JP3974620B2

JP3974620B2 - 還元剤を用いる改良された免疫診断アッセイ

Info

Publication number: JP3974620B2
Application number: JP2005000767A
Authority: JP
Inventors: ヘールト・メールテンス; ヨースト・ロウワヒー; アルフォンス・ボスマン; エルウィン・サブロン; マーン・ズレイン
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1998-04-17
Filing date: 2005-01-05
Publication date: 2007-09-12
Anticipated expiration: 2019-04-15
Also published as: CA2658218C; BRPI9909678B8; PL343469A1; CA2324970C; PT1071955E; DE69920895T2; PT1471074E; TR200202213T2; TR200101647T2; AU3817199A; AU751362B2; TR200003024T2; HK1036653A1; DK1071955T4; EP1471074B1; CY1108424T1; JP2005185285A; CZ20003819A3; EP1071955A1; ZA200005445B

Description

本発明は、ＨＣＶ感染の診断および治療の分野に関する。より詳細には、本発明は、ＨＣＶＮＳ３ヘリカーゼおよびその使用に関する。また本発明は、改良された免疫診断アッセイにも関する。

Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）はフラビウイルス科中の属を構成しており、Ｇ型およびＧＢ型肝炎ウイルスならびにペスチウイルスに対して相同性を有する。プラス鎖ＲＮＡゲノムは少なくとも９個の蛋白をコードしている。コア、Ｅ１およびＥ２は構造蛋白を構成する。ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂは非構造（ＮＳ）蛋白である。ＨＣＶ単離体は高レベルの配列異種性を示し、少なくとも１１タイプおよび９０サブタイプに分類される（Maertens and Stuyver, 1997）。ヒト肝臓へのＨＣＶの感染は、しばしば、臨床的に良性であり、急性フェーズにおいて弱い黄疸を伴う。急激に寛解するＣ型肝炎のいくつかの場合には、疾病は気づかれない可能性がある。しかしながら、大部分のケース（＞７０％）において、ＨＣＶ感染は慢性の持続的なまたは活性のある感染となり、しばしば、肝硬変および自己免疫性疾患といった合併症を伴う。肝細胞癌腫が約２０ないし３５年後に生じる可能性があり（Saito et al., 1990）、肝硬変の中間フェーズを伴わない場合がある。今日、予防策はなく、ＨＣＶ遺伝子型によっては、インターフェロン−α（ＩＮＦ−α）での治療のみが治療ケースの約４ないし３６％において長期の寛解を引き起こす（Maertens and Stuyver, 1997）。

ＨＣＶの生産的培養方法が現在利用できず、ごくわずかな量のＨＣＶ抗原しか感染患者体内を循環していないので、ＨＣＶ粒子の直接的検出をルーチンに行うことはできず、ＨＣＶＲＮＡを検出するために面倒な増幅方法を用いる間接的診断のみが可能である。他の多くのウイルス感染とは異なり、一般的には、大部分のＨＣＶ蛋白に対する細胞性および体液性免疫応答の存在にもかかわらずＨＣＶ粒子は血液、肝臓およびリンパ球中に持続的に存在する。便利には、ＨＣＶ抗体をＥＬＩＳＡ法により検出することができ、そのことにより血液銀行および臨床研究室における高処理量スクリーニングが可能となる。補足的な抗体試験が必要であり、現在、多くの国において必須となっている。このようにして真のＨＣＶの反応性が偽の反応性から区別されるが、偽の反応性は、被覆剤もしくはブロッキング剤への、またはＨＣＶ抗原調合物中に存在する汚染混入物質への、または組み換え抗原自体の融合部分もしくは非特異的領域への血清または血漿の免疫グロブリンまたは抗イディオタイプ成分の非特異的結合により生じる可能性がある（McFarlane et al., 1990）。慢性ＨＣＶ疾病、特に治療中のものをモニターするために、ＰＣＲまたは分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）法によるＨＣＶＲＮＡの検出が最近になって導入された。驚くべきことに、繰り返してＨＣＶＡｂ陽性である患者のわずか〜７０ないし９４％がネステッドＰＣＲにより陽性となるという事実にもかかわらず、ＨＣＶＲＮＡの検出は、しばしば、ＨＣＶＡｂスクリーニング試験を確認するために使用されている（Martin et al., 1994）。通常には温和な形態の疾病を示し、低いＨＣＶＲＮＡレベルであるＨＣＶＡｂ陽性血ドナーのうち、ネステッドＰＣＲにより確認されるのは〜４０％のオーダーである（Waumans et al., 1993; Stuyver et al., 1996）。それゆえ、片をベースにしたアッセイ（strip-based assay）はＨＣＶＡｂの確認のためのわずかに信頼できる別法を提供するものである。確認アッセイにおける中間的結果の場合、患者についてＨＣＶＲＮＡの検出よりもむしろ血清学的フォローアップが推奨される（Di Bisceglie et al., 1998）。生の（native）ＨＣＶ抗原は十分な量の使用ができないので、かかる確認アッセイには合成ペプチドおよび／またはＨＣＶ蛋白の組み換えフラグメントが用いられる。抗体確認において最も臨床的に用いられるのはＮＳ３蛋白の反応性である（Zaaijer et al., 1994）。しばしばＮＳ３抗体は一連のセロコンバージョンの最初に出現し、ＮＳ３蛋白の反応性は現在利用可能な個々の市販アッセイにおいて異なると思われる。

イノジェネティックス（Innogenetics）は、通常には合成ペプチドと組み換え蛋白との組み合わせを序列化され容易に読み取れるようになった個別の線として適用する、片による方法（strip technology）の概念を導入した。INNO-LIA HIV Ab試験はルーチンに使用されるウェスタンブロットよりも優れていることが証明された（Pollet et al., 1990）。Line Immuno Assayは多パラメーター試験を可能にし、かくしてカットオフおよび他の評価システムならびに試料添加コントロールを可能にし、さらにＥＬＩＳＡ試験におけるいくつかの抗原に必要な担体または融合パートナーとして用いられる非ＨＣＶ蛋白に関する偽の反応性の試験も可能とした。原理的には、該試験フォーマットは異なる病原体または表現型的にリンクした条件を単一試験において組み合わせることを可能にする。

INNO-LIA HCV Ab IIIは、コア領域、Ｅ２超可変領域（ＨＶＲ）、ＮＳ３ヘリカーゼ領域、ならびにＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ａ領域に由来するＨＣＶ抗原を含む第３世代のLine Immuno Assayである。当該第３世代のアッセイにおいて、高度に精製された組み換えサブタイプ１ｂＮＳ３蛋白およびＥ２ペプチドにより高感度が実現される一方で、ペプチドをベースにした試験の特徴である信頼できる特異性（Peeters et al., 1993）が担保されている。おそらく、このアッセイの最も重要な特徴の１つは、今までにないＨＣＶＲＮＡ陽性との相関関係である（Claeys et al., 1992; De Beenhouwer et al., 1992）。

抗原は６本の別個の線としてプラスチックで裏打ちされたナイロン片上に被覆される。さらに、４種の対照線、すなわち、抗ストレプトアビジン、３＋陽性対照（抗ヒトＩｇ）、１＋陽性対照（ヒトＩｇＧ）、および±カットオフ線が各片上に被覆される。希釈された試験試料をLIA III片と一緒にインキュベーションする。ＨＣＶ抗体が試験試料中に存在する場合には、ＨＣＶ抗体が片上のＨＣＶ抗原線に結合するであろう。次いで、アフィニティー精製されたアルカリ性ホスファターゼで標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抱合体が添加され、特異的なＨＣＶ抗原／抗体複合体が生成されている場合にはこれと反応する。酵素基質とのインキュベーションにより栗色が生じ、その強度は試料から捕獲された特定線上のＨＣＶ特異的抗体量に比例する。硫酸を用いて発色を停止させる。ＨＣＶ特異的抗体が存在しない場合、抱合体のみが±、１＋、および３＋対照線に結合する。試料を添加しない場合には、±および１＋対照線のみが染色される。
De Beenhouwer et al., (1992) Vox. Sang. 63, 198-203

改良されたＨＣＶ診断アッセイ成分および治療蛋白を提供することが本発明の目的である。

より詳細には、ＨＣＶ抗体の診断および／またはＨＣＶの治療に使用する改良されたＨＣＶＮＳ３蛋白調合物を提供することが本発明の目的である。
固相上に存在する組み換えまたは合成ＮＳ３ヘリカーゼ蛋白またはその一部分とＨＣＶ抗体との反応性を増大させる方法を提供することが本発明のさらなる目的である。
システイン含有組み換え蛋白、より詳細には、組み換えＨＣＶ蛋白の新規精製方法を提供することも本発明の目的である。
新たなＨＣＶＮＳ３蛋白コーディング配列を提供することも本発明の目的である。
産物が疑陽性ＨＣＶ試料とは反応しない新たなＨＣＶＮＳ３蛋白コーディング配列を提供することも本発明の目的である。
本発明の核酸を検出する方法を提供することも本発明の目的である。
本発明の核酸を検出するためのプローブおよびプライマーを提供することも本発明の目的である。
本発明の核酸を検出するための診断キットを提供することも本発明の目的である。
新たなＨＣＶＮＳ３ポリペプチドを提供することが本発明のもう１つの目的である。
疑陽性ＨＣＶ試料とは反応しない新たなＨＣＶＮＳ３ポリペプチドを提供することが本発明のもう１つの目的である。
ＨＣＶ感染を予防または治療するための医薬組成物を提供することが本発明のもう１つの目的である。
本発明のポリペプチドを検出する方法を提供することが本発明のもう１つの目的である。
受動免疫および／または治療に使用する本発明のポリペプチドに対する抗体を提供することが本発明のもう１つの目的である。
本発明のポリペプチドの製造方法を提供することが本発明のもう１つの目的である。
本発明のすべての目的は、後で示す具体例に合致すると考える。

本発明により、改良されたＨＣＶ診断アッセイ成分および治療蛋白が提供される。

定義
以下の定義は本明細書に用いられる異なる用語および表現を説明するものである。
用語「ＨＣＶＮＳ３」は、ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼまたはヘリカーゼのいずれかの少なくとも１つのエピトープを示すアミノ酸配列（および／またはアミノ酸アナログ）を含むポリペプチドまたはそのアナログ（例えば、ミモトープ（mimotopes））をいう。
用語「Ｃ型肝炎ウイルスエンベロープ蛋白」は、Ｅ１またはＥ２領域のいずれかの少なくとも１つのＨＣＶエピトープを示すアミノ酸配列（および／またはアミノ酸アナログ）を含むポリペプチドまたはそのアナログ（例えば、ミモトープ）をいう（WO96/04385参照、参照により本明細書に一体化させる）。
本発明の実施例セクションにおいて使用される単離体（生物学的試料）は本発明を限定するものでなく、タイプ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または他の新たなＨＣＶ遺伝子型に属するＨＣＶ単離体は本発明の実施に適したＨＣＶ配列源であることも理解されるはずである。

本発明に使用するＨＣＶ抗原は全長ウイルス蛋白、その実質的に全長のバージョン、あるいはそれらの機能的フラグメント（例えば、エピトープの形成または保持に必須の配列を失っていないフラグメント）であってもよい。さらにそのうえ、本発明のＨＣＶ抗原は、目的のコンホーメーション的エピトープの形成をブロックまたは妨害しない他の配列を包含しうる。抗体（ポリクローナル血清またはモノクローナル抗体）を用いて目的抗原をスクリーニングし、その反応性を、直鎖状エピトープ（存在する場合に）を保持している変性バージョンの抗原の反応性と比較することにより、コンホーメーション的エピトープの存在または不存在を容易に調べることができる。かかるスクリーニングにおいてポリクローナル抗体を用いる場合、最初にポリクローナル血清を変性抗原に吸着させ、それが目的抗原に対する抗体を保持しているかどうかを調べることが有利であるかもしれない。

用語「融合ポリペプチド」は、ポリペプチド中において、抗原が、詳細にはＨＣＶ抗原が天然には存在しない１本の連続したアミノ酸鎖の一部となっているポリペプチドを意味する。ペプチド結合によりＨＣＶ抗原を互いに直接連結することができ、スペーサーアミノ酸配列により分離することができる。融合ポリペプチドはＨＣＶに関して外来性のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
用語「固相」または「固体支持体」は、個々のＨＣＶ抗原またはＨＣＶ抗原含有融合ポリペプチドが共有結合され、あるいは疎水的吸着のごとき手段により非共有結合される固体を意味する。固相の例はマイクロタイタープレート、ナイロンまたはニトロセルロース片のごとき膜片、およびシリコンチップを包含する。
用語「生物学的試料」は、通常には個体により生成された抗体、詳細にはＨＣＶに対する抗体を含有する、哺乳動物個体（例えば、類人猿、ヒト）の体液または組織を意味する。体液または組織はＨＣＶ抗原を含んでいてもよい。かかる成分は当該分野において知られており、血液、血漿、血清、尿、脊髄液、リンパ液、呼吸器、腸管もしくは性器分泌物、涙、唾液、乳、白血球細胞および骨髄腫を包含するが、これらに限らない。体成分は生物学的液体を含む。用語「生物学的液体」は器官から得られる液体をいう。いくつかの生物学的液体は、凝固因子（例えば、因子ＶＩＩＩ）、血清アルブミン、成長ホルモン等のごとき他の生成物の源として使用される。かかる場合において、生物学的液体の源がＨＣＶのごときウイルスによるコンタミネーションがないことが重要である。

用語「免疫学的に反応性のある」は、問題となる抗原がＨＣＶ感染個体または免疫個体由来の体成分中の存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応することを意味する。
用語「免疫複合体」は、抗体がエピトープまたは抗原に結合した場合に形成される複合体を意味する。
本明細書の用語Ｅ１およびＥ２は、WO96/04385中に十分に記載されており、該文献を参照により本明細書に一体化させる。

蛋白に用いられる用語「精製」は、所望蛋白が組成物中の全蛋白成分の少なくとも３５％を占めている組成物をいう。好ましくは、所望蛋白は全蛋白成分の少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６０％、さらに好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは、少なくとも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％を占める。純度のパーセンテージ決定に影響しない場合には、組成物は炭水化物、塩類、脂質、溶媒等のごとき他の成分を含んでいてもよい。「単離」ＨＣＶ蛋白は、純度が少なくとも３５％であるＨＣＶ蛋白成分を意味する。
用語「本質的に精製された蛋白」は、インビトロ診断法に使用され、治療化合物として使用されるように精製されている蛋白をいう。これらの蛋白は細胞の蛋白またはＤＮＡ、ベクター由来の蛋白またはＤＮＡ、あるいは他のＨＣＶウイルス性成分を実質的に含まない。通常には、これらの蛋白は均質に精製されている（少なくとも純度８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、より好ましくは９９％、さらにより好ましくは９９．５％、最も好ましくはＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色のような慣用的方法によっては混入蛋白が検出されない）。

本明細書の用語「組み換え発現」は、本発明蛋白が、以下に詳述する原核細胞、下等もしくは高等真核細胞において組み換え発現法により製造されるという事実をいう。
用語「下等真核細胞」は、酵母、真菌等のごとき宿主細胞をいう。一般的には、下等真核細胞は単細胞である（必ずしもそうでなくもよい）。好ましい下等真核細胞はSaccharomyces、Schizosaccaromyces、Klyveromyces、Pichia（例えば、Pichia pastoris）、Hansenula（例えば、Hansenula polymorpha）、Yarowia、Schwanniomyces、Zygosaccaromyces等である。Saccharomyces cerevisiae、S. carlsbergensisおよびK. lactisは最も普通に使用される酵母宿主である。

用語「原核細胞」は、E. coli、Lactobacillus、Lactococcus、Salmonalla、Streptococcus、Bacillus subtilisまたはStreptomyecsのごとき宿主をいう。これらの宿主も本発明の範囲内であると考える。
用語「高等真核細胞」は、哺乳動物、爬虫類、昆虫等のごとき高等動物由来の宿主細胞をいう。現在好ましい高等真核宿主細胞はチャイニーズハムスター由来（例えば、ＣＨＯ）、サル由来（例えば、ＣＯＳおよびＶｅｒｏ細胞）、幼若ハムスター腎臓由来（ＢＨＫ）、ブタ腎臓由来（ＰＫ１５）のもの、ウサギ腎臓１３細胞（ＲＫ１３）、ヒト骨肉腫細胞系１４３Ｂ、ヒト細胞系ＨｅＬａおよびＨｅｐＧ２のようなヒト肝癌細胞系、ならびに昆虫細胞系（例えば、Spodoptera frugiperda）由来のものである。宿主細胞は懸濁液またはフラスコ培養物、組織培養物、器官培養物等として提供されううる。あるいはまた、宿主細胞はトランスジェニック動物であってもよい。

用語「ポリペプチド」はアミノ酸のポリマーをいい、特定の長さの生成物をいうのではない。よって、ペプチド、オリゴペプチドおよび蛋白はポリペプチドの定義に含まれる。またこの用語はポリペプチドの発現後修飾物、例えば、糖鎖付加物、アセチル化物、リン酸化物等を排除するものではない。例えば、１またはそれ以上のアミノ酸アナログ（例えば、非天然アミノ酸、ＰＮＡ等を包含）を含有するポリペプチド、置換結合を有するポリペプチド、ならびに当該分野において知られた他の天然および非天然修飾物がこの定義に含まれる。

用語「組み換えポリヌクレオチド」は、その起源または取り扱いに応じて、ポリヌクレオチドまたはゲノムの核酸、ｃＤＮＡ、半合成または合成のものを意味し、以下のものがある：（１）天然において結合しているポリヌクレオチドの全体または一部分に結合していないもの、（２）天然において結合しているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに結合しているもの、あるいは（３）天然において存在しないもの。

用語「組み換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」、ならびに単細胞として培養された微生物または高等真核細胞系を示す他のかかる用語は、組み換えベクターまたは他の導入ポリヌクレオチドのレシピエントとして用いることのできる、あるいは用いられている細胞をいい、トランスフェクションされた元の細胞の子孫を包含する。単一の親細胞の子孫は、自然、偶発的または人工的な変異のため、形態またはゲノムもしくは全ＤＮＡ相補性において必ずしも親と同じでなくてもよい。

用語「レプリコン」は遺伝学的エレメント、例えば、プラスミド、染色体、ウイルス、コスミド等であり、細胞中でポリヌクレオチド複製の自律的単位として挙動するもの、すなわち、自分自身の制御下で複製しうるものである。
用語「ベクター」は、所望オープンリーディングフレームの複製および／または発現を提供する配列をさらに含むレプリコンである。

用語「制御配列」は、連結されているコーディング配列の発現を起こさせるのに必要なポリヌクレオチド配列をいう。かかる制御配列の性質は宿主生物により異なる。原核細胞においては、一般的にかかる制御配列はプロモーター、リボソーム結合部位、およびターミネーターを含む。真核細胞においては、一般的にかかる制御配列はプロモーターを含み、エンハンサーを含んでいてもよい。用語「制御配列」は、最少でも、存在が有利であるさらなる成分、例えば、分泌をつかさどるリーダー配列を含んでいてもよい。

用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡ鋳型に結合させて、隣接する構造遺伝子に対する正常転写開始部位におけるｍＲＮＡ生成を開始させるコンセンサス配列を含むヌクレオチド配列である。
「作動可能に連結」なる表現は、そのように説明される成分が意図される様式で機能するような関係にある並置をいう。制御配列に適合した条件下でコーディング配列の発現が達成されるように制御配列がコーディング配列に「作動可能に連結」される。
「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）は、選択されたリーディングフレーム中のポリペプチドをコードしているが停止コドンを含まないポリヌクレオチド配列の領域をいう。この領域はコーディング配列の一部またはコーディング配列全体であってもよい。
「コーディング配列」は、適当な調節配列の制御下に置かれた場合、ｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。５’末端のスタートコドンおよび３’末端の翻訳停止コドンの翻訳によってコーディング配列の境界が決定される。コーディング配列はｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを包含）、および組み換えポリヌクレオチド配列を包含しうるが、これらに限らない。

用語「エピトープ」または「抗原決定基」は免疫反応性のあるアミノ酸配列を意味する。一般的には、エピトープは少なくとも３個または４個のアミノ酸からなり、より通常には少なくとも５個または６個のアミノ酸、時々、約７個ないし８個、あるいは約１０個のアミノ酸からなる。本明細書において用いるように、ポリペプチドのエピトープとは、該ポリペプチド中のエピトープと同じアミノ酸配列ならびにその免疫学的同等物をいう。また、かかる同等物は、例えば、遺伝子型1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 1f, 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 2g, 2h, 2i, 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f, 3g, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j, 4k, 4l, 5a, 5b, 6a, 6b, 6c, 7a, 7b, 7c, 8a, 8b, 9a, 9b, 10a, 11a, 12aに属する現在知られている配列または株あるいは新たに決定されたＨＣＶ（サブ）タイプの株、サブタイプ（＝遺伝子型）またはタイプ（グループ）特異的変種を包含する。エピトープを構成するアミノ酸は直鎖状配列の部分である必要はないが、いずれかの数のアミノ酸からなる１個またはそれ以上の列をなして散在し、かくしてコンホーメーション的エピトープを形成していてもよいことが理解されるべきである。
用語「免疫原性」は、体液性および／または細胞性の応答を引き起こす物質の能力をいい、該物質はアジュバント存在下または不存在下において、単独であっても、担体に結合していてもよい。「中和」は、感染性物質の感染性を不完全または完全にブロックする免疫応答をいう。「ワクチン」はＨＣＶに対する不完全または完全な防御を誘導しうる免疫学的組成物である。治療ワクチンと呼ばれる場合には、ワクチンは個体の治療にも有用でありうる。
用語「治療的」は、ＨＣＶ感染を治療しうる組成物をいう。
「有効量」は、投与された個体において免疫学的応答を誘導するに十分、あるいは意図された系（例えば、イムノアッセイ）において検出可能に免疫反応するに十分なエピトープを有するポリペプチドの量をいう。好ましくは、有効量は、上で定義した治療を行うに十分な量である。正確な必要量は適用例により異なるであろう。

「抗体」はポリクローナルまたはモノクローナル抗体をいう。用語「モノクローナル抗体」は、均一な抗体集団を有する抗体組成物をいう。当該用語は抗体の種または源に限定されず、さらにまた作成方法にも限定されない。ヒト化抗体、１本鎖抗体あるいは該抗体の特異性をほぼ保持しているそれらの他のフラグメントが本発明によりカバーされることにも留意すべきである。
本明細書の用語「ヒト化抗体」は、免疫グロブリンのフレームワーク領域の少なくとも一部分がヒト免疫グロブリン配列に由来することを意味する。
本明細書の用語「１本鎖抗体」は、結合抗体の結合ドメイン（重鎖および軽鎖の両方）を決定し、結合機能の保存を可能にする連結部分を提供することにより調製される抗体をいう。
本明細書の用語「（抗体の）フラグメント」は、元の抗体の抗原結合機能および特異性を保持しているＦ_ab、Ｆ_(ab)2、Ｆ_vおよび他のフラグメントをいう。

発明の詳細な説明
より詳細には、本発明は、還元剤の存在下における固相上の抗体を含む固相イムノアッセイに関する。実施例セクションで示すように、本発明者らは、固相に対して被覆された抗原とともにＤＴＴのごとき還元剤が存在することは、固相イムノアッセイと組み合わせた抗原を、該抗原に指向された抗体に対してずっと反応性にすることを見出した。溶液中においても、還元により抗原はより反応性となる。
本発明の還元剤はＳ−Ｓジスルフィド架橋を還元するいずれかの作用剤である。「Ｓ−Ｓ」ジスルフィド架橋の還元は化学反応であり、それによりジスルフィドが還元されてチオール（−ＳＨ）になる。ＷＯ９６／０４３８５に開示されたジスルフィド架橋破壊剤および方法を、参照により本明細書に一体化させる。「Ｓ−Ｓ」還元を、（１）酵素カスケード経路、または（２）還元性化合物により行うことができる。チオレドキシン、グルタレドキシンのような酵素はインビボにおけるジスルフィドの還元に関与することが知られており、インビトロにおける「Ｓ−Ｓ」架橋の還元に有効であることが示されている。ｐＨ７．０において還元されたチオレドキシンによりジスルフィド結合が迅速に開裂され、ＤＴＴとの反応に関する速度定数よりも約１０⁴倍大きな見かけの２次反応速度を有する。蛋白溶液を１ｍＭのＤＴＴまたはジヒドロリポアミドとともにプレインキュベーションすることにより還元のキネティクが劇的に増大しうる（Holmgren,1979）。

蛋白のジスルフィド架橋を還元することのできるチオール化合物は、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリチオール（ＤＴＥ）、β−メルカプトエタノール、チオカルバメート類、ビス（２−メルカプトエチル）スルホンおよびＮ，Ｎ’−ビス（メルカプトアセチル）ヒドラジン、ならびにナトリウム−チオナイトである。
アスコルビン酸または塩化すず（ＳｎＣｌ₂）のようなチオール基を有しない還元剤は、モノクローナル抗体中のジスルフィド架橋の還元に非常に有用であることが示されており（Thakur et al., 1991）、それらをＮＳ３の還元に使用してもよい。水素化ホウ素ナトリウムでの処理はペプチド中のジスルフィド架橋の還元に効果的であることが示されている（Gailit,1993）。トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）は低いｐＨにおいてジスルフィドを還元することができる（Burns et al., 1991）。ＤＴＴまたは水素化ホウ素ナトリウムを還元剤として用いる場合、セレノールはジスルフィドからチオールへの還元を触媒する。市販ジセレニドであるセレノシステアミンが触媒前駆体として使用された（Singh and Kats, 1995）。

より詳細には、本発明は、抗原を固相に被覆、ブロッキングおよび／または固定する工程の間に還元剤が固相に添加される上記イムノアッセイの製造方法に関する。
また本発明は、固相の前処理工程の間に還元剤が添加される上記イムノアッセイを実行する方法に関する。

被覆条件は当業者に知られているように広範であり、固相に蛋白を適用し、反応を起こさせて蛋白を固相に結合させることを包含する。結合は、共有結合、疎水結合またはイオン結合、ファンデルワールス力または水素結合であってよいが、これらに限らない。当業者に知られた別のバッファーをこの工程に使用してもよく、カルバメートおよびホスフェートバッファーがあるが、これらに限らない。
当該分野知られている方法によりブロッキングを行うことができ、例えば、アルブミン、血清蛋白、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、界面活性剤、ゼラチン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）またはカゼインを用いて行ってもよい。
当該分野において知られた方法により固定を行う。
ブロッキング、固定および被覆条件のさらなる例を実施例セクションに示す。

さらに詳細には、本発明は、抗原を固相に被覆する工程の間に還元剤が固相に添加される上記方法に関する。被覆バッファーの例を実施例セクションに示す。知られている他のすべての被覆バッファーも本開示の一部を形成する。

また本発明は、固相をブロックする工程の間に還元剤が固相に添加される上記方法にも関し、固相は還元剤の存在下または不存在下でそれに適用された抗原を含む。ブロッキングバッファーの例を実施例セクションに示す。知られている他のすべてのブロッキングバッファーも本開示の一部を形成する。

また本発明は、被覆抗原を固相に固定する工程の間に還元剤が固相に添加される上記方法にも関し、固相は還元剤の存在下または不存在下でそれに適用された抗原を含む。固定工程の前に、還元剤の存在下または不存在下でのブロッキング工程を行ってもよい。固定バッファーの例を実施例セクションに示す。知られている他のすべての固定バッファーも本開示の一部を形成する。

また本発明は、試料添加前における固相の前処理工程の間に還元剤が添加される上記方法に関する。被覆、ブロッキングおよび／または固定工程において還元剤で処理されたプレートに関して、あるいは前以て還元剤で処理されていないプレートに関してプレートの前処理を行うことができる。

結局、酵素イムノアッセイにおいて行われるさらなる工程の間に還元剤を添加してもよいが、可能には、被覆、ブロッキング、固定および／または前処理からなる上記４工程の１つまたはそれ以上において還元剤を適用した後に還元剤を添加する。かかるさらなる工程は抗体のインキュベーション、結合抗体の検出および発色を包含するが、これらに限らない。

好ましくは、本発明は、還元剤がＤＴＴ、ＤＴＥまたはＴＣＥＰである上記方法に関する。

また本発明は、還元剤が０．１ｍＭないし１Ｍ、より詳細には０．５ｍＭないし５００ｍＭ、さらにより詳細には１ｍＭないし２５０ｍＭ、最も詳細には１ないし５０ｍＭの濃度範囲で使用される上記方法に関する。いくつかの適用例においては０．５ないし５０ｍＭ、１ないし３０ｍＭ、２ないし２０ｍＭ、５ないし１５ｍＭの範囲、あるいは約１０ｍＭの還元剤が必要となりうる。他の適用例においては５０〜５００ｍＭ、１００〜３００ｍＭまたは２００ｍＭの濃度のＤＴＴが必要となりうる。ＤＴＴは還元剤として特に好ましい。

また本発明は、抗原がＨＣＶＮＳ３蛋白である上記方法に関する。より詳細には、ＨＣＶＮＳ３ヘリカーゼである。Ｅ１および／またはＥ２蛋白のごときＨＣＶエンベロープ蛋白も好ましい。当該分野で知られた他の蛋白も、ＤＴＴ存在下で固相に添加された場合、あるいは添加後ＤＴＴで処理された場合に、該蛋白に対する抗体とうまく反応する可能性がある。

また本発明は、該固相イムノアッセイが異なる病原体の抗原または表現型的に関連した条件の組み合わせを含むものである上記方法に関する。

また本発明は、上記方法により製造される固相イムノアッセイに関する、より詳細には、還元剤の存在下で抗原を含有するマイクロタイタープレート、膜片またはシリコンチップのごとき固相を少なくとも１個含むキットに関する。
より詳細には、本発明は、上記方法により製造されるＥＬＩＳＡに関する。

好ましい具体例において、本発明は、好ましくは被覆および／または固定工程において還元剤が添加される上記方法により製造されるＥＬＩＳＡに関する。１の好ましい具体例において、被覆工程において還元剤を適用することができる。もう１つの好ましい具体例において、固定工程において還元剤を適用することができる。特に好ましい具体例において、被覆工程および固定工程の両方において還元剤が添加される。
もう１つの好ましい具体例において、本発明は、試料添加前におけるプレートの前処理の間に還元剤が添加される上記方法により製造されるＥＬＩＳＡに関する。被覆および／または固定工程において還元剤で処理されたプレートに関して、あるいは前以て還元剤で処理されていないプレートに関してプレートの前処理を行うことができる。プレートの前処理を行うことができる。酵素イムノアッセイにおけるさらなる工程の間に還元剤を添加してもよい。かかるさらなる工程は抗体のインキュベーション、結合抗体の検出および発色を包含するが、これらに限らない。

また本発明は、上記方法により製造されるラインイムノアッセイ（ＬＩＡ）にも関する。
好ましい具体例において、本発明は、好ましくはブロッキング工程および／または洗浄工程において還元剤が添加される上記方法により製造されるラインイムノアッセイ（ＬＩＡ）に関する。酵素イムノアッセイを製造または実行するさらなる工程の間に還元剤を添加してもよい。かかるさらなる工程は、固定、前処理、抗体のインキュベーション、結合抗体の検出および発色を包含するが、これらに限らない。

また本発明は、上記方法により製造されるクイック（ＱＵＩＣＫ）アッセイにも関する。
好ましい具体例において、本発明は、好ましくは抗原を片に被覆する工程の間に還元剤が添加される上記方法により製造されるＱＵＩＣＫアッセイに関する。ＱＵＩＣＫアッセイは、スプレイにより抗原が片上に被覆される水平流れアッセイ（lateral flow assay）である。このアッセイにおいて、好ましくは還元剤をスプレイ溶液に添加する。酵素イムノアッセイの製造または実行におけるさらなる工程の間に還元剤を添加してもよい。かかるさらなる工程は、ブロッキング、固定、前処理、抗体のインキュベーション、結合抗体の検出および発色を包含するが、これらに限らない。
また本発明は、上記抗原に対して生成した抗体のインビトロでの診断のための上記アッセイの使用に関する。

また本発明は、スルホン化およびその後の脱スルホン化の工程を含む方法により処理されたＨＣＶＮＳ３蛋白にも関する。
スルホン化および脱スルホン化はそれぞれ蛋白に−ＳＯ₃基を導入または蛋白から除去する反応である。
スルホン化は、下記反応に従って蛋白（Ｒ）上のチオール基（ＳＨ）およびジスルフィド基をＳ−スルホネートに変換するプロセスであると定義される。
RSH ---> RS-SO₃ ^-(1)
RS-SR + 2 -SO₃ ^- + H₂O --> 2 RS-SO₃ ^-+ 2 OH^-(2)
反応生成物はＳ−スルホ蛋白であり、通常には中性ｐＨにおいて安定である。ｐＨ＞７において蛋白溶液をテトラチオネートとともにインキュベーションすることにより反応（１）を行うことができる（Inglis and Liu, 1970）。銅イオン存在下で反応（２）を完了させる（Cole, 1967）。Chan(1968)は、酸素の存在下における亜硫酸ナトリウムおよび触媒量のシステインでの蛋白の処理によりスルホ蛋白が得られることを示した。
（１）過剰の競合−ＳＨ（チオール）基により、（２）還元剤により、あるいは（３）非中性ｐＨ条件におけるインキュベーションにより、脱スルホン化を行うことができる。
RS-SO₃ ^- + R'SH ---> RSH + R'S-SO₃ ^-
RS-SO₃ ^- + 還元剤 ---> RSH
低分子量化合物または蛋白性−ＳＨ基から競合チオール基を得てもよい。
モノ−またはジチオール含有化合物の例は：
システイン、システアミン、還元されたグルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、ホモシステイン、β−メルカプトエタノール、チオカルバメート類、ビス（２−メルカプトエチル）スルホン（ＢＭＳ）およびＮ，Ｎ’−ビス（メルカプトアセチル）ヒドラジン（ＢＭＨ）、５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢまたはElman試薬）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびジチオエリスリトール（ＤＴＥ）である。

さらに本発明は、両性イオン性界面活性剤でさらに処理された上記ＨＣＶＮＳ３蛋白に関する。エムピゲン（Empigen）はベタインとして知られ、両性イオン性界面活性剤の特に好ましい例である。他の適当な界面活性剤は当業者に知られており、ＷＯ９６／０４３８５にも説明されている。

さらに本発明は、少なくとも２つ、好ましくは３つまたは４つ、さらに好ましくはすべての下記工程：
（ａ）組み換え宿主細胞からの溶解物をスルホン化すること、あるいは塩化グアニジウム（好ましくは、６ＭＧｕ．ＨＣｌ）の存在下で組み換え宿主細胞を溶解させて細胞溶解物をスルホン化すること、
（ｂ）好ましくは細胞残渣を除去した後に、両性イオン性界面活性剤で処理すること、
（ｃ）スルホン化組み換え蛋白を精製すること、あるいはスルホン化組み換え蛋白を精製し、その後両性イオン性界面活性剤を除去すること、ここに好ましくは、精製はクロマトグラフィー、より好ましくはＮｉ−ＩＭＡＣクロマトグラフィーであり、組み換え蛋白はＨｉｓ−タグを付した組み換え蛋白である、
（ｄ）好ましくはモル過剰のＤＴＴのごとき還元剤でスルホン化組み換え蛋白を脱スルホン化すること、
（ｅ）モル過剰のＤＴＴの存在下で貯蔵すること
を含む、システイン含有組み換え発現蛋白の精製方法に関する。
エムピゲンは両性イオン性界面活性剤の特に好ましい例である。かかる両性イオン性界面活性剤およびＤＴＴを用いることは、ＨＣＶＮＳ３ヘリカーゼおよびＨＣＶエンベロープ蛋白の精製プロトコールを改良するものである。

また本発明は、図１（配列番号：３〜１８）に示すＨＣＶＮＳ３ポリ蛋白（polyprotein）をコードするＨＣＶポリ核酸（polynucleic acid）、または図２−１、３−１、４−１、５−１、６−１、７−１および８−１（配列番号：１９、２１、２３、２５、２７、２９および３１）に示す配列を有するＨＣＶポリ核酸に関する。
また本発明は、図２−１、３−１、４−１、５−１、６−１、７−１および８−１において特徴づけられ、さらにその産物が疑陽性ＨＣＶ試料と反応しない事実により特徴づけられる上記ＨＣＶポリ核酸、あるいは疑陽性ＨＣＶ試料と反応しないＮＳ３エピトープをコードする該ポリ核酸の部分にも関する。配列番号：１９、２１、２３、２５、２７、２９および３１により示されるクローンによってコードされる蛋白は疑陽性ＨＣＶ試料と反応しないという特性を有するが、ＤＴＴ処理後、それらは大部分の既知ＮＳ３抗体陽性試料と反応し得た。

さらに本発明は、説明したポリ核酸を含む組み換えベクターに関する。
さらに本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞に関する。

さらに本発明は、本発明の核酸の検出方法に関する。この検出方法は、MaertensおよびStuyverのＷＯ９６／１３５９０に記載のごとき当該分野で知られたいずれの方法であってもよい。
より詳細には、本発明は、
本発明の核酸をプローブと接触させ；
該核酸と該プローブとの間に形成された複合体を調べること
を含む、本発明の核酸の検出方法に関する。
したがって、本発明は、プローブもしくはプライマーとして使用される上記単離核酸またはそのフラグメントに関する。

さらに本発明は、本発明の少なくとも１つのプライマーおよび／または少なくとも１つのプローブを含む、上記核酸配列を検出するための診断キットに関する。これらの適用を見渡すための詳細な説明についてはＷＯ９６／１３５９０を参照のこと。

還元により得られる反応性のほかに、ＮＳ３の反応性はＮＳ３抗原の配列によっても重大に決定される。
それゆえ、本発明は、図１、２−２、３−２、４−２、５−２、６−２、７−２および８−２（配列番号：２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２）に示すアミノ酸配列の部分または全体を有するＨＣＶポリペプチドにも関する。また本発明は、図１（配列番号：１〜１８）に示すＨＣＶＮＳ３ヘリカーゼ蛋白またはそのユニークな部分にも関する。
また本発明は、Ｓ１２００、Ａ１２１８、Ａ１３８４、Ｐ１４０７、Ｖ１４１２、Ｐ１４２４もしくはＦ１４４４のいずれか、またはこれらのアミノ酸とＬ１２０１、Ｓ１２２２、Ｉ１２７４、Ｓ１２８９、Ｔ１３２１、Ａ１３２３、Ｔ１３６９、Ｌ１３８２、Ｖ１４０８、Ａ１４０９もしくはＦ１４１０のいずれかとの組み合わせを含むＨＣＶＮＳ３ヘリカーゼ蛋白またはＨＣＶＮＳ３ヘリカーゼ蛋白の部分にも関する。上記番号付けは広く受け入れられているＨＣＶアミノ酸の番号付けシステムによるものである。

さらに本発明は、本発明のポリペプチドまたはその機能的同等物もしくはフラグメントを含む医薬組成物に関する。用語「医薬組成物」は、本発明のポリペプチドおよび医薬上許容される担体もしくは賦形剤（両方の用語を混用することができる）を含む組成物または医薬（両方の用語を混用することができる）に関する。この医薬組成物を医薬として使用することができる。この医薬組成物をＨＣＶ感染の治療または予防のための医薬として使用することができる。当業者に知られた適当な担体または賦形剤はセイライン、リンゲル液、ブドウ糖液、Hankの溶液、固定油脂（fixed oils）、オレイン酸エチル、セイライン中５％ブドウ糖、等張性および化学的安定性を高める物質、バッファーならびに保存料である。他の適当な担体は、それ自体組成物を与えられる個体に有害な抗体の産生を誘導しない担体を包含し、例えば、蛋白、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸およびアミノ酸コポリマーのごときものである。当業者の知識内の適当な方法により「医薬組成物」または「医薬」を投与することができる。好ましい投与経路は非経口経路またはワクチンである。非経口投与またはワクチン投与において、本発明の医薬を、上記の医薬上許容される賦形剤と混合された溶液、懸濁液またはエマルジョンのごとき１回分の注射可能形態として処方する。例えば、ワクチンとして適用するため、あるいはポリクローナル抗血清／抗体を生じさせるためには、有効量は種、年齢、および個体の一般的状態、治療すべき症状の重さ、選択される個々のポリペプチドならびに投与方法等により様々である。比較的広範囲かつクリティカルでない範囲にわたって有効量が見出されると考えられる。ルーチンな実験のみにより適切な有効量を容易に決定することができる。ＨＣＶ疾患の予防のためのＮＳ３および／またはＥ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２単量体またはオリゴマーエンベロープ蛋白の好ましい範囲は０．０１ないし１０００μｇ／回、好ましくは０．１ないし１００μｇ／回、より好ましくは１ないし５０μｇ／回である。十分な免疫応答およびその後のＨＣＶに対する防御を得るためには１個体につき数回の投与が必要になるかもしれない。治療的ワクチンの場合、必要な投与回数は１０回以上であるかもしれない。連続的輸液を用いてもよい。その場合、５ないし２０μｇ／ｋｇ／分、より好ましくは７ないし１５μｇ／ｋｇ／分の量で医薬を輸液してもよい。本発明の医薬組成物は、配列番号：３〜１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２に示される配列の機能的に同等な変種またはフラグメントを含んでいてもよい。変種またはフラグメントは、本発明のポリペプチドの蛋白配列全体あるいは本発明のポリペプチドの蛋白配列の一部を含む分子であって、ある種の修飾が付されており、本発明のポリペプチドの生物学的特性のすべてまたは一部を保持している分子をいう。かかる修飾は、多糖鎖の付加、ある種の化学基の付加、脂質部分の付加、他のペプチドまたは蛋白配列との融合ならびに分子内架橋の形成を包含するが、これらに限らない。

また本発明は上記ＨＣＶポリペプチドを含むイムノアッセイにも関する。該イムノアッセイは当該分野で知られたいずれのフォーマットのタイプであってもよい（例えば、ＷＯ９６／１３５９０およびColigan et al. 1992参照）。詳細には、本発明は、本発明のポリペプチドを検出する方法に関し、該方法は、
該ポリペプチドを該ポリペプチドに結合するリガンドと接触させ；
該ポリペプチドと該リガントとの間に形成された複合体を調べること
を含む。
また本発明は、本発明のポリペプチドに結合するリガンドにも関する。用語「リガンド」は、本発明のポリペプチドに結合しうる分子をいう。リガンドは、特に、本発明のポリペプチドに対して特異的に生成した（当該分野において知られた方法により）ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体をいい、さらに抗体様構築物およびLorre et alのＥＰ９７８００６２．０に詳述された他の構築物も包含する。かかる抗体は生物学的液体中の抗原の検出に非常に有用である可能性がある。ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジンを用いるアッセイ、ＥＬＩＳＡおよび免疫沈降、免疫組織化学的手法および凝集アッセイのごとき当該分野で知られたイムノアッセイにより抗原の検出を行うことができる。これらのアッセイに関する詳細な説明はＷＯ９６／１３５９０にあり、参照により本明細書に一体化させる。

さらにそのうえ、該抗体はＨＣＶまたは他の疾病の治療に非常に有用である可能性があり、それゆえ、非ヒト宿主において生成される場合にはヒト化されていてもよい。したがって、本発明は、医薬上許容される賦形剤中のこれらの抗体を含む、医薬として使用される組成物に関する。
また本発明は、本発明の該抗体を製造し使用する方法にも関する。ＨＣＶポリペプチドの製造および使用方法はＷＯ９６／１３５９０に開示されている。該使用は診断における使用のみならず治療的および予防的使用も包含する。本発明のＮＳ３蛋白はワクチン組成物中に含有させるのにも適する。かかるワクチン組成物は、有効成分のほかに、当該分野で知られたいずれかのタイプのアジュバントを含んでいてもよい。ＷＯ９６／１３５９０の内容を参照により本明細書の説明に取り入れる。本発明のＮＳ３蛋白は、薬剤スクリーニング目的のようにＮＳ３ヘリカーゼが適用可能ないずれの適用例にも使用することできる。

実施例１ＨＣＶＮＳ３タイプ１ｂクローン１９ｂのイー・コリ（E. coli）における発現
１．１ＨＣＶＮＳ３タイプ１ｂクローン１９ａおよび１９ｂ遺伝子のクローニング
合成オリゴヌクレオチドプライマーＨＣＰｒ５９（5'-GGGCCCCACCATGGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTT-3'）（配列番号：１）およびＨＣＰｒ６０（5'-CTATTAGCTGAAAGTCGACTGTCTGGGTGACAGCA-3'）（配列番号：２）を用いて、ＮＳ３ヘリカーゼドメイン（アミノ酸１１８８〜１４６５）をＲＴ−ＰＣＲによりＨＣＶサブタイプ１ｂ血清ＩＧ８３０９（Innogenetics, Ghent, Belgium）から増幅した。これによりＰＣＲフラグメント１９を得て、イー・コリ中にクローン化した。センスプライマーＨＣＰｒ５９は、人工的なメチオニンを含むＡｐａＩ制限部位を導入する。アンチセンスオリゴヌクレオチドＨＣＰｒ６０はａａ（アミノ酸）１４６５の後ろに停止コドンを導入する。次いで、ＰＣＲフラグメントをＡｐａＩで切断し、得られた８３３ｂｐのＡｐａＩフラグメントをＡｐａＩで切断した発現ベクターｐｍＴＮＦＨＲＰ（Innogenetics, Ghent, Belgium）中に組み込んだ。４つのＣ型肝炎クローン（ＨＣＣ１）を配列決定した：ＨＣＣ１１９ａおよびＨＣＣ１１９ｂ（図１および図２−２に示す推定アミノ酸配列参照）。クローンＨＣＣ１１９ｂ（ｐｍＴＮＦＨＲＰＨＣＣ１１９ｂ）をさらなるサブクローニングのために保存した。

１．２発現プラスミドｐＥｍＴＮＦＭＰＨＨＣＣ１１９ｂの構築
ベクターｐｍＴＮＦＨＲＰＨＣＣ１１９ｂから出発して、ＮＳ３クローン１９ｂコーディング配列を９００ｂｐのＮｃｏＩフラグメントとして単離し、ＮｃｏＩで切断した発現ベクターｐＥｍＴＮＦＭＰＨ（Innogenetics, Ghent, Belgium）に挿入し、ベクターｐＥｍＴＮＦＭＰＨＨＣＣ１１９ｂを得た。このプラスミドは、ヘキサヒスチジン精製タグおよびギ酸開裂部位が後に続くネズミＴＮＦのＮ末端の２５ａａとの融合蛋白としてＨＣＶＮＳ３クローン１９ｂを発現する（配列番号：１９および２０；図２）。

１．３イー・コリにおけるＨＣＶＮＳ３クローン１９ｂの発現
イー・コリ株ＭＣ１０６１（ｐＡｃＩ）細胞（Wertman et al., 1986）をプラスミドｐＥｍＴＮＦＭＰＨＨＣＣ１１９ｂで形質転換した。ｐＥｍＴＮＦＭＰＨＨＣＣ１１９ｂを有するＭＣ１０６１（ｐＡｃＩ）細胞を、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを補足したLuria Broth（ＬＢ）中、２８℃において一晩増殖させた。培養物を新鮮ＬＢで２０倍に希釈し、次いで、２８℃で増殖させてＯＤ₆₀₀を０．２とし、その後、温度を４２℃まで上昇させた。誘導から２〜３時間後に細胞を集めた。ＨＣＶＮＳ３クローン１９ｂ融合蛋白の発現を、特異的モノクローナル抗体およびＨＣＶ陽性ヒト血清を用いるウェスタンブロッティングにより分析した。

実施例２イー・コリにおけるＨＣＶＮＳ３クローンＢ９の発現
２．１ＨＣＶタイプ１ａクローンＢ９遺伝子のクローニング
合成オリゴヌクレオチドプライマーＨＣＰｒ５９（5'-GGGCCCCACCATGGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTT-3'）（配列番号：１）およびＨＣＰｒ６０（5'-CTATTAGCTGAAAGTCGACTGTCTGGGTGACAGCA-3'）（配列番号：２）を用いて、ＮＳ３ヘリカーゼドメイン（アミノ酸１１８８〜１４６５）をＲＴ−ＰＣＲによりＨＣＶサブタイプ１ａ血清ＩＧ２１０５４（Innogenetics, Ghent, Belgium）から増幅した。これによりＰＣＲフラグメントＢを得て、イー・コリ中にクローン化した。センスプライマーＨＣＰｒ５９は、人工的なメチオニンを含むＡｐａＩ制限部位を導入する。アンチセンスオリゴヌクレオチドＨＣＰｒ６０はａａ１４６５の後ろに停止コドンを導入する。次いで、ＰＣＲフラグメントをｐＧＥＭ−Ｔベクター（Promega, Madison, WI, US）中に組み込んだ。４つのＣ型肝炎クローンを配列決定した：Ｂ７、Ｂ９、Ｂ１２およびＢ１４（図１および図３−２に示す推定アミノ酸配列参照）。クローンＢ９（ｐＧＥＭＴＮＳ３Ｂ９）をさらなるサブクローニングのために保存した。

２．２発現プラスミドｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｂ９の構築
ベクターｐＧＥＭＴＮＳ３Ｂ９から出発して、Ｂ９コーディング配列を８５０ｂｐのＮｃｏＩ／ＳｔｕＩフラグメントとして単離し、ＮｃｏＩ／ＳｔｕＩで切断した発現ベクターｐＩＧＦＨ１１１（Innogenetics, Ghent, Belgium）に挿入し、ベクターｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｂ９を得た。このプラスミドは、ヘキサヒスチジン精製タグおよびギ酸開裂部位が後に続くネズミＴＮＦのＮ末端の２５ａａとの融合蛋白としてＨＣＶＮＳ３クローンＢ９を発現する（配列番号：２１および２２；図３）。

２．３イー・コリにおけるＨＣＶＮＳ３クローンＢ９の発現
イー・コリ株ＭＣ１０６１（ｐＡｃＩ）細胞（Wertman et al., 1986）をプラスミドｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｂ９で形質転換した。ｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｂ９を有するＭＣ１０６１（ｐＡｃＩ）細胞を、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを補足したLuria Broth（ＬＢ）中、２８℃において一晩増殖させた。培養物を新鮮ＬＢで２０倍に希釈し、次いで、２８℃で増殖させてＯＤ₆₀₀を０．２とし、その後、温度を４２℃まで上昇させた。誘導から２〜３時間後に細胞を集めた。ＨＣＶＮＳ３クローンＢ９融合蛋白の発現を、特異的モノクローナル抗体およびＨＣＶ陽性ヒト血清を用いるウェスタンブロッティングにより分析した。

実施例３イー・コリにおけるＨＣＶＮＳ３タイプ１ａクローンＡ２６、Ｃ１６およびＤ１８の発現
プライマーＨＣＰｒ５９およびＨＣＰｒ６０を用いるクローンＢ９の単離に関して説明したのと同様にして、クローンＡ２６、Ｃ１６およびＤ１８を、それぞれ、ＨＣＶサブタイプ１ａ感染血清ＩＧ２１０５１、ＩＧ１７７９０およびＩＧ２１０６８から単離した。最初に、クローンＡ５、Ａ２６、Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ１２、Ｃ１６、Ｄ１７、Ｄ１８およびＤ１９をクローン化し、次いで、配列決定した（図１に示す推定アミノ酸配列参照）。クローンＡ２６、Ｃ１６およびＤ１８をさらなるサブクローンのために保存した。

実施例４イー・コリにおけるＨＣＶＮＳ３タイプ３ａクローン２１および３２の発現
４．１ＨＣＶＮＳ３タイプ３ａクローン２１および３２遺伝子のクローニング
合成オリゴヌクレオチドプライマー４０３（5'GGGCCCCACCATAGGTGTAGCAAAAGCCCTACAGTT-3'）（配列番号：３３）および４０４（5'-CTATTAGCTGAAGTCAACGTACTGTTCAACAGC-3'）（配列番号：３４）を用いて、ＮＳ３ヘリカーゼドメイン（アミノ酸１１８８〜１４６５）をＲＴ−ＰＣＲによりＨＣＶサブタイプ３ａ血清ＩＧ２１３４９（Innogenetics, Ghent, Belgium）から増幅した。これにより、いずれの場合にも約８５０ｂｐのＰＣＲフラグメントが得られ、次いで、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Promega, Madison, WI, US）中にサブクローンした。クローン化された各ＰＣＲフラグメントから、数個のクローンを配列決定したが、配列決定により、各血清由来のただ１個のクローン化フラグメントだけが完全に正しいものであることがわかった。これらは血清ＩＧ２１３４９に関してはクローン３１（ｐＧＥＭ−ＴＮＳ３Ｔ３ａ．２１）であり、血清ＩＧ２００１４に関してはクローン３２（ｐＧＥＭ−ＴＮＳ３Ｔ３ａ．３２）であった（図４および５）。

４．２発現プラスミドｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ３ａ．２１およびｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ３ａ．３２の構築
ベクターｐＧＥＭ−ＴＮＳ３Ｔ３ａ．２１およびｐＧＥＭ−ＴＮＳ３Ｔ３ａ．３２から出発して、クローン２１および３２コーディング配列を８５０ｂｐのＮｃｏＩ／ＳａｌＩフラグメントとして単離し、ＮｃｏＩ／ＳａｌＩで切断した発現ベクターｐＩＧＦＨ１１１（Innogenetics, Ghent, Belgium）に挿入し、それぞれベクターｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ３ａ．２１およびｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ３ａ．３２を得た。これらのプラスミドは、ヘキサヒスチジン精製タグおよびギ酸開裂部位が後に続くネズミＴＮＦのＮ末端の２５ａａとの融合蛋白としてＨＣＶＮＳ３タイプ３ａクローン２１および３２を発現する（配列番号：２３〜２６；図４および５）。

４．３イー・コリにおけるＨＣＶＮＳ３タイプ３ａクローン２１および３２の発現
イー・コリ株ＭＣ１０６１（ｐＡｃＩ）細胞（Wertman et al., 1986）をプラスミドｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ３ａ．２１およびｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ３ａ．３２でそれぞれ形質転換した。ｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ３ａ．２１またはｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ３ａ．３２を有するＭＣ１０６１（ｐＡｃＩ）細胞を、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを補足したLuria Broth（ＬＢ）中、２８℃において一晩増殖させた。培養物を新鮮ＬＢで２０倍に希釈し、次いで、２８℃で増殖させてＯＤ₆₀₀を０．２とし、その後、温度を４２℃まで上昇させた。誘導から２〜３時間後に細胞を集めた。ＨＣＶＮＳ３タイプ３ａクローン２１および３２融合蛋白の発現を、特異的モノクローナル抗体およびＨＣＶ陽性ヒト血清を用いるウェスタンブロッティングにより分析した。

実施例５イー・コリにおけるＨＣＶＮＳ３タイプ２ａクローン３の発現
５．１ＨＣＶＮＳ３タイプ２ａクローン３遺伝子のクローニング
合成オリゴヌクレオチドプライマー４１２（5'-GGGCCCCACCATGGGCGTGGCCAAGTCCATAGACTT-3'）（配列番号：３５）および４１３（5'-CTATTAGCTGAAGTCTACAACTTGAGTGACCGC-3'）（配列番号：３６）を用いて、ＮＳ３ヘリカーゼドメイン（アミノ酸１１８８〜１４６５）をＲＴ−ＰＣＲによりＨＣＶサブタイプ２ａ血清ＩＧ２１３４２（Innogenetics, Ghent, Belgium）から増幅した。これにより、約８５０ｂｐのＰＣＲフラグメントが得られ、次いで、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Promega, Madison, WI, US）中にサブクローンした。数個のクローンを配列決定し、クローン３（ｐＧＥＭ−ＴＮＳ３Ｔ２ａ）をさらなるサブクローニングのために保存した（図６）。

５．２発現プラスミドｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ２ａの構築
ベクターｐＧＥＭ−ＴＮＳ３Ｔ２ａから出発して、クローン３コーディング配列を８５０ｂｐのＮｃｏＩフラグメントとして単離し、ＮｃｏＩで切断した発現ベクターｐＩＧＦＨ１１１（Innogenetics, Ghent, Belgium）に挿入し、ベクターｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ２ａを得た。このプラスミドは、ヘキサヒスチジン精製タグおよびギ酸開裂部位が後に続くネズミＴＮＦのＮ末端の２５ａａとの融合蛋白としてＨＣＶＮＳ３タイプ２ａクローン３を発現する（配列番号：２７および２８；図６）。

５．３イー・コリにおけるＨＣＶＮＳ３タイプ２ａクローン３の発現
イー・コリ株ＭＣ１０６１（ｐＡｃＩ）細胞（Wertman et al., 1986）をプラスミドｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ２ａで形質転換した。ｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ２ａを有するＭＣ１０６１（ｐＡｃＩ）細胞を、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを補足したLuria Broth（ＬＢ）中、２８℃において一晩増殖させた。培養物を新鮮ＬＢで２０倍に希釈し、次いで、２８℃で増殖させてＯＤ₆₀₀を０．２とし、その後、温度を４２℃まで上昇させた。誘導から２〜３時間後に細胞を集めた。ＨＣＶＮＳ３タイプ２ａクローン３融合蛋白の発現を、特異的モノクローナル抗体およびＨＣＶ陽性ヒト血清を用いるウェスタンブロッティングにより分析した。

実施例６イー・コリにおけるＨＣＶＮＳ３タイプ２ｂクローン９の発現
６．１ＨＣＶＮＳ３タイプ２ｂクローン９遺伝子のクローニング
合成オリゴヌクレオチドプライマー４０１（5'-GGGCCCCACCATGGGCGTAGCCAAATCCATTGACTT-3'）（配列番号：３７）および４０２（5'-CTATTAGCTGAAGTCTACAATTTGAGAGACCGC-3'）（配列番号：３８）を用いて、ＮＳ３ヘリカーゼドメイン（アミノ酸１１８８〜１４６５）をＲＴ−ＰＣＲによりＨＣＶサブタイプ２ｂ血清ＩＧ２０１９２（Innogenetics, Ghent, Belgium）から増幅した。これにより、約８５０ｂｐのＰＣＲフラグメントが得られ、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Promega, Madison, WI, US）中にサブクローンした。数個のクローンを配列決定し、クローン９をさらなるサブクローニングのために保存した（図７）。

６．２発現プラスミドｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ２ｂの構築
ベクターｐＧＥＭ−ＴＮＳ３Ｔ２ｂから出発して、クローン９コーディング配列を８５０ｂｐのＮｃｏＩフラグメントとして単離し、ＮｃｏＩで切断した発現ベクターｐＩＧＦＨ１１１（Innogenetics, Ghent, Belgium）に挿入し、ベクターｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ２ｂを得た。このプラスミドは、ヘキサヒスチジン精製タグおよびギ酸開裂部位が後に続くネズミＴＮＦのＮ末端の２５ａａとの融合蛋白としてＨＣＶＮＳ３タイプ２ｂクローン９を発現する（配列番号：２９〜３０；図７）。

６．３イー・コリにおけるＨＣＶＮＳ３タイプ２ｂクローン９の発現
イー・コリ株ＭＣ１０６１（ｐＡｃＩ）細胞（Wertman et al., 1986）をプラスミドｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ２ｂで形質転換した。ｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ２ｂを有するＭＣ１０６１（ｐＡｃＩ）細胞を、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを補足したLuria Broth（ＬＢ）中、２８℃において一晩増殖させた。培養物を新鮮ＬＢで２０倍に希釈し、次いで、２８℃で増殖させてＯＤ₆₀₀を０．２とし、その後、温度を４２℃まで上昇させた。誘導から２〜３時間後に細胞を集めた。ＨＣＶＮＳ３タイプ２ｂクローン９融合蛋白の発現を、特異的モノクローナル抗体およびＨＣＶ陽性ヒト血清を用いるウェスタンブロッティングにより分析した。

実施例７イー・コリにおけるＨＣＶＮＳ３タイプ２ｃクローン１４の発現
７．１ＨＣＶＮＳ３タイプ２ｃクローン１４遺伝子のクローニング
合成オリゴヌクレオチドプライマー４０１（5'-GGGCCCCACCATGGGCGTAGCCAAATCCATTGACTT-3'）（配列番号：３７）および４０２（5'-CTATTAGCTGAAGTCTACAATTTGAGAGACCGC-3'）（配列番号：３８）を用いて、ＮＳ３ヘリカーゼドメイン（アミノ酸１１８８〜１４６５）をＲＴ−ＰＣＲによりＨＣＶサブタイプ２ｃ血清ＩＧ２００３１（Innogenetics, Ghent, Belgium）から増幅した。これにより、約８５０ｂｐのＰＣＲフラグメントが得られ、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Promega, Madison, WI, US）中にサブクローンした。数個のクローンを配列決定し、クローン１４（ｐＧＥＭ−ＴＮＳ３Ｔ２ｃ）をさらなるサブクローニングのために保存した（図８）。

７．２発現プラスミドｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ２ｃの構築
ベクターｐＧＥＭ−ＴＮＳ３Ｔ２ｃから出発して、クローン１４コーディング配列を８５０ｂｐのＮｃｏＩフラグメントとして単離し、ＮｃｏＩで切断した発現ベクターｐＩＧＦＨ１１１（Innogenetics, Ghent, Belgium）に挿入し、ベクターｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ２ｃを得た。このプラスミドは、ヘキサヒスチジン精製タグおよびギ酸開裂部位が後に続くネズミＴＮＦのＮ末端の２５ａａとの融合蛋白としてＨＣＶＮＳ３タイプ２ｃクローン１４を発現する（配列番号：３１および３２；図８）。

７．３イー・コリにおけるＨＣＶＮＳ３タイプ２ｃクローン１４の発現
イー・コリ株ＭＣ１０６１（ｐＡｃＩ）細胞（Wertman et al., 1986）をプラスミドｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ２ｃで形質転換した。ｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ２ｃを有するＭＣ１０６１（ｐＡｃＩ）細胞を、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを補足したLuria Broth（ＬＢ）中、２８℃において一晩増殖させた。培養物を新鮮ＬＢで２０倍に希釈し、次いで、２８℃で増殖させてＯＤ₆₀₀を０．２とし、その後、温度を４２℃まで上昇させた。誘導から２〜３時間後に細胞を集めた。ＨＣＶＮＳ３タイプ２ｃクローン１４融合蛋白の発現を、特異的モノクローナル抗体およびＨＣＶ陽性ヒト血清を用いるウェスタンブロッティングにより分析した。

実施例８９体積の８Ｍ塩酸グアニジニウム（Ｇｕ．ＨＣｌ）および１体積の０．２ＭＮａＨＰＯ₄を各グラム当量の湿イー・コリ細胞ペーストに添加し、連続的にボルテックスすることにより溶液を均質化させた。固体Ｎａ₂Ｓ₄Ｏ₆およびＮａ₂ＳＯ₃を溶液に添加して、それぞれの最終濃度を６５ｍＭおよび３６０ｍＭとした。ＣｕＳＯ₄（ストック溶液：２５％ＮＨ₃中０．１Ｍ）を添加して最終濃度１００μＭとした。暗所かつ室温において溶液を一晩撹拌し、−７０℃でインキュベーションした後、４℃で遠心分離（２００００ｒｐｍで３０分、ＪＡ２０ローター）することにより清澄化させた。
エムピゲンＢＢ^TM（Albright & Wilson Ltd., Okibury, UK）およびイミダゾールを上清に添加して最終濃度をそれぞれ１％（ｗ／ｖ）および２０ｍＭとした。１ＮＨＣｌを用いてｐＨを７．２に合わせた。３Ｌの細胞培養物に相当する試料を、２０ｍＭイミダゾールを含有するバッファーＡで平衡化しておいた２５ｍＬのＮｉ−ＩＤＡＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（XK 16/20 カラム, Pharmacia, Upsala, Sweden）に２ｍＬ／分で負荷した（バッファーＡ：５０ｍＭホスフェート、６ＭＧｕ．ＨＣｌ、１％エムピゲン、ｐＨ７．２）。Ｎｉ−ＩＤＡＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムを下記バッファーで順次洗浄した：
２０ｍＭイミダゾール含有バッファーＡ
３５ｍＭイミダゾール含有バッファーＡ
５０ｍＭイミダゾール含有バッファーＡ
５０ｍＭイミダゾール含有バッファーＢ（バッファーＢ：５０ｍＭホスフェート、６ＭＧｕ．ＨＣｌ、ｐＨ７．２）
２００ｍＭイミダゾール含有バッファーＢ。
２８０ｎｍにおける吸光度がベースラインに達するまでクロマトグラフィーにおいて各洗浄を行った。５０ｍＭＥＤＴＡ、５００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０でカラムを再生した。
非還元的条件および銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによりフラクションを分析した。ｍＴＮＦ−ＮＳ３Ｂ９融合蛋白を２００ｍＭイミダゾールでの溶出物中に回収した。ウサギ抗ヒトＴＮＦ（１μｇＮＳ３／レーン）およびウサギ抗イー・コリ（１０μｇＮＳ３／レーン）を用いるウェスタンブロッティングにより、この単一クロマトグラフィー工程後におＮＳ３純度が９９％以上であることが示された。
２００ｍＭイミダゾール溶出フラクションをプールし、脱塩した。
４０ｍＬのＮｉ−ＩＤＡ溶出試料を、５０ｍＭホスフェート、６Ｍ尿素、１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．２で平衡化しておいた３００ｍＬのＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラム（XK 50, Pharmacia, Upsala, Sweden）に１０ｍＬ／分で負荷した。１０ｍＬのフラクションを集め、ミクロＢＣＡ法（Pierce, Rockford, IL, US）により蛋白濃度を調べた。脱塩バッファーを用いて蛋白濃度を５００μｇ／ｍＬに合わせ、次いで、脱スルホン化および還元を行った。全工程にわたる収量は、１Ｌの培養物あたり５０〜５５ｍｇの精製ＮＳ３融合蛋白であった。
最後に、ＤＴＴ（ストック溶液：蒸留水中１００ｍＭ）を、ＮＳ３抗原中のシステイン含量（例えば、ＮＳ３１９ｂは７個のシステインを含む）に対して１００倍モル過剰添加した。溶液に窒素を吹き込み、２８℃で１時間インキュベーションした。次いで、ＥＬＩＳＡおよびＬＩＡ被覆用にＮＳ３試料を適当なバッファーで希釈した。

実施例９ＬＩＡにおいて試験したＮＳ３ヘリカーゼ抗体の反応性
ＮＳ３ヘリカーゼ抗体の反応性を調べるために、ホスフェート緩衝化セイライン中の５０μｇ／ｍｌＮＳ３抗原溶液をナイロン膜片上に適用した。１８〜２４℃において少なくとも１時間片を乾燥させ、次いで、還元剤ＤＴＴの存在下（１０ｍＭ）または不存在下でＰＢＳ／カゼインでブロックした。次いで、ＤＴＴ不含または１０ｍＭＤＴＴ含有するＴｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで、次いで、ＤＴＴ不含または１０ｍＭＤＴＴ含有する１ｍＭＥＤＴＡ含有水で片を洗浄した。膜を３０分乾燥させ、異なる患者の試料を調べるために片状に切断した。
抗ＨＣＶセロコンバージョンパネルＰＨＶ９０３（Boston Biomedica Inc., Boston, US）とともに片をインキュベーションした実験結果を表１に示す。

実施例１０ＥＬＩＳＡにおいて試験したＮＳ３ヘリカーゼ抗体の反応性
ＮＳ３ヘリカーゼ抗体の反応性を調べるために、実施例４のごとく精製したＮＳ３抗原でＥＬＩＳＡプレートを次のように被覆した。
マイクロタイタープレートのウェルを、２００ｍＭＤＴＴ含有またはＤＴＴ不含の１ｍＭＥＤＴＡ含有５０ｍＭ炭酸バッファーを含有する被覆バッファー中、濃度０．３μｇ／ｍｌのＮＳ３蛋白で被覆した。マイクロタイタープレートを２０℃で１８時間インキュベーションし、１ウェルあたり３００μｌのＰＢＳ／カゼインバッファーでブロックした。プレートを２０℃で２時間インキュベーションし、次いで、２００ｍＭＤＴＴ含有またはＤＴＴ不含の１ｍＭＥＤＴＡ含有固定バッファー３００μｌで、２０℃で２時間固定した。
結果を表２および３に示す。表２は、ＮＳ３で被覆し、ＤＴＴありまたはなしで固定したアッセイをＢＢＩセロコンバージョンパネルＰＨＶ９０１およびＰＨＶ９０２に適用した場合のノイズ対シグナル値を示す。表３は、ＤＴＴを用いるアッセイによりＨＣＶ抗体をより早く検出できる日数をまとめたものである。明らかに、アッセイにＤＴＴを用いることによって、１２のＨＣＶセロコンバージョンにおけるより早い検出の全日数３４を得ることができる。

¹-: 反応せず; +反応陽性; 同じ片上にスプレイされた異なるカットオフ線との比較において強度等級を示す。

文献
Burns, J., Butler, J., Moran, J., and Whitesides, G. (1991) Selective reduction of disulfides by tris(2-carboxyethyl)phosphine. J. Org. Chem. 56, 2648-2650.

Chan, W. (1968) A method for the complete S sulfonation of cysteine residues in proteins. Biochemistry 7, 4247-4254.

Claeys, H., Volkaerts, A., Verhaert, H., De Beenhouwer, H., and Vermylen, C. (1992) Evaluation of anti-HCV capsid indeterminate samples. The Lancet 340, 249.

Cole, R. (1967) Sulfitolysis. Meth. Enzymol. 11, 206.

Coligan, J., Kruisbeek, A., Margulis, D., Shevach, E. and Strober, W. (1992) Current protocols in immunology. Wiley Interscience.

De Beenhouwer, H., Verhaert, H., Claeys, H., and Vermylen, C. (1992) Confirmation of hepatitis C virus positive blood donors by immunoblotting and polymerase chain reaction. Vox. Sang. 63, 198-203.

Di Bisceglie, AM, Carithers, RL Jr, Gores, GJ (1998) Hepatocellular carcinoma. Hepatology. 28, 1161-1165.

Gailit, J. (1993) Restoring free sulfhydryl groups in synthetic peptides. Anal. Biochem., 214, 334-335.

Holmgren, A. (1979) Thioredoxin catalyzes the reduction of insulin disulfides by dithiothreitol and dihydrolipoamide. J. Biol. Chem. 254, 9627-9632.

Inglis, A., and Liu, T. (1970) The stability of cysteine and cystine during acid hydrolysis of proteins and peptides. J. Biol. Chem. 245, 112-116.

McFarlane, I., Smith, H., Johnson, P., Bray, G., Vergani, D., and Williams, R. (1990) Hepatitis C virus antibodies in chronic active hepatitis: pathogenic factor or false-positive result? The Lancet 335, 754-757.

Maertens, G. and Stuyver, L. (1997) Genotypes and Genetic variation of hepatitis C virus. In: Molecular Medicine of Hepatitis (Eds. Zuckerman, A. and Harrison, T.), Molecular Medical Science Series (Eds. James, K. and Morris A) John Wiley and Sons Ltd., Chichester, England, Chapter 13, pp. 183-233.

Marin, M., Bresciani, S., Puoti, M., Rodella, A., Gussago, A., Ravaggi, A., Pizzocolo, G., Albertini, A., and Cariani, E. (1994) Clinical significance of serum HCV RNA as marker of HCV infection. J. Clin. Microbiol. 32, 3008-3012.

Peeters, D., Dekeyser, F., DeLeys, R., Maertens, G., and Pollet, D. (1993) Confirmation of anti-hepatitis C virus antibodies using the INNO-LIA HCV Ab III including Core, E2/NS1, NS3, NS4, and NS5 epitopes. International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease, Tokyo, abstract 413.

Pollet, D., Saman, E., Peeters, D., Warmenbol, H., Heyndricks, L., Wouters, C., Beelaert, G., van der Groen, G., and Van Heuverswyn, H. (1990) Confirmation and differentiation of antibodies to human immunodeficiency virus 1 and 2 with a strip-based assay including recombinant antigens and synthetic peptides. Clin. Chem. 37, 1700-1707.

Saito, I., Miyamura, T., Ohbayashi, A., Harada, H., Katayama, T., Kikuchi, S., Watanabe, Y., Koi, S., Onji, M., Ohta, Y., Choo, Q.-L., Houghton, M., and Kuo, G. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6547-6549.

Singh, R., and Kats, L. (1995) Catalysis of reduction of disulfide by selenol. Anal. Biochem.,232, 86-91.

Stuyver, L., Fretz, C., Esquivel, C., Boudifa, A., Jaulmes, D., Azar, N., Lunel, F., Leroux-Roels, G., Maertens, G., and Fournel, J. (1996) HCV genotype analysis in apparently healthy anti-HCV positive Parisian blood donors. Transfusion 36, 552-558.

Thakur, M., DeFulvio, J., Richard, M., and Park, C. (1991) Technetium-99m labeled monoclonal antibodies: evaluation of reducing agents. Nucl. Med. Biol., 18, 227- 233.

Waumans, L., Claeys, H., Verhaert, H., Mertens, W., and Vermylen, C. (1993) Hepatitis C virus confirmation in blood donor screening. Vox. Sang. 64, 145-149.

Wertman K.F., Wyman A.R. and Botstein D. (1986) Host/vector interactions which affect the viability of recombinant phage lambda clones. Gene 49: 253-262.

Zaaijer, H., Vrielink, H., van Exel-Oehlers, P., Cuypers, H., and Lelie, P. (1994) Confirmation of hepatitis C infection: a comparison of five immunoblot assays. Transfusion 34, 603-607.

本発明は、ＨＣＶに関する研究、ＨＣＶ診断薬の製造の分野などに利用可能である。

ＨＣＶサブタイプ１ａおよび１ｂ感染血清から単離されたＨＣＶＮＳ３クローンのアミノ酸配列を示す。ＨＣＶサブタイプ１ａおよび１ｂ感染血清から単離されたＨＣＶＮＳ３クローンのアミノ酸配列を示す。ＨＣＶサブタイプ１ａおよび１ｂ感染血清から単離されたＨＣＶＮＳ３クローンのアミノ酸配列を示す。ＨＣＶサブタイプ１ａおよび１ｂ感染血清から単離されたＨＣＶＮＳ３クローンのアミノ酸配列を示す。ＨＣＶサブタイプ１ａおよび１ｂ感染血清から単離されたＨＣＶＮＳ３クローンのアミノ酸配列を示す。ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３クローン１９ｂ融合蛋白のＤＮＡコーディング配列を示す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列はｍＴＮＦ融合パートナー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分を含む。ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３クローン１９ｂ融合蛋白のアミノ酸配列を示す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列はｍＴＮＦ融合パートナー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分を含む。ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３クローンＢ９融合蛋白のＤＮＡコーディング配列を示す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列はｍＴＮＦ融合パートナー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分を含む。ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３クローンＢ９融合蛋白のアミノ酸配列を示す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列はｍＴＮＦ融合パートナー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分を含む。ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３タイプ３ａクローン２１融合蛋白のＤＮＡコーディング配列を示す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列はｍＴＮＦ融合パートナー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分を含む。ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３タイプ３ａクローン２１融合蛋白のアミノ酸配列を示す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列はｍＴＮＦ融合パートナー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分を含む。ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３タイプ３ａクローン３２融合蛋白のＤＮＡコーディング配列を示す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列はｍＴＮＦ融合パートナー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分を含む。ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３タイプ３ａクローン３２融合蛋白のアミノ酸配列を示す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列はｍＴＮＦ融合パートナー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分を含む。ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３タイプ２ａ融合蛋白のＤＮＡコーディング配列を示す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列はｍＴＮＦ融合パートナー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分を含む。ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３タイプ２ａ融合蛋白のアミノ酸配列を示す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列はｍＴＮＦ融合パートナー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分を含む。ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３タイプ２ｂ融合蛋白のＤＮＡコーディング配列を示す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列はｍＴＮＦ融合パートナー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分を含む。ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３タイプ２ｂ融合蛋白のアミノ酸配列を示す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列はｍＴＮＦ融合パートナー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分を含む。ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３タイプ２ｃ融合蛋白のＤＮＡコーディング配列を示す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列はｍＴＮＦ融合パートナー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分を含む。ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３タイプ２ｃ融合蛋白のアミノ酸配列を示す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列はｍＴＮＦ融合パートナー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分を含む。

Claims

固相に被覆されたＨＣＶＮＳ３蛋白または少なくとも５個のアミノ酸のエピトープを含むその機能的フラグメントを含むＥＬＩＳＡキットまたはラインイムノアッセイキットの製造方法であって、下記工程：
（ｉ）ＨＣＶＮＳ３蛋白またはその機能的フラグメントでの固相の被覆工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）の後の、該固相のブロッキング工程；および
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の後の、該固相に被覆されたＨＣＶＮＳ３蛋白またはその機能的フラグメントの固定工程；および
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の後の、該固相の前処理工程
を含み、
（ａ）ＥＬＩＳＡキットの製造のためには、少なくとも工程（ｉｉｉ）において還元剤を添加する、あるいは
（ｂ）ラインイムノアッセイキットの製造のためには、少なくとも工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において還元剤を添加する
ものである、方法。
（ａ）において、該還元剤が少なくとも工程（ｉ）および（ｉｉ）において添加される請求項１記載の方法。
該還元剤がＤＴＴ、ＤＴＥまたはＴＣＥＰである請求項１または２記載の方法。
該還元剤が０．１ｍＭないし１Ｍの範囲の濃度で使用される請求項１ないし３のいずれか１項記載の方法。
該還元剤が０．５ｍＭないし５００ｍＭの範囲の濃度で使用される請求項１ないし４のいずれか１項記載の方法。
該還元剤が１ｍＭないし２５０ｍＭの範囲の濃度で使用される請求項１ないし５のいずれか１項記載の方法。
該還元剤が０．５ｍＭないし５０ｍＭの範囲の濃度で使用される請求項１ないし６のいずれか１項記載の方法。
該還元剤が１ｍＭないし３０ｍＭの範囲の濃度で使用される請求項１ないし７のいずれか１項記載の方法。
該還元剤が２ｍＭないし２０ｍＭの範囲の濃度で使用される請求項１ないし８のいずれか１項記載の方法。
該還元剤が５ｍＭないし１５ｍＭの範囲の濃度で使用される請求項１ないし９のいずれか１項記載の方法。
該還元剤が約１０ｍＭの濃度で使用される請求項１ないし１０のいずれか１項記載の方法。
ＨＣＶＮＳ３蛋白が配列番号：３〜１８からなる群より選択されるＨＣＶＮＳ３アミノ酸配列を含むものである請求項１ないし１１のいずれか１項記載の方法。
該ＨＣＶＮＳ３蛋白が融合蛋白中に含まれているものである請求項１ないし１２のいずれか１項記載の方法。
該融合蛋白が配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０および配列番号：３２からなるアミノ酸配列の群より選択されるものである請求項１３記載の方法。
該ＨＣＶＮＳ３蛋白が、Ｓ１２００、Ａ１２１８、Ａ１３８４、Ｐ１４０７、Ｖ１４１２、Ｐ１４２４もしくはＦ１４４４のいずれか、またはこれらのアミノ酸とＬ１２０１、Ｓ１２２２、Ｉ１２７４、Ｓ１２８９、Ｔ１３２１、Ａ１３２３、Ｔ１３６９、Ｌ１３８２、Ｖ１４０８、Ａ１４０９もしくはＦ１４１０のいずれかとの組み合わせを含むＨＣＶＮＳ３ヘリカーゼ蛋白である、請求項１ないし１４のいずれか１項記載の方法。
該ＨＣＶＮＳ３蛋白が、スルホン化工程およびその後の脱スルホン化工程を含む方法により処理されたＨＣＶＮＳ３蛋白である、請求項１ないし１５のいずれか１項記載の方法。
該ＨＣＶＮＳ３蛋白がさらに両性イオン性界面活性剤で処理されたものである請求項１６記載の方法。
該ＨＣＶＮＳ３蛋白が両性イオン性界面活性剤としてのエムピゲンで処理されたものである請求項１７記載の方法。
製造されるイムノアッセイキットが該ＨＣＶＮＳ３蛋白に対する抗体を検出するために用いられるものである請求項１ないし１８のいずれか１項記載の方法。
製造されるイムノアッセイキットが生物学的試料中の該抗体を検出するために用いられるものである請求項１９記載の方法。
製造されるイムノアッセイキットが初期のＨＣＶＮＳ３セロコンバージョンを検出するために用いられるものである請求項１ないし２０のいずれか１項記載の方法。