JP3958554B2

JP3958554B2 - Modulation contrast microscope

Info

Publication number: JP3958554B2
Application number: JP2001326702A
Authority: JP
Inventors: 健一日下; 隆笠原
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2001-10-24
Filing date: 2001-10-24
Publication date: 2007-08-15
Anticipated expiration: 2021-10-24
Also published as: JP2003131139A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、顕微鏡、特に変調コントラスト顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、不妊治療の一つに顕微鏡を用いたICSI(卵細胞質内精子注入法)が盛んに行なわれているが、ICSIでは変調コントラスト法（ホフマンモジュレーションコントラスト：Modulation Optics社の登録商標）が多く使われている。この変調コントラスト法は、特開昭５１−２９１４９号公報に開示されており、公知の技術であるが、図６乃至８を用いてその原理を簡単に説明する。図中、５はコンデンサレンズ、Sは標本、７は対物レンズである。また６は開口板で、中心部から離れた位置に矩形状開口６ａを有している。また、１４は円盤状の変調器で、開口板６と略共役な位置に配置されている。この変調器１４には、開口６aの像を含み得る透過率１００％の領域１４aと、例えば透過率１５％の領域１４bと、透過率０％の領域１４cとが順に隣接して配置形成されている。
【０００３】
この光学系では、矩形状開口６aが光軸から偏心した位置に配置されているので、コンデンサレンズ5に入射した光は標本Ｓを斜め方向から照明するように射出する。このとき、透明な標本Sが図６（a）に示すように扁平であると、標本Sを透過した光束は対物レンズ７により変調器１４の領域１４b内に結像し、図７（a）に示すように領域１４b内に開口像６a'が形成される。また、標本Sの表面が図６（b）に示すように右肩上がりの斜面となっていると、標本Sを透過するとき光束は右方へ屈折して変調器１４の領域１４c内に結像し、図７（b）に示すように領域１４c内に開口像６a'が形成される。また、標本Sの表面が図６（c）に示すように左肩上がりの斜面となっていると、標本Sを透過するとき光束は左方へ屈折して変調器１４の領域１４a内に結像し、図７（c）に示すように領域１４a内に開口像６a'が形成される。
【０００４】
この説明で明らかなように、標本Sが図８（a）に示すような平坦面と斜面とを有する無色透明体である場合、その観察像は図８（b）に示すように平坦面部分は灰色に、斜面部分は黒または白く見える。このように、変調コントラスト法では、変調器１４に設けた異なる透過率領域と偏斜照明の効果とにより、無色透明な標本でも陰影を持つ立体感のある像として観察することが可能となる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
変調コントラスト法は、上述のように卵細胞に精子を注入する時に用いられるが、その場合には、卵の周縁部にある透明帯と呼ばれる部分、特に卵細胞とその外側（例えば培養液）との境界部分が良く見えることが必要である。また周縁部より内側の部分では、この部分に存在する顆粒などの微細構造も良く見えることが必要である。しかしながら、従来のホフマンモジュレーションコントラストは、卵を見たときのコントラストは適切であるが、透明帯や顆粒などの細かい部分がコントラストが高すぎて見づらいという問題点があった。
【０００６】
本発明は、従来技術の有するこのような問題点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、卵細胞の透明帯やその内側の微細構造の見えが最適となる変調コントラスト顕微鏡を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明の変調コントラスト顕微鏡は、光源と、コンデンサレンズと、該コンデンサレンズの前側焦点位置近傍に配置された部分開口を有する開口部材と、対物レンズと、前記開口部材と略共役な位置に配置された変調器とを備えた変調コントラスト顕微鏡であって、前記変調器は透過率Ｔ（％）の領域を備え、以下の条件を満たすようにしたことを特徴としている。
1.05<|(Mo×fc)／(Mc×fr)|<1.4
8<T<25
但し、Moは前記透過率Tの領域における半径方向の長さ、Mcは前記部分開口における半径方向の長さ、fcは前記コンデンサレンズの焦点距離、frは標本面から前記変調器までの間にある光学系の焦点距離である。
本発明によれば、前記透過率Tの領域の顕微鏡光軸からの距離Dが0.2R<D<0.6Rなる条件を満たすように構成されている。但し、Rは変調器が配置されている面の有効半径である。
【０００８】
【発明に実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図示した実施例に基づき説明する。図１は本発明に係る変調コントラスト顕微鏡の全体構成を示す図である。図中、１は光源、２はコレクタレンズ、３は照明レンズ、４はミラー、５はコンデンサレンズ、６は開口板、７は対物レンズ、８はレボルバ、９，１０，１１，１２はリレーレンズ、１３は接眼レンズ、１４は変調器、１５は標本Sを載置するためのステージである。
開口板６はコンデンサレンズの前側焦点位置、あるいはその近傍に配置されている。そして、図２に示すように、開口板６には中心から離れた周辺部に矩形状の開口部６ａが設けられている。本実施例では、開口板６とは矩形状の開口部の大きさが異なる別の開口板６'が交換できるようになっている。開口板６と開口板６'の交換は、例えばターレット１５に開口板６と開口板６'を配置しておき、このターレット１５を回転させればよい。このようにすれば、開口板６と開口板６'のいずれか一方を光路内へ挿入することができる。また、変調器１４は対物レンズ７の後側焦点位置、あるいはその近傍に配置されている。この位置は、開口板６と開口板６'と略共役な位置である。また、変調器１４は図３に示すように透過率がＴ％の領域１６が設けられている。この、透過率がＴ％の領域１６は、矩形状の開口部６ａと同じように中心から離れた周辺部に形成されている。
【０００９】
この実施例において、Moを透過率がT％の領域１６における半径方向の長さ、Mcを矩形状の開口部６aにおける半径方向の長さ、fcをコンデンサレンズ５の焦点距離、frを標本面から前記変調器１４までの間にある光学系の焦点距離としたとき、下記の条件式を満足するように構成されている。なお、半径方向とは、図２あるいは図３に示している矢印方向である。この半径方向は、変調器１４において透過率の変化を示す境界線に対して直交する方向である。
1.05<|(Mo×fc)／(Mc×fr)|<1.4 （１）
8<T<25 （２）
【００１０】
本実施例は上記のように構成されているから、矩形状開口６a（開口６bについては後述する。）から射出した光源１からの光は、コンデンサレンズ５，標本S，対物レンズ７及び変調器１４を通過して、標本像を形成する。この標本像は従来技術で説明したように、標本の形状に応じてコントラストがついており、観察者は接眼レンズ１３を介して観察する。そして、上記条件式（１）は、半径方向に見た変調器１４の透過率Tの領域の大きさと、変調器１４が配置されている面内に投影される矩形状の開口部６aの半径方向の大きさとの比率を表しており、透過率Tの領域の大きさが上記開口像の大きさの１．０５倍から１．４倍の大きさとなっていることを示している。矩形状の開口部６aはコンデンサレンズ５の前側焦点位置近傍に配置されているため、変調器１４に投影される開口像の半径方向の大きさはMc×fr/fcとなる。
【００１１】
従来の変調コントラスト法では、透過率Ｔ％の領域の大きさと、この領域に投影された矩形状の開口部の大きさがほぼ同じであった。そのため、卵細胞のように凹凸の変化が大きい（厚みの変化が大きい）標本内を光が通過すると、この凹凸によって光が大きく屈折してしまう。そのため、変調器１４上に投影される開口は、透過率T％の領域からずれてしまう。この結果、コントラストが付き過ぎて観察像はぎらぎら輝くような像になり、細かい部分が見えなくなってしまう。これに対して、本発明では、透過率T％の領域を変調器１４上に投影される開口よりも大きくなるように選定したから、上記コントラストが抑えられて、細かい部分も良く見えるようにすることが出来る。
【００１２】
即ち、上記条件式（１）の上限を下回ると、観察像においてぎらつきが大きくなり過ぎてしまう。そのため、例えば卵細胞であれば、透明帯やその内側の細かい部分が見えない。また、この比が上限を上回ると、コントラストが弱くなり過ぎて、卵細胞全体が見難くなる。また、上記条件式（２）は、透過率T％の数値条件を示しているが、この透過率が（２）式の下限を下回ると、例えば卵細胞では、周辺部と中心部とのコントラストの差が強くなり過ぎ且つ中心部の像が暗くなり過ぎて観察し難くなる。また、この透過率が（２）式の上限を上回ると、コントラストが弱くなり過ぎて卵細胞全体が見難くなる。
【００１３】
実験の結果、|(Mo×fc)／(Mc×fr)|が下記の条件を満たすようにすれば、更にコントラストと解像バランスの良い変調コントラスト観察が可能であることが分かった。
1.15<|(Mo×fc)／(Mc×fr)|<1.3 （３）
【００１４】
また、本実施例において、透過率T％の領域の顕微鏡光軸からの距離をD、変調器１４が配置されている面の有効半径をR(図３参照)としたとき、下記の条件式（４）を満たすことが好ましい。即ち、下記（４）式の下限を下回ると、透過率T％の領域が光軸に近くなりコントラストは向上するが、解像力が悪くなる。また、下記（４）式の上限を上回ると、解像力の点では有利であるが、コントラストが悪くなる。
0.2R<D<0.6R （４）
【００１５】
また、本実施例において、NAoをNA（開口数）が最大の対物レンズのNA、NAcをコンデンサレンズ５のNAとしたとき、下記の条件式（５）を満たすことが好ましい。
0.7NAo<NAc （５）
上記（５）式はコンデンサレンズのNAを規定したものであるが、この条件から外れると、コンデンサレンズのNAが小さくなり、解像力の良い変調コントラスト観察が出来なくなる。
【００１６】
以上、本実施例においては６aを矩形状の開口部として説明したが、これはリング状の開口部であっても良い。但し、コンデンサレンズ５側の矩形状の開口部６ａと光学的に共役な位置に配置されていれば良い。矩形状の開口部６aの像は、対物レンズ７内と顕微鏡本体内にできるが、対物レンズ内の方が開口像のリレー回数が少なくて開口像の収差が少ないため、変調器１４は対物レンズ７内にあった方が望ましい。
【００１７】
なお、本発明は、変調コントラスト顕微鏡を近赤外光で観察することを特徴とする。近年、人工授精の研究分野では、卵細胞に対する損傷が可視光よりも近赤外光の方が少ないと考えられており、近赤外光によるTV観察が検討されて来ている。近赤外光を用いる場合は、可視光よりも変調器１４に投影される矩形状の開口部６aの像が、色収差のためぼやける傾向にある。そこで前記（１）式のように、変調器１４上に投影される矩形状の開口部６aの像よりも透過率Tの領域を大き目に取っていれば、近赤外光によるTV観察でも矩形状の開口部６aの像が透過率Tの領域よりもはみ出ることがなく、コントラストを抑えた観察が可能となる。
【００１８】
また、本実施例では、一つの変調器１４に対して複数の開口部材を切換えて使用するように構成されている。何れの開口部材を用いる場合も前記条件式（２）を満足する変調器１４が使用される。前述のように、矩形状の開口部６aを用いた場合は、コントラストを若干落とすことによりぎらつきを抑え、細かい部分の見え方を改善している。そのため、卵細胞以外の凹凸の少ない標本を見た場合には、コントラストが低く見難く感じることがある。このような場合には、Mcの大きい開口、即ち前記矩形状の開口６bを有する開口部材６'に切換えて観察すれば、前記（１）式の下限を外れてコントラストの良い観察が可能となる。
【００１９】
図４は、本実施例に係る変調コントラスト顕微鏡により観察された卵細胞像の一例を示す写真で、（a）は全体図、（b）は卵細胞の縁部分の拡大図ある。使用された対物レンズの倍率は20X、NAは0.4、コンデンサレンズのNAは0.5、|(Mo×fc)／Mc×fr)|＝1.2、T＝11％、D／R＝0.53である。
【００２０】
図５は従来の変調コントラスト顕微鏡により観察された卵細胞像の一例を示す写真で、（a）は全体図、（b）は卵細胞の縁部分の拡大図ある。使用された対物レンズの倍率は20X、NAは0.4、コンデンサレンズのNAは0.5、|(Mo×fc)／Mc×fr)|＝1、T＝15％、D／R＝0.625である。
【００２１】
図４（ａ）と図５（ａ）において、卵細胞は中心の円形部分とその周りにある輪帯状（リング状）の部分に分かれている。このうち、輪帯状の部分が透明帯である。ここで、図４（ｂ）と図５（ｂ）を比較する。何れの図にも輪帯状の透明帯とその内側の構造が示されている。ここで、図5（ｂ）では透明帯とその内側構造の境界は白く輝いており、透明帯と外部の境界は黒くなっている。これに対して、図４（ｂ）では透明帯とその内側構造の境界も透明帯と外部の境界も灰色近い。よって、図４（ｂ）の方が透明帯の境界を良好に認識できる。また、円形部分の内部構造のうち周辺部にある微細な粒状の構造も図４（ｂ）の方が良好に観察できる。
図４（b）と図５（b）との比較から明らかなように、本発明によれば、従来の変調コントラストによる場合よりも、卵細胞の縁部分が遥かに鮮明に観察され得る。
【００２２】
以上説明したように、本発明の変調コントラスト顕微鏡は、特許請求の範囲に記載した特徴の他に下記の特徴を有している。
（１）前記開口と略共役の位置に配置されていて該開口の像が投影される透過率T（％）の領域を持つ変調器を備え、以下の条件を満たす請求項１に記載の変調コントラスト顕微鏡。
1.15<|(Mo×fc)／Mc×fr)|<1.3
（２）以下の条件を満たす請求項１に記載の変調コントラスト顕微鏡。
0.7NAo<NAc
但し、NAoは変調コントラスト顕微鏡のNAが最大の対物レンズのNA、NAcはコンデンサレンズのNAである。
（３）前記開口が矩形である請求項１に記載の変調コントラスト顕微鏡。
（４）前記変調器が前記対物レンズ内に配置されている請求項１に記載の変調コントラスト顕微鏡。
（５）近赤外光を用いて観察するようにした請求項１に記載の変調コントラスト顕微鏡。
【００２３】
【発明の効果】
上述の如く本発明によれば、ICSI時に透明帯の見えが最適になる変調コントラスト顕微鏡を提供することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る変調コントラスト顕微鏡の全体構成を示す図である。
【図２】本発明に係る変調コントラスト顕微鏡に用いられる開口板の平面図である。
【図３】本発明に係る変調コントラスト顕微鏡に用いられる変調器の平面図である。
【図４】本発明実施例に係る変調コントラスト顕微鏡により観察された卵細胞像の一例を示す写真で、（a）は全体図、（b）は卵細胞の縁部分の拡大図ある。
【図５】従来の変調コントラスト顕微鏡により観察された卵細胞像の一例を示す写真で、（a）は全体図、（b）は卵細胞の縁部分の拡大図ある。
【図６】変調コントラストの原理を説明するための図である。
【図７】開口像と変調器との位置関係を説明するための図で、(a),(b),(c)は図６の(a),(b),(c)に夫々対応している。
【図８】 (a)は標本の一形状例を、(b)はこの標本に対応して現れる濃淡をそれぞれ示した図である。
【符号の説明】
１光源
２コレクタレンズ
３照明レンズ
４ミラー
５コンデンサレンズ
６開口板
６a，６b 開口
６a'，６b' 開口像
７対物レンズ
８レボルバ
９，１０，１１，１２リレーレンズ
１３接眼レンズ
１４変調器
S 標本[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a microscope, and more particularly to a modulation contrast microscope.
[0002]
[Prior art]
Currently, ICSI (intracytoplasmic sperm injection) using a microscope is actively used as one of infertility treatments, but the modulation contrast method (Hoffman modulation contrast: registered trademark of Modulation Optics) is often used in ICSI. It has been broken. This modulation contrast method is disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 51-29149 and is a known technique, but its principle will be briefly described with reference to FIGS. In the figure, 5 is a condenser lens, S is a sample, and 7 is an objective lens. Reference numeral 6 denotes an opening plate having a rectangular opening 6a at a position away from the center. Reference numeral 14 denotes a disk-shaped modulator, which is disposed at a position substantially conjugate with the aperture plate 6. In this modulator 14, a region 14a having a transmittance of 100%, which can include an image of the opening 6a, a region 14b having a transmittance of 15%, and a region 14c having a transmittance of 0%, for example, are arranged adjacent to each other. Yes.
[0003]
In this optical system, since the rectangular opening 6a is arranged at a position decentered from the optical axis, the light incident on the condenser lens 5 is emitted so as to illuminate the sample S from an oblique direction. At this time, if the transparent specimen S is flat as shown in FIG. 6A, the light beam transmitted through the specimen S is imaged in the region 14b of the modulator 14 by the objective lens 7, and FIG. As shown in FIG. 4, an aperture image 6a ′ is formed in the region 14b. Further, if the surface of the sample S has a slope that rises to the right as shown in FIG. 6B, when passing through the sample S, the light beam is refracted to the right and is confined in the region 14c of the modulator 14. As shown in FIG. 7B, an opening image 6a ′ is formed in the region 14c. Further, if the surface of the sample S has a slope that rises to the left as shown in FIG. 6C, the light beam is refracted to the left when passing through the sample S and forms an image in the region 14a of the modulator 14. Then, as shown in FIG. 7C, an aperture image 6a ′ is formed in the region 14a.
[0004]
As is clear from this description, when the sample S is a colorless transparent body having a flat surface and a slope as shown in FIG. 8A, the observed image is a flat surface portion as shown in FIG. 8B. Appears gray and the slopes appear black or white. As described above, in the modulation contrast method, it is possible to observe even a colorless and transparent sample as a three-dimensional image with a shadow due to the different transmittance regions provided in the modulator 14 and the effect of oblique illumination.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The modulation contrast method is used when injecting sperm into an egg cell as described above. In that case, the boundary called the zona pellucida in the periphery of the egg, particularly the boundary between the egg cell and the outside (eg culture medium) The part needs to look good. In addition, it is necessary that the fine structure such as granules existing in this portion is visible in the portion inside the peripheral portion. However, the conventional Hoffman modulation contrast is suitable when the egg is seen, but there is a problem that fine portions such as zona pellucida and granules are too high to be seen easily.
[0006]
The present invention has been made in view of such problems of the prior art, and the object of the present invention is to provide a modulation contrast microscope in which the appearance of the zona pellucida of the egg cell and the fine structure inside thereof is optimized. There is to do.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, a modulation contrast microscope of the present invention includes a light source, a condenser lens, an aperture member having a partial aperture disposed in the vicinity of the front focal position of the condenser lens, an objective lens, and the aperture member. A modulation contrast microscope including a modulator arranged at a substantially conjugate position, wherein the modulator has a region of transmittance T (%) and satisfies the following conditions.
1.05 <| (Mo × fc) / ( Mc × fr) | <1.4
8 <T <25
Where Mo is the radial length in the region of the transmittance T, Mc is the radial length in the partial aperture, fc is the focal length of the condenser lens, and fr is between the sample surface and the modulator. This is the focal length of an optical system.
According to the present invention, the distance D from the microscope optical axis in the region of the transmittance T is configured to satisfy the condition of 0.2R <D <0.6R. Where R is the effective radius of the surface on which the modulator is disposed .
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described based on the illustrated examples. FIG. 1 is a diagram showing the overall configuration of a modulation contrast microscope according to the present invention. In the figure, 1 is a light source, 2 is a collector lens, 3 is an illumination lens, 4 is a mirror, 5 is a condenser lens, 6 is an aperture plate, 7 is an objective lens, 8 is a revolver, and 9, 10, 11 and 12 are relay lenses. , 13 is an eyepiece, 14 is a modulator, and 15 is a stage on which the specimen S is placed.
The aperture plate 6 is disposed at or near the front focal position of the condenser lens. As shown in FIG. 2, the opening plate 6 is provided with a rectangular opening 6 a at a peripheral portion away from the center. In the present embodiment, another aperture plate 6 ′ having a rectangular aperture size different from that of the aperture plate 6 can be replaced. To replace the aperture plate 6 and the aperture plate 6 ′, for example, the aperture plate 6 and the aperture plate 6 ′ may be disposed on the turret 15 and the turret 15 may be rotated. In this way, one of the aperture plate 6 and the aperture plate 6 ′ can be inserted into the optical path. The modulator 14 is arranged at the rear focal position of the objective lens 7 or in the vicinity thereof. This position is substantially conjugate with the aperture plate 6 and the aperture plate 6 ′. Further, the modulator 14 is provided with a region 16 having a transmittance of T% as shown in FIG. The region 16 having a transmittance of T% is formed in the peripheral portion away from the center, like the rectangular opening 6a.
[0009]
In this embodiment, Mo is the radial length in the region 16 where the transmittance is T%, Mc is the radial length in the rectangular opening 6a, fc is the focal length of the condenser lens 5, and fr is the sample surface. To the modulator 14, the following conditional expression is satisfied. The radial direction is the arrow direction shown in FIG. 2 or FIG. This radial direction is a direction orthogonal to a boundary line indicating a change in transmittance in the modulator 14.
1.05 <| (Mo × fc) / (Mc × fr) | <1.4 (1)
8 <T <25 (2)
[0010]
Since the present embodiment is configured as described above, the light from the light source 1 emitted from the rectangular opening 6a (the opening 6b will be described later) is the condenser lens 5, the sample S, the objective lens 7, and the modulator. 14 passes through to form a sample image. As described in the prior art, this specimen image has a contrast according to the shape of the specimen, and the observer observes through the eyepiece 13. The conditional expression (1) satisfies the size of the region of transmittance T of the modulator 14 viewed in the radial direction and the radius of the rectangular opening 6a projected on the plane where the modulator 14 is disposed. It represents the ratio to the size of the direction, and indicates that the size of the region of transmittance T is 1.05 to 1.4 times the size of the aperture image. Since the rectangular opening 6a is disposed in the vicinity of the front focal position of the condenser lens 5, the size of the opening image projected onto the modulator 14 in the radial direction is Mc × fr / fc.
[0011]
In the conventional modulation contrast method, the size of the region of transmittance T% and the size of the rectangular opening projected onto this region are substantially the same. Therefore, when light passes through a specimen having a large unevenness change (a large change in thickness) like an egg cell, the unevenness causes the light to be largely refracted. For this reason, the aperture projected on the modulator 14 is shifted from the region of transmittance T%. As a result, the contrast becomes too high, and the observed image becomes a brilliantly shining image, and the fine portions cannot be seen. On the other hand, in the present invention, the region of transmittance T% is selected so as to be larger than the aperture projected onto the modulator 14, so that the contrast is suppressed and fine portions can be seen well. I can do it.
[0012]
That is, if the upper limit of the conditional expression (1) is not reached, the glare in the observed image becomes too large. Therefore, for example, if it is an egg cell, a zona pellucida and the fine part inside it cannot be seen. If this ratio exceeds the upper limit, the contrast becomes too weak, making it difficult to see the whole egg cell. The conditional expression (2) indicates the numerical condition of the transmittance T%. If this transmittance is lower than the lower limit of the expression (2), for example, in an egg cell, the contrast between the peripheral portion and the central portion is reduced. The difference becomes too strong and the image in the center becomes too dark, making it difficult to observe. Moreover, when this transmittance exceeds the upper limit of the formula (2), the contrast becomes too weak and it becomes difficult to see the whole egg cell.
[0013]
As a result of the experiment, it was found that if | (Mo × fc) / (Mc × fr) | satisfies the following conditions, it is possible to perform modulation contrast observation with a better contrast and resolution balance.
1.15 <| (Mo × fc) / (Mc × fr) | <1.3 (3)
[0014]
In this embodiment, when the distance from the microscope optical axis in the region of transmittance T% is D and the effective radius of the surface on which the modulator 14 is arranged is R (see FIG. 3), the following conditional expression It is preferable to satisfy (4). That is, below the lower limit of the following formula (4), the region of transmittance T% is close to the optical axis and the contrast is improved, but the resolution is deteriorated. Further, if it exceeds the upper limit of the following formula (4), it is advantageous in terms of resolving power, but the contrast deteriorates.
0.2R <D <0.6R (4)
[0015]
In this embodiment, it is preferable that the following conditional expression (5) is satisfied, where NAo is NA of the objective lens having the largest NA (numerical aperture) and NAc is NA of the condenser lens 5.
0.7NAo <NAc (5)
The above equation (5) defines the NA of the condenser lens. However, if this condition is not met, the NA of the condenser lens will be small, and modulation contrast observation with good resolution will not be possible.
[0016]
In the present embodiment, 6a has been described as a rectangular opening, but this may be a ring-shaped opening. However, it is only necessary to be disposed at a position optically conjugate with the rectangular opening 6a on the condenser lens 5 side. An image of the rectangular opening 6a can be formed in the objective lens 7 and in the microscope main body. However, the modulator 14 uses the objective lens because the number of relays of the aperture image is smaller and the aperture image has less aberration. 7 is better.
[0017]
The present invention is characterized by observing a modulation contrast microscope with near infrared light. In recent years, in the field of artificial insemination, it is considered that near-infrared light is less damaging to egg cells than visible light, and TV observation using near-infrared light has been studied. When using near-infrared light, the image of the rectangular opening 6a projected onto the modulator 14 rather than visible light tends to be blurred due to chromatic aberration. Therefore, as shown in the above equation (1), if the area of the transmittance T is set larger than the image of the rectangular opening 6a projected on the modulator 14, even in the TV observation with near infrared light, it is rectangular. The image of the opening 6a having a shape does not protrude beyond the region of transmittance T, and observation with reduced contrast is possible.
[0018]
In the present embodiment, a plurality of aperture members are switched and used for one modulator 14. Regardless of which aperture member is used, the modulator 14 that satisfies the conditional expression (2) is used. As described above, when the rectangular opening 6a is used, the glare is suppressed by slightly reducing the contrast, and the appearance of fine portions is improved. For this reason, when a specimen with few irregularities other than egg cells is viewed, the contrast may be low and difficult to see. In such a case, by switching to an opening member 6 ′ having a large Mc, that is, the opening member 6 ′ having the rectangular opening 6b, observation with good contrast can be performed by deviating from the lower limit of the expression (1). .
[0019]
FIG. 4 is a photograph showing an example of an egg cell image observed by the modulation contrast microscope according to the present embodiment, where (a) is an overall view and (b) is an enlarged view of an edge portion of the egg cell. The magnification of the objective lens used is 20 ×, NA is 0.4, NA of the condenser lens is 0.5, | (Mo × fc) / Mc × fr) | = 1.2, T = 11%, and D / R = 0.53.
[0020]
FIG. 5 is a photograph showing an example of an egg cell image observed with a conventional modulation contrast microscope. FIG. 5A is an overall view, and FIG. 5B is an enlarged view of an edge portion of an egg cell. The magnification of the objective lens used is 20 ×, NA is 0.4, NA of the condenser lens is 0.5, | (Mo × fc) / Mc × fr) | = 1, T = 15%, D / R = 0.625.
[0021]
In FIG. 4A and FIG. 5A, the egg cell is divided into a central circular portion and a ring-shaped (ring-shaped) portion around it. Among these, the ring-shaped part is a transparent band. Here, FIG. 4B and FIG. 5B are compared. Each figure shows a ring-shaped transparent band and its inner structure. Here, in FIG. 5B, the boundary between the transparent zone and its inner structure is shining white, and the boundary between the transparent zone and the outside is black. On the other hand, in FIG. 4B, the boundary between the transparent band and its inner structure and the boundary between the transparent band and the outside are nearly gray. Therefore, in FIG. 4B, the boundary of the zona pellucida can be recognized better. Moreover, the fine granular structure in the peripheral portion of the internal structure of the circular portion can be observed better in FIG.
As is clear from the comparison between FIG. 4B and FIG. 5B, according to the present invention, the edge portion of the egg cell can be observed much more clearly than in the case of the conventional modulation contrast.
[0022]
As described above, the modulation contrast microscope of the present invention has the following characteristics in addition to the characteristics described in the claims.
(1) The modulation according to claim 1, further comprising a modulator having a region of transmittance T (%) arranged at a position substantially conjugate with the aperture and onto which an image of the aperture is projected, and satisfying the following condition: Contrast microscope.
1.15 <| (Mo × fc) / Mc × fr) | <1.3
(2) The modulation contrast microscope according to claim 1, which satisfies the following condition.
0.7NAo <NAc
NAo is the NA of the objective lens with the largest NA of the modulation contrast microscope, and NAc is the NA of the condenser lens.
(3) The modulation contrast microscope according to claim 1, wherein the opening is rectangular.
(4) The modulation contrast microscope according to claim 1, wherein the modulator is disposed in the objective lens.
(5) The modulation contrast microscope according to claim 1, wherein observation is performed using near infrared light.
[0023]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, it is possible to provide a modulation contrast microscope in which the appearance of the zona pellucida is optimized during ICSI.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing an overall configuration of a modulation contrast microscope according to the present invention.
FIG. 2 is a plan view of an aperture plate used in the modulation contrast microscope according to the present invention.
FIG. 3 is a plan view of a modulator used in a modulation contrast microscope according to the present invention.
4A and 4B are photographs showing an example of an egg cell image observed by a modulation contrast microscope according to an embodiment of the present invention, where FIG. 4A is an overall view, and FIG. 4B is an enlarged view of an edge portion of an egg cell.
FIGS. 5A and 5B are photographs showing an example of an egg cell image observed by a conventional modulation contrast microscope, where FIG. 5A is an overall view and FIG. 5B is an enlarged view of an edge portion of an egg cell.
FIG. 6 is a diagram for explaining the principle of modulation contrast.
7 is a diagram for explaining the positional relationship between an aperture image and a modulator, and (a), (b), and (c) correspond to (a), (b), and (c) in FIG. 6, respectively. is doing.
8A is a diagram showing an example of a shape of a specimen, and FIG. 8B is a diagram showing shades appearing corresponding to the specimen.
[Explanation of symbols]
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Light source 2 Collector lens 3 Illumination lens 4 Mirror 5 Condenser lens 6 Aperture board 6a, 6b Aperture 6a ', 6b' Aperture image 7 Objective lens 8 Revolver 9, 10, 11, 12 Relay lens 13 Eyepiece 14 Modulator
S specimen

Claims

Modulation comprising a light source, a condenser lens, an aperture member having a partial aperture disposed in the vicinity of the front focal position of the condenser lens, an objective lens, and a modulator disposed at a position substantially conjugate with the aperture member A modulation contrast microscope, characterized in that the modulator has a region of transmittance T (%) and satisfies the following conditions.
1.05 <| (Mo × fc) / ( Mc × fr) | <1.4
8 <T <25
Where Mo is the radial length in the region of the transmittance T, Mc is the radial length of the partial aperture , fc is the focal length of the condenser lens, and fr is the distance from the sample surface to the modulator. This is the focal length of an optical system.

The microscope according to claim 1, wherein a distance D from the microscope optical axis in the region of the transmittance T satisfies the following condition.
0.2R <D <0.6R
Where R is the effective radius of the surface on which the modulator is disposed.