JP3928044B2

JP3928044B2 - Identification method of pollenability of wheat plants and improvement method of wheat plants using the method

Info

Publication number: JP3928044B2
Application number: JP2002350839A
Authority: JP
Inventors: 隆夫小松田; 吉郎間野; 一郎本多; トュルスペコフヤーラン; 好昭渡邊
Original assignee: National Institute of Agrobiological Sciences; National Agriculture and Food Research Organization
Current assignee: National Institute of Agrobiological Sciences; National Agriculture and Food Research Organization
Priority date: 2002-12-03
Filing date: 2002-12-03
Publication date: 2007-06-13
Anticipated expiration: 2022-12-03
Also published as: JP2004180570A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は麦類の開花／閉花受粉性を支配する遺伝子を有する麦類品種を識別する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
イネや、コムギ、オオムギなどの世界の重要穀物はいずれもその種子（胚および胚乳）を食用とする作物であり、いずれも同一の花に雄蘂、雌蘂を生じ、それが自家受粉することにより種子を生成する自家受粉性作物である。これらの作物の花は、一般的に受粉時に開花し、葯を外部に抽出するのが一般的であるが、花の内部で自家受粉が可能であるため、結実のためには開花を必ずしも必要とせず、環境条件によっては開花せず受粉する閉花受粉となることが知られている（非特許文献１参照）。一方、オオムギには古くから遺伝的に開花せず、閉花受粉する品種があることが知られており（非特許文献２参照）、国内でも二条大麦を中心に多く導入されている。しかしながら、受粉性に関する研究が困難なためか、これを支配する遺伝子の数や座乗染色体に関する報告は皆無であった。
【０００３】
近年、オオムギのこの閉花受粉性は、オオムギの赤かび病の抵抗性向上に有効な遺伝子であることが示されてきており、オオムギの赤かび病の感染防止に閉花受粉性の導入はきわめて有効な手段であることが明らかとなってきた（非特許文献３参照）。赤かび病は麦類に於ける最も重要な病害であり、その抵抗性の強化が求められているため、閉花受粉性の導入はオオムギの高品質化のために不可欠である。
【０００４】
しかしながら一方で、オオムギへの閉花受粉性の導入はそれほど進んでいない。この原因は、閉花受粉性が穂でのみでしか判断できない形質であり、早期選抜が不可能であること、また、上記のように環境条件によって受粉性が変動したり、導入した系統によっては受粉性の判別がきわめて困難なため、閉花受粉性個体そのものの選抜自体が穂を用いたとしても困難であったことに起因する。前述のようにこれに関わる基本的な研究がなされていない理由も、この点にあることが予想される。そこで容易に受粉性を判断する方法および、これを早期世代で判別する方法の確立が望まれていた。
【０００５】
【非特許文献１】
星川清親著、「イネの生長」、農山漁村文化協会、1975年、p249-252
【０００６】
【非特許文献２】
Briggs D. E. 著、「Barley」、Chapman and Hall, London, ISBN: 041211870X、1978年、p.45
【０００７】
【非特許文献３】
吉田めぐみ、河田尚之、塔野岡卓司、育種学研究4(別2)、p.303 (2002)（日本育種学会第102回講演会要旨集；日本育種学会）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、閉花受粉性遺伝子を有する系統と、そうでない開花受粉する系統とを特異的かつ効率的に識別できる方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った。その結果、ミサトゴールデンなどの国産オオムギ系統がもつ閉花受粉性は、その花を構成する小器官、鱗被の形態と完全に一致し、穂の鱗被の形態を観察することによりオオムギの受粉性が正確に判断できること、および、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-D)を開花前の穂に投与すると開花型の穂は数日開花が維持された状態となるのに比べ、閉花受粉型の穂ではこのような反応が見出されないことを示した（本多および牧野、育種学研究, 3(別2),p186,2001）。
【００１０】
そこで本発明者らは、穂の直接観察により判定する方法および上述の鱗被の形態、2,4-Dに対する反応性を調査する方法をもちいて、閉花受粉性を示すオオムギ品種「関東中生ゴール」と開花受粉性を示すオオムギ品種「アズマムギ」の組換え後代固定系統群（９９系統）を用い、これらの各個体の受粉性を正確に判定した。その結果、調査した受粉性は開花受粉個体６１、閉花受粉性個体３８に分離し、本系統群において、受粉性は１遺伝子支配を示すことが推察された。
【００１１】
本系統群については、既に間野らにより詳細な連鎖地図が作成され、報告されている(Mano, Y., et al. Genome, 44, 284-292, 2001)。間野らにより既に得られているこれらの連鎖地図上での個々の個体の分子マーカーの分離情報と、ここで得られた受粉性の分離データ間の連鎖を解析し、本受粉性の座乗染色体や本受粉性に連鎖する既知DNAマーカーを調査したところ、本受粉性はオオムギ2H染色体長腕上（連鎖地図（図１）に示す位置）に座乗し、地図上に示す分子マーカーにより検出できることを初めて見出した。
【００１２】
本発明者らは、開花受粉性オオムギ品種「さつき二条」の開花受粉性を閉花受粉性オオムギ品種「ミサトゴールデン」に導入したミサトゴールデンの開花・閉花受粉性に関する準同質遺伝子系群を作成し、この受粉性が一遺伝子支配の分離を示すことを既に報告している（本多および牧野、育種学研究, 3(別2),p186,2001）。
【００１３】
本発明者らは、これらの準同質遺伝子系統群のうち、閉花受粉性をもつと判定した個体より得られたDNAと、開花受粉性をもつと判定した個体より得られたDNAをそれぞれ数個体分あわせて、これらの合一した遺伝子を基に遺伝子多型を見出す集団分離分析方法（Bulk segregation analysis）により、両者に多型を示す分子マーカーを検索するとともに、上記「関東中生ゴール」と「アズマムギ」系統群で見出されたDNAマーカーの適応についても検討したところ、連鎖地図（図１）に示す位置に本遺伝子が座乗し、地図上に示す分子マーカーにより検出できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１４】
以上の結果はオオムギを材料に得られたものであるが、麦類の遺伝子には相同性があることが知られていることから、オオムギだけでなく、麦類全てで同様の形質を持っている可能性がある。本発明においてはオオムギに限定することなく麦類全てに適応するものと考えられる。
【００１５】
本発明によって閉花受粉性を導入することにより、花粉の飛散を防止できる。近年、遺伝子組換えなどにより人為的に改変された遺伝子が自然界に飛散し、その生態系を脅かし、野生種の保存に影響を与える可能性が指摘されており、これを防ぐために、閉花性の導入は有効な手段となりうる。
【００１６】
すなわち本発明は、閉花受粉性をもつ遺伝子をもつ系統と、そうでない開花受粉する系統を特異的かつ効率的に識別できる方法に関し、より具体的には、
〔１〕麦類植物の開花受粉性あるいは閉花受粉性を識別する方法であって、受粉性を支配する遺伝子と連鎖する図１の連鎖地図に示される、少なくとも１つの分子マーカーを用いることを特徴とする識別方法、
〔２〕分子マーカーが開花受粉性あるいは閉花受粉性を有する麦類植物と同様の型を示す場合に、被検植物がそれぞれ開花受粉性あるいは閉花受粉性であると判定される、〔１〕に記載の方法、
〔３〕分子マーカーがe11m19-3、e7m34、またはe7m34-420のいずれかのマーカーである、〔１〕に記載の方法、
〔４〕以下の（ａ）〜（ｄ）に記載の工程を含む、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）麦類植物からDNA試料を調製する工程
（ｂ）調製したDNA試料を制限酵素により切断する工程
（ｃ）DNA断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｄ）検出されたDNA断片の大きさを、対照と比較する工程
〔５〕以下の（ａ）〜（ｄ）に記載の工程を含む、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）麦類植物からDNA試料を調製する工程
（ｂ）調製したDNA試料を鋳型として、プライマーDNAを用いてPCR反応を行う工程
（ｃ）増幅したDNA断片を、その大きさに応じて分離する工程
（ｄ）検出されたDNA断片の大きさを、対照と比較する工程
〔６〕以下の（ａ）〜（ｅ）に記載の工程を含む、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）麦類植物からDNA試料を調製する工程
（ｂ）調製したDNA試料を制限酵素で処理する工程
（ｃ）処理されたDNA試料を鋳型として、AFLP反応を行う工程
（ｄ）増幅したDNA断片を、その大きさに応じて分離する工程
（ｅ）検出されたDNAパターンを、対照と比較する工程
〔７〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法により開花受粉性であると識別される麦類植物を早期に選抜する工程を含む、開花受粉性の形質を有する人為的に改変された麦類植物の作製方法、
〔８〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法により閉花受粉性であると識別される麦類植物を早期に選抜する工程を含む、閉花受粉性の形質を有する人為的に改変された麦類植物の作製方法、
〔９〕麦類植物がオオムギである、〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法、
〔１０〕〔７〕に記載の方法により作製される、開花受粉性の形質を有する麦類植物、
〔１１〕〔８〕に記載の方法により作製される、閉花受粉性の形質を有する麦類植物、を提供するものである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明は、麦類植物の開花受粉性あるいは閉花受粉性を識別する方法を提供する。本発明の識別方法においては、被検植物について「受粉性を支配する遺伝子」を有するか否かを調べることにより、被検植物が開花受粉性である、もしくは閉花受粉性であると識別される。
【００１８】
本発明の「受粉性を支配する遺伝子」は、例えば、オオムギにおいては、2H染色体長腕上に座乗している。また一般的傾向として、オオムギとコムギおよびライムギでは、祖先を同じくする遺伝子が同祖的染色体上に座乗している。このことから、コムギもしくはライムギにおける受粉性を支配する遺伝子も第二同祖群に座乗していると予想することができる。なおオオムギの2H染色体に対応する染色体は、コムギでは2A, 2B, 2D、ライムギでは2Rである。
【００１９】
本発明における「受粉性を支配する遺伝子」は、開花受粉性の形質を示す麦類植物の該遺伝子においては、「開花受粉性遺伝子」とも呼ばれ、一方、閉花受粉性の形質を示す麦類植物の該遺伝子においては、「閉花受粉性遺伝子」とも呼ばれる。
【００２０】
本発明の識別方法においては、開花／閉花受粉性を識別したい所望の麦類植物（「被検植物」と記載する場合あり）において、「開花受粉性遺伝子」を有する場合に、被検植物は開花受粉性の形質を有する植物であるものと判定され、一方、「閉花受粉性遺伝子」を有する場合に、被検植物は閉花受粉性の形質を有する植物であるものと判定される。
【００２１】
本発明の識別方法の好ましい態様においては、受粉性を支配する遺伝子と連鎖する分子マーカーを用いることを特徴とする。本発明における「分子マーカー」とは、受粉性を支配する遺伝子と遺伝的に連鎖するDNA領域であって、他のDNA領域と識別可能なDNA領域を言う。
【００２２】
本発明の識別方法には、図１に記載の分子マーカーを好適に用いることができる。本発明は、図１の連鎖地図に示される、少なくとも１つの分子マーカーを用いることを特徴とする識別方法を提供する。
【００２３】
一般に分子マーカーは、単位cMで表す連鎖距離が短いほどその遺伝子の近傍に位置し、その遺伝子と同時に遺伝するため、有用性が高い。即ち、好ましい本発明の分子マーカーとしては、例えばe11m19-3, e7m34, e7m34-420等を挙げることができる。これら分子マーカーは、「受粉性を支配する遺伝子」（図１において「Cleistogamy」と記載された位置に座乗）の近傍に位置し、連鎖距離が0.4cM、2.1cM、 9.2cM の短い距離で連鎖し、きわめて有用な分子マーカーである。また、図１に示される連鎖距離が少し離れるその他の分子マーカーは、有効性が上記マーカーほど高くはないものの、本発明の識別方法に利用可能なマーカーである。
【００２４】
本発明の図１に示される分子マーカーについての情報は、より詳しくはManoらの文献(Mano, Y., et al., Construction of a genetic map of barley (Hordeum vulgare L.) cross 'Azumamugi' x 'Kanto Nakate Gold' using a simple and efficient amplified fragment-length polymorphism system. Genome, 2001. 44: p. 284-292.)から取得することが可能である。
【００２５】
本発明の識別方法に利用可能な分子マーカー「e11m19-3」の一例としては、配列番号：１に記載の塩基配列を挙げることができるが、必ずしもこの配列に限定されるものではない。
【００２６】
本発明の好ましい態様においては、例えば、本発明の分子マーカーである「e11m19-3」を持つ閉花性品種と、「e11m19-3」を持たない開花性品種を交配して、分離集団を作ったとき、「e11m19-3」を持つ個体をマーカー分析で選抜すれば、選抜された個体は高い確率で閉花性遺伝子を持つものと考えられる。
【００２７】
また、本発明の分子マーカーをAFLPマーカーの状態で利用する場合には、例えば、被検植物（分離個体）が閉花性の親と共通の当該のAFLPマーカーバンドを持つとき、この被検植物は高い確率で閉花性を有するものと判定される。
【００２８】
本発明の一つの態様としては、開花受粉性もしくは閉花受粉性を有する麦類植物のそれぞれに特異的に存在し、かつ受粉性を支配する遺伝子と連鎖するDNA領域を検出することを特徴とする、開花受粉性もしくは閉花受粉性を有する麦類植物の識別方法である。本方法における被検植物は、通常、親の受粉性が判明しているものであり、育成途中の系統を指す。本方法においては、例えば、前記の「親」が開花受粉性である場合には、被検植物における分子マーカーが「親」における分子マーカーのDNA配列と同型のとき、被検植物は、開花受粉性を有するものと判定される。本発明において「同型（同様な型）」とは、分子マーカーを特徴付けるDNA情報、例えば、該分子マーカーに含まれる多型部位について、少なくとも同一であることを言い、必ずしも、配列全体が完全に同一である必要はない。
【００２９】
また、「e11m19-3」をAFLPからDNA配列に基づいて新しいプライマーを作成し、より簡便なPCRマーカーへと変更した場合は、被検植物が「e11m19-3」のDNA配列を有するとき、または「e11m19-3」のDNA配列の多型を有するときに、被検植物が閉花受粉性を有すると判定される。本発明の分子マーカーをAFLPマーカーとして再現するには、EcoプライマーにAGGを、MSEプライマーにCAGをそれぞれ付加して解析すれば良い。
【００３０】
また、本発明の一つの態様においては、図１で示される２つ以上の複数の分子マーカーを適宜選択し、本発明の識別方法を実施することにより、より確度の高い識別が可能となる。
【００３１】
本発明において「分子マーカーを用いる」とは、該分子マーカーを開花／閉花受粉性の識別のための指標として利用することを意味する。つまり本発明の好ましい態様においては、被検植物について分子マーカーが開花受粉性の形質を有する麦類植物と同様の型を示す場合に、被検植物は開花受粉性の形質を有するものと判定され、一方、分子マーカーが閉花受粉性の形質を有する麦類植物と同様の型を示す場合に、被検植物は閉花受粉性の形質を有するものと判定される。
【００３２】
本発明において「被検植物」は、麦類植物であれば特に制限されないが、例えば、コムギ、ライムギ等のコムギ連（Triticeae）に属する植物、ブロムグラス牧草等のBromeae連に属する植物、オートムギ等のAveneae連に属する植物、その他重要な牧草が多数含まれるPoeae連に属する植物等を挙げることができる。本発明の方法において用いられる好ましい麦類植物としては、オオムギを挙げることができる。
【００３３】
さらに、オオムギの開花受粉性品種としては、例えば、「アズマムギ」や「さつき二条」、閉花受粉性品種としては、例えば、「関東中生ゴール」や「ミサトゴールデン」を挙げることができるが、これらに限定されない。既に開花もしくは閉花受粉性を有することが判明している上記の麦類植物における分子マーカーの型を対照とすることにより、本発明の識別方法を好適に実施することができる。
【００３４】
また本発明の好ましい態様においては、「被検植物」は、親がはっきり分っている育成途中の系統等を指す。つまり、被検植物において、「閉花受粉性」の親と同じ型を示すものが、高い確率で閉花受粉性の形質を有する（閉花受粉性遺伝子を有する）ものと判定される。この場合の確率とは、組換え価をＰ（％）とした場合、1 - 0.01 x Pで表わすことができる。
【００３５】
本発明の分子マーカーとしては例えばRFLP（Retriction Fragment Length Polymorphism）マーカー、RAPD（Randam Amplified Polymorphic DNA）マーカー、AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism；増幅制限酵素断片長多型)マーカー等を挙げることができる。RFLPマーカーとは、染色体DNA配列の制限酵素断片長多型(RFLP)に関する情報を言う。RFLPとは、制限酵素で処理して得られるDNA断片の長さの違いによって見出される遺伝的変異（置換変異、挿入変異および欠失変異等）を言い、この変異は、DNA断片をアガロース電気泳動により断片長の長さに基づき分離し泳動距離の差をサザンブロットにより検出して確認できる。
【００３６】
また、RAPD法とは一般的に、適当なプライマーを用いてDNAを増幅させ、増幅させたDNAの長さの違いによりDNA多型を検出する方法を言う。また、AFLP法とは、上記のRFLP法とRAPD法を組み合わせた方法であり、制限酵素で切断されたDNA断片の長さの違いをPCRにより選択的に増幅させて検出する方法を言う。
【００３７】
本発明に使用できる上記のマーカーはとしては、本発明の遺伝子と連鎖しているマーカーであれば特に制限されず、任意のマーカーを用いることができる。
【００３８】
本発明の分子マーカーとしてRFLPマーカーを利用する場合、本発明の識別方法を、例えば以下のようにして行うことができる。まず、麦類植物からDNA試料を調製する。次いで調製したDNA試料を制限酵素により切断する。次いでDNA断片をその大きさに応じて分離する。検出されたDNA断片の大きさを、対照と比較する。上記方法においては、分離されたDNAの分離パターンが、開花受粉性を有する麦類植物あるいは閉花受粉性を有する植物において同様の型を示す場合、該植物はそれぞれ開花受粉性もしくは閉花受粉性の形質を有すると判定される。
【００３９】
より具体的には、以下のようにして本発明の識別方法を実施することができるが、この方法に特に限定されるものではない。まず、交配後代（通常は緑葉）から染色体DNAを抽出し、制限酵素HindIIIによって処理する。次いで、電気泳動により切断長の大小を分離した後、泳動したDNAをナイロンメンブレンに移し、プローブDNAを用いてサザンブロッティング解析を行う。このプローブDNAとしては、本発明の分子マーカーまたはその部分配列を使用することができる。このとき得られるバンドの分布パターンが、開花受粉性あるいは閉花受粉性を有する麦類植物におけるバンドの分布パターンと同様の型であるとき、被検植物の受粉性がそれぞれ開花受粉性もしくは閉花受粉性と判定される。
【００４０】
本発明における上記プローブDNAは、通常、本発明の分子マーカー上の多型に起因して差異を生じるDNAバンドに対してハイブリダイズするものを使用する。具体的には、本発明の各分子マーカーまたはその部分配列を例示することができる。
【００４１】
プローブDNAは、必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識する方法としては、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、プローブDNAの5'端を³²Pでリン酸化することにより標識する方法が挙げられる。また、クレノウ酵素等のDNAポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして、³²P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）によっても標識することができる。
【００４２】
また、上記のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件、または、よりストリンジェンシーの高い条件によって行うことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、例えば反応液の組成が6M尿素、0.4%SDS、0.5xSSCである条件を挙げることができる。よりストリンジェンシーの高い条件としては、例えば反応液の組成が6M尿素、0.4%SDS、0.5xSSCである条件を挙げることができるが、これらの条件と同等のストリンジェンシーであれば、上記の反応液の組成に限定されない。
【００４３】
また、本発明の分子マーカーとして、RAPDマーカーを使用する場合、本発明の識別方法は例えば以下のようにして行うことができる。まず、麦類植物からDNA試料を調製する。次いで調製したDNA試料を鋳型として、プライマーDNAを用いてPCR反応を行う。必要な場合は増幅したDNAを制限酵素で切断する。増幅したDNA断片の電気泳動後のバンドパターンを開花受粉性を有する麦類植物あるいは閉花受粉性を有する植物のバンドパターンと比較し、同様の型を示す場合、該植物はそれぞれ開花受粉性あるいは閉花受粉性の形質を有すると判定する。
【００４４】
本発明の識別方法に使用するプライマーDNAは、当業者においては、各種分子マーカーについての配列情報を考慮して、最適なプライマーを適宜設計することが可能である。通常、上記プライマーとは、開花受粉性もしくは閉花受粉性を有する麦類植物に特異的に存在し、受粉性を支配する遺伝子と連鎖する塩基配列に特異的なプライマー、または開花受粉性もしくは閉花受粉性を有する麦類植物に特異的に存在し、受粉性を支配する遺伝子と連鎖する塩基配列を挟み込むように設計された、該塩基配列を増幅するための一対のプライマーセットである。具体的には、下記のようなプライマーセットを例示することができる。

【００４５】
本発明の上記PCRプライマーは、当業者においては、例えば、自動オリゴヌクレオチド合成機等を利用して作製することができる。また、当業者においては周知の多型検出方法、例えば、上記PCRプライマーを用いたPCR-SSCP法等によっても本発明の方法を実施することが可能である。
【００４６】
また、本発明の分子マーカーがゲノムDNAのエクソン中に存在する場合には、mRNAを鋳型としたRT-PCRを利用することも可能である。また、Taqman（量的PCR検出）システム（Roche社）を利用すれば、蛍光により増幅産物の有無を検出することが可能である。このシステムによれば、電気泳動の手間も省けるため短時間で本発明の識別方法を行うことが可能である。
【００４７】
さらに本発明の分子マーカーとしてAFLPマーカーを使用する場合、本発明の識別方法は、例えば以下のようにして行うことができる。まず、麦類植物からDNA試料を調製する。次に、このDNA試料を制限酵素で処理した後、処理されたDNA試料を鋳型としてAFLP反応を行う。次いで増幅したDNA断片を、その大きさに応じて分離し、検出されたDNAパターンを、対照と比較する。AFLP反応を最適な制限酵素およびPCRプライマーを用いて実施することは、当業者においては、容易に行い得ることである。
【００４８】
本発明の上記方法の一例を以下に示すが、この方法に限定されない。まず被検植物から調製したDNA試料を制限酵素EcoRIおよびMseIで処理した後、所定のAFLPプライマーを接続し、AFLP反応を行い、増幅産物を得る。得られた増幅産物を電気泳動によって分析し、バンドパターンを開花受粉性を有する麦類植物あるいは閉花受粉性を有する植物のバンドパターンと比較し、同様の型を示す場合、該植物はそれぞれ開花受粉性あるいは閉花受粉性の形質を有すると判定される。
【００４９】
また、本発明の識別方法に供される、DNA試料は、特に制限されるものではないが、通常、被検植物である麦類植物から抽出するゲノムDNAを用いる。また、ゲノムDNAの採取源としては特に限定されるものではなく、植物体のいずれの組織からも抽出できる。例えば、穂、葉、根、茎、種子、胚乳部、フスマ、胚等から抽出することができる。
【００５０】
本発明の上記DNA試料の調製（抽出）方法としては、当業者においては、公知の方法によって行うことができる。好ましい調製方法として、例えば、CTAB法を用いてDNAを抽出する方法を挙げることができる。
【００５１】
さらに本発明の上記電気泳動分析は常法によって行えばよい。例えば、アガロースまたはポリアクリルアミドのゲル中で電圧をかけて電気泳動し、分離したDNAパターンを分析する。
【００５２】
また、本発明の識別方法は、AFLPマーカーの実際の配列解析により導き出されるCAPS (cleaved amplified porymorphic sequence)やSTS (sequence tagged site)マーカーなどのより信頼性の高いマーカーを用いて実施することも可能である。より具体的には、前述のプライマーセット１と２を使用して、オオムギ品種「ミサトゴールデン」と「さつき二条」のDNAからPCR反応を行い、生成したそれぞれのDNAを制限酵素MseIで処理すると、「さつき二条」のみがこの制限酵素で一部切断されるために短くなり、電気泳動による移動度に差が生じ、識別することができる。F2分離集団においては両親ホモ型とヘテロ型の３タイプが存在するが、ヘテロ型は両親のサイズを併せ持つタイプを示すことから、この３タイプについて識別可能となる。
【００５３】
本発明の識別方法を利用して、開花受粉性もしくは閉花受粉性と識別される麦類植物を早期に選抜することが可能となる。本発明はこのような開花受粉性もしくは閉花受粉性と識別される麦類植物を早期に選抜する方法も提供する。また本発明は、開花受粉性もしくは閉花受粉性の形質を有する人為的に改変された麦類植物の作製方法も提供する。
【００５４】
ここでいう「早期」とは、麦類植物の出穂より前の状態を指し、好ましくは発芽直後の状態を指す。
【００５５】
開花受粉性もしくは閉花受粉性の形質を有する人為的に改変された麦類植物の作製方法としては、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）の方法を挙げることができるが、これらの方法に特に制限されない。
【００５６】
（ａ）閉花受粉性品種に任意の開花受粉性品種を交配し、交配後代（雑種）に開花受粉性品種を反復して交配し、本発明の方法により各世代で開花受粉性を有する麦類植物を選抜する。もしくは、開花受粉性品種に任意の閉花受粉性品種を交配し、交配後代（雑種）に閉花受粉性品種を反復して交配し、本発明の方法により各世代で閉花受粉性を有する麦類植物を選抜する。
【００５７】
（ｂ）受粉性を支配する遺伝子が優性遺伝子である品種の遺伝子を、劣性遺伝子を有する品種に導入することにより、受粉性を改変する。
【００５８】
（ｃ）受粉性を支配する遺伝子が劣性遺伝子である品種の遺伝子を、優性遺伝子を有する品種に相同組換え法等の方法を用いて導入することにより、受粉性を改変する。
【００５９】
DNAの植物細胞への導入は、当業者においては、公知の方法、例えばアグロバクテリウム法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション法）、パーティクルガン法により実施することができる。
【００６０】
また、本発明の開花受粉性もしくは閉花受粉性の形質を有する人為的に改変された麦類植物の作製方法によって作製された、開花あるいは閉花受粉性の形質を有する麦類植物もまた本発明に含まれる。
【００６１】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００６２】
［実施例１］関東中生ゴール／アズマムギ組み換え後代固定系統による受粉性連鎖地図の作製と分子マーカーの獲得
関東中生ゴール／アズマムギより作成した組み換え後代固定系統（世代F9；99系統）各10個体を圃場栽培し、それぞれの系統の受粉性の固定度、圃場での受粉性、鱗被の形態、2,4-Dに対する反応を調査した。
【００６３】
各系統の系統内での受粉性の分離はみられず、各系統は受粉性に関して遺伝的に固定していると考えられた。圃場での受粉性については、出穂の遅い系統、穂が詰まった密穂の系統においては判定が困難であったため、本発明者らが報告した鱗被および2,4-D処理による受粉性判定方法（本多および牧野、育種学研究, 3(別2),p186,2001）により受粉性を判定した。すなわち、各系統の鱗被の形態を調査し、鱗被が小さい系統と大きい系統に分類した。次にこれらの系統の開花前の穂を切り取り、これを30ppmの2,4-D水溶液で処理したところ、鱗被の大きいすべての系統で開花が維持される現象が見いだされた。一方、鱗被の小さいすべての系統では、本現象は見いだされなかった。すなわち、鱗被の小さいものを閉花受粉系統、大きいものを開花受粉系統と判定した。
【００６４】
一方、これらの材料のうち16系統分からCTAB法により調製したゲノムDNAを受粉性が同じもの同士を合一し、集団とした。これらのDNAをEcoRI/MseIを用いて切断した後、各種プライマーセットを用いて増幅するAFLP法を行い、多型を検索し、多型を示すマーカーを6個見いだした。これらのマーカーと上記の受粉性の連鎖関係を解析し、連鎖マップ（図１）を得た。
【００６５】
また、判定したこれらの系統の受粉性形質を、既知のこれらの系統の分子マーカー情報とあわせ、連鎖関係を解析し、合わせて図１に示した。
【００６６】
［実施例２］開花受粉性オオムギ品種「さつき二条」の開花受粉性を閉花受粉性オオムギ品種「ミサトゴールデン」に導入した系統による受粉性遺伝子のマッピング
ミサトゴールデンの開花・閉花受粉性に関する準同質遺伝子系統(B5F3世代)30系統（1系統40個体）およびミサトゴールデンとさつき二条の交配によるF2世代150個体を圃場にて栽培した。
【００６７】
受粉性は開花期に圃場にて調査した。B5F3系統については、各個体の受粉性とともに系統内での受粉性の分離を調査し、系統のホモ・ヘテロ性を判定した。F2各個体については、それぞれの個体の受粉性を判定した。
【００６８】
B5F3系統のうち開花性が分離しないホモ系統13系統内のそれぞれランダムに選んだ個体および、F2世代150系統より新鮮葉を採取し、DNA抽出用試料とした。これらの試料よりCTAB法によりゲノムDNAを調製し、以後の実験に使用した。
【００６９】
B5F3個体より得られた各DNAを、受粉性ごとに合一し集団とした。これらのDNAをEcoRI/MseIを用いて切断した後、各種プライマーセットを用いて増幅するAFLP法を行い、多型を検索し、多型を示すマーカーを4個獲得した。また、実施例１で見いだした多型マーカーの摘要も試み、一個のマーカーが多型を示すことを見いだした。これらのマーカーと受粉性の連鎖関係を検討し図１に合わせて示した。
【００７０】
【発明の効果】
本発明の麦類の閉花／開花受粉性に連鎖するDNAマーカーを用いることにより、被検麦類植物についての受粉性がその穂を観察することなく、幼植物など、被検植物のあらゆる器官から抽出したDNAを用いて正確に判定できる。これにより、受粉性に関する判定が育成早期における個体を用いても可能となるため、開花／閉花受粉性を導入する育種における効率が飛躍的に向上する。
【００７１】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】受粉性を支配する遺伝子(Cleistogamy)と連鎖する分子マーカーを示す図である。
【図２】オオムギ品種「ミサトゴールデン」における分子マーカー「e11m19-3」の塩基配列の一例を示す図である。波線部分は、本発明の識別方法に使用可能なPCRプライマーの塩基配列を示す。オオムギ品種「さつき二条」においては、図中の四角で囲まれた塩基「C」は「T」であり、制限酵素MseIの認識サイトを構成する。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for identifying a wheat variety having a gene that controls the flowering / closed pollination of wheat.
[0002]
[Prior art]
The world's most important crops such as rice, wheat, and barley are crops that use their seeds (embryo and endosperm) as food, and all produce stamens and pistils on the same flower, which are self-pollinated. It is a self-pollinating crop that produces seeds. The flowers of these crops generally bloom at the time of pollination, and the buds are generally extracted to the outside, but self-pollination is possible inside the flowers, so flowering is not always necessary for fruiting. However, depending on the environmental conditions, it is known that it becomes a closed flower pollination that pollinates without flowering (see Non-Patent Document 1). On the other hand, it has been known that there are varieties of barley that have not been genetically flowered and that are pollinated by pollination (see Non-Patent Document 2), and are often introduced mainly in Nijo barley in Japan. However, there are no reports on the number of genes or locus chromosomes that control this because of the difficulty in research on pollination.
[0003]
In recent years, it has been shown that this flower pollination of barley is an effective gene for improving the resistance of head blight of barley. It has become clear that this is a very effective means (see Non-Patent Document 3). Red mold disease is the most important disease in wheat, and its resistance is required to be strengthened. Therefore, introduction of flower pollination is indispensable for improving barley quality.
[0004]
However, on the other hand, introduction of flower pollination into barley has not progressed so much. This is due to the traits that flower pollination can be determined only by ears, early selection is impossible, and pollination varies depending on environmental conditions as described above, and depending on the introduced line This is because it is very difficult to discriminate pollinating properties, and it was difficult to select closed pollinating individuals themselves even when using ears. It is expected that this is the reason why basic research related to this has not been done. Therefore, it has been desired to establish a method for easily determining pollination and a method for determining this in an early generation.
[0005]
[Non-Patent Document 1]
Hoshikawa Kiyochika, "Growth of Rice", Rural and Mountain Culture Association, 1975, p249-252
[0006]
[Non-Patent Document 2]
Briggs DE, Barley, Chapman and Hall, London, ISBN: 041211870X, 1978, p. 45
[0007]
[Non-Patent Document 3]
Megumi Yoshida, Naoyuki Kawada, Takuji Tonooka, Breeding Studies 4 (Attachment 2), p.303 (2002) (Abstracts of the 102nd Annual Meeting of the Breeding Society of Japan; Japanese Society of Breeding)
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method capable of specifically and efficiently discriminating between a line having a flower-pollinating gene and a flowering-pollinating line.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present inventor has intensively studied to solve the above problems. As a result, the closed pollination of domestic barley lines such as Misato Golden is completely consistent with the organelles and scales that make up the flowers. Compared to the fact that the sex can be accurately determined, and when 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) is administered to the pre-flowering ear, the flowering ear will remain in bloom for several days, It was shown that such a response was not found in the flower-pollinated ear (Honda and Makino, Breeding Studies, 3 (Attachment 2), p186, 2001).
[0010]
Therefore, the present inventors used the method of determining by direct observation of the ear and the method of investigating the above-described scale form, reactivity to 2,4-D, and the barley cultivar “Kanto Using a recombinant progeny fixed line group (99 lines) of barley cultivar “Azumamugi” exhibiting “raw goal” and flowering pollination, the pollinating ability of each of these individuals was accurately determined. As a result, the pollinating property investigated was separated into a flowering pollinating individual 61 and a closed flowering pollinating individual 38, and in this line group, it was inferred that the pollinating property was controlled by one gene.
[0011]
For this lineage group, a detailed linkage map has already been prepared and reported by Mano et al. (Mano, Y., et al. Genome, 44, 284-292, 2001). By analyzing the linkage between the individual molecular marker separation information on these linkage maps already obtained by Mano et al. And the pollinating separation data obtained here, this pollinating locus chromosome is analyzed. And the known DNA markers linked to the pollinating ability were investigated, and this pollinating ability can be detected on the barley 2H chromosome long arm (position shown in the linkage map (Fig. 1)) and detected by the molecular marker shown on the map. For the first time.
[0012]
The present inventors have created a near-isogenic group of flowering and flowering pollination properties of Misato Golden by introducing the flowering pollination of the flowering pollinating barley variety “Satsuki Nijo” into the flowering pollinating barley variety “Misato Golden”. However, it has already been reported that this pollination shows segregation controlled by one gene (Honda and Makino, Breeding Studies, 3 (Attachment 2), p186, 2001).
[0013]
The present inventors, among these quasi-isogenic lineage groups, count the number of DNAs obtained from individuals determined to have flower pollination and the number of DNAs obtained from individuals determined to have flower pollination. The molecular segregation analysis method (Bulk segregation analysis) that finds genetic polymorphisms based on these combined genes in combination with individual individuals, searches for molecular markers that show polymorphisms in both, and the above-mentioned “Kanto Meisei Goal” And also examined the adaptation of DNA markers found in the "Azumamugi" lineage group, found that this gene sits at the position shown in the linkage map (Fig. 1) and can be detected by the molecular marker shown on the map, The present invention has been completed.
[0014]
Although the above results were obtained using barley as a material, it is known that the wheat genes have homology, so not only barley but all wheat has similar traits. There is a possibility. In the present invention, it is considered that the present invention is applicable to all wheat without being limited to barley.
[0015]
By introducing closed pollination according to the present invention, pollen scattering can be prevented. In recent years, it has been pointed out that artificially modified genes due to genetic recombination, etc. may be scattered in nature, threatening the ecosystem and affecting the conservation of wild species. The introduction of can be an effective means.
[0016]
That is, the present invention relates to a method capable of specifically and efficiently discriminating a line having a gene having flower-pollinating ability and a non-flowering-pollinating line, more specifically,
[1] A method for discriminating flowering pollenability or closed flower pollination of a wheat plant, wherein at least one molecular marker shown in the linkage map of FIG. 1 linked to a gene that controls pollination is used. A distinctive identification method,
[2] When the molecular marker shows the same type as a wheat plant having flower pollination or flower pollination, it is determined that the test plant is flower pollination or flower pollination, respectively [1 The method described in
[3] The method according to [1], wherein the molecular marker is any one of e11m19-3, e7m34, and e7m34-420,
[4] The method according to any one of [1] to [3], comprising the steps described in the following (a) to (d):
(A) A step of preparing a DNA sample from a wheat plant
(B) A step of cleaving the prepared DNA sample with a restriction enzyme
(C) A step of separating DNA fragments according to their sizes
(D) comparing the size of the detected DNA fragment with a control
[5] The method according to any one of [1] to [3], comprising the steps described in the following (a) to (d):
(A) A step of preparing a DNA sample from a wheat plant
(B) A step of performing PCR reaction using the prepared DNA sample as a template and primer DNA
(C) A step of separating the amplified DNA fragment according to its size
(D) comparing the size of the detected DNA fragment with a control
[6] The method according to any one of [1] to [3], comprising the steps described in the following (a) to (e):
(A) A step of preparing a DNA sample from a wheat plant
(B) A step of treating the prepared DNA sample with a restriction enzyme
(C) A step of performing an AFLP reaction using the treated DNA sample as a template
(D) A step of separating the amplified DNA fragment according to its size
(E) a step of comparing the detected DNA pattern with a control
[7] Artificially modified to have a flowering pollinating trait, including a step of early selection of a wheat plant identified as flowering pollinating by the method according to any one of [1] to [6] A method for producing a treated wheat plant,
[8] Artificial having a flower-pollinating trait including a step of early selection of a wheat plant identified as flower-pollinating by the method according to any one of [1] to [6] A method for producing a modified wheat plant,
[9] The method according to any one of [1] to [8], wherein the wheat plant is barley.
[10] A wheat plant having a flower-pollinating character produced by the method according to [7],
[11] A wheat plant having a flower-pollinating character produced by the method according to [8] is provided.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention provides a method for discriminating the flowering and closing pollination of wheat plants. In the identification method of the present invention, the test plant is identified as having flowering pollination or closed flower pollination by examining whether or not the test plant has a “gene that controls pollination”. The
[0018]
The “gene that controls pollination” of the present invention sits on the 2H chromosome long arm in, for example, barley. As a general trend, in barley, wheat, and rye, genes that share the same ancestry are located on the homoeologous chromosome. From this, it can be expected that the gene controlling the pollination property in wheat or rye is also seated in the second sibling group. The chromosomes corresponding to the 2H chromosome of barley are 2A, 2B, 2D for wheat, and 2R for rye.
[0019]
In the present invention, the “gene that governs pollination” is also referred to as “flowering pollinating gene” in wheat genes that exhibit flowering pollinating traits, while wheat that exhibits closed flower pollinating traits. This gene of a plant is also called a “closed flower pollinating gene”.
[0020]
In the identification method of the present invention, a desired wheat plant (which may be referred to as “test plant” in some cases) whose flowering / closed flower pollinating property is to be identified has a “flowering pollination gene”. Is determined to be a plant having a flower-pollinating character, whereas if it has a “flower-pollinating gene”, the test plant is determined to be a plant having a flower-pollinating character .
[0021]
In a preferred embodiment of the identification method of the present invention, a molecular marker linked to a gene that controls pollination is used. The “molecular marker” in the present invention refers to a DNA region that is genetically linked to a gene that controls pollination and can be distinguished from other DNA regions.
[0022]
In the identification method of the present invention, the molecular marker shown in FIG. 1 can be suitably used. The present invention provides an identification method characterized by using at least one molecular marker shown in the linkage map of FIG.
[0023]
In general, molecular markers are more useful because the shorter the chain distance represented by the unit cM, the closer to the gene and the inheritance of the gene is at the same time. That is, preferable examples of the molecular marker of the present invention include e11m19-3, e7m34, e7m34-420 and the like. These molecular markers are located in the vicinity of “the gene that controls pollination” (located at the position marked “Cleistogamy” in FIG. 1), and the chain distances are as short as 0.4 cM, 2.1 cM, and 9.2 cM. It is linked and is a very useful molecular marker. In addition, other molecular markers shown in FIG. 1 that are slightly apart from each other in the chain distance are markers that can be used in the identification method of the present invention, although the effectiveness is not as high as that of the above marker.
[0024]
Information on the molecular markers shown in FIG. 1 of the present invention can be found in more detail in Mano et al. (Mano, Y., et al., Construction of a genetic map of barley (Hordeum vulgare L.) cross 'Azumamugi' x 'Kanto Nakate Gold' using a simple and efficient amplified fragment-length polymorphism system. Genome, 2001. 44: p. 284-292.).
[0025]
An example of the molecular marker “e11m19-3” that can be used in the identification method of the present invention is the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but is not necessarily limited to this sequence.
[0026]
In a preferred embodiment of the present invention, for example, a flowering cultivar having “e11m19-3” which is the molecular marker of the present invention and a flowering cultivar not having “e11m19-3” are crossed to form an isolated population. When an individual having “e11m19-3” is selected by marker analysis, the selected individual is considered to have a flowering gene with a high probability.
[0027]
When the molecular marker of the present invention is used in the state of an AFLP marker, for example, when the test plant (isolated plant) has the same AFLP marker band in common with the flowering parent, this test plant Is determined to have closeness with high probability.
[0028]
As one aspect of the present invention, it is characterized by detecting a DNA region that is specifically present in each of the wheat plants having flowering pollination property or closed flower pollination property and linked to a gene that controls pollination property. This is a method for identifying a wheat plant having flowering pollination or closed flower pollination. The test plant in this method usually indicates a parental line whose parent pollinating property is known. In this method, for example, when the “parent” is flowering pollinating, the test plant is flowering pollination when the molecular marker in the test plant is the same type as the DNA sequence of the molecular marker in the “parent”. It is determined to have sex. In the present invention, “same type (similar type)” means that DNA information characterizing a molecular marker, for example, polymorphic sites contained in the molecular marker is at least identical, and the entire sequence is not necessarily completely identical. Need not be.
[0029]
In addition, when “e11m19-3” is created from AFLP based on the DNA sequence and a new primer is changed to a simpler PCR marker, when the test plant has the DNA sequence of “e11m19-3”, or When the polymorphism of the DNA sequence “e11m19-3” is present, it is determined that the test plant has flower pollination. In order to reproduce the molecular marker of the present invention as an AFLP marker, analysis may be performed by adding AGG to the Eco primer and CAG to the MSE primer.
[0030]
Further, in one embodiment of the present invention, it is possible to identify with higher accuracy by appropriately selecting two or more molecular markers shown in FIG. 1 and implementing the identification method of the present invention.
[0031]
In the present invention, “using a molecular marker” means that the molecular marker is used as an index for distinguishing flowering / flower pollination. That is, in a preferred embodiment of the present invention, when the molecular marker of the test plant shows the same type as a wheat plant having a flowering pollinating character, the test plant is determined to have a flowering pollinating character. On the other hand, when the molecular marker shows the same type as a wheat plant having a flower-pollinating character, the test plant is determined to have a flower-pollinating character.
[0032]
In the present invention, the “test plant” is not particularly limited as long as it is a wheat plant. For example, plants belonging to the wheat series (Triticeae) such as wheat and rye, plants belonging to the Bromeae series such as bromegrass grass, oats and the like Plants belonging to the Aveneae series, and plants belonging to the Poeae series containing many important grasses. Preferred barley plants used in the method of the present invention include barley.
[0033]
Furthermore, examples of the flowering pollinating varieties of barley include `` Azumamugi '' and `` Satsuki Nijo '', and examples of the flowering pollinating varieties include `` Kanto Mesosei Goal '' and `` Misato Golden '', It is not limited to these. The identification method of the present invention can be suitably implemented by using as a control the type of molecular marker in the above-mentioned wheat plant that has already been found to have flowering or flower pollination.
[0034]
In a preferred embodiment of the present invention, the “test plant” refers to a growing line or the like whose parents are clearly known. That is, in the test plant, a plant having the same type as the parent of “closed flower pollinating” is determined to have a closed flower pollinating character (having a closed flower pollinating gene) with a high probability. The probability in this case can be expressed by 1−0.01 × P where the recombination value is P (%).
[0035]
Examples of the molecular marker of the present invention include RFLP (Retriction Fragment Length Polymorphism) marker, RAPD (Randam Amplified Polymorphic DNA) marker, AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) marker, and the like. An RFLP marker refers to information on restriction fragment length polymorphism (RFLP) of a chromosomal DNA sequence. RFLP refers to genetic mutations (substitution mutations, insertion mutations, deletion mutations, etc.) found by differences in the length of DNA fragments obtained by treatment with restriction enzymes. These mutations agarose electrophoresis the DNA fragments. Can be separated based on the fragment length and detected by Southern blotting to confirm the difference in migration distance.
[0036]
The RAPD method generally refers to a method in which DNA is amplified using an appropriate primer, and a DNA polymorphism is detected by the difference in length of the amplified DNA. The AFLP method is a method in which the above RFLP method and RAPD method are combined, and refers to a method in which a difference in length of DNA fragments cleaved with a restriction enzyme is selectively amplified by PCR and detected.
[0037]
The marker that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it is a marker linked to the gene of the present invention, and any marker can be used.
[0038]
When an RFLP marker is used as the molecular marker of the present invention, the identification method of the present invention can be performed, for example, as follows. First, a DNA sample is prepared from a wheat plant. Next, the prepared DNA sample is cleaved with a restriction enzyme. The DNA fragments are then separated according to their size. The size of the detected DNA fragment is compared to a control. In the above method, when the separated pattern of the isolated DNA shows a similar type in a wheat plant having flowering pollination or a plant having flowering pollination, the plant is flowering pollinating or flowering pollinating, respectively. It is determined to have a trait of
[0039]
More specifically, the identification method of the present invention can be carried out as follows, but is not particularly limited to this method. First, chromosomal DNA is extracted from the mating progeny (usually green leaves) and treated with the restriction enzyme HindIII. Next, after separating the size of the cleavage length by electrophoresis, the migrated DNA is transferred to a nylon membrane, and Southern blotting analysis is performed using the probe DNA. As the probe DNA, the molecular marker of the present invention or a partial sequence thereof can be used. When the distribution pattern of the band obtained at this time is the same type as the distribution pattern of the band in a wheat plant having flowering pollination or flower pollination, the pollination of the test plant is flowering pollination or flowering, respectively. Determined to be pollinating.
[0040]
As the probe DNA in the present invention, one that hybridizes to a DNA band that produces a difference due to the polymorphism on the molecular marker of the present invention is usually used. Specifically, each molecular marker of the present invention or a partial sequence thereof can be exemplified.
[0041]
The probe DNA can be appropriately labeled and used as necessary. As a labeling method, the 4 ′ end of the probe DNA is removed using T4 polynucleotide kinase. ³² A method of labeling by phosphorylation with P is mentioned. Also, using DNA polymerase such as Klenow enzyme, using random hexamer oligonucleotides as primers, ³² Labeling can also be performed by a method of incorporating a substrate base labeled with an isotope such as P, a fluorescent dye, biotin, or the like (random prime method or the like).
[0042]
In addition, the above hybridization can be performed under stringent conditions or conditions with higher stringency. Examples of stringent hybridization conditions include conditions in which the composition of the reaction solution is 6M urea, 0.4% SDS, 0.5xSSC. Examples of conditions with higher stringency include conditions in which the composition of the reaction solution is 6M urea, 0.4% SDS, 0.5xSSC, and the above reaction solution may be used as long as the stringency is equivalent to these conditions. It is not limited to the composition.
[0043]
When a RAPD marker is used as the molecular marker of the present invention, the identification method of the present invention can be performed, for example, as follows. First, a DNA sample is prepared from a wheat plant. Next, PCR reaction is performed using the prepared DNA sample as a template and primer DNA. If necessary, cleave the amplified DNA with a restriction enzyme. The band pattern after electrophoresis of the amplified DNA fragment is compared with the band pattern of a wheat plant having flowering pollination or a plant having flowering pollination. It is determined to have a flower-pollinating character.
[0044]
As a primer DNA used in the identification method of the present invention, those skilled in the art can appropriately design an optimal primer in consideration of sequence information on various molecular markers. Usually, the primer is a primer specific to a nucleotide sequence that is present in a wheat plant having flowering pollination or close flower pollination and is linked to a gene that controls pollination, or flowering pollination or closing. It is a pair of primer sets for amplifying the base sequence, which is designed to sandwich a base sequence linked to a gene that specifically exists in a flower pollinating wheat plant and governs pollination. Specifically, the following primer sets can be exemplified.

[0045]
The PCR primer of the present invention can be prepared by those skilled in the art using, for example, an automatic oligonucleotide synthesizer. Those skilled in the art can also carry out the method of the present invention by a known polymorphism detection method, for example, the PCR-SSCP method using the above PCR primers.
[0046]
When the molecular marker of the present invention is present in an exon of genomic DNA, RT-PCR using mRNA as a template can be used. Further, if a Taqman (quantitative PCR detection) system (Roche) is used, the presence or absence of an amplification product can be detected by fluorescence. According to this system, it is possible to perform the identification method of the present invention in a short time since the labor of electrophoresis can be saved.
[0047]
Further, when an AFLP marker is used as the molecular marker of the present invention, the identification method of the present invention can be performed, for example, as follows. First, a DNA sample is prepared from a wheat plant. Next, after treating this DNA sample with a restriction enzyme, AFLP reaction is performed using the treated DNA sample as a template. The amplified DNA fragments are then separated according to their size, and the detected DNA pattern is compared to a control. Carrying out the AFLP reaction with optimal restriction enzymes and PCR primers can be easily performed by those skilled in the art.
[0048]
An example of the above method of the present invention is shown below, but is not limited to this method. First, a DNA sample prepared from a test plant is treated with restriction enzymes EcoRI and MseI, and then a predetermined AFLP primer is connected to carry out AFLP reaction to obtain an amplification product. The obtained amplification product is analyzed by electrophoresis, and the band pattern is compared with the band pattern of a wheat plant having flowering pollination property or a plant having flowering pollination property. It is determined to have a pollinating or closed flower pollinating character.
[0049]
Further, the DNA sample used in the identification method of the present invention is not particularly limited, but usually genomic DNA extracted from a wheat plant as a test plant is used. Further, the collection source of genomic DNA is not particularly limited, and it can be extracted from any tissue of the plant body. For example, it can be extracted from ear, leaf, root, stem, seed, endosperm part, bran, embryo and the like.
[0050]
A person skilled in the art can prepare (extract) the above-described DNA sample of the present invention by a known method. As a preferable preparation method, for example, a method of extracting DNA using the CTAB method can be mentioned.
[0051]
Furthermore, the electrophoretic analysis of the present invention may be performed by a conventional method. For example, electrophoresis is performed by applying voltage in an agarose or polyacrylamide gel, and the separated DNA pattern is analyzed.
[0052]
In addition, the identification method of the present invention can also be carried out using more reliable markers such as CAPS (cleaved amplified porymorphic sequence) and STS (sequence tagged site) markers derived by actual sequence analysis of AFLP markers. It is. More specifically, using the primer sets 1 and 2 described above, a PCR reaction was performed from DNA of barley cultivars “Misato Golden” and “Satsuki Nijo”, and each of the generated DNAs was treated with the restriction enzyme MseI. Only “Satsuki Nijo” is partially cleaved by this restriction enzyme, so that it becomes shorter and the mobility by electrophoresis is different and can be identified. In the F2 segregated population, there are three types of parents, homozygous and heterozygous, and the heterozygous is a type that has both parents' sizes, so that these three types can be distinguished.
[0053]
By using the identification method of the present invention, it is possible to early select wheat plants identified as flowering pollenability or closed flower pollination. The present invention also provides a method for early selection of wheat plants identified as such flowering pollenability or closed flower pollination. The present invention also provides a method for producing an artificially modified wheat plant having a flowering pollinating property or a closed flower pollinating character.
[0054]
Here, “early” refers to the state before the heading of the wheat plant, preferably the state immediately after germination.
[0055]
Examples of methods for producing artificially modified wheat plants having flower pollination or closed flower pollination traits include the following methods (a) to (c). There are no particular restrictions.
[0056]
(A) Crossing any flowering pollinating variety to a flowering pollinating variety, and repeatedly mating the flowering pollinating variety to the progeny of the cross (hybrid), and the wheat having flowering pollination in each generation according to the method of the present invention Select plant species. Alternatively, any flower-pollinating variety is crossed to the flower-pollinating variety, and the flower-pollinating variety is crossed repeatedly to the progeny of the cross (hybrid), and each generation has the flower-pollinating property by the method of the present invention. Select wheat plants.
[0057]
(B) The pollinating property is modified by introducing a gene of a cultivar having a dominant gene as a gene that controls pollination into a cultivar having a recessive gene.
[0058]
(C) The pollenability is modified by introducing a gene of a cultivar having a recessive gene as a gene that controls pollination into a cultivar having a dominant gene using a method such as homologous recombination.
[0059]
Those skilled in the art can introduce DNA into plant cells by known methods such as the Agrobacterium method, electroporation method (electroporation method), and particle gun method.
[0060]
In addition, a wheat plant having a flowering or flower-pollinating character produced by the method for producing an artificially modified wheat plant having a flower-pollinating or flower-pollinating character of the present invention is also present. Included in the invention.
[0061]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not restrict | limited to these Examples.
[0062]
[Example 1] Preparation of pollinating linkage map and acquisition of molecular marker by Kanto Middle School Goal / Azumamugi recombinant progeny fixed line
Ten individual recombinant progeny fixed lines (generation F9; 99 lines) prepared from Kanto Meisho Goal / Azumamugi are cultivated in the field, and the degree of pollination fixation in each line, pollination in the field, form of scale cover, 2 Therefore, the response to 4-D was investigated.
[0063]
There was no separation of pollinability within each line, and each line was considered to be genetically fixed with respect to pollination. As for pollination in the field, it was difficult to judge in the late heading line and the dense ear line, which was reported by the present inventors. The pollination was determined by the method (Honda and Makino, Breeding Studies, 3 (Attachment 2), p186, 2001). That is, the scale form of each line was investigated and classified into a line with a small scale and a line with a large scale. Next, when the spikes before flowering of these lines were cut out and treated with 30 ppm 2,4-D aqueous solution, it was found that flowering was maintained in all lines with large scale coats. On the other hand, this phenomenon was not found in all strains with small scales. That is, a small scale cover was determined to be a closed pollination line, and a large scale cover was determined to be a flowering pollination line.
[0064]
On the other hand, genomic DNAs prepared from 16 strains of these materials by the CTAB method were put together by combining those with the same pollinating property. After cleaving these DNAs with EcoRI / MseI, the AFLP method was used to amplify them using various primer sets, and polymorphisms were searched, and 6 markers indicating polymorphisms were found. The linkage relationship between these markers and the above pollinating property was analyzed, and a linkage map (FIG. 1) was obtained.
[0065]
In addition, the determined pollinating traits of these lines were combined with the known molecular marker information of these lines, the linkage relationship was analyzed, and the results are shown in FIG.
[0066]
[Example 2] Mapping of pollinating genes by lines in which the flowering pollinating ability of flowering pollinating barley cultivar "Satsuki Nijo" was introduced into the flowering pollinating barley cultivar "Misato Golden"
30 near-isogenic lines (B5F3 generation) 30 lines (40 lines per line) and Misato golden and Satsuki Nijo crossing 150 lines of F2 generation were cultivated in the field.
[0067]
The pollination was investigated in the field during the flowering period. For the B5F3 strain, pollen segregation within each strain as well as pollinability of each individual was investigated, and the homo / heterogeneity of the strain was determined. For each individual F2, the pollinating ability of each individual was determined.
[0068]
Fresh leaves were collected from individuals randomly selected from 13 homozygous lines of B5F3 that did not segregate, and F2 generation 150 lines, and used as samples for DNA extraction. Genomic DNA was prepared from these samples by the CTAB method and used for subsequent experiments.
[0069]
The DNAs obtained from B5F3 individuals were combined for each pollinating group to form a group. After cleaving these DNAs with EcoRI / MseI, the AFLP method was used to amplify them using various primer sets, and polymorphisms were searched to obtain 4 markers indicating polymorphisms. In addition, an attempt was made to abstract the polymorphic marker found in Example 1, and it was found that one marker showed polymorphism. The linkage relationship between these markers and pollinating properties was examined and shown in FIG.
[0070]
【The invention's effect】
By using the DNA marker linked to the flower closing / flowering pollination of the wheat of the present invention, all organs of the test plant such as a young plant can be observed without observing the ear of the pollination of the test wheat plant. It can be accurately determined using DNA extracted from. Thereby, since the determination regarding pollination is possible even if it uses the individual | organism | solid at the early stage of breeding, the efficiency in the breeding which introduces flowering / closed flower pollination is improved dramatically.
[0071]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing molecular markers linked to a gene (Cleistogamy) that controls pollination.
FIG. 2 is a diagram showing an example of a base sequence of a molecular marker “e11m19-3” in a barley variety “Misato Golden”. A wavy line part shows the base sequence of the PCR primer which can be used for the identification method of this invention. In the barley variety “Satsuki Nijo”, the base “C” surrounded by a square in the figure is “T”, which constitutes a recognition site for the restriction enzyme MseI.

Claims

Characterized by using the molecular markers e11m19-3 for gene linkage governing the pollinating a method of identifying a flowering pollinating or cleistogamous barley plant, wherein the molecular marker is flowering pollinating or closed A method for determining that a progeny plant to be tested is flower-pollinating or flower-pollinating, respectively, when the same type as a barley parent plant having flower pollination is exhibited.

Comprising the steps described in the following (a) ~ (d), Method according to claim 1.
(A) a step of preparing a DNA sample from a barley plant (b) a step of cleaving the prepared DNA sample with a restriction enzyme (c) a step of separating a DNA fragment according to its size (d) a detected DNA fragment Comparing the size with the control

Comprising the steps described in the following (a) ~ (d), Method according to claim 1.
(A) a step of preparing a DNA sample from a barley plant (b) a step of performing a PCR reaction using the prepared DNA sample as a template and using a primer DNA (c) separating the amplified DNA fragment according to its size Step (d) comparing the size of the detected DNA fragment with the control

Comprising the steps described in the following (a) ~ (e), The method of claim 1.
(A) a step of preparing a DNA sample from a barley plant (b) a step of treating the prepared DNA sample with a restriction enzyme (c) a step of performing an AFLP reaction using the treated DNA sample as a template (d) an amplified DNA fragment (E) a step of comparing the detected DNA pattern with a control

Production of an artificially modified barley plant having a flowering pollinating trait comprising the step of early selection of a barley plant identified as flowering pollinating by the method according to any one of claims 1 to 4. Method.

An artificially modified barley plant having a flower-pollinating trait comprising the step of early selection of a barley plant identified as flower-pollinating by the method according to any one of claims 1 to 4. Manufacturing method.