg was obtained.
[0118]
[Synthesis Example 4] Synthesis of Dye (D-4)
(4-1) Synthesis of 2-methyloxazolo [4,5-b] pyridine
80 mL of ethyl orthoacetate and a catalytic amount of paratoluenesulfonic acid monohydrate were added to 15 g of 2-amino-3-hydroxypyridine (manufactured by Aldrich), and reacted at 120 ° C. for 4 hours. After cooling, 2 mL of triethylamine was added, the solvent was distilled off under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (elution solvent: hexane / ethyl acetate = 2/1). The target product was obtained as crystals.
(4-2) Synthesis of dye (D-4)
The dye (D-4) was obtained according to the method shown in Synthesis Example 3 using 2-methyloxazolo [4,5-b] pyridine synthesized in (4-1).
[0119]
[Synthesis Example 5] Synthesis of dye (D-5)
(5-1) Synthesis of 6-bromo-2-mercaptooxazolo [4,5-b] pyridine
2 g of 2-amino-5-bromo-3-hydroxypyridine, 8 g of potassium xanthate, and 50 mL of ethanol were mixed and heated to reflux for 10 hours. The solvent was distilled off under reduced pressure, 40 mL of water was added to dissolve the residue, and acetic acid was added to precipitate crystals. The crystals were filtered under reduced pressure, washed with water and dried. Yield 4.0 g, Yield 81.8%
(5-2) Synthesis of 6-bromo-2-methylthiooxazolo [4,5-b] pyridine
15 mL of dimethylformamide was added to 2 g of 5-bromo-2-mercaptooxazolo [4,5-b] pyridine synthesized in Synthesis Example (5-1), and 2 mL of triethylamine was added to dissolve. Subsequently, 1 mL of methyl iodide was added and reacted at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction, water was added and the precipitated crystals were filtered under reduced pressure. Washing with water and drying were performed to obtain the desired product. Yield 2g, Yield 94.3%
[0120]
(5-3) Synthesis of 1- (3-ethoxycarbonylpropyl) -4-methylquinolinium bromide
19.5 g of 4-bromobutyric acid ethyl ester and 14.3 g of lepidine were mixed and reacted at 130 ° C. for 2 hours. After cooling, ethyl acetate was added to remove ethyl acetate-soluble components. This operation was repeated to obtain the desired product as an oil. This was used in the next reaction without further purification.
(5-4) Synthesis of dye (D-5)
Using the raw materials synthesized in Synthesis Examples (5-2) and (5-3), a dye (D-5) was synthesized according to the method shown in Synthesis Example 1.
[0121]
[Synthesis Example 6] Synthesis of Dye (D-6)
(6-1) Synthesis of 6-methyl-2-mercaptothiazolo [4,5-b] pyridine, Journal of Medicinal Chemistry (J. Med. Chem.), 37, 248 (1994) Synthesized according to the method described. 10 g of 2-amino-3-bromo-5-methylpyridine, 120 mL of N-methylpyrrolidone and 16.7 g of potassium xanthate were mixed and heated at 170 ° C. for 3.5 hours. The reaction solution turned black at first and gradually became reddish brown. After completion of the reaction, the reaction mixture was cooled to room temperature and acidified with acetic acid to obtain the target crystal (gray yellow). The crystals were collected by filtration, washed with water and dried. Yield 8.7 g, Yield 89.2%
[0122]
(6-2) Synthesis of 6-methyl-2-methylthiothiazolo [4,5-b] pyridine 2 g of raw material thiol was dissolved in 10 mL of dimethylformamide, and 2 mL of triethylamine was added. Next, 1.5 mL of methyl iodide was added and reacted at room temperature for 30 minutes. 100 mL of water was added to the reaction solution, and the precipitated crystals were collected by filtration. After washing with water and drying, the desired product was obtained. Yield 1.7g, Yield 78.9%
(6-3) Synthesis of dye (D-6)
The dye (D-6) was synthesized according to the method shown in Synthesis Example 1 using the raw materials synthesized in Synthesis Example (6-2) and Synthesis Example (5-2).
[0123]
[Synthesis Example 7] Synthesis of dye (D-15)
(7-1) Synthesis of 4-dimethylaminobutyric acid ethyl ester
250 mL of a 50% aqueous solution of dimethylamine and 200 mL of ethanol were mixed, and 120 g of 4-bromobutyric acid ethyl ester was added dropwise while maintaining the temperature at 10 ° C. or lower. After completion of the dropwise addition, the mixture was reacted at room temperature for 2 hours, and then heated to 50 ° C. and reacted for 2 hours. The solvent was concentrated to about half, and the mixture was made basic by adding sodium hydroxide while cooling with ice water, followed by extraction with 400 mL of ethyl acetate. This organic phase was extracted four times with 150 mL of 4M hydrochloric acid, and the organic phase was discarded. The hydrochloric acid extract was cooled with ice water, basified with sodium hydroxide, and extracted three times with 200 mL of ethyl acetate. The organic phase was dried over potassium carbonate and concentrated to obtain the desired product. Yield 45g
[0124]
(7-2) Synthesis of (6-bromohexyl) (3-ethoxycarbonylpropyl) dimethylammonium bromide
To 15 g of 4-dimethylaminobutyric acid ethyl ester synthesized in Synthesis Example (7-1), 50 g of 1,6-dibromohexane was mixed and allowed to stand overnight at room temperature. Since crystals precipitated, ethyl acetate was added to loosen the crystals, and the target product was obtained by filtration under reduced pressure. Hygroscopic crystals. Yield 21g
[0125]
(7-3) Synthesis of 1- (6- (dimethyl (3-ethoxycarbonylpropyl) ammonio) hexyl-4-methylquinolinium dibromide
8 g of 6-bromohexyldimethyl (3-ethoxycarbonylpropyl) ammonium bromide and 12 g of lepidine were mixed and reacted at 125 ° C. for 1 hour. After cooling, ethyl acetate was added and stirred, and the ethyl acetate-soluble component was removed by decantation, then dissolved in methanol, and purified using Sephadex LH-20 (eluent: methanol). Oily product, yield 6g
(7-4) Synthesis of dye (D-15)
The dye (D-15) was synthesized according to the synthesis method shown in Synthesis Example 1 using the raw materials synthesized in Synthesis Example (7-3) and Synthesis Example (1-4).
[0126]
[Synthesis Example 8] Synthesis of dye (D-16)
(8-1) Synthesis of 5-fluoro-4-methylquinoline / paratoluenesulfonate
Australian Journal of Chemistry (Aust. J. Chem.), 45, 1119 (1992) and Journal of American Chemical Society, 67, 86 pages (1945). Mix 33.2 g (0.225 mol) 3-fluoroaniline hydrochloride, 97.2 g (0.36 mol) ferric chloride hexahydrate, 3.6 g anhydrous zinc chloride, 160 mL 95% ethanol, water bath Under 60-65 ° C., 0.18 mol of methyl vinyl ketone was slowly added dropwise. After completion of dropping, the mixture was heated to reflux for 2 hours and allowed to stand overnight. The solvent was almost distilled off and made alkaline with 25% sodium hydroxide. After filtration through celite, washing with ethyl acetate, the filtrate was separated, and the organic phase was purified by silica gel column chromatography. The resulting isomer mixture (5-fluoro-4-methylquinoline and 7-fluoro-4-methyl) was obtained. Quinoline) was distilled. When the initial fraction component having a high ratio of 5-fluoro-4-methylquinoline is dissolved in ethyl acetate, an acetone solution of p-toluenesulfonic acid monohydrate is added and cooled with ice water, 5-fluoro-4-methylquinoline. Crystals of paratoluene sulfonate were obtained. Yield 1.7g
7-Fluoro-4-methylquinoline was also isolated as a paratoluenesulfonate crystal.
[0127]
(8-2) Synthesis of (4-bromobutyl) (3-ethoxycarbonylpropyl) dimethylammonium bromide
To 15 g of 4-dimethylaminobutyric acid ethyl ester synthesized in Synthesis Example (7-1), 50 g of 1,4-dibromobutane was mixed and left overnight at room temperature. Since crystals precipitated, ethyl acetate was added to loosen the crystals, and the target product was obtained by filtration under reduced pressure. Yield 30g
(8-3) Synthesis of 1- (4- (dimethyl (3-ethoxycarbonylpropyl) ammonio) butyl) -5-fluoro-4-methylquinolinium dibromide
1 g of 4-bromobutyldimethyl (3-ethoxycarbonylpropyl) ammonium bromide and 0.1 g of 5-fluoro-4-methylquinoline / p-toluenesulfonate were mixed, 0.2 mL of triethylamine was added, and 130 ° C. For 1 hour. After cooling, ethyl acetate was added and stirred, and the ethyl acetate-soluble component was removed by decantation, then dissolved in methanol, and purified using Sephadex LH-20 (eluent: methanol). Oily substance.
(8-4) Synthesis of dye (D-16)
The pigment | dye (D-16) was obtained by the synthesis method similar to the method shown to the synthesis example 1 by using the compound synthesize | combined by the synthesis example (8-3) and the synthesis example (6-2) as a raw material.
[0128]
[Synthesis Example 9] Synthesis of dye (D-17)
(9-1) Synthesis of 5-chloro-4-methylquinoline
Australian Journal of Chemistry (Aust. J. Chem.), 45, 1119 (1992) and Journal of American Chemical Society, 67, 86 pages (1945). Mix 40.0 g (0.225 mol) 3-chloroaniline hydrochloride, 97.2 g (0.36 mol) ferric chloride hexahydrate, 3.6 g anhydrous zinc chloride, 160 mL 95% ethanol, water bath 12.6 g (0.18 mol) of methyl vinyl ketone was slowly added dropwise at 60 to 65 ° C. below. After completion of dropping, the mixture was heated to reflux for 2 hours and allowed to stand overnight. The solvent was almost distilled off and made alkaline with 25% sodium hydroxide. After filtration through Celite and washing with ethyl acetate, the filtrate was separated, and the organic phase was 5-chloro-4-methylquinoline and 7-chloro-4-methylquinoline. : Hexane / ethyl acetate = 9/1) and separated.
[0129]
(9-2) Synthesis of 1- (4- (dimethyl (3-ethoxycarbonylpropyl) ammonio) butyl-5-chloro-4-methylquinolinium dibromide
1 g of 4-bromobutyldimethyl (3-ethoxycarbonylpropyl) ammonium bromide (Synthesis Example 8-2) and 0.1 g of 5-chloro-4-methylquinoline were mixed and reacted at 130 ° C. for 1 hour. After cooling, ethyl acetate was added and stirred, and the ethyl acetate-soluble component was removed by decantation, then dissolved in methanol, and purified using Sephadex LH-20 (eluent: methanol). Oily substance.
(9-3) Synthesis of dye (D-17)
The pigment | dye (D-17) was obtained with the synthesis method similar to the method shown to the synthesis example 1 by using the compound synthesize | combined by the synthesis example (9-2) and the synthesis example (6-2) as a raw material.
[0130]
[Synthesis Example 10] Synthesis of Dye (D-18)
(10-1) Synthesis of 4-methyl-1-phenyl-1,2-dihydroquinolin-2-one
To 150 mL of concentrated sulfuric acid, 60 g of N, N-diphenylacetoacetamide was added little by little at 5 to 10 ° C. After almost complete dissolution, it was allowed to stand at room temperature overnight. Since the reaction was completed, it was poured into ice water, and 200 mL of ethyl acetate was added and stirred to precipitate crystals. The crystals were collected by filtration and dried to obtain the desired product.
(10-2) Synthesis of 4-methyl-1-phenyl-1,2-dihydroquinoline-2-thione
10 g of 4-methyl-1-phenyl-1,2-dihydroquinolin-2-one (0.0425 mol) and 9 g of Lawson reagent were mixed in toluene and heated to reflux. After disappearance of the raw materials, the reaction solution was directly subjected to silica gel column chromatography. Elution with chloroform and recrystallization from hexane / ethyl acetate.
[0131]
(10-3) Synthesis of 2- (4- (dimethyl (3-ethoxycarbonylpropyl) ammonio) butylthiobromide-2-methyl-1-phenylquinolinium dibromide
0.5 g of 4-methyl-1-phenyl-1,2-dihydroquinolin-2-thione synthesized in Synthesis Example (10-2) and 4-bromobutyldimethyl bromide synthesized in Synthesis Example (8-2) ( 1 g of 3-ethoxycarbonylpropyl) ammonium was mixed and reacted at 130 ° C. for 1 hour. After cooling, ethyl acetate was added to remove the ethyl acetate-soluble component, and the residue was dissolved in methanol and purified using Sephadex LH-20 (eluent: methanol).
(10-4) Synthesis of dye (D-18)
Using the raw materials synthesized in Synthesis Example (6-2) and Synthesis Example (10-3), a dye (D-18) was synthesized according to the method shown in Synthesis Example 1.
[0132]
[Synthesis Example 11] Synthesis of Dye (D-19)
(11-1) Synthesis of dye (D-19)
The dye (D-19) was synthesized by the method shown in Synthesis Example 1 using the compounds synthesized in Synthesis Example (7-3) and Synthesis Example (6-2) as raw materials.
[Synthesis Example 12] Synthesis of Dye (D-23)
(12-1) Synthesis of 3-chloro-4-methylquinoline
Synthesis was performed with reference to Synthesis page 798 (1976). Specifically, 1.31 g (10 mmol) of 3-methylindole, 50 mg of benzyltrimethylammonium chloride, and 3.2 mL of a 1/1 mixture of chloroform (ethanol free) / benzene were stirred vigorously at 40 ° C., and 3 g of sodium hydroxide / A solution of 6 mL of water was added dropwise over 15 minutes. After reacting for 8 hours, the reaction mixture was diluted with ethyl acetate and water and extracted with 2N hydrochloric acid. The acidic solution was made weakly basic with concentrated sodium hydroxide and extracted with ethyl acetate. After drying over anhydrous sodium sulfate, the solvent was distilled off to obtain a crude product. The product was further purified by short silica gel column chromatography to obtain the desired product.
[0133]
(12-2) Synthesis of 1- (6- (dimethyl (3-ethoxycarbonylpropyl) ammonio) hexyl-3-chloro-4-methylquinolinium dibromide
1 g of 6-bromohexyldimethyl (3-ethoxycarbonylpropyl) ammonium bromide (Synthesis Example 7-2) and 0.1 g of 3-chloro-4-methylquinoline (Synthesis Example 12-1) were mixed at 130 ° C. Reacted for 1 hour. After cooling, ethyl acetate was added and stirred, and the ethyl acetate-soluble component was removed by decantation, then dissolved in methanol, and purified using Sephadex LH-20 (eluent: methanol). Oily substance.
(12-3) Synthesis of dye (D-23)
The dye (D-23) was synthesized according to the method of Synthesis Example 1 using the compounds synthesized in Synthesis Example (12-2) and Synthesis Example (6-2) as raw materials.
[0134]
[Synthesis Example 13] Synthesis of dye (D-25)
(13-1) Synthesis of 2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo [2,3-b] pyridine-5-carboxylic acid ethyl ester
(13-1-1) Synthesis of 2-hydrazinopyridine-5-carboxylic acid
50 g of 6-chloronicotinic acid was mixed with 300 mL of n-butanol, 80 g of hydrazine monohydrate was added, and the mixture was heated to reflux for 10 hours. After cooling, it was poured into 500 mL of dilute hydrochloric acid, and the precipitated crystals were collected by filtration, washed with water and dried to obtain the desired product. Yield 44.2 g, Yield 90.9%
[0135]
Synthesis of (13-1-2) 2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo [2,3-b] pyridine-5-carboxylic acid
30 g of 2-hydrazinopyridine-5-carboxylic acid and 30 g of 3-methyl-2-butanone were mixed, 120 mL of ethylene glycol was added, and the reaction was performed at 100 ° C. for 1 hour. Excess 3-methyl-2-butanone was distilled off under reduced pressure, followed by heating and refluxing for 5 hours. After cooling, purification was performed by silica gel column chromatography as it was, and fractions that developed color with a color developing solution (p-anisaldehyde / ethanol / sulfuric acid = 5/90/5 (volume percent)) were collected on TLC. Since this fraction was a mixture of the target product and the ethylene glycol ester of the target product, the mixture was hydrolyzed with 1N sodium hydroxide as it was, and the target product was obtained as crystals after neutralization. About 40% was recovered as hydrazone produced from raw material hydrazine and 3-methyl-2-butanone. Yield 1.8g, Yield 4.5%
[0136]
(13-1-3) Synthesis of 2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo [2,3-b] pyridine-5-carboxylic acid ethyl ester
1 g of 2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo [2,3-b] pyridine-5-carboxylic acid, 1.5 g of paratoluenesulfonic acid monohydrate and 100 mL of ethanol are mixed and heated. The solvent was distilled off little by little and reacted for 8 hours while adding ethanol as appropriate. After cooling, the solvent was distilled off by about 70%, extraction was performed by adding water and ethyl acetate, and the organic phase was washed with an aqueous sodium carbonate solution and then concentrated. Silica gel column chromatography was performed using a short column to obtain the desired product. Yield 0.8g, Yield 70.3%
(13-2) Synthesis of 4- (2- (N-acetyl-N-phenylamino) vinyl) -1- (6- (dimethyl (3-ethoxycarbonylpropyl) ammonio) hexylquinolinium dibromide
Using 1- (6- (dimethyl (3-ethoxycarbonylpropyl) ammonio) hexyl-4-methylquinolinium dibromide synthesized in Synthesis Example (7-3), it is shown in Synthesis Example (3-1). The target product was obtained in the same manner as described above.
[0137]
(13-3) Synthesis of 5-ethoxycarbonyl-7- (2-methoxyethoxymethyl) -2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo [2,3-b] pyridinium chloride
0.1 g of 2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo [2,3-b] pyridine-5-carboxylic acid ethyl ester synthesized in Synthesis Example (13-1) was replaced with 0.8 g of 2-methoxyethoxymethyl chloride. Mixed and reacted at 110 ° C. for 1 hour. After cooling, ethyl acetate was added, and ethyl acetate-soluble components were removed by decantation. The residue was used in the next reaction without further purification.
(13-4) Synthesis of dye (D-25)
Using the compound synthesized in Synthesis Example (13-2) and Synthesis Example (13-3) as a raw material, a dye (D-25) was obtained in the same manner as in Synthesis Example (3-3).
[0138]
[Synthesis Example 14] Synthesis of Dye (D-27)
(14-1) Synthesis of 6-bromo-2-methylthiazolo [4,5-b] pyridine
25.2 g of 2-amino-3,5-dibromopyridine was suspended in 500 mL of acetonitrile, 50 mL of acetic anhydride was added, and the mixture was heated to reflux for 3 hours. After cooling, water was added and the precipitated crystals were collected by filtration. The crystals were dried and suspended in 300 mL of dioxane, 6 g of sodium hydride was added, and the mixture was heated to reflux for 4 hours. After cooling, 20 mL of ethanol was added, the solvent was distilled off, and the residue was purified by silica gel column chromatography to obtain the desired product.
(14-2) Synthesis of 1- (4- (dimethyl (3-ethoxycarbonylpropyl) ammonio) butyl) -4-methylquinolinium dibromide
1 g of 4-bromobutyldimethyl (3-ethoxycarbonylpropyl) ammonium bromide and 2 g of 4-methylquinoline (repidine) were mixed and reacted at 130 ° C. for 1 hour. After cooling, ethyl acetate was added and stirred, and the ethyl acetate-soluble component was removed by decantation. Purification was performed using Sephadex LH-20 (eluent: methanol) to obtain crystals.
[0139]
(14-3) 4- (4- (N-acetyl-N-phenylamino) -1,3-butadiene-1-yl) -1- (4- (dimethyl (3-ethoxycarbonylpropyl) ammonio) dibromide ) Synthesis of butyl) -4-methylquinolinium
1- (4- (dimethyl (3-ethoxycarbonylpropyl) ammonio) butyl) -4-methylquinolinium dibromide synthesized in Synthesis Example (14-2) and 0.5 g of malonaldehyde dianilide hydrochloride Was added, and 5 mL of acetic anhydride was mixed and reacted at 110 ° C. for 2 hours. After cooling, ethyl acetate was added, and ethyl acetate-soluble components were removed by decantation. The residue was used in the next reaction without further purification.
(14-3) Synthesis of dye (D-27)
Using the compounds shown in Synthesis Examples (14-1) and (14-3) as raw materials, the compounds were synthesized in the same manner as in Synthesis Example 3.
[0140]
[Synthesis Example 15] Synthesis of dye (D-35)
(15-1) Synthesis of 5-acetylamino-2-mercaptooxazolo [4,5-b] pyridine
(15-1-1) Synthesis of 5-amino-3-benzyloxy-2-nitropyridine The method described in Journal of Organic Chemistry (J. Org. Chem), 57, 4784 (1992) The synthesis was performed with reference to That is, synthesis was carried out by reacting 3-benzyloxy-2-nitropyridine with a nitrogen anion of N, N-tetramethylenethiocarbamoylsulfenamide in the presence of a strong base.
Synthesis of (15-1-2) 5-acetylamino-3-benzyloxy-2-nitropyridine
3 g of 5-amino-3-benzyloxy-2-nitropyridine (Synthesis Example 15-1-1) was suspended in 30 mL of acetic anhydride, a catalytic amount of concentrated sulfuric acid was added, and the mixture was reacted at 70 ° C. for 1 hour. After completion of the reaction, the reaction mixture was poured into ice water, and the precipitated crystals were collected by filtration and dried. Thereafter, purification was further performed by short silica gel column chromatography.
[0141]
(15-1-3) Synthesis of 2-amino-5-acetylamino-3-hydroxypyridine
1 g of 5-acetylamino-3-benzyloxy-2-nitropyridine was added to 50 mL of methanol, and a hydrogenation reaction was performed at 50 ° C. using 5% activated carbon palladium as a catalyst in an autoclave. After standing overnight, the catalyst was filtered off and the solvent was distilled off under reduced pressure. The product was used in the next reaction without further purification.
Synthesis of (15-1-4) 5-acetylamino-2-mercaptooxazolo [4,5-b] pyridine
2 g of potassium xanthate and 50 mL of ethanol were added to the product of Synthesis Example (15-1-3), and the mixture was heated to reflux for 15 hours. After cooling, the solvent was distilled off, water was added to dissolve the solid, and acetic acid was added to precipitate crystals. The crystals were filtered under reduced pressure, washed with water and dried to obtain the desired product.
(15-2) Synthesis of 5-acetylamino-2-methylthiooxazolo [4,5-b] pyridine
Synthesis was performed according to the method of Synthesis Example (5-2).
(15-3) Synthesis of dye (D-35)
Using the compound synthesized in Synthesis Examples (15-1-4) and (15-2) as a raw material, a dye (D-35) was obtained in the same manner as in Synthesis Example 1.
[0142]
[Synthesis Example 16] Synthesis of dye (D-37)
(16-1) Synthesis of 5-bromo-2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo [2,3-b] pyridine
Synthesis of (16-1-1) 5-bromo-2-hydrazinopyridine
125 g of 2,5-dibromopyridine, 350 mL of ethanol, and 250 mL of hydrazine hydrate were mixed and heated to reflux for 30 hours. Ethanol was distilled off under reduced pressure, water was added and the precipitated crystals were collected by filtration. Washing with water and drying were performed to obtain 77 g of 5-bromo-2-hydrazinopyridine. Yield 77.6%
(16-1-2) Synthesis of 5-bromo-2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo [2,3-b] pyridine
76 g of 5-bromo-2-hydrazinopyridine and 100 ml of 3-methyl-2-butanone were mixed and reacted at 100 ° C. for 30 minutes. After excess 3-methyl-2-butanone was distilled off, 100 ml of 1,4-butanediol was added and heated to 240 ° C. and refluxed for 5 hours.
The reaction solution was cooled and directly subjected to silica gel column chromatography, and each fraction was confirmed by nmr. Fractions containing the desired product were collected and the solvent was distilled off, followed by crystallization from hexane / ethyl acetate to obtain the desired product as single brown crystals. Yield 8.5 grams, 8.8% yield
[0143]
(16-2) Synthesis of 5-phenyl-2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo [2,3-b] pyridine
0.5 g of 5-bromo-2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo [2,3-b] pyridine synthesized in Synthesis Example (16-1-2), 0.38 g of phenylboronic acid and 7 mL of dimethylformamide were added. After mixing, 0.072 g of tetrakis (triphenylphosphine) palladium and 0.9 g of potassium carbonate were added thereto under a nitrogen stream. The reaction mixture was stirred and heated to 100 ° C. and reacted for 4 hours. After completion of the reaction, the mixture was extracted with chloroform, and the concentrate was purified by silica gel column chromatography. Chloroform / methanol was used as an eluent, and the target product was eluted with chloroform / methanol = 4/1. Fractions containing the desired product were collected and concentrated to obtain the desired product as a pale yellow solid. Yield 0.45 g, Yield 91%
[0144]
(16-3) Synthesis of 7- (2-methoxyethoxymethyl) -5-phenyl-2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo [2,3-b] pyridinium chloride
0.2 g of 5-phenyl-2,3,3-trimethyl-3H-pyrrolo [2,3-b] pyridine synthesized in Synthesis Example (16-2) and 1 g of 2-methoxyethoxymethyl chloride were mixed, and 100 The reaction was carried out at 0 ° C for 1 hour. After cooling, ethyl acetate was added and the ethyl acetate-soluble component was removed by decantation. After repeating this operation three times, the residue was used in the next reaction without further purification.
(16-4) Synthesis of 6-methoxy-4-methyl-1- (3-trimethylammoniopropyl) quinolinium dibromide
3 g of (3-bromopropyl) trimethylammonium bromide (manufactured by Aldrich) and 5 g of 6-methoxy-4-methylquinoline (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) were mixed and reacted at 120 ° C. for 3 hours. After cooling, ethyl acetate was added and the ethyl acetate-soluble component was removed by decantation. After repeating this operation three times, the residue was used in the next reaction without further purification.
[0145]
(16-5) Synthesis of 4- (2- (N-acetyl-N-phenylamino) vinyl) -6-methoxy-1- (3-trimethylammoniopropyl) quinolinium dibromide
1.5 g of 1,3-diphenylformamidine was added to quinolinium synthesized in (16-4), 5 mL of acetic anhydride was mixed, and the mixture was reacted at 120 ° C. for 1 hour. After cooling, ethyl acetate was added and the ethyl acetate-soluble component was removed by decantation. After repeating this operation twice, the residue was used in the next reaction without further purification.
(16-6) Synthesis of dye (D-37)
To the compound synthesized in Synthesis Example (16-5), 5 mL of dimethylformamide was added, and 1 mL of acetic anhydride was added. Furthermore, the compound synthesized in Synthesis Example (16-3) was added to this mixed solution to obtain a uniform solution at room temperature. A dye was formed when 0.3 mL of triethylamine was added at room temperature. After this dye was purified by column chromatography using Sephadex LH-20 (eluent: methanol), a catalytic amount of pyridinium p-toluenesulfonate was added to the methanol solution of this dye and allowed to stand at room temperature for 2 days. . This solution was purified again by column chromatography using Sephadex LH-20 to obtain a dye (D-37).
[0146]
[Synthesis Example 17] Synthesis of dye (D-38)
(17-1) Synthesis of 2-mercaptooxazolo [4,5-c] isoquinoline
(17-1-1) Synthesis of 4-hydroxy-3-nitroisoquinoline
10 g of 4-hydroxyisoquinoline was dissolved in 80 g of concentrated sulfuric acid and stirred at 2 ° C. While maintaining the temperature at 10 ° C. or lower, 2.7 mL of fuming nitric acid was slowly added dropwise. The mixture was allowed to stand as it was, reacted at room temperature for 2 hours, poured into 1 kg of ice water, and the precipitated crystals were collected by filtration.
(17-1-2) Synthesis of 2-mercaptooxazolo [4,5-c] isoquinoline Ethyl acetate and water were added to 4 g of 4-hydroxy-3-nitroisoquinoline, and an excess amount of sodium hydrosulfite was added. And heated to reflux for 2 hours. The organic phase was separated and washed with water, and then the solvent was distilled off. Ethanol and 8 g of potassium xanthate were added to the residue and heated under reflux for 5 hours. After cooling, ethanol was distilled off, the residue was dissolved in 20 mL of water, and acetic acid was added little by little to precipitate crystals. The crystals were collected by filtration, washed with water, and dried to obtain the desired product.
[0147]
(17-2) Synthesis of 2-methylthiooxazolo [4,5-c] isoquinoline
2 g of raw material thiol was added to 15 mL of dimethylformamide, and 2 mL of triethylamine was added to dissolve the raw material. Then, 1.5 mL of methyl iodide was added and reacted at room temperature for 1 hour. When 50 mL of water was added, crystals were precipitated. The crystals were collected by filtration, washed with water and dried to obtain the desired product.
(17-3) Synthesis of dye (D-38)
Using the compound synthesized in Synthesis Example (17-2) and Synthesis Example (14-2) as a raw material, a dye (D-38) was synthesized in the same manner as in Synthesis Example 3.
[0148]
[Example 1] Detection of multi-stranded nucleic acid in solution system
(Preparation of sample nucleic acid solution)
As a double-stranded nucleic acid, sodium deoxyribonucleic acid, fibrous, made by salmon testis (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in 20 mM citrate-disodium phosphate buffer having a pH of 6.0 to prepare 100 μg / mL. This was further heated at 100 ° C. for 30 minutes, and then rapidly cooled with ice water to prepare single-stranded deoxyribonucleic acid.
[0149]
(Preparation of detection compound solution)
The compounds shown in Table 1 were dissolved in 20 mM citrate-disodium phosphate buffer at pH 4.0 and 5 × 10^-FiveA solution of mol / L was prepared. All of these solutions were substantially colorless and non-fluorescent. For comparison, PicoGreen (Molecular Probes) was dissolved in 20 mM citrate-disodium phosphate buffer having a pH of 4.0 to prepare a solution having an optical density of 0.5 in the visible range.
(Measurement of fluorescence intensity)
A solution was prepared by mixing the sample nucleic acid solution with 1, the detection compound solution with 1, and the dilution buffer with a volume ratio of 8. The fluorescence intensity was measured using a fluorometer, and the results are shown in Table 1. . For the fluorescence intensity, the fluorescence excitation spectrum was measured for each sample, and the fluorescence intensity when excited at the wavelength where the intensity was maximum was shown.
[0150]
[Table 1]

[0151]
From the results shown in Table 1, it can be seen that in the method of the present invention, a high fluorescence yield (fluorescence intensity / absorbance) is achieved when a double-stranded nucleic acid is present. Furthermore, the fluorescence intensity is dramatically increased by the presence of double strands compared to single strands, indicating that the method of the present invention is extremely excellent for detecting double-stranded nucleic acids.
[0152]
[Example 2] Detection of multi-stranded nucleic acid on solid phase carrier
(1) Preparation of DNA fragment fixed slide
A glass slide (25 mm × 75 mm) is immersed in an ethanol solution of 2% by weight aminopropylethoxysilane (manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) for 10 minutes, taken out, washed with ethanol, dried at 110 ° C. for 10 minutes, and silane A compound-coated slide (A) was prepared. Next, the silane compound-coated slide (A) was immersed in a 3% by mass compound VS-1 solution for 10 minutes, then taken out, washed with water, washed with ethanol, dried at 120 ° C. for 15 minutes, and then VS-1 coated slide. (B) was created.
[0153]
Embedded image

(2) Spotting of DNA fragments and measurement of fluorescence intensity
A DNA fragment (U-1: SEQ ID NO: 1) in which the 3 ′ end is modified with an amino group and a complementary strand (U-2) of the above-described DNA fragment in which the 3 ′ end is modified with an amino group are similarly added to 0.1M. Aqueous liquid (1 × 10 5) dispersed in carbonate buffer (pH 9.8)^-FiveM) was prepared, and these were spotted on the slide (B) obtained in the above step (1). Immediately after the spotting, the slide was left overnight at 60 ° C. and 90% humidity. This slide was mixed with 0.1% by mass SDS (sodium dodecyl sulfate) and 2 × SSC (2 × SSC: a solution obtained by diluting the SSC stock solution twice, SSC: standard saline-citrate buffer). Was washed once with 0.2 × SSC aqueous solution. Next, the washed slide was immersed in a 0.1 M glycine aqueous solution (pH 10) for 1 hour 30 minutes, washed with distilled water, and dried at room temperature to obtain a slide (C) on which the DNA fragment was fixed. It was.
[0154]
The 60-mer DNA (U-3) having a sequence complementary to the DNA sequence (U-1) was dispersed in a hybridization solution (mixed solution of 4 × SSC and 10% by mass of SDS) (20 μL), and the above And the surface was protected with a microscope cover glass, followed by incubation at 60 ° C. for 10 hours in a moisture chamber. Next, the slide was washed with a mixed solution of 0.1% by mass SDS and 2 × SSC for 10 seconds, centrifuged at 600 rpm for 20 seconds, and dried at room temperature to obtain a slide (D). For comparison, a sample was prepared in the same manner for a 60mer having the same sequence as that of (U-3) labeled with Cy3 at the 5 'end, and used as a slide (E). The fluorescence intensity of each slide glass surface was measured with a fluorescence scanning device. The excitation wavelength was 532 nm, and the detection was performed through a bandpass filter having a maximum at 570 nm.
[0155]
[Table 2]

[0156]
The same as slide (D) was prepared and compound 2 × 10 6 by the method of the present invention.^-Five40 μL of a 20 mM citrate / disodium phosphate buffer solution having a pH of 5 mol / L was developed on the slide (D). These solutions were substantially colorless and non-fluorescent at the time of preparation. After the surface was protected with a microscope cover glass, the fluorescence intensity was measured with a fluorescence scanning apparatus in the same manner as described above. The results are shown in Table 3. From this result, it is clear that the multi-stranded nucleic acid can be detected without labeling according to the method of the present invention.
[0157]
[Table 3]

[0158]
An experiment was performed on nursery rhymes by changing the oligonucleic acid immobilized on the solid phase carrier to the nucleic acid of SEQ ID NO: 2 (80mer), the nucleic acid of SEQ ID NO: 3 (80mer), and the nucleic acid of SEQ ID NO: 4 (100mer). Almost the same result was obtained, and it was found that multi-stranded nucleic acid could be detected without labeling.
[0159]
[Example 3] Detection of DNA / RNA hybrid
In Example 2, exactly the same experiment was conducted except that 40-mer oligodeoxy A was immobilized instead of 60-mer DNA immobilized on the slide glass surface, and oligo U was used as a complementary sequence. The spot that occurred was detected, and it became clear that RNA could also be detected without labeling.
[0160]
[Sequence Listing]

Claims (5)

A method for optically measuring a multi-stranded nucleic acid, comprising the step of contacting a compound capable of interacting with the multi-stranded nucleic acid with the multi-stranded nucleic acid, wherein the compound has the following properties:
(a) in the absence of multi-stranded nucleic acid, can exist in a substantially colorless and non-fluorescent state in an aqueous solution under at least one condition;
(b) When a multi-stranded nucleic acid is present under the conditions of (a) above, it substantially changes in color due to the interaction with the multi-stranded nucleic acid, and substantially exhibits fluorescence due to the interaction. Having the following general formula (VI):

Wherein R ¹ , R ² and R ³ each independently represent a hydrogen atom or a substituent, and R ¹ and R ² and R ² and R ³ may be bonded to each other to form a ring; Represents an oxygen atom, a sulfur atom, —N (R ²⁴ ) —, or —C (R ²⁴ ) (R ²⁵ ) — (R ²⁴ and R ²⁵ each independently represents an alkyl group, an aryl group, or a heterocyclic group) R ²⁴ and R ²⁵ may combine with each other to form a 3- to 8-membered ring); R ⁶ represents an alkyl group, an aryl group, or a heterocyclic group, and R ⁶ represents R ¹ , R ³ may combine with R ¹⁵ , or R ¹⁷ to form a ring; n represents an integer of 0, 1, 2, or 3; R ¹⁴ , R ¹⁵ , R ¹⁶ , and R ¹⁷ are each hydrogen. Atom, halogen atom, alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, aryl group, amino group, hydroxyl group, alkoxy group, aryloxy group, alkylthio group, aryl Thio group, acylamino group, sulfonylamino group, heterocyclic group, cyano group, sulfonyl group, sulfinyl group, nitro group, sulfo group, carboxyl group, alkoxycarbonyl group, aryloxycarbonyl group, carbamoyl group, sulfamoyl group, and mercapto group A substituent selected from the group consisting of R ¹⁴ and R ¹⁵ and R ¹⁶ and R ¹⁷ may be bonded to each other to form a 5- to 8-membered ring)
The method which is a compound represented by these. A method for optically measuring a multi-stranded nucleic acid, comprising the step of contacting a compound capable of interacting with the multi-stranded nucleic acid with the multi-stranded nucleic acid, wherein the compound has the following properties;
(c) substantially non-fluorescent in an unprotonated state in aqueous solution in the absence of multi-stranded nucleic acid,
(d) can exist in a substantially colorless and substantially non-fluorescent state in the protonated state in aqueous solution under at least one condition in the absence of multi-stranded nucleic acid; and
(e) When a multi-stranded nucleic acid is present under the conditions of (d) above, it substantially changes in color due to interaction with the multi-stranded nucleic acid, and substantially exhibits fluorescence due to the interaction. And a compound represented by the above general formula (VI). A method for optical measurement of a multi-stranded nucleic acid, comprising:
(1) contacting the compound (B) in the following general formula (I) with a multi-stranded nucleic acid; and
(2) A step of measuring the fluorescence of the compound (C) generated by the interaction between the compound (B) and the multi-stranded nucleic acid

(Where the two-way arrows indicate chemical equilibrium;
Compound (A) represents a substantially non-fluorescent compound;
Compound (B) represents a compound that is substantially non-fluorescent under at least one condition and does not have an absorption maximum at 400-1000 nm;
Compound (C) is generated by the interaction between compound (B) and a multi-stranded nucleic acid under the above conditions, has an absorption maximum at 400 to 1000 nm, and substantially exhibits fluorescence due to the above interaction. Indicates a compound that:
X represents an atomic group necessary for binding to -C (R) = Y to form a dye molecule; Y represents an atom necessary for binding to X-C (R) = to form a dye molecule. R represents a hydrogen atom or a substituent, and may combine with X and / or Y to form a ring; Y ′ represents a protonation of a C═Y double bond in compound (A). And Z represents the conjugate base of the acid HZ, which may be bound to X, Y (or Y ′), or R).
And the compound (A) is a compound represented by the above general formula (VI).   The method according to any one of claims 1 to 3, which comprises a step of interacting with a multi-stranded nucleic acid in a solution state.   The method according to any one of claims 1 to 4, comprising a step of interacting with a multi-stranded nucleic acid immobilized on a solid phase carrier.