JP3958502B2

JP3958502B2 - Novel polysaccharides that induce apoptosis and uses thereof

Info

Publication number: JP3958502B2
Application number: JP2000204404A
Authority: JP
Inventors: 啓臣舟橋; 靖一田沼; 健北島; あけみ早川; 智之山田
Original assignee: APION JAPAN CO., LTD.
Current assignee: APION JAPAN CO., LTD.
Priority date: 2000-07-05
Filing date: 2000-07-05
Publication date: 2007-08-15
Anticipated expiration: 2020-07-05
Also published as: JP2002020403A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌細胞などの生体にとって望ましくない異常細胞に対して選択的にアポトーシスを誘導し得る新規多糖（以下、単に「アポトーシス誘導性多糖」という場合もある）、当該多糖を含有する海藻水抽出物のフラクション、それらを有効成分とする医薬組成物、特にアポトーシス誘導が有効な疾患（例えば、癌、大腸ポリポーシス、リウマチなどの自己免疫疾患、ウイルス感染症等）の予防および治療用医薬組成物に関する。本発明はまた、上記多糖または多糖含有組成物を含んでなる健康食品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アポトーシス（apoptosis）とよばれる遺伝子に制御された細胞死は、高等動物の個体発生における形態変化や神経系のネットワークの確立、成熟個体の内分泌系における恒常性の維持、免疫系の多様性と特異性の確立などの基本的な生命現象に、重要な役割を果たしている。アポトーシスは、このような生理的な現象のみならず、癌、ＡＩＤＳ等のウイルス感染症、アルツハイマー病等の神経疾患、慢性関節リウマチ等の自己免疫疾患など、様々な病態の発症に深く関わっていることが次第に明らかになってきている。このようなアポトーシスが関与する疾患に対して、その病原細胞に選択的にアポトーシスを誘導し、且つ正常細胞に対して毒性をほとんど持たない化合物の探索が盛んに行われており、実際に、いくつかの有望な化合物がスクリーニングされている。しかしながら、そのような化合物による治療法および予防法の確立にまでは結びついていないのが現状である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、癌細胞やウイルス感染細胞などの病原細胞に対して選択的なアポトーシス誘導能を有し、且つ生体に対する安全域の広い新規化合物を、天然物の中からスクリーニングし、当該化合物を用いて、上記の病原細胞により引き起こされる各種疾患の有効且つ安全な予防および治療のための医薬品を提供することである。また、本発明の他の目的は、該新規化合物を含んでなる健康食品を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、アポトーシスを人為的に制御する研究の中で、アポトーシスの誘導活性があり、且つほとんど毒性のない化合物の探索を広く天然物から進めてきた。この分野の研究の成果により、天然多糖類の特殊な構造体にアポトーシス誘導能があることが明らかになってきている。本発明において、本発明者らは、メカブ、コンブ、モズク、フノリ等の海藻に着目し、これら海藻の中から、目的とするアポトーシス誘導能を有する多糖類の取得を試みた。その結果、海藻の水抽出液中に、癌細胞等のアポトーシスが関与する疾患の病原細胞に対して、選択的にアポトーシスを誘導する物質が存在することを見出した。次いで、本発明者らは、本物質を限外濾過法により分画精製し、構造解析を行なって、その有効成分が従来公知の多糖とは構成糖組成の異なる新規な多糖であることを明らかにした。さらに、本発明者らは、該新規多糖は、担癌動物実験において、インビボでも癌細胞に選択的にアポトーシスを誘導し、抗腫瘍効果を発揮し得ることを確認して、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、海藻の水抽出液を分子量の差に基づいて分画することにより得られる１以上の画分であって、生体にとって望ましくない異常細胞に対して選択的にアポトーシスを誘発する多糖を含有することを特徴とする組成物を提供する。好ましい実施態様においては、該組成物は分子量５，０００〜１００，０００の画分であり、より好ましくは分子量５０，０００〜１００，０００の画分である。かかるフラクション中には、以下の糖組成：
(1) ガラクトース、フコース、マンノースのモル比が１：０．４±０．１：０．３±０．０５で構成される
(2) グルクロン酸をガラクトース１に対して０．６〜１．０のモル比で含有するを有する本発明のアポトーシス誘導性多糖が含まれる。
【０００６】
本発明のアポトーシス誘導性多糖および該多糖を含有する海藻由来組成物は、生体にとって望ましくない異常細胞に対して選択的にアポトーシスを誘発し得るので、これらの細胞により引き起こされる疾患の予防および治療に有効である。したがって、本発明はまた、医薬上有効な量のアポトーシス誘導性多糖または該多糖を含有する海藻由来組成物を含んでなる、癌、自己免疫疾患、神経疾患、ウイルス感染症、放射線被曝障害等の疾患の予防および治療用医薬組成物を提供する。
【０００７】
本発明のアポトーシス誘導性多糖および該多糖を含有する海藻由来組成物は、食用となり得る海藻からの抽出物およびその分画精製物、あるいはそれらの同等物であることから、安全に食用として利用することができ、日常的に経口摂取することにより、上記疾患の予防効果を達成することができる。したがって、本発明はまた、本発明のアポトーシス誘導性多糖または該多糖を含有する海藻由来組成物を含んでなる食用品を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の「アポトーシス誘導性多糖」は、生体にとって望ましくない異常細胞に対して選択的にアポトーシスを誘発することができ、且つ以下の性質：
(1) 分子量：５，０００〜１００，０００
(2) ガラクトース、フコース、マンノースのモル比が１：０．４±０．１：０．３±０．０５で構成される
(3) グルクロン酸をガラクトース１に対して０．６〜１．０のモル比で含有するを有するものであれば特に制限はないが、好ましくは、以下の性質：
(4) 一定条件下（条件の詳細は後記実施例５に記載する）でのガスクロマトグラフィーにおいて、保持時間１１．９分および１３．１分にピークを示し、前者に対応する物質をガラクトース１に対して２００±５０、後者に対応する物質をガラクトース１に対して１０±５のモル比で含有する
(5) 中性糖１に対して硫酸基を０．９〜１．５のモル比で含有する
をさらに有するものである。
【０００９】
本発明の「アポトーシス誘導性多糖」はいかなる由来のものであってもよいが、例えば、海藻、好ましくは紅藻類または褐藻類に属する海藻、より好ましくはチガイソ科、コンブ科、モズク科、フノリ科等に属する海藻、特に好ましくはワカメ、最も好ましくはメカブ（ワカメの岩に着生した根付近に葉が厚く短いひだ状に集まった部位）由来のものが挙げられる。
【００１０】
本発明において「生体にとって望ましくない異常細胞」とは、アポトーシスが発症あるいはその抑制に深く関与する疾患の病原となる異常細胞をいい、例えば、癌における癌細胞、自己免疫疾患における自己反応性細胞、ウイルス感染症におけるウイルス感染細胞、神経疾患における異常神経細胞、放射線被曝障害における放射線被曝細胞等が挙げられる。好ましくは「生体にとって望ましくない異常細胞」は癌細胞であり、より好ましくは乳癌細胞やグリオーマ細胞等である。
【００１１】
より好ましくは、本発明のアポトーシス誘導性多糖は、分子量５０，０００〜１００，０００のものである。
【００１２】
本発明のアポトーシス誘導性多糖は、例えばワカメ（特にメカブ）、コンブ、モズク、フノリ等の海藻を原料とした場合、以下の方法により調製することができる。
まず、乾燥した海藻を粉砕器等を用いて細かく粉砕し、該粉砕物に適当量の水を加えて十分混合した後、４〜３０℃、好ましくは４〜１０℃で１５〜２５時間静置して抽出を行う。遠心分離等により沈殿物を除去した後、上清を１００〜０．４５μｍのナイロンメッシュまたは濾紙等に（必要に応じて徐々に孔径を小さくしながら）１ないし数回通す。得られた濾液を限外濾過に供し、例えば、分子量１０万以上、１０万〜５万、５万〜５，０００および５，０００以下の各フラクションに分画することにより、上述の分子量および糖組成を有するアポトーシス誘導性多糖を得ることができる。得られたフラクションは、用途に応じて原液のまま、希釈もしくは濃縮して、あるいは乾燥もしくは凍結乾燥して使用および保存することができる。
【００１３】
本発明はまた、海藻の水抽出液を分子量の差に基づいて分画することにより得られる１以上の画分であって、生体にとって望ましくない異常細胞に対して選択的にアポトーシスを誘発する多糖を含有することを特徴とする組成物を提供する。すなわち、上記のような方法で得られる海藻水抽出液の分画精製物は、本発明のアポトーシス誘導性多糖を含有する分子量１０万〜５万および５万〜５，０００のフラクションだけでなく、分子量１０万以上のフラクションや分子量５，０００以下のフラクションも、アポトーシス誘導能を有している。分子量１０万以上のフラクションに含有される多糖の糖組成は、未分離の海藻水抽出液中の糖組成に近似し、海藻多糖の中で最も多く存在すると考えられる。一方、分子量５，０００以下のフラクションに含有される多糖の糖組成は、分子量５万〜５，０００のフラクションに含有される多糖の糖組成に近似する。尚、本発明において「多糖」とは、単糖類（糖アルコールやウロン酸等の誘導体を含む）が１０分子以上脱水結合して生じた糖質をいう。したがって、本発明の「海藻水抽出物由来のアポトーシス誘導性多糖含有組成物」は、上に定義される多糖を少なくとも含有する程度の分子量を包含するフラクションでなければならない。
【００１４】
本発明の「海藻水抽出物由来のアポトーシス誘導性多糖含有組成物」は、いかなる海藻由来であってもよいが、好ましくは紅藻類または褐藻類に属する海藻、より好ましくはチガイソ科、コンブ科、モズク科、フノリ科等に属する海藻、特に好ましくはワカメ、最も好ましくはメカブ由来のものである。
【００１５】
本発明の「海藻水抽出物由来のアポトーシス誘導性多糖含有組成物」は、好ましくは本発明のアポトーシス誘導性多糖を含有するフラクション由来のもの、したがって、分子量５，０００〜１００，０００、より好ましくは分子量５０，０００〜１００，０００のフラクション由来のものである。
【００１６】
本発明はまた、本発明の「アポトーシス誘導性多糖」または本発明の「海藻水抽出物由来のアポトーシス誘導性多糖含有組成物」を、医薬上有効な量含有する医薬組成物を提供する。本発明の「アポトーシス誘導性多糖」または本発明の「海藻水抽出物由来のアポトーシス誘導性多糖含有組成物」は、生体にとって望ましくない異常細胞に対して選択的にアポトーシスを誘発することができるので、当該医薬組成物は、該異常細胞によって引き起こされる疾患の予防および治療用として使用することができる。そのような疾患としては、例えば、乳癌やグリオーマ等の癌、白血病、大腸ポリポーシス、全身性エリテマトーデスや慢性関節リウマチ等の自己免疫疾患、潰瘍性大腸炎やシェーグレン症候群などの炎症性疾患、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症候群、筋萎縮性側索硬化症等の神経疾患、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、アデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、パポバウイルス等のウイルス感染症、数Ｇｙ以上の放射線照射による被曝障害等が挙げられる。好ましくは癌、特に乳癌、グリオーマ等の癌の予防および治療用医薬組成物である。
【００１７】
本発明の「アポトーシス誘導性多糖」または本発明の「海藻水抽出物由来のアポトーシス誘導性多糖含有組成物」は、必要に応じて医薬上許容される担体（例えば、賦形剤、希釈剤等）などの必要な成分と適宜混合し、液状製剤、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、エアロゾル剤等の剤形で製剤化することができ、経口的または非経口的に投与することができる。
【００１８】
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリジン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００１９】
好ましくは、本発明の製剤は経口用または注射用製剤である。経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に、有効量の「アポトーシス誘導性多糖」または「海藻水抽出物由来のアポトーシス誘導性多糖含有組成物」を溶解させた液剤、有効量の該物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の該物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の該物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【００２０】
非経口的な投与に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、肥厚剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。本発明の製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効量の「アポトーシス誘導性多糖」または「海藻水抽出物由来のアポトーシス誘導性多糖含有組成物」および医薬上許容される担体を凍結乾燥（フリーズドライ）し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００２１】
本発明の医薬組成物の投与量は、有効成分であるアポトーシス誘導性多糖の有効量、該物質の細胞毒性、病気の種類、病気の進行度、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、例えば経口投与の場合、通常、有効成分である多糖の量として１〜１，０００ｍｇ／ｋｇ体重であり、この量を１日１回または数回に分けて投与することができる。
【００２２】
本発明の「アポトーシス誘導性多糖」および「海藻水抽出物由来のアポトーシス誘導性多糖含有組成物」は、食用として従来より安全に摂取されているものもしくはその同等物であるから、投与量に比べてＬＤ₅₀値が極めて高く、安全域の広い物質である（ここで「同等物」とは、食用以外の海藻もしくは海藻以外の原料から得られるが、物質として食用の海藻から得られるものと実質的に同一のものをいう）。したがって、本発明の「アポトーシス誘導性多糖」および「海藻水抽出物由来のアポトーシス誘導性多糖含有組成物」は、医薬としての使用のみならず、単独で、また許容される食品添加物とともに、健康食品等の食用品としても利用することができる。許容される食品添加物としては、通常使用される防腐剤、着色料、香料、安定剤等が挙げられる。また、糖分、蛋白質、脂質、アミノ酸、ビタミン類、鉄分、カルシウム、マグネシウム、食物繊維等の他の栄養素等と混合して多機能性栄養食品とすることもできる。
【００２３】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００２４】
実施例１メカブ水抽出物凍結乾燥粉末（メカブ多糖）の調製
メカブ（三陸産乾燥メカブ）をブレンダー粉砕器を用いて、１５，０００回転／分で１分間粉砕し、メカブパウダーを得た。次に、メカブパウダー１０ｇに対して水１Ｌを加え、十分に混合した後４℃で２４時間静置した。高速遠心（３，０００ｒｐｍ，５分間）により沈殿物を除去し、上清を回収した。その溶液をナイロンメッシュ７０μｍおよび４５μｍに各１回づつ通した。さらにWhatman GD/X（０．４５μｍ）フィルターに１回通した後、限外濾過法により分子量１０万以下のフラクションを集め、凍結乾燥により粉末（メカブ多糖）にした。
【００２５】
実施例２メカブ多糖の癌細胞培養株に対するアポトーシス誘導活性
９，１０−ジメチルベンズアントラセン（ＤＭＢＡ）誘発ラット乳癌細胞培養株を６０ｍｍシャーレに５×１０⁵細胞／ｍｌになるように蒔き、ＣＯ₂−インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ₂−９５％大気雰囲気下で一晩培養した後、上記メカブ多糖を種々の濃度で培地に添加し、さらに培養を行った。培地中に浮遊した細胞を回収し、シャーレ面に接着している残りの細胞をトリプシン/ＥＤＴＡ処理により回収して合わせた。回収した細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、ＲＮａｓｅ（１ｍｇ／ｍｌ）４０μｌ／サンプルで３７℃、４０分間処理した。ＰＢＳ（−）で２回洗浄して、ヨウ化プロピジウム（２５μg／ｍｌ）１００μｌ／サンプルで遮光氷上３０分間染色した。７０μｍナイロンメッシュに１回通し、フローサイトメーター（Bechman Coulter E picsXL-2）で細胞のＤＮＡ断片化率を定量し評価した。結果を表１に示す。
【００２６】
【表１】

【００２７】
メカブ多糖は、濃度および時間依存的にラット乳癌細胞株に対してアポトーシスを誘発する能力を有することがわかった。
【００２８】
実施例３メカブ多糖のアポトーシス誘導能の細胞選択性
２種のヒト乳癌細胞培養株（Ｔ４７ＤおよびＭＤＡ−ＭＢ２３１）および正常ヒト乳腺細胞株（ＭＣＦ−１０Ａ）に対するメカブ多糖（０．４８ｍｇ／ｍｌ）のアポトーシス誘導能を、実施例２と同様にして調べた。結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】

【００３０】
メカブ多糖は乳癌細胞にアポトーシスを誘発するが、正常乳腺細胞にはアポトーシス誘導能を示さないことがわかった。
【００３１】
実施例４メカブ多糖と５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のアポトーシス誘導能の比較
メカブ多糖（０．４８ｍｇ／ｍｌ）と、ヒト乳癌の治療に最も多用されている５−ＦＵ（２および２０μｇ／ｍｌ）の、ヒト乳癌細胞培養株（Ｔ４７Ｄ）に対するアポトーシス誘導能を比較検討した。結果を表３に示す。
【００３２】
【表３】

【００３３】
それぞれの最適濃度範囲で比較した結果、メカブ多糖は、５−ＦＵよりやや強いアポトーシス能を有することがわかった。５−ＦＵは細胞毒性が強く、これ以上の濃度では実質上使用できない。
【００３４】
実施例５メカブ多糖の限外濾過法による分画と分画精製物の糖組成分析
メカブ多糖溶液を限外濾過法により分子量１０万以上（Ｉ）、１０〜５万（II）、５〜０．５万（III）、および０．５万以下（IV）とした。対照として未分離メカブ多糖および同メカブから抽出したフコイダンを用い、各分画精製物の糖組成の比較分析を行った。各画分をエタノールで晶析したものを基準水に溶解し、サンプルとした。構成糖の分析は、Reinholdの方法［Reinhold, V. N. (1972) Methods in Enzymolozy, 25B, 244-249］に従ってガスクロマトグラフィーにより定量した。ガスクロマトグラフィーの条件は下記の通りである。
【００３５】
ガスクロマトグラフ装置：島津GC14A
カラム：キャピラリーカラム（島津CBJ15, 0.32 mm × 30 mm）
昇温条件：開始温度１８０℃から５℃／分で２５０℃まで昇温
キャリアガス：窒素ガス
検出器：水素炎イオン検出器
定量：島津インテグレーターC-R6Aクロマトパック
【００３６】
中性糖の定量はフェノール硫酸法［Dubois, M., Gilles, K. A. et al. (1956) Anal. Chem., 28, 350］に従ってガラクトースを標準にして定量した。硫酸基の定量については、コンドロイチン硫酸Ｃを標準物質として、ロジソン酸法［Terho, T. T. and Hartiala, K. (1971) Anal. Biochem., 41, 471］で定量した。結果を表４および５に示す。
【００３７】
【表４】

【００３８】
【表５】

【００３９】
中性糖としては、フコース、ガラクトース、マンノースが含まれる。未分離ではガラクトースを標準（１．０）とすると、フコースとマンノースの比は１：０．６であるが、画分II、III、IVでのそれはいずれも、０．４±０．１：０．３±０．０５である。グルクロン酸のモル比は、未分画ではガラクトース１に対して０．１であるのに対し、画分II、III、IVではいずれも１〜０．６と含有率が高くなる。画分II、III、IVに含有率の高い未同定ピークＸ、Ｙが存在した。ガスクロマトグラフィーでの保持時間（Ｘ：１１．９分，Ｙ：１３．１分）から、これらはマンニトール様およびイノシトール様の糖アルコールである可能性が高い。したがって、本多糖の糖組成はメカブフコイダンとは異なるものである。
【００４０】
一方、フコイダンの特徴である硫酸（基）の含量は、画分II、III、IVではいずれもフコイダンの約１／５０程度で非常に低く、やはりメカブフコイダンとは特徴的に異なるものである。メカブ多糖の中性糖に対する硫酸基のモル比は、未分離および画分II、III、IVとも約１（０．９〜１．５）であるのに対し、メカブフコイダンでは約２である。
【００４１】
実施例６メカブ多糖の各画分のアポトーシス誘導活性
サンプルの濃度は０．４８ｍｇ／ｍｌ、処理時間は９６時間とし、実施例２と同様の方法で、ヒト乳癌培養細胞株（Ｔ４７Ｄ，ＭＤＡ−ＭＢ２３１，ＭＣＦ−７）に対するアポトーシス誘導能を評価した。結果を図１に示す。アポトーシス誘導能はいずれの画分にもみられるが、未分離よりも分子量１０万以下の画分に高いアポトーシス誘導活性が回収され、とくに分子量１０〜５万の画分IIが未分離に比べ約１．５倍の高い効果を示した。
【００４２】
実施例７インビボでのメカブ多糖の発癌抑制効果
８週齢のSprague-Danley系ラット４８匹に、オリーブオイルで溶解したＤＭＢＡを２０ｍｇ／個体／１ｍｌオリーブオイルで１回胃内投与し、１週間後に全体を任意に４群（ｎ＝１２）に分けた。メカブ多糖を４００ｍｌの給水瓶に入れ、原液（６ｍｇ／ｍｌ）摂取群（Ｍ−Ａ）、２倍希釈液（３ｍｇ／ｍｌ）摂取群（Ｍ−Ｂ）、４倍希釈液（１．５ｍｇ／ｍｌ）摂取群（Ｍ−Ｃ）、コントロール群（ｃｏｎｔ）として水を用い、経口的に自由量摂取（投与）を行った。給水瓶は２日おきに洗浄、交換し、その都度摂取量を測定し、１週間毎の摂取量を計算した。ＤＭＢＡ投与後３２週間にわたって毎週各ラットの体重変化、触診による乳癌の発生した腫瘍数、すべての腫瘍径を測定した。３２週目の実験終了時に、採血、全乳腺腫瘍の摘出、各種臓器の摘出を行い、乳腺腫瘍の重量および直径を測定した。
【００４３】
その結果を図２〜６に示す。各群とも体重変化、摂取量には差は認められずメカブ多糖の長期摂取の安全性が示唆される。コントロール群がＤＭＢＡ投与後１３週目で乳癌発生率１００％となったのに対して、Ｍ−Ａ群は２３週目で１００％、Ｍ−Ｂ群は実験終了時の３２週目で８３．３％、Ｍ−Ｃ群は３２週目で２５％と、いずれもコントロール群と比較して有意に高い発癌抑制効果が認められた（図２）。また、乳腺腫瘍発生個数の比較では、実験終了時の３２週目の比較でコントロール群が平均７．２個であるのに対して、Ｍ−Ａ、Ｍ−Ｂ、Ｍ−Ｃ群ではそれぞれ２．２、１．１、０．３個と有意に乳腺腫瘍発生個数の抑制効果が認められた（図３）。以上の結果より、メカブ多糖にはＤＭＢＡ誘発乳癌ラット実験系において乳癌の発生および乳癌の増殖を抑制する効果があることが判明した。
【００４４】
実施例８製剤例
実施例５で得られたメカブ水抽出液の画分II（分子量１０万〜５万）を乾燥して粉末化した後、該乾燥粉末１０００ｇに対して乳糖２００ｇを加えて混合し、水１５〜２０％を加えて練合した。この練合物を造粒機にかけて顆粒とした後、乾燥、打錠した。
【００４５】
実施例９食品製造例（１）メカブ飴の製造
実施例５で得られたメカブ水抽出液の画分II（分子量１０万〜５万）を乾燥して粉末化した後、常法を用いて、表６記載の組成を有するメカブ飴を製造した。
【００４６】
【表６】

【００４７】
実施例１０食品製造例（２）メカブ栄養カプセルの製造
実施例１と同様にして得られたメカブ水抽出液（但し、限外濾過は行わない）を乾燥して粉末化した後、表７記載の組成を有するカプセル（表８記載のゼラチン配合処方による涙型軟カプセル）を製造した。
【００４８】
【表７】

【００４９】
【表８】

【００５０】
【発明の効果】
本発明のアポトーシス誘導性多糖および海藻水抽出物由来のアポトーシス誘導性多糖含有組成物は、生体にとって望ましくない異常細胞に対して選択的にアポトーシスを誘発し得るので、これらの細胞により引き起こされる疾患の予防および治療に有効である。また、当該アポトーシス誘導性多糖および海藻水抽出物由来のアポトーシス誘導性多糖含有組成物は、安全域が非常に広く、日常的に経口摂取することができるので、上記疾患の予防等に有用な健康食品等の食用品の素材としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】各種ヒト乳癌細胞培養株に対するメカブ水抽出液の各分画精製物のアポトーシス誘導活性を示す図である。
【図２】各種濃度のメカブ多糖投与ラット群および非投与ラット群における乳癌発生率の経時変化を示す図である。
【図３】各種濃度のメカブ多糖投与ラット群および非投与ラット群におけるラット１匹あたりの平均乳癌腫瘍数の経時変化を示す図である。
【図４】各種濃度のメカブ多糖投与ラット群および非投与ラット群における乳癌発症までの平均期間を示す図である。
【図５】各種濃度のメカブ多糖投与ラット群および非投与ラット群における３２週目の平均腫瘍重量を示す図である。
【図６】各種濃度のメカブ多糖投与ラット群および非投与ラット群における３２週目の平均腫瘍表面積を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel polysaccharide capable of selectively inducing apoptosis with respect to abnormal cells that are undesirable for a living body such as cancer cells (hereinafter sometimes simply referred to as “apoptosis-inducing polysaccharide”), seaweed water containing the polysaccharide Extract fractions, pharmaceutical compositions containing them as active ingredients, especially pharmaceutical compositions for the prevention and treatment of diseases in which apoptosis induction is effective (for example, autoimmune diseases such as cancer, colon polyposis, rheumatism, viral infections, etc.) About. The present invention also relates to a health food comprising the polysaccharide or the polysaccharide-containing composition.
[0002]
[Prior art]
Cell death controlled by a gene called apoptosis is morphological changes in the development of higher animals, establishment of neural networks, maintenance of homeostasis in the endocrine system of mature individuals, diversity and specificity of the immune system It plays an important role in basic life phenomena such as the establishment of sex. Apoptosis is deeply involved in the development of various pathological conditions such as cancer, viral infections such as AIDS, neurological diseases such as Alzheimer's disease, and autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis. It has become increasingly clear. For such diseases involving apoptosis, there has been an active search for compounds that selectively induce apoptosis in pathogenic cells and have little toxicity to normal cells. These promising compounds have been screened. However, the current situation is not linked to the establishment of therapeutic and preventive methods using such compounds.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, an object of the present invention is to screen a novel compound having natural ability to induce apoptosis selectively against pathogenic cells such as cancer cells and virus-infected cells from a natural product, It is to provide a pharmaceutical for effective and safe prevention and treatment of various diseases caused by the above pathogenic cells using the compound. Another object of the present invention is to provide a health food comprising the novel compound.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
In the study of artificially controlling apoptosis, the present inventors have widely searched for natural compounds that have apoptosis-inducing activity and have almost no toxicity. The results of research in this field have revealed that special structures of natural polysaccharides have the ability to induce apoptosis. In the present invention, the present inventors paid attention to seaweeds such as mekabu, kombu, mozuku and funori, and attempted to obtain a target polysaccharide having apoptosis-inducing ability from these seaweeds. As a result, it was found that a substance that selectively induces apoptosis is present in pathogenic cells of diseases in which apoptosis is involved, such as cancer cells, in an aqueous extract of seaweed. Next, the present inventors fractionated and purified this substance by ultrafiltration and conducted structural analysis, and revealed that the active ingredient is a novel polysaccharide having a constituent sugar composition different from that of conventionally known polysaccharides. I made it. Furthermore, the present inventors have completed the present invention by confirming that the novel polysaccharide can induce apoptosis selectively in cancer cells and exert an antitumor effect even in vivo in cancer-bearing animal experiments. It came to.
[0005]
That is, the present invention is one or more fractions obtained by fractionating a water extract of seaweed based on the difference in molecular weight, and selectively induces apoptosis for abnormal cells that are undesirable for a living body. A composition comprising a polysaccharide is provided. In a preferred embodiment, the composition is a fraction having a molecular weight of 5,000 to 100,000, more preferably a fraction having a molecular weight of 50,000 to 100,000. In such a fraction, the following sugar composition:
(1) The molar ratio of galactose, fucose, and mannose is 1: 0.4 ± 0.1: 0.3 ± 0.05
(2) The apoptosis-inducing polysaccharide of the present invention having glucuronic acid in a molar ratio of 0.6 to 1.0 with respect to galactose 1 is included.
[0006]
The apoptosis-inducing polysaccharide of the present invention and the seaweed-derived composition containing the polysaccharide can induce apoptosis selectively against abnormal cells that are undesirable for the living body, and thus can be used for the prevention and treatment of diseases caused by these cells. It is valid. Therefore, the present invention also provides a pharmaceutically effective amount of an apoptosis-inducing polysaccharide or a seaweed-derived composition containing the polysaccharide, such as cancer, autoimmune disease, neurological disease, viral infection, radiation exposure disorder, etc. Pharmaceutical compositions for the prevention and treatment of disease are provided.
[0007]
The apoptosis-inducing polysaccharide of the present invention and the seaweed-derived composition containing the polysaccharide are extracts from seaweed that can be edible and fractionated purified products thereof, or equivalents thereof, so that they can be safely used as edible foods. The preventive effect of the above-mentioned diseases can be achieved by daily oral intake. Therefore, the present invention also provides an edible product comprising the apoptosis-inducing polysaccharide of the present invention or a seaweed-derived composition containing the polysaccharide.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The “apoptosis-inducing polysaccharide” of the present invention can selectively induce apoptosis in abnormal cells that are undesirable for a living body, and has the following properties:
(1) Molecular weight: 5,000 to 100,000
(2) The molar ratio of galactose, fucose, and mannose is 1: 0.4 ± 0.1: 0.3 ± 0.05
(3) There is no particular limitation as long as it contains glucuronic acid in a molar ratio of 0.6 to 1.0 with respect to galactose 1, but preferably the following properties:
(4) In gas chromatography under certain conditions (details of the conditions are described in Example 5 below), peaks were observed at retention times of 11.9 minutes and 13.1 minutes, and the substance corresponding to the former was galactose 1 The substance corresponding to the latter is contained in a molar ratio of 10 ± 5 to galactose 1
(5) Contains a sulfate group in a molar ratio of 0.9 to 1.5 with respect to neutral sugar 1.
Is further included.
[0009]
The “apoptosis-inducing polysaccharide” of the present invention may be of any origin, for example, seaweed, preferably seaweed belonging to red algae or brown algae, more preferably Chigaisoaceae, Compositae, Mosucaceae, Funoriceae And the like, particularly preferably seaweed, and most preferably derived from mekabu (a site where leaves are gathered in thick and short folds near the roots on the rocks of seaweed).
[0010]
In the present invention, "abnormal cells undesirable for a living body" refers to abnormal cells that cause pathogenesis of diseases that are deeply involved in the onset or suppression of apoptosis, such as cancer cells in cancer, autoreactive cells in autoimmune diseases, Examples thereof include virus-infected cells in virus infections, abnormal nerve cells in neurological diseases, and radiation-exposed cells in radiation exposure disorders. Preferably, “abnormal cells undesirable for a living body” are cancer cells, more preferably breast cancer cells, glioma cells, and the like.
[0011]
More preferably, the apoptosis-inducing polysaccharide of the present invention has a molecular weight of 50,000 to 100,000.
[0012]
The apoptosis-inducing polysaccharide of the present invention can be prepared by the following method when seaweed such as seaweed (particularly mekabu), kombu, mozuku, funori and the like is used as a raw material.
First, the dried seaweed is finely pulverized using a pulverizer or the like, and an appropriate amount of water is added to the pulverized product and sufficiently mixed, followed by standing at 4-30 ° C, preferably 4-10 ° C for 15-25 hours. And extract. After removing the precipitate by centrifugation or the like, the supernatant is passed 1 to several times through a nylon mesh or filter paper of 100 to 0.45 μm (while gradually reducing the pore size as necessary). The obtained filtrate is subjected to ultrafiltration, and fractionated into fractions having a molecular weight of 100,000 or more, 100,000 to 50,000, 50,000 to 5,000, and 5,000 or less, for example. An apoptosis-inducing polysaccharide having a composition can be obtained. The obtained fraction can be used and stored as a stock solution, diluted or concentrated, or dried or lyophilized depending on the intended use.
[0013]
The present invention also provides one or more fractions obtained by fractionating an aqueous extract of seaweed based on a difference in molecular weight, wherein the polysaccharide selectively induces apoptosis against abnormal cells that are undesirable for a living body. The composition characterized by containing is provided. That is, the fraction purified product of the seaweed water extract obtained by the method as described above is not only a fraction having a molecular weight of 100,000 to 50,000 and 50,000 to 5,000 containing the apoptosis-inducing polysaccharide of the present invention, A fraction having a molecular weight of 100,000 or more and a fraction having a molecular weight of 5,000 or less also have the ability to induce apoptosis. The sugar composition of the polysaccharide contained in the fraction having a molecular weight of 100,000 or more approximates the sugar composition in the unseparated seaweed water extract, and is considered to be most abundant in the seaweed polysaccharide. On the other hand, the sugar composition of the polysaccharide contained in the fraction having a molecular weight of 5,000 or less approximates the sugar composition of the polysaccharide contained in the fraction having a molecular weight of 50,000 to 5,000. In the present invention, “polysaccharide” refers to a saccharide produced by dehydrating 10 or more molecules of monosaccharides (including derivatives such as sugar alcohol and uronic acid). Therefore, the “apoptosis-inducing polysaccharide-containing composition derived from seaweed water extract” of the present invention must be a fraction including a molecular weight at least containing the polysaccharide as defined above.
[0014]
The `` apoptosis-inducing polysaccharide-containing composition derived from a seaweed water extract '' of the present invention may be derived from any seaweed, but is preferably a seaweed belonging to red algae or brown algae, more preferably a chigaiaceae, a kombutidae, It is derived from seaweeds belonging to the family Mosuku, Funori, etc., particularly preferably seaweed, and most preferably derived from mekabu.
[0015]
The “apoptosis-inducing polysaccharide-containing composition derived from the seaweed water extract” of the present invention is preferably derived from a fraction containing the apoptosis-inducing polysaccharide of the present invention, and therefore preferably has a molecular weight of 5,000 to 100,000. Is derived from a fraction having a molecular weight of 50,000 to 100,000.
[0016]
The present invention also provides a pharmaceutical composition containing a pharmaceutically effective amount of the “apoptosis-inducing polysaccharide” of the present invention or the “apoptosis-inducing polysaccharide-containing composition derived from seaweed water extract” of the present invention. Since the “apoptosis-inducing polysaccharide” of the present invention or the “apoptosis-inducing polysaccharide-containing composition derived from the seaweed water extract” of the present invention can selectively induce apoptosis against abnormal cells that are undesirable for a living body. The pharmaceutical composition can be used for the prevention and treatment of diseases caused by the abnormal cells. Examples of such diseases include cancer such as breast cancer and glioma, leukemia, colorectal polyposis, autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis, inflammatory diseases such as ulcerative colitis and Sjogren's syndrome, Huntington's disease, Due to neurological diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Down's syndrome, amyotrophic lateral sclerosis, viral infections such as HIV, HBV, HCV, adenovirus, poxvirus, herpesvirus, papovavirus, etc. Examples include exposure damage. Preferred is a pharmaceutical composition for preventing and treating cancer, particularly cancer such as breast cancer and glioma.
[0017]
The “apoptosis-inducing polysaccharide” of the present invention or the “apoptosis-inducing polysaccharide-containing composition derived from the seaweed water extract” of the present invention is a pharmaceutically acceptable carrier (eg, excipient, diluent, etc.) as necessary. ), Etc., and can be formulated in liquid dosage forms, powders, granules, tablets, capsules, syrups, injections, aerosols, etc., orally or parenterally Can be administered.
[0018]
Examples of the pharmaceutically acceptable carrier include excipients such as sucrose, starch, mannitol, sorbit, lactose, glucose, cellulose, talc, calcium phosphate, calcium carbonate, cellulose, methylcellulose, hydroxypropylcellulose, polypropylpyrrolidone , Gelatin, gum arabic, polyethylene glycol, sucrose, starch and other binders, starch, carboxymethylcellulose, hydroxypropyl starch, sodium-glycol starch, sodium bicarbonate, calcium phosphate, calcium citrate and other disintegrants, magnesium stearate , Aerosil, Talc, Lubricant such as sodium lauryl sulfate, Citric acid, Menthol, Glycyllysine / Ammonium salt, Glycine, Orange powder, Fragrance, Nato benzoate Preservatives such as sodium, sodium bisulfite, methylparaben, propylparaben, stabilizers such as citric acid, sodium citrate, acetic acid, suspensions such as methylcellulose, polyvinylpyrrolidone, aluminum stearate, dispersants such as surfactants, Examples include, but are not limited to, water, physiological saline, diluents such as orange juice, base waxes such as cacao butter, polyethylene glycol, and white kerosene.
[0019]
Preferably, the formulation of the present invention is an oral or injectable formulation. Formulations suitable for oral administration dissolve an effective amount of “apoptosis-inducing polysaccharide” or “apoptosis-inducing polysaccharide-containing composition derived from seaweed water extract” in a diluent such as water, physiological saline or orange juice. Liquids, capsules containing an effective amount of the substance as solids or granules, sachets or tablets, suspensions in which an effective amount of the substance is suspended in a suitable dispersion medium, effective amounts of the substance And an emulsion obtained by dispersing and emulsifying a solution in which an aqueous solution is dissolved in an appropriate dispersion medium.
[0020]
Formulations suitable for parenteral administration include aqueous and non-aqueous isotonic sterile injection solutions, which include antioxidants, buffers, antibacterial agents, isotonic agents and the like. May be. Aqueous and non-aqueous sterile suspensions are also included, which may contain suspending agents, solubilizers, thickeners, stabilizers, preservatives and the like. The preparation of the present invention can be enclosed in a container in unit doses or multiple doses such as ampoules and vials. In addition, an effective amount of “apoptosis-inducing polysaccharide” or “apoptosis-inducing polysaccharide-containing composition derived from seaweed water extract” and a pharmaceutically acceptable carrier are freeze-dried (freeze-dried), and an appropriate aseptic medium is used immediately before use. It can also be stored in a state where it can be dissolved or suspended in a vehicle.
[0021]
The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention depends on the effective amount of the apoptosis-inducing polysaccharide as the active ingredient, the cytotoxicity of the substance, the type of disease, the degree of disease progression, the drug acceptability of the administration subject, body weight, age, etc. Although different, for example, in the case of oral administration, the amount of polysaccharide as an active ingredient is usually 1 to 1,000 mg / kg body weight, and this amount can be administered once or divided into several times a day.
[0022]
Since the “apoptosis-inducing polysaccharide” and “apoptosis-inducing polysaccharide-containing composition derived from seaweed water extract” of the present invention are those that have been safely ingested as foods or their equivalents, LD ₅₀ A substance with a very high value and a wide safety range (here, “equivalent” is obtained from non-edible seaweed or raw material other than seaweed, but is substantially the same as that obtained from edible seaweed as a substance. ). Therefore, the “apoptosis-inducing polysaccharide” and “apoptosis-inducing polysaccharide-containing composition derived from the seaweed water extract” of the present invention are used not only as a pharmaceutical, but also alone and with an acceptable food additive. It can also be used as a food product. Acceptable food additives include commonly used preservatives, colorants, fragrances, stabilizers, and the like. In addition, it can be mixed with other nutrients such as sugar, protein, lipid, amino acid, vitamins, iron, calcium, magnesium, dietary fiber, etc. to make a multifunctional nutritional food.
[0023]
【Example】
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but these are merely examples and do not limit the scope of the present invention.
[0024]
Example 1 Preparation of freeze-dried powder of mekabu water extract (mekabu polysaccharide)
Mechabu (Sanriku dried mekabu) was pulverized at 15,000 rpm for 1 minute using a blender pulverizer to obtain Mechabu powder. Next, 1 L of water was added to 10 g of Mechabu powder and mixed well, and then allowed to stand at 4 ° C. for 24 hours. The precipitate was removed by high-speed centrifugation (3,000 rpm, 5 minutes), and the supernatant was collected. The solution was passed through nylon mesh 70 μm and 45 μm once each. Further, after passing once through a Whatman GD / X (0.45 μm) filter, fractions having a molecular weight of 100,000 or less were collected by ultrafiltration, and powdered by freeze-drying (mechab polysaccharide).
[0025]
Example 2 Apoptosis-inducing activity of mekabu polysaccharide against cancer cell cultures
9 × 10-dimethylbenzanthracene (DMBA) -induced rat breast cancer cell cultures in a 60 mm dish ^Five Cell / ml, CO ₂ -Incubator at 37 ° C, 5% CO ₂ After culturing overnight at -95% air, the mekabu polysaccharide was added to the medium at various concentrations and further cultured. Cells floating in the medium were collected, and the remaining cells adhering to the petri dish surface were collected by trypsin / EDTA treatment and combined. The collected cells were washed with PBS (−) and treated with RNase (1 mg / ml) 40 μl / sample at 37 ° C. for 40 minutes. The plate was washed twice with PBS (−) and stained with propidium iodide (25 μg / ml) 100 μl / sample for 30 minutes on light-shielded ice. The DNA fragmentation rate of the cells was quantified and evaluated with a flow cytometer (Bechman Coulter EpisXL-2) once through a 70 μm nylon mesh. The results are shown in Table 1.
[0026]
[Table 1]

[0027]
Mekabu polysaccharide was found to have the ability to induce apoptosis against rat breast cancer cell lines in a concentration and time dependent manner.
[0028]
Example 3 Cell Selectivity of Mekabu Polysaccharide inducing Apoptosis
Apoptosis-inducing ability of mekabu polysaccharide (0.48 mg / ml) against two human breast cancer cell culture lines (T47D and MDA-MB231) and normal human breast cell line (MCF-10A) was examined in the same manner as in Example 2. It was. The results are shown in Table 2.
[0029]
[Table 2]

[0030]
Mekabu polysaccharide was found to induce apoptosis in breast cancer cells but not to induce apoptosis in normal breast cells.
[0031]
Example 4 Comparison of apoptosis-inducing ability between mekabu polysaccharide and 5-fluorouracil (5-FU)
The ability of inducing apoptosis of human breast cancer cell culture strain (T47D) was compared with mekabu polysaccharide (0.48 mg / ml) and 5-FU (2 and 20 μg / ml) most frequently used for human breast cancer treatment. The results are shown in Table 3.
[0032]
[Table 3]

[0033]
As a result of comparison in each optimum concentration range, it was found that mekabu polysaccharide has a slightly stronger apoptotic ability than 5-FU. 5-FU is highly cytotoxic and cannot be used practically at higher concentrations.
[0034]
Example 5 Fractionation of mekabu polysaccharide by ultrafiltration and analysis of sugar composition of purified fraction
The mekabu polysaccharide solution was adjusted to a molecular weight of 100,000 or more (I), 10 to 50,000 (II), 5 to 5,000 (III), or 50,000 or less (IV) by ultrafiltration. As a control, unseparated mekabu polysaccharide and fucoidan extracted from the mekabu were used, and the sugar composition of each fraction purified product was comparatively analyzed. Each fraction crystallized with ethanol was dissolved in standard water to prepare a sample. Analysis of the constituent sugars was quantified by gas chromatography according to the method of Reinhold [Reinhold, VN (1972) Methods in Enzymolozy, 25B, 244-249]. The conditions for gas chromatography are as follows.
[0035]
Gas chromatograph: Shimadzu GC14A
Column: Capillary column (Shimadzu CBJ15, 0.32 mm × 30 mm)
Temperature rising condition: Starting temperature from 180 ° C to 250 ° C at 5 ° C / min
Carrier gas: Nitrogen gas
Detector: Hydrogen flame ion detector
Quantification: Shimadzu C-R6A Chromatopack
[0036]
Neutral sugars were quantified using galactose as a standard according to the phenol sulfate method [Dubois, M., Gilles, KA et al. (1956) Anal. Chem., 28, 350]. The sulfate group was quantified by the rosison acid method [Terho, TT and Hartiala, K. (1971) Anal. Biochem., 41, 471] using chondroitin sulfate C as a standard substance. The results are shown in Tables 4 and 5.
[0037]
[Table 4]

[0038]
[Table 5]

[0039]
Neutral sugars include fucose, galactose, and mannose. If unseparated, galactose is the standard (1.0), the ratio of fucose to mannose is 1: 0.6, but in fractions II, III and IV, all are 0.4 ± 0.1: 0.3 ± 0.05. The molar ratio of glucuronic acid is 0.1 with respect to galactose 1 in the unfractionated fraction, whereas the fractions II, III, and IV all have a high content ratio of 1 to 0.6. Unidentified peaks X and Y having a high content were present in fractions II, III and IV. From the retention times in gas chromatography (X: 11.9 minutes, Y: 13.1 minutes), these are likely mannitol-like and inositol-like sugar alcohols. Therefore, the sugar composition of this polysaccharide is different from mechabufucoidan.
[0040]
On the other hand, the content of sulfuric acid (group), which is a characteristic of fucoidan, is about 1/50 of fucoidan in fractions II, III, and IV, and is very low, which is also characteristically different from mechabufucoidan. The molar ratio of sulfate groups to neutral sugars of mekabu polysaccharide is about 1 (0.9 to 1.5) for unseparated and fractions II, III, and IV, while it is about 2 for mechabufucoidan.
[0041]
Example 6 Apoptosis-inducing activity of each fraction of mekabu polysaccharide
The sample concentration was 0.48 mg / ml, the treatment time was 96 hours, and the apoptosis-inducing ability for human breast cancer cell lines (T47D, MDA-MB231, MCF-7) was evaluated in the same manner as in Example 2. The results are shown in FIG. Apoptosis-inducing ability is observed in all fractions, but higher apoptosis-inducing activity is recovered in fractions having a molecular weight of 100,000 or less than unseparated, and in particular, fraction II having a molecular weight of 10 to 50,000 is about 1 compared to unseparated. .5 times higher effect.
[0042]
Example 7 Inhibitory effect of mekabu polysaccharide on carcinogenesis in vivo
Forty-eight week old Sprague-Danley rats were given DMBA dissolved in olive oil once in the stomach at 20 mg / individual / 1 ml olive oil, and one week later the whole was arbitrarily divided into 4 groups (n = 12) divided. Mechabu polysaccharide was placed in a 400 ml water bottle, and the stock solution (6 mg / ml) ingestion group (MA), 2-fold dilution (3 mg / ml) ingestion group (MB), 4-fold dilution (1.5 mg / ml) ml) Ingestion (administration) was orally performed using water as an intake group (MC) and a control group (cont). The water bottle was cleaned and replaced every two days, the intake was measured each time, and the intake per week was calculated. The body weight change of each rat, the number of tumors in which breast cancer occurred by palpation, and all tumor diameters were measured every week for 32 weeks after DMBA administration. At the end of the experiment at the 32nd week, blood was collected, the whole breast tumor was removed, and various organs were removed, and the weight and diameter of the breast tumor were measured.
[0043]
The results are shown in FIGS. There was no difference in body weight change or intake in each group, suggesting the safety of mechabu polysaccharide long-term intake. The control group had a breast cancer incidence of 100% at 13 weeks after DMBA administration, whereas the MA group was 100% at 23 weeks, and the MB group was 83. 32 weeks at the end of the experiment. 3% and the MC group were 25% at the 32nd week, both showing significantly higher carcinogenic inhibitory effect than the control group (FIG. 2). In comparison of the number of breast tumors, the control group averaged 7.2 in the comparison at the 32nd week at the end of the experiment, whereas in the MA, MB, and MC groups, 2 each. The inhibitory effect on the number of breast tumors was significantly observed (2, 1.1, 0.3) (FIG. 3). From the above results, it was found that mekabu polysaccharide has an effect of suppressing the occurrence of breast cancer and the growth of breast cancer in a DMBA-induced breast cancer rat experimental system.
[0044]
Example 8 Formulation Example
Fraction II (molecular weight 100,000 to 50,000) of mechabu water extract obtained in Example 5 was dried and powdered, and then 200 g of lactose was added to and mixed with 1000 g of the dry powder, and water 15 to 20% was added and kneaded. The kneaded product was granulated with a granulator, dried and tableted.
[0045]
Example 9 Example of food production (1) Manufacture of mekabu rice cake
After drying and pulverizing fraction II (molecular weight 100,000 to 50,000) of the mekabu water extract obtained in Example 5, a mekabu cake having the composition shown in Table 6 was produced using a conventional method. .
[0046]
[Table 6]

[0047]
Example 10 Food Production Example (2) Production of Mekabu Nutritional Capsule
The mechabu water extract obtained in the same manner as in Example 1 (however, ultrafiltration was not performed) was dried and powdered, and then capsules having the composition described in Table 7 (according to the gelatin formulation described in Table 8) A tear-type soft capsule) was produced.
[0048]
[Table 7]

[0049]
[Table 8]

[0050]
【The invention's effect】
Since the apoptosis-inducing polysaccharide and the composition containing an apoptosis-inducing polysaccharide derived from the seaweed water extract of the present invention can selectively induce apoptosis with respect to abnormal cells that are undesirable for a living body, it is possible to prevent diseases caused by these cells. Effective for prevention and treatment. Moreover, since the apoptosis-inducing polysaccharide-containing composition derived from the apoptosis-inducing polysaccharide and the seaweed water extract has a very wide safety range and can be taken orally on a daily basis, it is useful for the prevention of the above diseases and the like. It is also useful as a material for foodstuffs such as food.
[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a graph showing the apoptosis-inducing activity of each fraction purified product of Mekabu water extract against various human breast cancer cell culture strains.
FIG. 2 is a graph showing changes in breast cancer incidence with time in a rat group administered with various concentrations of mekabu polysaccharide and a non-administered rat group.
FIG. 3 is a graph showing changes over time in the average number of breast cancer tumors per rat in the mechab polysaccharide-administered rat group and the non-administered rat group at various concentrations.
FIG. 4 is a graph showing the average period until the onset of breast cancer in the mechab polysaccharide-administered rat group and the non-administered rat group at various concentrations.
FIG. 5 is a graph showing the average tumor weights at week 32 in the mechab polysaccharide-administered rat group and the non-administered rat group at various concentrations.
FIG. 6 is a graph showing the mean tumor surface area at week 32 in the mechab polysaccharide-administered rat group and the non-administered rat group at various concentrations.

Claims

One or more fractions obtained by fractionating an aqueous extract of seaweed based on the difference in molecular weight, which has the following properties and selectively induces apoptosis against abnormal cells that are undesirable for a living body A water-extracted fraction characterized by containing an inducing polysaccharide.
(1) Molecular weight: 5,000 to 100,000
(2) The molar ratio of galactose, fucose, and mannose is 1: 0.4 ± 0.1: 0.3 ± 0.05
(3) Glucuronic acid is contained in a molar ratio of 0.6 to 1.0 with respect to galactose 1

The water extraction fraction according to claim 1, wherein the seaweed belongs to red algae or brown algae.

The water-extracted fraction according to claim 1, wherein the seaweed belongs to a family selected from the group consisting of Chigaisoaceae, Compositae, Mosaceae, and Funoriaceae.

The water extraction fraction according to any one of claims 1 to 3, wherein the abnormal cells that are undesirable for a living body are selected from the group consisting of cancer cells, self-reactive cells, abnormal nerve cells, virus-infected cells, and radiation-exposed cells.

A pharmaceutical composition comprising a water-extracted fraction according to any one of claims 1 to 4 in a pharmaceutically effective amount, comprising a cancer, an autoimmune disease, a neurological disease, a viral infection and a radiation exposure disorder A pharmaceutical composition for the prevention and treatment of a disease selected from the group.

The foodstuff which comprises the water extraction fraction in any one of Claims 1-4.

A polysaccharide that has the following properties and selectively induces apoptosis in abnormal cells that are undesirable for a living body.
(1) Molecular weight: 5,000 to 100,000
(2) The molar ratio of galactose, fucose, and mannose is 1: 0.4 ± 0.1: 0.3 ± 0.05. (3) Glucuronic acid is 0.6 to 1. Contains at a molar ratio of 0

The polysaccharide according to claim 7, which has a molecular weight of 50,000 to 100,000.

The polysaccharide according to claim 7 or 8, which is derived from seaweed.

The polysaccharide according to any one of claims 7 to 9, wherein the abnormal cells that are undesirable for a living body are selected from the group consisting of cancer cells, autoreactive cells, abnormal nerve cells, virus-infected cells, and radiation-exposed cells.

The composition containing the polysaccharide in any one of Claims 7-10.

A pharmaceutical composition comprising the polysaccharide according to any one of claims 7 to 10 as an active ingredient, wherein the disease is selected from the group consisting of cancer, autoimmune disease, neurological disease, viral infection and radiation exposure disorder And pharmaceutical compositions that are therapeutic.

A food product comprising the polysaccharide according to any one of claims 7 to 10.

Including a water extract from seaweed and fractionating the prepared water extract based on the difference in molecular weight, it has the following properties and selectively induces apoptosis against abnormal cells that are undesirable for the living body A method for producing a water-extracted fraction, characterized by containing an inducing polysaccharide.
(1) Molecular weight: 5,000 to 100,000
(2) The molar ratio of galactose, fucose, and mannose is 1: 0.4 ± 0.1: 0.3 ± 0.05
(3) Glucuronic acid is contained in a molar ratio of 0.6 to 1.0 with respect to galactose 1

The method according to claim 14, wherein the extraction is performed under a temperature condition of 4 to 10C.

The method according to claim 14 or 15, wherein a fraction having a molecular weight of 50,000 to 100,000 is extracted.