JP4001699B2 - エンテロコッカス属細菌用プライマー - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する利用分野】
本発明は、嫌気性連鎖球菌及びエンテロコッカス属細菌の同定に有用なＤＮＡプライマー及びこれを用いた検出・同定・解析方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ペプトストレプトコッカス属細菌、サルサイナ属細菌等の嫌気性連鎖球菌は、ヒトの口腔や肺などの炎症部位において頻繁に検出され、腸内に生息するものもある。嫌気性連鎖球菌には他にも、アトポビウム属細菌、ゲメラ属細菌、ベイロネラ属細菌、アシドアミノコッカス属細菌、メガスフェラ属細菌等がある。また、エンテロコッカス属細菌は、主として腸管内に生息する菌である。
【０００３】
これらの菌を同定・解析することは、例えば腸内細菌叢における菌の動向を把握することによる個体の健康状態の把握、腸管内の病理的研究等に非常に有用である。また、病変部位において発症に関与する菌を同定できれば、抗生物質の選定等の対応を迅速に行うことができる。現状では同定の手段として、種々の選択培地を組み合わせて用いる選別方法や顕微鏡観察が主に行われている。
【０００４】
菌の同定、解析を行うためには、対象となる個体の糞便を嫌気条件下において希釈液で希釈し、これを培地上にまき、嫌気性培養を行う必要がある。しかし、培養の際には数日から数週間の時間を要することとなり、コロニー数のカウント等操作も煩雑であった。
【０００５】
また、近年では、ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーによる判定も行われるようになっている。（Collins, M. D., et al., INTERNATIONAL JOURNAL of SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, 39, 105−108(1989)）。しかしながら、この同定法も長時間を要し、迅速な菌種同定を行うには好ましいものではなかった。
【０００６】
上記検出法の問題点を解消するため、本出願人らはある種の腸内細菌に特異的なプローブやプライマーを用いて、菌の同定を行う方法を検討し、例えば特開平１１−２８０９０号にはバクテロイデスグループ細菌に特異的なプローブを、特開平１１−１２３０９３号にはビフィドバクテリウム属細菌に特異的なプライマーを開示している。この方法によれば、菌の同定・検出を簡便、迅速に行えるが、ヒト腸内や病変部位にはこの他にも様々な細菌が存在しているため、上記のペプトストレプトコッカス属細菌等とは別の菌をもカバーできるプライマーやプローブのセットが要望されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、腸内細菌の同定等に使用しうるプライマーを設計するためには、遺伝子のシークエンシング、アライメント等かなりの手間がかかるばかりか、せっかく設計した配列でプライマーを合成しても、特異性が得られない場合もある。このため、プライマーの種類がなかなか増えず、腸内、病変部での菌の動向を把握するには未だ不充分である。
【０００８】
従って、本発明の目的は、ヒト腸内や病変部位にて検出される各種の菌を特異的に同定できるプライマーを合成し、このプライマーを用いて菌を迅速、簡便に同定・解析する方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
斯かる現状に鑑み本発明は鋭意研究を行ったところ、各種嫌気性連鎖球菌およびエンテロコッカス属細菌に特異的な塩基配列を有するＤＮＡプライマーを見いだし、これを用いれば、細菌の培養を行うことなく、検体から抽出した細菌由来のＤＮＡのＰＣＲ反応により、迅速かつ簡便に上記の菌の同定・解析が可能となることを見出し本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、配列番号１と９に記載の塩基配列の組み合わせ又はこれらの塩基配列の組み合わせに相補的な配列からなるエンテロコッカス属細菌特異的プライマー対を提供するものである。
【００１２】
更に、本発明は、上記のプライマー対を使用することを特徴とするエンテロコッカス属細菌の検出方法を提供するものである。
【００１３】
更にまた、本発明は、（１）検体中のＤＮＡを抽出する工程、（２）上記プライマー対を用いてＰＣＲ反応を行う工程及び（３）工程（２）により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程を含むエンテロコッカス属細菌の検出方法を提供するものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の嫌気性連鎖球菌またはエンテロコッカス属細菌に特異的なプライマーは、ヒトの腸管や病変部位で頻繁に検出される菌に特異的な配列を有するものである。具体的には、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）、エンテロコッカス・カッセリフィラバス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｓｅｒｉｆｉｌａｖｕｓ）、エンテロコッカス・ガリナラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・セコラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ）、エンテロコッカス・コランビー（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｌｕｍｂａｅ）またはエンテロコッカス・サルフロイス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ）の８菌種に特異的なエンテロコッカス属細菌用プライマー、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属中のアナエロビウス（ａｎａｅｒｏｂｉｕｓ）グループ、アサカロリティクス（ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）グループ、プレボティ（ｐｒｅｖｏｔｉｉ）グループまたはマグナス（ｍａｇｎｕｓ）グループの各々に特異的なプライマー、サルサイナ・ベントリクリ（Ｓａｒｃｉｎａ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｉ）またはサルサイナ・マキシマ（Ｓａｒｃｉｎａ ｍａｘｉｍａ）に特異的なサルサイナ属細菌用プライマー、ベイロネラ・パルブラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｐａｒｖｕｌａ）に種特異的なプライマー、アシドアミノコッカス・ファーメンタンス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）に種特異的なプライマーを例示することができる。
【００１５】
ここで、上記ペプトストレプトコッカス属中の４つのグループとは、１６Ｓリボソームの配列から４つの系統に細分され、各々のグループに共通の配列を保有する遺伝学的に類似した集団を指す。
【００１６】
上記の嫌気性連鎖球菌またはエンテロコッカス属細菌にし特異的なプライマーを作成するにあたり、そのターゲットには、系統分類の指標として信頼性の高い１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を用い、同定・解析には、ＰＣＲ法等の手段が必要となるため、ＲＮＡでなくＤＮＡを用いた。
【００１７】
プライマーは、本発明者がシークエンスを行って得た塩基配列とデータベース（ＤＤＢＪ、Ｇｅｎｂａｎｋ等）から得た塩基配列とを比較・検討することにより得たものである。ここで、本発明者が比較対象として新たに１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のシークエンスを行った菌種は、具体的には、エンテロコッカス・デュランス（Ｅ．ｄｕｒａｎｓ）ＡＴＣＣ１９４３２、ペプトストレプトコッカス・アナエロビウス（Ｐｓ．アナエロビウス）ＧＩＦＵ７８８２、Ｐｓ． アサカロリティクス ＧＩＦＵ７６５６、Ｐｓ． アサカロリティクスＧＩＦＵ７７１５、Ｐｓ．アサカロリティクス ＧＩＦＵ７７１７、Ｐｓ． アサカロリティクス ＧＩＦＵ７７５２、 Ｐｓ．アサカロリティクス ＧＩＦＵ８１２４、 Ｐｓ．プレボティＧＩＦＵ７６５８、 ペプトストレプトコッカ・バジナリス（Ｐｓ．ｈｙｄｒｏｇｅｎａｌｉｓ）ＧＩＦＵ７６６２、ペプトストレプトコッカス・ラクリマリス（Ｐｓ．ｌａｃｒｉｍａｌｉｓ）ＧＩＦＵ７６６７、ペプトストレプトコッカス・テトラディウス（Ｐｓ．ｔｅｔｒａｄｉｕｓ）ＧＩＦＵ７６７２、ペプトストレプトコッカス・バジナリス（Ｐｓ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）ＧＩＦＵ７７３２、ペプトストレプトコッカス・ミクロス（Ｐｓ．ｍｉｃｒｏｓ）ＧＩＦＵ７８２４、ペプトストレプトコッカス・インドリカス（Ｐｓ．ｉｎｄｏｌｉｃｕｓ）ＧＩＦＵ７８４８、ペプトストレプトコッカス・マグナス（Ｐｓ．ｍａｇｎｕｓ）ＧＩＦＵ７８８１、ペプトストレプトコッカス・ラクトリティカス（Ｐｓ．ｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＧＩＦＵ８５８６ 及びペプトストレプトコッカス・ヘリオトリンレデゥセンス （Ｐｓ．ｈｅｌｉｏｔｒｉｎｒｅｄｕｇｅｎｓ）ＧＩＦＵ９９１０である。これらの配列は、遺伝研データベースＤＤＢＪに登録する予定である。
【００１８】
プライマーの設計の際には、同定の対象となる菌とその近縁の菌を配列をアライメントした。その結果、エンテロコッカス属細菌では大腸菌のナンバリングにおける１７０領域付近と５６０領域付近に、アナエロビウスグループ、アサカロリティクスグループ、プレボティグループ及びマグナスグループでは３１０領域付近と６６０領域付近に、サルサイナ・ベントリクリおよびサルサイナ・マキシマでは１７０領域付近と６６０領域付近に、ベイロネラ・パルブラ及びアシドアミノコッカス・ファーメンタンスでは１４０領域付近と６６０領域付近に、それぞれ特異性が認められたので、この部分をターゲットとして用いた。また、オリゴヌクレオチドの長さはプライマーによって異なっており、１９〜２１ｂ．ｐとなっている。これらは操作上最も好適な長さであるが、使用に際しては、各々の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子中において、該オリゴヌクレオチドに隣接する数〜十数ｂ．ｐ の塩基配列を増減させたものを用いても良い。
【００１９】
このようにして得られたプライマーのうち、配列番号１及び９記載の塩基配列を有するものは、エンテロコッカス属細菌に特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、菌種の同定、解析を行うためのプライマーやプローブとして使用することができる。プライマーとしては、公知の乳酸菌用ユニバーサルプライマー等と組み合わせて用いることも可能であるが、その組み合わせによっては種特異的な検出を行えないものもあるので、両者を組み合わせることが望ましい。
【００２０】
また、配列番号２及び１０記載の塩基配列を有するものは、アナエロビウスグループ細菌に特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組みあわせて用いることが好ましい。
【００２１】
また、配列番号３及び１１記載の塩基配列を有するものは、アサカロリティクスグループ細菌（Ｐｓ．アサカロリティクス及びＰｓ．インドリカス）に特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組みあわせて用いることが好ましい。
【００２２】
また、配列番号４及び１２記載の塩基配列を有するものは、プレボティグループ細菌（Ｐｓ．プレボティ、Ｐｓ．テトラディウス及びＰｓ．バジナリス）に特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組みあわせて用いることが好ましい。
【００２３】
また、配列番号５及び１３記載の塩基配列を有するものは、マグナスグループ細菌（Ｐｓ．マグナス及びＰｓ．ミクロス）に特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組みあわせて用いることが好ましい。
【００２４】
また、配列番号６及び１４記載の塩基配列を有するものは、サルサイナ・ベントリクリおよびサルサイナ・マキシマに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組みあわせて用いることが好ましい。
【００２５】
また、配列番号７及び１５記載の塩基配列を有するものは、ベイロネラ・パルブラに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組みあわせて用いることが好ましい。
【００２６】
更に、配列番号８及び１６記載の塩基配列を有するものは、アシドアミノコッカス・ファーメンタンスに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組みあわせて用いることが好ましい。
【００２７】
上記のように設計したオリゴヌクレオチドプライマーは、その塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機により、人工的に合成される。その特異性は、以下の実施例に示す近縁種のＤＮＡに対する、プライマーのバンド形成能を指標として確認した。結果として、上記全ての菌種の特異性に問題はなかった。
【００２８】
一方で、今回新たにシークエンスを行ったことにより、配列番号１〜１６に示す配列以外にも種特異的な配列が見出されている。しかしながら、これらの配列や他の公知のプライマーで同定を行っても、別の種に属する株と反応したり、目的とする種の株と反応しない場合もあり、使用上好ましいものではなかった。このようなプライマーを用いてもＰＣＲ反応時の条件設定によって種特異的な反応性は達成されるものと考えられるが、現状ではそのような条件は見出されていない。
【００２９】
本発明のプライマーは、このように各種嫌気性連鎖球菌またはエンテロコッカス属細菌への特異性を有するため、これらを用いて糞便、腸内細菌、病変部位の菌を迅速に同定できる。また、各菌の選択培地（例えばエンテロコッカス属細菌であれば、乳酸菌用選択培地であるＢＣＰ加コロニーカウント寒天培地（栄研化学社製）等）に形成されたコロニーから直接、あるいは培養した菌体からＤＮＡを抽出し、各プライマーとの反応性を調べることによって菌の簡易同定を行うことができる。
【００３０】
培養を行うことなく糞便等から目的とする菌を特異的に検出するためには、例えば、まず、糞便等のサンプル１ｍｌ程度を遠心分離して得られるペレットから塩化ベンジル法等によってＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとする。この鋳型ＤＮＡに本発明のプライマーを組み合わせ、増幅反応を行うことにより、菌に特異的なＤＮＡ配列（ＰＣＲ産物）を得ることができる。このようにして得られたＤＮＡを電気泳動すれば、バンドの有無と用いたプライマーから菌を特異的に検出することができる。
【００３１】
また、ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性試験や生物、生化学的性状試験等の煩雑な操作を行うことなく、菌の同定を行うためには、例えば、まずボイリング法等によってＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとする。この鋳型ＤＮＡに本発明のプライマーを組み合わせ、増幅反応を行うことにより、菌に特異的なＤＮＡ配列（ＰＣＲ産物）を得ることができる。このようにして得られたＤＮＡを電気泳動すれば、バンドの有無と用いたプライマーから菌を特異的に検出することができる。
【００３２】
ＤＮＡを抽出する方法としては、上記ボイリング法、常法であるＭａｒａｕｒ法、その変法である酵素法、及び簡便法である上記ベンジルクロライド法が好ましい。これらの方法は多少煩雑になるものの、酵素法において、幅広い菌種から収率よくＤＮＡを抽出できる。
【００３３】
このように、コロニーや糞便サンプル等から抽出したＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマーを用いて菌の同定を行うと、従来の方法では検出限界以下であった菌株や種の判別が困難であった菌株も簡便に検出することが可能であった。また、ＰＣＲ を行う際に、鋳型のＤＮＡ量を段階希釈しＰＣＲを行えば、目的とする菌の定量化も可能である。
【００３４】
また、本発明のプライマーは、単独でもプローブとして使用できる。これらは他の公知のユニバーサルプライマーやオリゴヌクレオチド等と組み合わせても用いることができる。
【００３５】
また、本発明のプライマーを用いれば、ヒト、動物等の腸内細菌叢等の解析も行える。すなわち、上記ビフィドバクテリウム属細菌用プライマーやその他の多岐にわたる細菌のプライマーと組み合わせて用いれば、細菌叢の全体像を把握することも可能である。
【００３６】
【発明の効果】
本発明のプライマーを使用すれば、菌を培養することなく、迅速、簡便、低コスト且つ高精度に嫌気性連鎖球菌またはエンテロコッカス属細菌の同定を行うことができる。また、他の菌に特異的なプライマー等と組み合わせて使用することで、腸内細菌叢の解析等をも行うことができる。更に、同定、解析の結果から病変部位の菌や消化管等の状態を把握できるため、種々疾病等の予防・治療が容易になる。
【００３７】
【実施例１】
プライマーの設計及び合成
ＤＤＢＪ、Ｇｅｎｂａｎｋ等のデータベースより得られた細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列と、本発明者が解読した上記の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を基に、プライマーの設計を行った。エンテロコッカス属細菌では大腸菌のナンバリングにおける１７０領域付近と５６０領域付近に、アナエロビウスグループ、アサカロリティクスグループ、プレボティグループ及びマグナスグループでは３１０領域付近と６６０領域付近に、サルサイナ・ベントリクリおよびサルサイナ・マキシマでは１７０領域付近と６６０領域付近に、ベイロネラ・パルブラ及びアシドアミノコッカス・ファーメンタンスでは１４０領域付近と６６０領域付近に、それぞれ特異性が認められたので、この部分をターゲットとして用いた。こうして設計した塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプライマーを合成した（表１）。
【００３８】
【表１】
【００３９】
【実施例２】
エンテロコッカス属細菌用プライマーの特異性の確認
本発明のプライマーが、実際に特異性を有しているかを確認するため、近縁種の株とプライマーとの反応性を検討した。
【００４０】
（１）菌株の純粋培養及びＤＮＡの抽出
表２に示す、２４菌種の細菌を血液寒天培地（ベクトンデッキンソン社製）にて好気的に一晩純粋培養した。こうして得た菌体各々から、塩化ベンジル法(Zhu, H. et al.,(1993) Nucleic Acids Research, 21,5279-5280)により、ＤＮＡを抽出した。
【００４１】
すなわち、血液寒天培地を用いた一夜培養菌液１．５ｍｌを作成し、遠心した後、菌体にＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ buffer（１００ｍM Tris,４０ｍM EDTA ｐH9.0）２５０μｌ、ベンジルクロライド１５０μｌ，１０％SDS５０μｌを加え、５０℃で３０分間激しく振盪した。３M酢酸ナトリウム１５０μｌを加えて氷中で１５分間静置した後、１５０００ｒｐｍ、１０分間の遠心で得られた上清をイソプロパノールで沈殿させ７０％エタノールで洗浄した。沈殿を５０μｌのＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶かして濃度を測定し、１０μｇ／ｍｌの濃度に調製して鋳型ＤＮＡ溶液とした。
【００４２】
（２）ＰＣＲ反応
総量を２５μｌとし、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍｌ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅに、０．８μＭプライマー（Ｅｎｔ−１，２）、１．０Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラ社製）、１０ｎｇ 鋳型ＤＮＡを含む反応液で、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ４８０（タカラ社製）により、９４℃、２０秒、５0℃、２０秒、７２℃、３０秒を３０回のＰＣＲ反応を行った。
【００４３】
（３）プライマーの特異性の検討
ＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有無によりプライマーの各菌株のＤＮＡとの結合能を確認することにより、プライマーの特異性を判定した。１．５％アガロース(Ｍｏlｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ａｇａｒｏｓｅ；バイオラッド社製)で、Ｍｕｐｉｄ−２（コスモ・バイオ）により１００Ｖ、２５分電気泳動し、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ（０．５ｍｇ／ｍｌ）で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。その結果は表２に示すとおりであり、プライマーはエンテロコッカス属細菌特異的にバンドを形成した。
【００４４】
【表２】
【００４５】
【実施例３】
嫌気性連鎖球菌用プライマーの特異性の確認
本発明のプライマーが、実際に特異性を有しているかを確認するため、実施例２と同様に近縁種の株とプライマーとの反応性を検討した。
【００４６】
（１）菌株の純粋培養及びＤＮＡの抽出
表３に示す、２５菌種細菌をＢｒｕｃｅｌｌａ ＨＫ 寒天培地（極東社製）にて嫌気性的に一晩純粋培養した。こうして得た菌体各々から、実施例１と同様に塩化ベンジル法(Zhu, H. et al.,(1993) Nucleic Acids Research, 21, 5279-5280)により、ＤＮＡを抽出した。
【００４７】
（２）ＰＣＲ反応
総量を２５μｌとし、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍｌ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅに、各々０．８μＭプライマー、１．０Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラ社製）、１０ｎｇ 鋳型ＤＮＡを含む反応液で、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ４８０（タカラ社製）により、９４℃、２０秒、５0℃、２０秒、７２℃、３０秒を３０回のＰＣＲ反応を行った。
【００４８】
（３）プライマーの特異性の検討
ＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有無によりプライマーの各菌株のＤＮＡとの結合能を確認することにより、プライマーの特異性を判定した。１．５％アガロース(Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ａｇａｒｏｓｅ；バイオラッド社製)で、Ｍｕｐｉｄ−２（コスモ・バイオ）により１００Ｖ、２５分電気泳動し、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ（０．５ｍｇ／ｍｌ）で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。その結果は表３に示すとおりであり、プライマーは対象となる各菌特異的にバンドを形成した。
【００４９】
【表３】
【配列表】
【発明の属する利用分野】
本発明は、嫌気性連鎖球菌及びエンテロコッカス属細菌の同定に有用なＤＮＡプライマー及びこれを用いた検出・同定・解析方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ペプトストレプトコッカス属細菌、サルサイナ属細菌等の嫌気性連鎖球菌は、ヒトの口腔や肺などの炎症部位において頻繁に検出され、腸内に生息するものもある。嫌気性連鎖球菌には他にも、アトポビウム属細菌、ゲメラ属細菌、ベイロネラ属細菌、アシドアミノコッカス属細菌、メガスフェラ属細菌等がある。また、エンテロコッカス属細菌は、主として腸管内に生息する菌である。
【０００３】
これらの菌を同定・解析することは、例えば腸内細菌叢における菌の動向を把握することによる個体の健康状態の把握、腸管内の病理的研究等に非常に有用である。また、病変部位において発症に関与する菌を同定できれば、抗生物質の選定等の対応を迅速に行うことができる。現状では同定の手段として、種々の選択培地を組み合わせて用いる選別方法や顕微鏡観察が主に行われている。
【０００４】
菌の同定、解析を行うためには、対象となる個体の糞便を嫌気条件下において希釈液で希釈し、これを培地上にまき、嫌気性培養を行う必要がある。しかし、培養の際には数日から数週間の時間を要することとなり、コロニー数のカウント等操作も煩雑であった。
【０００５】
また、近年では、ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーによる判定も行われるようになっている。（Collins, M. D., et al., INTERNATIONAL JOURNAL of SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, 39, 105−108(1989)）。しかしながら、この同定法も長時間を要し、迅速な菌種同定を行うには好ましいものではなかった。
【０００６】
上記検出法の問題点を解消するため、本出願人らはある種の腸内細菌に特異的なプローブやプライマーを用いて、菌の同定を行う方法を検討し、例えば特開平１１−２８０９０号にはバクテロイデスグループ細菌に特異的なプローブを、特開平１１−１２３０９３号にはビフィドバクテリウム属細菌に特異的なプライマーを開示している。この方法によれば、菌の同定・検出を簡便、迅速に行えるが、ヒト腸内や病変部位にはこの他にも様々な細菌が存在しているため、上記のペプトストレプトコッカス属細菌等とは別の菌をもカバーできるプライマーやプローブのセットが要望されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、腸内細菌の同定等に使用しうるプライマーを設計するためには、遺伝子のシークエンシング、アライメント等かなりの手間がかかるばかりか、せっかく設計した配列でプライマーを合成しても、特異性が得られない場合もある。このため、プライマーの種類がなかなか増えず、腸内、病変部での菌の動向を把握するには未だ不充分である。
【０００８】
従って、本発明の目的は、ヒト腸内や病変部位にて検出される各種の菌を特異的に同定できるプライマーを合成し、このプライマーを用いて菌を迅速、簡便に同定・解析する方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
斯かる現状に鑑み本発明は鋭意研究を行ったところ、各種嫌気性連鎖球菌およびエンテロコッカス属細菌に特異的な塩基配列を有するＤＮＡプライマーを見いだし、これを用いれば、細菌の培養を行うことなく、検体から抽出した細菌由来のＤＮＡのＰＣＲ反応により、迅速かつ簡便に上記の菌の同定・解析が可能となることを見出し本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、配列番号１と９に記載の塩基配列の組み合わせ又はこれらの塩基配列の組み合わせに相補的な配列からなるエンテロコッカス属細菌特異的プライマー対を提供するものである。
【００１２】
更に、本発明は、上記のプライマー対を使用することを特徴とするエンテロコッカス属細菌の検出方法を提供するものである。
【００１３】
更にまた、本発明は、（１）検体中のＤＮＡを抽出する工程、（２）上記プライマー対を用いてＰＣＲ反応を行う工程及び（３）工程（２）により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程を含むエンテロコッカス属細菌の検出方法を提供するものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の嫌気性連鎖球菌またはエンテロコッカス属細菌に特異的なプライマーは、ヒトの腸管や病変部位で頻繁に検出される菌に特異的な配列を有するものである。具体的には、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）、エンテロコッカス・カッセリフィラバス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｓｅｒｉｆｉｌａｖｕｓ）、エンテロコッカス・ガリナラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・セコラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ）、エンテロコッカス・コランビー（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｌｕｍｂａｅ）またはエンテロコッカス・サルフロイス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ）の８菌種に特異的なエンテロコッカス属細菌用プライマー、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属中のアナエロビウス（ａｎａｅｒｏｂｉｕｓ）グループ、アサカロリティクス（ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）グループ、プレボティ（ｐｒｅｖｏｔｉｉ）グループまたはマグナス（ｍａｇｎｕｓ）グループの各々に特異的なプライマー、サルサイナ・ベントリクリ（Ｓａｒｃｉｎａ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｉ）またはサルサイナ・マキシマ（Ｓａｒｃｉｎａ ｍａｘｉｍａ）に特異的なサルサイナ属細菌用プライマー、ベイロネラ・パルブラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｐａｒｖｕｌａ）に種特異的なプライマー、アシドアミノコッカス・ファーメンタンス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）に種特異的なプライマーを例示することができる。
【００１５】
ここで、上記ペプトストレプトコッカス属中の４つのグループとは、１６Ｓリボソームの配列から４つの系統に細分され、各々のグループに共通の配列を保有する遺伝学的に類似した集団を指す。
【００１６】
上記の嫌気性連鎖球菌またはエンテロコッカス属細菌にし特異的なプライマーを作成するにあたり、そのターゲットには、系統分類の指標として信頼性の高い１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を用い、同定・解析には、ＰＣＲ法等の手段が必要となるため、ＲＮＡでなくＤＮＡを用いた。
【００１７】
プライマーは、本発明者がシークエンスを行って得た塩基配列とデータベース（ＤＤＢＪ、Ｇｅｎｂａｎｋ等）から得た塩基配列とを比較・検討することにより得たものである。ここで、本発明者が比較対象として新たに１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のシークエンスを行った菌種は、具体的には、エンテロコッカス・デュランス（Ｅ．ｄｕｒａｎｓ）ＡＴＣＣ１９４３２、ペプトストレプトコッカス・アナエロビウス（Ｐｓ．アナエロビウス）ＧＩＦＵ７８８２、Ｐｓ． アサカロリティクス ＧＩＦＵ７６５６、Ｐｓ． アサカロリティクスＧＩＦＵ７７１５、Ｐｓ．アサカロリティクス ＧＩＦＵ７７１７、Ｐｓ． アサカロリティクス ＧＩＦＵ７７５２、 Ｐｓ．アサカロリティクス ＧＩＦＵ８１２４、 Ｐｓ．プレボティＧＩＦＵ７６５８、 ペプトストレプトコッカ・バジナリス（Ｐｓ．ｈｙｄｒｏｇｅｎａｌｉｓ）ＧＩＦＵ７６６２、ペプトストレプトコッカス・ラクリマリス（Ｐｓ．ｌａｃｒｉｍａｌｉｓ）ＧＩＦＵ７６６７、ペプトストレプトコッカス・テトラディウス（Ｐｓ．ｔｅｔｒａｄｉｕｓ）ＧＩＦＵ７６７２、ペプトストレプトコッカス・バジナリス（Ｐｓ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）ＧＩＦＵ７７３２、ペプトストレプトコッカス・ミクロス（Ｐｓ．ｍｉｃｒｏｓ）ＧＩＦＵ７８２４、ペプトストレプトコッカス・インドリカス（Ｐｓ．ｉｎｄｏｌｉｃｕｓ）ＧＩＦＵ７８４８、ペプトストレプトコッカス・マグナス（Ｐｓ．ｍａｇｎｕｓ）ＧＩＦＵ７８８１、ペプトストレプトコッカス・ラクトリティカス（Ｐｓ．ｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＧＩＦＵ８５８６ 及びペプトストレプトコッカス・ヘリオトリンレデゥセンス （Ｐｓ．ｈｅｌｉｏｔｒｉｎｒｅｄｕｇｅｎｓ）ＧＩＦＵ９９１０である。これらの配列は、遺伝研データベースＤＤＢＪに登録する予定である。
【００１８】
プライマーの設計の際には、同定の対象となる菌とその近縁の菌を配列をアライメントした。その結果、エンテロコッカス属細菌では大腸菌のナンバリングにおける１７０領域付近と５６０領域付近に、アナエロビウスグループ、アサカロリティクスグループ、プレボティグループ及びマグナスグループでは３１０領域付近と６６０領域付近に、サルサイナ・ベントリクリおよびサルサイナ・マキシマでは１７０領域付近と６６０領域付近に、ベイロネラ・パルブラ及びアシドアミノコッカス・ファーメンタンスでは１４０領域付近と６６０領域付近に、それぞれ特異性が認められたので、この部分をターゲットとして用いた。また、オリゴヌクレオチドの長さはプライマーによって異なっており、１９〜２１ｂ．ｐとなっている。これらは操作上最も好適な長さであるが、使用に際しては、各々の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子中において、該オリゴヌクレオチドに隣接する数〜十数ｂ．ｐ の塩基配列を増減させたものを用いても良い。
【００１９】
このようにして得られたプライマーのうち、配列番号１及び９記載の塩基配列を有するものは、エンテロコッカス属細菌に特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、菌種の同定、解析を行うためのプライマーやプローブとして使用することができる。プライマーとしては、公知の乳酸菌用ユニバーサルプライマー等と組み合わせて用いることも可能であるが、その組み合わせによっては種特異的な検出を行えないものもあるので、両者を組み合わせることが望ましい。
【００２０】
また、配列番号２及び１０記載の塩基配列を有するものは、アナエロビウスグループ細菌に特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組みあわせて用いることが好ましい。
【００２１】
また、配列番号３及び１１記載の塩基配列を有するものは、アサカロリティクスグループ細菌（Ｐｓ．アサカロリティクス及びＰｓ．インドリカス）に特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組みあわせて用いることが好ましい。
【００２２】
また、配列番号４及び１２記載の塩基配列を有するものは、プレボティグループ細菌（Ｐｓ．プレボティ、Ｐｓ．テトラディウス及びＰｓ．バジナリス）に特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組みあわせて用いることが好ましい。
【００２３】
また、配列番号５及び１３記載の塩基配列を有するものは、マグナスグループ細菌（Ｐｓ．マグナス及びＰｓ．ミクロス）に特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組みあわせて用いることが好ましい。
【００２４】
また、配列番号６及び１４記載の塩基配列を有するものは、サルサイナ・ベントリクリおよびサルサイナ・マキシマに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組みあわせて用いることが好ましい。
【００２５】
また、配列番号７及び１５記載の塩基配列を有するものは、ベイロネラ・パルブラに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組みあわせて用いることが好ましい。
【００２６】
更に、配列番号８及び１６記載の塩基配列を有するものは、アシドアミノコッカス・ファーメンタンスに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組みあわせて用いることが好ましい。
【００２７】
上記のように設計したオリゴヌクレオチドプライマーは、その塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機により、人工的に合成される。その特異性は、以下の実施例に示す近縁種のＤＮＡに対する、プライマーのバンド形成能を指標として確認した。結果として、上記全ての菌種の特異性に問題はなかった。
【００２８】
一方で、今回新たにシークエンスを行ったことにより、配列番号１〜１６に示す配列以外にも種特異的な配列が見出されている。しかしながら、これらの配列や他の公知のプライマーで同定を行っても、別の種に属する株と反応したり、目的とする種の株と反応しない場合もあり、使用上好ましいものではなかった。このようなプライマーを用いてもＰＣＲ反応時の条件設定によって種特異的な反応性は達成されるものと考えられるが、現状ではそのような条件は見出されていない。
【００２９】
本発明のプライマーは、このように各種嫌気性連鎖球菌またはエンテロコッカス属細菌への特異性を有するため、これらを用いて糞便、腸内細菌、病変部位の菌を迅速に同定できる。また、各菌の選択培地（例えばエンテロコッカス属細菌であれば、乳酸菌用選択培地であるＢＣＰ加コロニーカウント寒天培地（栄研化学社製）等）に形成されたコロニーから直接、あるいは培養した菌体からＤＮＡを抽出し、各プライマーとの反応性を調べることによって菌の簡易同定を行うことができる。
【００３０】
培養を行うことなく糞便等から目的とする菌を特異的に検出するためには、例えば、まず、糞便等のサンプル１ｍｌ程度を遠心分離して得られるペレットから塩化ベンジル法等によってＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとする。この鋳型ＤＮＡに本発明のプライマーを組み合わせ、増幅反応を行うことにより、菌に特異的なＤＮＡ配列（ＰＣＲ産物）を得ることができる。このようにして得られたＤＮＡを電気泳動すれば、バンドの有無と用いたプライマーから菌を特異的に検出することができる。
【００３１】
また、ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性試験や生物、生化学的性状試験等の煩雑な操作を行うことなく、菌の同定を行うためには、例えば、まずボイリング法等によってＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとする。この鋳型ＤＮＡに本発明のプライマーを組み合わせ、増幅反応を行うことにより、菌に特異的なＤＮＡ配列（ＰＣＲ産物）を得ることができる。このようにして得られたＤＮＡを電気泳動すれば、バンドの有無と用いたプライマーから菌を特異的に検出することができる。
【００３２】
ＤＮＡを抽出する方法としては、上記ボイリング法、常法であるＭａｒａｕｒ法、その変法である酵素法、及び簡便法である上記ベンジルクロライド法が好ましい。これらの方法は多少煩雑になるものの、酵素法において、幅広い菌種から収率よくＤＮＡを抽出できる。
【００３３】
このように、コロニーや糞便サンプル等から抽出したＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマーを用いて菌の同定を行うと、従来の方法では検出限界以下であった菌株や種の判別が困難であった菌株も簡便に検出することが可能であった。また、ＰＣＲ を行う際に、鋳型のＤＮＡ量を段階希釈しＰＣＲを行えば、目的とする菌の定量化も可能である。
【００３４】
また、本発明のプライマーは、単独でもプローブとして使用できる。これらは他の公知のユニバーサルプライマーやオリゴヌクレオチド等と組み合わせても用いることができる。
【００３５】
また、本発明のプライマーを用いれば、ヒト、動物等の腸内細菌叢等の解析も行える。すなわち、上記ビフィドバクテリウム属細菌用プライマーやその他の多岐にわたる細菌のプライマーと組み合わせて用いれば、細菌叢の全体像を把握することも可能である。
【００３６】
【発明の効果】
本発明のプライマーを使用すれば、菌を培養することなく、迅速、簡便、低コスト且つ高精度に嫌気性連鎖球菌またはエンテロコッカス属細菌の同定を行うことができる。また、他の菌に特異的なプライマー等と組み合わせて使用することで、腸内細菌叢の解析等をも行うことができる。更に、同定、解析の結果から病変部位の菌や消化管等の状態を把握できるため、種々疾病等の予防・治療が容易になる。
【００３７】
【実施例１】
プライマーの設計及び合成
ＤＤＢＪ、Ｇｅｎｂａｎｋ等のデータベースより得られた細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列と、本発明者が解読した上記の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を基に、プライマーの設計を行った。エンテロコッカス属細菌では大腸菌のナンバリングにおける１７０領域付近と５６０領域付近に、アナエロビウスグループ、アサカロリティクスグループ、プレボティグループ及びマグナスグループでは３１０領域付近と６６０領域付近に、サルサイナ・ベントリクリおよびサルサイナ・マキシマでは１７０領域付近と６６０領域付近に、ベイロネラ・パルブラ及びアシドアミノコッカス・ファーメンタンスでは１４０領域付近と６６０領域付近に、それぞれ特異性が認められたので、この部分をターゲットとして用いた。こうして設計した塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプライマーを合成した（表１）。
【００３８】
【表１】
【実施例２】
エンテロコッカス属細菌用プライマーの特異性の確認
本発明のプライマーが、実際に特異性を有しているかを確認するため、近縁種の株とプライマーとの反応性を検討した。
【００４０】
（１）菌株の純粋培養及びＤＮＡの抽出
表２に示す、２４菌種の細菌を血液寒天培地（ベクトンデッキンソン社製）にて好気的に一晩純粋培養した。こうして得た菌体各々から、塩化ベンジル法(Zhu, H. et al.,(1993) Nucleic Acids Research, 21,5279-5280)により、ＤＮＡを抽出した。
【００４１】
すなわち、血液寒天培地を用いた一夜培養菌液１．５ｍｌを作成し、遠心した後、菌体にＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ buffer（１００ｍM Tris,４０ｍM EDTA ｐH9.0）２５０μｌ、ベンジルクロライド１５０μｌ，１０％SDS５０μｌを加え、５０℃で３０分間激しく振盪した。３M酢酸ナトリウム１５０μｌを加えて氷中で１５分間静置した後、１５０００ｒｐｍ、１０分間の遠心で得られた上清をイソプロパノールで沈殿させ７０％エタノールで洗浄した。沈殿を５０μｌのＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶かして濃度を測定し、１０μｇ／ｍｌの濃度に調製して鋳型ＤＮＡ溶液とした。
【００４２】
（２）ＰＣＲ反応
総量を２５μｌとし、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍｌ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅに、０．８μＭプライマー（Ｅｎｔ−１，２）、１．０Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラ社製）、１０ｎｇ 鋳型ＤＮＡを含む反応液で、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ４８０（タカラ社製）により、９４℃、２０秒、５0℃、２０秒、７２℃、３０秒を３０回のＰＣＲ反応を行った。
【００４３】
（３）プライマーの特異性の検討
ＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有無によりプライマーの各菌株のＤＮＡとの結合能を確認することにより、プライマーの特異性を判定した。１．５％アガロース(Ｍｏlｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ａｇａｒｏｓｅ；バイオラッド社製)で、Ｍｕｐｉｄ−２（コスモ・バイオ）により１００Ｖ、２５分電気泳動し、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ（０．５ｍｇ／ｍｌ）で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。その結果は表２に示すとおりであり、プライマーはエンテロコッカス属細菌特異的にバンドを形成した。
【００４４】
【表２】
【実施例３】
嫌気性連鎖球菌用プライマーの特異性の確認
本発明のプライマーが、実際に特異性を有しているかを確認するため、実施例２と同様に近縁種の株とプライマーとの反応性を検討した。
【００４６】
（１）菌株の純粋培養及びＤＮＡの抽出
表３に示す、２５菌種細菌をＢｒｕｃｅｌｌａ ＨＫ 寒天培地（極東社製）にて嫌気性的に一晩純粋培養した。こうして得た菌体各々から、実施例１と同様に塩化ベンジル法(Zhu, H. et al.,(1993) Nucleic Acids Research, 21, 5279-5280)により、ＤＮＡを抽出した。
【００４７】
（２）ＰＣＲ反応
総量を２５μｌとし、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍｌ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅに、各々０．８μＭプライマー、１．０Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラ社製）、１０ｎｇ 鋳型ＤＮＡを含む反応液で、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ４８０（タカラ社製）により、９４℃、２０秒、５0℃、２０秒、７２℃、３０秒を３０回のＰＣＲ反応を行った。
【００４８】
（３）プライマーの特異性の検討
ＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有無によりプライマーの各菌株のＤＮＡとの結合能を確認することにより、プライマーの特異性を判定した。１．５％アガロース(Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ａｇａｒｏｓｅ；バイオラッド社製)で、Ｍｕｐｉｄ−２（コスモ・バイオ）により１００Ｖ、２５分電気泳動し、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ（０．５ｍｇ／ｍｌ）で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。その結果は表３に示すとおりであり、プライマーは対象となる各菌特異的にバンドを形成した。
【００４９】
【表３】
Claims (3)
- 配列番号１と９に記載の塩基配列の組み合わせ又はこれらの塩基配列の組み合わせに相補的な配列からなるエンテロコッカス属細菌特異的プライマー対。
- 請求項１記載のプライマー対を使用することを特徴とするエンテロコッカス属細菌の検出方法。
- （１）検体中のＤＮＡを抽出する工程、（２）請求項１記載のプライマー対を用いてＰＣＲ反応を行う工程及び（３）工程（２）により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程を含むエンテロコッカス属細菌の検出方法。
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