JP4009732B2 - レポーター遺伝子産物を発現するｈｃｖ全長ゲノム複製細胞、並びに、当該細胞を用いたスクリーニング方法およびスクリーニングキット - Google Patents

Description

本発明は、レポーター遺伝子産物を発現するＨＣＶ全長ゲノム複製細胞、当該細胞を用いたスクリーニング方法、およびＣ型肝炎治療用組成物に関するものである。

Ｃ型肝炎ウイルス（以下「ＨＣＶ」と記載する）は非Ａ非Ｂ型肝炎の原因ウイルスとして１９８９年に発見同定されたフラビウイルス科に属するＲＮＡウイルスである。ＨＣＶは持続感染を成立させるウイルスであることから、ＨＣＶ感染により引き起こされる肝炎（Ｃ型肝炎）は高率に慢性肝炎に移行する。その後、二十数年の経過のなかで肝硬変、そして最終的に肝細胞癌発症に至ることが明らかになっている。

ＨＣＶ感染者は日本国内で約２００万人、世界で約２億人いると推定されている。最近の社会的問題にもなっているフィブリノゲン製剤によるＨＣＶ感染という事態からもわかるように、ＨＣＶに感染していることを自覚していないいわゆる無症候性キャリアーも多数存在している。現在、日本国内における肝細胞癌による犠牲者は年間約３．５万人となっており、その８割はＨＣＶ感染によるものである。また、その前段階である肝硬変においても年間約２万人が犠牲となっている。したがって、ＨＣＶは深刻な感染症を引き起こすウイルスであると言える。

現在、Ｃ型慢性肝炎に対して単独で抗ウイルス効果を示す治療薬はインターフェロン（以下「ＩＦＮ」と記載する）のみである。日本国内では１９９２年からＣ型慢性肝炎に対するＩＦＮ療法が開始され、ＩＦＮの投与法の試行錯誤により治療効果にも向上がみられるようになった。しかし、約半数の患者には治癒が望めないことから、ＩＦＮ療法の限界も明らかになっている。

ＨＣＶには多数の遺伝子型が存在しているが、日本国内では１ｂ型が約７０％、２ａ型が約２０％、２ｂ型が約１０％であり、稀にその他の遺伝子型が見出される。遺伝子型によりＩＦＮ治療に対する効果が異なり、２ａ型や２ｂ型ではＩＦＮ治療効果が高い（著効率が５０％以上）のに対して、１ｂ型ではＩＦＮ治療効果が低いことが知られている。また、ウイルス量が多い患者では、少ない患者よりもＩＦＮが効き難いことが知られているが、１ｂ型にはウイルス量が多い患者が多く、１ｂ型でウイルス量が多い患者の著効率は２〜８％と極端に低い。これらの患者群は、いわゆる「インターフェロン抵抗性」あるいは「インターフェロン難治性」と呼ばれている。

著効率を上げることを目的として、近年になって核酸構造類似体で幅広い抗ウイルス活性を示すことが知られていたリバビリン（単独ではＣ型肝炎には効果がない）とＩＦＮとの併用療法（２００１年１２月に保険適用認可）やＩＦＮにポリエチレングリコールを結合させてＩＦＮの血中での安定性を高め、かつ腎排泄度を低下させたペグＩＦＮを用いた療法（２００３年１２月使用認可）が行われるようになっている。

ＨＣＶが発見された翌年にはＨＣＶのＲＮＡゲノムの全構造が解明され、約9,600塩基の１本鎖プラス鎖ＲＮＡから１０種類のＨＣＶタンパク質が産生されることが明らかになっている（図１参照）。前半部のコアとエンベロープからウイルス粒子が産生され、後半部の非構造（ＮＳ）領域からＨＣＶゲノムの複製に必須なＮＳタンパク質が産生される。

ゲノム構造が解明されたことにより、ＨＣＶ研究は大きく進展したが、中和抗体、ワクチン、特異的抗ＨＣＶ薬剤の開発については依然として苦戦を強いられている。その最大の理由として、ＨＣＶを人工的に増殖させる実験システムの欠如が挙げられる。ＨＣＶの発見以後、多くの培養細胞や動物を用いて人工増殖システムの開発が試みられたが、実用的なものは得られなかった。また、ＨＣＶ感染のモデル動物はチンパンジーのみであり、これに代わる動物は未だ見つかっていない。チンパンジーを薬剤のスクリーニングに用いることは希少性および経済性の観点から現実的でない。

１９９９年に、上記の問題点をある程度クリアする新しい実験システムとしてＨＣＶレプリコンシステムが登場した（非特許文献１参照）。このシステムでは、ＨＣＶゲノムの複製に必須のＮＳ３〜ＮＳ５Ｂ領域とゲノムの両末端からなるＨＣＶサブゲノムが細胞内で複製するようになっており、１細胞あたりのＨＣＶサブゲノムのコピー数は数千というレベルに達する。その後、いくつかの異なるＨＣＶ株由来のサブゲノミックＨＣＶレプリコン細胞が樹立されている（例えば、非特許文献２参照）。また、上記レプリコン細胞において、サブゲノミックＨＣＶレプリコンの複製レベルを容易にモニターできるようにする目的で、レポーター遺伝子を組み込んだサブゲノミックＨＣＶレプリコンが導入された細胞が開発されている（非特許文献３〜５を参照）。

現在、Ｃ型肝炎治療薬の開発においては、多数のモデル動物（チンパンジー）を用いた薬理試験を実施することができないため、上記サブゲノミックＨＣＶレプリコンシステムを用いた薬効評価が必須となっている。

しかしながら、上記サブゲノミックＨＣＶレプリコンシステムでは、ＨＣＶ構造タンパク質の影響を評価できないという問題を有している。ＨＣＶ構造タンパク質の１つであるコアタンパク質が宿主の細胞因子に影響を及ぼすことは従来知られている。したがって、実際にＨＣＶに感染したヒト肝臓で生じていることを見ようとする試みには、レプリコンシステムでは不十分である。また、サブゲノミックＨＣＶレプリコンシステムを用いてスクリーニングされたウイルスの複製を抑制する薬剤が、実際にはＨＣＶの複製を十分抑制できない場合もあることが予想される。

そこで、上記サブゲノミックＨＣＶレプリコンシステムの有する問題を解決するために、ＨＣＶ全長ゲノムＲＮＡの複製システムが開発され、これまでに、３種類のＨＣＶ株（Ｎ株、Ｃｏｎ−１株およびＨ７７株）の全長ゲノムを複製できる細胞（全長ＨＣＶ ＲＮＡ複製システム）の樹立が報告されている（非特許文献６〜８を参照）。

スタチンは、高脂血症治療剤、高コレステロール血症治療剤として広く臨床使用されているＨＭＧ Ｃｏ−Ａ還元酵素阻害剤である。最近、スタチンの抗ウイルス作用が報告されており、抗ＨＣＶ作用についてもいくつかの報告がある。

特許文献１には、アトルバスタチン、ローバスタチン、シンバスタチン、セリバスタチンおよびプラバスタチンの５種類についてサブゲノミックＨＣＶレプリコンシステムを用いて複製抑制効果を検討し、プラバスタチン以外の４種類のスタチンに抗ＨＣＶ作用が認められたことが記載されている。しかし、全長ＨＣＶ ＲＮＡ複製システムを用いて評価したものではないため、構造タンパク質の影響については評価できていない。また、他の抗ウイルス剤（ＩＦＮ、リバビリン）とスタチンとの併用についても言及されているが、実証データは付されていない。

特許文献２および非特許文献９には、ローバスタチンについて抗ＨＣＶ作用を検討した結果が記載されている。これらの報告においては、全長ＨＣＶ ＲＮＡ複製システムを使用しているが、ＲＮＡレベルの評価にはサブゲノミックＨＣＶレプリコンシステムを用いており、全長ＨＣＶ ＲＮＡ複製システムではＨＣＶタンパク質の発現抑制を評価しているに過ぎない。

シクロスポリンＡは、免疫抑制剤として広く臨床使用されている。シクロスポリンＡが抗ＨＣＶ作用を有することは既に報告されており、その作用機序についても明らかにされている（非特許文献１０〜１３を参照）。
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サブゲノミックＨＣＶレプリコンシステムの有する問題は、全長ＨＣＶ ＲＮＡ複製システム（ＨＣＶ全長ゲノム複製細胞）の樹立によって解決されたと考えられる。しかし、既に樹立されているＨＣＶ全長ゲノム複製細胞において、ＨＣＶの複製レベルをモニターする際には、煩雑な操作を要するＲＴ−ＰＣＲ法やノーザンブロット法などで行う必要があり、抗ＨＣＶ薬剤の大量スクリーニングに利用することは困難である。また、複製レベルを感度良く正確にモニターするにも困難さを伴う。そこで、ＨＣＶの複製レベルを簡便かつ正確にモニターできるように、レポーター遺伝子を組み込んだ全長ＨＣＶ ＲＮＡ複製システムの開発が必要である。

しかし、既に樹立されているＨＣＶ全長ゲノム複製細胞が非常に少数であることからもわかるように、ＨＣＶ全長ゲノム複製細胞を樹立することは容易なことではない。その理由は、ＨＣＶの全長ゲノムＲＮＡに薬剤耐性マーカー遺伝子をコードする領域を付加したＲＮＡは１１ｋｂを超え、このように長いＲＮＡを宿主細胞へ導入して安定的に複製させることが非常に難しいからである。それゆえ、さらにレポーター遺伝子配列を付加することで一層長くなるＲＮＡ（約１２ｋｂ）を宿主細胞に導入して安定的に複製させることは非常に困難であり、レポーター遺伝子を組み込んだＨＣＶ全長ゲノム複製細胞は、未だ樹立されていない。

一方、ＩＦＮを主体とした現在のＣ型肝炎治療法では、約５０%の患者の治癒が望めないことから、ＩＦＮとの併用でさらに有効な薬剤あるいはＩＦＮに代わる薬剤の開発が切望されている。

本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、レポーター遺伝子を組み込んだＨＣＶ全長ゲノムが導入され、レポーター遺伝子産物を発現する全長ＨＣＶ全長ゲノム複製細胞を実現し、当該細胞を用いた抗ＨＣＶ薬剤のスクリーニング方法を提供し、さらに当該スクリーニング方法を用いて得られた抗ＨＣＶ作用を有する物質を有効成分とするＣ型肝炎治療用組成物を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討し、レポーター遺伝子を組み込んだＨＣＶ全長ゲノムを導入するための親細胞として、既に本発明者らが樹立していたＨＣＶ全長ゲノム複製細胞をＩＦＮ−αで処理してＨＣＶ ＲＮＡを完全に排除した、いわゆる治癒細胞が好適であることを見出し、レポーター遺伝子を組み込んだＨＣＶ全長ゲノム複製細胞を樹立した。そして、本発明者らは、レポーター遺伝子産物の発現量とＨＣＶ ＲＮＡの複製量とが非常によく相関することを確認した。さらに、本発明者らは当該細胞を用いて、既にＨＭＧ Ｃｏ−Ａ阻害剤として市販されているスタチンをスクリーニングした結果、ＨＣＶゲノム複製抑制作用を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明に係る細胞は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の全長ゲノムを複製し、かつレポーター遺伝子産物を発現する細胞であって、レポーター遺伝子配列、選択マーカー遺伝子配列およびＨＣＶ全長ゲノム配列を含むＲＮＡが導入されていることを特徴としている。

本発明に係る細胞に導入されているＲＮＡは、さらに外来性のインターナルリボソーマルエントリーサイト（ＩＲＥＳ）配列を含むことが好ましい。

本発明に係る細胞は、上記ＲＮＡが挿入される親細胞として、選択マーカー遺伝子配列およびＨＣＶ全長ゲノム配列を含むＲＮＡが導入されたＨＣＶ全長ゲノム複製細胞を、抗ウイルス作用を有する薬剤を含む培地で培養することにより得られる治癒細胞が用いられることが好ましい。上記抗ウイルス作用を有する薬剤は、インターフェロンであることが好ましい。さらに、当該治癒細胞は、ヒト肝癌細胞株ＨｕＨ−７由来のＯｃ細胞（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５１７）であることが好ましい。

本発明に係る細胞において、親細胞に導入されるＲＮＡのＨＣＶオープンリーディングフレーム配列中に、少なくとも１個のアミノ酸置換を伴う変異が含まれることがより好ましい。上記変異はＮＳ３領域内に生じていることがさらに好ましい。

本発明に係るＨＣＶの全長ゲノムを複製する細胞において、親細胞に導入されるＲＮＡは、５’末端から、ＨＣＶのＩＲＥＳ配列、レポーター遺伝子配列、選択マーカー遺伝子配列、外来性ＩＲＥＳ配列、ＨＣＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列、ＨＣＶ３’非翻訳配列の順に連結されていることが好ましい。

本発明に係るスクリーニング方法は、抗ＨＣＶ作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、被検物質を上記本発明に係る細胞と接触させる工程；レポーター遺伝子産物のレベルを測定する工程；および上記レポーター遺伝子産物のレベルを、被検物質を接触させないときのレベルと比較する工程、を包含することを特徴としている。

本発明に係るスクリーニングキットは、抗ＨＣＶ作用を有する物質をスクリーニングするためのキットであって、上記本発明に係るＨＣＶの全長ゲノムを複製する細胞を備えることを特徴としている。

本発明に係るＣ型肝炎治療用組成物は、上記本発明に係るスクリーニング方法により得られた抗ＨＣＶ作用を有する物質を有効成分とすることを特徴としている。

本発明に係るＣ型肝炎治療用組成物は、(1)フルバスタチンまたはその誘導体、(2)アトルバスタチンまたはその誘導体、(3)シンバスタチンまたはその誘導体、(4)ローバスタチンまたはその誘導体、(5)ピタバスタチンまたはその誘導体を有効成分とすることが好ましい。

本発明に係るＣ型肝炎治療用組成物は、インターフェロンを投与されるＣ型肝炎患者を適用対象とすることが好ましい。

本発明に係るＣ型肝炎治療用組成物は、インターフェロンおよびシクロスポリンＡを投与されるＣ型肝炎患者を適用対象とすることが好ましい。

本発明に係るＣ型肝炎治療剤は、フルバスタチンまたはその誘導体、アトルバスタチンまたはその誘導体、シンバスタチンまたはその誘導体、ローバスタチンまたはその誘導体およびピタバスタチンまたはその誘導体からなる群より選択されえる少なくとも１種と、インターフェロンとを組み合わせてなることを特徴としている。

本発明に係るＣ型肝炎治療剤は、さらに、上記に加えてシクロスポリンＡを組み合わせなることが好ましい。

本発明に係るＣ型肝炎治療用キットは、上記本発明に係るＣ型肝炎治療用組成物を備えることを特徴としている。

本発明に係るＣ型肝炎治療用キットにおいて、さらに、インターフェロンを有効成分とするＣ型肝炎治療用組成物を備えることが好ましく、さらにシクロスポリンＡを有効成分とするＣ型肝炎治療用組成物を備えることがより好ましい。

本発明に係るＨＣＶの全長ゲノムを複製する細胞は、ＨＣＶの全長ゲノムを複製できるとともに、レポーター遺伝子産物を発現するものである。複製されたゲノムＲＮＡ量とレポーター遺伝子産物量は非常によく相関するため、本細胞を用いることで、ＨＣＶ全長ゲノムＲＮＡの複製レベルを簡便かつ正確にモニタリングできるという効果を奏する。

本発明に係るスクリーニング方法は、本発明にかかるＨＣＶの全長ゲノムを複製する細胞を用いるものであり、抗ＨＣＶ作用を有する物質のハイスループットスクリーニングが可能となるという効果を奏する。

本発明に係るＣ型肝炎治療用組成物を用いれば、従来のＣ型肝炎治療法における著効率の改善、副作用の低減を実現できるという効果を奏する。

本発明に係るＣ型肝炎治療用キットを用いれば、スタチンとＩＦＮとの併用、またはスタチン、シクロスポリンＡおよびＩＦＮの併用により、ＩＦＮとリバビリンとの併用による抗ＨＣＶ効果を顕著に上回る抗ＨＣＶ効果を実現することができるという効果を奏する。また、ＩＦＮの投与量を軽減してもＩＦＮとリバビリンとの併用効果と同等以上の効果を得ることが可能となり、ＩＦＮによる副作用の低減を図ることができる。

（１）ＨＣＶの全長ゲノムを複製し、かつレポーター遺伝子産物を発現する細胞
本発明は、ＨＣＶの全長ゲノムを複製し、かつレポーター遺伝子産物を発現する細胞を提供する。本発明に係る細胞は、レポーター遺伝子配列、選択マーカー遺伝子配列およびＨＣＶ全長ゲノム配列を含むＲＮＡが導入された細胞で、ＨＣＶの全長ゲノムを複製し、かつレポーター遺伝子産物を発現するものであればよい。本発明に係る細胞においては、レポーター遺伝子産物の発現量とＨＣＶ ＲＮＡの複製量は非常によく相関するので、レポーター遺伝子産物を定量することにより、ＨＣＶ全長ゲノムの複製レベルを簡便にモニターすることができる。また、サブゲノミックＨＣＶレプリコンでは不可能である、構造タンパク質の影響をも含めたＨＣＶの機能解析に非常に有用である。すなわち、本発明に係る細胞を用いることにより、ＨＣＶの機能解析、抗ＨＣＶ作用を有する物質のスクリーニングなどを簡便かつ迅速に行うことが可能となる。

本明細書において、「ＨＣＶの全長ゲノム」とは、図１に示されるＨＣＶゲノムの全領域が含まれているＲＮＡを意味するものである。

本発明に係る細胞に導入されているＲＮＡは、レポーター遺伝子配列、選択マーカー遺伝子配列およびＨＣＶ全長ゲノム配列を含むものであればよい。これらの配列の順序は、レポーター遺伝子産物、選択マーカー遺伝子産物およびＨＣＶゲノムがコードするタンパク質が発現できる順序であれば特に限定されない。また、当該ＲＮＡには、レポーター遺伝子および選択マーカー遺伝子を翻訳するためのＩＲＥＳと、ＨＣＶのＯＲＦを翻訳するためのＩＲＥＳとの２つのＩＲＥＳが含まれることが好ましい。これにより、翻訳されるタンパク質を高レベルに維持できるという効果が得られる。２つのＩＲＥＳは、いずれもＨＣＶ由来のＩＲＥＳであってもよいが、少なくとも１つは外来性のＩＲＥＳであることが好ましい。外来性のＩＲＥＳを用いることにより、全長ゲノムの複製様式が維持されるという効果が得られる。外来性のＩＲＥＳとしては、特に限定されず、例えばencephalomyocarditis virus（ＥＭＣＶ）由来のＩＲＥＳ、牛ウイルス性下痢ウイルス（Bovine viral diarrhea virus：ＢＶＤＶ）のＩＲＥＳ、ポリオウイルスのＩＲＥＳなどを挙げることができるが、活性が高く頻用されているという理由で、ＥＭＣＶ由来のＩＲＥＳが好ましい。

本発明に係る細胞に導入されているＲＮＡに含まれる各配列の順序の一例としては、５’末端から、ＨＣＶのＩＲＥＳ配列、レポーター遺伝子配列、選択マーカー遺伝子配列、外来性ＩＲＥＳ配列、ＨＣＶ ＯＲＦ配列、ＨＣＶ３’非翻訳配列の順序を挙げることができるが、これに限定されない。なお、ＨＣＶのＩＲＥＳは５’非翻訳領域およびコアの５’側の一部とからなるＲＮＡである。例えば、本発明者らは、配列番号１に示されるＨＣＶ−Ｏ株の塩基配列の第１位〜第３７７位（第１位〜第３４１位が５’非翻訳領域）を用いている。ただし、これに限定されるものではない。

本発明に係る細胞に導入されているＲＮＡに含まれるＨＣＶゲノム配列は、ＨＣＶに由来するものであればよい。ＨＣＶには、Ｃ型肝炎を引き起こすことができる病原株のみでなく、弱毒株および変異株も含まれる。また、ＨＣＶには多数の遺伝子型が存在しているが、いずれの遺伝子型のＨＣＶに由来するものであってもよい。好ましくは１ｂである。日本国内のＣ型肝炎患者の約７０％が１ｂ型のＨＣＶに感染しているからである。

遺伝子型１ｂのＨＣＶ株としては、ＨＣＶ−Ｏ株、Ｎ株、Ｃｏｎ−１株、ＪＴ株などが知られている。本発明者らは、ＨＣＶ−Ｏ株のゲノムＲＮＡを用いて本発明に係る細胞を作製しているが、これに限定されない。なお、ＨＣＶ−Ｏ株の塩基配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）は、ＧｅｎＢａｎｋにACCESSION AB191333として登録されている。

本発明に係る細胞に導入されているＲＮＡに含まれるレポーター遺伝子としては、特に限定されず、ルシフェラーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子などを挙げることができる。なかでもルシフェラーゼ遺伝子が、簡便かつ高感度にレポーターアッセイを行うことができる点で好ましい。ルシフェラーゼ遺伝子としては、一般にホタル由来ルシフェラーゼ遺伝子またはウミシイタケ由来ルシフェラーゼ遺伝子が使用されているが、いずれを用いてもよい。遺伝子の長さがより短いという点で、ウミシイタケ由来ルシフェラーゼ遺伝子が好ましい。

本発明に係る細胞に導入されているＲＮＡに含まれる選択マーカー遺伝子としては、特に限定されないが、簡便性の観点から薬剤耐性遺伝子が好ましい。薬剤耐性遺伝子としては、特に限定されず、形質転換細胞の選択に使用可能な公知の薬剤耐性遺伝子から適宜選択すればよい。具体的には、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などを挙げることができる。

本発明に係る細胞の由来、すなわち上記ＲＮＡが導入される親細胞は、ＨＣＶ全長ゲノムが複製可能な細胞であれば特に限定されないが、哺乳動物の肝細胞であることが好ましく、ヒトの肝細胞であることがより好ましく、ヒト肝癌細胞株であることがさらに好ましい。ヒト肝癌細胞株としては、例えば、ＨｕＨ−７、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｃ３Ａ、ＰＬＣなどを挙げることができる。

本発明に係る細胞において、上記ＲＮＡが導入される親細胞として、選択マーカー遺伝子配列およびＨＣＶ全長ゲノム配列を含むＲＮＡが導入されたＨＣＶ全長ゲノム複製細胞を、抗ウイルス作用を有する薬剤を含む培地で培養することにより得られる治癒細胞が用いられることが好ましい。

本明細書において「治癒細胞」とは、サブゲノミックＨＣＶレプリコンを複製する細胞またはＨＣＶ全長ゲノムを複製する細胞を、抗ウイルス作用を有する薬剤で培養することにより得られる、サブゲノミックＨＣＶレプリコンが完全に排除された細胞またはＨＣＶ全長ゲノムが完全に排除された細胞を意味する。ここで、「完全に排除された」とは、ＲＴ−ＰＣＲでＨＣＶ ＲＮＡが検出されないことを意味する。

抗ウイルス作用を有する薬剤としては、培地に添加することで治癒細胞を得られるものであれば特に限定されないが、抗ＨＣＶ作用を有する薬剤が好ましい。具体的には、例えば、ＩＦＮ、シクロスポリンＡなどが挙げられるが、特に好ましくはＩＦＮである。ＩＦＮとしては、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βを挙げることができ、ＩＦＮ−αが好ましい。ＩＦＮの処理方法の一例としては、ＩＦＮ−αを500 IU/mlの濃度で含む培地を用いて２週間処理する方法を挙げることができる。ただし、処理濃度、処理期間は治癒細胞が得られたか否かを確認しながら、適宜変更すればよい。治癒細胞が得られたか否かの確認は、細胞にＨＣＶ由来のＲＮＡが含まれているか否かを、ＲＴ−ＰＣＲ法やノーザンブロット法で確認すればよい。さらに、ＨＣＶ由来のタンパク質が発現していないことは、ウエスタンブロット法などにより確認することができる。

本発明に係る細胞において、上記ＲＮＡが導入される親細胞として、本発明者らが作製した治癒細胞であるヒト肝癌細胞株ＨｕＨ−７由来のＯｃ細胞が用いられることが特に好ましい。当該Ｏｃ細胞を親細胞として用いれば、ＨＣＶ全長ゲノムを複製し、ウミシイタケルシフェラーゼを発現する本発明に係る細胞が効率良く得られることを本発明者らが実証しているからである。

Ｏｃ細胞は、例えば以下に示す手順で作製することができる（図２参照）。なお、本発明者らが実際にＯｃ細胞を作製した具体的手順については、実施例の項で詳細に説明する。また、以下の説明における、分子生物学の通常の実験手法は、例えば、J. Sambrook et al. 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition」 Cold Spring Harbor Laboratory（2001）に記載されている方法にしたがって実施することができる。

図１に示されるＯＮ／３−５Ｂ ＲＮＡをインビトロ合成し、ヒト肝癌細胞株ＨｕＨ−７細胞にエレクトロポレーション法などで導入する。ＯＮ／３−５Ｂ ＲＮＡが導入された細胞（図２中「ｓＯ」と表記）はＧ４１８を含む培地で培養することにより選抜することができる。また、サブゲノミックＨＣＶレプリコンを複製していることは、ＲＴ−ＰＣＲ法またはノーザンブロット法により確認できる。サブゲノミックＨＣＶレプリコンがコードしているＨＣＶタンパク質の発現は、ウエスタンブロット法により確認できる。サブゲノミックＨＣＶレプリコンを複製している細胞であることを確認した後に、当該細胞をＩＦＮ−αを含む培地で培養する。例えばＩＦＮ−αを500 IU/mlの濃度で含む培地で２〜３週間培養し、治癒細胞が得られたことを確認する。確認は上述のように、細胞にＨＣＶ由来のＲＮＡが含まれていないことを、ＲＴ−ＰＣＲ法やノーザンブロット法で確認すればよい。これにより、サブゲノミックＨＣＶレプリコン複製細胞の治癒細胞（図２中「ｓＯｃ」と表記）が得られる。

次に、図１に示されるＯＮ／Ｃ−５Ｂ ＲＮＡをインビトロ合成し、上記サブゲノミックＨＣＶレプリコン複製細胞の治癒細胞（ｓＯｃ）にエレクトロポレーション法などで導入する。上記と同様に、ＯＮ／Ｃ−５Ｂ ＲＮＡが導入された細胞（図２中「Ｏ」と表記）はＧ４１８を含む培地で培養することにより選抜することができる。また、ＨＣＶ全長ゲノムを複製していることは、ＲＴ−ＰＣＲ法またはノーザンブロット法により確認できる。ＨＣＶ全長ゲノムがコードしているＨＣＶタンパク質の発現は、ウエスタンブロット法により確認できる。ＨＣＶ全長ゲノムを複製している細胞であることを確認した後に、当該細胞をＩＦＮ−αを含む培地で培養する。例えばＩＦＮ−αを500 IU/mlの濃度で含む培地で２〜３週間培養し、治癒細胞が得られたことを確認する。確認は上述のように、細胞にＨＣＶ由来のＲＮＡが含まれていないことを、ＲＴ−ＰＣＲ法やノーザンブロット法で確認すればよい。これにより、ＨＣＶ全長ゲノム複製細胞の治癒細胞、すなわちＯｃ細胞が得られる。

なお、本発明者らが作製したＯｃ細胞は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに、平成１７年４月２６日に寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ Ｐ−２０５１７である。

本発明に係る細胞に導入されているＲＮＡのＨＣＶ ＯＲＦ中に少なくとも１個のアミノ酸置換を伴う変異が含まれていることが好ましい。このような変異を有することにより、細胞内でのＨＣＶゲノムの複製効率の向上が認められる。一般に、このような効果が得られる変異を「適応変異」と呼ぶ。適応変異であるか否かは、変異を有するＲＮＡおよび変異を有しないＲＮＡをそれぞれ細胞に導入し、Ｇ４１８を含む培地で３〜４週間培養した後に生育コロニー数を比較することにより確認することができる。

本発明に係る細胞に導入されているＲＮＡに含まれる適応変異は、上述の効果が得られるものであれば特に限定されない。上記適応変異は、ＮＳ３（ヘリカーゼ）領域に存在することが好ましい。具体的には例えば、ＨＣＶ−Ｏ株のアミノ酸配列（配列番号２を参照）の１６０９位のリジンがグルタミン酸に置換する変異（Ｋ１６０９Ｅ）、１２０２位のグルタミン酸がグリシンに置換する変異（Ｅ１２０２Ｇ）を挙げることができる。

（２）スクリーニング方法
本発明は、抗ＨＣＶ作用を有する物質をスクリーニングする方法を提供する。本発明に係るスクリーニング方法は、被検物質を上述の本発明に係る細胞に接触させる工程、レポーター遺伝子産物のレベルを測定する工程、および上記レポーター遺伝子産物のレベルを、被検物質を接触させないときのレベルと比較する工程、を包含するものであればよい。本発明に係るスクリーニング方法を用いることにより、多数の被検物質を、簡便かつ迅速にスクリーニングすることができる。

本発明に係るスクリーニング方法においては、抗ＨＣＶ作用は、ＨＣＶ全長ゲノムの複製を抑制する作用である。すなわち、本発明に係るスクリーニング方法は、ＨＣＶ全長ゲノムの複製を抑制する作用を有している物質をスクリーニングする方法である。

また、本発明に係るスクリーニング方法を用いれば、ＨＣＶに近縁のウイルスやＨＣＶと同様の複製形式をとるウイルスの複製を抑制する物質のスクリーニングが可能である。ＨＣＶに近縁のウイルスとしては、フラビウイルス科のフラビウイルス属およびペスチウイルス属に属するウイルスを挙げることができる。フラビウイルス属に属するウイルスには日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルスなどが属し、ペスチウイルス属にはブタコレラウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルスなどが属する。

さらに、本発明に係るスクリーニング方法を用いれば、ＨＣＶと同様の複製形式をとるウイルスの複製を抑制する物質のスクリーニングが可能である。ＨＣＶの複製の特徴は、細胞質内で複製が全て行われ、ウイルスゲノムが核内に存在することはないことである。したがって、本発明に係るスクリーニング方法により、このような複製形式をとるウイルスの複製を抑制する物質をスクリーニングすることができる。

被検物質と細胞との接触は、被検物質を培地に溶解または懸濁することで行うことができる。したがって、被検物質は、培地に溶解または懸濁可能なものであればよい。

レポーター遺伝子産物のレベル測定は、用いるレポーター遺伝子に応じて公知の方法から選択すればよい。例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いる場合には、細胞を界面活性剤を含む緩衝液等で溶解した細胞溶解液を試料として、ルミノメーター等の機器を用いて発光量を測定すればよい。また、この際、市販のルシフェラーゼ測定用試薬やルシフェラーゼ測定用キットを好適に用いることができる。

上記により測定したレポーター遺伝子産物のレベルを、被検物質を接触させていない細胞のレポーター遺伝子産物のレベルと比較することにより、当該被検物質が抗ＨＣＶ作用を有するか否かを判定することができる。なお、細胞増殖能を低下させない被検物質濃度において、被検物質を接触させていない細胞のレポーター遺伝子産物のレベルより低ければ抗ＨＣＶ作用を有すると判定でき、好ましくは、少なくとも５０％以下、より好ましくは１０％以下であるときに抗ＨＣＶ作用を有すると判定する。

さらに好ましい判定基準としては、現在のＣ型慢性肝炎治療の標準的な方法であるＩＦＮ−αを本発明に係るスクリーニング方法に適用したときのレベル、またはＩＦＮ−αとリバビリンとを併用して本発明に係るスクリーニング方法に適用したときのレベルを判定基準とすることである。現在の標準的なＣ型肝炎治療法に用いられている薬剤よりＨＣＶの複製レベルが低ければ、非常に有用なＣ型肝炎治療薬を見出すことができる。

本発明に係るスクリーニング方法により、少なくともＣ型肝炎治療薬の有効成分の候補物質を選択することができる。また、ＨＣＶ感染モデル動物はチンパンジーのみであるため、現在の状況では多数の動物を用いた薬理試験の実施は不可能であり、本発明に係るスクリーニング方法がＣ型肝炎治療薬の開発における薬効評価に必須な方法になることが期待される。

（３）スクリーニングキット
本発明は、抗ＨＣＶ作用を有する物質をスクリーニングするためのスクリーニングキットを提供する。本発明に係るスクリーニングキットは、上述した本発明に係る細胞を備えるものであればよい。当該スクリーニングキットを用いることにより、簡便かつ効率的に上記本発明に係るスクリーニング方法を実施することができる。

本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは当該材料を使用するための使用説明書を備える。使用説明書は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、CD-ROMなどのような電子媒体に付されてもよい。

本発明に係るスクリーニングキットには、本発明に係るＨＣＶの全長ゲノムを複製する細胞以外のものが備えられていてもよい。当該細胞以外の具体的な構成については特に限定されるものではなく、必要な試薬や器具等を適宜選択してキットの構成とすればよい。例えば、細胞溶解液、レポーター遺伝子産物測定用試薬、レポーター遺伝子産物測定用器具等を挙げることができるが、これらに限定されない。

本発明に係るスクリーニングキットの使用方法は、上述した本発明に係るスクリーニング方法の使用形態に準じればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。

（４）Ｃ型肝炎治療用組成物
本発明は、Ｃ型肝炎治療用組成物を提供する。本発明に係るＣ型肝炎治療用組成物は、上述した本発明に係るスクリーニング方法により得られた抗ＨＣＶ作用を有する物質を有効成分とするものであればよい。Ｃ型肝炎は、急性Ｃ型肝炎と慢性Ｃ型肝炎とに分けることができるが、本発明に係るＣ型肝炎治療用組成物は慢性Ｃ型肝炎に好適である。

本発明に係るＣ型肝炎治療用組成物の有効成分は、上述した本発明に係るスクリーニング方法により、ＨＣＶの全長ゲノムの複製を抑制する作用を有する物質として選択される。

本発明者らは、上記本発明に係るスクリーニング方法を用いて、既に高脂血症治療薬、高コレステロール血症治療薬として使用されている、ＨＭＧ Ｃｏ−Ａ還元酵素阻害剤のスタチンについて、抗ＨＣＶ作用の有無を試験した。詳細は後段の実施例で説明するが、試験に供した６種類のスタチンのうち、５種類のスタチンで抗ＨＣＶ作用が認められた。

試験に供したスタチンは、下記式（１）に示される構造を有するフルバスタチン、

下記式（２）に示される構造を有するアトルバスタチン、

下記式（３）に示される構造を有するシンバスタチン、

下記式（４）に示される構造を有するローバスタチン、

下記式（５）に示される構造を有するプラバスタチンである。

および下記式（６）に示される構造を有するピタバスタチンである。

フルバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、ピタバスタチンは、それぞれローコール（ノバルチス）、リピトール（山之内）、リポバス（萬有）、メバロチン（三共）、リバロ（興和）の商品名で日本国内で医療用医薬品として販売されている。なお、ローバスタチンは日本国内では販売されていないが、海外では既に承認され販売されている。

本発明者らの実施した試験において、フルバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、ローバスタチン、およびピタバスタチンに抗ＨＣＶ作用が認められたが、プラバスタチンには抗ＨＣＶ作用が認められなかった。

ローバスタチンに関しては、ＨＣＶ全長ゲノム複製細胞系を用いて、ＨＣＶタンパク質の発現が抑制されることが報告されている（特許文献２、非特許文献９）。しかし、複製されたＲＮＡを定量したものではない。また、構造が類似するプラバスタチン（上記式（４）および式（５）を参照）には、抗ＨＣＶ作用が認められなかったことからも明らかなように、試験に供したスタチンについて、作用（ＨＭＧ Ｃｏ−Ａ還元酵素阻害剤）および構造の類似性から抗ＨＣＶ作用を有するか否かを予測することは、当業者が容易になせることではない。

また、ＩＦＮ−αとの併用によるＣ型慢性肝炎治療剤として臨床で用いられているリバビリンの構造を下記式（７）に示す。

リバビリンは核酸構造類似体であり、上記各スタチンの構造とは全く類似していない。また、リバビリンは単独では抗ＨＣＶ作用がほとんどないことが知られている。したがって、リバビリンの構造または作用から、当業者が容易にスタチンの抗ＨＣＶ作用を推定することができないことは明らかである。

なお、本発明に係るＣ型肝炎治療用組成物の有効成分には、フルバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、ローバスタチンおよびピタバスタチン、並びにこれらの誘導体も含まれる。

上述のように、フルバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、ローバスタチンおよびピタバスタチンは、ＨＭＧ Ｃｏ−Ａ還元酵素阻害剤として既に臨床において使用されている薬剤であることから、遅滞なくＣ型肝炎治療薬として臨床応用が可能であるという利点を有している。

本発明に係るＣ型肝炎治療用組成物は、経口、非経口、または局所のいずれかの経路で哺乳動物に投与することができる。有効成分の含有量は、治療対象の体重および状態、治療される疾病の状態、および選択される特定の投与経路に応じて、適宜選択すればよい。

有効成分は、上記投与経路のいずれかにより、単独で、あるいは、薬剤学的に許容することのできる担体または希釈剤との組み合わせで、投与することができ、投与は、単回または複数回投与で実施することができる。より具体的には、本発明に係るＣ型肝炎治療用組成物は、幅広い種々の剤形で投与することができる。すなわち、錠剤、カプセル剤、ロゼンジ剤、トローチ剤、ハードキャンディー剤、散剤、スプレー剤、クリーム剤、塗剤、坐剤、ゼリー剤、ゲル剤、ペースト剤、ローション剤、軟膏剤、水性懸濁液、注射溶液、エリキシル剤、シロップ剤などの形で、種々の薬剤学的に許容されることのできる不活性担体と組み合わせることができる。担体には、固体希釈剤もしくは充填剤、滅菌水性媒体、種々の非毒性有機溶媒などが含まれる。更に、経口医薬組成物には、適当な甘味および／または香気を付与することができる。通常、有効成分は、上記剤形中に、５重量％〜７０重量％（好ましくは１０重量％〜５０重量％）の範囲の濃度レベルで存在する。

経口投与用では、種々の賦形剤（例えば、微結晶セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸二カリウム、およびグリシン）を含有する錠剤を、種々の崩壊剤（例えば、デンプン（好ましくはコーン、ポテト、またはタピオカスターチ）、アルギン酸、およびケイ酸複合体）と一緒に、あるいは顆粒化結合剤（例えば、ポリビニルピロリドン、スクロース、ゼラチン、およびアラビアゴム）と一緒に用いることができる。加えて、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルク）が、多くの場合、錠剤形成用に非常に有用である。また、同型の固体組成物をゼラチンカプセルにおける充填剤として用いることができる。これに関連する好適材料には、ラクトース（乳糖）および高分子量ポリエチレングリコールが含まれる。経口投与用に水性懸濁液および／またはエリキシル剤が望まれる場合には、活性成分を、種々の甘味量もしくは香料、着色剤、または色素と組み合わせることができ、所望により、さらに乳化剤および／または懸濁剤と、上記希釈剤（例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、およびそれらの種々の組み合わせ）と一緒に組み合わせることができる。

非経口投与用では、ゴマもしくはピーナッツオイルまたは水性プロピレングリコールのいずれかを溶媒として用いることができる。所望に応じて、上記水溶液を適当に緩衝化（好ましくはｐＨ＞８）すべきであり、液体希釈剤を最初に等張性にするべきである。これらの水溶液は、静脈注射用に適している。油性溶液は、関節内、筋内、および皮下注射用に適している。滅菌条件下におけるこれらの全ての溶液の調製は、当業者に周知の標準的薬剤学的技術により、容易に達成される。

薬剤学的に許容できる担体は当業者には周知であり、例えば、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．， Ｎ．Ｊ．１９９１）に十分に記載されている。

（５）スタチンと他の薬剤とを組み合わせたＣ型肝炎治療剤
現在、Ｃ型慢性肝炎に対する標準的治療法は、ＩＦＮとリバビリンの併用療法である。しかし、この治療法を適用したときのＣ型肝炎に対する有効性は、血中での安定性を高めたペグＩＦＮを用いた場合でも最大５０％に過ぎず、残りの患者は、致死的な肝硬変、肝癌発症の危険に曝されている。また、リバビリンは６５歳以上の高齢者には溶血性貧血の副作用が頻発し、治療の中止を余儀なくされるという事態が生じている。したがって、リバビリンに代わる新たなＩＦＮとの併用に有効な薬剤の早期開発が望まれている。

本発明者らは、本発明に係るスクリーニング方法により見出した、抗ＨＣＶ作用を有するスタチンとＩＦＮとの併用による抗ＨＣＶ効果（ＨＣＶ複製抑制効果）を検討し、スタチンとＩＦＮとの併用が、ＩＦＮとリバビリンとの併用と比較して大幅に高い抗ＨＣＶ効果を発現することを見出した。すなわち、本発明に係るＣ型肝炎治療剤は、フルバスタチンまたはその誘導体、アトルバスタチンまたはその誘導体、シンバスタチンまたはその誘導体、ローバスタチンまたはその誘導体およびピタバスタチンまたはその誘導体からなる群より選択されえる少なくとも１種と、インターフェロンとを組み合わせてなるものであればよい。ＩＦＮとしては、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βが好ましく、ＩＦＮ−αが特に好ましい。また、ＩＦＮはＰＥＧ化等の修飾がされていてもよい。

当該Ｃ型肝炎治療剤は、一製剤中に有効成分としてのスタチンとＩＦＮとが混合された配合剤の形態としてもよく、後述するように、スタチンを有効成分とする製剤とＩＦＮを有効成分とする製剤とを含有するキットの形態としてもよい。

さらに、本発明者らは、抗ＨＣＶ作用を有することが報告されているシクロスポリンＡについても、スタチンとの併用、スタチンおよびＩＦＮとの併用による抗ＨＣＶ効果を検討した。ここで、シクロスポリンＡは免疫抑制剤として広く臨床使用されている薬剤であり、下記式（８）に示される構造を有している。

その結果、スタチンとシクロスポリンＡとの併用は、ＩＦＮとリバビリンとの併用と比較して高い抗ＨＣＶ効果を発現することを見出した。さらに、スタチン、シクロスポリンＡおよびＩＦＮの３剤を併用すると、スタチンとＩＦＮとの併用による抗ＨＣＶ効果を顕著に上回る抗ＨＣＶ効果を発現することが見出された。したがって、本発明に係るＣ型肝炎治療剤は、フルバスタチンまたはその誘導体、アトルバスタチンまたはその誘導体、シンバスタチンまたはその誘導体、ローバスタチンまたはその誘導体およびピタバスタチンまたはその誘導体からなる群より選択されえる少なくとも１種と、インターフェロンと、シクロスポリンＡとを組み合わせてなるものであることがより好ましい。

当該Ｃ型肝炎治療剤は、一製剤中に有効成分としてのスタチンとＩＦＮとシクロスポリンＡとが混合された配合剤の形態としてもよく、後述するように、スタチンを有効成分とする製剤とＩＦＮを有効成分とする製剤とシクロスポリンＡを有効成分とする製剤とを含有するキットの形態としてもよい。

スタチン、ＩＦＮおよびシクロスポリンＡは、いずれも既に臨床において使用されている薬剤であることから、遅滞なくＣ型肝炎治療薬として臨床応用が可能であるという利点を有している。

（５）Ｃ型肝炎治療用キット
本発明は、上述した本発明に係るＣ型肝炎治療用組成物を備えるＣ型肝炎治療用のキットを提供する。本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは当該材料を使用するための使用説明書を備える。使用説明書は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、CD-ROMなどのような電子媒体に付されてもよい。

本発明に係るＣ型肝炎治療用キットには、本発明に係るＣ型肝炎治療用組成物のみではなく、これとは異なる成分を含む組成物が含まれていてもよい。本発明に係るＣ型肝炎治療用組成物と異なる成分を含む組成物としては、特に限定されないが、ＩＦＮを有効成分とするＣ型肝炎治療用組成物が好ましい。本発明に係るＣ型肝炎治療用組成物の有効成分は、ＩＦＮと併用することで、それぞれ単独で使用した場合より、さらに強くＨＣＶゲノムの複製を抑制することが、本発明者らにより実証されているからである（実施例１１および１２を参照）。ＩＦＮとしては、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βが好ましく、ＩＦＮ−αが特に好ましい。また、ＩＦＮはＰＥＧ化等の修飾がされていてもよい。

また、本発明に係るＣ型肝炎治療用組成物と異なる成分を含む組成物としては、シクロスポリンＡを有効成分とするＣ型肝炎治療用組成物が好ましい。さらに、本発明に係るＣ型肝炎治療用キットには、本発明に係るＣ型肝炎治療用組成物、ＩＦＮを有効成分とするＣ型肝炎治療用組成物およびシクロスポリンＡを有効成分とするＣ型肝炎治療用組成物の３剤が含まれることが特に好ましい。これらの３剤を併用することにより、顕著な抗ＨＣＶ効果（ＨＣＶゲノムの複製抑制）の発現が、本発明者らにより実証されているからである（実施例１４を参照）。

キットに２種類以上の組成物が含まれる場合には、これらは別個の容器（例えば、分割されたボトルなど）に入れてもよく、分割されていない単独の容器に入れてもよい。またキットには、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備え得る。さらに、本Ｃ型肝炎治療用キットには、Ｃ型肝炎治療法に適用するために必要な器具をあわせて備えてもよい。

キットの形態は、別個の成分が好ましくは異なる剤形（例えば経口および非経口）で投与され、異なる投与量で投与され、または、処方する医師が当該組み合わせの各成分の滴定を所望する場合などに特に有利である。

本発明に係るＣ型肝炎治療用キットにおける本発明に係るＣ型肝炎治療用組成物およびその他の物質の使用方法は、上述した組成物の使用形態に準じればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。

（６）Ｃ型肝炎治療法
また、本発明はＣ型肝炎治療法を提供する。本発明のＣ型肝炎治療法は、上記本発明に係るＣ型肝炎治療用組成物を被検体に投与する工程を包含するものであればよい。より好ましい形態は、ＩＦＮを有効成分とするＣ型肝炎治療用組成物との併用療法である。したがって、被検体がＩＦＮを投与されるＣ型肝炎患者であることが好ましい。さらに好ましい形態は、ＩＦＮを有効成分とするＣ型肝炎治療用組成物およびシクロスポリンＡを有効成分とするＣ型肝炎治療用組成物との３剤併用療法である。したがって、被検体がＩＦＮおよびシクロスポリンＡを投与されるＣ型肝炎患者であることが好ましい。

本発明のＣ型肝炎治療法における本発明に係るＣ型肝炎治療用組成物およびその他の物質の適用は、上述した組成物の使用形態に準じればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。

なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様および以下の実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、当業者は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲内で変更して実施することができる。

また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

以下、本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

最初に、実験材料および実験方法について記載する。

〔使用試薬〕
アトルバスタチンは山之内製薬より、シンバスタチンは萬有製薬より、プラバスタチン、フルバスタチン、ローバスタチンはCalbiochem社よりおよびピタバスタチンは興和より購入した。NystatinはCalbiochem社より、ファンギゾン(AMPH-B)は免疫生物研究所より購入した。IFN-αはSigma社より購入した。シクロスポリンＡはSigma社より購入した。

〔培養細胞〕
高分化型ヒト肝癌細胞株であるHuH-7細胞を用いた。HuH-7細胞は、10％胎児牛血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むDulbecco’s modified Eagles medium (complete DMEM) (Invitrogen社)で培養した。サブゲノミックレプリコン、HCV全長ゲノムを含むHuH-7細胞株は0.3 mg/mlの濃度のG418(Invitrogen社)を含む培地で維持した。継代は週2回5:1の分割比で行った。

〔プラスミドの構築〕
プラスミドpON/C-5B は、HCVのIRES（Internal ribosomal entry site）の下流にネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ（Neo）、およびEncephalomyocarditis virus（EMCV）のIRESの下流に全長HCV-Oタンパク質をコードする配列を含む。

最初に、HCV陽性血清より遺伝子型１b型のHCV-O全長cDNAを含むプラスミドpHCV-Oを、２つのフラグメントを用いて構築した。２つのフラグメントとは、参考文献（N.Kato,M.Ikeda,K.Sugiyama,T.Mizutani,T.Tanaka,K.Shimotohno,Hepatitis C virus population dynamics in human lymphocytes and hepatocytes infected in vitro,J.Gen.Virol.79 (1998)1859-1869.）に記載のpBR322/16-6に由来するEcoR I−Mlu Iフラグメント（HCVゲノムの45位−2528位に相当）および血清1B-2のPCR産物由来のMlu I−Spe Iフラグメント（HCVゲノムの2528位−3420位に相当）である。これらを、1B-2R1配列を有するpNSS1RZ2RU（非特許文献２を参照）のEcoR I−Spe I サイトにライゲートし、pHCV-Oを構築した。

pON/C-5Bを構築するためのフラグメントを得るために、オーバーラッピングPCRを用いて、EMCVのIRESとコアタンパク質をコードする配列とを融合した。得られたDNAをRsr IIおよびCla I で消化し、これをpNSS1RZ2RUのXba I−Rsr IIフラグメントと共に、pHCV-OのCla I−Xba I サイトにライゲートすることで、pON/C-5Bを構築した。

プラスミドpON/3-5Bの構築は、非特許文献２に詳細に記載されている。すなわち、sO細胞より抽出したRNAを非特許文献２に記載されているように、HCV-O遺伝子の3474位-9185位に相当する領域をRT-PCR法で増幅しこれをpNSS1RZ2RUのSpe I-Bsiw Iサイトにライゲートして、pON/3-5Bを構築した。

M.Ikedaらの方法（非特許文献７を参照）に従い、QuickChange mutagenesis（Stratagene）を用いて、pON/3-5B およびpON/C-5B にそれぞれK1609E 変異を導入し、pON/3-5B/KE およびpON/C-5B/KEを構築した。具体的には、配列番号１に記載の塩基配列において第5166位のアデニン（a）をグアニン（g）に置換する変異を導入した。なお、K1609E 変異については後段の〔実施例２〕で説明する。

プラスミドpORN/3-5B/KE およびプラスミドpORN/C-5B/KEは、pON/3-5B/KE およびpON/C-5B/KEに、それぞれRenilla luciferase (Promega) のPCR産物をNeo 遺伝子の上流のAsc I サイトに導入することにより構築した。なお、上記各プラスミドは、挿入遺伝子の5’側にT7プロモーター配列を含んでいる。

〔RNA合成〕
プラスミドDNAをXba I で切断して線状化し、T7 MEGAscript Kit (Ambion社)を用いて、添付の実験説明書に従い、RNAの合成を行った。塩化リチウムで沈澱させた後、RNAを75％エタノールで洗浄し、RNaseフリー水で溶解した。

〔RNAのトランスフェクションおよびG418耐性細胞の選抜〕
エレクトロポレーションを適用するために、HuH-7細胞を氷冷PBSで２回洗浄し、PBSで10⁷cell/mlとなるように再懸濁した。細胞懸濁液500μLおよび上記合成したRNA 20μgを2mm幅のcuvette (Bio-Rad社)に移した。Gene Pulser(Bio-Rad社)にて1.2 KV、25μF、最大抵抗の条件で２回電気刺激を加え、RNAを細胞内へ導入した。その後10分間室温でインキュベートし、10cmの培養ディッシュに細胞を播いた。0.3 mg/mlの濃度のG418を含むDMEM培地にてG418耐性細胞を選抜した。

〔ノーザンブロット分析〕
RNeasy Mini Kit (Qiagen社)を用いて、添付の実験説明書に従い、対象の細胞からトータルRNAを抽出した。波長260nmの吸光度測定により抽出したRNAを定量した。4μgのRNAを用いてHCV RNAおよびβ-actin RNAの検出を行った。すなわち、Northern Max Kit (Ambion社)を用いて、添付の実験説明書に従いRNAの特異的検出を行った。RNAサンプルを電気泳動し、ゲルをHybond-N+ ナイロンメンブレン (Amersham-Pharmacia Biotech社)にブロティングした。UVクロスリンク (Stratagene社)を行ってRNAをメンブレンに固定化し、メンブレン上の28S rRNA部分をエチジウムブロマイドで染色した。28S rRNA バンドの約1cm下でメンブレンをカットした。カットしたメンブレンの上部にはHCV RNAが含まれ、下部にはβ-actin mRNA が含まれる。HCV RNAの特異的検出のために、digoxigenine labeing kit (Roche社)を用いて、添付の実験説明書に従い、digoxigenineで標識したHCV NS5B領域に相補的なマイナス鎖リボプローブを合成して用いた。HCV RNAに特異的に結合したリボプローブの検出はアルカリフォスファターゼ標識抗digoxigenine抗体を用いた。CSPD（Roche社）で反応させた後、Ｘ線フィルムに感光し、特異的なHCV RNAの検出を行った。β-actin RNAの検出も同様に行った。なお、レプリコンRNAレベルおよび全長HCV RNAレベルとの比較のため、pON/3-5B/KEおよびpON/C-5Bからそれぞれ転写した合成RNA（10⁸ゲノム相当の合成RNAを正常細胞由来のRNAに加えたもの）を用いた。

〔ウエスタンブロット分析〕
６ウェルの細胞培養プレートで培養した細胞に、SDSを含むサンプルバッファー100μlを加えて、細胞溶解液を回収した。10分間超音波破砕機にてソニケイションを行った後、各サンプルに10μlの2-メルカプトエタノールを加え100℃で３分間処理した。10〜20μlのサンプルを10％のSDS-PAGEに供し、これをメンブレン（PVDF膜）に転写した。５％のスキムミルクを含む0.1% トリス緩衝液(10mM Tris (ph7.5), 150mM NaCl, 0.1% Tween20)で６０分間、蛋白質を転写したメンブレンをブロッキングした。その後、各HCV蛋白質に対する抗体およびβ-actin蛋白質に対する抗体を0.1% トリス緩衝液で１０００倍希釈した溶液と前記のメンブレンとを接触させ、６０分間反応を行った。メンブレンを0.1% トリス緩衝液にて５分×３回洗浄後、１０００倍希釈したHRP標識マウス二次抗体を加えた0.1% トリス緩衝液と接触させ、６０分間反応を行った。メンブレンを0.1% トリス緩衝液にて２０分×３回洗浄した。ルネッサンスTMルミノールウェスタンブロット化学発光検出試薬プラス（NEN Life Science）にて化学発光させ、Ｘ線フィルム（KODAK BioMax）で感光した。

今回の実験で用いた抗体は、抗Core抗体（Institute of Immunology社）、抗E1抗体(東京都臨床研究所、小原博士より供与)、抗E2抗体（参考文献：Microbiol.Immunolo. 42,875-877,1998を参照）、抗NS3抗体（Novocastera Laboratories社）、抗NS4A抗体（大阪大学、高見沢博士より供与）、抗NS5A抗体（大阪大学、高見沢博士より供与）、抗NS5B抗体(東京都臨床研究所、小原博士より供与)、抗β-actin抗体(Sigma社)である。

〔IFN処理による治癒細胞の作製〕
サブゲノミックレプリコン細胞由来の治癒細胞の作製方法は、非特許文献２に記載されている（なお、非特許文献２において「1B-2R1」と表記しているサブゲノミックレプリコン細胞を本明細書では「sO」と表記し、非特許文献２において「1B-2R1C」と表記しているサブゲノミックレプリコン細胞の治癒細胞を本明細書では「sOc」と表記する。）。HCV全長ゲノム複製細胞（本明細書では「O」と表記する。）の治癒細胞を作製するために、O細胞を６ウェル培養プレートに播き、24時間後にIFN処理を行った。ヒトIFN−α（Sigma）を最終濃度500 IU/mlで培地に添加した。４日ごとにIFN−α（500IU/ml）を含む新鮮な培地に交換し、G418なしで細胞を２週間培養した。本明細書ではO細胞の治癒細胞を「Oc」と表記する。

なお、治癒細胞であることはHCV RNAが存在していないこと、および／またはHCV ゲノムがコードするタンパク質が発現していないことにより確認した。

〔RT-PCR〕
RT-PCRは分離した２つの部分について行った。第１の部分はHCVの5'UTRからNS3をカバーする部分で、約5.1kbのフラグメントが増幅される。第２の部分はNS2から大部分の3'UTRをカバーする部分で、約6.1kbのフラグメントが増幅される。これらのフラグメントはNS2およびNS3領域が重複しており、後述するようにpBR322にサブクローニングされHCVのORFの塩基配列解析に用いられた。

２つの部分の逆転写（RT）には、以下に示すアンチセンスプライマー290ROKおよび386Rをそれぞれ用いた。
290ROK:5'-ATTATTCTAGATCGACCTGGTTCCTGTCCCG-3'（配列番号３）
386R:5'-AATGGCCTATTGGCCTGGAG-3'（配列番号４）
第１の部分のPCRには以下に示すプライマーペアを用いた。
21X: 5'-ATTATTCTAGAGCCAGCCCCCGATTGGGGGCG-3'（配列番号５）
NS3RXOK: 5'-ATTATTCTAGAGGCCTGTGAGACTAGTGATGATGC-3'（配列番号６）
第２の部分のPCRには以下に示すプライマーペアを用いた。
NS2XOK: 5'-ATTATTCTAGACGTGTGGGGACATCATCTTGGGTC-3'（配列番号７）
9388RX: 5'-ATTATTCTAGAATGGCCTATTGGCCTGGAGTG-3'（配列番号８）
KOD-plus DNAポリメラーゼを用い、45サイクルのPCRを行った。１サイクルはアニーリング64℃30秒、伸長68℃7分、変性94℃15秒とした。

〔cDNAクローニングおよび塩基配列解析〕
２つのPCR産物（5.1kbおよび6.1kb）をXba Iで消化し、pBR322MCのXba Iサイトにサブクローニングした。プラスミドに挿入された領域についてセンス方向およびアンチセンス方向に塩基配列を解析した。解析にはBig Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Perkin-Elmer Life Sciences)およびABI PRISM 310 genetic analyzer (Applied Biosystems)を用いた。

〔HCV RNAの定量〕
HCV RNA複製細胞から、RNeasy Mini Kit (Qiagen社)を用いて、添付の実験説明書に従い、トータルRNAを抽出した。はじめに、２μgのRNAを鋳型として、SuperScript^TMII 逆転写酵素 (Invitrogen社)および下記のプライマー319Rを用いて添付の実験説明書に従い、逆転写反応（RT）を行った。得られたcDNAを鋳型としてリアルタイムLightCycler PCRによるHCV RNAの定量を行った。リアルタイムLightCycler PCRは、下記のプライマー104および197Rを用いて、本発明者らが以前に報告した方法（参考文献：Acta Med. Okayama 56,107-110,2002）に基づいて実施した。
319R: 5'-TGCTCATGGTGCACGGTCTA-3'（配列番号９）
104: 5'-AGAGCCATAGTGGTCTGCGG-3'（配列番号１０）
197R: 5'-CTTTCGCGACCCAACACTAC-3'（配列番号１１）
〔薬剤処理〕
ORN/3-5B/KE細胞およびORN/C-5B/KE細胞に対するIFN−αまたは各種スタチンの作用を観察するために、24ウェル培養プレートに2×10⁴個の細胞を播き、24時間培養した。

IFN-α処理の場合は、培養開始24時間後に、最終濃度0、1、10および100 IU/mlのIFN−αを培地に添加し、24時間処理した。

各種スタチン処理の場合は、培養開始24時間後に、培地に薬剤を各濃度で添加し、72時間培養した。

〔ルシフェラーゼレポーターアッセイ〕
Renilla Luciferase Assay System (Promega社)を用い、添付の実験説明書に従って細胞を回収し、ウミシイタケルシフェラーゼの定量を行った。

〔実施例１：Oc 細胞の樹立および特性の検討〕
上述のようにサブゲノミックレプリコン細胞（sO細胞）およびサブゲノミックレプリコン細胞の治癒細胞（sOc細胞）の作製方法については、非特許文献２に記載されている。

全長HCV全長ゲノム複製細胞を作製するための親細胞として、sOc細胞を用いた。その理由は、本発明者らがサブゲノミックレプリコン細胞の親細胞としてHuH-7細胞よりsOc細胞を用いた方がG418耐性細胞のコロニー形成率が高いことを見出しいていたからである。

10μgのON/C-5Bのin vitro転写産物（ON/C-5B RNA）をエレクトロポレーション法によりsOc細胞に導入し、３週間のG418による選抜を行った結果、ただ１つのG418耐性コロニーが得られた（O細胞）。同じ実験を繰り返したところ、G418耐性コロニーの出現は１個または０個であった。この条件におけるコロニー形成率（ECF）は0.5コロニー/μg RNAと概算された。

続いて、上述のようにO細胞をIFN-αで処理することによりO細胞の治癒細胞であるOc細胞を得た（図２参照）。

図３にOc細胞、sO細胞およびO細胞のノーザンブロット分析の結果を示した。レーン１およびレーン２は対照であり、pON/3-5B/KEおよびpON/C-5Bからそれぞれ転写した合成RNA（10⁸ゲノム相当の合成RNAを正常な細胞由来のRNAに加えたもの、図中それぞれSub-genomeおよびGenome-lengthと表記）を用いた結果である。図３から明らかなように、Oc細胞由来のRNA中にHCV RNAは検出されなかった。

図４にOc細胞、sO細胞およびO細胞の各細胞由来タンパク質についてのウエスタンブロット分析の結果を示した。図４から明らかなように、Oc細胞からはHCV RNAにコードされる７種類のタンパク質（コア（core）、E1、E2、NS3、NS4A、NS5AおよびNS5B）はいずれも検出されなかった。

以上の結果から、Oc細胞は全長HCV RNAが存在しない治癒細胞であることが確認された。

次に、サブゲノミックレプリコン細胞の治癒細胞であるsOc細胞およびHCV全長ゲノム複製細胞の治癒細胞であるOc細胞にON/C-5B RNA またはON/3-5B RNAを再導入し、G418耐性コロニーの形成率を比較した。すなわち、RNAを導入した細胞をφ10cmの培養用シャーレに播き、G418を含む培地で３週間培養した後、出現したG418耐性コロニーをクマシーブリリアントブルーで染色した。

結果を図５に示した。図５から明らかなように、ON/C-5B RNA導入については、Oc細胞ではRNA量が0.02μgでもG418耐性コロニーが得られ、コロニー数はRNAの用量に依存して増加した。Oc細胞におけるON/C-5Bのコロニー形成率は、約50コロニー/μg RNAと概算された。一方、sOc細胞におけるON/C-5BのECFは、0.5コロニー/μg RNA未満であった。なお、ON/3-5B RNAが導入されたsOc細胞およびOc細胞からは、多数のG418耐性コロニーが得られた。以上の結果から、Oc細胞が全長HCV RNA複製システムのための親細胞として非常に優れていることが示された。

〔実施例２：適応変異の検出および適応変異の効果検討〕
３つの独立したO細胞クローンについてHCVゲノムのORFの塩基配列を解析した。３クローンの塩基配列解析結果を相互に比較し、各クローンが有する変異を検出した。

結果を図６に示した。３つのクローン（図中、Clone1-1、Clone1-2およびClone1-3）に共通する変異を星印で示し、各クローンにそれぞれ単独に検出された変異を点で示した。図６から明らかなように、３クローンに共通の変異が１つだけ検出された。この変異は、NS3ヘリカーゼ領域内に存在し、HCV-O株がコードするアミノ酸配列（配列番号２（GenBank ACCESSION AB191333）を参照）の1609位のリジンがグルタミン酸に置換する変異（K1609E）であった。

検出された変異（K1609E）のコロニー形成率に及ぼす効果を検証するために、当該変異を有しない野生型のRNA（C-5B/wt）または当該変異を有するRNA（C-5B/KE）を、sOc細胞およびOc細胞に導入し、上記実施例１に記載の方法と同様の方法でG418耐性コロニーの形成率を比較した。

結果を図７に示した。図７から明らかなように、sOc細胞ではC-5B/KE RNAを導入した場合にはG418耐性コロニーが得られた（コロニー形成率は約75コロニー/μg RNA）が、ON/C-5B/wt RNAを導入した場合にはG418耐性コロニーが得られなかった。一方、Oc細胞では、C-5B/KE RNAを導入した場合、非常に多数のG418耐性コロニーが得られ（コロニー形成率は約1500コロニー/μg RNA）、C-5B/wt RNAを導入した場合でも多数のG418耐性コロニーが得られた。

以上の結果から、K1609E変異は適応変異としての働きを有すること、およびOc細胞が全長HCV RNA複製システムのための親細胞として非常に優れていることが示された。

〔実施例３：ルシフェラーゼ遺伝子を発現するHCV全長ゲノム複製細胞の樹立〕
pORN/3-5B/KEまたはpORN/C-5B/KEのin vitro 転写産物（ORN/3-5B/KE RNAまたはORN/C-5B/KE RNA、図１参照）の10μgをOc細胞にエレクトロポレーション法により導入し、細胞を5枚の細胞培養器に播いて（2μg RNA/細胞培養器）、４週間のG418（300μg/ml）含む培地で選抜し、G418耐性細胞（ORN/3-5B/KE細胞およびORN/C-5B/KE細胞）を選抜した。Oc細胞におけるORN/C-5B/KEのコロニー形成率は約7コロニー/μg RNA であった。

ORN/3-5B/KE細胞およびORN/C-5B/KE細胞中のHCV RNAの存在を確認するために、これらの細胞由来のトータルRNAを用いてノーザンブロット分析を行った。

結果を図８に示した。レーン１およびレーン２は対照であり、pORN/3-5B/KEおよびpORN/C-5Bからそれぞれ転写した合成RNA（10⁸ゲノム相当の合成RNAを正常細胞由来のRNAに加えたもの）を用いた結果である。レーン３はOc細胞、レーン４はORN/3-5B/KE細胞、レーン５はORN/C-5B/KE細胞の結果である。図８から明らかなように、ORN/3-5B/KE細胞由来のRNA中には9kbのHCV特異的RNAが検出され、ORN/C-5B/KE細胞由来のRNA中には12kbのHCV特異的RNAが検出された。

また、Oc細胞、ORN/3-5B/KE細胞およびORN/C-5B/KE細胞の各細胞由来タンパク質についてのウエスタンブロット分析の結果を図９に示した。図９から明らかなように、ORN/3-5B/KE細胞では、NS3タンパク質およびNS5Bタンパク質が検出され、ORN/C-5B/KE細胞では、コアタンパク質、NS3タンパク質およびNS5Bタンパク質が検出された。

以上の結果より、得られたORN/C-5B/KE細胞は、ウミシイタケルシフェラーゼ（Renilla luciferase）遺伝子およびNeo 遺伝子を含むHCV全長ゲノム複製細胞であることが確認された。

上記ORN/C-5B/KE細胞は、複数のG418耐性コロニーが集まったポリクローナルな細胞株であった。そこで、より安定した均一な細胞株を樹立するために、約３週間のG418処理後に得られたコロニーよりクローン化細胞を樹立した。いくつかのクローン化細胞株のなかで、最も安定している（G418存在下、高い生存率で増殖を続けることができる）細胞株を「OR6」と名付けた。さらに、このOR6細胞についても、上述の方法（IFN-α処理）により治癒細胞「OR6c」を作製した。

〔実施例４：ルシフェラーゼ活性とHCV RNA量との相関の検証〕
ルシフェラーゼ活性とHCV RNA量との相関を検証するために、ルシフェラーゼレポーターアッセイおよびリアルタイムLightCycler PCRを実施した。すなわち、ORN/3-5B/KE細胞およびORN/C-5B/KE細胞を、それぞれ最終濃度0、1、10および100IU/mlのIFN-αで24時間処理した後、上述の方法でルシフェラーゼレポーターアッセイおよびリアルタイムLightCycler PCRを行った。

結果を図１０（ａ）〜（ｄ）に示した。（ａ）はORN/3-5B/KE細胞のルシフェラーゼ活性測定結果を示したグラフであり、（ｂ）はORN/3-5B/KE細胞のリアルタイムLightCycler PCRによるHCV RNA定量結果を示したグラフであり、（ｃ）はORN/C-5B/KE細胞のルシフェラーゼ活性測定結果を示したグラフであり、（ｄ）はORN/C-5B/KE細胞のリアルタイムLightCycler PCRによるHCV RNA定量結果を示したグラフである。どちらの測定結果も、IFN-αを添加していない細胞を100％として相対値で示した。

図１０（ａ）〜（ｄ）から明らかなように、両細胞ともIFN-αの濃度に依存してルシフェラーゼ活性およびHCV RNA量が減少し、ルシフェラーゼ活性はHCV RNA量と非常によく相関していた。IFN-αのIC₅₀は1 IU/ml前後であり、このIC₅₀値は以前の研究（参考文献：J.T.Guo,Q.Zhu,C.Seeger,Cytopathic and noncytopathic interferon responses in cells expressing hepatitis C virus subge-nomic replicons,J.Virol.77 (2003)10769-10779.）で報告されたものと同等であった。

〔実施例５：スタチンのHCVゲノム複製に対する抑制効果の検討〕
上述の方法に従い、ORN/3-5B/KE細胞およびOR6細胞に対して、アトルバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチンおよびローバスタチンをそれぞれ0、5または10μMの濃度で72時間処理し、細胞を回収してルシフェラーゼ活性を測定した。

結果を図１１（ａ）および（ｂ）に示した。いずれの結果もスタチンを添加していないものを100％として相対値で示した。（ａ）にはサブゲノミックレプリコン細胞であるORN/3-5B/KE細胞の結果を示し、（ｂ）にはHCV全長ゲノム複製細胞であるOR6細胞結果を示した。（ａ）から明らかなように、ORN/3-5B/KE細胞を用いた場合、プラバスタチンを除き、各スタチン処理により相対的なルシフェラーゼ活性が20〜50％程度低下していた。一方、（ｂ）から明らかなように、OR6細胞を用いた場合には、プラバスタチンを除き、各スタチン処理により相対的なルシフェラーゼ活性が、用量依存的に非常に大きく低下していた。特にフルバスタチンの効果が最も顕著であり、５μMの添加においても相対的なルシフェラーゼ活性は30分の1程度に低下していた。

以上の結果より、アトルバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチンおよびローバスタチンはHCV全長ゲノムの複製を抑制することが明らかとなった。また、抗HCV効果を有する薬剤をスクリーニングするためには、HCVの構造タンパク質コード領域を欠くサブゲノミックレプリコン細胞系ではなく、HCV全長ゲノム複製系を用いることが必要であることが示された。

〔実施例６：スタチンのOR6細胞に対する毒性の検討〕
６ウェル培養プレートに4×10⁴ 個のOR6細胞を播き、24時間培養した後、アトルバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチンおよびローバスタチンをそれぞれ５μＭの濃度で添加して72時間培養した。培養終了後、トリプシンで細胞を剥がしてトリパンブルー染色し、生細胞数を計測した。薬剤を添加していないOR6細胞を対照とした。

結果を図１２に示した。対照の生細胞数を100％とし、各スタチン処理群の生細胞数を相対値で示した。図１２から明らかなように、各スタチン５μＭで処理した場合の生細胞数は、対照の生細胞数と同程度であり、各スタチン５μＭではOR6細胞に対して細胞毒性を示さなかった。この結果から、上記実施例５で示された各スタチンのHCVゲノム複製抑制効果は細胞毒性に基づくものではなく、スタチンの抗HCV効果によるものであることが確認された。

〔実施例７：スタチンのEMCV-IRESに対する作用の確認〕
OR6細胞内におけるHCV蛋白質の発現はEMCV-IRESの活性により規定されていることから、スタチンがEMCV-IRESの活性を抑制している可能性がある。この可能性を否定するために、EMCV-IRESの下流にRenillaルシフェラーゼ遺伝子を有するような発現プラスミドを作成し、OR6c細胞（OR6細胞の治癒細胞）に導入してRenillaルシフェラーゼを発現させる系を作製した。

pEMCV-RLはEMCVとRLの２つのPCRフラグメントをpCX／bsrのBamHI-NotIサイトにライゲートして作製した。EMCVフラグメントは5‘末端側にBamHIサイトを、３’末端側にXhoIサイトを持つように、EMCVBamHIF （5'-cgggatccgcgggactctggggttcg-3'：配列番号１２）とEMCVXhoI （5'-ccgctcgagggtattatcgtgtttttcaaagg-3'：配列番号１３）の２つのプライマーを用いてPCRで増幅した。RLフラグメントは5'末端側にXhoIサイトを、3'末端側にNotIサイトをもつようにRennilaXhoIF （5'-ccgctcgagatggcttccaaggtgtacgacc-3'：配列番号１４）とRennilaNotIR （5'-atagtttagcggccgcctagacgttgatcctgg-3'：配列番号１５）の２つのプライマーを用いてPCRで増幅した。pEMCV-RLはCMVプロモーターを上流にもつプラスミドである。

作製した細胞に、各種スタチンを5μM添加し、72時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。陰性対照として薬剤を添加していない細胞を用いた。また、陽性対照として、ルシフェラーゼ活性を抑制することが判っているファンギゾン（AMPH-B）およびNystatinを用いた。

結果を図１３に示した。陰性対照のルシフェラーゼ活性を100％とし、各薬剤処理群のルシフェラーゼ活性を相対値で示した。図１３から明らかなように、各スタチン処理群のルシフェラーゼは抑止されておらず、用いたスタチンはEMCV-IRES活性およびウミシイタケルシフェラーゼを抑制しないことが示された。

〔実施例８：ウエスタンブロット分析によるスタチンの抗HCV効果の確認〕
６ウェル培養プレートに4×10⁴ 個のOR6細胞を播き、24時間培養した後、各薬剤を添加して96時間培養した細胞を、ウエスタンブロット分析に供した。使用薬剤は、IFN-α（10 IU/ml）、プラバスタチン（5μM）、ローバスタチン（5μM）、フルバスタチン（5μMまたは10μM）である。対照として、治癒細胞であるOR6c細胞および薬剤処理していないOR6細胞を用いた。

結果を図１４に示した。図１４から明らかなように、レーン１のOR6c細胞ではHCVタンパク質の発現していなかった。また、レーン２の薬剤処理していないOR6細胞ではコアタンパク質、NS3タンパク質およびNS5Bタンパク質の強い発現が認められた。レーン３のIFN-α処理細胞では、レーン２と比較して各HCVタンパク質の発現が減少していた。レーン４のプラバスタチン処理細胞では、各HCVタンパク質の発現は減少しておらず、レーン２と同程度の発現が認められた。レーン５のローバスタチン処理細胞では、各HCVタンパク質の発現が減少していた。レーン６および７は、それぞれフルバスタチン5μMおよび10μMで処理した細胞であるが、レーン５のローバスタチン5μMで処理した細胞よりさらに強く各HCVタンパク質の発現が減少していた。

〔実施例９：HCV-O RNAの複製に対するフルバスタチンの抑制効果の確認〕
OR6細胞で複製しているORN/C-5B/KE RNAには、HCVの遺伝子以外に、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子、Neo遺伝子およびHCVタンパク質の翻訳をするためのEMCV-IRESの３つの外来性遺伝子が含まれている。スタチンがこれらの３つの外来性遺伝子を抑制する可能性を否定するために、外来性遺伝子を含まないHCV-O RNAのみを導入した細胞を作製した。

具体的には、細胞に導入するHCV RNAとして、HCVの複製効率を増強させるKE/EGの適応変異を含むHCV-O/KE/EG RNAを用いた。KE変異は、上述のとおり、HCV-O株がコードするアミノ酸配列の1609位のリジンがグルタミン酸に置換する変異（K1609E）である。EGは同じくNS3領域の1202位のグルタミン酸がグリシンに置換する変異（E1202G）である。変異の導入にはQuickChange mutagenesis（Stratagene）を用い、K1609Eの導入には、配列番号１に記載の塩基配列における第5166位のアデニン（a）をグアニン（g）に置換し、E1202Gの導入には配列番号１に記載の塩基配列における第3946位のアデニン（a）をグアニン（g）に置換した。

また、陰性対照細胞として、RNAポリメラーゼ活性を持たない、すなわちHCV RNAの複製が起こらない細胞を作製した。具体的には、RNAポリメラーゼ活性のモチーフであるGDDを含む、NS5B領域の2732位から2741位までの10アミノ酸（MLVCGDDLVV）を欠損させたHCV-O/dGDD RNAを細胞に導入した。上記10アミノ酸の欠損変異の導入には、QuickChange mutagenesis（Stratagene）を用い、配列番号１に記載の塩基配列における第8535位〜第8564位の塩基を欠損させた。

これらのHCV-O RNAを導入する細胞には治癒細胞であるOR6c細胞を用いた。細胞へのRNAの導入方法は、上述の〔RNAのトランスフェクションおよびG418耐性細胞の選抜〕の項に記載のとおり行った。ただし、HCV-O/KE/EG RNAおよびHCV-O/dGDD RNAはNeo遺伝子を含まないためG418による選抜は不要である。

陰性対照としてのHCV-O/dGDD RNA導入細胞群、薬剤処理をしないHCV-O/KE/EG RNA導入細胞群、およびフルバスタチン処理HCV-O/KE/EG RNA導入細胞群の３群を設けて実験を行った。HCV-O/dGDD RNA導入細胞群および薬剤処理をしないHCV-O/KE/EG RNA導入細胞群は、RNA導入後24、48、72および96時間後にそれぞれ細胞を回収し、ウエスタンブロット分析に供した。フルバスタチン処理群はRNA導入後24時間目にフルバスタチン5μMを培地に添加し、48、72および96時間後にそれぞれ細胞を回収し、ウエスタンブロット分析に供した。

結果を図１５に示した。レーン１〜４はHCV-O/dGDD RNA導入細胞群の結果である。いずれの時間でもコアタンパク質およびNS3タンパク質の発現は認められなかった。レーン５〜８は薬剤処理をしないHCV-O/KE/EG RNA導入細胞群の結果である。24時間後にわずかにコアタンパク質およびNS3タンパク質の発現が見られ、その後発現レベルが上昇し、96時間後に最も強くなった。レーン９〜１１は5μMのフルバスタチンで処理したHCV-O/KE/EG RNA導入細胞群の結果である。明らかにコアタンパク質およびNS3タンパク質の発現が抑制されていることが示された。

〔実施例１０：スタチンの用量依存的抗HCV効果の確認〕
OR6細胞にアトルバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチンおよびローバスタチンを、それぞれ0、0.625、1.25、2.5または5μMの濃度で添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。

結果を図１６に示した。薬剤を添加していない（0μM）細胞のルシフェラーゼ活性を100％として示している。なお、プラバスタチンは抗HCV効果が認められなかったので、図示していない。図１６から明らかなように、プラバスタチ以外の４種類のスタチン処理細胞は、用量に依存してルシフェラーゼ活性が減少した。すなわち、アトルバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチンおよびローバスタチンは用量依存的にHCVゲノムの複製を抑制する効果を有することが示された。

各種スタチン剤における抗HCV効果の違いに有意差があるかどうかについては、Student t検定（P値が0.05未満を有意差ありとする）を用いて統計学的に検討した。その結果、フルバスタチン（0.625μM−5μMでP＜0.01）、アトルバスタチン（1.25μMでP＜0.05、2.5μM と 5μMでP＜0.01）およびシンバスタチン（0.625μM と 1.25μMでP＜0.05、2.5μMと5μMでP＜0.01）はローバスタチンと比較して有意に強い抗HCV効果を有していることがわかった。

特に、フルバスタチンは他のシンバスタチン（1.25μM−5μMでP＜0.01）やアトロバスタチン（1.25μMでP＜0.05、2.5μM と 5μMでP＜0.01）と比較しても有意に強い抗HCV効果を有していることがわかった。

この実験結果から各スタチンのIC₅₀値を算出した（表１参照）。

〔実施例１１：スタチンとIFN-αの併用による抗HCV効果の検討〕
24ウェル培養プレートに4×10⁴ 個のOR6細胞を播き、24時間培養した後、アトルバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチンおよびローバスタチンをそれぞれ５μＭの濃度で添加するとともに、IFN-αを0、2、4または8IU/mlの濃度で添加した。その後72時間培養し、細胞を回収してルシフェラーゼ活性を測定した。スタチンを添加せずに、IFN-αのみ0、2、4または8 IU/mlの濃度で添加した細胞を対照とした。

結果を図１７に示した。スタチンもIFN-αも添加していない細胞のルシフェラーゼ活性を100％とし、各処理群のルシフェラーゼ活性を相対値で示した。IFN-αのみを2、4、8 IU/mlの濃度で添加した場合のルシフェラーゼ活性は、それぞれ、15.2%、6.2%、2.5%に低下した。アトルバスタチン5μMにIFN-αを0、2、4、8 IU/mlの濃度で併用した時のルシフェラーゼ活性は、それぞれ、8.9%、0.75%、0.30%、0.19%と、IFN-α単独処理よりさらに低下した。シンバスタチン5μMにIFN-αを0、2、4、8 IU/mlの濃度で併用した時のルシフェラーゼ活性は、それぞれ、8.5%、1.3%、0.45%、0.24%であった。プラバスタチン5μMにIFN-αを0、2、4、8 IU/mlの濃度で併用した時のルシフェラーゼ活性は、それぞれ、100%、18.3%、6.4%、2.2%であり、IFN-α単独処理とほぼ同程度であった。フルバスタチン5μMにIFN-αを0、2、4、8 IU/mlの濃度で併用した時のルシフェラーゼ活性は、それぞれ、3.5%、0.42%、0.29%、0.15%であり、今回用いたスタチンのなかで最も強い抗HCV効果を示した。ローバスタチン5μMにIFN-αを0、2、4、8 IU/mlの濃度で併用した時のルシフェラーゼ活性は、それぞれ、24.1%、3.3%、1.1%、0.45%であった。

以上の結果より、プラバスタチン以外のアトルバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチンおよびローバスタチンとIFN-αとの併用は、各薬剤の単独処理より抗HCV効果を増強することが明らかとなった。

〔実施例１２：フルバスタチンとIFN-αの併用による抗HCV効果の検討〕
上記実施例１１でIFN-αとの併用により最も強い抗HCV効果を示したフルバスタチンについて、より詳細にIFN-αとの併用効果を検討した。

24ウェル培養プレートに4×10⁴ 個のOR6細胞を播き、24時間培養した後、フルバスタチンを0、0.625、1.25、2.5または5μMの濃度で添加するとともに、IFN-αを0、4、8、16、32または64 IU/mlの濃度で添加した。その後72時間培養し、細胞を回収してルシフェラーゼ活性を測定した。

結果を図１８に示した。薬剤を添加していない細胞のルシフェラーゼ活性を100％とし、各処理群のルシフェラーゼ活性を相対値で示した。図１８に示したグラフの縦軸は相対的なルシフェラーゼ活性（％）を示し、横軸はフルバスタチン濃度（μM）を示す。

フルバスタチン2.5μMを単独で処理した場合は、IFN-α 4 IU/mlを単独で用いた場合に相当する抗HCV効果を示し、フルバスタチン5μMを単独で処理した場合は、IFN-α 8 IU/mlを単独で用いた場合に相当する抗HCV効果を示した。フルバスタチン1.25μM、2.5μMまたは5μMをIFN-αと併用すると、IFN-α濃度にかかわらず、それぞれ約２倍、約４倍、約８倍の抗HCV効果が認められた。具体的には、例えば、IFN-α 8 IU/mlとフルバスタチン1.25μM、2.5μMまたは5μMとの併用時の抗HCV効果は、それぞれIFN-α単独処理の16 IU/ml、32 IU/ml、64 IU/mlの抗HCV効果に相当した。

臨床でのIFN-αの投与の最大投与量は、副作用などの観点から約1000万IU/mlであるが、以上の結果は、これにフルバスタチン1.25μM、2.5μM、5μMを併用すると、それぞれ2000万IU/ml、4000万IU/ml、8000万IU/ml相当のIFN-αの効果が期待できることを暗示する。

一般にIFN-αの投与期間、投与量が増えるとHCVの治癒率が改善することが知られている。投与期間の延長は可能であるが医療費の負担、患者の社会生活への圧迫が問題となる。投与量の増加はIFN-α 1000万IU/mlでも相当の副作用が生じることから現実的ではない。IFN-α 1000万IU/mlにフルバスタチンを併用することで、耐えられる副作用の範囲内でより高い抗HCV効果が実現できれば、さらなるHCVの治癒率の改善にとどまらず、HCV治療期間の短縮が期待でき患者の負担も軽減できる可能性がある。

〔実施例１３：ピタバスタチンの用量依存的抗HCV効果〕
OR6細胞にピタバスタチンを、それぞれ0、0.156、0.31、0.625、1.25、2.5または5μMの濃度で添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。

結果を図１９に示した。ピタバスタチンを添加していない（0μM）細胞のルシフェラーゼ活性を100％として示している。図１９から明らかなように、ピタバスタチンの用量に依存してルシフェラーゼ活性が減少し、用量依存的にHCVゲノムの複製を抑制する効果を有することが示された。なお、IC₅₀値は0.45μMであった。

〔比較例：リバビリンとIFN-αとの併用による抗HCV効果〕
現在、臨床で用いられているリバビリンとIFN-αとの併用による抗HCV効果を、OR6細胞を用いて検討した。

24ウェル培養プレートに4×10⁴ 個のOR6細胞を播き、24時間培養した後、IFN-αを2 IU/mlの濃度で添加するとともに、リバビリンを0、5、10、15、20または25μMの濃度で添加した。その後72時間培養し、細胞を回収してルシフェラーゼ活性を測定した。

結果を図２０に示した。リバビリンを添加していない細胞のルシフェラーゼ活性を100％とし、各処理群のルシフェラーゼ活性を相対値で示した。図２０から明らかなように、用量依存的にルシフェラーゼ活性は減少し、25μMでは約３０％の抑制効果を示した。しかしながら、抑制効果はスタチンとIFN-αとの併用効果より非常に弱いものであった。

〔実施例１４：フルバスタチン、シクロスポリンＡおよびIFN-αの併用による抗HCV効果の検討〕
24ウェル培養プレートに4×10⁴ 個のOR6細胞を播き、24時間培養した後、フルバスタチン、シクロスポリンＡ、IFN-αの各薬剤を添加した。フルバスタチンは0、0.625、1.25または2.5μMの濃度で添加した。シクロスポリンＡは細胞毒性の認められない濃度として0.25μg/mlとした。IFN-αは2 IU/mlの濃度で添加した。薬剤の組み合わせとしては、フルバスタチンおよびシクロスポリンＡの２剤併用、フルバスタチンおよびIFN-αの２剤併用、フルバスタチン、シクロスポリンＡおよびIFN-αの３剤併用とした。対照は薬剤無添加とした。薬剤添加後72時間培養し、細胞を回収してルシフェラーゼ活性を測定した。

結果を図２１および表２に示した。対照（薬剤無添加）のルシフェラーゼ活性を100％とし、各薬剤処理群のルシフェラーゼ活性を相対値で示した。図２１のグラフでは、Ｙ軸が相対的ルシフェラーゼ活性（％）を示し、Ｘ軸はフルバスタチン濃度を示す。また、（◇）はフルバスタチンのみの場合、（□）はフルバスタチンとシクロスポリンＡとを併用した場合、（△）はフルバスタチンとIFN-αとを併用した場合、（×）はフルバスタチン、シクロスポリンＡおよびIFN-αを併用した場合を示す。

表２の相加効果としての予測値は、それぞれの抗HCV効果を加算した値として算出した。

IFN-α2 IU/mlとフルバスタチンとを併用した場合、それぞれ単独で使用した場合の抗HCV効果から予測される値よりも低い値が得られたことから、相乗的抗HCV効果が観察された。また、シクロスポリンＡ 0.25μg/mlとフルバスタチンとを併用した場合も、それぞれ単独で使用した場合の抗HCV効果から予測される値より低い値が得られたことから、相乗的抗HCV効果が観察された。

さらに、IFN-α2 IU/ml、シクロスポリンＡ 0.25μg/mlおよびフラバスタチンの３剤を併用した場合、それぞれ単独で使用した場合に予測される値より大幅に低い値が得られたことから、顕著な相乗的抗HCV効果が認められた。例えば、フルバスタチン1.25μMの場合、３剤併用で予想される相対的ルシフェラーゼ活性は2.96％であるが、実測値は0.58％となり、予想値の５分の１程度まで低下していた。以上の結果より、フルバスタチン、シクロスポリンＡおよびIFN-αの３剤併用による抗HCV効果は、フルバスタチンとIFN-αとの併用による効果を大きく上回ることが明らかとなった。

臨床でのIFN-αの最大投与量は副作用などの点から約1000万IU/mlであるが、これにフルバスタチンやシクロスポリンＡを併用すると大きな抗HCV効果が期待できる。また、フルバスタチンやシクロスポリンＡを併用することにより、IFN-αの量を軽減することが可能となり、IFN-αによる副作用を小さくすることができる。

本発明を用いれば、抗ＨＣＶ作用を有する物質のスクリーニング方法、さらにＣ型肝炎治療薬を提供できるので、試薬産業、医薬品産業などの発展に貢献することができる。

ＨＣＶゲノムの構成、サブゲノミックＨＣＶレプリコン細胞に導入されるＲＮＡ（ＯＮ／３−５Ｂ）の構成、ＨＣＶ全長ゲノム複製細胞に導入されるＲＮＡ（ＯＮ／Ｃ−５Ｂ）の構成、ルシフェラーゼ遺伝子産物を発現するサブゲノミックＨＣＶレプリコン細胞に導入されるＲＮＡ（ＯＲＮ／３−５Ｂ／ＫＥ）の構成、およびルシフェラーゼ遺伝子産物を発現するＨＣＶ全長ゲノム複製細胞に導入されるＲＮＡ（ＯＲＮ／Ｃ−５Ｂ／ＫＥ）の構成を示す模式図である。 Ｏｃ細胞を作製する手順を示す図である。 Ｏｃ細胞、ｓＯ細胞およびＯ細胞のノーザンブロット分析の結果を示す画像である。 Ｏｃ細胞、ｓＯ細胞およびＯ細胞のウエスタンブロット分析の結果示す画像である。 ｓＯｃ細胞およびＯｃ細胞にＯＮ／Ｃ−５Ｂ ＲＮＡを導入してＧ４１８耐性コロニー形成率を比較した実験結果を示す写真である。 ３つのＯ細胞クローンのＨＣＶゲノムＯＲＦ塩基配列を比較した変異箇所を示した図である。 Ｋ１６０９Ｅ変異の有無によるコロニー形成率の違いを、ｓＯｃ細胞およびＯｃ細胞を用いて比較した実験結果を示す写真である。 ＯＲＮ／３−５Ｂ／ＫＥ細胞およびＯＲＮ／Ｃ−５Ｂ／ＫＥ細胞のノーザンブロット分析の結果を示す画像である。 ＯＲＮ／３−５Ｂ／ＫＥ細胞およびＯＲＮ／Ｃ−５Ｂ／ＫＥ細胞のウエスタンブロット分析の結果を示す画像である。 ＯＲＮ／３−５Ｂ／ＫＥ細胞およびＯＲＮ／Ｃ−５Ｂ／ＫＥ細胞に対して各濃度のＩＦＮ−α処理を行い、ルシフェラーゼレポーターアッセイおよびリアルタイムLightCycler PCRを実施した結果を示すグラフである。 ＯＲＮ／３−５Ｂ／ＫＥ細胞およびＯＲ６細胞を用いて、５種類のスタチンのＨＣＶゲノム複製抑制効果を調べた実験結果を示すグラフである。 ５種類のスタチンのＯＲ６細胞に対する細胞毒性を検討した結果を示すグラフである。 ５種類のスタチンのＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ活性抑制作用を検討した結果を示すグラフである。 ＯＲ６細胞系における、ＩＦＮ−α、プラバスタチン、ローバスタチンおよびフルバスタチンの抗ＨＣＶ効果を、ウエスタンブロット分析により確認した結果を示す画像である。 ＯＲ６細胞系において、フルバスタチンが外来性遺伝子を抑制しないことを確認するための実験結果を示す、ウエスタンブロット分析画像である。 ＯＲ６細胞系における、アトルバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチンおよびローバスタチンの用量依存的抗ＨＣＶ効果を確認した結果を示すグラフである。 ＯＲ６細胞系における、５種類のスタチンとＩＦＮ−αとの併用による抗ＨＣＶ効果を検討した結果を示すグラフである。 ＯＲ６細胞系における、フルバスタチンとＩＦＮ−αとの併用による抗ＨＣＶ効果を詳細に検討した結果を示すグラフである。 ＯＲ６細胞系における、ピタバスタチンの用量依存的抗ＨＣＶ効果を確認した結果を示すグラフである。 ＯＲ６細胞系における、リバビリンとＩＦＮ−αとの併用による抗ＨＣＶ効果を検討した結果を示すグラフである。 ＯＲ６細胞系における、フルバスタチン、シクロスポリンＡおよびＩＦＮ−αの併用による抗ＨＣＶ効果を検討した結果を示すグラフである。

Claims (7)

1. Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の全長ゲノムを複製し、かつレポーター遺伝子産物を発現する細胞であって、
   レポーター遺伝子配列、選択マーカー遺伝子配列およびＨＣＶ全長ゲノム配列を含むＲＮＡが、ヒト肝癌細胞株ＨｕＨ−７由来のＯｃ細胞（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５１７）に導入されている細胞。
2. 上記ＲＮＡは、さらに外来性のインターナルリボソーマルエントリーサイト（ＩＲＥＳ）配列を含む、請求項１に記載の細胞。
3. 上記ＲＮＡのＨＣＶオープンリーディングフレーム配列中に、少なくとも１個のアミノ酸置換を伴う適応変異が含まれている、請求項１または２に記載の細胞。
4. 上記適応変異がＮＳ３領域内に生じている、請求項３に記載の細胞。
5. 上記ＲＮＡは、５’末端から、ＨＣＶのＩＲＥＳ配列、レポーター遺伝子配列、選択マーカー遺伝子配列、外来性ＩＲＥＳ配列、ＨＣＶオープンリーディングフレーム配列、ＨＣＶ３’非翻訳配列の順に連結されている、請求項２に記載の細胞。
6. 抗ＨＣＶ作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、
   被検物質を請求項１ないし５のいずれかに記載の細胞と接触させる工程；
   レポーター遺伝子産物のレベルを測定する工程；および
   上記レポーター遺伝子産物のレベルを、被検物質を接触させないときのレベルと比較する工程
   を包含する、方法。
7. 抗ＨＣＶ作用を有する物質をスクリーニングするためのキットであって、
   請求項１ないし５のいずれかに記載の細胞を備える、スクリーニングキット。