JP3905604B2 - New chemical substance Koror Sewing Machine - Google Patents

Description

【０００６】
【化４】

【０００７】
また、本発明は、シュードアルテロモナス属に属しコロールミシンを生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にコロールミシンを生成蓄積させ、該生成蓄積したコロールミシンを採取することを特徴とするコロールミシンの製造法である。そして、上記シュードアルテロモナス属に属する微生物としてはシュードアルテロモナス・スピーシーズF-420が挙げられる。
さらに、本発明は、コロールミシンを有効成分として含有することを特徴とする抗菌剤である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
以下にコロールミシン〔式（Ｉ）又は式（II）の化合物〕の理化学的、生物学的性質を示す。
【０００９】
１．物質の色：無色
２．分子量：433
３．分子式：C₂₅H₃₉NO₅
高分解能質量分析：実測値 434.2898 〔(M+H)⁺〕
計算値 434.2906 (C₂₅H₄₀NO₅)
４．核磁気共鳴シグナル：
１）¹H-NMR（重DMSO：500MHz）
δppm 0.74(3H, t), 0.83(3H, t), 1.1-1.5(16H, br), 1.37(3H, s), 1.74(2H, m), 2.38(1H, dd), 2.58(1H, dd), 2.86(1H, m), 2.88(1H, m), 4.83(1H, m), 5.09(1H, s), 5.29(1H, t), 5.70(1H, m), 5.91(1H, t), 6.45(1H, m), 7.26(1H, s), 9.83(1H, s)
２）¹³C-NMR（重DMSO：500MHz）
δppm 8.0(q), 13.9(q), 22.1(t), 24.1(q), 26.1(t), 27.2(t), 28.6(t), 28.89(t), 28.92(t), 30.9(t), 31.22(t), 31.25(t), 44.0(t), 55.1(d), 56.0(d), 63.8(d), 87.2(s), 125.1(s), 127.6(d), 128.2(d), 130.9(d), 132.8(d), 133.9(d), 168.4(s), 170.1(s)
５．赤外吸収スペクトルにおける主な吸収帯（KBr法）
νmax 3438, 2930, 2860, 1765, 1700, 1655, 1543, 1460, 1381, 1328, 1205, 1110, 1054, 996, 948cm ^-1
６．紫外線吸収スペクトルにおける主な吸収帯（エタノール中）
λmax=270nm、ε=340
７．比旋光度：〔α〕_D ²⁵ -5.3 °（c 0.23、クロロホルム中）
８．溶解性：クロロホルム、酢酸エチル、エタノール、メタノールに可溶。水には難溶。
９．抗菌活性
コロールミシンの1000-0.4μg/ml溶液を用いて直径8mmのペーパーディスク（アドバンテック東洋社製）にそれぞれディスクあたり50μlの溶液を添加した場合の、４種の細菌、即ち、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus IFO12732 、以下「S.a.」）、ビブリオ・コスチコラ（Vibrio costicola ATCC33508、以下「V.c.」）、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli IFO3301、以下「E.c.」）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis IFO3134 、以下「B.s.」）に対する生育阻害活性を調べた。ペーパーディスク法による阻止円の大きさを表１に示す。
【００１０】
【表１】

【００１１】
コロールミシンは、化学的方法によって合成することもできるが、微生物を用いて生産することも可能である。コロールミシンの生産に用いる微生物としては、シュードアルテロモナス属に属し、コロールミシン生産能を有する微生物であれば特に限定されず、例えば、パラオ共和国海域で採取されたサボテングサ属海藻から分離されたF-420株や該菌株に由来する変異株を挙げることができる。
【００１２】
このF-420株の菌学的性質は次の通りである。
なお、形態観察は、培地にシュードアルテロモナス・スピーシーズF-420株を植菌し、30℃で24〜48時間培養したのちに光学顕微鏡および透過型電子顕微鏡を用いて行った。培地は、マリンアガー（Bacto Marine Agar 2216、ディフコ社製）あるいはマリンブロス（Bacto Marine Broth 2216、ディフコ社製）を用いた。また、本菌株は培地中の塩化ナトリウム濃度が1％以下では菌の生育が認められないことから、生化学的性状の試験は75％人工海水を用いて培地を作成するか、あるいは培地中に3％塩化ナトリウムを添加することによって行った。
【００１３】
ａ．形態
１）細胞の形および大きさ：桿菌、1.5-2.6 × 0.6-1.2μm。
２）細胞の多形性の有無：無し。
３）運動性の有無、鞭毛の着生状態：有り、極毛。
４）胞子の有無：無し。
５）グラム染色性：陰性。
６）抗酸性の有無：無し。
ｂ．各培地における生育状態
１）マリンアガー平板培養 ：良好に生育、コロニーは円形、凸円状、全縁、湿光、中心部黄色、周辺部乳白色、あるいは黄色、あるいは乳白色のコロニーを形成する。
２）マリンアガー斜面培養 ：良好に生育、糸状、黄色。
３）マリンブロス培養 ：良好に生育、被膜、リングを形成し、培地上部が濁る。
４）マリンブロスゼラチン穿刺培養：液化する。
５）リトマスミルク ：消化する。
ｃ．生理学的性質
１）硝酸塩の還元：還元しない。
２）MRテスト：陰性。
３）VPテスト：陰性。
４）インドールの生成：生成しない。
５）硫化水素の生成：生成しない。
６）でんぷんの加水分解：分解する。
７）クエン酸の利用：Simmons培地：利用しない。
：Cristensen培地：利用しない。
８）無機窒素源の利用：アンモニウム塩は利用するが、硝酸塩は利用しない。
９）色素の生成：非水溶性黄色色素を生産する。
１０）ウレアーゼ活性：陰性。
１１）オキシダーゼ活性：陽性。
１２）カタラーゼ活性：陽性。
１３）生育の範囲（温度、pH）：温度10〜50℃、24〜38℃で最も良好に生育。pH3〜11、最適生育pH範囲6〜10。
１４）酸素に対する態度：好気性。
１５）OF試験：ブドウ糖を酸化的に分解する。
１６）糖類からの酸およびガスの生成の有無：
基礎培地はBaumannのBM培地を使用、30℃、３週間培養後。
生成の有無を表２に示す。
【００１４】
【表２】

１７）エスクリンの分解：分解する。
１８）アルギニンの分解：分解しない。
１９）ＤＮＡの分解：分解する。
２０）好塩性：有り、生育塩濃度範囲１〜１０％。
２１）βガラクトシダーゼ：陰性。
２２）ＧＣ含量（モル％）：４２．３。
２３）イソプレノイドキノン：主たるユビキノン Ｑ−８、
マイナー成分としてＱ−７、Ｑ−９を含む。
【００１５】
以上の菌学的性質からバージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー第８版の分類基準にしたがって公知の菌種と比較した。本菌株は好気性グラム陰性桿菌で極毛を有し、ブドウ糖を酸化的に分解、オキシダーゼ、カタラーゼが陽性であった。さらに、ゼラチンを液化し、DNAを加水分解し、GC含量が50％以下であることから従来の分類法に従えばアルテロモナス属に所属すると考えられた。現在、アルテロモナス属は、16S rDNA塩基配列の相同性から２つの属に分かれるが、以上に記した本菌株の表現形はシュードアルテロモナスにより近いと判断されることより、本菌株をシュードアルテロモナス・スピーシーズ（Pseudoalteromonas sp. ）と同定した。そして、この菌株をシュードアルテロモナス・スピーシーズ（Pseudoalteromonas sp. ）F-420とし、平成９年２月１８日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-16084として寄託した。
【００１６】
次に培養法について述べる。
本発明の培養においては通常の細菌の培養方法が一般に用いられる。培地としては資化可能な炭素源、窒素源、無機物および必要な生育、生産促進物質を程よく含有する培地であれば合成培地、天然培地のいずれでも使用可能である。炭素源としてはグルコース、澱粉、デキストリン、マンノース、フラクトース、シュークロース、ラクトース、キシロース、アラビノース、マンニトール、糖密などの糖類、酢酸等の有機酸、グリセリン等のアルコール類などが単独または組み合わせて用いられる。窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・ステープ・リカー、大豆粉、カザミノ酸などが単独または組み合わせて用いられる。そのほか、必要に応じて食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、燐酸二水素カリウム、燐酸水素二カリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅などの無機塩類を加える。さらに使用菌の生育やコロールミシンの生産を促進する微量成分を適当に添加することができる。
【００１７】
培養法としては、液体培養法が最も適している。培養温度は30℃が適当であり、培地のpHは3〜11で培養することができ、6〜10が望ましい。液体培養で通常１〜４日間培養を行うと、コロールミシンが培養液中および菌体中に生成蓄積される。培養物中の生成量が最大に達したときに培養を停止する。
【００１８】
培養物からコロールミシンの単離精製は、微生物代謝産物をその培養物から単離精製するために常用される方法に従って行われる。例えば培養物を濾過や遠心分離により培養濾液と菌体に分け、菌体を含水メタノール、含水エタノールなどで抽出する。ついで、抽出液と培養濾液とを合わせて酢酸エチルなどで抽出する。抽出液を濃縮し、シリカゲルによるカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどにより、コロールミシンを得る。
【００１９】
本発明の抗菌剤は、コロールミシンを有効成分とする。有効濃度は、抗菌性を発揮できる範囲内であれば特に限定されないが、１〜200 μg/mlとするのが好ましい。本発明の抗菌剤は特に好塩性を示すグラム陰性細菌に有効である。
以下に本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
【００２０】
【実施例】
〔実施例１〕
種菌としてシュードアルテロモナス・スピーシーズF-420を用いる。該菌株を1000ml容量の三角フラスコ中のマリンブロス（ディフコ社製、37.4g/l）200mlに植菌し、30℃で24時間振盪（110rpm）培養した。このようにして得られた培養液4.8リットルを遠心分離した。遠心分離によって得られた菌体を、200mlのエタノールで抽出し、濃縮した。濃縮物を水200mlに懸濁させ、酢酸エチル400mlによって分配抽出し、濃縮した。得られた濃縮液をクロロホルムーメタノール（100 ：1〜40：1、v/v）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、抗菌活性フラクションを得た。ついで活性フラクションを濃縮し、移動相としてクロロホルムを用いたゲル浸透高速液体クロマトグラフィー（日本分析工業製ジャイゲル-1HF、内径20mm×長さ300mm）で精製し、抗菌活性を有するコロールミシン2.4mgを得た。ここで得たコロールミシンは、前記した理化学的性質および生物学的性質を示した。
【００２１】
〔実施例２〕
種々の濃度のコロールミシンのメタノール溶液（濃度200,40,10,2,0.4μ/ml ）を直径8mmのペーパーディスク（アドバンテック東洋社製）に１ディスクあたり50μl 添加した。
種々の好塩性を示すあるいは示さない細菌をマリンアガー2216^(TM)（ディフコ社製）寒天培地上に植菌して前述のペーパーディスクをこの寒天培地上に置いた。その後、この寒天培地を30℃で16から40時間放置し、ペーパーディスク周辺に形成された阻止円を観察した。この結果を表３に示す。
【００２２】
【表３】

【００２３】
ここで表の左端に「♯」マークを付した細菌は、発明の実施の形態の欄で記載したデータを再掲したものである。なお、表中の「Salinivibrio costicola」は、前記の「ビブリオ・コスチコラ」（Vibrio costicola ATCC33508）と同一の細菌である（従来ビブリオ・コスチコラとして登録されていたものであるが、最近になって、サリニビブリオ・コスチコラと名称の変更がなされたものである。その経緯については Melladoら著「インターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリオロジー誌」第46巻817ページより821ページ(1996年発行) に記述されている。また、「Pseudomonas aeruginosa OTA-05-H3株」、「Litoralomonas mutabilis EN102株」、「Pelagiobacter variavilis Ni-2088株」の３株はいずれも本発明者の属する研究室で取得された菌株であり、この表に挙げてある株番号は当研究室で用いられている番号に過ぎない。
【００２４】
表３に示すように、コロールミシンはグラム陽性細菌一般、グラム陰性細菌のうち好塩性を示さないもの、及びグラム陰性細菌のうちコロールミシンを生産するシュードアルテロモナス・スピーシーズF-420に対する生育阻害効果はないが、コロールミシンの生産を認めるもの以外の好塩性を示すグラム陰性細菌に対して生育阻害活性を示すことがわかる。
【００２５】
〔実施例３〕
Dilution Assay法によりコロールミシンの各種微生物に対する最小生育阻害濃度を調べた。この結果を表４に示す。なお、Dilution Assayとは「液体培地または寒天培地を用いて抗生物質を段階的に希釈した系列を作り、この希釈列に試験菌を接種し、一定時間培養後試験菌の発育を阻止する最小阻止濃度をその抗生物質の力価とする」試験である。
【００２６】
【表４】

【００２７】
表４に示すように、コロールミシンは感染症の原因として知られる各種微生物には実用的濃度では抗菌性を示さないことがわかる。なお、この実施例にとりあげた病原菌はいずれも好塩性を示さないものである。
【００２８】
〔実施例４〕
コロールミシンの10mg/ml溶液（原液）を用いてウィルス感染細胞に対する生理活性を調査した。
（１）種々の希釈度のコロールミシン溶液の水疱性口内炎ウィルスを感染させた細胞に対するウィルス増殖阻害を該ウイルスによる細胞変性作用を指標として調べた。この結果を表５に示す。
【００２９】
【表５】

【００３０】
表５に示すように、原液の1/160希釈液においても細胞変性作用の減少が観察され、わずかながら増殖阻害が認められた。また、原液の1/40-1/80希釈液では増殖阻害を示したが、その効果にはばらつきがあった。なお、本実験においてコロールミシンによる細胞毒性は観察されなかった。
（２）種々の希釈度のコロールミシン溶液を用いてニューカッスル病ウィスルを感染させた細胞の合胞体形成作用を調べた。この結果を表６に示す。
【００３１】
【表６】

【００３２】
表６に示すように、該ウイルスによる合胞体形成作用は、原液の1-40-1/80希釈液においてやや抑制が認められた。なお、この実験において細胞凝集(V-ATPase阻害剤に特徴的な生理作用) は観察されなかった。
（３）種々の希釈度のコロールミシン溶液を用いてニューカッスル病ウィルスの外被糖蛋白質の１つである赤血球凝集素（ＨＡ）の合成に対する影響を調べた。この結果を表７に示す。
【００３３】
【表７】

【００３４】
表７に示すように、ＨＡ糖蛋白質の合成阻害は、原液の1/40から1/80希釈液において観察された。
（４）種々の希釈度のコロールミシン溶液を用いてベビーハムスター腎細胞の増殖阻害を調べた。この結果を表８に示す。
【００３５】
【表８】

【００３６】
表８に示すように、増殖阻害は、原液の1/400から1/800希釈液においてわずかに観察される。
〔実施例５〕
実施例２と同様の方法でシュードアルテロモナス(Pseudoalteromonas)属及びビブリオ(Vibrio)属に分類される海洋細菌を被検菌としてコロールミシン、抗生物質ペンチルキノリノン（2-Pentyl-4-quinolinone）、ポリミキシンＢの抗菌活性を調べた。この結果を表９に示す。
なお、上記細菌はいずれも好塩性を示すグラム陰性菌である。
【００３７】
【表９】

【００３８】
表９に示すように、コロールミシンは、シュードアルテロモナス属あるいはビブリオ属に分類される好塩性のグラム陰性菌について、コロールミシン生産菌株に対しては生育阻害活性を示さないが、コロールミシン非生産菌株に対しては生育阻害活性を示す。
【００３９】
【発明の効果】
本発明により抗菌活性を有する新規化合物コロールミシンが提供される。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel antibiotic produced by a microorganism, a method for producing the same, and use thereof.
[0002]
[Prior art]
Antibiotics play an important role as pharmaceuticals that are effective in treating infectious diseases. Conventionally, β-lactams, aminoglycosides, macrolides, polyether (ionophore) compounds, etc. are known as antibiotics, and these are used as antibacterial agents (Modern Chemistry / Special Issue 9 “Antibiotics”). The cutting edge of material research, Masaji Ohno and Satoshi Omura, Tokyo Chemical Dojin, 1987, 4-15, Pharmaceutical and microbial production (bottom), Yoshiro Okami, Takashi Nara, Academic Publishing Center, 1982, 128- 157).
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
Although many compounds are currently used as antibacterial agents, there are problems such as the presence of naturally resistant bacteria and the appearance of bacteria that have acquired drug resistance. For drug resistance, resistance mechanisms such as the drug itself can no longer be taken up by fungal cells, the drug is inactivated by decomposition, modification, etc., the drug action point changes and the drug becomes ineffective As a solution, new and superior antibacterial agents are required (drug resistance of pathogenic bacteria (elucidation of mechanisms and countermeasures), Hajime Hashimoto and Matsuhisa Inoue, Academic Publishing Center, 1993, 1-17).
An object of the present invention is to provide a novel antibacterial substance in order to solve the problem against such resistant bacteria.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
In view of such circumstances, the present inventor conducted a search for a novel antibacterial active substance, and as a result, isolated corrolemicin from a culture solution of a strain belonging to the genus Pseudoarteromonas, and that the compound is a novel compound. As a result, the present invention has been completed.
That is, the present invention is a corrole sewing machine represented by the following formula (I) or (II).
[0005]
[Chemical 3]

[0006]
[Formula 4]

[0007]
The present invention also relates to culturing microorganisms belonging to the genus Pseudoalteromonas that have the ability to produce corroleuminum in a medium, producing and accumulating corrolmycin in the culture, and collecting the accumulative product that has been produced and accumulated. This is a feature of a method for producing a color sewing machine. An example of the microorganism belonging to the genus Pseudoalteromonas is Pseudoalteromonas sp. F-420.
Furthermore, the present invention is an antibacterial agent characterized by containing a corrole sewing machine as an active ingredient.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention is described in detail below.
The physicochemical and biological properties of the corrole sewing machine [compound of formula (I) or formula (II)] are shown below.
[0009]
1. Material color: colorless Molecular weight: 433
3. Molecular formula: C ₂₅ H ₃₉ NO ₅
High resolution mass spectrometry: measured value 434.2898 [(M + H) ⁺ ]
Calculated 434.2906 (C ₂₅ H ₄₀ NO ₅ )
4). Nuclear magnetic resonance signal:
1) ¹ H-NMR (heavy DMSO: 500 MHz)
δppm 0.74 (3H, t), 0.83 (3H, t), 1.1-1.5 (16H, br), 1.37 (3H, s), 1.74 (2H, m), 2.38 (1H, dd), 2.58 (1H, dd ), 2.86 (1H, m), 2.88 (1H, m), 4.83 (1H, m), 5.09 (1H, s), 5.29 (1H, t), 5.70 (1H, m), 5.91 (1H, t) , 6.45 (1H, m), 7.26 (1H, s), 9.83 (1H, s)
2) ¹³ C-NMR (heavy DMSO: 500 MHz)
δppm 8.0 (q), 13.9 (q), 22.1 (t), 24.1 (q), 26.1 (t), 27.2 (t), 28.6 (t), 28.89 (t), 28.92 (t), 30.9 (t) , 31.22 (t), 31.25 (t), 44.0 (t), 55.1 (d), 56.0 (d), 63.8 (d), 87.2 (s), 125.1 (s), 127.6 (d), 128.2 (d) , 130.9 (d), 132.8 (d), 133.9 (d), 168.4 (s), 170.1 (s)
5. Major absorption bands in the infrared absorption spectrum (KBr method)
νmax 3438, 2930, 2860, 1765, 1700, 1655, 1543, 1460, 1381, 1328, 1205, 1110, 1054, 996, 948cm ^-1
6). Main absorption band in UV absorption spectrum (in ethanol)
λmax = 270nm, ε = 340
7). Specific rotation: [α] _D ²⁵ -5.3 ° (c 0.23 in chloroform)
8). Solubility: Soluble in chloroform, ethyl acetate, ethanol and methanol. Insoluble in water.
9. Four types of bacteria, namely staphylococcus, when a solution of 50 μl per disc is added to a paper disc of 8 mm diameter (manufactured by Advantech Toyo Co., Ltd.) using a 1000-0.4 μg / ml solution of an antibacterial active corrole sewing machine Aureus (Staphylococcus aureus IFO12732, hereinafter referred to as “Sa”), Vibrio costicola ATCC33508 (hereinafter referred to as “Vc”), Escherichia coli IFO3301, hereinafter referred to as “Ec”, Bacillus subtilis (hereinafter referred to as “Bacillus subtilis IFO3 134”) The growth inhibitory activity against “Bs”) was examined. Table 1 shows the size of the inhibition circle by the paper disk method.
[0010]
[Table 1]

[0011]
A corrole sewing machine can be synthesized by a chemical method, but can also be produced using a microorganism. The microorganism used for the production of corrole sewing machine is not particularly limited as long as it belongs to the genus Pseudoalteromonas and has the ability to produce corror sewing machine. For example, F isolated from a cactus seaweed collected in the sea area of the Republic of Palau -420 strain and mutant strains derived from the strain can be mentioned.
[0012]
The mycological properties of the F-420 strain are as follows.
Morphological observation was performed using an optical microscope and a transmission electron microscope after inoculating Pseudoalteromonas sp. Strain F-420 in the medium and culturing at 30 ° C. for 24 to 48 hours. As the medium, marine agar (Bacto Marine Agar 2216, manufactured by Difco) or marine broth (Bacto Marine Broth 2216, manufactured by Difco) was used. In addition, since the bacterial strain does not grow when the concentration of sodium chloride in the medium is 1% or less, the biochemical property test should be performed using 75% artificial seawater or in the medium. This was done by adding 3% sodium chloride.
[0013]
a. Form 1) Cell shape and size: Neisseria gonorrhoeae, 1.5-2.6 × 0.6-1.2 μm.
2) Presence or absence of cell polymorphism: None.
3) Presence of motility, flagellar state: Yes, polar hair.
4) Presence or absence of spores: None.
5) Gram stainability: negative.
6) Presence or absence of acidity: None.
b. Growth state in each medium 1) Marine agar plate culture: grows well, colonies form round, convex circle, whole edge, wet light, central yellow, peripheral milky white, yellow, or milky white colonies.
2) Marine agar slope culture: grows well, filamentous, yellow.
3) Marine broth culture: grows well, forms a film and a ring, and the upper part of the medium becomes cloudy.
4) Marine broth gelatin puncture culture: liquefy.
5) Litmus milk: digested.
c. Physiological properties 1) Reduction of nitrate: not reduced.
2) MR test: negative.
3) VP test: negative.
4) Generation of indole: not generated.
5) Production of hydrogen sulfide: not produced.
6) Starch hydrolysis: Decomposes.
7) Use of citric acid: Simmons medium: Not used.
: Cristensen medium: Not used.
8) Use of inorganic nitrogen source: Ammonium salt is used, but nitrate is not used.
9) Production of pigment: Produces a water-insoluble yellow pigment.
10) Urease activity: negative.
11) Oxidase activity: positive.
12) Catalase activity: positive.
13) Range of growth (temperature, pH): grows best at temperatures of 10-50 ° C and 24-38 ° C. pH 3-11, optimal growth pH range 6-10.
14) Attitude toward oxygen: aerobic.
15) OF test: Glucose is degraded oxidatively.
16) Presence or absence of acid and gas generation from saccharides:
The basal medium is Baumann's BM medium, after culturing at 30 ° C for 3 weeks.
Table 2 shows the presence or absence of generation.
[0014]
[Table 2]

17) Degradation of esculin: Decomposes.
18) Decomposition of arginine: not decomposed.
19) Decomposition of DNA: Decomposes.
20) Saltiness: Yes, growth salt concentration range 1-10%.
21) β-galactosidase: negative.
22) GC content (mol%): 42.3.
23) Isoprenoid quinone: main ubiquinone Q-8,
Q-7 and Q-9 are included as minor components.
[0015]
Based on the above bacteriological properties, it was compared with known bacterial species in accordance with the classification criteria of the 8th edition of the Virgie's Manual of Systematic Bacteriology. This strain was an aerobic gram-negative bacilli, had polar hair, oxidatively degraded glucose, and was positive for oxidase and catalase. Furthermore, gelatin was liquefied, DNA was hydrolyzed, and the GC content was 50% or less, so it was considered that it belongs to the genus Alteromonas according to the conventional classification method. At present, the genus Alteromonas is divided into two genera based on the homology of the 16S rDNA nucleotide sequence. The phenotype of the strain described above is judged to be closer to Pseudoarteromonas. Identified as Pseudoalteromonas sp. This strain was designated as Pseudoalteromonas sp. F-420, and was deposited as FERM P-16084 at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology on February 18, 1997.
[0016]
Next, the culture method will be described.
In the culture of the present invention, a usual bacterial culture method is generally used. As the medium, any of a synthetic medium and a natural medium can be used as long as it contains moderately assimilable carbon sources, nitrogen sources, inorganic substances and necessary growth and production promoting substances. As the carbon source, saccharides such as glucose, starch, dextrin, mannose, fructose, sucrose, lactose, xylose, arabinose, mannitol, sugartight, organic acids such as acetic acid, alcohols such as glycerin, etc. are used alone or in combination. . As the nitrogen source, ammonium chloride, ammonium sulfate, sodium nitrate, urea, peptone, meat extract, yeast extract, dry yeast, corn steep liquor, soy flour, casamino acid and the like are used alone or in combination. In addition, inorganic salts such as sodium chloride, potassium chloride, magnesium sulfate, calcium carbonate, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, ferrous sulfate, calcium chloride, manganese sulfate, zinc sulfate, and copper sulfate are added as necessary. Furthermore, trace components that promote the growth of the bacteria used and the production of corrole sewing machine can be appropriately added.
[0017]
As the culture method, a liquid culture method is most suitable. The culture temperature is suitably 30 ° C., and the medium can be cultured at a pH of 3 to 11, preferably 6 to 10. When culturing is usually carried out for 1 to 4 days in a liquid culture, a corrole sewing machine is produced and accumulated in the culture solution and in the cells. The culture is stopped when the production amount in the culture reaches the maximum.
[0018]
The isolation and purification of corrole sewing machine from the culture is performed according to a method commonly used for isolating and purifying microbial metabolites from the culture. For example, the culture is separated into a culture filtrate and cells by filtration or centrifugation, and the cells are extracted with water-containing methanol, water-containing ethanol, or the like. Next, the extract and the culture filtrate are combined and extracted with ethyl acetate or the like. The extract is concentrated, and a corrole sewing machine is obtained by column chromatography using silica gel, high performance liquid chromatography, or the like.
[0019]
The antibacterial agent of the present invention contains a corrole sewing machine as an active ingredient. The effective concentration is not particularly limited as long as it is within the range where antibacterial properties can be exhibited, but it is preferably 1 to 200 μg / ml. The antibacterial agent of the present invention is particularly effective against gram-negative bacteria exhibiting halophilicity.
Hereinafter, the present invention will be described specifically by way of examples. However, the technical scope of the present invention is not limited by these examples.
[0020]
【Example】
[Example 1]
Pseudoalteromonas sp. F-420 is used as an inoculum. The strain was inoculated into 200 ml of marine broth (Difco, 37.4 g / l) in a 1000 ml Erlenmeyer flask and cultured at 30 ° C. for 24 hours with shaking (110 rpm). 4.8 liters of the culture solution thus obtained was centrifuged. The cells obtained by centrifugation were extracted with 200 ml of ethanol and concentrated. The concentrate was suspended in 200 ml of water, partitioned and extracted with 400 ml of ethyl acetate, and concentrated. The obtained concentrated liquid was purified by silica gel column chromatography using chloroform-methanol (100: 1 to 40: 1, v / v) to obtain an antibacterial activity fraction. Next, the active fraction was concentrated and purified by gel permeation high-performance liquid chromatography using chloroform as the mobile phase (Jaigel-1HF, manufactured by Nihon Analytical Industrial Co., Ltd., inner diameter 20 mm × length 300 mm) to obtain 2.4 mg of corrole sewing machine having antibacterial activity. It was. The corrole sewing machine obtained here showed the physicochemical and biological properties described above.
[0021]
[Example 2]
50 μl of corol sewing machine in various concentrations (concentrations of 200, 40, 10, 2, 0.4 μ / ml) was added to a paper disk (made by Advantech Toyo Co., Ltd.) having a diameter of 8 mm per disk.
Bacteria showing or not showing various halophilicity were inoculated on a marine agar 2216 ^(TM) (manufactured by Difco) agar medium, and the aforementioned paper disk was placed on the agar medium. Thereafter, this agar medium was allowed to stand at 30 ° C. for 16 to 40 hours, and the inhibition circle formed around the paper disk was observed. The results are shown in Table 3.
[0022]
[Table 3]

[0023]
Here, the bacterium marked with the “#” mark at the left end of the table is a reprint of the data described in the column of the embodiment of the invention. In addition, “Salinivibrio costicola” in the table is the same bacterium as the above-mentioned “Vibrio costicola ATCC33508” (previously registered as Vibrio costicola).・ The name was changed to Kosticola, which was described in Mellado et al., "International Journal of Systematic Bacteriology", Volume 46, page 817, page 821 (issued in 1996). In addition, all three strains of “Pseudomonas aeruginosa OTA-05-H3”, “Litoralomonas mutabilis EN102” and “Pelagiobacter variavilis Ni-2088” were obtained in the laboratory to which the inventor belongs. The strain numbers listed in this table are only numbers used in our laboratory.
[0024]
As shown in Table 3, cholormicin is a gram-positive bacterium in general, gram-negative bacterium that does not show halophilicity, and gram-negative bacterium that grows against Pseudoalteromonas sp. Although there is no inhibitory effect, it can be seen that it exhibits growth inhibitory activity against gram-negative bacteria exhibiting halophilicity other than those that recognize the production of corromycin.
[0025]
Example 3
The minimum inhibitory concentration of corrole sewing machine for various microorganisms was examined by the Dilution Assay method. The results are shown in Table 4. Dilution Assay is “Minimum inhibition that makes a series of serially diluted antibiotics using liquid medium or agar medium, inoculates this dilution series with test bacteria, and incubates the test bacteria after incubation for a certain period of time. This is the test where the concentration is the titer of the antibiotic.
[0026]
[Table 4]

[0027]
As shown in Table 4, it can be seen that the corrole sewing machine does not exhibit antibacterial activity at various practical concentrations for various microorganisms known to cause infection. In addition, none of the pathogenic bacteria taken in this example show halophilicity.
[0028]
Example 4
Physiological activity against virus-infected cells was investigated using a 10 mg / ml solution (stock solution) of corrole sewing machine.
(1) Virus growth inhibition of cells infected with vesicular stomatitis virus in various dilutions of cholormicin solution was examined using the cytopathic action of the virus as an index. The results are shown in Table 5.
[0029]
[Table 5]

[0030]
As shown in Table 5, a decrease in cytopathic action was also observed in the 1/160 dilution of the stock solution, and a slight growth inhibition was observed. In addition, the 1 / 40-1 / 80 dilution of the stock solution showed growth inhibition, but the effects varied. In this experiment, no cytotoxicity due to corrolemicin was observed.
(2) The syncytium formation action of cells infected with Newcastle disease virus was examined using various dilutions of corrole sewing machine solutions. The results are shown in Table 6.
[0031]
[Table 6]

[0032]
As shown in Table 6, the syncytium formation action by the virus was somewhat suppressed in the 1-40-1 / 80 dilution of the stock solution. In this experiment, cell aggregation (physiological action characteristic of V-ATPase inhibitor) was not observed.
(3) The effect on the synthesis of hemagglutinin (HA), one of the coat glycoproteins of Newcastle disease virus, was examined using various dilutions of corrole sewing machine solutions. The results are shown in Table 7.
[0033]
[Table 7]

[0034]
As shown in Table 7, inhibition of HA glycoprotein synthesis was observed in 1/40 to 1/80 dilutions of the stock solution.
(4) Growth inhibition of baby hamster kidney cells was examined using various dilutions of corrole sewing machine solutions. The results are shown in Table 8.
[0035]
[Table 8]

[0036]
As shown in Table 8, growth inhibition is slightly observed in 1/400 to 1/800 dilutions of the stock solution.
Example 5
In the same manner as in Example 2, marine bacteria classified into the genus Pseudoalteromonas and Vibrio are used as test bacteria. The antibacterial activity of polymyxin B was examined. The results are shown in Table 9.
In addition, all the said bacteria are gram-negative bacteria which show halophilicity.
[0037]
[Table 9]

[0038]
As shown in Table 9, the corrole sewing machine shows no growth inhibitory activity against the corrol mycin producing strain with respect to halophilic gram-negative bacteria classified into the genus Pseudoalteromonas or Vibrio. It exhibits growth inhibitory activity against non-producing strains.
[0039]
【The invention's effect】
The present invention provides a novel compound corrole sewing machine having antibacterial activity.

Claims (5)

A chemical corrole sewing machine represented by the following formula (I).

A chemical corrole sewing machine represented by the following formula (II).

Belonging to the shoe door Le terrorism Sphingomonas sp, and culturing the microorganism having the ability to produce Koror sewing machine according to claim 1 or 2, wherein in the culture to produce and accumulate the Koror sewing machine, the Koror sewing machine thus generated accumulation The method for producing a corrole sewing machine according to claim 1 or 2, wherein the method is collected.   4. The method for producing a corrole sewing machine according to claim 3, wherein the microorganism belonging to the genus Pseudoalteromonas is Pseudoalteromonas sp. F-420. An antibacterial agent comprising the corrole sewing machine according to claim 1 or 2 as an active ingredient.