JP3903125B2

JP3903125B2 - Novel tyrosinase gene melB

Info

Publication number: JP3903125B2
Application number: JP2000398616A
Authority: JP
Inventors: 浩小畑; 博樹石田; 洋二秦; 章嗣川戸; 康久安部; 健赤尾; 修秋田; 英治一島
Original assignee: Gekkeikan Sake Co Ltd; National Research Institute of Brewing
Current assignee: Gekkeikan Sake Co Ltd; National Research Institute of Brewing
Priority date: 2000-12-27
Filing date: 2000-12-27
Publication date: 2007-04-11
Anticipated expiration: 2020-12-27
Also published as: JP2002191366A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規チロシナーゼ遺伝子に関するものであり、詳細には、特に固体培養において高発現する麹菌由来の新規チロシナーゼ遺伝子に関するものである。本発明によれば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅより新規に単離したチロシナーゼ遺伝子を利用することにより、チロシナーゼを効率的に生産できるだけでなく、清酒麹の褐変防止、醸造食品その他の飲食品の着色防止、着色防止物質の開発など、様々な産業分野での利用を可能にするものである。
【０００２】
【従来の技術】
食品が褐変する機構の一つにチロシナーゼによる、メラニン物質の生産があげられる。これは食品中のチロシンがチロシナーゼにより酸化されドーパ（ＤＯＰＡ）と呼ばれる物質に変化し、これが前駆体となってメラニンが合成されることによる。この反応には酸素が必要となるため、多くの場合食品が酸素にふれることにより、急速に褐変化が起こる。チロシナーゼによる食品の褐変化は、椎茸などのキノコ類からリンゴ、ナシなどの果実類まで多くの食品で見られる現象である。食品が褐変することは外観品質を著しく低下させることであり、褐変防止には多くの努力が払われてきている。
【０００３】
清酒醸造においても、米麹が褐変し、最終的に酒粕中に黒い米粒として存在する「黒粕」現象が大きな問題となっている。清酒発酵中は米麹は清酒もろみ中に存在するため、酸素が必要なチロシナーゼによる酸化反応は起こらない。しかしもろみを圧搾し、酒粕を分離した時点で酸素に接触することになり、チロシナーゼによる酸化反応が進行し、麹部分のみが黒く褐変する。現在ではこのような褐変反応を生じない、非褐変性の麹菌株を使用することにより黒粕を防止している。
【０００４】
このような褐変反応を遺伝子レベルで解析するため麹菌のチロシナーゼ遺伝子（ｍｅｌＯ）が取得されている（Biochim.Biophys.Acta.,1261(1)、p.151、1995）。このｍｅｌＯ遺伝子には、チロシナーゼ活性を持つ蛋白がコードされており、確かにチロシナーゼ遺伝子であることが確認されている。しかしながら、本発明者らはこのｍｅｌＯ遺伝子の発現条件を検討した結果、本遺伝子は液体培養で強力に発現する遺伝子であり、固体培養（麹培養）ではほとんど発現していないことを明らかにした。これは米麹の褐変に関与するチロシナーゼはｍｅ１Ｏ遺伝子とは異なる新規なチロシナーゼ遺伝子にコードされていることを強く示唆するものである。またこの新規チロシナーゼこそが、米麹の褐変現象はもとより味噌、醤油など麹を用いる食品の着色に大きく関与していると考えられる。従ってこれら醸造食品の褐変を防止するためには、ｍｅｌＯとは異なる新規なチロシナーゼを単離して解析する必要がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
発明者が解決しようとする課題は、製麹等の固体培養でも褐変が依然として生じている現状に鑑み、ｍｅｌＯとは異なる固体培養で大量に発現するチロシナーゼ遺伝子を単離することである。そしてこの新規チロシナーゼ遺伝子を用いて、米麹の褐変防止など食品の褐変防止に広く利用することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記した目的を達成するためになされたものであって、先ず、既に単離されているチロシナーゼ遺伝子（ｍｅｌＯ）の発現条件についての検討を行い、その結果、ｍｅｌＯ遺伝子は液体培養では大量に発現しているものの、固体培養（麹培養）ではほとんど発現していないことを確認した。
【０００７】
具体的には、ｍｅｌＯプロモーター下流にレポーター遺伝子として大腸菌のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を連結したプロモーター解析用プラスミドを構築し、これを麹菌に導入して行った。すなわち、この遺伝子導入株を、様々な培養条件で培養し、菌体内のＧＵＳ活性を測定することにより、ｍｅｌＯプロモーター発現を定量化する。その結果、液体培養では４０４０Ｕ／ｍｇと非常に高いＧＵＳ活性が得られたが、固体培養では１／１００程度の活性しか認められなかった。固体培養（麹培養）ではチロシナーゼ活性が認められ、褐変化現象も起こる。これらの結果は、固体培養ではｍｅｌＯとは異なる新規チロシナーゼ遺伝子が発現していることを示唆するものであった。
【０００８】
固体培養と液体培養で発現する遺伝子が異なる現象は、既にグルコアミラーゼ遺伝子で証明されている。すなわち、麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）には２種類のグルコアミラーゼ遺伝子が存在する。１種類はグルコアミラーゼＡ遺伝子（ｇｌａＡ）であり、液体培養において発現し、固体培養ではほとんど発現しない。一方もう１種類のグルコアミラーゼ遺伝子Ｂ（ｇｌａＢ）は固体培養でのみ大量に発現する。そしてこのｇｌａＢ遺伝子にコードされるグルコアミラーゼ蛋白は、糖含量が非常に高いなど固体培養での活性維持に非常に有用な性質を持っている。このように麹菌は、同じ活性を持つ酵素であっても、培養条件によって異なる遺伝子を発現させていることが明らかとなっている。チロシナーゼにおいても液体培養と固体培養では異なる遺伝子が発現されている可能性は非常に高い。
【０００９】
そこで、固体培養で発現しているチロシナーゼ遺伝子の単離を試みた。具体的には、フスマ培養を行ったＡ．ｏｒｙｚａｅの菌体よりｍＲＮＡを調製し、このｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡライブラリーを構築する。このライブライリーの塩基配列を網羅的に決定し、各配列と既知遺伝子データーベースとのホモロジーを検索する。これらのｃＤＮＡクローンからの糸状菌チロシナーゼ遺伝子と高いホモロジーを示すクローンを検索し、本クローンからＡ．ｏｒｙｚａｅの新規チロシナーゼ遺伝子を単離する。単離したチロシナーゼ遺伝子のノザン解析を行うことにより、本遺伝子が固体培養で特異的に発現している遺伝子であることを確認する。
【００１０】
また本遺伝子のアンチセンスＲＮＡ解析等を行うことにより、本遺伝子がチロシナーゼ活性を持つ蛋白をコードしかつ、米麹の褐変現象に関与していることを証明する。
以下に、本発明の詳細について述べる。
【００１１】
まずｍｅｌＯ遺伝子と米麹の褐変性を検討するため、ｍｅｌＯプロモーターの発現解析を行った。まずＧＵＳ遺伝子を含むプラスミド（ｐＮＧＳ１）（Ｈ. Ishidaら、J. Ferment． Bioeng．８６、 301-307、1998 ）のPstＩ、SalＩギャップに、melO遺伝子の開始コドンATG上流１１００ｂｐを挿入し、図９に示すようなプロモーター解析用プラスミドを構築する。このプラスミドを麹菌に導入すると、ｍｅｌＯプロモーターの支配下でレポーター遺伝子（ＧＵＳ）が発現することになり、ＧＵＳ活性を測定すればプロモーターの発現量が定量化できる。作成したプラスミドを麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅ１０１３−ｎｉａＤ株に導入し、マーカー遺伝子であるｎｉａＤ遺伝子が導入されて、硝酸資化能が回復した株を形質乾換体として選択した。さらに得られた形質転換体をサザン解析を行い、導入したプラスミドが染色体のｎｉａＤｌｏｃｕｓに１コピーだけ組み込まれた株をｍｅｌＯプロモーター解析株として以下の検討を行った。このｍｅｌＯ解析株を液体培養と固体培養（米麹培養）を行い、菌体内のＧＵＳ活性を測定した。その結果、液体培養では４０４０Ｕ／ｍｇと非常に高い活性が認められたのに対して、固体培養では４８Ｕ／ｍｇと非常に低い活性しか得られなかった。
【００１２】
更に、培養温度に対する影響についても検討した。固体培養で特異的に発現する遺伝子ｇｌａＢは、培養温度を４０℃以上の高温で培養すると発現誘導が認められ、実際の米麹培養においても培養後期に品温が４０℃以上にまで上昇する。しかしｍｅｌＯ遺伝子は、高温では発現が抑制され、逆に２０℃などの低温で発現誘導が認められた。これらの結果は、ｍｅｌＯ遺伝子は固体培養、特に麹培養においてほとんど発現していないことを示している。しかしながら、固体培養においてもチロシナーゼ活性は認められ、褐変現象も起こっている。これは固体培養で生産されるチロシナーゼはｍｅｌＯとは異なる新規なチロシナーゼ遺伝子にコードされていることを強く示唆するものである。
【００１３】
そこでフスマを用いた固体培養を行い、常法に従いｍＲＮＡを調製し、これよりｃＤＮＡライブラリーを作成した。このｃＤＮＡを網羅的に配列を決定し、ＥＳＴ情報を収集した。この中から、マッシュルームのチロシナーゼ遺伝子に対してホモロジーを示すクローンを抽出することができた。このＥＳＴクローンの配列を用いて、Ａ．ｏｒｙｚａｅゲノムライブラリーからチロシナーゼ遺伝子の単離を試みた。具体的には、ＥＳＴ配列情報から２種類のプローブを作成し、Ａ．ｏｒｙｚａｅゲノムＤＮＡをテンペレートとしてＰＣＲ反応を行う。増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、抽出したＥＳＴクローンに対応したゲノムＤＮＡであることを確認する。
【００１４】
次に、このＤＮＡ断片をプローブとして、Ａ．ｏｒｙｚａｅのＥＭＢＬ３ファージライブラリーから、プラークハイブリダイゼーションにより目的（ポジティブ）クローンを抽出する。得られたポジティブクローンをテンペレートとして塩基配列を決定する。シーケンス解析用のプローブをいくつか作成することにより、プロモーター、ターミネーター領域を含むチロシナーゼ遺伝子の全塩基配列の決定に成功した。
【００１５】
チロシナーゼ遺伝子は、６つのイントロンに分断された７つのエキソンとして存在し、そのコーディング領域には６１６アミノ酸がコードされていた。ｍｅｌＯ遺伝子とのアミノ酸レベルでのホモロジーは２４％であったが、マッシュルームのチロシナーゼなどで保存性の高い領域については、さらに高いホモロジーを示した。以上の結果より、この遺伝子はチロシナーゼ遺伝子である可能性が高く、ｍｅｌＢ遺伝子と命名した。
【００１６】
このｍｅｌＢ遺伝子の発現条件を検討するためノザン解祈を行った。ＤＰＹ培地を用いた液体培養と白米を用いた麹培養を行い、それぞれの培養物から常法に従いＲＮＡを抽出した。先のｍｅｌＢ遺伝子の一部をプローブとして、両方のＲＮＡに対してノザンハイブリダイゼーションを行った。その結果液体培養から得られたＲＮＡには全くシグナルが認められないのに対して、固体培養から得られたＲＮＡには非常に強いハイブリダイズシグナルが検出された。これはｍｅｌＢ遺伝子が液体培養ではほとんど発現せず、固体培養（麹培養）で非常に強く発現していることを示すものである。
【００１７】
次に、ｍｅｌＢ遺伝子の機能を推定するため、本遺伝子の麹菌への導入を試みた。プロモーター、ターミネーターを含むｍｅ１Ｂ遺伝子（４．２ｋｂ）を麹菌の形質転換用ベクターｐＩＮ９３に挿入し、麹菌宿主ｎｉａＤ変異株（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託ＦＥＲＭＰ−１７７０７）株に導入した。ｍｅｌＢ遺伝子を単コピーで導入した形質転換体（ＴｍｅｌＢ株：工業技術院生命工学工業技術研究所寄託ＦＥＲＭＰ−１８１３４）を用いて麹を作成した所、宿主株に較べて高い褐変性を示した。次にこれらの麹の抽出液のチロシナーゼを比較した結果、ＴｍｅｌＢ株の活性は宿主株に比べて２倍に上昇していることが明らかとなった。
【００１８】
従って、我々が単離したｍｅｌＢ遺伝子には、チロシナーゼ活性を有する蛋白がコードされており、このチロシナーゼが麹菌の固体培養における褐変現象に強く関与していることが示された。このように本発明に係るｍｅｌＢ遺伝子は新規なものであって、従来既知のチロシナーゼとは異なる新規チロシナーゼをコードする遺伝子、該新規チロシナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、これらの遺伝子の少なくともひとつを含有する遺伝子、から選ばれる少なくともひとつを指示するものである（以下、単にｍｅｌＢ遺伝子ということもあり、その塩基配列を配列表の配列番号２、及び、図面の図４、図５、図６に示す。）
【００１９】
本発明において、このようにして単離したｍｅｌＢ遺伝子は、これを宿主に導入して発現せしめ、チロシナーゼ又はチロシナーゼ酵素活性を有するタンパク質を製造するものである。なお、本発明において、チロシナーゼ酵素活性を有するタンパク質にはチロシナーゼも包含されるものであって、そのアミノ酸配列は配列番号１（図１、図２、図３）に示される。
【００２０】
本発明によれば、このようにして製造した新規チロシナーゼ（又はその酵素活性を有するタンパク質）は、試薬として各方面で有効に利用することができ、他方、このようにして単離したｍｅｌＢ遺伝子については、これを遺伝子破壊、遺伝子発現抑制等を行うことによって、麹や各種飲食品の褐変を防止することができるし、また、このｍｅｌＢ遺伝子にコードされるチロシナーゼは上記のように試薬として利用するほか、そのインヒビターをスクリーニングすることにより、麹や各種飲食品の褐変防止剤を新たに開発することも期待される。
以下、本発明の実施例について述べる。
【００２１】
【実施例１】
ｍｅｌＯ遺伝子の固体培養と液体培養での発現強度
先ず、ｍｅｌＯ遺伝子の固体培養と液体培養での発現強度について、図９に示すプロモーター解析用プラスミドｐｍｅｌＯ−ＧＵＳを構築し、これを用いて発現強度を測定した。
【００２２】
ＧＵＳ遺伝子を含むプラスミド（ｐＮＧＳ１）は、形質転換用マーカーであるＡ．ｏｒｙｚａｅのｎｉａＤ遺伝子（S.Unklesら、Mol. Gen. Genet., 218、p.99-104、1989）と、レポーター遺伝子である大腸菌のβグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするｕｉｄＡ遺伝子（R. A. Jeffersonら、Proc. Natl. Acad. Sci., p.8447-8451、1986）を含む。このプラスミドのｕｉｄＡ遺伝子の上流域（例えばＳａｌＩ、ＰｓｔＩサイト）に、ｍｅｌＯプロモーターを挿入し、得られたこのプラスミドを麹菌に導入すると、ｍｅｌＯプロモーターの支配下でレポーター遺伝子（ＧＵＳ）が発現することになり、ＧＵＳ活性を測定すれば、プロモーターの発現量が定量化できるのである。
【００２３】
そこで本例においては、先述のｐＮＧＳ１のＰｓｔ１／ＳａｌＩギャップに、ｍｅｌＯ遺伝子の開始コドンＡＴＧの上流１１００ｂｐを挿入し、構築されたプロモーター解析用プラスミドをＡ．ｏｒｙｚａｅ（ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅＯ−１０１３：本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＰ−１６５２８として既に寄託されている）のｎｉａＤ変異株（硝酸資化能欠損株、ＮｉｔｒａｔｅＲｅｄｕｃｔａｓｅ欠損株；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ１０１３−ｎｉａＤ：本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＰ−１７７０７として既に寄託されている）に導入し、マーカー遺伝子であるｎｉａＤ遺伝子が導入されて、硝酸資化能が回復した株を形質転換体として選択した。さらに得られた形質転換体をサザン解析を行い、導入したプラスミドが染色体のｎｉａＤｌｏｃｕｓに１コピーだけ組み込まれた株をｍｅｌＯプロモーター解析株として、以下の検討を行った。
【００２４】
このｍｅｌＯ解析株について、液体培養と固体培養（米麹培養）を行い、菌体内のＧＵＳ活性を測定した。その結果、液体培養では４０４０Ｕ／ｍｇと非常に高い活性が認められたのに対して、固体培養では４８Ｕ／ｍｇと非常に低い活性しか得られなかった。このことから、麹の褐変にはｍｅｌＯ遺伝子は関与していないと考えられ、麹には他のチロシナーゼ遺伝子が存在することが示唆された。
【００２５】
【実施例２】
ｍｅｌＢ遺伝子のクローニング
フスマ培養から得られたｍＲＮＡによるｃＤＮＡライブラリー（ＥＳＴライブラリー）の中より、Ａ．ｏｒｙｚａｅのｍｅｌＯ遺伝子に相同性の高いクローンＪＺ４４９５を選択した。次にこのクローンをプローブとしてＥＭＢＬ３ファージを用いたアスペルギルス・オリゼーＯ−１０１３株（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託ＦＥＲＭＰ−１６５２８）の染色体ジーンライブラリーより、プラークハイブリダイゼーション法によりｍｅｌＢ遺伝子をクローニングした。プローブとしては、２種類のオリゴＤＮＡを用いて染色体ＤＮＡをＰＣＲ法により増幅したＤＮＡを用いた。
【００２６】
上記２種類のオリゴＤＮＡの内、一方は、オリゴＤＮＡ＃１であって、その塩基配列は配列番号３（図７）に示され、他方は、オリゴＤＮＡ＃２であって、その塩基配列は配列番号４（図８）に示される。
【００２７】
この方法により約１００００個のファージクローンの中から、上記のプローブとハイブリダイズするクローンλＴＲ９９を単離した。上記のオリゴＤＮＡをプライマーとしてジデオキシ法によりＤＮＡ塩基配列を決定し、本クローンが確かに目的のｍｅｌＢ遺伝子であることを確認した。
【００２８】
【実施例３】
ｍｅｌＢ遺伝子の塩基配列の決定
ポジティブクローンλＴＲ９９株をテンペレートとしてｍｅｌＢ遺伝子の全塩基配列の決定を行った。プロモーター部分、コーディング領域、ターミネーター部分をあわせて４．２ｋｂの配列を決定した（配列番号２：図４、図５、図６）。上記配列の内、１位置から１４３６位置までがプロモーター部分であり、１４３７位置から３６３５位置までがコーディング領域であり、３６３６位置から４１７４位置までがターミネーター部分である。
【００２９】
ｍｅｌＯ遺伝子とのホモロジー検索の結果から、ｍｅｌＢ遺伝子には６つのイントロンが存在し、そのコーディング領域は、２．２ｋｂｐであって（更に詳細には、１４３７位置のＡＴＧから３６３５位置のＧＣＣまでの２１９９ｂｐ）、塩基配列から推定されるタンパク質は６１６残基であることが明らかとなった（配列番号１：図１、図２、図３）。なお、ｍｅｌＯ遺伝子とｍｅｌＢ遺伝子の構造の比較を下記表１に示す。
【００３０】

【００３１】
【実施例４】
ｍｅｌＢ遺伝子の発現強度
ｍｅｌＢ遺伝子の固体培養と液体培養での発現強度について、実施例１と同様にして、図１０に示すプロモーター解析用プラスミドｐｍｅｌＢ−ＧＵＳを構築し、これを用いて発現強度を測定した。
【００３２】
ｐＮＧＳ１のＰｓｔＩ／ＳａlＩギャツプに、ｍｅｌＢ遺伝子の開始コドンＡＴＧ上流１．４ｋｂｐを挿入し、プロモーター解析用プラスミドｐｍｅｌＢ−ＧＵＳを構築した。（図１０）このプラスミドを麹菌に導入すると、ｍｅｌＢプロモーターの支配下でレポーター遺伝子（ＧＵＳ）が発現することになり、ＧＵＳ活性を測定すればプロモーターの発現量が定量化できる。作成したプラスミドを麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅ１０１３−ｎｉａＤ株に導入し、マーカー遺伝子であるｎｉａＤ遺伝子が導入されて、硝酸資化能が回復した株を形質転換体として選択した。さらに得られた形質転換体をサザン解析を行い、導入したプラスミドが染色体のｎｉａＤｌｏｃｕｓに１コピーだけ組み込まれた株をｍｅｌＢプロモーター解析株として以下の検討を行った。
【００３３】
このｍｅｌＢ解析株について、液体培養と固体培養（米麹培養）を行い、菌体内のＧＵＳ活性を測定した。その結果、液体培養では４５Ｕ／ｍｇと低い活性しか得られなかったのに対して、固体培養では２８５０Ｕ／ｍｇと非常に高い活性が得られた。また、液体培養では褐変が認められなかったのに対し、固体培養では褐変が認められた。このことから、麹の褐変にはｍｅｌＢ遺伝子が関与しているものと考えられた。
【００３４】
また、ノザン解析を行った。上記と同じ液体培養と固体培養（麹培養）を行い、それぞれの培養物から常法に従いＲＮＡを抽出した。ｍｅｌＢ遺伝子の一部をプローブとして、両方のＲＮＡに対してノザンハイブリダイゼーションを行った。その結果液体培養から得られたＲＮＡには全くシグナルが認められなかったのに対して、固体培養から得られたＲＮＡには非常に強いハイブリダイズシグナルが検出された。
【００３５】
【実施例５】
ｍｅｌＢ遺伝子の麹菌への導入
得られたプロモーター、ターミネーターを含むｍｅｌＢ遺伝子（４．２ｋｂ）を麹菌の形質転換用ベクターｐＩＮ９３に挿入した、ｍｅｌＢ発現プラスミドｐｍｅｌＢ−ｎｉａを構築した（図１１）。このｐｍｅｌＢ−ｎｉａを麹菌宿主ｎｉａＤ変異株（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託ＦＥＲＭＰ−１７７０７）株に常法に従い導入した。このようにして得た、ｍｅｌＢ遺伝子を単コピーで導入した形質転換体（ＴｍｅｌＢ−１１株）をアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）ＴｍｅｌＢ−１１と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＰ−１８１３４として寄託した。そして、この形質転換体（ＴｍｅｌＢ−１１株）を用いて麹を作成した。
【００３６】
その結果、遺伝子導入株では宿主株に比べて高い褐変性が観察された。このことから遺伝子導入株ではｍｅｌＢが強く発現していることが示唆された。
【００３７】
【実施例６】
ｍｅｌＢ遺伝子を利用した麹の褐変防止
ｍｅｌＢ遺伝子を抑制するために、まずｍｅｌＢのアンチセンス遺伝子を作成した。これをアスペルギルス・オリゼーＭ−ＮＳ４（国税庁醸造研究所より分与）に導入し、固体培養（麹培養）を行った。これにより通常のｍｅｌＢのｍＲＮＡがアンチセンス遺伝子のｍＲＮＡと結合し、蛋白を作れなくなる。その結果、アンチセンス遺伝子を導入した株の麹の褐変が抑制された。
【００３８】
また、次に上記の株にｍｅｌＢのパーシャル遺伝子を多コピー導入し、固体培養（麹培養）を行った。これによりタイトレーションが起こり、本来のｍｅｌＢの働きが弱くなる。その結果、やはり麹の褐変が抑制された。
これらのことから、ｍｅｌＢを抑制することにより、麹の褐変が抑制されることが分かった。
【００３９】
【発明の効果】
本発明により、麹菌の褐変性を持つチロシナーゼ（ｍｅｌＢ）を大量に生産することが可能となり、清酒麹の褐変防止、醸造食品の着色防止、着色防止物質の開発など様々な産業分野に利用することを可能にするものである。また本発明は麹菌の酵素を麹菌で生産させるため、生産される酵素蛋白は非常に安全性が高く、食品、医薬品、化粧品産業などへも応用が可能な画期的な技術である。
【００４０】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】新規チロシナーゼ（ｍｅｌＢ）のアミノ酸配列を示す。
【図２】同上続きを示す。
【図３】同上続きを示す。
【図４】新規チロシナーゼ遺伝子ｍｅｌＢの塩基配列を示す。
【図５】同上続きを示す。
【図６】同上続きを示す。
【図７】オリゴＤＮＡ＃１を示す。
【図８】オリゴＤＮＡ＃２を示す。
【図９】解析用プラスミドｐｍｅｌＯ−ＧＵＳを示す。
【図１０】解析用プラスミドｐｍｅｌＢ−ＧＵＳを示す。
【図１１】ｍｅｌＢ発現用プラスミドｐｍｅｌＢ−ｎｉａを示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel tyrosinase gene, and particularly to a novel tyrosinase gene derived from Aspergillus oryzae that is highly expressed in solid culture. According to the present invention, by using a tyrosinase gene newly isolated from Aspergillus oryzae, not only can tyrosinase be efficiently produced, but also prevention of browning of sake lees, prevention of coloring of brewed foods and other foods and drinks, and prevention of coloring. It can be used in various industrial fields such as material development.
[0002]
[Prior art]
One of the mechanisms for browning food is the production of melanin by tyrosinase. This is because tyrosine in food is oxidized by tyrosinase and converted to a substance called dopa (DOPA), which is used as a precursor to synthesize melanin. Since oxygen is required for this reaction, browning frequently occurs when food is exposed to oxygen in many cases. The browning of food by tyrosinase is a phenomenon seen in many foods from mushrooms such as shiitake mushrooms to fruits such as apples and pears. The browning of food means that the quality of appearance is remarkably lowered, and many efforts have been made to prevent browning.
[0003]
Even in sake brewing, the rice bran browns, and the “black koji” phenomenon, which finally exists as black rice grains in the sake lees, is a major problem. During sake fermentation, rice bran is present in sake mash, so no oxidation reaction by tyrosinase that requires oxygen occurs. However, when the mash is squeezed and the sake lees are separated, it comes into contact with oxygen, and the oxidation reaction by tyrosinase proceeds, and only the cocoon part turns brown. At present, black wrinkles are prevented by using non-brown denatured strains that do not cause such browning reaction.
[0004]
In order to analyze such a browning reaction at the gene level, a tyrosinase gene (melO) of Aspergillus has been obtained (Biochim. Biophys. Acta., 1261 (1), p. 151, 1995). This melO gene encodes a protein having tyrosinase activity, and has been confirmed to be a tyrosinase gene. However, as a result of examining the expression conditions of the melO gene, the present inventors have clarified that this gene is a gene that is strongly expressed in liquid culture and is hardly expressed in solid culture (spear culture). This strongly suggests that tyrosinase involved in rice bran browning is encoded by a novel tyrosinase gene different from the me1O gene. This new tyrosinase is considered to be greatly involved in the coloring of foods using miso, soy sauce, and so on, as well as the browning phenomenon of rice koji. Therefore, in order to prevent browning of these brewed foods, it is necessary to isolate and analyze a novel tyrosinase different from melO.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The problem to be solved by the inventor is to isolate a tyrosinase gene that is expressed in a large amount in a solid culture different from melO in view of the current state of browning still occurring in solid culture such as koji making. And this new tyrosinase gene is used widely for preventing browning of foods such as prevention of browning of rice bran.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present invention has been made in order to achieve the above-mentioned object. First, the expression conditions of the already isolated tyrosinase gene (melO) were examined. As a result, the melO gene was not used in liquid culture. Although it was expressed in large quantities, it was confirmed that it was hardly expressed in solid culture (spear culture).
[0007]
Specifically, a promoter analysis plasmid in which E. coli β-glucuronidase (GUS) gene was linked as a reporter gene downstream of the melO promoter was constructed and introduced into Aspergillus oryzae. That is, this gene-introduced strain is cultured under various culture conditions, and the GUS activity in the cells is measured to quantify melO promoter expression. As a result, a very high GUS activity of 4040 U / mg was obtained in liquid culture, but only about 1/100 activity was observed in solid culture. In solid culture (spear culture), tyrosinase activity is observed and browning occurs. These results suggested that a novel tyrosinase gene different from melO was expressed in solid culture.
[0008]
The phenomenon that the genes expressed in solid culture and liquid culture differ is already proven with the glucoamylase gene. That is, there are two types of glucoamylase genes in A. oryzae. One type is the glucoamylase A gene (glaA), which is expressed in liquid culture and hardly expressed in solid culture. On the other hand, another type of glucoamylase gene B (glaB) is expressed in large quantities only in solid culture. The glucoamylase protein encoded by the glaB gene has very useful properties for maintaining the activity in solid culture such as a very high sugar content. Thus, it has been clarified that koji molds express different genes depending on the culture conditions, even if they have the same activity. It is very likely that different genes are expressed in liquid culture and solid culture in tyrosinase.
[0009]
Therefore, an attempt was made to isolate the tyrosinase gene expressed in solid culture. Specifically, the A. cerevisiae culture was performed. mRNA is prepared from oryzae cells and a cDNA library synthesized from this mRNA is constructed. The base sequence of this library is comprehensively determined, and the homology between each sequence and a known gene database is searched. Clones having high homology with the filamentous fungus tyrosinase gene were searched from these cDNA clones. A new tyrosinase gene from oryzae is isolated. By performing Northern analysis of the isolated tyrosinase gene, it is confirmed that this gene is a gene that is specifically expressed in solid culture.
[0010]
By conducting antisense RNA analysis of this gene, it is proved that this gene encodes a protein having tyrosinase activity and is involved in the browning phenomenon of rice bran.
Details of the present invention will be described below.
[0011]
First, in order to examine brown degeneration of melO gene and rice bran, expression analysis of melO promoter was performed. First, 1100 bp of the start codon ATG upstream of the melO gene was inserted into the PstI and SalI gaps of the plasmid (pNGS1) containing the GUS gene (H. Ishida et al., J. Ferment. Bioeng. 86, 301-307, 1998). A plasmid for promoter analysis as shown in FIG. When this plasmid is introduced into Neisseria gonorrhoeae, a reporter gene (GUS) is expressed under the control of the melO promoter, and the expression level of the promoter can be quantified by measuring the GUS activity. The prepared plasmid was designated as Neisseria gonorrhoeae. The strain was introduced into the oryzae 1013-niaD strain, and the strain in which the niaD gene, which is a marker gene, was introduced and the nitrate utilization ability was recovered was selected as a transformant. Further, the obtained transformant was subjected to Southern analysis, and the following examination was carried out using a strain in which only one copy of the introduced plasmid was integrated into the niaD locus of the chromosome as a melO promoter analysis strain. This melO analysis strain was subjected to liquid culture and solid culture (rice bran culture), and the GUS activity in the cells was measured. As a result, a very high activity of 4040 U / mg was observed in the liquid culture, whereas a very low activity of 48 U / mg was obtained in the solid culture.
[0012]
Furthermore, the influence on the culture temperature was also examined. The gene glaB that is specifically expressed in solid culture is induced to be induced when cultured at a high temperature of 40 ° C. or higher, and the temperature of the product glaB rises to 40 ° C. or higher later in the actual rice bran culture. However, expression of the melO gene was suppressed at high temperatures, and conversely, expression induction was observed at low temperatures such as 20 ° C. These results indicate that the melO gene is hardly expressed in solid culture, particularly in anther culture. However, tyrosinase activity is also observed in solid culture, and browning has also occurred. This strongly suggests that tyrosinase produced in solid culture is encoded by a novel tyrosinase gene different from melO.
[0013]
Therefore, solid culture using bran was performed, mRNA was prepared according to a conventional method, and a cDNA library was prepared therefrom. The cDNA was comprehensively sequenced and EST information was collected. From this, a clone showing homology to the mushroom tyrosinase gene could be extracted. Using the sequence of this EST clone, A. An attempt was made to isolate the tyrosinase gene from the oryzae genomic library. Specifically, two types of probes are created from EST sequence information. PCR reaction is performed using oryzae genomic DNA as a template. The base sequence of the amplified DNA fragment is determined, and it is confirmed that it is genomic DNA corresponding to the extracted EST clone.
[0014]
Next, using this DNA fragment as a probe, A. From the oryzae EMBL3 phage library, target (positive) clones are extracted by plaque hybridization. The nucleotide sequence is determined using the obtained positive clone as a template. By creating several probes for sequence analysis, we succeeded in determining the entire nucleotide sequence of the tyrosinase gene including the promoter and terminator regions.
[0015]
The tyrosinase gene existed as seven exons divided into six introns, and the coding region encoded 616 amino acids. The homology at the amino acid level with the melO gene was 24%, but the region with high conservative properties such as mushroom tyrosinase showed higher homology. From the above results, it is highly possible that this gene is a tyrosinase gene, and it was named melB gene.
[0016]
Northern prayer was conducted to examine the expression conditions of the melB gene. Liquid culture using DPY medium and koji culture using white rice were performed, and RNA was extracted from each culture according to a conventional method. Northern hybridization was performed on both RNAs using a part of the melB gene as a probe. As a result, no signal was observed in the RNA obtained from the liquid culture, whereas a very strong hybridization signal was detected in the RNA obtained from the solid culture. This indicates that the melB gene is hardly expressed in liquid culture and is very strongly expressed in solid culture (spear culture).
[0017]
Next, in order to estimate the function of the melB gene, introduction of this gene into koji molds was attempted. The me1B gene (4.2 kb) containing a promoter and terminator was inserted into a gonococcal transformation vector pIN93 and introduced into a gonococcal host niaD mutant strain (FERM P-17707 deposited at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology). A cocoon was prepared using a transformant in which the melB gene was introduced in a single copy (TmelB strain: Biotechnology Industrial Technology Research Institute deposit FERM P-18134), and showed higher browning than the host strain. . Next, as a result of comparing the tyrosinases in the extracts of these strawberries, it was revealed that the activity of the TmelB strain was increased by a factor of 2 compared to the host strain.
[0018]
Therefore, the melB gene we isolated encodes a protein having tyrosinase activity, indicating that this tyrosinase is strongly involved in the browning phenomenon in the solid culture of Aspergillus oryzae. Thus, the melB gene according to the present invention is a novel gene, and a gene encoding a novel tyrosinase different from a conventionally known tyrosinase, a gene encoding a protein having the novel tyrosinase activity, and at least one of these genes It indicates at least one selected from the contained genes (hereinafter sometimes simply referred to as the melB gene, the base sequence of which is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and FIGS. 4, 5, and 6 in the drawing) Show.)
[0019]
In the present invention, the melB gene isolated as described above is introduced into a host and expressed to produce tyrosinase or a protein having tyrosinase enzyme activity. In the present invention, tyrosinase is also included in the protein having tyrosinase enzyme activity, and the amino acid sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 1 (FIGS. 1, 2, and 3).
[0020]
According to the present invention, the novel tyrosinase produced in this way (or a protein having the enzyme activity) can be effectively used as a reagent in various fields. On the other hand, the melB gene isolated in this way Can prevent browning of rice cakes and various foods by performing gene disruption, gene expression suppression, etc., and tyrosinase encoded by this melB gene is used as a reagent as described above. In addition, it is also expected to develop new anti-browning agents for straw and various foods by screening the inhibitors.
Examples of the present invention will be described below.
[0021]
[Example 1]
Expression intensity of melO gene in solid culture and liquid culture First, for expression intensity of melO gene in solid culture and liquid culture, a plasmid pmelO-GUS for promoter analysis shown in FIG. It was measured.
[0022]
A plasmid (pNGS1) containing the GUS gene is a marker for transformation. oryzae niaD gene (S. Unkles et al., Mol. Gen. Genet., 218, p. 99-104, 1989) and reporter gene E. coli β-glucuronidase (GUS) uidA gene (RA Jefferson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., P. 8447-8451, 1986). When the melO promoter is inserted into the upstream region of the uidA gene of this plasmid (eg, SalI, PstI sites) and the resulting plasmid is introduced into Aspergillus oryzae, a reporter gene (GUS) is expressed under the control of the melO promoter. Thus, if the GUS activity is measured, the expression level of the promoter can be quantified.
[0023]
Therefore, in this example, 1100 bp upstream of the start codon ATG of the melO gene was inserted into the Pst1 / SalI gap of the above-described pNGS1, and the constructed plasmid for promoter analysis was A.P. oryzae (Aspergillus oryzae O-1013: this strain has already been deposited as FERM P-16528 at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) (Nitrate-deficient-deficient strain, Nitrate Redactase-deficient strain; Aspergillus oryzae 1013-niaD: This strain has already been deposited as FERM P-17707 at the National Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, and the niaD gene, which is a marker gene, has been introduced, and its ability to assimilate nitrate The strain that recovered was selected as a transformant. Further, the obtained transformant was subjected to Southern analysis, and the following examination was conducted using a strain in which only one copy of the introduced plasmid was integrated into the niaD locus of the chromosome as a melO promoter analysis strain.
[0024]
About this melO analysis strain | stump | stock, liquid culture and solid culture (rice bran culture) were performed, and the GUS activity in a microbial cell was measured. As a result, a very high activity of 4040 U / mg was observed in the liquid culture, whereas a very low activity of 48 U / mg was obtained in the solid culture. This suggests that the melO gene is not involved in the browning of the cocoons, suggesting that other tyrosinase genes are present in the cocoons.
[0025]
[Example 2]
Cloning of the melB gene From the cDNA library (EST library) by mRNA obtained from the bran culture, A. A clone JZ4495 having high homology to the melO gene of oryzae was selected. Next, the melB gene was obtained by plaque hybridization from the chromosome gene library of Aspergillus oryzae O-1013 strain (FERM P-16528 deposited by Biotechnology Institute of Industrial Science and Technology) using this clone as a probe and EMBL3 phage. Cloned. As the probe, DNA obtained by amplifying chromosomal DNA by PCR using two kinds of oligo DNAs was used.
[0026]
Of the two types of oligo DNAs, one is oligo DNA # 1 and its base sequence is shown in SEQ ID NO: 3 (FIG. 7), and the other is oligo DNA # 2 and its base sequence is It is shown in SEQ ID NO: 4 (FIG. 8).
[0027]
By this method, clone λTR99 hybridizing with the above probe was isolated from about 10,000 phage clones. The DNA base sequence was determined by the dideoxy method using the above oligo DNA as a primer, and it was confirmed that this clone was indeed the target melB gene.
[0028]
[Example 3]
Determination of the base sequence of the melB gene The entire base sequence of the melB gene was determined using the positive clone λTR99 strain as a template. A 4.2 kb sequence was determined by combining the promoter portion, coding region, and terminator portion (SEQ ID NO: 2, FIGS. 4, 5, and 6). Among the above sequences, the 1 to 1436 position is the promoter portion, the 1437 to 3635 position is the coding region, and the 3636 to 4174 position is the terminator portion.
[0029]
As a result of homology search with the melO gene, there are 6 introns in the melB gene, and its coding region is 2.2 kbp (more specifically, 2199 bp from ATG at 1437 position to GCC at 3635 position) ), The protein deduced from the base sequence was found to be 616 residues (SEQ ID NO: 1, FIG. 2, FIG. 3). A comparison of the structures of the melO gene and the melB gene is shown in Table 1 below.
[0030]

[0031]
[Example 4]
Expression intensity of melB gene About the expression intensity of the melB gene in solid culture and liquid culture, the plasmid pmelB-GUS for promoter analysis shown in FIG. 10 was constructed in the same manner as in Example 1, and the expression intensity was measured using this plasmid. did.
[0032]
A plasmid pmelB-GUS for promoter analysis was constructed by inserting 1.4 kbp upstream of the start codon ATG of the melB gene into the PstI / SalI gap of pNGS1. (FIG. 10) When this plasmid is introduced into Aspergillus, the reporter gene (GUS) is expressed under the control of the melB promoter, and the expression level of the promoter can be quantified by measuring the GUS activity. The prepared plasmid was designated as Neisseria gonorrhoeae. The strain was introduced into the oryzae 1013-niaD strain, and a strain in which the niaD gene, which is a marker gene, was introduced and the ability to assimilate nitrate was recovered was selected as a transformant. Further, the obtained transformant was subjected to Southern analysis, and the following examination was performed using a strain in which only one copy of the introduced plasmid was incorporated into the niaD locus of the chromosome as a melB promoter analysis strain.
[0033]
About this melB analysis strain, liquid culture and solid culture (rice bran culture) were performed, and GUS activity in the microbial cells was measured. As a result, only a low activity of 45 U / mg was obtained in the liquid culture, whereas a very high activity of 2850 U / mg was obtained in the solid culture. Further, browning was not observed in liquid culture, whereas browning was observed in solid culture. From this, it was considered that the melB gene is involved in the browning of cocoons.
[0034]
Northern analysis was also conducted. The same liquid culture and solid culture (spear culture) as described above were performed, and RNA was extracted from each culture according to a conventional method. Northern hybridization was performed on both RNAs using a part of the melB gene as a probe. As a result, no signal was observed in the RNA obtained from the liquid culture, whereas a very strong hybridization signal was detected in the RNA obtained from the solid culture.
[0035]
[Example 5]
Introduction of the melB gene into Aspergillus oryzae The melB expression plasmid pmelB-nia was constructed by inserting the melB gene (4.2 kb) containing the obtained promoter and terminator into the gonococcal transformation vector pIN93 (FIG. 11). This pmelB-nia was introduced into a Neisseria gonorrhoeae host niaD mutant strain (FERM P-17707 deposited by Biotechnology Institute of Industrial Science and Technology) according to a conventional method. The thus obtained transformant (TmelB-11 strain) into which the melB gene was introduced in a single copy was named Aspergillus oryzae TmelB-11 and was transferred to the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Deposited as P-18134. And the cocoon was created using this transformant (TmelB-11 strain | stump | stock).
[0036]
As a result, higher browning was observed in the transgenic strain than in the host strain. This suggested that melB was strongly expressed in the transgenic strain.
[0037]
[Example 6]
In order to suppress the melB gene that prevents tanning of cocoons using the melB gene, an antisense gene of melB was first prepared. This was introduced into Aspergillus oryzae M-NS4 (distributed from the National Tax Agency Brewing Research Institute), and solid culture (spear culture) was performed. As a result, the normal melB mRNA binds to the antisense gene mRNA, making it impossible to produce a protein. As a result, the browning of the cocoons of the strain into which the antisense gene was introduced was suppressed.
[0038]
Next, multiple copies of the melB partial gene were introduced into the above strain, and solid culture (spear culture) was performed. This causes titration and weakens the original function of melB. As a result, browning of the cocoon was also suppressed.
From these things, it turned out that browning of a cocoon is suppressed by suppressing melB.
[0039]
【The invention's effect】
According to the present invention, it becomes possible to produce tyrosinase (melB) having the brown degeneration of Aspergillus oryzae and used in various industrial fields such as prevention of browning of sake lees, coloring of brewed foods, development of anti-coloring substances. Is possible. In addition, the present invention is an epoch-making technique in which the enzyme protein produced is very safe and can be applied to the food, pharmaceutical, cosmetics industry, etc., because the koji mold enzyme is produced by koji mold.
[0040]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the amino acid sequence of a novel tyrosinase (melB).
FIG. 2 shows the continuation of the above.
FIG. 3 shows the continuation of the above.
FIG. 4 shows the base sequence of a novel tyrosinase gene melB.
FIG. 5 shows the continuation of the above.
FIG. 6 shows the continuation of the above.
FIG. 7 shows oligo DNA # 1.
FIG. 8 shows oligo DNA # 2.
FIG. 9 shows an analysis plasmid pmelO-GUS.
FIG. 10 shows an analysis plasmid pmelB-GUS.
FIG. 11 shows a plasmid pmelB-nia for expressing melB.

Claims

A protein having tyrosinase enzyme activity having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.

The DNA of the gene encoding the protein according to claim 1, which is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.

A recombinant vector comprising at least a coding region in the DNA of claim 2.

A recombinant vector according to claim 3, wherein the recombinant vector is a recombinant vector pmelB-nia having the structure shown in FIG .

A transformant obtained by introducing the recombinant vector according to claim 3 or 4 into koji mold.

Aspergillus oryzae TmelB-11 (FERM P-18134).

A method for producing a protein having tyrosinase enzyme activity, characterized by using the transformant according to claim 5 or 6.