JP3939592B2 - Method for producing oligosaccharide (salt) - Google Patents

Description

【０００５】
また、上記ヒアルロン酸を分解して得られるオリゴヒアルロン酸、例えばヒアルロン酸４糖などは、アポトーシス抑制剤として有効であること、その誘導体が抗血液凝固活性を示すことなどが分かっている。そのため、ヒアルロン酸４糖などのオリゴヒアルロン酸は、生理活性を示す物質として注目されている。
【０００６】
また、上記オリゴヒアルロン酸の製造に応用可能な方法としては、例えば、特開昭６３−５７６０２号公報（公開日：１９８８年３月１２日）、特開平２−２４５１９３号公報（公開日：１９９０年９月２８日）、および特開平１１−１２４４０１号公報（公開日：１９９９年５月１１日）に開示の方法がある。
【０００７】
特開昭６３−５７６０２号公報に開示の方法は、ヒアルロン酸含有原料をアルカリで処理して、さらに酸で処理をすることによって、低分子ヒアルロン酸を製造する方法である。また、特開平２−２４５１９３号公報に開示の方法は、発酵法によって得られたヒアルロン酸を塩素系の酸化剤で処理することにより、低重合のヒアルロン酸塩を得る方法である。また、特開平１１−１２４４０１号公報に開示の方法は、ヒアルロン酸を分解酵素で分解した後に、限外ろ過膜を用いてオリゴヒアルロン酸を得る方法である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、特開昭６３−５７６０２号公報の方法により平均分子量が１万未満のオリゴヒアルロン酸を製造するためには、その公報に記載の通り、酸処理におけるｐＨを２．８よりも小さくするなどの、極端に酸性の強い条件としなければならない。また、そのような極端に酸性の強い条件によって平均分子量１万未満のオリゴヒアルロン酸を製造する上記方法では、上記オリゴヒアルロン酸の収率が低下するという問題点がある。さらに、上記のような、極端に酸性の強い条件による上記方法では、オリゴヒアルロン酸の変色が発生するという問題点もある。
【０００９】
また、特開平２−２４５１９３号公報に開示の方法のように、ヒアルロン酸を次亜塩素酸などの塩素系の酸化剤で処理する方法では、ヒアルロン酸を酸化により分解する。そのため、酵素などによる加水分解では生成することがないオリゴヒアルロン酸が、酸化剤で処理する上記方法によって生成されるという問題点がある。つまり、酸化剤によって、オリゴヒアルロン酸の化学構造が変化するという問題点がある。具体的に言うと、酸化剤で処理する上記方法では、還元性末端および非還元末端に、新たな化学構造の末端を有するオリゴヒアルロン酸が生成される。このような新たな化学構造の末端を有するオリゴヒアルロン酸は、医薬品、化粧品、および食料品にオリゴヒアルロン酸を使用する場合に問題となる。
【００１０】
また、特開平１１−１２４４０１号公報に開示の方法では、分解酵素として、エンド型グルコシダーゼを用いる。このようなエンド型グルコシダーゼを用いた分解反応では、その分解反応と併行して糖転位反応を伴うことが知られている。
【００１１】
上記糖転位反応について、具体的に説明する。例えば、エンド型グルコシダーゼであるヒアルロニダーゼでヒアルロン酸を分解すると、オリゴヒアルロン酸が生成する。また、分解が進むにつれて、ヒアルロン酸は減少し、オリゴヒアルロン酸は増加する。しかし、分解が進みオリゴヒアルロン酸の量が多くなると、これまでは分解することに働いていた酵素が、分解と逆の反応を引き起こすという問題点がある。その逆の反応とは、オリゴヒアルロン酸からヒアルロン酸を合成する反応のことである。さらに、その逆の反応により、オリゴヒアルロン酸が減少するという問題点がある。
【００１２】
酸・アルカリを用いる方法、および酸化剤を用いる方法では、分解反応は、分解する方向にしか反応は進まない。しかし、上記のように酵素を用いた方法では、分解する方向の他に、その分解とは逆の方向、つまり合成する方向にも反応が進む。つまり、酵素を用いた方法では、分解反応の制御が難しく、効率よくオリゴヒアルロン酸を得ることができないという問題点がある。特に、文献（Kinoshita M et al., Electrophoresis(2001),22,p3458-3465、およびTakagaki K et al., Biochem.(1994),33,p6503-6507）によると、上記のような逆の反応は、工業的にオリゴヒアルロン酸を調製するために、高濃度のヒアルロン酸および大量の酵素を用いるときに、より顕著に観察される。
【００１３】
上記のような逆の反応は、反応基質であるヒアルロン酸の濃度をできるだけ低く、例えば１％またはそれ以下とすることによって、ある程度防ぐことができる。しかし、そのように逆反応を防いでオリゴヒアルロン酸を製造する方法は、オリゴヒアルロン酸を得るときに、反応液を大量に濃縮する工程が必要となる。そのため、オリゴヒアルロン酸を工業的に製造する方法として実用的であるとは言えない（Kakehi, J.Chromatogr.(1994),630,p141）。
【００１４】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、オリゴ糖またはオリゴ糖塩の変色と、酸化による化学構造の変化とを発生させずに、酵素による分解とは逆の反応を抑制して、収率の高いオリゴ糖（塩）の製造方法を提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題点を解決するために、鋭意検討した。その結果、一定の分子量で分子を分別する膜を有する仕切りで仕切られた空間内で、酵素によるムコ多糖（塩）の分解反応を行うことにより、一定の分子量以下となったオリゴ糖（塩）は、上記の膜から仕切りの外に出ると考えた。そして、仕切りの外に出た一定の分子量以下のオリゴ糖（塩）を、分解と逆の反応に使用されるのを防ぎ、選択的に分別できることを見出して、本発明を完成するに至った。
【００１６】
本発明のオリゴ糖（塩）の製造方法は、ムコ多糖またはその塩を酵素で分解してオリゴ糖またはその塩を製造するオリゴ糖（塩）の製造方法において、酵素は通過させず、製造するオリゴ糖（塩）を通過させる通過膜を有する仕切りで仕切られた第１空間および第２空間を用意し、上記第１空間内でムコ多糖またはその塩を酵素で分解し、その分解によって生成して通過膜を通って第２空間に移動したオリゴ糖（塩）を回収することを特徴としている。
【００１７】
上記方法によれば、上記仕切りで仕切られた第１空間内で、ムコ多糖またはその塩を酵素で分解する。上記通過膜としては、例えば、分子量で分子を分別する膜が挙げられる。さらに、その分子量で分子を分別する膜としては、例えば、透析膜、限外ろ過膜などが挙げられる。例えば、製造したいオリゴ糖（塩）の分子量が７５０であるとする。そのとき、分子量が７５０以下の分子は通過でき、ムコ多糖（塩）および酵素のような分子量が大きいものは通過できない膜を、上記通過膜として使用することができる。
【００１８】
また、酵素は通過させず、製造するオリゴ糖（塩）を通過させる通過膜を有する仕切りとは、仕切りのうちの少なくとも一部に、通過膜が設けられていればよい。そのとき、通過膜以外の仕切りの部分は、例えば、酵素、ムコ多糖（塩）、およびオリゴ糖（塩）などが通過できないもので構成する。なお、もちろん、上記仕切りは、その仕切りの全部を上記通過膜で構成してもよい。
【００１９】
上記仕切りで仕切られた第１空間でムコ多糖（塩）を酵素で分解すると、分解によって、通過膜を通過できるオリゴ糖（塩）が生成される。その通過膜を通過できるオリゴ糖（塩）は、仕切りにある通過膜から通過して、第２空間に出る。
【００２０】
例えば、ムコ多糖（塩）と、分解酵素と、酵素の反応に適した緩衝液とを、一方を閉じた透析膜の中に投入する。次に、透析膜の残りのもう一方を閉じて、その透析膜を液体の中に入れる。その透析膜を入れる液体としては、例えば、酵素による分解に適した緩衝液などが挙げられる。そのような緩衝液に上記透析膜を入れると、透析膜内（第１空間内）のｐＨが一定に保たれて、透析膜内の酵素による分解が安定化する。そのような環境で透析膜内（第１空間内）のムコ多糖（塩）を分解すると、透析膜を通過可能な分子量となったオリゴ糖（塩）は、透析膜の外、つまり仕切りの外（第２空間）に出る。
【００２１】
上記のように、通過膜（透析膜）を通過して仕切りの外へ出たオリゴ糖（塩）は、仕切りの内側（第１空間）にある酵素から離れる。また、酵素は、仕切りの外（第２空間）へは出られないので、仕切りの外へ出たオリゴ糖（塩）と、酵素とが結合することはない。そのため、第２空間へ出たオリゴ糖（塩）は、酵素の影響を受けない。つまり、仕切りの外へ出たオリゴ糖（塩）は、酵素によって、さらに分解されることも、分解とは逆の反応を受けることもない。このように酵素による分解とは逆の反応を避けることができるため、上記方法によれば、酵素を用いた従来のオリゴ糖（塩）製造方法と比べて、オリゴ糖（塩）の収率は上昇する。また、上記方法によれば、分解反応終了後に、酵素とオリゴ糖（塩）とを分離する必要はない。
【００２２】
また、上記方法によれば、酵素による分解反応を用いるため、酵素がその活性を失わない範囲内でムコ多糖（塩）を分解することができる。つまり、極端にｐＨが低い環境と極端にｐＨが高い環境とを避けて、ムコ多糖（塩）を分解することが可能である。また、酸化剤を使用せずにムコ多糖（塩）を分解することができる。その結果、オリゴ糖またはオリゴ糖塩の変色と、酸化による化学構造の変化とを発生させずに、酵素による分解とは逆の反応を抑制して、収率の高いオリゴ糖（塩）の製造方法を提供することができる。
【００２３】
本発明のオリゴ糖（塩）の製造方法は、上記方法に加えて、上記通過膜が、製造するオリゴ糖（塩）の分子量以下の分子量を持つ物質のみを通過させることを特徴としている。
【００２４】
上記方法によれば、上記通過膜は、製造するオリゴ糖（塩）の分子量以下の分子量を持つ物質のみを通過させる。つまり、製造するオリゴ糖（塩）の分子量よりも大きい分子量を持つ物質、例えばムコ多糖（塩）は、通過膜を通過することができない。
【００２５】
その結果、原料であるムコ多糖（塩）と、そのムコ多糖（塩）を分解することにより生成されるオリゴ糖（塩）との分離工程を省くことができる。さらに、分解の結果得られたオリゴ糖（塩）が通過膜を通過して第２空間に出ると、第１空間内のオリゴ糖（塩）濃度が減少するため、第１空間内における酵素反応の平衡を、分解方向に促進させることができる。
【００２６】
また、本発明のオリゴ糖（塩）の製造方法は、上記方法に加えて、ムコ多糖は、ヒアルロン酸、コンドロイチン４硫酸、コンドロイチン６硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、キチン、およびキトサンからなる群より選ばれる多糖であることを特徴としている。
【００２７】
上記方法によれば、ムコ多糖は上記の群より選ばれる多糖であり、これらムコ多糖には、それぞれ、分解する酵素が存在する。
【００２８】
その結果、上記効果に加えて、ヒアルロン酸、コンドロイチン４硫酸、コンドロイチン６硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、キチン、およびキトサンを酵素で分解することにより得られる、多くの種類のオリゴ糖（塩）を製造することができる。
【００２９】
また、本発明のオリゴ糖（塩）の製造方法は、ムコ多糖にはヒアルロン酸を、酵素にはエンド型ヒアルロニダーゼを用いて、４個以上の糖からなるオリゴヒアルロン酸またはオリゴヒアルロン酸塩を製造することを特徴としている。
【００３０】
上記方法によれば、エンド型ヒアルロニダーゼを用いることによって、オリゴ糖（塩）として、ヘキソサミンを還元末端とする最小単位が４糖のヒアルロン酸（塩）を、高い収率で得ることができる。エンド型ヒアルロニダーゼとしては、例えば、ウシまたはヒツジの睾丸（精巣）由来のヒアルロニダーゼ、放線菌由来のヒアルロニダーゼなどが挙げられる。また、例えば分画分子量が１０００の膜を通過膜として用いると、ヒアルロン酸４糖（塩）を選択的に取得することができる。
【００３１】
その結果、上記効果に加えて、オリゴヒアルロン酸（塩）（ヒアルロン酸のオリゴ糖（塩））、例えばヒアルロン酸４糖（塩）を、選択的にかつ効率よく製造することができる。
【００３２】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について説明する。本実施の形態のオリゴ糖（塩）の製造方法では、ムコ多糖またはその塩を酵素で分解して、オリゴ糖またはそのオリゴ糖の塩を製造する。また、酵素は通過させず、製造するオリゴ糖（塩）を通過させる通過膜を有する仕切りで仕切られた第１空間および第２空間を用意して、上記第１空間内でムコ多糖またはその塩を酵素で分解する。また、その分解によって生成して、通過膜を通って第２空間に移動したオリゴ糖（塩）を回収する。本実施の形態のオリゴ糖（塩）の製造方法では、この回収によりオリゴ糖（塩）を製造する。
【００３３】
すなわち、本実施の形態のオリゴ糖（塩）の製造方法は、まず、通過膜として、例えば、一定の分子量で分子を分別する膜を用いて、その通過膜を含む仕切りで区切られた空間内において、ムコ多糖（塩）を酵素で分解する。そして、その通過膜を通過できる分子量になったオリゴ糖（塩）は、上記空間の外に遊離するので、その空間の外に遊離したオリゴ糖（塩）を回収して、高純度のオリゴ糖（塩）を製造する方法である。特に、本実施の形態のオリゴ糖（塩）の製造方法は、下記に示すように、ムコ多糖のオリゴ糖（オリゴムコ多糖）を製造する方法として有用である。
【００３４】
従来、オリゴムコ多糖を得る方法において、酵素による分解と、その分解とは逆の反応の防止と、一定の分子量のオリゴ糖（塩）の分別とを同時に行う方法は知られていなかった。しかし、本実施の形態の方法は、酵素を用いた分解を第１空間で行い、第１空間で生成したオリゴ糖（塩）を第２空間に出すことによって、酵素による分解と、その分解とは逆の反応の防止と、一定の分子量のオリゴ糖（塩）の分別とを同時に行う方法である。
【００３５】
（１）ムコ多糖（塩）
まず、ムコ多糖（塩）について説明する。ムコ多糖（塩）とは、構成糖として、アミノ基を有する糖であるヘキソサミンを構造中に有する、天然に存在する高分子多糖類である。また、ムコ多糖（塩）としては、例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸類、ヘパリン、ヘパラン硫酸、キチン、およびキトサンなどが挙げられる。
【００３６】
ヒアルロン酸としては、例えば、微生物由来のもの、組織（鶏冠）由来のものが挙げられる。
【００３７】
【化２】

【００３８】
また、ヒアルロン酸は、一般に、式（１）で表される化合物である。なお、式（１）のｎは正の整数を示す。また、ヒアルロン酸には、式（１）に示すように、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）がある。そのため、ヒアルロン酸は、例えばナトリウムなどの金属との塩（ヒアルロン酸塩）として存在することも多い。
【００３９】
また、コンドロイチン硫酸類としては、例えば、コンドロイチン４硫酸、コンドロイチン６硫酸、およびデルマタン硫酸などが挙げられる。また、通常、天然において、上記ムコ多糖は、金属塩という形態で、特にナトリウムおよびカリウムなどのアルカリ金属の塩という形態で存在している。
【００４０】
なお、本実施の形態の製造方法に使用可能なムコ多糖は、酵素で分解することができるムコ多糖である。
【００４１】
（２）オリゴ糖（塩）
オリゴ糖は、通常、単糖が数個数個結合した物質であり、１０数個結合した物質も含む。本実施の形態におけるオリゴ糖（塩）は、ムコ多糖（塩）を酵素で分解して得られたオリゴ糖（塩）である。
【００４２】
例として、ヒアルロン酸のオリゴ糖（オリゴヒアルロン酸）について説明する。ヒアルロン酸を示す式（１）において、ｎが１のときは、ヒアルロン酸を構成する糖が４個つらなったものであり、ヒアルロン酸４糖というオリゴ糖である。同じく、ｎが２のときは、ヒアルロン酸を構成する糖が８個つらなったものであり、ヒアルロン酸８糖というオリゴ糖である。また、それ以外にも、オリゴヒアルロン酸には、それを構成する糖が６個、１０個、あるいは１２個つらなった、ヒアルロン酸６糖、ヒアルロン酸１０糖、ヒアルロン酸１２糖などもある。
【００４３】
（３）ムコ多糖またはその塩を分解する酵素およびその分解の条件
次に、ムコ多糖（塩）を分解する酵素について説明する。上記ムコ多糖を分解する酵素としては、その基質特異性の点から、例えば、ヒアルロニダーゼ類、コンドロイチナーゼ類、ヘパリナーゼ、へパリチナーゼ、キチナーゼ、キトサナーゼなどが挙げられる。
【００４４】
ヒアルロニダーゼ類には、まず、ウシまたはヒツジの睾丸（精巣）由来のものがある。その由来のヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸、コンドロイチン４硫酸、およびコンドロイチン６硫酸を分解することができる。また、ヒアルロニダーゼ類には、放線菌、細菌、およびヒル由来のものがあり、それら由来のヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸を分解する。
【００４５】
また、コンドロイチナーゼ類には、ヒアルロン酸およびコンドロイチン硫酸類を分解するもの（コンドロイチナーゼＡＢＣなど）がある。また、ヘパリナーゼはヘパリンを、へパリチナーゼはヘパラン硫酸を、キチナーゼはキチンを、キトサナーゼはキトサンを分解する。
【００４６】
また、選択する酵素によって分解の様式が異なるため、目的とするオリゴ糖（塩）の製造に合わせて、上記酵素を選択することが好ましい。例えば、ヘキソサミンを還元末端とする最小単位が４糖のオリゴヒアルロン酸を得たいときは、ウシやヒツジの睾丸（精巣）由来のヒアルロニダーゼ、あるいは放線菌由来のヒアルロニダーゼなど、エンド型のヒアルロニダーゼを選択することが好ましい。
【００４７】
次に、酵素による分解の条件について説明する。上記酵素による分解は、例えば、ムコ多糖またはその塩を酵素で分解できる条件、例えば、ムコ多糖またはその塩と酵素とが流動性を有する条件で行う。そのムコ多糖またはその塩と酵素とが流動性を有する条件とは、例えば、液体中において、溶解、懸濁、または乳濁させたムコ多糖またはその塩と、酵素とが存在している条件などである。しかし、酵素による分解の条件を、そのような条件だけにこだわる必要はない。例えば、上記酵素による分解を、不溶性担体に固定した酵素で行ってもよい。
【００４８】
また、液体中において、溶解、懸濁、または乳濁させたムコ多糖またはその塩と、酵素とが存在している条件としては、例えば、水などの液体に溶解、懸濁、または乳濁させたムコ多糖またはその塩と、酵素とが存在していることが挙げられる。もちろん、酵素による分解に適したｐＨの緩衝液を、上記液体として用いてもよい。なお、上記液体は、水などに限定されない。例えば、酵素によるムコ多糖（塩）分解と、製造するオリゴ糖（塩）の通過膜の通過とが可能であれば、上記液体は、水などではなく他の溶媒でもよい。
【００４９】
また、酵素によってムコ多糖（塩）を分解するとき、酵素の至適条件、例えば至適ｐＨおよび至適温度の条件下で分解をするのが一般的である。例えば、分解反応に最適な温度および最適なｐＨという条件が整った緩衝溶液中で、ムコ多糖（塩）を分解する。しかし、上記至適条件の他に、得られるオリゴムコ多糖（塩）の重合度を高くするために、穏やかに酵素による分解反応が進む条件で、ムコ多糖（塩）を分解してもよい。通常は、ｐＨ４〜１０、反応温度４℃〜６０℃の範囲から、反応条件を選択する。
【００５０】
また、酵素による分解に時間を要して微生物などの増殖が予想される場合、上記液体中に、酵素による分解反応に影響しない程度の量の防腐剤を入れても良い。なお、そのような防腐剤としては、例えばメチルパラベンなどが挙げられる。
【００５１】
（４）通過膜および仕切り
次に、酵素は通過させず、製造するオリゴ糖（塩）を通過させる通過膜を有する仕切りについて説明する。
【００５２】
上記通過膜としては、例えば、一定の分子量によって分子を分別する膜などが挙げられる。また、一定の分子量によって分子を分別する膜としては、例えば、透析膜、限外ろ過膜などがある。なお、上記通過膜は、透析膜および限外ろ過膜に限定されるものではない。
【００５３】
また、上記通過膜としては、製造するオリゴ糖（塩）の分子量以下の分子量を持つ物質のみを通過させる膜を使用することが好ましい。そのような膜を使用すると、製造するオリゴ糖（塩）の分子量よりも大きい分子量を持つ物質、例えばムコ多糖（塩）は、通過膜を通過しない。そのため、オリゴ糖（塩）を得るときに、原料であるムコ多糖（塩）と、そのムコ多糖（塩）を分解することにより生成されるオリゴ糖（塩）とを分離する工程を省くことができる。さらに、分解の結果得られたオリゴ糖（塩）が通過膜を通過して第２空間に出ると、第１空間内のオリゴ糖（塩）濃度が減少するため、第１空間内における酵素反応の平衡を、分解方向に促進させることができる。
【００５４】
上記のように、ムコ多糖（塩）および酵素は通過できず、製造するオリゴ糖（塩）は通過できる通過膜を選定するためには、製造するオリゴ糖（塩）の分子量と、ムコ多糖（塩）の分子量と、酵素の分子量とに注意して、上記通過膜を選定する必要がある。
【００５５】
なお、上記通過膜を少なくとも一部に有する仕切りの内側で分解を行うのは、通過膜を通過可能となったオリゴ糖（塩）を、酵素から引き離すためである。そのように酵素からオリゴ糖（塩）を引き離すのは、酵素とオリゴ糖（塩）とが共存すると、分解と逆の反応が生じて、オリゴ糖（塩）の収率が低くからである。さらに、従来の製造方法と同じように酵素を除去する工程があると、製造工程が複雑になるからである。
【００５６】
また、上記のようにオリゴ糖は、通常、単糖が数個結合した物質であるから、官能基の種類と数とで多少変化するものの、オリゴ糖（塩）の分子量は、最大でも２０００程度となる。従って、本実施の形態における通過膜として一定の分子量によって分子を分別する膜を用いる場合であって、製造したいオリゴ糖（塩）の分子量が最大でも２０００であるときは、分画分子量が２０００以下の膜を選択する。
【００５７】
なお、製造したいオリゴ糖（塩）の分子量に合わせて、上記膜の分画分子量は決定すればよい。例えば、１０数個の糖からなるオリゴ糖（塩）の場合、そのオリゴ糖（塩）の分子量は、３０００から３５００程度となる。そのような１０数個の糖からなるオリゴ糖（塩）を製造する場合は、それに応じて、上記膜の分画分子量を、３０００から３５００にする。
【００５８】
なお、上記のように、一定の分子量によって分子を分別する膜を通過膜として用いる場合、ムコ多糖（塩）を分解する酵素は、その通過膜を通過しない分子量を持つ酵素を用いる。
【００５９】
また、通過膜の種類を変更することにより、取得するオリゴ糖の分子量を変化させることができる。例えば、分画分子量が２０００の膜を通過膜として選択した場合と、分画分子量が１０００の膜を通過膜として選択した場合とを比較すると、分画分子量が２０００の膜を選択した方が、分子量の大きいオリゴ糖を取得することができる。
【００６０】
また、本実施の形態における仕切りとは、その仕切りの少なくとも一部に、上記通過膜を有しているものである。そのように仕切りの一部に上記通過膜を有する場合、通過膜以外の部分の仕切りは、液体および液体中の分子を通過させないもので構成する。なお、上記仕切りは、その仕切りの全部を上記通過膜で構成してもよい。
【００６１】
次に、通過膜および仕切りの様式について説明する。仕切りとしては、例えば、その仕切り全体を、通過膜である透析膜で構成することが挙げられる。具体的には、水系の緩衝液にムコ多糖（塩）が溶解もしくは懸濁している液を、片方が閉じられている透析膜（透析チューブ）に投入する。次に、ムコ多糖（塩）を分解する酵素を透析膜に投入して、透析膜の残りの片方を閉じる。次に、その透析膜を、上記と同じ水系の緩衝液に入れて、温度を一定（例えば分解に最適な温度）に保ちながら、ムコ多糖を分解する。つまり、透析膜で閉じられた空間（第１空間）内でムコ多糖を分解する。そして、透析膜の外（第２空間）に出たオリゴ糖（塩）を回収して、オリゴ糖（塩）を製造する。
【００６２】
また、樹脂などでできた管の両側を、透析膜（通過膜）で封をすることによって仕切りを構成してもよい。この場合、まず、管の片側を透析膜（通過膜）で封をする。次に、水系の緩衝液にムコ多糖（塩）が溶解もしくは懸濁している液を、管の中に投入する。次に、ムコ多糖（塩）を分解する酵素を管に入れて、管の残りの側を透析膜（通過膜）で封をする。この場合、管と透析膜とで閉じられた空間が第１空間である。そして、その管に水系の緩衝液を流して、透析膜から第２空間に流出するオリゴ糖（塩）を回収することで、オリゴ糖（塩）を製造する。
【００６３】
（５）オリゴ糖（塩）の取得（回収）方法
次に、通過膜を通過して仕切りの外側に出たオリゴ糖（塩）の取得（回収）方法について説明する。上記のように、通過膜を通過して仕切りの外側に出たオリゴ糖（塩）は、仕切りの外側の液体中に存在する。そのため、その外側の液体から、オリゴ糖（塩）を回収する。例えば、アルコール、アセトンなど有機溶媒を用いた沈殿、凍結乾燥、およびイオン交換樹脂などによる吸着によって、オリゴ糖（塩）の回収が可能である。なお、沈殿させるときに用いる上記アルコールとしては、例えば、エタノール、イソプロパノール（２−プロパノール）などが挙げられる。
【００６４】
なお、アルコールやアセトンなどの有機溶媒を用いて沈殿を生成させて、オリゴ糖（塩）を回収する場合、有機溶媒は、製造するオリゴ糖（塩）に合わせて選択すればよい。例えば、オリゴヒアルロン酸を回収するときは、エタノールを使用することが好ましい。
【００６５】
なお、従来のオリゴ糖（塩）の製造方法においては、ムコ多糖を分解後、目的とするオリゴ糖を、ゲルろ過などのクロマトグラフ法で分別するという方法がなされていた。しかし、クロマトグラフ法は、一般的に操作が煩雑であり収率も悪い。そのため、クロマトグラフ法は、目的とするオリゴ糖を効率よく得る方法とは言えない。本実施の形態の方法においては、クロマトグラフ法のような煩雑な操作は不要であり、オリゴ糖（塩）の収率も良い。
【００６６】
また、従来のオリゴ糖（塩）の製造方法には、クロマトグラフ法を用いない方法として、ヒアルロン酸を酵素で分解してオリゴヒアルロン酸とした後に、分画分子量１万以下の限外ろ過膜を用いて、その膜を通過するオリゴヒアルロン酸を集める方法もある。しかし、その方法では、酵素によって分解と逆の反応（つまり合成反応）が起こるため、分解により生成するオリゴ糖とともに、そのオリゴ糖よりも分子量の大きい糖も生成する。その結果、ヒアルロン酸を酵素で分解した後に限外ろ過膜などでオリゴ糖を集める方法では、製造者の要求に応じた分子量をもつオリゴ糖を、効率よく得ることができない。
【００６７】
また、上記のように、分解の後に限外ろ過を行う場合には、当然、その限外ろ過の工程を１段階加えることとなる。しかし、分解反応後の液を限外ろ過に使用する前に、さらに、限外ろ過におけるろ過速度を上げるための処理が必要となる。ろ過速度を上げるための処理とは、あらかじめ分解反応の液を遠心分離した上清をろ過に用いて、上記ろ過膜の目詰まりなどを防止する処理である。このように、遠心分離して上清を取得する工程が必要なために、ヒアルロン酸を酵素で分解した後に限外ろ過膜を用いる上記従来の方法では、製造工程が煩雑となる。
【００６８】
本実施の形態の製造方法においては、酵素は通過させず製造するオリゴ糖（塩）を通過させる通過膜、例えば、目的とするオリゴ糖の分子量以下の分子量を持つ物質のみ通過できる通過膜を用いる。そのため、従来の方法のような、分解反応後に、所望のオリゴ糖（塩）とそれより分子量の大きいオリゴ糖（塩）とを分離する限外ろ過の工程は不要であり、その限外ろ過の速度を上げるための遠心分離も不要となる。
【００６９】
【実施例】
（実施例１）
オリゴ糖（塩）の製造方法の例として、ムコ多糖にはヒアルロン酸を、酵素にはヒアルロニダーゼを用いて、オリゴヒアルロン酸またはオリゴヒアルロン酸塩、特にヒアルロン酸４糖（塩）を製造する例を示す。
【００７０】
０．０５％のメチルパラベンを含む１０ｍＭの酢酸緩衝液５０ｍｌ（ｐＨ５．３）に、ムコ多糖の塩であるヒアルロン酸ナトリウム（ナカライテクス製、特級、微生物由来）５ｇと、酵素であるエンド型ヒアルロニダーゼ（ヒツジの睾丸由来のヒアルロニダーゼ（Biozyume社））２５００００Ｕ（国立衛生試験所標準ヒアルロニダーゼ換算値）とを加えて、ヒアルロン酸液を調製した。また、そのヒアルロン酸液は、３０℃〜４０℃に温度を保ちながら、７日間撹拌した。
【００７１】
次に、そのヒアルロン酸液に上記ヒアルロニダーゼ１０００００Ｕを追加して、さらに、そのヒアルロン酸液を、分画分子量１０００の透析膜（Spectra/Por ＭＷＣＯ１０００）のチューブに入れて、そのチューブの端を閉じて密封した。次に、その密封した透析膜を上記酢酸緩衝液９００ｍｌに入れて、その緩衝液全体を３０℃〜４０℃に保ちながら、７日間透析した。
【００７２】
次に、上記透析で得た透析液を濃縮した後、その透析液に、１０％になるように酢酸ナトリウムを溶かした。次に、その透析液に、９倍量（Ｖ／Ｖ）のエタノールを加えて、沈殿を析出させた。次に、ろ過によりその沈殿を取得して、取得した沈殿を、２−プロパノールおよびアセトンで洗浄した。洗浄後、五酸化二リンとともにデシケーター中に沈殿を入れて、沈殿を減圧乾燥した。その乾燥後の沈殿（オリゴヒアルロン酸）の重量は、３．９ｇであった。なお、最初に使用したヒアルロン酸ナトリウムは５ｇであり、得られた沈殿（オリゴヒアルロン酸）は３．９ｇであるので、収率は７８％であった。
【００７３】
オリゴヒアルロン酸の分子量は、６糖のとき、約１０００となる。ゆえに、上記で得られた沈殿には、オリゴヒアルロン酸として、４糖を主成分とした６糖以下のオリゴ糖が含まれていることが予想される。
【００７４】
次に、上記で得た沈殿（オリゴヒアルロン酸）を、キャピラリー電気泳動で分析した。なお、このときのキャピラリー電気泳動の条件を、以下に示す。装置は、BeckmanP/ACE5010型を用いた。キャピラリーは、フューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、有効長４０ｃｍ）を用いた。緩衝液は、１００ｍＭのＳＤＳを含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．３）を用いた。なお、ＳＤＳとは、ドデシル硫酸ナトリウム（sodium dodecyl sulfate）のことである。また、印加電圧は２０ｋＶ、分析温度は３０℃とし、検出には２００ｎｍの紫外部吸収を用いた。このキャピラリー電気泳動の結果を、図１に示す。
【００７５】
図１に示すキャピラリー電気泳動の結果、上記に予想した通り、得られた沈殿は、オリゴヒアルロン酸として、ヒアルロン酸４糖を主成分として含んでいることが分かった。また、得られた沈殿には、ヒアルロン酸６糖も含まれており、さらにヒアルロン酸８糖もごく微量含まれていることが分かった。つまり、上記方法により、７８％という高い収率でオリゴヒアルロン酸が得られることが分かった。
【００７６】
また、上記オリゴヒアルロン酸を、さらにエタノールにより沈殿させて精製することにより、簡便にかつ高い収率でヒアルロン酸４糖を得ることができる。
【００７７】
まず、上記オリゴヒアルロン酸３ｇを、１０％酢酸ナトリウム水溶液３０ｍｌに溶解させた。次に、そのオリゴヒアルロン酸が溶解している液にエタノール９０ｍｌを加えて、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）した。次に、遠心分離後の上清を回収して、その回収した上清に２７０ｍｌのエタノールを加え、沈殿を得た。次に、その沈殿をろ過により取得して、取得した沈殿を、２−プロパノールおよびアセトンで洗浄した。洗浄後、五酸化二リンとともにデシケーター中に沈殿を入れて、沈殿を減圧乾燥した。その乾燥後の沈殿（ヒアルロン酸４糖）は、１．２５ｇであった。
【００７８】
なお、オリゴヒアルロン酸３ｇから１．２５ｇの沈殿（ヒアルロン酸４糖）を得たので、オリゴヒアルロン酸から計算した収率は、約４０％（４１．６７％）である。
【００７９】
さらに、上記の沈殿（ヒアルロン酸４糖）をキャピラリー電気泳動で分析した。結果を図２に示す。なお、キャピラリー電気泳動の分析条件は、上記と同じ条件とした。図２に示すデータにより、上記操作で精製した沈殿は、９７％以上の純度のヒアルロン酸４糖であることが分かった。
【００８０】
（実施例２）
実施例１よりも分画分子量が大きい透析膜を用いた、オリゴ糖（塩）の製造方法の例を示す。酢酸緩衝液５ｍｌ（ｐＨ５．３）に、ヒアルロン酸ナトリウム５ｇと、ヒアルロニダーゼ２５００００Ｕとを加えて、ヒアルロン酸液を調製した。次に、そのヒアルロン酸液を、分画分子量２０００の透析膜（Spectra/Por ＭＷＣＯ２０００）のチューブに入れ、両端を密封した。次に、その密封した透析膜のチューブを酢酸緩衝液３００ｍｌに入れて、その緩衝液全体を３０℃〜４０℃に保ちながら、２日間透析した。なお、酢酸緩衝液、ヒアルロン酸ナトリウム、およびヒアルロニダーゼは、実施例１と同じものを使用した。
【００８１】
次に、上記透析で得た透析液を濃縮した後、その透析液に、１０％になるように酢酸ナトリウムを溶かした。次に、その透析液に、９倍量（Ｖ／Ｖ）のエタノールを加えて、沈殿を析出させた。次に、ろ過によりその沈殿を取得して、取得した沈殿を、２−プロパノールおよびアセトンで洗浄した。洗浄後、五酸化二リンとともにデシケーター中に沈殿を入れて、沈殿を減圧乾燥した。
【００８２】
オリゴヒアルロン酸の分子量は、１２糖のとき、約２０００となる。ゆえに、分画分子量２０００の透析膜を用いて取得した上記沈殿は、１２糖以下のオリゴ糖であることが予想される。
【００８３】
次に、上記沈殿を、キャピラリー電気泳動で分析した。その結果を図３に示す。図３に示すように、上記沈殿に含まれている１４糖以上の糖は、ごくわずかの量であることが分かった。また、上記沈殿は、上記の予想通り、１２糖以下の糖を主成分とするオリゴ糖であることが分かった。
【００８４】
また、実施例１と実施例２とを比較すれば分かるように、通過膜、つまり実施例における透析膜の種類を変化させることにより、異なる分子量のオリゴ糖を、選択的に得ることが可能となる。
【００８５】
（実施例３）
ムコ多糖としてコンドロイチン４硫酸を用いた例を示す。酢酸緩衝液（実施例１と同じもの）１５ｍｌに、コンドロイチン４硫酸（和光純薬製（コンドロイチン硫酸Ａ））１．５ｇと、ヒアルロニダーゼ（実施例１と同じもの）５０００Ｕとを溶解させて、溶液を調製した。また、その溶液は、３０℃〜４０℃に温度を保ち、３日間反応させた。
【００８６】
次に、その溶液に、上記ヒアルロニダーゼ５０００Ｕを追加し、さらに、その溶液液を、分画分子量１０００の透析膜（Spectra/Por ＭＷＣＯ１０００）のチューブに入れて、そのチューブの端を閉じて密封した。次に、その密封した透析膜を上記酢酸緩衝液（１５０ｍｌ）に入れて、その緩衝液全体を室温に保ち、７日間透析した。
【００８７】
次に、上記透析で得た透析液を濃縮した後、その透析液に、１０％になるように酢酸ナトリウムを溶かした。次に、その透析液に、９倍量（Ｖ／Ｖ）のエタノールを加えて、沈殿を析出させた。次に、ろ過によりその沈殿を取得して、取得した沈殿を、２−プロパノールおよびアセトンで洗浄した。洗浄後、五酸化二リンとともにデシケーター中に沈殿を入れて、沈殿（オリゴコンドロイチン硫酸）を減圧乾燥した。
【００８８】
コンドロイチン硫酸は、Ｎ−アセチルＤ−グルコサミンと、Ｄ−グルクロン酸との繰り返し糖単位からなっている。また、コンドロイチン硫酸においては、Ｎ−アセチルＤ−グルコサミンの水酸基の平均約１個が、硫酸エステルとなっている。従って、コンドロイチン硫酸では、おおよそ４糖で分子量が１０００となるため、上記で得た沈殿は、４糖を主成分とするオリゴ糖であると予想される。
【００８９】
次に、上記沈殿を、キャピラリー電気泳動で分析した。その結果を図４に示す。図４に示すように、キャピラリー電気泳動で分析すると、複数のピークが得られ、組成が明確に示されなかった。
【００９０】
上記のように組成が明確とならなかった理由としては、以下のことが考えられる。コンドロイチン硫酸のうち、繰り返し糖単位であるＮ−アセチルＤ−グルコサミンの４位の水酸基が硫酸エステルとなっているものを、コンドロイチン４硫酸と呼んでいる。しかし、そのコンドロイチン４硫酸と称されるものには、同一分子内には硫酸基が全くない糖単位のもの、および、６位に硫酸基がある糖単位のものも含まれている。つまり、コンドロイチン４硫酸と称されるものは、不均一な構造である。そのため、キャピラリー電気泳動で分析すると、複数のピークが得られ、組成が明確に示されなかったと考えられる。
【００９１】
そこで、上記沈殿を、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Matrix assisted laser-desorption ionization time-of-flight mass spectrometry）で分析した。その結果を図５に示す。図５に示すように、５本のピークが顕著である。そのうち、ｍ／ｚ＝９５８、ｍ／ｚ＝９８０、およびｍ／ｚ＝１００２付近のピークは、いずれもコンドロイチン硫酸４糖由来のピークである。また、ｍ／ｚ＝８５６、ｍ／ｚ＝８７９付近のピークは、コンドロイチン４硫酸の硫酸基のないもののピークである。従って、上記沈殿（オリゴコンドロイチン硫酸）の主成分は、上記の予想通り、４糖であることが分かった。
【００９２】
（比較例１）
反応時の基質とするヒアルロン酸濃度、酵素の濃度、反応温度、および反応時間といった各酵素反応の条件は実施例１と同じであるけれども、透析膜を使用しない条件で分解を行い、沈殿（オリゴヒアルロン酸）を得るという操作を行った。さらにその沈殿をキャピラリー電気泳動で調べた。実施例１の結果と、比較例１の結果とを、図６および表１に示す。
【００９３】
なお、比較例１においては、透析膜を使用しないこと以外は実施例１と同じ条件で分解して、その分解後、透析膜を使用せずに、多量のエタノールを用いて沈殿（オリゴヒアルロン酸）を得た。この操作およびこの操作による結果を、比較例１−１と表記する。なお、図６においては、比較例１−１の結果を図６（ｂ）に示す。
【００９４】
また、比較例１においては、透析膜を使用しないこと以外は実施例１と同じ条件で分解して、その分解後に透析膜により透析して沈殿を得るという操作も行った。この操作およびこの操作による結果を、比較例１−２と表記する。なお、図６においては、比較例１−２の結果を図６（ｃ）に示す。
【００９５】
【表１】

【００９６】
実施例１では、表１に示すように、沈殿（オリゴヒアルロン酸）の収量は３．９ｇであった。また、表１と図６（ａ）とに示すように、オリゴヒアルロン酸は、４糖が主成分で、６糖も含み、８糖はごくわずかしか含んでいないものであった。
【００９７】
それに対し、比較例１−１の結果は、表１と図６（ｂ）とに示すように、８糖の割合が多くなっている。また、８糖よりも大きい１０糖、１２糖なども含まれている。さらに、図６（ｂ）の結果によれば、１２糖以上の大きな分子も認められる。また、比較例１−１の結果は、収量が２．５ｇであり、実施例１の収量よりも小さい。ゆえに、比較例１−１のように、透析膜を用いずにオリゴヒアルロン酸を製造すると、収量は小さく、分子量のバラツキは大きいオリゴヒアルロン酸が製造されることが分かる。
【００９８】
また、比較例１−２では、表１に示すように、分解後に透析膜を使用したため、４糖および６糖が大部分のオリゴヒアルロン酸を製造することができる。しかし、表１に示すように、比較例１−２では、収量が１．３ｇであり、実施例１と比べてかなり低い収量となる。
【００９９】
ゆえに、本実施例のように、透析膜などの通過膜を有する仕切りの内側（第１空間）で、ヒアルロン酸などのムコ多糖（塩）を分解して、仕切りの外側（第２空間）に出たオリゴ糖（塩）を回収する方法は、収率が高く、分子量のバラツキも少ないオリゴ糖（塩）を製造する方法と言える。
【０１００】
なお、本発明は、上記実施の形態および実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内で種々の変更が可能である。
【０１０１】
【発明の効果】
本発明のオリゴ糖（塩）の製造方法は、以上のように、酵素は通過させず、製造するオリゴ糖（塩）を通過させる通過膜を有する仕切りで仕切られた第１空間および第２空間を用意し、上記第１空間内でムコ多糖またはその塩を酵素で分解し、その分解によって生成して通過膜を通って第２空間に移動したオリゴ糖（塩）を回収するという方法である。
【０１０２】
それゆえ、オリゴ糖またはオリゴ糖塩の変色と、酸化による化学構造の変化とを発生させずに、分解とは逆の反応を抑制して、収率の高いオリゴ糖（塩）の製造方法を提供することができるという効果を奏する。
【０１０３】
また、本発明のオリゴ糖（塩）の製造方法は、上記方法に加えて、上記通過膜が、製造するオリゴ糖（塩）の分子量以下の分子量を持つ物質のみを通過させるという方法である。
【０１０４】
それゆえ、原料であるムコ多糖（塩）と、そのムコ多糖（塩）を分解することにより生成されるオリゴ糖（塩）との分離工程を省くことができるという効果を奏する。さらに、第１空間内における酵素反応の平衡を、分解方向に促進させるという効果を奏する。
【０１０５】
また、本発明のオリゴ糖（塩）の製造方法は、上記方法に加えて、ムコ多糖は、ヒアルロン酸、コンドロイチン４硫酸、コンドロイチン６硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、キチン、およびキトサンからなる群より選ばれる多糖であるという方法である。
【０１０６】
それゆえ、上記効果に加えて、ヒアルロン酸、コンドロイチン４硫酸、コンドロイチン６硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、キチン、およびキトサンを酵素で分解することにより得られる、多くの種類のオリゴ糖（塩）を製造することができるという効果を奏する。
【０１０７】
また、本発明のオリゴ糖（塩）の製造方法は、上記方法に加えて、ムコ多糖にはヒアルロン酸を、酵素にはエンド型ヒアルロニダーゼを用いて、４個以上の糖からなるオリゴヒアルロン酸またはオリゴヒアルロン酸塩を製造するという方法である。
【０１０８】
それゆえ、上記効果に加えて、オリゴヒアルロン酸（塩）（ヒアルロン酸のオリゴ糖（塩））、例えばヒアルロン酸４糖（塩）を、選択的にかつ効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例において、ムコ多糖としてヒアルロン酸を、通過膜として分画分子量１０００の透析膜を使用してオリゴ糖を得て、その得られたオリゴ糖（オリゴヒアルロン酸）を、キャピラリー電気泳動で分析した結果を示すチャートである。
【図２】本発明の実施例において、図１の結果を示したオリゴ糖（オリゴヒアルロン酸）を精製して、その精製したオリゴ糖（オリゴヒアルロン酸）をキャピラリー電気泳動で分析した結果を示すチャートである。
【図３】本発明の実施例において、ムコ多糖としてヒアルロン酸を、通過膜として分画分子量２０００の透析膜を使用してオリゴ糖を得て、その得られたオリゴ糖（オリゴヒアルロン酸）を、キャピラリー電気泳動で分析した結果を示すチャートである。
【図４】本発明の実施例において、ムコ多糖としてコンドロイチン４硫酸を、通過膜として分画分子量１０００の透析膜を使用してオリゴ糖を得て、その得られたオリゴ糖（オリゴコンドロイチン硫酸）を、キャピラリー電気泳動で分析した結果を示すチャートである。
【図５】本発明の実施例において、ムコ多糖としてコンドロイチン４硫酸を、通過膜として分画分子量１０００の透析膜を使用してオリゴ糖を得て、その得られたオリゴ糖（オリゴコンドロイチン硫酸）を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで分析した結果を示すスペクトル図である。
【図６】図６（ａ）は図１と同じ結果を、図６（ｂ）は、比較例１において、ヒアルロン酸の分解後、透析膜を使用せずに、多量のエタノールを用いてオリゴヒアルロン酸を得て、そのオリゴヒアルロン酸をキャピラリー電気泳動で分析した結果を、図６（ｃ）は、比較例１において、ヒアルロン酸の分解後に、透析膜により透析してオリゴヒアルロン酸を得て、そのオリゴヒアルロン酸をキャピラリー電気泳動で分析した結果を示すチャートである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an oligosaccharide (salt) production method for producing an oligosaccharide or an oligosaccharide salt by decomposing at least one of mucopolysaccharide and a salt of the mucopolysaccharide.
[0002]
[Prior art]
Oligosaccharide is a substance made by combining several monosaccharides (ten or more) according to the literature (Dictionary of Molecular Cell Biology 1997, published by Tokyo Chemical Co., Ltd.). Oligosaccharides are highly useful substances that are widely used as raw materials for pharmaceuticals, cosmetics, foods, and the like.
[0003]
Among oligosaccharides, those having high utility include, for example, oligosaccharides of hyaluronic acid (“oligosaccharides of hyaluronic acid” are appropriately referred to as “oligohyaluronic acid”). In addition, hyaluronic acid which is one of mucopolysaccharides is shown in Formula (1).
[0004]
[Chemical 1]

[0005]
Further, it has been known that oligohyaluronic acid obtained by decomposing the above hyaluronic acid, such as hyaluronic acid tetrasaccharide, is effective as an apoptosis inhibitor, and that its derivative exhibits anticoagulant activity. Therefore, oligohyaluronic acid such as hyaluronic acid tetrasaccharide has attracted attention as a substance exhibiting physiological activity.
[0006]
Examples of methods applicable to the production of the above oligohyaluronic acid include, for example, JP-A-63-57602 (publication date: March 12, 1988) and JP-A-2-245193 (publication date: 1990). September 28, 1999) and Japanese Patent Laid-Open No. 11-124401 (publication date: May 11, 1999).
[0007]
The method disclosed in JP-A-63-57602 is a method for producing low molecular weight hyaluronic acid by treating a hyaluronic acid-containing raw material with an alkali and further treating with an acid. In addition, the method disclosed in JP-A-2-245193 is a method for obtaining a low-polymerization hyaluronate by treating hyaluronic acid obtained by a fermentation method with a chlorine-based oxidizing agent. The method disclosed in JP-A-11-124401 is a method for obtaining oligohyaluronic acid using an ultrafiltration membrane after degrading hyaluronic acid with a degrading enzyme.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
However, in order to produce oligohyaluronic acid having an average molecular weight of less than 10,000 by the method of JP-A-63-57602, as described in the publication, the pH in the acid treatment is made smaller than 2.8. The conditions must be extremely acidic. In addition, the above method for producing oligohyaluronic acid having an average molecular weight of less than 10,000 under such extremely acidic conditions has a problem that the yield of the oligohyaluronic acid is reduced. Furthermore, the above-described method under extremely acidic conditions as described above also has a problem that discoloration of oligohyaluronic acid occurs.
[0009]
In the method of treating hyaluronic acid with a chlorine-based oxidizing agent such as hypochlorous acid as in the method disclosed in JP-A-2-245193, hyaluronic acid is decomposed by oxidation. Therefore, there is a problem that oligohyaluronic acid that cannot be produced by hydrolysis with an enzyme or the like is produced by the above-described method of treating with an oxidizing agent. That is, there is a problem that the chemical structure of oligohyaluronic acid changes depending on the oxidizing agent. Specifically, the above-described method of treating with an oxidizing agent produces oligohyaluronic acid having new chemical structure ends at the reducing and non-reducing ends. Oligohyaluronic acid having such a new chemical structure end is a problem when oligohyaluronic acid is used in pharmaceuticals, cosmetics, and foods.
[0010]
In the method disclosed in JP-A-11-124401, endo-type glucosidase is used as a degrading enzyme. It is known that such a decomposition reaction using endo-type glucosidase is accompanied by a sugar rearrangement reaction in parallel with the decomposition reaction.
[0011]
The sugar rearrangement reaction will be specifically described. For example, when hyaluronic acid is decomposed by hyaluronidase which is an endo-type glucosidase, oligohyaluronic acid is generated. As the decomposition proceeds, hyaluronic acid decreases and oligohyaluronic acid increases. However, when the decomposition proceeds and the amount of oligohyaluronic acid increases, there is a problem that the enzyme that has been working for the decomposition causes a reaction opposite to the decomposition. The reverse reaction is a reaction for synthesizing hyaluronic acid from oligohyaluronic acid. Furthermore, there is a problem that oligohyaluronic acid is reduced by the reverse reaction.
[0012]
In the method using an acid / alkali and the method using an oxidizing agent, the decomposition reaction proceeds only in the direction of decomposition. However, in the method using an enzyme as described above, the reaction proceeds in the direction opposite to the decomposition, that is, the direction of synthesis in addition to the direction of decomposition. That is, in the method using an enzyme, there is a problem that it is difficult to control the decomposition reaction and oligohyaluronic acid cannot be obtained efficiently. In particular, according to the literature (Kinoshita M et al., Electrophoresis (2001), 22, p3458-3465, and Takagaki K et al., Biochem. (1994), 33, p6503-6507) Are more prominently observed when high concentrations of hyaluronic acid and large amounts of enzyme are used to industrially prepare oligohyaluronic acid.
[0013]
The reverse reaction as described above can be prevented to some extent by setting the concentration of hyaluronic acid as a reaction substrate as low as possible, for example, 1% or less. However, such a method for producing oligohyaluronic acid while preventing reverse reaction requires a step of concentrating a large amount of the reaction solution when obtaining oligohyaluronic acid. Therefore, it cannot be said that it is practical as a method for industrially producing oligohyaluronic acid (Kakehi, J. Chromatogr. (1994), 630, p141).
[0014]
The present invention has been made in view of the above-described conventional problems, and its purpose is to prevent degradation by an enzyme without causing discoloration of an oligosaccharide or oligosaccharide salt and a change in chemical structure due to oxidation. An object of the present invention is to provide a method for producing an oligosaccharide (salt) with a high yield by suppressing the reverse reaction.
[0015]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have intensively studied to solve the above problems. As a result, oligosaccharides (salts) that have become below a certain molecular weight by decomposing mucopolysaccharides (salts) with enzymes in a space partitioned by a partition having a membrane that separates molecules with a certain molecular weight. Thought to get out of the partition from the above membrane. And it discovered that the oligosaccharide (salt) below a certain molecular weight which went out of the partition was prevented from being used for the reaction opposite to the decomposition and could be selectively separated, and the present invention was completed. .
[0016]
The method for producing an oligosaccharide (salt) according to the present invention is a method for producing an oligosaccharide (salt) in which mucopolysaccharide or a salt thereof is decomposed with an enzyme to produce an oligosaccharide or a salt thereof. A first space and a second space partitioned by a partition having a passage membrane through which an oligosaccharide (salt) passes are prepared, and mucopolysaccharide or a salt thereof is decomposed with an enzyme in the first space, and generated by the decomposition. The oligosaccharide (salt) that has moved to the second space through the passage membrane is recovered.
[0017]
According to the above method, mucopolysaccharide or a salt thereof is decomposed with an enzyme in the first space partitioned by the partition. Examples of the passage membrane include a membrane that separates molecules according to molecular weight. Furthermore, examples of the membrane for fractionating molecules based on the molecular weight include a dialysis membrane and an ultrafiltration membrane. For example, assume that the oligosaccharide (salt) to be produced has a molecular weight of 750. At that time, a membrane that can pass a molecule having a molecular weight of 750 or less and cannot pass a substance having a large molecular weight such as mucopolysaccharide (salt) and an enzyme can be used as the passage membrane.
[0018]
In addition, the partition having a passage membrane that allows the oligosaccharide (salt) to be produced to pass therethrough without passing through the enzyme only needs to be provided with a passage membrane in at least a part of the partition. At that time, the partition part other than the passage membrane is constituted by, for example, an enzyme, a mucopolysaccharide (salt), an oligosaccharide (salt) and the like that cannot pass through. Of course, the partition may be entirely composed of the passage membrane.
[0019]
When the mucopolysaccharide (salt) is decomposed by the enzyme in the first space partitioned by the partition, an oligosaccharide (salt) that can pass through the passage membrane is generated by the decomposition. The oligosaccharide (salt) that can pass through the passage membrane passes through the passage membrane in the partition and exits to the second space.
[0020]
For example, mucopolysaccharide (salt), a degrading enzyme, and a buffer suitable for the reaction of the enzyme are put into a dialysis membrane closed on one side. Next, the other side of the dialysis membrane is closed and the dialysis membrane is placed in the liquid. Examples of the liquid into which the dialysis membrane is placed include a buffer solution suitable for enzymatic degradation. When the dialysis membrane is placed in such a buffer solution, the pH in the dialysis membrane (in the first space) is kept constant, and the degradation by the enzyme in the dialysis membrane is stabilized. When the mucopolysaccharide (salt) in the dialysis membrane (in the first space) is decomposed in such an environment, the oligosaccharide (salt) having a molecular weight that can pass through the dialysis membrane is removed from the dialysis membrane, that is, outside the partition. Go to (second space).
[0021]
As described above, the oligosaccharide (salt) that has passed through the passage membrane (dialysis membrane) and exited from the partition is separated from the enzyme inside the partition (first space). Moreover, since an enzyme cannot go out of a partition (2nd space), the oligosaccharide (salt) which went out of the partition and an enzyme do not couple | bond together. Therefore, the oligosaccharide (salt) that has entered the second space is not affected by the enzyme. That is, the oligosaccharide (salt) that has moved out of the partition is not further decomposed by the enzyme, nor is it subjected to a reaction opposite to the decomposition. Thus, since the reverse reaction to the enzymatic degradation can be avoided, according to the above method, compared to the conventional oligosaccharide (salt) production method using an enzyme, the yield of oligosaccharide (salt) is To rise. Moreover, according to the said method, it is not necessary to isolate | separate an enzyme and oligosaccharide (salt) after completion | finish of a decomposition reaction.
[0022]
Moreover, according to the said method, since the decomposition reaction by an enzyme is used, mucopolysaccharide (salt) can be decomposed | disassembled within the range in which an enzyme does not lose the activity. That is, it is possible to decompose mucopolysaccharide (salt) while avoiding an environment with extremely low pH and an environment with extremely high pH. In addition, mucopolysaccharide (salt) can be decomposed without using an oxidizing agent. As a result, high-yield oligosaccharides (salts) can be produced without causing discoloration of the oligosaccharide or oligosaccharide salt and chemical structure change due to oxidation, while suppressing the reverse reaction to enzymatic degradation. A method can be provided.
[0023]
The method for producing an oligosaccharide (salt) of the present invention is characterized in that, in addition to the above method, the passage membrane allows only a substance having a molecular weight equal to or lower than the molecular weight of the oligosaccharide (salt) to be produced to pass through.
[0024]
According to the said method, the said passage membrane allows only the substance with the molecular weight below the molecular weight of the oligosaccharide (salt) to manufacture to pass. That is, a substance having a molecular weight larger than that of the oligosaccharide (salt) to be produced, such as mucopolysaccharide (salt), cannot pass through the passage membrane.
[0025]
As a result, it is possible to omit the step of separating the mucopolysaccharide (salt) as a raw material from the oligosaccharide (salt) produced by decomposing the mucopolysaccharide (salt). Furthermore, when the oligosaccharide (salt) obtained as a result of the decomposition passes through the passage membrane and exits into the second space, the concentration of the oligosaccharide (salt) in the first space decreases, so that the enzyme reaction in the first space Can be promoted in the direction of decomposition.
[0026]
In the oligosaccharide (salt) production method of the present invention, in addition to the above method, the mucopolysaccharide comprises hyaluronic acid, chondroitin tetrasulfate, chondroitin hexasulfate, dermatan sulfate, heparin, heparan sulfate, chitin, and chitosan. It is a polysaccharide selected from the group.
[0027]
According to the above method, the mucopolysaccharide is a polysaccharide selected from the above group, and each of these mucopolysaccharides has an enzyme that degrades.
[0028]
As a result, in addition to the above effects, many kinds of oligosaccharides (salts) obtained by enzymatic degradation of hyaluronic acid, chondroitin 4 sulfate, chondroitin 6 sulfate, dermatan sulfate, heparin, heparan sulfate, chitin, and chitosan ) Can be manufactured.
[0029]
In addition, the oligosaccharide (salt) production method of the present invention produces oligohyaluronic acid or oligohyaluronate consisting of four or more sugars, using hyaluronic acid as the mucopolysaccharide and endo hyaluronidase as the enzyme. It is characterized by doing.
[0030]
According to the above method, by using endo-type hyaluronidase, as a oligosaccharide (salt), hyaluronic acid (salt) having a minimum unit of tetrasaccharide having hexosamine as a reducing end can be obtained in high yield. Examples of the endo-type hyaluronidase include hyaluronidase derived from bovine or sheep testicles (testis), hyaluronidase derived from actinomycetes, and the like. For example, when a membrane having a molecular weight cut-off of 1000 is used as a passage membrane, hyaluronic acid tetrasaccharide (salt) can be selectively obtained.
[0031]
As a result, in addition to the above effects, oligohyaluronic acid (salt) (oligosaccharide (salt) of hyaluronic acid), for example, hyaluronic acid tetrasaccharide (salt) can be selectively and efficiently produced.
[0032]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
An embodiment of the present invention will be described. In the method for producing an oligosaccharide (salt) of the present embodiment, mucopolysaccharide or a salt thereof is decomposed with an enzyme to produce an oligosaccharide or a salt of the oligosaccharide. In addition, a first space and a second space that are partitioned by a partition having a passage membrane that allows the oligosaccharide (salt) to be produced to pass therethrough are prepared, and the mucopolysaccharide or a salt thereof is prepared in the first space. Is degraded with an enzyme. Moreover, the oligosaccharide (salt) produced by the decomposition and moved to the second space through the passage membrane is recovered. In the method for producing an oligosaccharide (salt) of the present embodiment, the oligosaccharide (salt) is produced by this recovery.
[0033]
That is, in the method for producing an oligosaccharide (salt) according to the present embodiment, first, as a passage membrane, for example, a membrane that separates molecules with a certain molecular weight is used, and in a space partitioned by a partition including the passage membrane. In, mucopolysaccharide (salt) is degraded with an enzyme. And since the oligosaccharide (salt) having a molecular weight that can pass through the passage membrane is released outside the space, the oligosaccharide (salt) released outside the space is recovered to obtain a high-purity oligosaccharide. This is a method for producing (salt). In particular, the oligosaccharide (salt) production method of the present embodiment is useful as a method for producing a mucopolysaccharide oligosaccharide (oligomucopolysaccharide) as described below.
[0034]
Conventionally, in a method for obtaining an oligomucopolysaccharide, there has not been known a method for simultaneously performing degradation by an enzyme, prevention of a reaction opposite to the degradation, and fractionation of an oligosaccharide (salt) having a certain molecular weight. However, in the method of the present embodiment, the enzyme is decomposed in the first space, and the oligosaccharide (salt) generated in the first space is put out in the second space. Is a method of simultaneously performing prevention of the reverse reaction and fractionation of oligosaccharides (salts) of a certain molecular weight.
[0035]
(1) Mucopolysaccharide (salt)
First, mucopolysaccharide (salt) will be described. A mucopolysaccharide (salt) is a naturally occurring polymeric polysaccharide having hexosamine, which is a sugar having an amino group, as a constituent sugar. Examples of the mucopolysaccharide (salt) include hyaluronic acid, chondroitin sulfates, heparin, heparan sulfate, chitin, and chitosan.
[0036]
Examples of hyaluronic acid include those derived from microorganisms and those derived from tissue (chicken crown).
[0037]
[Chemical 2]

[0038]
Hyaluronic acid is generally a compound represented by the formula (1). In addition, n of Formula (1) shows a positive integer. Hyaluronic acid has a carboxyl group (—COOH) as shown in Formula (1). For this reason, hyaluronic acid often exists as a salt (hyaluronic acid salt) with a metal such as sodium.
[0039]
Examples of chondroitin sulfates include chondroitin tetrasulfate, chondroitin 6 sulfate, and dermatan sulfate. In general, the above mucopolysaccharides exist in nature in the form of metal salts, particularly in the form of salts of alkali metals such as sodium and potassium.
[0040]
The mucopolysaccharide that can be used in the production method of the present embodiment is a mucopolysaccharide that can be degraded by an enzyme.
[0041]
(2) Oligosaccharide (salt)
The oligosaccharide is usually a substance in which several monosaccharides are bonded, and includes a substance in which several dozens are bonded. The oligosaccharide (salt) in the present embodiment is an oligosaccharide (salt) obtained by decomposing mucopolysaccharide (salt) with an enzyme.
[0042]
As an example, oligosaccharide of hyaluronic acid (oligohyaluronic acid) will be described. In the formula (1) indicating hyaluronic acid, when n is 1, it is an oligosaccharide called hyaluronic acid tetrasaccharide, which is composed of four sugars constituting hyaluronic acid. Similarly, when n is 2, eight sugars constituting hyaluronic acid are combined, which is an oligosaccharide called hyaluronic acid octasaccharide. In addition, oligohyaluronic acid includes hyaluronic acid hexasaccharide, hyaluronic acid 10 sugar, hyaluronic acid 12 sugar, etc., which are composed of 6, 10 or 12 sugars.
[0043]
(3) Enzymes that degrade mucopolysaccharides or their salts and conditions for their degradation
Next, an enzyme that degrades mucopolysaccharide (salt) will be described. Examples of the enzyme that degrades the mucopolysaccharide include hyaluronidases, chondroitinases, heparinase, heparitinase, chitinase, chitosanase and the like from the standpoint of substrate specificity.
[0044]
Hyaluronidases are first derived from bovine or sheep testicles (testis). The derived hyaluronidase can degrade hyaluronic acid, chondroitin tetrasulfate, and chondroitin 6 sulfate. Hyaluronidases include those derived from actinomycetes, bacteria, and leech, and hyaluronidases derived from them degrade hyaluronic acid.
[0045]
In addition, chondroitinases include those that degrade hyaluronic acid and chondroitin sulfate (such as chondroitinase ABC). Heparinase degrades heparin, heparitinase degrades heparan sulfate, chitinase degrades chitin, and chitosanase degrades chitosan.
[0046]
Moreover, since the mode of decomposition differs depending on the enzyme to be selected, it is preferable to select the enzyme according to the production of the target oligosaccharide (salt). For example, if you want to obtain oligohyaluronic acid with the smallest unit of hexosamine as the reducing end, select an endo-type hyaluronidase, such as a hyaluronidase from bovine or sheep testes (testis), or a hyaluronidase from actinomycetes. It is preferable.
[0047]
Next, conditions for enzymatic degradation will be described. The degradation by the enzyme is performed, for example, under conditions where the mucopolysaccharide or a salt thereof can be degraded by the enzyme, for example, under conditions where the mucopolysaccharide or a salt thereof and the enzyme are fluid. The conditions under which the mucopolysaccharide or salt thereof and the enzyme have fluidity include, for example, conditions in which the mucopolysaccharide or salt thereof dissolved and suspended or emulsified in a liquid and the enzyme are present. It is. However, it is not necessary to stick to such conditions for enzymatic degradation. For example, the enzyme degradation may be performed with an enzyme immobilized on an insoluble carrier.
[0048]
In addition, as conditions for the presence of the mucopolysaccharide or salt thereof dissolved in, suspended in, or emulsified in the liquid and the enzyme, for example, dissolved, suspended, or emulsified in a liquid such as water. The presence of mucopolysaccharide or a salt thereof and an enzyme. Of course, a buffer solution having a pH suitable for enzymatic degradation may be used as the liquid. The liquid is not limited to water. For example, if the mucopolysaccharide (salt) decomposition by the enzyme and the passage of the oligosaccharide (salt) to be produced through the passage membrane are possible, the liquid may be other solvent instead of water.
[0049]
In addition, when decomposing mucopolysaccharide (salt) with an enzyme, it is generally decomposed under the optimum conditions of the enzyme, for example, under the conditions of optimum pH and optimum temperature. For example, the mucopolysaccharide (salt) is decomposed in a buffer solution with the optimal temperature and optimal pH for the decomposition reaction. However, in addition to the optimum conditions described above, the mucopolysaccharide (salt) may be decomposed under conditions where the enzymatic degradation reaction proceeds in order to increase the degree of polymerization of the resulting oligomucopolysaccharide (salt). Usually, the reaction conditions are selected from a pH range of 4 to 10 and a reaction temperature range of 4 ° C to 60 ° C.
[0050]
In addition, when it takes time to decompose by an enzyme and growth of microorganisms or the like is expected, a preservative in an amount that does not affect the enzymatic decomposition reaction may be added to the liquid. Examples of such preservatives include methyl paraben.
[0051]
(4) Passing membrane and partition
Next, a partition having a passage membrane that allows the oligosaccharide (salt) to be produced to pass therethrough without allowing the enzyme to pass through will be described.
[0052]
Examples of the passage membrane include a membrane that separates molecules according to a certain molecular weight. Examples of the membrane for separating molecules according to a certain molecular weight include a dialysis membrane and an ultrafiltration membrane. The passage membrane is not limited to a dialysis membrane and an ultrafiltration membrane.
[0053]
Further, as the passage membrane, it is preferable to use a membrane that allows passage of only a substance having a molecular weight equal to or lower than the molecular weight of the oligosaccharide (salt) to be produced. When such a membrane is used, a substance having a molecular weight larger than the molecular weight of the oligosaccharide (salt) to be produced, for example, mucopolysaccharide (salt) does not pass through the passage membrane. Therefore, when obtaining an oligosaccharide (salt), it is possible to omit the step of separating the raw mucopolysaccharide (salt) from the oligosaccharide (salt) produced by decomposing the mucopolysaccharide (salt). it can. Furthermore, when the oligosaccharide (salt) obtained as a result of the decomposition passes through the passage membrane and exits into the second space, the concentration of the oligosaccharide (salt) in the first space decreases, so that the enzyme reaction in the first space Can be promoted in the direction of decomposition.
[0054]
As described above, the mucopolysaccharide (salt) and the enzyme cannot pass through, and the oligosaccharide (salt) to be produced can be selected to pass through the membrane by selecting the molecular weight of the oligosaccharide (salt) to be produced, the mucopolysaccharide (salt) ( It is necessary to select the passage membrane in consideration of the molecular weight of the salt) and the molecular weight of the enzyme.
[0055]
The reason why the decomposition is performed inside the partition having at least a part of the passage membrane is to separate the oligosaccharide (salt) that can pass through the passage membrane from the enzyme. The reason why the oligosaccharide (salt) is separated from the enzyme is that, when the enzyme and the oligosaccharide (salt) coexist, a reaction opposite to the decomposition occurs and the yield of the oligosaccharide (salt) is low. Furthermore, it is because a manufacturing process will become complicated if there exists a process of removing an enzyme like the conventional manufacturing method.
[0056]
In addition, since oligosaccharides are usually substances in which several monosaccharides are bonded as described above, the molecular weight of oligosaccharides (salts) is at most about 2000, although it varies somewhat depending on the type and number of functional groups. It becomes. Therefore, when a membrane for separating molecules according to a certain molecular weight is used as the passage membrane in the present embodiment, and the molecular weight of the oligosaccharide (salt) to be produced is 2000 at the maximum, the fractional molecular weight is 2000 or less. Select the membrane.
[0057]
The fractional molecular weight of the membrane may be determined according to the molecular weight of the oligosaccharide (salt) to be produced. For example, in the case of an oligosaccharide (salt) composed of more than 10 sugars, the molecular weight of the oligosaccharide (salt) is about 3000 to 3500. When producing such an oligosaccharide (salt) consisting of a dozen sugars, the molecular weight cut-off of the membrane is changed from 3000 to 3500 accordingly.
[0058]
As described above, when a membrane that separates molecules according to a certain molecular weight is used as a passage membrane, an enzyme having a molecular weight that does not pass through the passage membrane is used as an enzyme that decomposes mucopolysaccharide (salt).
[0059]
Moreover, the molecular weight of the oligosaccharide acquired can be changed by changing the kind of passage membrane. For example, comparing a case where a membrane having a molecular weight cut off of 2000 is selected as a passage membrane and a case where a membrane having a molecular weight cut off of 1000 is selected as a passage membrane, the membrane having a molecular weight cut off of 2000 is selected. An oligosaccharide having a large molecular weight can be obtained.
[0060]
Moreover, the partition in this Embodiment has the said passage film in at least one part of the partition. Thus, when it has the said passage film in a part of partition, the partition of parts other than a passage film is comprised with what does not let the molecule | numerator in a liquid and a liquid pass. In addition, you may comprise the said partition for all of the partition with the said passage film.
[0061]
Next, the mode of the passage membrane and the partition will be described. As the partition, for example, the entire partition may be composed of a dialysis membrane that is a passage membrane. Specifically, a solution in which mucopolysaccharide (salt) is dissolved or suspended in an aqueous buffer solution is poured into a dialysis membrane (dialysis tube) that is closed on one side. Next, an enzyme for decomposing mucopolysaccharide (salt) is introduced into the dialysis membrane, and the remaining one of the dialysis membrane is closed. Next, the dialysis membrane is placed in the same aqueous buffer as described above, and the mucopolysaccharide is decomposed while keeping the temperature constant (for example, the optimum temperature for decomposition). That is, mucopolysaccharide is decomposed in a space (first space) closed with a dialysis membrane. And the oligosaccharide (salt) which came out of the dialysis membrane (2nd space) is collect | recovered, and an oligosaccharide (salt) is manufactured.
[0062]
Moreover, you may comprise a partition by sealing the both sides of the pipe | tubes made from resin etc. with a dialysis membrane (passage membrane). In this case, first, one side of the tube is sealed with a dialysis membrane (passage membrane). Next, a solution in which mucopolysaccharide (salt) is dissolved or suspended in an aqueous buffer solution is poured into the tube. Next, an enzyme that decomposes mucopolysaccharide (salt) is put into the tube, and the remaining side of the tube is sealed with a dialysis membrane (passage membrane). In this case, the space closed by the tube and the dialysis membrane is the first space. Then, an oligosaccharide (salt) is produced by flowing an aqueous buffer through the tube and collecting the oligosaccharide (salt) flowing out from the dialysis membrane into the second space.
[0063]
(5) Method for obtaining (collecting) oligosaccharide (salt)
Next, a method for obtaining (recovering) the oligosaccharide (salt) that has passed through the passage membrane and exited the partition will be described. As described above, the oligosaccharide (salt) that has passed through the passage membrane and exited outside the partition is present in the liquid outside the partition. Therefore, oligosaccharide (salt) is collect | recovered from the liquid of the outer side. For example, the oligosaccharide (salt) can be recovered by precipitation using an organic solvent such as alcohol or acetone, lyophilization, and adsorption using an ion exchange resin. In addition, as said alcohol used when making it precipitate, ethanol, isopropanol (2-propanol), etc. are mentioned, for example.
[0064]
In addition, what is necessary is just to select an organic solvent according to the oligosaccharide (salt) to manufacture, when producing | generating precipitation using organic solvents, such as alcohol and acetone, and collect | recovering oligosaccharides (salt). For example, when recovering oligohyaluronic acid, it is preferable to use ethanol.
[0065]
In the conventional oligosaccharide (salt) production method, after decomposing mucopolysaccharide, the target oligosaccharide is separated by a chromatographic method such as gel filtration. However, the chromatographic method is generally complicated in operation and yield is poor. Therefore, the chromatographic method cannot be said to be a method for efficiently obtaining the target oligosaccharide. In the method of the present embodiment, a complicated operation such as a chromatographic method is unnecessary, and the yield of oligosaccharide (salt) is good.
[0066]
Further, as a conventional method for producing an oligosaccharide (salt), an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut-off of 10,000 or less after hydrolyzing hyaluronic acid with an enzyme to obtain oligohyaluronic acid is a method that does not use a chromatographic method. There is also a method of collecting oligohyaluronic acid passing through the membrane using However, in this method, a reverse reaction (that is, a synthesis reaction) is caused by the enzyme, so that a saccharide having a molecular weight larger than that of the oligosaccharide is produced together with the oligosaccharide produced by the decomposition. As a result, the method of collecting oligosaccharides with an ultrafiltration membrane after degrading hyaluronic acid with an enzyme cannot efficiently obtain oligosaccharides having a molecular weight according to the requirements of the manufacturer.
[0067]
Further, as described above, when ultrafiltration is performed after decomposition, naturally, the ultrafiltration process is added in one step. However, before the solution after the decomposition reaction is used for ultrafiltration, a treatment for increasing the filtration rate in ultrafiltration is required. The process for increasing the filtration rate is a process for preventing clogging of the filtration membrane by using the supernatant obtained by centrifuging the decomposition reaction solution for filtration. Thus, since the process of centrifuging and acquiring a supernatant is required, in the said conventional method using an ultrafiltration membrane after decomposing | disassembling hyaluronic acid with an enzyme, a manufacturing process becomes complicated.
[0068]
In the production method of the present embodiment, a passage membrane through which an oligosaccharide (salt) to be produced is allowed to pass without passing through an enzyme, for example, a passage membrane that can pass only a substance having a molecular weight equal to or lower than the molecular weight of the target oligosaccharide is used. . Therefore, the ultrafiltration step of separating the desired oligosaccharide (salt) and the oligosaccharide (salt) having a higher molecular weight after the decomposition reaction as in the conventional method is unnecessary. Centrifugation to increase speed is also unnecessary.
[0069]
【Example】
Example 1
As an example of a method for producing an oligosaccharide (salt), an example of producing oligohyaluronic acid or oligohyaluronate, particularly hyaluronic acid tetrasaccharide (salt) using hyaluronic acid for mucopolysaccharide and hyaluronidase for enzyme Show.
[0070]
To 50 ml of 10 mM acetate buffer (pH 5.3) containing 0.05% methylparaben, 5 g of sodium hyaluronate (manufactured by Nacalai Tex, special grade, derived from microorganisms), a salt of mucopolysaccharide, and endo-type hyaluronidase (enzyme) A hyaluronic acid solution was prepared by adding 250,000 U (national hygiene laboratory standard hyaluronidase equivalent value) of hyaluronidase (Biozyume) derived from sheep testicles. The hyaluronic acid solution was stirred for 7 days while maintaining the temperature at 30 ° C to 40 ° C.
[0071]
Next, 100000 U of the hyaluronidase was added to the hyaluronic acid solution, and the hyaluronic acid solution was put into a dialysis membrane (Spectra / Por MWCO1000) having a molecular weight cut off of 1000, and the end of the tube was closed. Sealed. Next, the sealed dialysis membrane was put into 900 ml of the above acetate buffer, and dialyzed for 7 days while keeping the entire buffer at 30 ° C. to 40 ° C.
[0072]
Next, after concentrating the dialysate obtained by the above dialysis, sodium acetate was dissolved in the dialysate so as to be 10%. Next, 9 times the amount of ethanol (V / V) was added to the dialysate to precipitate a precipitate. Next, the precipitate was obtained by filtration, and the obtained precipitate was washed with 2-propanol and acetone. After washing, the precipitate was put in a desiccator together with diphosphorus pentoxide, and the precipitate was dried under reduced pressure. The weight of the precipitate (oligohyaluronic acid) after drying was 3.9 g. In addition, since the sodium hyaluronate used initially was 5 g and the obtained precipitate (oligohyaluronic acid) was 3.9 g, the yield was 78%.
[0073]
The molecular weight of oligohyaluronic acid is about 1000 when it is hexasaccharide. Therefore, it is expected that the precipitate obtained above contains oligosaccharide having 6 or less saccharides composed mainly of tetrasaccharides as oligohyaluronic acid.
[0074]
Next, the precipitate (oligohyaluronic acid) obtained above was analyzed by capillary electrophoresis. The conditions for capillary electrophoresis at this time are shown below. The apparatus used was a BeckmanP / ACE5010 type. As the capillary, a fused silica capillary (inner diameter 50 μm, effective length 40 cm) was used. As the buffer, 50 mM borate buffer (pH 9.3) containing 100 mM SDS was used. In addition, SDS is sodium dodecyl sulfate (sodium dodecyl sulfate). The applied voltage was 20 kV, the analysis temperature was 30 ° C., and 200 nm ultraviolet absorption was used for detection. The result of this capillary electrophoresis is shown in FIG.
[0075]
As a result of capillary electrophoresis shown in FIG. 1, it was found that the obtained precipitate contained, as the main component, hyaluronic acid tetrasaccharide as oligohyaluronic acid, as expected above. Further, it was found that the obtained precipitate contained hyaluronic acid hexasaccharide, and further contained a very small amount of hyaluronic acid octasaccharide. That is, it was found that oligohyaluronic acid was obtained by the above method with a high yield of 78%.
[0076]
Further, by purifying the oligohyaluronic acid by further precipitation with ethanol, a hyaluronic acid tetrasaccharide can be obtained easily and with a high yield.
[0077]
First, 3 g of the oligohyaluronic acid was dissolved in 30 ml of a 10% aqueous sodium acetate solution. Next, 90 ml of ethanol was added to the solution in which the oligohyaluronic acid was dissolved, followed by centrifugation (3000 rpm, 10 minutes). Next, the supernatant after centrifugation was collected, and 270 ml of ethanol was added to the collected supernatant to obtain a precipitate. Next, the precipitate was obtained by filtration, and the obtained precipitate was washed with 2-propanol and acetone. After washing, the precipitate was put in a desiccator together with diphosphorus pentoxide, and the precipitate was dried under reduced pressure. The dried precipitate (hyaluronic acid tetrasaccharide) was 1.25 g.
[0078]
Since 1.25 g of precipitate (hyaluronic acid tetrasaccharide) was obtained from 3 g of oligohyaluronic acid, the yield calculated from oligohyaluronic acid was about 40% (41.67%).
[0079]
Further, the above precipitate (hyaluronic acid tetrasaccharide) was analyzed by capillary electrophoresis. The results are shown in FIG. The analysis conditions for capillary electrophoresis were the same as described above. From the data shown in FIG. 2, it was found that the precipitate purified by the above operation was hyaluronic acid tetrasaccharide having a purity of 97% or more.
[0080]
(Example 2)
The example of the manufacturing method of an oligosaccharide (salt) using the dialysis membrane whose fraction molecular weight is larger than Example 1 is shown. A hyaluronic acid solution was prepared by adding 5 g of sodium hyaluronate and 250000 U of hyaluronidase to 5 ml of acetate buffer (pH 5.3). Next, the hyaluronic acid solution was put in a tube of a dialysis membrane (Spectra / Por MWCO2000) having a molecular weight cut-off of 2000, and both ends were sealed. The sealed dialysis membrane tube was then placed in 300 ml of acetate buffer and dialyzed for 2 days while keeping the entire buffer at 30 ° C to 40 ° C. The same acetate buffer, sodium hyaluronate, and hyaluronidase as in Example 1 were used.
[0081]
Next, after concentrating the dialysate obtained by the above dialysis, sodium acetate was dissolved in the dialysate so as to be 10%. Next, 9 times the amount of ethanol (V / V) was added to the dialysate to precipitate a precipitate. Next, the precipitate was obtained by filtration, and the obtained precipitate was washed with 2-propanol and acetone. After washing, the precipitate was put in a desiccator together with diphosphorus pentoxide, and the precipitate was dried under reduced pressure.
[0082]
The molecular weight of oligohyaluronic acid is about 2000 for 12 sugars. Therefore, it is expected that the precipitate obtained using a dialysis membrane having a molecular weight cut off of 2000 is an oligosaccharide having 12 sugars or less.
[0083]
Next, the precipitate was analyzed by capillary electrophoresis. The result is shown in FIG. As shown in FIG. 3, it was found that the amount of 14 or more sugars contained in the precipitate was very small. Moreover, it turned out that the said precipitation is an oligosaccharide which has 12 or less saccharides as a main component as said expectation.
[0084]
Further, as can be seen by comparing Example 1 and Example 2, it is possible to selectively obtain oligosaccharides having different molecular weights by changing the type of the passage membrane, that is, the dialysis membrane in the Example. Become.
[0085]
(Example 3)
An example using chondroitin tetrasulfate as a mucopolysaccharide is shown. In 15 ml of acetate buffer (the same as in Example 1), 1.5 g of chondroitin tetrasulfate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (chondroitin sulfate A)) and 5000 U of hyaluronidase (same as in Example 1) are dissolved to obtain a solution. Was prepared. Moreover, the solution was made to react for 3 days, keeping temperature at 30 to 40 degreeC.
[0086]
Next, the above-mentioned hyaluronidase 5000U was added to the solution, and the solution was put into a dialysis membrane (Spectra / Por MWCO1000) having a molecular weight cut off of 1000, and the end of the tube was closed and sealed. The sealed dialysis membrane was then placed in the acetate buffer (150 ml) and the entire buffer was kept at room temperature and dialyzed for 7 days.
[0087]
Next, after concentrating the dialysate obtained by the above dialysis, sodium acetate was dissolved in the dialysate so as to be 10%. Next, 9 times the amount of ethanol (V / V) was added to the dialysate to precipitate a precipitate. Next, the precipitate was obtained by filtration, and the obtained precipitate was washed with 2-propanol and acetone. After washing, a precipitate was placed in a desiccator together with diphosphorus pentoxide, and the precipitate (oligochondroitin sulfate) was dried under reduced pressure.
[0088]
Chondroitin sulfate is composed of repeating sugar units of N-acetyl D-glucosamine and D-glucuronic acid. In chondroitin sulfate, an average of about one hydroxyl group of N-acetyl D-glucosamine is a sulfate ester. Therefore, since chondroitin sulfate has approximately 4 sugars and a molecular weight of 1000, the precipitate obtained above is expected to be an oligosaccharide having tetrasaccharides as a main component.
[0089]
Next, the precipitate was analyzed by capillary electrophoresis. The result is shown in FIG. As shown in FIG. 4, when analyzed by capillary electrophoresis, a plurality of peaks were obtained, and the composition was not clearly shown.
[0090]
The reason why the composition is not clear as described above can be considered as follows. Among chondroitin sulfates, the one in which the hydroxyl group at the 4-position of N-acetyl D-glucosamine, which is a repeating sugar unit, is a sulfate ester is called chondroitin tetrasulfate. However, the so-called chondroitin tetrasulfate includes a sugar unit having no sulfate group in the same molecule and a sugar unit having a sulfate group at the 6-position. That is, what is called chondroitin tetrasulfate has a heterogeneous structure. Therefore, it is considered that when analyzing by capillary electrophoresis, a plurality of peaks were obtained and the composition was not clearly shown.
[0091]
Then, the said precipitation was analyzed by mass spectrometry (MALDI-TOFMS: Matrix assisted laser-desorption ionization time-of-flight mass spectrometry). The result is shown in FIG. As shown in FIG. 5, five peaks are prominent. Among them, the peaks near m / z = 958, m / z = 980, and m / z = 1002 are all peaks derived from chondroitin sulfate tetrasaccharide. Further, the peaks near m / z = 856 and m / z = 879 are those of chondroitin 4 sulfate having no sulfate group. Therefore, it was found that the main component of the precipitate (oligochondroitin sulfate) was tetrasaccharide as expected.
[0092]
(Comparative Example 1)
The conditions of each enzyme reaction, such as the concentration of hyaluronic acid used as a substrate during the reaction, the concentration of the enzyme, the reaction temperature, and the reaction time, are the same as in Example 1, but the decomposition is performed without using a dialysis membrane, and precipitation (oligo Hyaluronic acid) was obtained. Further, the precipitate was examined by capillary electrophoresis. The result of Example 1 and the result of Comparative Example 1 are shown in FIG.
[0093]
In Comparative Example 1, decomposition was performed under the same conditions as in Example 1 except that no dialysis membrane was used. After the decomposition, precipitation was performed using a large amount of ethanol without using a dialysis membrane (oligohyaluronic acid). ) This operation and the result of this operation are denoted as Comparative Example 1-1. In addition, in FIG. 6, the result of the comparative example 1-1 is shown in FIG.6 (b).
[0094]
In Comparative Example 1, an operation was also performed in which decomposition was performed under the same conditions as in Example 1 except that no dialysis membrane was used, and after the decomposition, dialysis was performed using a dialysis membrane to obtain a precipitate. This operation and the result of this operation are denoted as Comparative Example 1-2. In addition, in FIG. 6, the result of the comparative example 1-2 is shown in FIG.6 (c).
[0095]
[Table 1]

[0096]
In Example 1, as shown in Table 1, the yield of the precipitate (oligohyaluronic acid) was 3.9 g. Further, as shown in Table 1 and FIG. 6 (a), oligohyaluronic acid was mainly composed of tetrasaccharides, contained 6 sugars, and contained very few octasaccharides.
[0097]
On the other hand, the result of Comparative Example 1-1 shows that the ratio of octasaccharide is increased as shown in Table 1 and FIG. 6 (b). Also included are 10 sugars, 12 sugars, etc., which are larger than 8 sugars. Furthermore, according to the result of FIG.6 (b), the big molecule | numerator more than 12 sugar is also recognized. Moreover, as for the result of Comparative Example 1-1, the yield is 2.5 g, which is smaller than the yield of Example 1. Therefore, it can be seen that when oligohyaluronic acid is produced without using a dialysis membrane as in Comparative Example 1-1, oligohyaluronic acid with a small yield and large molecular weight variation is produced.
[0098]
Moreover, in Comparative Example 1-2, as shown in Table 1, since a dialysis membrane was used after decomposition, tetrasaccharide and hexasaccharide can produce most oligohyaluronic acid. However, as shown in Table 1, in Comparative Example 1-2, the yield is 1.3 g, which is considerably lower than that in Example 1.
[0099]
Therefore, as in this embodiment, mucopolysaccharides (salts) such as hyaluronic acid are decomposed inside the partition having a passage membrane such as a dialysis membrane (first space), and outside the partition (second space). It can be said that the method for recovering the oligosaccharide (salt) is a method for producing an oligosaccharide (salt) with high yield and low molecular weight variation.
[0100]
In addition, this invention is not limited to the said embodiment and Example, A various change is possible within the scope of the present invention.
[0101]
【The invention's effect】
As described above, the oligosaccharide (salt) production method of the present invention does not allow the enzyme to pass through, and the first space and the second space partitioned by a partition having a passage membrane that allows the oligosaccharide (salt) to be produced to pass through. In which the mucopolysaccharide or a salt thereof is decomposed with an enzyme in the first space, and the oligosaccharide (salt) generated by the decomposition and moved to the second space through the passage membrane is recovered. .
[0102]
Therefore, a method for producing oligosaccharides (salts) with a high yield can be achieved without causing discoloration of oligosaccharides or oligosaccharide salts and changes in chemical structure due to oxidation, while suppressing the reverse reaction to decomposition. There is an effect that it can be provided.
[0103]
The oligosaccharide (salt) production method of the present invention is a method in which, in addition to the above method, only the substance having a molecular weight equal to or lower than the molecular weight of the oligosaccharide (salt) to be produced is passed through the passage membrane.
[0104]
Therefore, there is an effect that it is possible to omit the separation step of the raw material mucopolysaccharide (salt) and the oligosaccharide (salt) produced by decomposing the mucopolysaccharide (salt). Furthermore, the effect of promoting the equilibrium of the enzyme reaction in the first space in the decomposition direction is achieved.
[0105]
In the oligosaccharide (salt) production method of the present invention, in addition to the above method, the mucopolysaccharide comprises hyaluronic acid, chondroitin tetrasulfate, chondroitin hexasulfate, dermatan sulfate, heparin, heparan sulfate, chitin, and chitosan. It is a method of being a polysaccharide selected from the group.
[0106]
Therefore, in addition to the above effects, many kinds of oligosaccharides (salts) obtained by enzymatic degradation of hyaluronic acid, chondroitin 4 sulfate, chondroitin 6 sulfate, dermatan sulfate, heparin, heparan sulfate, chitin, and chitosan ) Can be produced.
[0107]
The oligosaccharide (salt) production method of the present invention, in addition to the above method, uses hyaluronic acid for mucopolysaccharide and endo-type hyaluronidase for enzyme, or oligohyaluronic acid consisting of 4 or more sugars or This is a method of producing oligohyaluronate.
[0108]
Therefore, in addition to the above effects, oligohyaluronic acid (salt) (oligosaccharide (salt) of hyaluronic acid), for example, hyaluronic acid tetrasaccharide (salt) can be selectively and efficiently produced.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows an oligosaccharide obtained by using hyaluronic acid as a mucopolysaccharide and a dialysis membrane having a fractional molecular weight of 1000 as a passage membrane in an example of the present invention, and the resulting oligosaccharide (oligohyaluronic acid) is obtained. It is a chart which shows the result analyzed by capillary electrophoresis.
FIG. 2 shows the results of purifying the oligosaccharide (oligohyaluronic acid) shown in FIG. 1 and analyzing the purified oligosaccharide (oligohyaluronic acid) by capillary electrophoresis in the examples of the present invention. It is a chart.
FIG. 3 shows an example in which hyaluronic acid is used as a mucopolysaccharide and a dialysis membrane having a molecular weight cut off of 2000 is used as a passage membrane to obtain an oligosaccharide, and the resulting oligosaccharide (oligohyaluronic acid) is used. It is a chart which shows the result analyzed by capillary electrophoresis.
FIG. 4 shows an oligosaccharide obtained by using chondroitin tetrasulfate as a mucopolysaccharide and a dialysis membrane having a fractional molecular weight of 1000 as a passage membrane in an example of the present invention, and the resulting oligosaccharide (oligochondroitin sulfate) It is a chart which shows the result of having analyzed by capillary electrophoresis.
FIG. 5 shows an oligosaccharide obtained by using chondroitin tetrasulfate as a mucopolysaccharide and a dialysis membrane having a fractional molecular weight of 1000 as a passage membrane in an example of the present invention, and the resulting oligosaccharide (oligochondroitin sulfate) It is a spectrum figure which shows the result of having analyzed this by MALDI-TOFMS.
FIG. 6 (a) shows the same results as FIG. 1, and FIG. 6 (b) shows the results of Comparative Example 1 after decomposing hyaluronic acid and using a large amount of ethanol without using a dialysis membrane. FIG. 6 (c) shows the result of obtaining hyaluronic acid and analyzing the oligohyaluronic acid by capillary electrophoresis. In FIG. 2 is a chart showing the results of analyzing the oligohyaluronic acid by capillary electrophoresis.

Claims (4)

In a method for producing an oligosaccharide (salt) in which hyaluronic acid or a salt thereof is decomposed with endo-type hyaluronidase to produce an oligosaccharide or a salt thereof,
Preparing a first space and a second space partitioned by a partition having a passage membrane that allows the oligosaccharide (salt) to be produced to pass through, without passing the endo hyaluronidase ;
In the first space, hyaluronic acid or a salt thereof is decomposed by endo-type hyaluronidase , generated by the decomposition, and oligosaccharide (salt) that has moved to the second space through the passage membrane by dialysis is recovered ,
A method for producing an oligosaccharide (salt), comprising producing an oligohyaluronic acid or oligohyaluronate comprising four or more sugars .   2. The method for producing an oligosaccharide (salt) according to claim 1, wherein the passage membrane allows only a substance having a molecular weight equal to or lower than that of the oligosaccharide (salt) to be produced to pass through. The method for producing an oligosaccharide (salt) according to claim 1 or 2 , wherein the recovered oligosaccharide (salt) is purified by precipitation with an organic solvent . The oligosaccharide (salt) is oligohyaluronic acid or oligohyaluronate consisting of four sugars, or oligohyaluronic acid or oligohyaluronate consisting of six sugars . 4. The method for producing an oligosaccharide (salt) according to any one of 3 above.

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