JP3948971B2

JP3948971B2 - Method for differentiating and inducing bone marrow stromal cells into nerve cells and skeletal muscle cells using Notch gene transfer

Info

Publication number: JP3948971B2
Application number: JP2002030003A
Authority: JP
Inventors: 真理出澤; 元澤田; 洋菅野; 雅彦高野
Original assignee: サンバイオ，インコーポレイティド
Priority date: 2001-08-30
Filing date: 2002-02-06
Publication date: 2007-07-25
Anticipated expiration: 2022-02-06
Also published as: JP2003144155A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｎｏｔｃｈ遺伝子の導入を含む多段階から成る操作を加えることによって骨髄間質細胞を神経細胞又は骨格筋細胞にインビトロにおいて分化・誘導する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）などの、病状の進行した神経変性疾患を対象にする場合、細胞死によって失われた神経細胞そのものを補充しなくては神経機能再建が実現しない。神経細胞移植に対して動物実験レベルで試みられているとしては胎児及び成体由来の神経幹細胞、ES細胞又は胎児由来の神経細胞などである。しかしながら、いずれもヒトヘの応用において大きなハードルがある。胎児由来の幹細胞又は神経細胞の使用に対しては倫理的な問題があり、安定した供給性が得られるか不安がある。またＥＳ細胞はその多分化能という点において現在多くの注目を集めているが、やはり倫理問題を大きく含み、特定の細胞への分化・誘導に対して費用と労力がかかること、さらに移植後奇形腫を形成する危険性があることなども不安定要素として挙げられる。また成体由来の神経幹細胞を用いる場合、中枢神経系の極く限られた中心部分に存在するため開頭して採取しなくてはならず、再生治療と引き換えに受ける患者の危険と負担は多大なものである。
【０００３】
インビトロで中枢神経系幹細胞が分離されてから約１０年程たつが、今のところ一般に受け入れられたプロトコルでは、神経幹細胞を分化させ、機能しうるドーパミン作動性又はコリン作動性ニューロンを大量に得ることはできていない（ＬｏｒｅｎｚＳｔｕｄｅｒ，ｎａｔｕｒｅｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２月号Ｐ．１１１７（２００１））。
【０００４】
また、カルガリー大学（Ｃａｌｇａｒｙ、カナダ）のワイス・サミュエル、新郷哲郎教授らの研究グループは、複数のチロシン水酸化酵素誘導因子の混合液（ＴＨカクテル）をマウス脳内に投与し、ドーパミン産生神経細胞を高効率で分化・誘導することに成功しているようであるが、本願発明におけるように骨髄間質細胞からドーパミン作動性ニューロン及びコリン作動性ニューロンを分化・誘導した例は全くない。
【０００５】
運動性ニューロンは、アセチルコリン作動性であり、この細胞はＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）という難病への適用が考えられる。ＡＬＳは何らかの理由で脊髄の運動性ニューロンが細胞死に陥り、筋肉を動かす神経が無くなるために呼吸筋にいたるまで全身の筋肉を動かすことができなくなり発病２〜３年で死亡に至る疾患である。現在有効な治療法は無いが、ラットにおいてＡＬＳモデル動物が作成されつつある。
筋ジストロフィーなどの変性性筋肉疾患の多くは進行性であり、やはり骨格筋細胞の移植が解決となりうる。正常人においては筋組織に存在する衛星細胞（ｓａｔｅｌｌｉｔｅｃｅｌｌ）が再生能力を持ち失われた骨格筋の補充に働くが、進行性の筋疾患の場合、細胞数も減少しており再生能力も低くなっている。したがって骨格筋又はその前駆細胞の移植が治療となり得るが現在有効な手段は存在しない。
【０００６】
脳神経系の発生過程では、比較的均一な神経前駆細胞（神経幹細胞ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ）から、ニューロンやグリア細胞が分化・誘導される。前駆細胞群の一部の細胞は分化シグナルに反応してさるサブタイプの細胞に分化するが、残りの細胞は未分化のままで留まる機構が存在している。つまり、先に分化した細胞が周りにあるシグナルを出して自分と同じ細胞に分化するのを防ぐメカニズムが存在する。これを側方制御（ｌａｔｅｒａｌｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）という。ショウジョウバエでは先に神経に分化した細胞がＤｅｌｔａというリガンドを発現し、その周りの細胞がＤｅｌｔａの受容体であるＮｏｔｃｈを発現し、それらは神経細胞にならない（Ｎｏｔｃｈシグナリング）。このＤｅｌｔａ−Ｎｏｔｃｈ系は、脊椎細胞においても働いているようである（例えば、Chitnis, A., Henrique, D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., Kintner, C.: Nature, 375, 761-766 (1995)を参照のこと）。
【０００７】
このように均一なものから多様なものを生み出す発生過程においては、膜タンパク質Ｎｏｔｃｈを介した細胞間相互作用が重要な役割を担っていること、すなわち、Ｎｏｔｃｈは隣接細胞からリガンド刺激を受けると、Ｍａｓｈ１、Ｍａｔｈ１、ニューロゲニン（Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ）に代表されるｂＨＬＨ（ｂａｓｉｃｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ）型神経分化因子を阻害するＨＥＳ１やＨＥＳ５の発現を誘導することにより隣接細胞と同じ種類の細胞への分化を抑制すると考えられている（例えば、影山ら、細胞工学Vol.18, No.9, 1301-1306 (1999)を参照のこと）。
【０００８】
Ｎｏｔｃｈの細胞内経路は以下のように考えられている。Ｎｏｔｃｈは、まず隣接細胞の表面に存在するリガンド（Ｄｅｌｔａ，Ｓｅｒｒａｔｅ，Ｊａｇｇｅｄ）によって活性化されるとその細胞内ドメインが切り出される（Artavanis-Tsakonas S, et al: Science (1999) 284: 770-776、及び影山ら、細胞工学Vol.18, No.9, 1301-1306 (1999)を参照のこと)。Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメインが切り出された後、核移行シグナル（ＮＬＳ）によって細胞膜から核に移行して核内でＲＢＰ−ＪκというＤＮＡ結合タンパク質と複合体を形成する（Honjo T: Genes Cells (1996) 1: 1-9、及び影山ら、細胞工学Vol.18, No.9, 1301-1306 (1999)を参照のこと）。ＲＢＰ−Ｊκそのものは、ＤＮＡに結合して転写を抑制するレプレッサーで、Ｎｏｔｃｈが不活性のときには分化抑制因子であるＨＥＳ１遺伝子のプロモーターに結合してその発現を制御しているが、ＲＢＰ−ＪκとＮｏｔｃｈの細胞内ドメインが複合体を形成すると、この複合体が逆にＨＥＳ１遺伝子の転写を活性化する(jarriault S, et al: Nature (1995) 377: 355-358、Kageyama R, et al: Curr Opin Genet Dev (1997) 7: 659-665、及び影山ら、細胞工学Vol.18, No.9, 1301-1306 (1999)を参照のこと)。その結果、ＨＥＳ１の発現が誘導され、さらにＨＥＳ１により分化が抑制される。すなわち、ＮｏｔｃｈはＨＥＳ１を介して分化を抑制していると考えられている（影山ら、細胞工学Vol.18, No.9, 1301-1306 (1999)を参照のこと)。
【０００９】
哺乳動物においても、神経前駆細胞（神経幹細胞）の維持や多様性に富んだニューロンの分化過程に、Ｎｏｔｃｈを介した遺伝子発現制御が重要であること、また、Ｎｏｔｃｈ経路は神経系以外の細胞分化にも必須であることがわかってきている(Tomita K, et al: Genes Dev (1999) 13: 1203-1210、及び影山ら、細胞工学Vol.18, No.9, 1301-1306 (1999)を参照のこと)。さらに、ＨＥＳが関わらないＮｏｔｃｈ経路の存在、Ｎｏｔｃｈシグナリングの転写レベルでの負の調節、タンパク質レベルでの負の相互作用の存在なども予想されている（郷正博、細胞工学Vol.18, No.9, 1291-1300 (1999)を参照のこと)。しかしながら、上記いずれの文献も、Ｎｏｔｃｈシグナリングは分化を抑制する方向に働くということを示唆・教示している。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
再建が不可能とされている中枢神経疾患は、外傷による脊髄損傷や脳血管障害、失明に至る緑内症からパーキンソン氏病などの変性疾患まで実に多種多様の疾患が含まれ、罹患人口は多いものと思われる。従ってこれらの疾患に対する神経再生法の研究は社会的急務であり、我々の研究結果は実際の人への応用の突破になるものと思われる。骨髄間質細胞であれば骨髄穿刺によって病院の外来レベルでの採取が容易であり、非常に旺盛な増殖能を持つので大量培養が比較的短い時間で可能である。さらに自分の骨髄間質細胞から神経が作成できれば自家移植が可能であり、これは大変大きな利点であると思われる。免疫拒絶反応が起きないので免疫抑制剤の投与が不必要であり、安全な治療を与えることが可能と思われる。また、骨髄バンクからも骨髄間質細胞を得ることが可能であるため、供給面からは現実的な対応が可能である。これらの細胞を用いて現在有効な手段のない神経細胞を誘導することができれば再生医学において大きな効果が期待される。
【００１１】
また、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）は何らかの理由で脊髄の運動ニューロンが細胞死に陥り、筋肉を動かす神経が無くなるために呼吸筋にいたるまで全身の筋肉を動かすことができなくなり発病２〜３年で死に至る疾患であるが、現在有効な治療法は無い。自分の骨髄間質細胞からアセチルコリン作動性ニューロンを作成することができれば自家移植が可能であり、これは大変大きな利点であり、ＡＬＳの治療法となるかもしれない。
【００１２】
また、筋疾患、とくに骨格筋の変性疾患である筋ジストロフィーなどに対しては現時点では有効な治療手段が無い。自分の骨髄間質細胞から骨格筋細胞を作成することができれば自家移植が可能であり、これは大変大きな利点であると思われる。これらの細胞を用いて現在有効な手段のない骨格筋細胞を誘導することができれば再生医学において大きな効果が期待できる。
上記の臨床治療の面だけてはなく、今後開発が予想される人工臓器などの工学的な方面においても応用が考えられる。培養レベルで神経細胞や筋肉細胞が容易に作成できることから、ハイブリッド型の人工臓器などの作成において使用も考えられる。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
以上の現状を鑑み、比較的容易に採取できる細胞を用いて人為的操作を加え、神経細胞や骨格筋などを作成することが出来るかどうか検討した。
発明者らは骨髄間質細胞に対して形態形成の初期において中心的な役割を果たす遺伝子の導入が骨髄間質細胞をなんらかの形で刺激し、この刺激が骨髄間質細胞の分化・誘導に及ぼす影響について調べてみた。すなわち、特に神経系の発生分化において重要な役割を果たしており、前駆細胞が神経細胞とグリア細胞とに分かれる時点で運命決定に作用しているとされているＮｏｔｃｈ遺伝子及びＮｏｔｃｈシグナリング遺伝子を導入することによって骨髄間質細胞をリセット（初期設定）することができるかもしれないと期待した。
【００１４】
ここで、重要なことは、Ｎｏｔｃｈ遺伝子及びＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子が細胞の分化・誘導を抑制するということは示唆・教示されていたものの、以下に詳述するように、Ｎｏｔｃｈ遺伝子及びＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子の導入を他の分化・誘導のための刺激と組み合わせることにより、Ｎｏｔｃｈ遺伝子及びＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子が導入された細胞自体（Ｎｏｔｃｈ遺伝子及びＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子が導入された細胞に接触した細胞ではない）が分化・誘導されうるということは全く予想外の出来事であるということである。本願発明にかかる分化・誘導方法において、Ｎｏｔｃｈ遺伝子及びＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子の導入が骨髄間質細胞の発生・分化をリセットすることができたと断言することはできない。しかしながら、かかる遺伝子導入を他の分化・誘導ステップと組み合わせることにより、本願発明は、結果として、骨髄間質細胞を効率よく神経細胞又は骨格筋細胞に分化・誘導する方法を提供すること可能にしたといえる。
【００１５】
今般、本願発明者らは、Ｎｏｔｃｈ遺伝子及びＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子の導入を含む複数ステップの組み合わせ実験を繰返した結果、骨髄間質細胞をインビトロにおいて神経細胞又は骨格筋細胞に、効率よく分化・誘導することに初めて成功した。さらに、かかる分化誘導方法により得られた神経細胞をパーキンソンモデルラットや、視神経損傷による網膜・視神経変性モデルラットに移植することにより実際に神経が生着・機能することを確認し、ここに本願発明を完成するに至った。
【００１６】
驚くべきことに、骨髄間質細胞にＮｏｔｃｈ遺伝子及びＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子を導入し、さらに分化開始における一般的なトリガーと考えられている細胞内ｃＡＭＰの上昇及び神経分化に作用すると考えられている種々の因子・サイトカインを投与することによってインビトロ培養条件において骨髄間質細胞を神経細胞に分化・誘導することに成功した。神経細胞に特異的なＭＡＰ−２、神経細線維（Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ）のみならず、神経伝達物質、及びその合成酵素であるチロシン・ヒドロキシラーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、アセチルコリン（Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ニューロペプチドＹ（ＮｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅＹ）、サブスタンスＰ（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）などの発現も確認した。
【００１７】
一方、１個又はごく少数の遺伝子が５−アザシチジン（５−ＡＺＣ）処理によって脱メチル化され、活性化されることによって筋芽細胞への転換が起こることが示唆されている(Taylar SM, Jones PA: ell 17: 771-779, 1979、及び鍋島陽一、生体の科学 47(3): 184-189, 1996を参照のこと）。そこで、我々は、上記の神経細胞におけるＮｏｔｃｈ遺伝子及びＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子の導入を、上記５−アザシチジン（５−ＡＺＣ）処理による脱メチル化と組み合わせてみた。具体的には、上記脱メチル化剤を用いて遺伝子のメチル化による発現抑制を解除することによって骨髄間質細胞をリセットし、次にＮｏｔｃｈ及びＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子を導入し、次に上記遺伝子が導入された細胞を上記遺伝子を導入していない骨髄間質細胞とともに共培養し（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）、そして最後に分化開始における一般的なトリガーと考えられている細胞内ｃＡＭＰの上昇作用物質で処理することによって、Ｎｏｔｃｈ及びＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子が導入された細胞を、インビトロにおける培養により骨格筋細胞に分化・誘導することに成功した。得られた細胞は、特徴的な多核を有する筋管の形成と横紋を認め、筋肉に特異的なミオゲニン（ｍｙｏｇｅｎｉｎ），Ｍｙｆ５の発現もｍＲＮＡレベルで確認した。
【００１８】
本願発明の１の態様においては、骨髄間質細胞をインビトロにおいて神経細胞又は骨格筋細胞に分化・誘導する方法であって、上記細胞内にＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子を導入することを含み、ここで、最終的に得られた分化・誘導された細胞が、上記のＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子が導入された骨髄間質細胞が細胞分裂した結果として得られたものである、前記分化・誘導方法が提供される。
【００１９】
本願発明の他の態様においては、骨髄間質細胞をインビトロにおいて神経細胞に分化・誘導する方法であって、以下のステップ：
（１）骨髄から骨髄間質細胞を採取し、そして標準的な基礎培地に血清を加えた培地中で上記細胞を培養し；
（２）上記細胞内にＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子を導入し、そしてさらに培養し；及び
（３）サイクリックＡＭＰ上昇作用性薬剤又はサイクリックＡＭＰアナログ、及び／又は細胞分化生存作用性因子を上記培養液に添加し、そしてさらに培養して神経細胞を得る；
を含む、前記分化・誘導方法が提供される。
【００２０】
前記標準的な基礎培地はイーグルス（Ｅａｇｌｅ’ｓ）アルファ修飾最小必須培地であり、そして前記血清はウシ胎児血清であることができる。前記Ｎｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング遺伝子の導入は、哺乳動物発現ベクターを用いたリポフェクションによることができる。好ましくは、前記ステップ（２）と（３）の間に、前記遺伝子が導入された細胞の選択を所定期間行うステップをさらに含むことができる。この選択は、硫酸Ｇ４１８の添加によるネオマイシン耐性に基づく選択（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）であることができる。ここで、重要なことは、この選択が、最終的に得られた分化・誘導された神経細胞が、上記のＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子が導入された骨髄間質細胞が細胞分裂した結果として得られたものであることを保証しているということである。
【００２１】
前記サイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログは好ましくはフォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）である。また、前記サイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログの濃度は、０．００１ｎＭ〜１００μＭであることができる。好ましくは、この濃度は、０．５μＭ〜５０μＭであることができる。前記細胞分化生存作用性因子は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ））、毛様体神経栄養因子（ｃｉｌｉａｒｙｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ（ＣＮＴＦ））、及びそれらの混合物から成る群から選ぶことができる。好ましくは、前記細胞分化生存作用性因子の濃度は、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである。この濃度は、好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌであることができる。
前記のように分化誘導した神経細胞を、さらに以下のように処理することにより、ドーパミン作動性ニューロンの割合を高めることができる。
本発明の他の態様においては、前記神経細胞が、ドーパミン作動性ニューロンであり、かつ、前記ステップ（３）の後に、以下のステップ：
（４）ステップ（３）において得られた神経細胞を、標準的な基礎培地に血清を加えた培地中で培養し；及び
（５）グリア由来神経栄養因子（Ｇｌｉａｌｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ））、及びサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログ、及び／又は上記グリア由来神経栄養因子以外の細胞分化生存作用性因子を、上記培養液に添加し、そしてさらに培養して、ドーパミン作動性ニューロンを得る；
をさらに含む、前記分化・誘導方法が提供される。
前記ステップ（４）における標準的な基礎培地は、イーグルス（Ｅａｇｌｅ’ｓ）アルファ修飾最小必須培地であり、そして前記ステップ（４）における血清はウシ胎児血清であることができる。前記ステップ（５）におけるサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログは、フォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）である。前記ステップ（５）におけるサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログの濃度は、０．００１ｎＭ〜１００μＭであることができ、そして好ましくは、５００ｎＭ〜５０μＭであることができる。
前記ステップ（５）における、グリア由来神経栄養因子以外の細胞分化生存作用性因子は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ））、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ））、及びそれらの混合物から成る群から選ぶことができる。好ましくは、前記ステップ（５）におけるグリア由来神経栄養因子の濃度は、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであり、好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌであることができる。前記ステップ（５）における、グリア由来神経栄養因子以外の細胞分化生存作用性因子の濃度は、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであり、好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌであることができる。
あるいは、前記のように分化誘導した神経細胞を、さらに以下のように処理することにより、アセチルコリン作動性ニューロンの割合を高めることができる。
本発明の他の態様においては、前記神経細胞が、アセチルコリン作動性ニューロンであり、かつ、前記ステップ（３）の後に、以下のステップ：
（４）ステップ（３）において得られた神経細胞を、標準的な基礎培地に血清を加えた培地中で培養し；及び
（５）神経成長因子（Ｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）（ＮＧＦ）、及びサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログ、及び／又は上記神経成長因子以外の細胞分化生存作用性因子を、上記培養液に添加し、そしてさらに培養して、アセチルコリン作動性ニューロンを得る；
をさらに含む、前記分化・誘導方法が提供される。
前記ステップ（４）における標準的な基礎培地が、イーグルス（Ｅａｇｌｅ’ｓ）アルファ修飾最小必須培地であり、そして前記ステップ（４）における血清がウシ胎児血清であることができる。前記ステップ（５）におけるサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログは、フォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）である。前記ステップ（５）におけるサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログの濃度は、０．００１ｎＭ〜１００μＭであることができ、そして好ましくは、５００ｎＭ〜５０μＭであることができる。
前記ステップ（５）における、神経成長因子以外の細胞分化生存作用性因子が、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ））、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ））、及びそれらの混合物から成る群から選ぶことができる。
好ましくは、前記ステップ（５）における神経成長因子の濃度は、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであり、好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌであることができる。前記ステップ（５）における、神経成長因子以外の細胞分化生存作用性因子の濃度は、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであり、好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌであることができる。
【００２２】
また、本願発明の他の態様においては、骨髄間質細胞をインビトロにおいて骨格筋細胞に分化・誘導する方法であって、以下のステップ：
（１）骨髄から骨髄間質細胞を採取し、そして標準的な基礎培地に血清を加えた培地中で上記細胞を培養し；
（２）上記培養液に脱メチル化剤を添加し、そしてさらに培養し；
（３）サイクリックＡＭＰ上昇作用性薬剤又はサイクリックＡＭＰアナログ、及び／又は細胞分化生存作用性因子を上記培養液に添加し、そしてさらに培養し；
（４）上記細胞内にＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子を導入し、そしてさらに培養し；
（５）上記の遺伝子導入された細胞を、遺伝子導入のされていない無処理の上記骨髄間質細胞と接触させながら、これとともに共培養し；及び
（６）サイクリックＡＭＰ上昇作用性薬剤又はサイクリックＡＭＰアナログを上記培養液に添加し、そしてさらに培養して骨格筋細胞を得る；
を含む、前記分化・誘導方法が提供される。
【００２３】
前記標準的な基礎培地はイーグルス（Ｅａｇｌｅ’ｓ）アルファ修飾最小必須培地であり、そして前記血清はウシ胎児血清であることができる。前記脱メチル化剤は好ましくは５−アザシチジン（５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）である。前記５−アザシチジンの濃度は３０ｎｍｏｌ／ｌ〜３００μｍｏｌ／ｌであることができ、好ましくは、３００ｎｍｏｌ／ｌ〜３０μｍｏｌ／ｌであることができる。前記ステップ（３）におけるサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログはフォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）であることができる。前記ステップ（３）におけるサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログの濃度は、０．００１ｎＭ〜１００μＭであることができ、そして好ましくは、５００ｎＭ〜５０μＭであることができる。前記細胞分化生存作用性因子が、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ））、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ））、ヘレグリン（Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ商標）、及びそれらの混合物から成る群から選ぶことができる。前記細胞分化生存作用性因子の濃度は、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであることができ、そして好ましくは、０．５ｎｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌであることができる。
【００２４】
前記Ｎｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子の導入は哺乳動物発現ベクターを用いたリポフェクションによるものであることができる。好ましくは、前記ステップ（４）と（５）の間に、前記遺伝子が導入された細胞の選択を所定期間行うステップをさらに含むことがきる。この選択は、硫酸Ｇ４１８の添加によるネオマイシン耐性に基づく選択（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）であることができる。ここで、重要なことは、この選択が、最終的に得られた分化・誘導された骨格筋細胞が、上記のＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子が導入された骨髄間質細胞が細胞分裂した結果として得られたものであることを保証しているということである。
【００２５】
前記ステップ（５）におけるサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログはフォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）であることができる。前記ステップ（５）におけるサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログの濃度は、０．００１ｎＭ〜１００μＭであることができ、そして好ましくは５００ｎＭ〜５μＭであることができる。
本発明のさらに他の態様においては、前記分化・誘導方法を用いて製造されたドーパミン作動性ニューロンが提供される。
本発明のさらに他の態様においては、前記ドーパミン作動性ニューロンを含む、パーキンソン病治療用医薬組成物が提供される。
本願明細書中、用語「骨髄間質細胞」とは、骨髄中に存在する造血系以外の細胞をいい、骨、軟骨、脂肪細胞等の細胞に分化できると考えられている。骨髄間質細胞は、Ｔｈｙ１，２が＋、β１−インテグリンが＋、及びＣＤ３４が−により識別しうる。
【００２６】
本願明細書中に使用するとき、分化誘導において用語「効率よく」とは、本願発明に係る分化・誘導方法により、前記選択後の骨髄間質細胞が、最終に神経細胞又は骨格筋細胞に変換される割合が高いことをいう。本願発明に係る分化・誘導方法においては、この効率は、５０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは９０％以上、そして最も好ましくは９５％以上である。
【００２７】
本願明細書中、用語「神経細胞」とは、ニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）のことをいい、形態学的には、細胞体と２種類の突起（樹状突起と軸索）を特徴とし、そして生化学的にはＭＡＰ−２（ＣｈｅｍｉｃｏｎＡＢ１５１）、ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，８１４３４２）、及びｎｅｓｔｉｎ（Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＢＭＳ４３５３）に対する抗体と反応するものをいう。また、神経伝達物質、及びその合成酵素である、例えば、チロシン・ヒドロキシラーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ），小胞アセチルコリン・トランスポーター（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ），ニューロペプチドＹ（ＮｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅＹ），サブスタンスＰ（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）等を分泌することを特徴とする。
ここで、上記チロシン・ヒドロキシラーゼは、ドーパミン作動性ニューロンの指標であり、そして小胞アセチルコリン・トランスポーターは、運動性ニューロンに代表されるアセチルコリン作動性ニューロンの指標である。
【００２８】
本願明細書中、用語「グリア細胞」とは、中枢神経において、ニューロンとその突起の間を埋めているアストロサイト、オリゴデンドロサイト、マイクログリアと上皮細胞をいう。
ここで、グリアル・フィブリラー酸性タンパク質（Ｇｌｉａｌｆｉｂｒｉｌｌａｒａｃｉｄｉｃｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ））は、アストロサイトの指標であり、そして、Ｏ４は、オリゴデンドロサイトの指標である。
【００２９】
本願明細書中、用語「骨格筋細胞」とは、筋線維又は筋肉線維のことをいい、骨格筋の単一筋細胞である。形態学的には、細長い巨大な多核であり、筋管の形成と横紋があり、そして生化学的にはミオゲニン（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）Ｍｙｆ５などの転子制御因子の発現を特徴とする。
【００３０】
本願発明に係る骨髄間質細胞をインビトロにおいて神経細胞又は骨格筋細胞に分化・誘導する方法は、上記細胞内にＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子を導入するステップを含む点で新規である。さらに、新規のステップを従来技術の他の分化・誘導ステップと一定の順序で組み合わせる点においても新規である。本願発明における上記ステップの選択及び最適な組み合わせは、本願発明者らにより初めて発見された意義はひじょうに高いといえる。なぜなら、骨髄間質細胞が、骨芽細胞、血管内皮細胞、骨格筋細胞、脂肪細胞、平滑筋細胞等に分化誘導される可能性がある間葉系の幹細胞又は前駆細胞であることは判っていたとしても、骨髄間質細胞を、実際に、神経胞又は骨格筋細胞に分化させることができるかどうかについては知られておらず、かつ、切望されていたにも拘らず未だかつて誰も実際にこれに成功した者はいなかったからである。いずれの理論に拘束されることを望まないが、本願発明者らは、上記細胞内にＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子を導入することが、細胞の発生・分化をリセットするように機能し、そして他の分化・誘導処理の働きを助けると推定する。
【００３１】
以下の実施例により、本願発明をさらに詳細に説明する。但し、本願発明の範囲を何ら限定するものと解してはならない。
【００３２】
【実施例】
実施例１：神経誘導
成体ラット（Ｗｉｓｔｅｒ種）の骨髄より間質細胞を採取し培養する。培地はＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍＡｌｐｈａＥａｇｌｅＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社、Ｍ４５２６）に２０％のウシ胎児血清（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ社、１４−５０１Ｆ，Ｌｏｔ＃６１−１０１２）を加えたものを用いた。
４代まで継代培養し、８０−９０％の集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に達した時点でＮｏｔｃｈ細胞内ドメインの遺伝子を導入した。これはＰｒｏｍｅｇａ社、ｐＣＩ−ｎｅｏ哺乳動物発現ベクター（＃Ｅ１８４１）のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩマルチクローニング部位に、３．１ｋｂのＮｏｔｃｈ細胞内ドメインのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片を挿入し組み換えたものであった。導入には、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，１１６６８−０２７）のシステムを用いた。
【００３３】
導入の翌日にＧ４１８ｓｕｌｆａｔｅ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，８３−５０２７）を２００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加し導入細胞の選択（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を１０日間行った。
細胞数が９０％集密を回復した後、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎｅ５μＭ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，３４４２７３）、ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ１０ｎｇ／ｍｌ（ＰｅｐｒｏｔｅｃｈＥＣ，ＬＴＤ，１００−１８Ｂ）、ｃｉｌｉａｒｙｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ５０ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，５５７−ＮＴ）を添加した。
【００３４】
１０日程たって細胞を解析した結果、図１に示すように、神経細胞に特徴的な形態が観察された。誘導された細胞は、図２に示すように、以下の抗体、ＭＡＰ−２（ＣｈｅｍｉｃｏｎＭＡＢ３６４）、ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，８１４３４２）、ｎｅｓｔｉｎ（Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＢＭＳ４３５３）に対して陽性反応を示した。ＭＡＰ−２とｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔは神経細胞の、ｎｅｓｔｉｎは神経前駆細胞のマーカーであるため、誘導された細胞は神経細胞としての性質を持つものと判断できる。
【００３５】
また、図３に示すように、神経伝達物質、及びその合成酵素であるＴｙｒｏｓｉｎｅ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（ＣｈｅｍｉｃｏｎＡＢ１５１）、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ（ＣｈｅｍｉｃｏｎＡＢ１５７８）、ＮｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅＹ（ＰｅｎｉｎｓｕｌａＬａｂＩＮＣ，ＲＩＮ７１７２）、ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ（ＡｍｅｒｓｈａｍＩＮＣ，ＲＰＮ１５７２）等の抗体を用いて検索したところ、それぞれ２〜４％前後の陽性細胞を認めたため、神経伝達物質を持つ神経細胞も存在することが分かった。
【００３６】
上記操作によって神経細胞が誘導されるが、この段階では、図５のグラフの左側に示すように、ドーパミン作動性ニューロンの指標であるチロシン・ヒドロキシラーゼに対して反応する分化誘導された神経細胞は、全神経細胞の２．９±０．５％であった。また、図７のグラフの左側に示すように、運動ニューロンに代表されるアセチルコリン作動性ニューロンの指標であるＶｅｓｉｃｕｌａｒａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒに対して反応する分化誘導された神経細胞は、全神経細胞の１．７８±０．７５％であった。
【００３７】
実施例２：ドーパミン作動性ニューロンの誘導
上記の分化・誘導された神経細胞を、以下の培地中でさらに培養する。培地は、ＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍＥａｇｌｅＡｌｐｈａＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社、Ｍ４５２６）に１０％のウシ胎児血清（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ社、１４−５０１Ｆ，Ｌｏｔ＃６１−１０１２）を加えたものであり、さらに、グリア由来神経栄養因子（Ｇｌｉａｌｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ；ＰｅｐｒｏｔｅｃｈＥＣＬＴＤ，ｈｕｍａｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＧＤＮＦ，＃４５０−１０）５０ｎｇ／ｍｌ，Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ５μＭ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，３４４２７３），ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ１０ｎｇ／ｍｌ（ＰｅｐｒｏｔｅｃｈＥＣ，ＬＴＤ，１００−１８Ｂ），Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−ＡＡ５ｎｇ／ｍｌ（ＰｅｐｒｏｔｅｃｈＥＣＬＴＤ，３９６−ＨＢ）を添加したものであった。
かかる操作により、チロシン・ヒドロキシラーゼに対して反応するドーパミン作動性ニューロンは、全神経細胞に対して、１７．２±５．１％まで劇的に上昇した（図５のグラフの右側参照）。図４の写真に示すように、ＧＤＮＦ投与後に、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｉａｎａｔｅ）で緑に染色されるタンパク質チロシン・ヒドロキシラーゼの割合が劇的に上昇した。
【００３８】
実施例３：アセチルコリン作動性ニューロンの誘導
実施例１において分化・誘導された神経細胞を、以下の培地中でさらに培養する。培地は、ＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍＡｌｐｈａＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社、Ｍ４５２６）に１０％のウシ胎児血清（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ社、１４−５０１Ｆ，Ｌｏｔ＃６１−１０１２）を加えたものであり、さらに、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）（２．５ＳＮＧＦ，Ｔａｋａｒａ，＃Ｔ００２Ａ）５０ｎｇ／ｍｌ，Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ５μＭ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，３４４２７３），ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ１０ｎｇ／ｍｌ（ＰｅｐｒｏｔｅｃｈＥＣ，ＬＴＤ，１００−１８Ｂ），Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−ＡＡ５ｎｇ／ｍｌ（ＰｅｐｒｏｔｅｃｈＥＣＬＴＤ，３９６−ＨＢ）を添加したものであった。
かかる操作により、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒに対して反応するアセチルコリン作動性ニューロンは、全神経細胞に対して、２０．５±０．０５％まで劇的に上昇した（図７のグラフの右側参照）。図６の写真に示すように、ＮＧＦ（Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ（ＮＴｓ））投与後に、ＦＩＰＣで緑に染色されるタンパク質Ｖｅｓｉｃｕｌａｒａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒの割合が劇的に上昇した。
【００３９】
実施例４：骨格筋誘導
成体ラット（Ｗｉｓｔｅｒ種)の骨髄より間質細胞を採取し培養する。培地はＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍＥａｇｌｅＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社、Ｍ４５２６）に２０％のウシ胎児血清（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ社、１４−５０１Ｆ，Ｌｏｔ＃６１−１０１２）を加えたものを用いた。
４代まで継代培養し、８０−９０％の集密に達した時点で５−アザシチジン（５−Ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）を３μｍｏｌ／ｌを添加し、２４時間培養した。
その後、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎｅ５μＭ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，３４４２７３）、ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ１０ｎｇ／ｍｌ（ＰｅｐｒｏｔｅｃｈＥＣ，ＬＴＤ，１００−１８Ｂ）、Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−ＡＡ５ｎｇ／ｍｌ（ＰｅｐｒｏｔｅｃｈＥＣＬＴＤ，３９６−ＨＢ）、Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ２００ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，３９６−ＨＢ）を培地に添加したものに切り替えて７日間培養した。
その後、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインの遺伝子を実施例１におけるのと同様に導入した。
【００４０】
導入の翌日にＧ４１８ｓｕｌｆａｔｅ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，８３−５０２７）を２００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加し導入細胞の選択（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を１０日間行った。
細胞数がほぼ１００％の集密を回復した後、上記遺伝子の導入されていない無処理の骨髄間質細胞を培地に加えてこれとともに共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）した。
３日後、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，３４４２７３）５μＭを添加した。数日後に、細胞が融合し多核の骨格筋細胞が局所的に出現し（図８参照）、そして経時的に増加した(図９参照）。図１０に見られるように、多核の骨格筋細胞が共焦点レーザー顕微鏡において観察された。これらの細胞ではｍｙｏｇｅｎｉｎ及びＭｙｆ５のｍＲＮＡの発現がＲＴ−ＰＣＲにおいて確認された。また電子顕微鏡観察により、骨格筋に特徴的な筋線維が認められた。
【００４１】
実施例５：ラットのパーキンソン病モデルを用いた、本願発明に係る分化・誘導方法により得られたドーパミン作動性ニューロンの、線状体への移植による治療効果
本願発明に係る分化・誘導方法により得られたドーパミン作動性ニューロンを、ラットのパーキンソンモデルに適用して移植の効果を検討した。ラットの脳の黒質に６−ＯＨＤＡ（６−ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ）を注入することによってパーキンソンモデルを作成する方法はすでに確立されており、今回もそのモデルを用いた（例えば、Ｓｖｅｎｄｓｅｎら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１３７：３７６−３８８（１９９６）；Ｓｖｅｎｓｅｎら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４８，１３５−１４６（１９９７））。このモデルにおいてはアポモルフィンを投与することによってラットが回転運動することが判っており、この回転数が増加すれば症状の悪化を、減少すれば改善を示唆する。
図１１の上段に示すように、９週間の観察期間では、神経細胞に誘導しただけのものを線状体に移植した場合、回転数は移植直後とほぼ横ばいであった。何も処置を施さない場合、回転数はどんどん増加する傾向にあるため（図示せず）、横ばいということは少なくとも悪化を防いでいる、と言える。
図１１の下段に示すように、ドーパミン作動性の誘導をかけたものを線状体に移植した場合、移植１週目より回転数が減少しはじめ、約半数の動物で、９週後に回転数がゼロ、又は１〜２回という非常に顕著な改善を認めるに至った。（尚、図１１の下段に示す９週後に８回転数／分を超える２つのケースは、移植操作に失敗したものと考えられるので評価から除外した。）
線状体に注入（移植）された本願発明に係るドーパミン作動性ニューロンが、どのような細胞に分化したかを調べるために、１０週後に、上記線状体組織を採取し、その切片を作成して免疫組織化学的検査を実施した。
骨髄間質細胞は、レトロウイルスにより、緑色蛍光を発するグリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）を産生する遺伝子をその染色体内に組込んである。したがって、図１２中の免疫蛍光写真において、骨髄間質細胞から分化誘導された神経細胞、それ故、線状体に移植されたドーパミン作動性ニューロンは、緑色の蛍光を発している。
一方、神経細胞をＮｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔを指標として、ドーパミン作動性ニューロンをチロシン・ヒドロキシラーゼを指標として、グリア細胞であるアストロサイトをＧＦＡＰを指標として、そして同じくグリア細胞であるオリゴデンドロサイトをＯ４を指標として、それぞれ、赤色で発色させた。
したがって、上記ＧＦＰによる緑色と、上記赤色による発色が重なれば、黄色に発色することになり、これは、移植されたドーパミン作動性ニューロンが、移植から１０週後にどの細胞になっていたかを表すことになる。
図１２に見られるように、移植から１０週後の線状体においては、移植された細胞はほぼ全てが神経細胞になっており、グリア細胞にはなっていなかった。また、チロシン・ヒドロキシラーゼ陽性の神経細胞（すなわち、ドーパミン作動性ニューロン）が相当数にのぼっていることから、インビトロにおける本願発明に係る分化・誘導方法によってドーパミン作動性ニューロンの全神経細胞に対する割合を、１７．２±５．１％まで高めることができたけれども、上記移植によって、この割合をさらに高めることができたことが分かる。
図１３に、チロシン・ヒドロキシラーゼを発色させた免疫蛍光写真を拡大したものを示す。図１３中、細胞の核を、細胞種を問わず、青色で染色した（Ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ）。青色で表される核の位置が、細胞の位置を示す。
以上により、ラットのパーキンソン病モデルにおいて、本願発明に係る分化・誘導方法によって得られたドーパミン作動性ニューロンを、線状体に移植することにより、パーキンソン病の症状を劇的に改善することが認められた。
【図面の簡単な説明】
【図１】本願発明に従って分化・誘導された神経細胞の、図面に代わる顕微鏡写真（位相差顕微鏡像）である。
【図２】本願発明に従って分化・誘導された神経細胞の、ＭＡＰ−２抗体、ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ抗体、及びｎｅｓｔｉｎ抗体に対する陽性反応を示す、図面に代わる免疫蛍光写真である。
【図３】本願発明に従って分化・誘導された神経細胞の、神経伝達物質及びその合成酵素であるＴｙｒｏｓｉｎｅ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（ＴＨ）、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ（ＶＡＣｈＴ）、ＮｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅＹ（ＮＰＹ）、ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ（ＳＰ）、Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｇｌｕ）、ＣａｌｃｉｔｏｎｉｎＧｅｎｅＲｅｌａｔｅｄＰｅｐｔｉｄｅ（ＣＧＲＰ）、Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ（ＶＩＰ）の抗体に対する反応を示す、図面に代わる免疫蛍光写真である。
【図４】本願発明に従って分化・誘導された神経細胞の、ＧＤＮＦ添加処理前後の、チロシン・ヒドロキシラーゼ陽性率（ドーパミン作動性ニューロン分化・誘導率）の変化を示す図面に代わる免疫蛍光写真である。
【図５】本願発明に従って分化・誘導された神経細胞の、ＧＤＮＦ添加処理前後の、チロシン・ヒドロキシラーゼ陽性率（ドーパミン作動性ニューロン分化・誘導率）の変化を示すグラフである。
【図６】本願発明に従って分化・誘導された神経細胞の、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ（ＮＴｓ；２．５ＳＮＧＦ）添加処理前後の、ＶｅｓｉｃｕｌａｒＡｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅＴｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ陽性率（アセチルコリン作動性ニューロン分化・誘導率）の変化を示す図面に代わる免疫蛍光写真である。
【図７】本願発明に従って分化・誘導された神経細胞の、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ（ＮＴｓ；２．５ＳＮＧＦ）添加処理前後の、ＶｅｓｉｃｕｌａｒＡｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅＴｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ陽性率（アセチルコリン作動性ニューロン分化・誘導率）の変化を示すグラフである。
【図８】本願発明に従って分化・誘導された骨格筋細胞の、図面に代わる顕微鏡写真（位相差顕微鏡像）である。
【図９】本願発明に従って分化・誘導された骨格筋細胞の、図面に代わる顕微鏡写真（位相差顕微鏡像）である。図８に示す骨格筋が経時的に増加したことを示す。
【図１０】本願発明に従って分化・誘導された骨格筋細胞が多核であることを示す、図面に代わる共焦点レーザー顕微鏡写真顕写真を示す。核は緑色で示され、そしてアクチン線維は赤色で示される。
【図１１】ラットのパーキンソン病モデルを用いた、本願発明に係る分化・誘導方法により得られたドーパミン作動性ニューロンの、線状体への移植による治療効果を示すグラフである。
【図１２】線状体に移植された細胞が、グリア細胞ではなく、神経細胞、及びドーパミン作動性ニューロンであることを示す、図面に代わる免疫蛍光写真である。
【図１３】線状体に移植された細胞が、神経細胞、及びドーパミン作動性ニューロンであることを示す、図面に代わる拡大された免疫蛍光写真である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for differentiating and inducing bone marrow stromal cells into nerve cells or skeletal muscle cells in vitro by applying a multi-step operation including introduction of a Notch gene.
[0002]
[Prior art]
When targeting advanced neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and ALS (Amyotrophic Lateral Sclerosis), it is necessary to replenish nerve cells lost due to cell death. Is not realized. Attempts at the level of animal experiments for nerve cell transplantation include embryonic and adult-derived neural stem cells, ES cells, or fetal-derived nerve cells. However, both have great hurdles in human application. There is an ethical problem with the use of fetal stem cells or neurons, and there is concern about whether a stable supply can be obtained. ES cells are currently attracting a lot of attention in terms of their pluripotency, but they still involve a large number of ethical issues, cost and labor for differentiation and induction into specific cells, and post-transplant malformations. The risk of forming a tumor is also an unstable factor. In addition, when using neural stem cells derived from adults, they must be harvested because they are located in a very limited central part of the central nervous system, and the risks and burdens of patients in exchange for regenerative treatment are enormous. Is.
[0003]
About 10 years have passed since the isolation of CNS stem cells in vitro, but the currently accepted protocol is to differentiate neural stem cells and obtain large quantities of functional dopaminergic or cholinergic neurons. (Lorenz Student, nature biotechnology December issue P.1117 (2001)).
[0004]
A group of researchers such as Weiss Samuel and Professor Tetsuro Shingo from the University of Calgary (Calgary, Canada) administered a mixture of multiple tyrosine hydroxylase inducers (TH cocktail) into the mouse brain to produce dopaminergic neurons. However, there is no example in which dopaminergic neurons and cholinergic neurons are differentiated and induced from bone marrow stromal cells as in the present invention.
[0005]
The motor neuron is acetylcholinergic, and this cell can be applied to an intractable disease called ALS (Amyotrophic Lateral Sclerosis). ALS is a disease in which the motor neurons in the spinal cord fall into cell death for some reason, and the muscles that move the muscles disappear, so that the muscles of the whole body cannot be moved until reaching the respiratory muscles, and death occurs in 2 to 3 years from the onset. There is currently no effective treatment, but ALS model animals are being created in rats.
Many degenerative muscle diseases such as muscular dystrophy are progressive, and skeletal muscle cell transplantation can still be the solution. In normal people, satellite cells present in muscle tissue have the ability to regenerate and replace lost skeletal muscle, but in the case of progressive muscle disease, the number of cells has decreased and the ability to regenerate is low. It has become. Therefore, transplantation of skeletal muscle or its progenitor cells can be a treatment, but there is currently no effective means.
[0006]
In the developmental process of the cranial nervous system, neurons and glial cells are differentiated and induced from relatively uniform neural progenitor cells (neural stem cells). Some cells in the progenitor cell group differentiate into subtype cells that respond to differentiation signals, but the remaining cells remain undifferentiated. In other words, there is a mechanism that prevents a previously differentiated cell from differentiating into the same cell as itself by giving a surrounding signal. This is referred to as lateral inhibition. In Drosophila, cells previously differentiated into nerves express a ligand called Delta, and surrounding cells express Notch, which is a receptor for Delta, and they do not become nerve cells (Notch signaling). This Delta-Notch system also appears to work in spinal cells (eg, Chitnis, A., Henrique, D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., Kintner, C .: Nature, 375 , 761-766 (1995)).
[0007]
In the developmental process that produces various things from the uniform one, cell-cell interaction via the membrane protein Notch plays an important role, that is, when Notch receives ligand stimulation from neighboring cells, Differentiation into cells of the same type as neighboring cells by inducing the expression of HES1 and HES5 that inhibits bHLH (basic helex-loop-helix) type neuronal differentiation factors represented by Mash1, Math1, and neurogenin (See, for example, Kageyama et al., Cell Engineering Vol. 18, No. 9, 1301-1306 (1999)).
[0008]
The intracellular pathway of Notch is considered as follows. When Notch is first activated by a ligand (Delta, Serrate, Jagged) present on the surface of an adjacent cell, its intracellular domain is cleaved (Artavanis-Tsakonas S, et al: Science (1999) 284: 770-776). And Kageyama et al., Cell Engineering Vol. 18, No. 9, 1301-1306 (1999)). After the Notch intracellular domain is excised, it is transferred from the cell membrane to the nucleus by a nuclear translocation signal (NLS) to form a complex with a DNA binding protein called RBP-Jκ in the nucleus (Honjo T: Genes Cells (1996) 1: 1-9 and Kageyama et al., Cell Engineering Vol. 18, No. 9, 1301-1306 (1999)). RBP-Jκ itself is a repressor that binds to DNA and represses transcription. When Notch is inactive, it binds to the promoter of the HES1 gene, which is a differentiation inhibitor, and regulates its expression. And the intracellular domain of Notch form a complex that in turn activates transcription of the HES1 gene (jarriault S, et al: Nature (1995) 377: 355-358, Kageyama R, et al: Curr Opin Genet Dev (1997) 7: 659-665 and Kageyama et al., Cell Engineering Vol. 18, No. 9, 1301-1306 (1999)). As a result, HES1 expression is induced, and differentiation is further suppressed by HES1. That is, Notch is thought to suppress differentiation through HES1 (see Kageyama et al., Cell Engineering Vol. 18, No. 9, 1301-1306 (1999)).
[0009]
In mammals, it is important to control gene expression via Notch in the maintenance of neural progenitor cells (neural stem cells) and the differentiation process of diverse neurons, and the Notch pathway is used to differentiate cells other than the nervous system. (Tomita K, et al: Genes Dev (1999) 13: 1203-1210, and Kageyama et al., Cell Engineering Vol. 18, No. 9, 1301-1306 (1999)). See In addition, the presence of Notch pathway that does not involve HES, negative regulation at the transcriptional level of Notch signaling, the presence of negative interaction at the protein level, etc. are expected (Masahiro Go, Cell Engineering Vol.18, No. 9, 1291-1300 (1999)). However, any of the above documents suggests or teaches that Notch signaling works in the direction of suppressing differentiation.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
Central nervous system diseases that cannot be reconstructed include a wide variety of diseases ranging from traumatic spinal cord injury, cerebrovascular disorders, glaucoma leading to blindness to degenerative diseases such as Parkinson's disease, and a large population It seems to be. Therefore, research on nerve regeneration methods for these diseases is a social urgent task, and our research results will break through the practical application to humans. Bone marrow stromal cells can be easily collected at the outpatient level of the hospital by bone marrow puncture and have a very vigorous proliferative capacity, so that large-scale culture is possible in a relatively short time. Furthermore, if a nerve can be created from my bone marrow stromal cells, autologous transplantation is possible, which seems to be a great advantage. Since immune rejection does not occur, administration of an immunosuppressant is unnecessary, and it seems possible to give safe treatment. In addition, since bone marrow stromal cells can be obtained from a bone marrow bank, realistic measures can be taken from the supply side. If these cells can be used to induce nerve cells without currently effective means, a great effect is expected in regenerative medicine.
[0011]
In addition, ALS (Amyotrophic Lateral Sclerosis) causes spinal motor neurons to die for some reason, and there is no nerve to move the muscles, so it is impossible to move the whole body muscles until reaching the respiratory muscles. Although the disease is fatal in 3 years, there is currently no effective treatment. If acetylcholinergic neurons can be created from their own bone marrow stromal cells, autologous transplantation is possible, which is a great advantage and may be a treatment for ALS.
[0012]
In addition, there is currently no effective treatment for muscular diseases, particularly muscular dystrophy, which is a skeletal muscle degenerative disease. If skeletal muscle cells can be created from their own bone marrow stromal cells, autologous transplantation is possible, which seems to be a great advantage. If these cells can be used to induce skeletal muscle cells that do not currently have effective means, great effects can be expected in regenerative medicine.
In addition to the above-mentioned clinical treatment, it can be applied to engineering aspects such as artificial organs that are expected to be developed in the future. Since nerve cells and muscle cells can be easily created at the culture level, it can be used in the production of hybrid type artificial organs.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
In view of the above situation, we examined whether it is possible to create nerve cells, skeletal muscles, etc. by performing artificial manipulation using cells that can be collected relatively easily.
The inventors have introduced a gene that plays a central role in bone marrow stromal cells in the early stages of morphogenesis and stimulates bone marrow stromal cells in some way, and this stimulation affects the differentiation and induction of bone marrow stromal cells. I examined the effect. That is, to introduce notch genes and notch signaling genes that play an important role particularly in the development and differentiation of the nervous system, and that are considered to act for fate determination when progenitor cells are divided into nerve cells and glial cells I expected that I could be able to reset (initial setting) bone marrow stromal cells.
[0014]
Here, what is important is that the Notch gene and the Notch signaling-related gene are suggested and taught that they suppress cell differentiation / induction, but as described in detail below, the Notch gene and the Notch signaling-related gene The cell itself into which Notch gene and Notch signaling-related gene have been introduced (not a cell in contact with the cell into which Notch gene and Notch signaling-related gene have been introduced) It is a completely unexpected event that can be differentiated and induced. In the differentiation / induction method according to the present invention, it cannot be asserted that introduction of a Notch gene and a Notch signaling-related gene could reset the development / differentiation of bone marrow stromal cells. However, by combining such gene transfer with other differentiation / induction steps, the present invention has made it possible to provide a method for efficiently differentiating and inducing bone marrow stromal cells into nerve cells or skeletal muscle cells. It can be said.
[0015]
As a result of repeating a multi-step combination experiment including introduction of a Notch gene and a Notch signaling-related gene, the inventors of the present application efficiently differentiate and induce bone marrow stromal cells into neurons or skeletal muscle cells in vitro. The first success. Furthermore, it was confirmed that the nerves were actually engrafted and functioned by transplanting the nerve cells obtained by such a differentiation induction method to Parkinson model rats or retinal / optic nerve degeneration model rats caused by optic nerve damage. It came to complete.
[0016]
Surprisingly, various Notch genes and Notch signaling-related genes are introduced into bone marrow stromal cells, and are further considered to act on the increase of intracellular cAMP and neuronal differentiation, which are considered to be general triggers for the initiation of differentiation. The bone marrow stromal cells were successfully differentiated and induced into neurons under in vitro culture conditions by administering the above factors and cytokines. In addition to MAP-2 and neurofilament specific to nerve cells, neurotransmitters, and tyrosine hydroxylase, which is a synthesizing enzyme thereof, acetylcholine, neuropeptide Y (Neuropeptide) Y), the expression of substance P (Substance P), etc. was also confirmed.
[0017]
On the other hand, it has been suggested that one or very few genes are demethylated and activated by treatment with 5-azacytidine (5-AZC) (Taylar SM, Jones). PA: ell 17: 771-779, 1979, and Yoichi Nabeshima, Biological Sciences 47 (3): 184-189, 1996). Therefore, we combined the introduction of Notch gene and Notch signaling-related gene in the above-mentioned nerve cells with the above-mentioned demethylation by 5-azacytidine (5-AZC) treatment. Specifically, bone marrow stromal cells are reset by releasing the suppression of expression due to methylation of the gene using the demethylating agent, and then Notch and Notch signaling related genes are introduced. The introduced cells are co-cultured with bone marrow stromal cells into which the above gene has not been introduced, and finally treated with an agent that increases intracellular cAMP, which is considered to be a general trigger for differentiation initiation. Thus, the cells into which Notch and Notch signaling-related genes were introduced were successfully differentiated and induced into skeletal muscle cells by in vitro culture. The resulting cells showed the formation of myotubes with characteristic multinuclei and striated pattern, and the expression of muscle-specific myogenin and Myf5 was also confirmed at the mRNA level.
[0018]
In one aspect of the present invention, there is provided a method for differentiating and inducing bone marrow stromal cells into neural cells or skeletal muscle cells in vitro, wherein Notch gene and / or Notch signaling related gene is introduced into the cells. In this case, the finally obtained differentiated / derived cells are obtained as a result of cell division of the bone marrow stromal cells into which the above Notch gene and / or Notch signaling related gene has been introduced. The differentiation / induction method is provided.
[0019]
In another aspect of the present invention, there is provided a method for differentiating and inducing bone marrow stromal cells into neurons in vitro, comprising the following steps:
(1) harvesting bone marrow stromal cells from the bone marrow and culturing the cells in a medium supplemented with serum in a standard basal medium;
(2) introducing a Notch gene and / or a Notch signaling-related gene into the cell and further culturing; and
(3) A cyclic AMP-elevating drug or a cyclic AMP analog and / or a cell differentiation / surviving factor is added to the culture medium, and further cultured to obtain nerve cells;
The differentiation / induction method is provided.
[0020]
The standard basal medium is Eagle's alpha modified minimal essential medium, and the serum can be fetal bovine serum. The Notch gene and / or the Notch signaling gene can be introduced by lipofection using a mammalian expression vector. Preferably, a step of selecting a cell into which the gene has been introduced for a predetermined period may be further included between the steps (2) and (3). This selection can be a selection based on neomycin resistance by the addition of G418 sulfate. Here, it is important that this selection is performed by dividing the finally obtained differentiated / induced neuronal cell into the bone marrow stromal cell into which the above Notch gene and / or Notch signaling related gene is introduced. It is guaranteed that it is obtained as a result.
[0021]
The cyclic AMP elevating agent or the cyclic AMP analog is preferably forskolin. In addition, the concentration of the cyclic AMP-elevating agent or the cyclic AMP analog may be 0.001 nM to 100 μM. Preferably, this concentration can be between 0.5 μM and 50 μM. The cell differentiation survival factor is selected from the group consisting of basic fibroblast growth factor (bFGF), ciliary neurotrophic factor (CNTF), and mixtures thereof. be able to. Preferably, the concentration of the cell differentiation survival factor is 0.001 ng / ml to 100 μg / ml. This concentration can preferably be between 1 ng / ml and 500 ng / ml.
The ratio of dopaminergic neurons can be increased by further treating the neurons induced to differentiate as described above as follows.
In another aspect of the present invention, the nerve cell is a dopaminergic neuron, and after the step (3), the following steps:
(4) culturing the nerve cells obtained in step (3) in a medium supplemented with serum in a standard basal medium; and
(5) A glial-derived neurotrophic factor (GDNF), a cyclic AMP elevating agent or a cyclic AMP analog, and / or a cell differentiation survival factor other than the glial-derived neurotrophic factor , Added to the medium and further cultured to obtain dopaminergic neurons;
The differentiation / induction method is further provided.
The standard basal medium in step (4) can be Eagle's alpha modified minimal essential medium and the serum in step (4) can be fetal bovine serum. The cyclic AMP-elevating agent or the cyclic AMP analog in the step (5) is forskolin. The concentration of the cyclic AMP-elevating agent or cyclic AMP analog in step (5) can be 0.001 nM to 100 μM, and preferably 500 nM to 50 μM.
The cell differentiation survival factor other than the glial-derived neurotrophic factor in the step (5) is a basic fibroblast growth factor (bFGF), a platelet-derived growth factor (platelet-derived growth factor). -AA (PDGF-AA)), and mixtures thereof. Preferably, the concentration of glial-derived neurotrophic factor in the step (5) is 0.001 ng / ml to 100 μg / ml, preferably 1 ng / ml to 500 ng / ml, more preferably 1 ng / ml to 100 ng. / Ml. The concentration of the cell differentiation survival factor other than the glial-derived neurotrophic factor in the step (5) is 0.001 ng / ml to 100 μg / ml, preferably 1 ng / ml to 500 ng / ml. it can.
Alternatively, the ratio of acetylcholinergic neurons can be increased by further treating the neurons induced to differentiate as described above as follows.
In another aspect of the present invention, the nerve cell is an acetylcholinergic neuron, and after the step (3), the following steps:
(4) culturing the nerve cells obtained in step (3) in a medium supplemented with serum in a standard basal medium; and
(5) Nerve growth factor (NGF), a cyclic AMP-elevating agent or a cyclic AMP analog, and / or a cell differentiation survival-acting factor other than the nerve growth factor is added to the culture medium. Added and further cultured to obtain acetylcholinergic neurons;
The differentiation / induction method is further provided.
The standard basal medium in step (4) can be Eagle's alpha modified minimal essential medium and the serum in step (4) can be fetal calf serum. The cyclic AMP-elevating agent or the cyclic AMP analog in the step (5) is forskolin. The concentration of the cyclic AMP-elevating agent or cyclic AMP analog in step (5) can be 0.001 nM to 100 μM, and preferably 500 nM to 50 μM.
In step (5), the cell differentiation survival factor other than nerve growth factor is basic fibroblast growth factor (bFGF), platelet-derived growth factor (AA). (PDGF-AA)), and mixtures thereof.
Preferably, the concentration of nerve growth factor in step (5) is 0.001 ng / ml to 100 μg / ml, preferably 1 ng / ml to 500 ng / ml, more preferably 1 ng / ml to 100 ng / ml. Can be. In the step (5), the concentration of the cell differentiation survival factor other than nerve growth factor is 0.001 ng / ml to 100 μg / ml, preferably 1 ng / ml to 500 ng / ml.
[0022]
In another aspect of the present invention, there is provided a method for differentiating and inducing bone marrow stromal cells into skeletal muscle cells in vitro, comprising the following steps:
(1) harvesting bone marrow stromal cells from the bone marrow and culturing the cells in a medium supplemented with serum in a standard basal medium;
(2) adding a demethylating agent to the culture medium and further culturing;
(3) A cyclic AMP elevating agent or a cyclic AMP analog and / or a cell differentiation survival agent is added to the culture medium and further cultured;
(4) introducing a Notch gene and / or a Notch signaling-related gene into the cell, and further culturing;
(5) co-culturing the above-introduced cells with the untreated bone marrow stromal cells to which the gene has not been introduced; and
(6) A cyclic AMP-elevating drug or a cyclic AMP analog is added to the culture medium, and further cultured to obtain skeletal muscle cells;
The differentiation / induction method is provided.
[0023]
The standard basal medium is Eagle's alpha modified minimal essential medium, and the serum can be fetal bovine serum. The demethylating agent is preferably 5-azacytidine. The concentration of 5-azacytidine may be 30 nmol / l to 300 μmol / l, and preferably 300 nmol / l to 30 μmol / l. The cyclic AMP elevating agent or the cyclic AMP analog in the step (3) may be forskolin. The concentration of the cyclic AMP elevating agent or the cyclic AMP analog in the step (3) can be 0.001 nM to 100 μM, and preferably 500 nM to 50 μM. The cell differentiation survival factor may be a basic fibroblast growth factor (bFGF), a platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA), or a heregulin trademark. ), And mixtures thereof. The concentration of the cell differentiation survival agent may be 0.001 ng / ml to 100 μg / ml, and preferably 0.5 ng / ml to 2 μg / ml.
[0024]
The introduction of the Notch gene and / or Notch signaling-related gene can be by lipofection using a mammalian expression vector. Preferably, the method may further include a step of selecting a cell into which the gene is introduced for a predetermined period between the steps (4) and (5). This selection can be a selection based on neomycin resistance by the addition of G418 sulfate. Here, it is important that this selection is performed when the finally obtained differentiated and induced skeletal muscle cells are divided into bone marrow stromal cells into which the above Notch gene and / or Notch signaling related gene is introduced. It is guaranteed that it is obtained as a result.
[0025]
The cyclic AMP elevating agent or the cyclic AMP analog in the step (5) may be forskolin. The concentration of the cyclic AMP-elevating agent or cyclic AMP analog in the step (5) can be 0.001 nM to 100 μM, and preferably 500 nM to 5 μM.
In still another aspect of the present invention, a dopaminergic neuron produced using the differentiation / induction method is provided.
In still another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for treating Parkinson's disease comprising the dopaminergic neuron.
In the present specification, the term “bone marrow stromal cell” refers to a cell other than the hematopoietic system existing in the bone marrow, and is considered to be able to differentiate into cells such as bone, cartilage, and adipocyte. Bone marrow stromal cells can be distinguished by Thy1,2 +, β1-integrin +, and CD34-.
[0026]
As used herein, the term “efficiently” in differentiation induction means that the selected bone marrow stromal cells are finally converted into nerve cells or skeletal muscle cells by the differentiation / induction method according to the present invention. This means that the percentage of In the differentiation / induction method according to the present invention, this efficiency is 50% or more, preferably 75% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more.
[0027]
In this specification, the term “neural cell” refers to a neuron, morphologically characterized by a cell body and two types of processes (dendrites and axons), and biochemistry Specifically, it reacts with an antibody against MAP-2 (Chemicon AB151), neurofilament (Boehringer Mannheim, 814342), and nestin (Bioproducts, BMS4353). In addition, neurotransmitters and synthesizing enzymes thereof such as tyrosine hydroxylase, vesicular acetylcholine transporter, neuropeptide Y (Neuropeptide Y), substance P (Substance) ) And the like.
Here, the tyrosine hydroxylase is an indicator of dopaminergic neurons, and the vesicular acetylcholine transporter is an indicator of acetylcholinergic neurons represented by motor neurons.
[0028]
In the present specification, the term “glia cells” refers to astrocytes, oligodendrocytes, microglia and epithelial cells filling between neurons and their processes in the central nerve.
Here, Gial fibrillar acidic protein (GFAP) is an indicator of astrocytes, and O4 is an indicator of oligodendrocytes.
[0029]
In the present specification, the term “skeletal muscle cell” refers to a muscle fiber or muscle fiber, and is a single muscle cell of skeletal muscle. Morphologically, it is a long, elongated, multinucleated nucleus, with myotube formation and striation, and biochemically characterized by the expression of trochanter regulatory factors such as myogenin Myf5.
[0030]
The method of differentiating and inducing bone marrow stromal cells according to the present invention into neurons or skeletal muscle cells in vitro is novel in that it includes a step of introducing a Notch gene and / or a Notch signaling-related gene into the cells. Furthermore, it is also novel in that the new steps are combined with other differentiation / induction steps of the prior art in a certain order. It can be said that the selection and the optimum combination of the above steps in the present invention have a very high significance first discovered by the present inventors. This is because bone marrow stromal cells are known to be mesenchymal stem cells or progenitor cells that can be induced to differentiate into osteoblasts, vascular endothelial cells, skeletal muscle cells, adipocytes, smooth muscle cells, etc. Even so, it is not known whether bone marrow stromal cells can actually be differentiated into neural vesicles or skeletal muscle cells, and no one has been No one succeeded in this. Although not wishing to be bound by any theory, the inventors of the present application function that resetting the development / differentiation of cells by introducing Notch genes and / or Notch signaling-related genes into the cells. , And presumed to help other differentiation and induction processes.
[0031]
The following examples further illustrate the present invention. However, it should not be construed as limiting the scope of the present invention.
[0032]
【Example】
Example 1: Neural induction
Stromal cells are collected from adult bone marrow (Wister species) bone marrow and cultured. The medium used was Medium Essential Alpha Alpha Modification (Sigma, M4526) plus 20% fetal bovine serum (Biowhittaker, 14-501F, Lot # 61-1012).
The cells were subcultured up to the fourth generation, and the Notch intracellular domain gene was introduced when 80-90% confluence was reached. This was recombined by inserting the EcoRI-XbaI fragment of the 3.1 kb Notch intracellular domain into the EcoRI-XbaI multicloning site of Promega, pCI-neo mammalian expression vector (# E1841). For introduction, a system of LipofectAMINE2000 (GibcoBRL, 11668-027) was used.
[0033]
On the next day after introduction, G418sulfate (GibcoBRL, 83-5027) was added at a concentration of 200 ng / ml, and selection of the introduced cells was performed for 10 days.
After the cell number has recovered to 90% confluence, Forskolin 5 μM (Calbiochem, 344273), basic-Fibroblast growth factor 10 ng / ml (Peprotech EC, LTD, 100-18B), ciliary neurotroph / 55 -NT) was added.
[0034]
As a result of analyzing the cells after about 10 days, as shown in FIG. 1, a characteristic morphology of the nerve cells was observed. As shown in FIG. 2, the induced cells were positive for the following antibodies, MAP-2 (Chemicon MAB364), neurofilament (Boehringer Mannheim, 814342), and nestin (Bioproducts, BMS4353). Since MAP-2 and neurofilament are markers of nerve cells and nestin is a marker of neural progenitor cells, it can be determined that the induced cells have properties as nerve cells.
[0035]
In addition, as shown in FIG. 3, neurotransmitters and their synthases, Tyrosine-hydroxylase (Chemicon AB151), Vesicular acetylcholine transporter (Chemicon AB1578), Neuropeptide Y (Pinm ulce 71), Neuropeptide Y , RPN 1572) and the like, and 2 to 4% of positive cells were found, and it was found that there are also neurons with neurotransmitters.
[0036]
Neurons are induced by the above operation. At this stage, as shown on the left side of the graph of FIG. 5, differentiation-induced neurons that respond to tyrosine hydroxylase, which is an indicator of dopaminergic neurons, 2.9 ± 0.5% of all neurons. In addition, as shown on the left side of the graph of FIG. 7, differentiation-induced nerve cells that respond to the vascular cholinergic neuron transporter, which is an index of acetylcholinergic neurons represented by motor neurons, are 1.78 of all neurons. ± 0.75%.
[0037]
  Example 2: Induction of dopaminergic neurons
  The differentiated / induced nerve cells are further cultured in the following medium. The medium is a medium obtained by adding 10% fetal calf serum (Biowhittaker, 14-501F, Lot # 61-1012) to Minimum Essential Medium Eagle Modification (Sigma, M4526), and further, glial-derived neurotrophic factor (Gial derived neurotrophic factor (GDNF; Peprotech EC LTD, human recombinant GDNF, # 450-10) 50 ng / ml, Forskolin 5 μM (Calbiochem, 344273), bass ), Platele -derived growth factor-AA 5ng / ml (Peprotech EC LTD, 396-HB) were those added.
  This manipulation dramatically increased dopaminergic neurons responding to tyrosine hydroxylase to 17.2 ± 5.1% of all neurons (see the right side of the graph in FIG. 5). As shown in the photograph of FIG. 4, after administration of GDNF, FITC (Fluorescein isothiocyanate) Dramatically increased the proportion of protein tyrosine hydroxylase that stained green.
[0038]
Example 3: Induction of acetylcholinergic neurons
The nerve cells differentiated and induced in Example 1 are further cultured in the following medium. The medium is a medium obtained by adding 10% fetal bovine serum (Biowhittaker, 14-501F, Lot # 61-1012) to Minimum Essential Medium Alpha Modification (Sigma, M4526), and further, nerve growth factor (Nerve growth factor). ) (2.5S NGF, Takara, # T002A) 50 ng / ml, Forskolin 5 [mu] M (Calbiochem, 344273), basic-Fibroblast growth factor 10 ng / ml (Peprotech EC, LTD-Pl, 100-Bt) 5 ng / ml (Peprotech EC LTD, 396 HB) were those that were added.
By this operation, acetylcholinergic neurons responding to the vascular acylcholine transporter increased dramatically to 20.5 ± 0.05% with respect to the total nerve cells (see the right side of the graph in FIG. 7). As shown in the photograph of FIG. 6, after administration of NGF (Neurotrophin (NTs)), the ratio of the protein vegetative acetate transporter stained green with FIPC increased dramatically.
[0039]
Example 4: Skeletal muscle induction
Stromal cells are collected from adult rat (Wister species) bone marrow and cultured. The medium used was Minumum Essential Medium Eagle Modification (Sigma, M4526) plus 20% fetal bovine serum (Biowhittaker, 14-501F, Lot # 61-1012).
The cells were subcultured up to the fourth generation, and when 80-90% confluence was reached, 3 μmol / l of 5-azacytidine was added and cultured for 24 hours.
Afterwards, Forskolin 5 μM (Calbiochem, 344273), basic-Fibroblast growth factor 10 ng / ml (Peprotech EC, LTD, 100-18B), Platelet-developed GrowApT 200 ng / ml (R & D Systems, 396-HB) was added to the medium and cultured for 7 days.
Thereafter, the gene of Notch intracellular domain was introduced in the same manner as in Example 1.
[0040]
On the next day after the introduction, G418 sulfate (GibcoBRL, 83-5027) was added at a concentration of 200 ng / ml, and selection of the introduced cells was performed for 10 days.
After recovering the confluence of almost 100%, the untreated bone marrow stromal cells into which the above gene was not introduced were added to the medium and co-cultured therewith.
Three days later, Forskolin (Calbiochem, 344273) 5 μM was added. Several days later, the cells fused and multinucleated skeletal muscle cells appeared locally (see FIG. 8) and increased over time (see FIG. 9). As seen in FIG. 10, multinucleated skeletal muscle cells were observed with a confocal laser microscope. In these cells, the expression of myogenin and Myf5 mRNA was confirmed by RT-PCR. Electron microscopy revealed muscle fibers characteristic of skeletal muscle.
[0041]
Example 5: Therapeutic effect by transplantation of dopaminergic neurons obtained by the differentiation / induction method according to the present invention using a rat Parkinson's disease model into a linear body
The effect of transplantation was examined by applying dopaminergic neurons obtained by the differentiation / induction method according to the present invention to a rat Parkinson model. A method for creating a Parkinson model by injecting 6-OHDA (6-hydroxydopamine) into the substantia nigra of the rat brain has already been established, and this model was also used this time (see, for example, Svendsen et al., Exp. Neurol. 137: 376-388 (1996); Svensen et al., Exp. Neurol. 148, 135-146 (1997)). In this model, it is known that administration of apomorphine causes the rat to rotate, suggesting that worsening of the symptoms is indicated by an increase in the number of revolutions, and improvement is indicated by a decrease in the number.
As shown in the upper part of FIG. 11, in the observation period of 9 weeks, when only the nerve cell-induced one was transplanted into the linear body, the number of rotations was almost the same as that immediately after the transplantation. When no treatment is performed, the rotational speed tends to increase steadily (not shown). Therefore, it can be said that leveling off at least prevents deterioration.
As shown in the lower part of FIG. 11, when dopaminergic induction was transplanted into a linear body, the number of rotations began to decrease from the first week of transplantation, and about half of the animals had the number of rotations after 9 weeks. Was found to be zero, or a very significant improvement of 1 to 2 times. (Note that the two cases exceeding 8 revolutions / minute after 9 weeks shown in the lower part of FIG. 11 were excluded from the evaluation because it is considered that the transplantation operation failed.)
In order to examine what kind of cells the dopaminergic neuron according to the present invention injected (transplanted) into the linear body differentiated, the above-mentioned linear body tissue was collected after 10 weeks and a section was prepared. Then, immunohistochemical examination was performed.
Bone marrow stromal cells incorporate a gene that produces green fluorescent protein (GFP) that emits green fluorescence into its chromosome by retrovirus. Therefore, in the immunofluorescence picture in FIG. 12, the nerve cells differentiated from bone marrow stromal cells, and hence the dopaminergic neurons transplanted into the striatum, emit green fluorescence.
On the other hand, with neurofilament as an index, dopaminergic neuron as a tyrosine hydroxylase as an index, astrocytes that are glial cells as GFAP, and oligodendrocytes that are also glial cells as O4 as an index, Each was colored red.
Therefore, if the green color by the GFP and the color development by the red color overlap, the color develops to yellow, which indicates which cells the transplanted dopaminergic neurons have become 10 weeks after transplantation. It will be.
As seen in FIG. 12, in the linear body 10 weeks after the transplantation, almost all of the transplanted cells were nerve cells and not glial cells. In addition, since there are a considerable number of tyrosine hydroxylase-positive neurons (ie, dopaminergic neurons), the ratio of dopaminergic neurons to all neurons is determined by the differentiation / induction method according to the present invention in vitro. However, it can be seen that this ratio could be further increased by the transplantation.
FIG. 13 shows an enlarged view of an immunofluorescence photograph in which tyrosine hydroxylase is colored. In FIG. 13, the cell nucleus was stained in blue regardless of the cell type (Counter stain). The position of the nucleus represented in blue indicates the position of the cell.
Based on the above, it was found that in the Parkinson's disease model of rats, the symptoms of Parkinson's disease were dramatically improved by transplanting dopaminergic neurons obtained by the differentiation / induction method according to the present invention into a linear body. It was.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a photomicrograph (phase contrast micrograph) of a nerve cell differentiated and induced according to the present invention instead of a drawing.
FIG. 2 is an immunofluorescence photograph instead of a drawing showing a positive reaction of a neural cell differentiated and induced according to the present invention to MAP-2 antibody, neurofilament antibody, and nestin antibody.
FIG. 3 shows neurotransmitters and their synthesizing enzymes, Tyrosine-hydroxylase (TH), Vesicular acetate transporter (VAChT), Neuropeptide Y (NPY), and Substance P (SP), which are differentiated and induced according to the present invention. 2 is an immunofluorescent photograph replacing the drawing, showing the reaction of Glutamine (Glu), Calcitonin Gene Related Peptide (CGRP), and Vasoactive intestinal peptide (VIP) to the antibody.
FIG. 4 is an immunofluorescence photograph replacing a drawing showing changes in tyrosine hydroxylase positive rate (differentiation / induction rate of dopaminergic neurons) before and after GDNF addition of nerve cells differentiated and induced according to the present invention. .
FIG. 5 is a graph showing a change in tyrosine hydroxylase positive rate (dopaminergic neuron differentiation / induction rate) before and after GDNF addition treatment of nerve cells differentiated / induced according to the present invention.
FIG. 6 is a graph showing changes in the positive rate of vascular cholinergic neuron transporter (acetylcholinergic neuron differentiation / induction rate) before and after the addition of Neurotrophin (NTs; 2.5S NGF) to neurons differentiated and induced according to the present invention. It is an immunofluorescence photograph replaced with.
FIG. 7 is a graph showing a change in positive positive rate (acetylcholinergic neuron differentiation / induction rate) of neuronal cells differentiated / induced according to the present invention before and after addition of Neurotrophin (NTs; 2.5S NGF). It is.
FIG. 8 is a photomicrograph (phase contrast micrograph) of a skeletal muscle cell differentiated and induced according to the present invention instead of a drawing.
FIG. 9 is a photomicrograph (phase contrast micrograph) of a skeletal muscle cell differentiated and induced according to the present invention instead of a drawing. It shows that the skeletal muscle shown in FIG. 8 increased with time.
FIG. 10 shows a confocal laser micrograph of a photomicrograph in place of a drawing showing that the skeletal muscle cells differentiated and induced according to the present invention are multinucleated. Nuclei are shown in green, and actin fibers are shown in red.
FIG. 11 is a graph showing the therapeutic effect of dopaminergic neurons obtained by the differentiation / induction method according to the present invention using a rat Parkinson's disease model by transplantation into a linear body.
FIG. 12 is an immunofluorescence photograph instead of a drawing showing that cells transplanted into a linear body are not glial cells but neurons and dopaminergic neurons.
FIG. 13 is an enlarged immunofluorescence photograph replacing the drawing, showing that cells transplanted into the striatum are neurons and dopaminergic neurons.

Claims

A method for differentiating and inducing bone marrow stromal cells into neurons in vitro, comprising the following steps:
(1) culturing bone marrow stromal cells isolated from bone marrow in medium supplemented with serum in standard basal medium;
(2) introducing Notch intracellular domain genes into the cells and further culturing; and (3) Forskolin and / or basic-fibroblast growth factor (bFGF) )), A ciliary neurotrophic factor (CNTF), and a cell differentiation / surviving factor selected from the group consisting of the mixture thereof is added to the culture medium, and the cells are further cultured to obtain;
Wherein the finally obtained differentiated and induced cells are obtained as a result of cell division of the bone marrow stromal cells into which the above Notch intracellular domain gene has been introduced.・ Guidance method.

2. The method of claim 1 , wherein the standard basal medium is Eagle's alpha modified minimal essential medium.

The method of claim 1 , wherein the serum is fetal bovine serum.

The method according to claim 1 , wherein the introduction of the gene of the Notch intracellular domain is by lipofection using a mammalian expression vector.

During said step (2) and (3), further comprising the step of selecting the cells that the gene has been introduced a predetermined period, the method according to claim 1.

The method of claim 1 , wherein the forskolin concentration is 0.001 nM to 100 μM.

The method according to claim 1 , wherein the concentration of the cell differentiation survival factor is 0.001 ng / ml to 100 μg / ml.

The method according to any one of claims 1 to 7 , wherein the isolated bone marrow stromal cells are human cells.

Neural cells prepared by the method according to any one of claims 1 to 7.

A nerve cell produced by the method according to claim 8 .

A method for differentiating and inducing bone marrow stromal cells into dopaminergic neurons in vitro, comprising the following steps:
(1) culturing bone marrow stromal cells isolated from bone marrow in medium supplemented with serum in standard basal medium;
(2) introducing the Notch intracellular domain gene into the cells and further culturing;
(3) Forskolin , and / or basic fibroblast growth factor (bFGF), platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA), and A cell differentiation survival agent selected from the group consisting of a mixture thereof is added to the culture medium, and further cultured to obtain nerve cells;
(4) Nerve cells obtained in step (3) are cultured in a medium obtained by adding serum to a standard basal medium; and (5) Glial derived neurotrophic factor (GDNF), And / or forskolin and / or basic fibroblast growth factor (bFGF), platelet-derived growth factor-AA (PDGF) other than the glial-derived neurotrophic factor -AA)), and a cell differentiation survival agent selected from the group consisting of the mixture thereof is added to the culture medium and further cultured to obtain dopaminergic neurons;
Here, the finally obtained differentiated and induced dopaminergic neurons were obtained as a result of cell division of the bone marrow stromal cells into which the genes of the Notch intracellular domain were introduced. The differentiation / induction method.

The differentiation / induction method according to claim 11 , wherein the standard basal medium in step (4) is Eagle's alpha-modified minimum essential medium.

The method according to claim 11 , wherein the serum in step (4) is fetal bovine serum.

The method according to claim 11 , wherein the concentration of forskolin in step (5) is 0.001 nM to 100 μM.

The method according to claim 11 , wherein the concentration of glial-derived neurotrophic factor in the step (5) is 0.001 ng / ml to 100 μg / ml.

The method according to claim 15 , wherein the concentration of glial-derived neurotrophic factor in the step (5) is 1 ng / ml to 100 ng / ml.

The method according to claim 11 , wherein the concentration of the cell differentiation survival factor other than the glial-derived neurotrophic factor in the step (5) is 0.001 ng / ml to 100 µg / ml.

The method according to any one of claims 11 to 17 , wherein the isolated bone marrow stromal cells are human cells.

It claims 11-17 dopaminergic neurons produced by the method according to any one of.

A dopaminergic neuron produced by the method of claim 18 .

A method for differentiating and inducing bone marrow stromal cells into acetylcholinergic neurons in vitro, comprising the following steps:
(1) culturing bone marrow stromal cells isolated from bone marrow in medium supplemented with serum in standard basal medium;
(2) introducing the Notch intracellular domain gene into the cells and further culturing;
(3) Forskolin , and / or basic fibroblast growth factor (bFGF), platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA), and A cell differentiation survival agent selected from the group consisting of a mixture thereof is added to the culture medium, and further cultured to obtain nerve cells;
(4) Nerve cells obtained in step (3) are cultured in a medium supplemented with serum in a standard basal medium; and (5) Nerve growth factor (NGF), and forskolin (Forskolin) and / or basic fibroblast growth factor other than the above nerve growth factor (basic-Fibroblast growth factor (bFGF)), platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA)), And a cell differentiation survival factor selected from the group consisting of and mixtures thereof , is added to the culture medium and further cultured to obtain acetylcholinergic neurons;
Here, the finally obtained differentiated and induced acetylcholinergic neurons were obtained as a result of cell division of the bone marrow stromal cells into which the above Notch intracellular domain gene was introduced. The differentiation / induction method.

The method of claim 21 , wherein the standard basal medium in step (4) is Eagle's alpha modified minimal essential medium.

The method according to claim 21 , wherein the serum in step (4) is fetal bovine serum.

The method according to claim 21 , wherein the concentration of forskolin in the step (5) is 0.001 nM to 100 µM.

The method according to claim 21 , wherein the concentration of nerve growth factor in the step (5) is 0.001 ng / ml to 100 μg / ml.

The method according to claim 25 , wherein the concentration of nerve growth factor in the step (5) is 1 ng / ml to 100 ng / ml.

The method according to claim 21 , wherein the concentration of the cell differentiation survival factor other than nerve growth factor in the step (5) is 0.001 ng / ml to 100 µg / ml.

28. A method according to any one of claims 21 to 27 , wherein the isolated bone marrow stromal cells are human cells.

An acetylcholinergic neuron produced by the method according to any one of claims 21 to 27 .

An acetylcholinergic neuron produced by the method of claim 28 .

A method for differentiating and inducing bone marrow stromal cells into skeletal muscle cells in vitro, comprising the following steps:
(1) culturing bone marrow stromal cells isolated from bone marrow in medium supplemented with serum in standard basal medium;
(2) adding 5-azacytidine to the culture and further culturing;
(3) Forskolin and / or basic-fibroblast growth factor (bFGF), platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA), heregulin (Heregulin), and a cell differentiation survival agent selected from the group consisting of a mixture thereof , is added to the culture medium, and further cultured;
(4) introducing Notch intracellular domain genes into the cells and further culturing;
(5) co-culturing the gene-introduced cell and the untreated bone marrow stromal cell to which no gene has been introduced; and (6) adding Forskolin to the culture medium; and Further culture to obtain skeletal muscle cells;
Wherein the finally obtained differentiated / derived cells are obtained as a result of cell division of the bone marrow stromal cells into which the gene of the above Notch intracellular domain has been introduced, Differentiation and induction methods.

32. The method of claim 31 , wherein the standard basal medium is Eagle's alpha modified minimal essential medium.

32. The method of claim 31 , wherein the serum is fetal bovine serum.

32. The method of claim 31 , wherein the concentration of 5-azacytidine is from 30 nmol / l to 300 [mu] mol / l.

32. The method according to claim 31 , wherein the forskolin concentration in step (3) is 0.001 nM to 100 [mu] M.

32. The method according to claim 31 , wherein the concentration of the cell differentiation survival agent is 0.001 ng / ml to 100 μg / ml.

The method according to claim 31 , wherein the introduction of the gene of the Notch intracellular domain is by lipofection using a mammalian expression vector.

The method according to claim 31 , further comprising a step of performing selection of a cell into which the gene has been introduced for a predetermined period between the steps (4) and (5).

32. The method according to claim 31 , wherein the concentration of forskolin in step (5) is 0.001 nM to 100 [mu] M.

40. The method of any one of claims 31 to 39 , wherein the isolated bone marrow stromal cells are human cells.

Skeletal muscle cells produced by the method according to any one of claims 31-39.

The skeletal muscle cell manufactured by the method of Claim 40 .

A method for inducing neural progenitor cells in vitro from bone marrow stromal cells comprising the following steps:
(1) culturing bone marrow stromal cells isolated from bone marrow in medium supplemented with serum in standard basal medium; and
(2) Introducing a Notch intracellular domain gene into the cells and further culturing to obtain neural progenitor cells;
Wherein the obtained neural progenitor cell is obtained as a result of cell division of the bone marrow stromal cell into which the above Notch intracellular domain gene has been introduced .

44. The method of claim 43, wherein the isolated bone marrow stromal cells are human cells.

45. A neural progenitor cell obtained by the method according to claim 43 or 44.