JP4012928B2 - 接合安定化されたポリペプチド組成物 - Google Patents

Description

本発明は、接合安定化ポリペプチド組成物発明の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、接合安定化ポリペプチド組成物（ポリ）ペプチドおよびタンパク質組成物ならびにフォーミレーション、ならびにその製法およびその使用方法に関する。

［関連する技術の説明］
特定の病気の系統的な治癒ためにポリペプチドおよびタンパク質を使用することは、今や医療分野における一般的なこととなっている。ペプチドが置換治療において果たす役割は、非常に重要であり、このため、ＤＮＡ組換え技術により大量に合成することを目的として多数の研究が行われている。こうしたポリペプチドの多くは、その生物学的作用を発揮させる可能性を秘めかつ特定的である内在性分子である。

こうした物質をその所期の適用目的に使用する有用性を阻害する１つの大きな原因は、非経口的に投与したとき、タンパク質分解酵素血漿によって容易に代謝されることである。これら物質を経口投与することは、また、胃内部のタンパク質分解に加えて、胃が非常に酸性であるため、その物質が所期の標的とする組織に達する前に、その物質が破壊されてしまうため、極めて問題が多い。胃およびタンパク質分解の酵素の作用によって発生されるポリペプチドおよびタンパク質物質は、腸の刷子境界薄膜内の外部および内部ペプチダーゼによって分解されて、ジペプチドおよびトリペプチドを発生させ、また、膵臓の酵素によるタンパク質分解が防止されるとしても、ポリペプチドは、刷子境界ペプチダーゼによって劣化する。胃を通る間に生き残った所定のペプチドの何れも侵入隔膜が細胞内への侵入を防止する腸の粘膜内で更に代謝作用を受ける。

こうした障害にも拘らず、栄養分および薬剤タンパク質が腸の粘膜を通じて吸収されることを示唆する相当な証拠が文献に記載されている。他方、栄養分および薬（ポリ）ペプチドは、腸の粘膜細胞内の特定のペプチド担体により吸収される。こうした知見から、適正にフォーミレートした（ポリ）ペプチドおよびタンパク質は、経口的に投与することができ、その所期の目的のための十分な生物学的活性が保持されることが分かる。しかしながら、その物理的活性が完全に保たれるようにするため、そのペプチドが少なくとも相当な程度まで変性させることが可能であると同時に、タンパク質分解酵素に対して安定させかつ腸の粘膜を通じてその侵入機能を向上させ得るならば、これらをその所期の目的のために適正に使用することが可能となる。このようにして得られた製品は、より効率良く吸収が為され、これと同時に、最適な治療効果を上げるためにより少量の投与量で済むという利点が得られる。

タンパク質の経口または非経口投与に伴う問題点は製薬業界で周知であり、こうした問題点を解決すべく各種の方策が採用されている。これらの方策には、サリチル酸塩、リピド・バイル塩混合ミセル（微胞）、グリセライドおよびアクリルカルニチンのようなタンパク質促進剤を添加することを含むが、こうした方法は、局部的な炎症および毒性、上皮の層の完全な摩耗および組織の炎症といった重大な局部的な毒性に伴う問題点を生じさせることが多い。こうした問題点が生ずる理由は、促進剤が通常、ペプチド生成物と共に投与され、その投与量が漏れることが多いからである。経口投与を改善するためのその他の方策には、投与した薬剤の劣化を制限すべくアプロチン、大豆トリプシン阻止剤およびアマルスタチンのようなプロテアーゼとペプチドを混合させることを含む。不都合なことに、こうしたプロテアーゼは、選択的ではなく、また内在性タンパク質が阻害されてしまう。この作用は望ましくない。

また、対象とする薬剤の物理化学的性質を変性させることにより、粘膜のような薄膜におけるペプチドの侵入を促進させることも研究されている。研究結果から、親油性を増進させるだけでは細胞間の輸送を促進するには十分でないことが分かる。実際には、ペプチド水和結合を分解することは薄膜においてペプチドを拡散させるときに打ち勝つべきエネルギ障壁であることが示唆されている（非特許文献１参照）。また、タンパク質の安定化は何人かの著者により発表されている。非特許文献２には水溶性で非免疫性の生体中において、安定化された生成物を提供するため、酵素を修飾する各種の方法が開示されている。

タンパク質安定化を対象とする極めて多くの研究が公表されている。酵素と重合材料とを接合させる各種の方法（例えば、非特許文献２参照）が開示されている。より具体的には、これらの重合体は、デクストラン、ポリビニルピロリドン、グリコペプチド、ポリエチレングリコールおよびポリアミノ酸である。形成される、接合したポリペプチドはその生物学的活性を保ち、また非経口の投与のため水溶性を保つと報告されている。また、同一人が、ポリエチレングリコールはかかるタンパク質と結合したときにタンパク質を可溶性にしかつ非免疫性にすることを開示している（特許文献１参照）。しかしながら、こうした重合材料は腸の粘膜との結合に適した成分を含まず、また薄膜への浸透を促進しまたは増進する成分を含んでいない。こうした接合体は水溶性であるが、経口投与を目的としてはいない。

コンドロイチン硫酸と共役させることによりタンパク質を安定化させ得ることも教示されている（特許文献２参照）。この組み合わせの生成物は、通常、ポリ陰イオンで、極めて親水性であり、細胞への浸透性を欠く。これらの生成物は、通常、経口投与を目的としない。

ペクチン、アルジェシック酸、ヒアルロン酸、カラゲエニンのような特定の酸性の多糖類をタンパク質と結合させて、可溶性および不溶性の生成物の双方を形成することが教示されている（例えば、特許文献３参照）。かかる多糖類は、食用植物から得られるポリ陰イオンである。これら物質は細胞への浸透性を欠き、通常、経口投与を目的としていない。

ポリエチレングリコールが過酸化不均化酵素（「ＳＯＤ」）のようなタンパク質に結合可能であることが開示されている（例えば、非特許文献３参照）。形成された接合タンパク質は変成および酵素の消化に対して安定性を増す。重合体は薄膜との相互作用に必要とされる成分を含まず、このため、経口投与に適していないという上述と同一の問題点がある。

アミノレチン、脂肪酸、ビタミンＢ１２、グリコシドのような比較的低分子量の化合物とタンパク質系薬剤物質が接合されたペプチドおよびタンパク質薬剤を安定化させるその他の技術が開示されている非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７参照）。変性化合物は重合体ではなく、従って、経口投与および非経口投与の後に生物学的作用に必要な可溶性および薄膜との親和性の双方を得るために必要とされる成分を含んでいない。こうした研究の多くは経口的に生体に投与できない。

タンパク質系物質の生体内の作用時間を長くするためのもう１つの解決策は、封止技術である。経口投与のためタンパク質系薬剤をアゾ重合体内に封止することが教示されている（非特許文献８参照）。このフィルムは胃内での消化に生き残り、大腸内の微生物により劣化され、封止されたタンパク質が放出されると報告されている。この技術は生理的混合体を利用するものであり、薄膜において放出されたタンパク質の吸収を促進はしない。また、タンパク質を含む生理的に活性な化合物はコアセルベーションによるフィルムにより封止することができ、最終製品は経粘膜投与に適したものとなることが教示されている（特許文献４参照）。本発明のその他のフォーミュレーションは、吸入、経口、非経口および経皮膚投与により投与することが可能である。こうした解決策は経口投与に望まれる性質である、酸および胃腸管のタンパク質系酵素に対して完全な安定性は得られない。

経口投与および非経口投与のためにタンパク質薬剤を安定化される別の方策は、治療剤をリポソームに取り込むことを含む（非特許文献９参照）。リポソーム−タンパク質複合体は生理的混合体である。その投与は不規則でかつ予見不能な結果を生じる。かかるリポソームタンパク質複合体を使用するとき、特定の器官にタンパク質成分が望ましくないほどに蓄積することが報告されている。こうしたファクタに加え、コスト、複雑な凍結乾燥工程を必要とする難しい製造方法、溶剤の不適合性といったリポソームの使用に伴う更に別の欠点もある。更に、臨床的に有用なリポソームのフォーミュレーションを開発するときに、制約的なファクタとして生体での配分をおよび抗原性が変更するという問題が生じる。

「ｐｒｏｔｅｉｎｏｉｄｓ」の使用は最近発表されている（非特許文献１０参照）。このシステムを使用して、幾つかの種類の治療薬剤を経口投与することが報告されており、このシステムは極めて分岐したアミノ酸からなる重合体シース内に対象とする薬剤を封止するものである。リポソームの場合と同様に、薬剤はプロチノイド球と化学的に結合されず、投与形態の化合物から薬剤が漏れる可能性がある。

合成しようとする研究、およびその投与および生体への同化を促進させようとする研究の対象となるペプチドはインシュリンである。

インシュリンを糖尿病の治療に使用することは１９９２年に遡及し、このとき、膵臓から抽出された活性抽出物が糖尿病の犬において治療効果があることが示された（非特許文献１１参照）。膵臓抽出物による同年の糖尿病患者の治療の結果、劇的な生命維持の臨床的改善が見られた。長期の回復のためには、インシュリンを毎日注射する過程が必要とされる。

インシュリン分子は、ディサルファイド結合体により結合された２つのアミノ酸鎖からなっている。インシュリンの分子量は約６，０００である。膵臓ｉｓｌｅｔｓのベータ細胞は、プロインシュリンとして公知のインシュリンの単一鎖前駆体を分泌する。プロインシュリンのプロテオリスの結果、４つの基本的アミノ酸が除去され（プロインシュリン鎖におけるＮｏ．３１、３２、６４、６５、即ちそれぞれＡｒｇ1、Ａｒｇ1、Ｌｙｓ、Ａｒｇである）、および接続（「Ｃ」）ペプチドが除去された。形成される２つの鎖インシュリン分子において、Ａ鎖はアミノ端にてグリシンを有し、Ｂ鎖はアミノ酸でフェニルアラニンを有する。

インシュリンはモノマー（単量体）、ダイマーまたは３つのダイマー（２量体）から形成されたヘキサマー（６量体）として存在することができる。ヘキサマーは２つのＺｎ2+原子に配位する。モノマーは生体的活性が存在する。最近まで、人間の糖尿病の治療のため、牛および豚のインシュリンがもっぱら使用されているが、種類によりインシュリンに多数の相違点があることが公知である。

豚のインシュリンは人間のインシュリンと殆ど同様であり、Ｂ鎖Ｃ端にてトレオニン残基ではなくて、アラニンを有する点のみが異なる。こうした相違点にも拘らず、殆どの哺乳類のインシュリンは比較可能な特定の活性を有する。最近まで、動物の抽出物で、この病気の治療に使用される全てのインシュリンを提供してきた。遺伝子組換え技術の到来により、人間のインシュリンを商業的規模で製造することが可能となった（例えば、インディアナ州、インディアナポリスのイーライ・リリィ・アンド・カンパニー（Ｅｌｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍ-ｐａｎｙ）から市販されているヒューミリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標名））インシュリン）。

インシュリンは、糖尿病の治療薬として７０年以上に亘って使用されているが、そのフォーミュレーションの安定性の研究が少なく、最近２つの出版物が発表されただけである（非特許文献１２、非特許文献１３参照）。こうした出版物において、著者は各種の温度およびｐＨ状態下において幾つかのインシュリン調合剤の化学的安定性を詳細に述べている。初期の報告書は、インシュリン調合剤を安定させる手段としてほぼ殆ど生物学的能力のみを対象としている。しかしながら、幾つかの新規でかつ有効な分析技術であるディスク電気泳動、サイズ除外クロマトグラフィおよびＨＰＬＣの登場により、インシュリンの化学的安定性の特徴を詳細に検査することが可能となっている。インシュリンの安定性に関する初期の化学的研究は、検査の対象とする再結晶化したインシュリンの純度が８０乃至９０％以下であるため、困難であった。より最近、単一成分で高純度のインシュリンが利用可能となっている。この単一成分のインシュリンは、現在の分析技術では検知不可能な濃度の不純物を含んでいる。

調合したインシュリンは、多数の種類の劣化の傾向がある。グルタミノールまたはアスファラジニル残基からの側部鎖アミノ基が自由なカルボキシル酸に加水分解されたとき、酵素によらないアミド分解が行われる。インシュリンにおけるかかるアミド分解には６つの可能な箇所がある。即ち、ＧｌｎA5、ＧｌｎA15、ＡｓｎA18、ＡｓｎA21、ＡｓｎB3およびＧｌｎB4である。出版された報告書は、３つのＡｓｎ残基は、かかる反応を最も受け易いと報告している。

酸性状態にてインシュリンはＡｓｎA21にて顕著なアミド分解により急激に劣化することが報告されている（非特許文献１３参照）。一方、中性のフォーミュレーションにおいて、アミド分解はインシュリンの濃度およびインシュリンの採取源に関係なく、ＡｓｎB3にて遥かに遅い速度で生じる。しかしながら、温度およびフォーミュレーションの種類は、Ｂ３における加水分解の速度を決定する上で重要な役割を果たす。例えば、インシュリンが非結晶ではなくて結晶性である場合、Ｂ３における加水分解は最小限である。勿論、結晶形態における可撓性が低下すれば（第３の構造体）、反応速度が遅くなる。フェノールを中性のフォーミュレーションに組込むことにより、第３の構造体を安定させれば、アミド分解の速度が遅くなる。

インシュリンのフォーミュレーションにおいて加水分解で劣化した生成物に加えて、高分子量の変性生成物もまた形成される。ブランジェその他の者は、サイズ除外クロマトグラフィによりインシュリンフォーミュレーションを４℃乃至４５℃の温度範囲で貯蔵したときに形成される生成物は共有結合したインシュリンダイマーであることを明らかにしている。また、プロタミンを含むフォーミュレーションにおいて、共有結合したインシュリン・プロタミン生成物も形成される。インシュリンダイマーおよびインシュリン・プロタミン生成物の調合速度は、温度により著しく影響される。人間または豚のインシュリンの場合（レギュラーＮ１フォーミュレーション）１％の高分子量の生成物を調合する時間４℃と比較して３７℃のとき、１５４カ月から１．７カ月に短縮される。豚のインシュリンの亜鉛懸濁調合剤の場合、同一の変性のためには、４℃にて３５７カ月かかるが、３７℃では僅か０．６カ月で済む。

インシュリンにおけるこうした種類の劣化は糖尿病の研究にとって極めて有意義である。高分子量の生成物の形成は、上述の加水分解（化学的）劣化生成物が形成される速度よりも全体として遅いが、その意味はより重大である。インシュリンに対して免疫学的応答性があることは、インシュリンの共有結合した凝集体が存在することに起因するという顕著な証拠がある（非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６参照）。

インシュリンの投与を受けている糖尿病患者の３０％が、共有結合インシュリンダイマーに対する特定の抗体を持つことが示されている。２％の低濃度のときでも、共有結合インシュリンダイマーの存在はアレルギー患者にリンパ球刺激において極めて顕著な応答性を示すと報告されている。ダイマー含有量が０．３乃至０．６％のとき、応答性は顕著ではない。その結果、フォーミュレーション中に存在する共有結合インシュリンダイマーの濃度は臨床的症状を回避するため、１％以下に保つべきことが推奨されている。

いくつかのインシュリンフォーミュレーションが市販されている。いずれのフォーミュレーションも最早、冷蔵の必要がない程度まで、安定性が改善されているが、依然、安定性の向上したインシュリンフォーミュレーションが課題とされている。高分子量生成物を形成する傾向のない変性したインシュリンが開発されることは、製薬業界および医療分野にて顕著な進歩であり、また、（インシュリンの経口投与を可能にすることに加えて）この安定性が得られるように変性し得るならば、糖尿病の管理に著しく貢献することになろう。

ポリペプチドおよびタンパク質を治療薬として生体内で使用することに加えて、ポリペプチドおよびタンパク質を診断用試薬の分野で使用する事例が著しく増えている。かかる適用例の多くにおいて、ポリペプチドおよびタンパク質は溶液状態で使用され、この場合、ポリペプチドおよびタンパク質は、次のような（ポリ）ペプチドおよびタンパク質の熱および酵素による劣化を受け易い。即ち、酵素、ペプチドおよびタンパク質ホルモン、抗体、免疫検定法に使用される酵素タンパク質接合体、抗体ハプテン接合体、ＡＩＤＳのような病気の診断または検査のため多数の分析方法に使用されるウィルス性タンパク質、肝炎、風疹、例えば、組織培養に使用されるペプチドおよびタンパク質成長剤、臨床化学に使用される酵素、食品業界で使用されるように不溶性酵素である。更に具体的な一例として、生物流体中に抗体または抗原が存在することを色度測定法により検出するために使用されるキットの試薬として、アルカリフォスファターゼ酵素が広く利用されている。かかる酵素は、自由酵素および抗体接合体を含んで各種の形態にて市販されているが、その貯蔵安定性および溶解は制限されることが多い。その結果、アルカリフォスファターゼ酵素接合体は冷凍乾燥されることが多く、ウシの血清アルブミンおよびトウィーン２０のような添加剤を使用して酵素調合剤の安定性を増している。かかる解決策は、ポリペプチドおよびタンパク質薬剤の劣化に対するその抵抗性を増すためにある場合には有益ではあるが、その一般的な適用を妨げる重大な欠点がある。

米国特許第４，１７９，３３７号明細書 米国特許第４，５８５，７５４号明細書 米国特許第４，００３，７９２号明細書 米国特許第４，９６３，３６７号明細書 コンラディ、Ｒ．Ａ．，ヒルガー、Ａ．Ｒ．，ＨＯ，Ｎ．Ｆ．ＨＬ．，およびバートン、Ｐ．Ｓ．，「Ｃａｃｏ−２細胞における輸送に対するペプチド構造体の影響」、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，８，１４５３−１４６０，（１９９１）） アブショウスキーおよびデイビス（「可溶性重合体−酵素付加物」「薬剤としての酵素」中、Ｅｄｓ．ホルチェンベーグおよびロバート、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、ＮＹ（１９８１）） ボッシュ（Ｂｏｃｃｕ）ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１４，１１−１２０（１９８２）において、その他の者 Ｒ．イガーシら、「Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｄ．Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１７，３６６，（１９９０） Ｔ．タニグチら、同上、１９，１０４，（１９９２） Ｇ．Ｊ．ラッセル−ジョーンズ、同上、１９，１０２，（１９９２） Ｍ．バウディスら、同上、１９，２１０，（１９９２） Ｍ．サーファンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２３，１０８１，（１９８６） Ｙ．Ｗ．チェーン（Ｃｈｉｅｎ）の「Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ」１９９２年、ＮＹ、ニューヨーク、マーセル・デッカー サンチャゴ、Ｎ．マイルステイン、Ｓ．Ｊ．リベラ、Ｔ．ガルシア、Ｅ．チャン、Ｔ．Ｃ．ボウマン、Ｒ．Ａ．およびバッハ、Ｄ．「インフルエンザウィルスＭタンパク質（Ｍｌ）微球状体によるネズミの免疫化」アブストラクトＮｏ．Ａ２２１、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｄ．Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９，１１６（１９９２）議事録） バンティンその他の者（「糖尿病マルティアスの治療における膵臓抽出物」、Ｃａｎ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．Ｊ．，１２，１４１−１４６（１９９２）） ブンランジェ・Ｊ、ラングジェア・Ｌ、ヘーブランド・Ｓおよびボーランド・Ａ「インシュリンの化学的安定性、１．薬剤調合剤の貯蔵中の劣化」Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，９，７１５−７２６（１９９２） ブンランジェ・Ｊ、ヘーブランド・Ｓおよびホガード・Ｐ「インシュリンの化学的安定性、２．薬剤調合剤の貯蔵中の高分子量の変性生成物のフォーミュレーション」Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，９，７２７−７３４（１９９２） ロビンズ．Ｄ．Ｃ、クーパー．Ｓ．Ｍ、ファインバーク．Ｓ．Ｅ．およびミードＰ．Ｍ、「インシュリンを使用する糖尿病患者の血液中のインシュリンの供給結合した凝集体に対する抗体」Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３６，８３８−８４１（１９８７） メイジオス．Ｍ、ミード．Ｐ．Ｍ、ガイナー．Ｄ．Ｈおよびロビンズ．Ｄ．Ｃ「タイプ１型糖尿病患者における循環凝集体の発生源は、治療用インシュリンである」。Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，７７，７１７−７２３（１９８６） ラットナーＲ．Ｅ、フィリップス．Ｔ．Ｍおよびスタイナー．Ｍ「高分子量インシュリン凝集体に起因する慢性的な皮膚アレルギー」Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３９，７２８−７３３（1990）

本発明は、生物学的作用を発揮させうるタンパク質の接合体、およびこれを含む医薬組成物を提供することを目的とする。

本発明は全体として、接合安定化させた（ポリ）ペプチドおよびタンパク質組成物およびフォーミュレーション、ならびにその製法および使用方法に関するものである。

より具体的には、本発明はその広い組成物の形態において、共有結合されたペプチド複合体に関するものであり、この場合、ペプチドは例えば、線状ポリアルキレングリコールのような親水性成分をその一体の成分として含む重合体の１または複数の分子に共有結合され、上記重合体は、その一体成分として親油性成分を含む。

１つの特定の形態において、本発明は（ｉ）は線状ポリアルキレングリコール成分と、（ｉｉ）親油性成分とからなり、重合体と共有結合された、生理的に活性なペプチドを含む、生理的に活性なペプチド組成物に関し、ペプチド、線状ポリアルキレングリコール成分および親油性の成分が互いに関して適合可能に配置され、生理的に活性なペプチド組成分中の生理的な活性なペプチドは、生理的に活性なペプチドを単独で使用した場合（即ち、それに結合した重合体がない非接合形態）と比べて、酵素の劣化に対する生体内での抵抗性が向上し得るようにしてある。

もう１つの形態において、本発明は、（ｉ）線状ポリアルキレングリコール成分と、（ｉｉ）親油性の成分とからなるポリソルベート複合体に共有結合された、生理的に活性なペプチドからなる三次元的な適合性を有する生理的に活性なペプチド組成物に関し、生理的に活性なペプチド、線状ポリアルキレングリコール成分および親油性成分は、互いに関して適合可能に配置され、（ａ）親油性の成分が、三次元的形態にて外部から利用可能であり、（ｂ）生理的に活性なペプチド組成物中の生理的に活性なペプチドが、生理的に活性なペプチド単独の場合と比較して、酵素による劣化に対する生体内での抵抗性を増すようにしてある。

更に別の形態において、本発明はトリグリセリド本体成分からなるマルチリガンド接合ペプチド複合体に関し、該複合体は、次のものを含む。すなわち、トリグリセリド本体成分の炭素原子にて結合されたポリアルキレングリコールスペーサ部分を通じてトリグリセリド本体成分と共有結合された生物学的活性のあるペプチド、および、トリグリセリド本体成分の炭素原子に共有結合するように直接、付着され、またはポリアルキレングリコールスペーサ部分を通じて共有結合された少なくとも１つの脂肪酸成分。

かかるマルチリガンド接合ペプチド複合体において、トリグリセリドの生物学的に活性な成分のαおよびβ炭素原子は、直接共有結合し、またはポリアルキレングリコールスペーサ部分を通じて間接的に共有結合された脂肪酸成分を有する。これと代替的に、脂肪酸成分は直接的、またはポリアルキレングリコールスペーサ部分を通じてトリグリセリド本体成分のαおよびα′炭素に共有結合状態で付着され、生物学的ペプチドは、トリグリセリド本体成分のβ炭素に共有結合され、該トリグリセリド本体成分は、直接に共有結合され、またはポリアルキレンスペーサ成分を通じて間接的に結合される。上記の説明の範囲内で、トリグリセリド本体成分からなるマルチリガンド接合ペプチドに対し各種の構造的、組成的および適合可能な形態が可能であることが認識されよう。

かかるマルチリガンド接合ペプチド複合体において、生物学的に活性なペプチドを、アルキルスペーサ基を通じてトリグリセリド変性本体成分と共有結合させることが有利であり、または代替的に本発明の広い範囲内にその他の許容可能なスペーサ基を通じて結合させることもできる。本明細書で使用するように、スペーサ基が許容し得ることは立体化学的、組成物でありかつ最終適用例に特有の許容特性があることを意味する。

更に別の形態において、本発明は、α、α′およびβ炭素原子に共有結合されたトリグリセリド本体を含むポリソルベート成分からなるポリソルベート複合体に関し、該複合体は次の基を含む官能基を有する。すなわち、（ｉ）脂肪酸基、および、（ii）例えば、ポリエチレングリコール基の適当な官能基に共有結合された生理的に活性な成分のような、共有結合された生体的に活性な成分を有するポリエチレングリコール基。

かかる共有結合は、例えば、ポリエチレングリコール基のヒドロキシ端の官能部分に直接結合するか、または例えば、ポリエチレングリコール基のヒドロキシ端を端末カルボキシ官能部分スペーサ基で反応可能にキャップすることにより間接的に共有結合し、形成されるキャップしたポリエチレングリコール基が端末カルボキシ官能部分を有し、生理的に活性な成分をこの官能部分に共有結合し得るようにする。

本発明は更に別の形態において、生理的に適合可能なポリエチレングリコールで変性した糖脂質成分に共有結合された生理的に活性なペプチドからなる、安定的で水溶性の接合ペプチド複合体に関する。かかる複合体において、生理的な活性なペプチドは、ペプチドの自由アミノ酸基にて共有結合により、生理的に適合可能なポリエチレングリコール変性による糖脂質成分に共有結合することができ、ここで可能な共有結合は、生化学的な加水分解および／またはタンパク質加水分解により生体内で分離可能である。生理的に適合可能なポリエチレングリコール変性による糖脂質成分は、例えば、ポリソルベート重合体のようなポリソルベート重合体を含むことが有利であり、この基は、モノパルミテート、ジパルミテート、モノローレート、ジローレート、トリローレート、モノリート、ジオーリート、トリオリート、モノステレート、ジスチレートおよびトリスチレートからなる。かかる複合体において、生理的に適合可能なポリエチレングリコール変性による糖脂質成分は、脂肪酸のポリエチレングリコール・エーテルと、脂肪酸のポリエチレングリコール・エステルとからなる基から選択された重合体を適宜に含むことができ、ここで、脂肪酸、例えばリック、パルミティック、オーリックおよびステアリン酸からなる基から選択された脂肪酸を含む。上記の複合体において、生理的に活性なペプチドは一例として、インシュリン、カルシトニン、ＡＣＴＨ、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、エリスロポエチン、視床下部放出因子、プロラクチン、甲状腺剌激ホルモン、エンドルフィン、エンケファリン、バソプレシン、天然に存在しないオピオイド、スーパーオキシドジムスターゼ、インターフェロン、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、リボヌクレアーゼ、トリプシン、キモトリプシン並びにパパインからなる群より選択されたペプチドにて形成することができる。

もう１つの形態において、本発明は生理的に適合可能なポリエチレングリコール変性による糖脂質成分に共有結合されたインシュリンまたはプロインシュリンからなる安定的で水溶性の接合インシュリン複合体と、薬剤として許容可能な担体とからなるインシュリン不足の治療用の経口投与用の投与形態に関する。

更に別の形態において、本発明はインシュリンが不足する人間または人間以外の哺乳類対象のインシュリン不足を治療する方法であって、生理的に適合可能なポリエチレングリコール変性による糖脂質成分に共有結合されたインシュリン、または共有結合されたプロインシュリンからなる安定的で水溶性の接合インシュリン複合体からなる接合インシュリンの有効量を患者に経口投与する段階を含む治療方法に関する。

本明細書で使用する「ペプチド」という語は、分子量が約１０，０００以下の固有のポリペプチドおよび分子量が約１０，０００以上のタンパク質を含む広義の意味を有するものと解釈し、ここで、分子量は平均分子量とする。本明細書で使用するように、「共有結合した」という語は、特定の成分が互いに直接的に共有結合するか、またはブリッジ、スペーサまたは１または複数の連結成分のような介在する１または複数の成分を通じて相互に間接的に共有結合されることを意味するものである。「接合状態に結合された」という語は、特定の成分が互いに共有結合され、または例えば、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力等により互いに共有結合されることを意味するものとする。

このように、本発明は治療（生体内）用の各種の組成物を対象とし、ここで、接合ペプチド複合体のペプチド成分は、生理的に活性であるか、または生物学的に活性なペプチドである。かかるペプチドを含む組成物において、親水性および親油性成分からなる重合体にペプチド成分を接合させることは、直接的または間接的な（適当なスペーサ基を通じて）共有結合とすることができ、また互いに直接または間接的に共有結合することを含む任意の適当な方法にて、重合体の接合構造体内に構造的に配置することが可能である。このように、所定の最終的な治療目的に必要とされ、または望まれるように、各種のペプチドスペーサを本発明の広範囲の実施に適合させることができる。

もう１つの形態において、上述したような共有結合したペプチド組成物は、診断用または生体外の適用を目的とするペプチド化合物を利用することができ、この場合、ペプチドは、例えば、診断用試薬とし、免疫学的検定またはその他の診断、あるいは生体外の適用のための診断用接合体の相補的なものとすることができる。かかる治療以外の適用例において、本発明のペプチド複合体は、例えば適合可能な溶剤またはその他の溶剤系のフォーミレーション中で調合して、劣化に対する抵抗性が増した安定的な組成物の形態とすることのできる、安定化した組成物として極めて有効に採用される。

上述の治療目的または治療以外の適用例（例えば、診断）の場合、本発明はその広い形態において、共有結合により接合したペプチド複合体に関し、この場合、例えば、ポリアルキレングリコール成分のような親水性成分、および例えば、脂肪酸成分のような親油性成分を上記重合体の一体部分として含む重合体の１または複数の分子にペプチドが共有結合される。１つの好適な形態において、ペプチドは、その一体部分が、例えば脂肪酸成分のような親油性成分である線状ポリアルキレングリコール重合体の１または複数の分子との共有結合により、ペプチドを共有結合させることができる。

もう１つの特別な広い形態において、本発明は非共有的に結合されたペプチド複合体に関し、この場合、ペプチドは例えば、ポリアルキレングリコール成分のような親水性成分および、例えば脂肪酸成分のような親油性成分をその一体部分として含む重合体の１または複数の成分と非共有的に結合する状態にて関係付けられる。該重合体は、上述の共有結合による接合ペプチド複合体中の重合体に関して説明したと同様の各種の構造および配置とすることができるが、ペプチドは、共有結合による方法で重合体分子に結合されず、例えば、関連する結合、水素結合、イオン結合または複合化、ファンデルワールス結合、分子封止または関係付け（特定のペプチド）等のような方法により重合体に関係付けられる。

ペプチド成分および重合体成分のかかる非共有的な結合による関係付けは、例えば、治療（例えば、生体内）適用のため、ペプチド成分を利用し、また、例えば、診断またはその他の（生体外）適用のため、治療用以外のペプチド成分を利用することができる。

このように関係付けられた接合ペプチド組成物において、重合体成分は、当業者の技術範囲内で、選択的な方法にて（例えば、ペプチド毎に重合体を水素に結合可能とするため）、関係付け可能な接合体を提供し得るよう、適宜に構成し、変性し、または適宜に機能を持たせることができる。

本発明のその他の形態、特徴および応用例は、以下の開示および請求の範囲の記載から一層明らかになるであろう。

本発明およびその好適な実施例の詳細な説明 非毒性、非免疫性重合体でペプチドを変性する結果、いくつかの利点が得られる。生成物（重合体−ペプチド接合物）が、その生物学的活性の全てまたは殆どを保つような方法にて変性を行うならば、次のような特性が得られる。即ち、生体の上皮への侵入機能が向上する。変性したペプチドは、タンパク質分解消化およびその後の活性の損失から保護される。生体内在性輸送搬送系統への同化性が増す。胃内の酸性に対する化学的安定性が向上する。重合体の親油性と親水性が最適な均衡状態となる。タンパク質性物質は、上述の改良された特性が付与されたときに、経口投与または非経口投与の後に、代替治療方法として効果的である。また、変性ペプチドを使用して、鼻および皮膚のようなその他の経路を通じての投与も可能である。

治療以外の適用例において、最終用途のペプチド前駆体または中間体またはその他の生成物を含むペプチドの診断用および／または試薬の接合体−安定化により、本発明の方法によりペプチド成分を重合体に共有結合させたときに、それに伴う利点が得られる。この形成された共有結合ペプチドは、溶剤または溶液を媒介させた劣化過程を含む環境的に劣化ファクタに対する抵抗性がある。劣化に対する抵抗性が増す結果、活性ペプチド成分の貯蔵寿命は、著しく引き伸ばすことが可能となり、これに伴い、ペプチドを採用するその特定の最終用途に対してペプチドを含む組成物の効果を増すことができる。

本発明の方法によりペプチドを重合体と共有結合する結果、加水分解による劣化が効果的に最小となり、生体外および生体内の安定化を実現することができる。

本発明の方法により治療、診断または試薬のペプチドを重合体分子と非共有的な結合状態で関係付けて接合させたときに、同様の利点が得られる。

本発明の実施例の一例として、重合体成分に共有結合させたインシュリンを利用することにより、分解可能な化学的共有結合を含む接合の性質により、重合体がペプチド（インシュリン）から分解される時間を制御することが可能となる。この分解は、酵素または化学的メカニズムによって行うことができる。接合した重合体−ペプチド複合体は、その性質上、活性である。重合体をペプチドから酵素で分解した後に完全な活性が得られる。更に、化学的変性により、例えば、インシュリンのような付着したペプチドが細胞薄膜に侵入することが可能となる。

本発明の好適な形態において、親油性の脂肪酸残基の薄膜透過性が増す性質は、接合重合体の本体に組込まれる。この点に関し、対象とするペプチド、インシュリンの脂肪酸重合体の誘導体としてインシュリンを利用する場合にも、同様にインシュリンの腸内で吸収を促進するＰｈｅB1およびＬｙｓB29のアミノ基を長鎖脂肪酸重合体とカルバミル基化すれば、ある程度の低血糖効果がある化合物が得られる。この誘導化により、腸粘膜におけるインシュリンの安定性が増し、また小腸からの吸収性も増す。

上記の説明は、主として本発明の各種の組成物およびフォーミュレーションにおいて、ペプチド化合物としてインシュリンを使用することを説明するものであるが、本発明の有用性はこれにのみ限定されず、本発明の方法にて、共有結合または関係付け可能に接合し得る任意のペプチドにも適用可能であり、これには、次のペプチド、カルシトニン、ＡＣＴＨ、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、エリスロポエチン、視床下部放出因子、プロラクチン、甲状腺剌激ホルモン、エンドルフィン、抗体、ヘモグロビン、可溶性ＣＤ−４、凝固因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、エンケファリン、バソプレシン、天然に存在しないオピオイド、スーパーオキシドジムスターゼ、インターフェロン、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、リボヌクレアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、アルカリフォスファターゼ、および他の適する酵素類、ホルモン類、タンパク質類、ポリペプチド類、酵素タンパク質接合体類、抗体ハプテン接合体類、ウイルスエピトープ類等を含むが、これらのみに限定されるものではない。

本発明の１つの目的は、上述の望ましい特性を得るために、ペプチドとの接合に適した重合体を提供することである。もう１つの目的は、ペプチドを生体内で長時間投与するために変性ペプチドを利用することである。更に別の目的は、ペプチドをその活性のある形態にて経口投与する技術を使用することである。

更に別の目的は、免疫学的検定、診断およびその他の治療以外（例えば、生体外）適用例に使用する関係可能に接合したペプチドを採用することである。本発明の更に別の目的は、各種の生体内および生体外の適用例に適した共有結合による組成物を含む、安定状態に接合したペプチド組成物を提供し、また、各種の生体内および生体外の適用例に適した非共有的な結合状態にて関係付けて接合したペプチド組成物を提供することである。

本発明の広い範囲内において、複数のペプチドと接合させるため、単一の重合体分子を採用することができ、また、本発明の広範囲の実施例において、所定のペプチドに対し接合剤として各種の重合体を使用することが有利であり、かかる方法を組み合わせて採用することも可能である。更に、安定状態に接合させたペプチド組成物は、生体内および生体外の適用例の双方で適用可能である。更に、接合重合体は最終の適用例に適するものとしてその他任意の基、分子またはその他の接合物質を利用することが可能であることが理解されよう。一例として、ある適用例においては、ＵＶ劣化抵抗性、または酸化抵抗性またはその他の特性あるいは特徴を重合体に付与する官能成分を重合体に共有結合することが有用であることがある。更に別の一例として、ある適用例においては、同一の反応性または架橋結合特性を持つようにして、全体的な結合材料の各種の特性または特徴を向上させるため重合体を官能化することが有利である。従って、該重合体は、その所期の目的のため、共有結合した組成物の効果を妨害しない官能、反復基、連結体またはその他の成分構造体を含むことができる。本発明のその他の目的および利点は、次の開示内容および請求の範囲の記載から一層明らかになるであろう。

こうした望ましい特徴を実現するために有用に採用することのできる一例としての重合体について、一例としての反応過程に関して、以下に説明する。共有結合したペプチドの適用例において、重合体は官能化し、次に、ペプチドの自由アミノ酸に結合して、不安定な結合を保って活性を保持することを可能にする不安定な結合体を形成することができる。次に、化学的な加水分解およびタンパク質加水分解により結合を分解すれば、ペプチドの活性が向上する。

本発明に利用される重合体は、食用脂肪酸（親油性の末端）、ポリエチレングリコール（水溶性の末端）、許容可能な糖成分（受容体と相互作用する末端）およびペプチド付着用のスペーサのような分子成分を適宜に含むことができる。選択すべき重合体の内、ポリソルベートが特に好適であり、以下の説明において、本発明の各種の実施例を説明するためにこのポリソルベートを選択する。

もちろん、本発明の範囲は、ポリソルベートにのみ限定されるものではなく、上記の成分を含む各種のその他の重合体を本発明の広い範囲にて有効に採用することができる。重合体構造体において、本発明の目的を失わずにかかる成分の１つを除去し、その他方を保持することが望ましいことがある。かかる措置が望ましい場合、本発明の目的および利点を失わずに除去することが好ましい成分は、糖および／または成分である。

分子量が５００乃至１０，０００ダルトンの範囲の重合体と作用させることが好ましい。

本発明を実施するとき、Ｃ2−Ｃ4アルキル・ポリアルキレングリコール、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のポリアルキレングリコール残基を対象とする重合体系に組込むことが有利である。

こうしたＰＥＧ残基が存在すれば、重合体および対応する重合体ペプチド結合体は親水性となる。タンパク質およびペプチドを安定させる特定の糖脂質が公知である。この安定化のメカニズムは、糖脂質脂肪酸成分をペプチドまたはタンパク質の疎水性領域に関係付けることを含み、このため、タンパク質またはペプチドの凝集が阻止される。また、凝集したペプチドは、天然のペプチドと比べて小腸に吸収される程度が劣ることも公知である。故に本発明は、例えばインシュリンのようなペプチドが重合体の親水性または疎水性残基と接合された重合体−ペプチド生成物を対象とするものである。ペプチドに疎水性領域と関係し得るように重合体の脂肪酸部分が提供され、これにより、溶液中での凝集が阻止される。このため、形成される重合体−ペプチド接合体は安定し（化学的および酵素による加水分解に対し）ＰＥＧ残基のため水溶性であり、また、脂肪酸−疎水性領域の相互作用のため、凝集する傾向がない。

本発明の実施に際し、ポリアルキレングリコール誘導体は、次のポリアルキレングリコール誘導体と関係したとき、重合体−ペプチド接合体を形成するときに多数の有利な特性がある。即ち、水溶性を増すと同時に、抗原性または免疫学的応答性を示さない、高度の生体適合性がある。ポリアルキレングリコール誘導体が生体内で生物学的に劣化することがない。および生物器官による排泄が容易であること。

本発明の実施に採用される重合体は、親油性および親水性成分を含み、形成される重合体−ペプチド接合体を経口投与、非経口投与およびその他の生理的投与方法において、極めて効果的（生体活性的）にし、また、生体以外の適用例でも極めて効果的にする。

以下に示すものは、本発明の重合体−ペプチド接合体の一例であり、その後の参照に便宜なように、接合体１、接合体２、接合体３として示した共有結合による接合体の等式であり、ここで、「ｉｎｓ」は、インシュリン、ｍ、ｎ、ｗ、ｘ、ｙの特定の値は以下に説明する。

接合体１は以下の式で表される。

（式中、ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚ＝２０であり、Ｒはオレイン酸：（ＣＨ3（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7Ｃ（Ｏ）−である。）
接合体２は以下の式で表される。

接合体３は以下の式で表される。

接合体１は、重合体系の中心に市販のポリソルベート・モノオレート、即ち、多くの薬剤の分野で使用される糖誘導体を特徴とする。親油性および吸収性増進特性がオレイン酸鎖により付与される一方、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）残基は、親水性（水素結合促進）環境を提供する。インシュリンは、重合体のＰＥＧ領域に隣接するカーボネート連結体を通じて付着される。

接合体２において、糖残基は除かれるが、インシュリンは再度、重合体の親水性ＰＥＧ領域の隣接するカーボネート結合体を通じてポリマーに付着される。重合体の親油性の脂肪酸領域は、インシュリンへの付着点からある程度離れた位置にある。

結合体２に関して上述した構成は、結合体３の場合、逆となる。この場合も糖残基は除去されるが、この構造体において、親油性の脂肪酸残基はインシュリンへの付着点に最も近い位置にあり、親和性ＰＥＧ領域は同様にカーボネート結合体を通じての付着点から離れた位置にある。

ペプチドに対する重合体の付着点に関して親水性領域および親油性領域を各種の整合状態にすることが、本発明の広範囲の実施にて可能であり、かかる変更により、インシュリンの親油性および親水性領域を均衡性よく保護する重合体が得られる。接合体１、２および３において、重合体間のカーボネート結合体の付着点はＧｌｙA1のアミン官能基であることが好ましい。上述のように、ペプチドの各分子の１つに複数変位の重合体を付着させることが可能である。例えば、第２の重合体をインシュリンに付着させる場合、その付着点は、ＰｈｅB1のアミン官能基を通ることが好ましい。少なくとも理論上、第３の重合体をＬｙｓB29のアミン官能基に付着させることが可能である。しかしながら、インシュリン分子当り２つの重合体を付着させることが妥当な誘導化の最大の限度であることが経験的に確認されている。

本発明の全体的な実施に当り、重合体をペプチドに結合する各種の方法が利用可能であり、これについては、以下に更に詳細に説明する。タンパク質およびポリペプチドを取り扱う場合、ペプチド内の特定の残基基は、その全体的な生物学的完全性の点が重要であることを理解すべきである。かかる残基を不当に妨害しない適当な結合剤を選択することが重要である。場合によっては、結合を阻止し、従って、こうした残基の活性を遮断することが困難であるが、付与された有利な特性を保ちつつ、安定性を増すことの犠牲としてある種の活性は失ってもよい。例えば、生体内への適用例において、投与頻度を少なくして、コストを削減し且つ患者の便宜性を増すことができる。

本発明に従い、タンパク質／ペプチド結合体に利用される重合体は、所望の目的を達成することを可能にする良好な物理的特性を含み得るように設定される。吸収促進剤は、細胞薄膜を通じてペプチドの浸透を可能にする一方、ペプチドの安定性は改善せず、生体内への適用例において、かかる浸透促進剤を使用しないフォーミュレーションにおいて本発明の重合体−ペプチド接合体を利用することができる。このため、本発明の１つの形態は、浸透促進剤を最小にすべく重合体内に脂肪酸誘導体を含めることに関する。

本発明の共有結合による重合体−ペプチド接合体において、ペプチドは不安定な化学的結合により水溶性重合体に共有結合させて付着させることができる。ペプチドおよび重合体のこの共有結合は、化学的または酵素反応により、分解させることができる。この重合体−ペプチド重合体は、許容可能な程度の活性を保持する。重合体がペプチドから完全に分解されたときに、成分としてのペプチドの完全な活性が実現される。これと同時に、接合重合体にポリエチレングリコールの一部が存在して、重合体−ペプチドに対して高度の水溶性および長期に亘る血液循環機能を付与する。糖脂質は、通常、重合体と関係付けられ、その脂肪酸成分がペプチドの疎水性領域を占め、これにより凝集を阻止する。ペプチドが凝集すると、小腸での吸収が不十分となる。凝集しないペプチドは、小腸により、より容易に吸収される。このため、糖脂質を結合重合体に含めることは、安定性を増しかつ接合後のペプチドの凝集を阻止する働きをする。上述の変性は、ペプチドに対して改良された溶融性、安定性および薄膜との親和特性を付与する。こうした改良にかかる特性の結果、本発明は、活性な重合体−ペプチド双方の非経口投与および経口投与を可能にし、また、生体への適用例において、加水分解による分解後に、ペプチドそれ自体の生体利用性を実現する。

以下に説明する実施例に使用される重合体は、ポリエチレングリコール変性による糖脂質およびポリエチレングリコール変性による脂肪酸として種類分けすることができる。好適な接合重合体の内、モノパルミテート、ジパルミテート、トリパルミテート、モノローレート、ジローレート、トリアローレート、モノオレート、ジオレート、トリオレート、モノスチレート、ジスチレートおよびトリスチレートを含むポリソルベートを掲げることができる。各組み合わせから得られる重合体の平均分子量は、約５００乃至約１０，０００ダルトンの範囲であることが好ましい。この実施例に好適な代替的な重合体は、ポリエチレングリコール・エーテルまたはエステルであり、かかる脂肪酸は、ローリック、パルミティックおよびステアリック酸であり、重合体の平均分子量は、５００乃至１０，０００ダルトンの範囲である。重合体には、誘導体基を有することが好ましく、この場合、かかる基は、最後がポリエチレングリコールとなり、または脂肪酸となるようにすることができる。この誘導基は、重合体内に配置することもでき、このように、ペプチドと重合体との間のスペーサー基として機能することができる。

所望の重合体を得るために脂肪酸・ソルビタンを変性させる幾つかの方法について、分子構造体を参照しつつ以下に更に詳細に説明する。ポリソルベートは、ソルビトールのエステルおよびその無水物であり、ソルビトールおよびソルビトール無水物の各分子毎に約２０個のエチレン酸化物の分子で共重合される。以下に、典型的な重合体の構造を示す。

ｗ、ｘ、ｙ、ｚの合計は２０であり、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は各々、ローリック、オレイック、パルミティックおよびステアリン酸基からなる基から独立的に選択され、またはＲ1、Ｒ2は各々ヒドロキシルである一方、Ｒ3はローリック、パルミティック、オレイックまたはステアリン酸基である。これら重合体は市販されており、薬剤のフォーミュレーションとして使用されている。高分子量の重合体が所望である場合、その重合体は、ソルビタン・モノローレート、ソルビタン・モノオレート、ソルビタン・モノパルミテートまたはソルビタン・モノステアレートのような糖脂質および適当なポリエチレングリコールから合成することができる。開始試薬として使用することのできる糖脂質の構造体について以下に説明する。

３つの位置にて、ポリエチレングリコールで置換した糖脂質重合体を構成するとき、端末に２つのフリーのヒドロキシルを有する所望のポリエチレングリコールをトリチル・クロライドの１モルを使用して、ポリジン内のトリチル基にて１つの端末にて保護する。ポリエチレングリコールの残りのフリーのヒドロキシル基は、トシレートまたは臭化物に置換する。所望の糖脂質は適当な不活性溶剤中で溶融させかつナトリウム複合体により処理する。保護されたポリエチレングリコールのトシレートまたは臭化物は不活性溶剤中で溶融させ、過剰な量にて糖脂質の溶液に添加する。この生成物は、室温にて無水物の不活性溶液内でパラトルエンスルホン酸の溶液で処理し、カラムクロマトグラフで精製する。この変換の構造体について以下に説明する。

試薬のモル等量を調整し、かつポリエチレングリコールの適当な分子量範囲を使用することにより、上記の方法により、所望の範囲の分子量を有するモノまたは二置換性の糖脂質を形成することができる。

ここで、ｎおよびｍは各々独立的に変更可能であり、安定化される特定のペプチドに適した値、例えば、１乃至１６の何れかとすることができる。

上述の糖脂質の糖部分は、以下の構造分子式を有するグリセロールまたはアミノグリセロールと、置換することができる。

この変性において、一次アルコールを最初に、ローリック、オレイック、パルミティックまたはステアリックのような脂肪酸成分でエーテル化またはエステル化し、アミノ基は脂肪酸で誘導して、以下に示すようなアミドまたは二次的アミノ基を形成する。

ここで、ｍは例えば１０乃至１６のような任意の適当な値とすることができる。
残りの第１のアルコール基は、トリチル基により保護される一方、第２のアルコール基は、ポリエチレングリコールにより所望の重合体が変換される。

通常、ポリエチレングリコールは、一端に分離する基を有し、その他端にメタオキシ基を有する。ポリエチレングリコールは不活性溶剤中で溶融させ、糖脂質およびナトリウム複合体を含む溶液に添加する。

この生成物は、以下に示すような所望の重合体が得られるように、パラトルエンスルホン酸内で室温にて保護を解除する。

例えば、ポリソルベート・トリオレートのような脂肪酸の２つまたは３つの分子で置換されたポリソルベートと同様の特定の物理化学的性質が得られるよう、ポリエチレングリコール鎖の別の部分に脂肪酸誘導体を含めることが望ましい場合がある。

この重合体を示す構造体は、以下の反応式にてポリソルベートの開放鎖として示してある。

重合体Ａを合成するとき、例えば、ソルケタールのようなグリセロールの第１および第２の炭素にてヒドロキシル成分を保護することが望ましい。残りのヒドロキシル基は不活性溶剤中でナトリウム塩に変換し、ハロゲン化またはトシル化したポリエチレングリコールと反応させポリエチレングリコールの一端からエステルとして保護されるようにする。このグリセロール保護を解除し、形成される２つの自由ヒドロキシル基を対応するナトリウム塩に変換する。これらの塩は、脂肪酸で一部誘導したポリエチレングリコールにて不活性溶剤中で反応させる。自由ヒドロキシルがトシルまたは臭素に変換された後に反応が行われる。

重合体Ｇは、同一の方法で合成されるが、酸の端末炭素にてハロゲン化された脂肪酸のエステルと保護されたグリセロールとを最初に反応させる。

重合体Ｃを合成するとき、１、３−ジハロ−２−プロパノールで開始することが望ましい。このジハロ化合物は不活性溶剤で溶融させ、１モルの脂肪酸成分で予め誘導された２モルのポリエチレングリコールのナトリウム塩で処理する。この生成物は、クロマトグラフ、または透析で精製する。形成される乾燥生成物は、不活性溶剤中でナトリウム水素化物で処理する。このようにして形成されたナトリウム塩は、部分的に保護されたポリエチレングリコールのハロ誘導体と反応させる。

重合体の糖部分を省くことが望ましい場合がある。形成される重合体は、依然としてポリエチレングリコール成分を含む。脂肪酸成分の薄膜親和特性は、固有の脂肪酸を親脂性の長繊維アルキンで置換することにより保持することができ、このため生体適合性が保たれる。この実施例の一例において、２つの端末自由ヒドロキシル基を有するポリエチレングリコールを不活性溶剤中でナトリウム水素化物で処理する。脂肪酸状成分の第１の臭素誘導体の１つの等価重量をポリエチレングリコール溶剤の混合体に添加する。所望の生成物は、不活性溶剤中で抽出し、必要であれば、カラム・クロマトグラフにより精製する。

ここで、脂肪酸とポリエチレングリコールとの間でエステル連結体を形成することが望ましい場合、この酸の酸塩化物は、適当な不活性溶剤中で余剰な所望のポリエチレングリコールで処理する。重合体は、不活性溶剤内で抽出され、必要であればクロマトグラフにより更に精製する。

ある種のペプチドの変性例において、脂肪酸成分をペプチドに直接、接合することが望ましいことがある。この場合、重合体は、脂肪酸分子に置かれた誘導可能な官能基により合成する。不活性溶剤中の適当な分子量のモノメタオキシル・ポリエチレングリコールの溶液は、ナトリウム水素化物で処理し、その後、酸の端末炭素に分離基を有する脂肪酸のエチルエステルを含む溶液を添加する。この生成物は、溶剤抽出後に精製し、必要であれば、カラム・クロマトグラフにより精製する。

希釈酸または塩基で処理することにより、エステルの保護を解除する。

ポリペプチドとのカーボネート結合体を形成することが望まれる場合、当該技術分野で公知の化学的還元法により、カルボキシルまたはエステルをヒドロキシル基に変換する。

ポリペプチド接合体に使用される官能基は、通常、重合体の末端にあるが、場合によっては、その官能基が重合体内に位置することが好ましいことがある。この状況のとき、誘導基がスペーサとして機能する。この実施例の一例において、脂肪酸成分は、炭素αにてカルボキシル基に臭素化して、酸成分は、エステル化することができる。かかる型式の化合物に対する実験方法は、上述の方法と同様であり、以下に示した生成物が得られる。

長いスペーサが望ましいとき、ポリエチレングリコール・モノエーテルをアミノ基に変換し、脂肪酸成分により誘導された無水ケイ酸で処理することができる。所望のポリエチレングリコールを支持する一次アミンは、ｐＨ８．８のナトリウム・リン緩衝液に溶融させ、以下の等式に示すように、置換した無水ケイ酸の脂肪酸成分で処理する。この生成物は、溶剤抽出により分離し、必要であれば、カラム・クロマトグラフにより精製する。

上述の反応過程は、説明の便宜のためにのみ掲げたものであり、本発明の広い範囲の実施に当り、ペプチドを変性するのに有利に使用することのできる、例えば、溶融性、安定性、非経口投与および経口投与のための細胞膜との親和性を達成するために利用することのできる反応剤および構造体に限定するものであると解釈されるべきではない。

本発明は、例えばペプチド、タンパク質、酵素、成長ホルモン、成長因子等のような生物的な活性な長分子、診断用試薬との生体的に適合可能な重合体の結合体を提供するものである。かかる長分子化合物は、１つのアミド連結体内で接合したアルファ・アミノ酸で形成して、ペプチド・オリゴノマーおよび重合体を形成することができる。これら物質の機能に依存して、ペプチド成分は、タンパク質、酵素、成長ホルモン等とすることができる。明確化のため、これらの物質は、全体として以下にペプチドと称し、Ｐｒで表示する。全ての場合、生物学的に活性なペプチドは、フリーのアミノまたはカルボキシル基を含む重合体とペプチドとの結合は、一般に、フリーのアミノ、またはカルボキシル基を通じて行われる。

本発明の説明のために選択したペプチドは、医薬、農業、科学および家庭用並びに工業用の分野で特に有益である。これらのペプチドは、置換治療で利用される酵素、動物の成長促進ホルモン、細胞培養における細胞成長ホルモン、または、例えば、バイオテクノジーおよび生物学的および医療用診断のような各種の分野で使用される活性タンパク質性物質とすることができる。酵素としては、スーパーオキシドジムスターゼ、インターフェロン、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、リボヌクレアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、パパインがあり、ペプチドホルモンとしては、インシュリン、カルシトニン、ＡＣＴＨ、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、エリスロポエチン、視床下部放出因子、プロラクチン、甲状腺剌激ホルモン、エンドルフィン、エンケファリン、バソプレシンがある。

共有結合した生成物を得るための重合体とペプチドとの反応は、容易に行われる。説明の簡略化のため、重合体は（Ｐ）で表示する。重合体がヒドロキシル基を含む場合、重合体は最初にパラ・ニトロフェルカルボネートのような活性なカルボネート誘導体に変換される。この活性な誘導体は、次に、緩やかな条件下で短時間にてペプチドと反応して、生物学的活性を保つカルバミン酸エステルの誘導体を発生する。

上述の反応および試薬は、単に説明のためのものであり、限定的なものではない。ウレタン、またはその他の結合体を生じるその他の活性試薬を採用することもできる。ヒドロキシル基は、当該技術分野で公知の試薬を使用して、アミノ基に変換することもできる。そのカルボキシル基を通じてその後にペプチドと結合する結果、アミドが形成される。

重合体がカルボキシル基を含む場合、該重合体は、混合した無水化物に変換し、ペプチドのアミノ基と反応させ、アミド結合体を含む接合体を形成することができる。その他の方法において、カルボキシル基は、水溶性のカルボジイミドで処理し、ペプチドと反応させ、アミド結合体を含む接合体を生じさせることができる。

ペプチド結合体の活性および安定性は、重合体とペプチドとの分子量比率を変更し且つ異なる分子寸法の重合体を使用する等の各種の方法で変更することが可能である。接合体の溶融性は、重合体組成物に含まれるポリエチレングリコール成分の比率および寸法を変えることで変更することができる。親水性および親油性の特性は、脂肪酸成分とポリエチレングリコール成分とを注意深く組み合わせることにより、均衡させることが可能である。

以下には、本発明の重合体をペプチド接合体との変性反応の幾つかの例が示してある。

Ｉ、ＪおよびＫを含む上記の反応過程において、接合重合体の親水性／親脂性の釣り合わせを変性する手順が明らかにされている。接合重合体内のエステル基は、エステラーゼによる加水分解を受け易く、このため、エステル基を含む接合重合体は、エステル基を加水分解に対する抵抗性の大きいエーテル基に変換することができる。ＬおよびＭを含む反応過程は、ヒドロキシル基をカルボキシル基に変換する状態を示す。この点に関し、カルボキシル基は、ヒドロキシルよりも安定化機能に優れた（イオン調和させた複合体を形成する）カルボキシレート・アニオンを提供し、このアニオンは、かかる複合体からは形成されない。本発明の重合体を含む調和したイオン複合体を形成するためのその他の適当なアニオン源の官能基は、硫酸およびリン酸基を含む。

一般に本発明の重合体−ペプチド接合体の安定特性を向上させるためには、各種の技術を有利に採用することができる。これら技術には、次のものが含まれる。即ち、例えばエステル基をその他の基に変換する上述した例のような重合体を加水分解に対する抵抗性に優れた基で官能基とすること、重合体により安定化されたペプチドに適するように接合重合体の親脂性／親水性の釣り合いを変性すること、および重合体により安定化されるペプチドの分子量に対し重合体の分子量を適正なレベルに調整することである。

本発明を治療目的に適用するために価値のある、ポリアクリレート・グリコール誘導による重合体のユニークな特性は、全体として生体適合性、つまり生理的適合性があることである。重合体は、各種の水溶性の性質を有し、また毒性がない。これら重合体は、非抗原性であり、また、非免疫原性で、酵素の生物学的活性を妨害しない。これら重合体は、血液内で長期に亘り循環し、生体器官から容易に排泄される。

本発明の生成物は、ペプチドの生物学的活性を保持するのに有用であることが、確認されており、例えば、水または許容可能な液体媒体中で溶融させることにより、例えば、治療の投与のために調合することもできる。非経口投与または経口投与により投与される。非経口投与のために微細なコロイド状懸濁液を調合し、滞留効果を提供し、または経口により投与することができる。

凍結乾燥状態において、本発明のペプチド−重合体の接合体は、貯蔵安定性に優れ、また、本発明の接合体の溶液フォーミュレーションも同様に貯蔵安定性に優れることを特徴とする。

本発明の治療用重合体−ペプチド接合体は、そのペプチドの成分が有効であるあらゆる症状または病状の予防または治療のために利用することができる。

更に、本発明の重合体−ペプチド接合体は、生物系あるいは種の成分、状態または病状の診断および非生理系統の診断の目的に利用することが可能である。

更に、本発明の重合体−ペプチド接合体は、植物系の予防または症状あるいは病状の治療に適用することが可能である。一例として、接合体のペプチド成分は、各種の植物系に使用可能であり、殺虫性、除草剤、殺菌剤および／または殺虫剤効果を有する。

更に、本発明の接合体のペプチド成分は、抗体とし、または診断、免疫検定および／または分析目的のために抗原の特性を持つようにしてもよい。

治療目的に使用するとき、本発明はかかる症状または病状があり、またはかかる症状または病状に罹る可能性があり、かかる治療を必要とする動物の治療方法に適用することも可能であり、上記症状または病状の治療に有効である本発明の重合体−ペプチド接合体の有効量をその動物に投与する段階を含む。

本発明の重合体−ペプチド接合体により治療すべき対象は、人間および人間以外の動物（例えば、鳥、犬、猫、牛、馬）の双方を含み、哺乳類であることが好ましく、更に、人間であることが最も好ましい。

対処すべき特定の症状または病状に依存して、動物には、本発明の重合体−ペプチド接合体を任意の適当な治療上有効な投与量で投与し、この投与量は当業者の技術の範囲内で、また、不必要な実験を行わずに、容易に判断することができる。

一般に、治療効果を達成するために化学式１の化合物の適当な投与量は、１日当り、受手の体重１ｋｇあたり１μｇ乃至１００ｍｇの範囲であり、１日当り、体重の１ｋｇ当り１０μｇ乃至５００ｍｇの範囲であることが好ましく、また、１日当り、体重１ｋｇ当り１０μｇ乃至５０ｍｇの範囲であることが最も好ましい。この所望の投与量は、１日の適当な間隔にて２回、３回、４回、５回、６回またはそれ以上に分けて投与することが好ましい。こうした少量ずつの投与量は、単位投与量の形態にて投与することができ、例えば、１０μｇ乃至１０００ｍｇの範囲とし、単位投与量の形態に当り、活性成分の５０μｇ乃至５００ｍｇの範囲であることが好ましく、また、５０μｇ乃至２５０ｍｇの範囲内であることが最も好ましい。これと代替的に、受手の状態が必要とするならば、投与量は連続的な注入として投与することもできる、もちろん、投与方法および投与形態は、所定の治療目的に望ましく且つ有効である化合物の治療量に影響する。

例えば、経口的に投与するときの投与量は、同一の活性成分を非経口投与するときの量の少なくとも２倍とし、典型的に例えば２乃至１０倍とする。

本発明の重合体−ペプチド接合体は、それ自体を投与し、および薬学的に許容可能なエステル、塩およびその他の生理的に有効な誘導体の形態として投与することが可能である。また、本発明は獣および人間の治療の双方に適する薬剤フォーミュレーションを対象としており、このフォーミュレーションは、活性剤として本発明の１または複数の重合体−ペプチド接合体を含む。

かかる薬学的および医療用フォーミュレーションにおいて、活性剤は、薬学的に許容可能な１または複数の担体と共に、および選択随意により、その他の治療成分と共に利用される。該担体は、フォーミュレーションのその他の成分と適合し、その受手に不当に害にならない点で薬学的に許容可能なものでなければならない。活性剤は、上述のように所望の薬理的効果を達成する量にてかつ所望の１日当りの投与を達成するのに適した量にて投与する。

このフォーミュレーションは、非経口投与およびその他の投与法に適したものを含んでおり、具体的な投与方法には、経口、直腸、頬側、局所的、鼻、眼、皮下、筋間、静脈、皮膚、鞘内、関節内、心房内、くも膜下、気管支、リンパ管鞘および子宮内投与がある。経口投与および非経口投与に適したフオーミュレーションであることが好ましい。

液体溶液を含むフォーミュレーションに活性剤を利用するとき、そのフォーミュレーションは、経口または非経口投与することが有利である。活性剤が液体懸濁フォーミュレーションに採用され、または生体適合性担体フォーミュレーションの粉末として採用される場合、そのフォーミュレーションは、経口、直腸または気管支を通じて投与することが有利である。

活性剤が粉末固体の形態にて直接利用される場合、その活性剤は経口投与することが有利である。これと代替的に気管支に対して、担体ガス中に粉末を噴霧して粉末をガス状に分散させ、患者が適当なネブライザー装置を備える呼吸回路からそのガスを吸引するように投与してもよい。

本発明の活性剤を含むフォーミュレーションは、単位投与量の形態にて便宜に提供することができ、また、製薬分野で周知の任意の方法により調合してもよい。かかる方法は、一般に、活性化合物を１または複数の付随の成分を構成する担体と関係付ける段階を含む。典型的にフォーミュレーションは活性化合物を液体担体、微細に粉砕した固体担体、或いはその双方と均一に且つ密接に接触させることにより調合され、次に必要であれば、その製品の形状を所望のフォーミュレーション投与の形態にする。

経口投与に適した本発明のフォーミュレーションは、カプセル、カシュ剤、錠剤またはトローチのような別個の単位として提供することができ、その各々が粉末または粒子または水溶液、またはシロップ、エリキシル剤、エマルジョン、またはドーナツのような水以外の液体中の懸濁液として活性成分の所定の量を含む。

錠剤は圧縮または成形により、選択随意により１または複数の補助的な添加物を加えることにより形成することもできる。圧縮した錠剤は、適当な機械で圧縮し、活性化合物が粉末または粒子のように自由に流動する形態とし、それを選択随意にバインダ、崩壊剤、平滑剤、不活性希釈剤、表面活性剤または放出剤と混合させる。粉末状の活性化合物と適当な担体の混合物からなる成形錠剤は、適当な機械で成形することにより製造することができる。

例えば、スクロースのような糖の濃縮水溶液に活性化合物を添加し、任意の補助的な成分を添加することにより、シロップを製造することができる。かかる補助的な成分は、風味剤、適当な防腐剤、糖結晶化の遅延剤、および、例えばグリセロールまたはソルビトールといったポリヒドロキシル・アルコールのようなその他の成分の溶融性促進剤を含むこともできる。

非経口投与に適したフォーミュレーションは、活性化合物の無菌水溶液調合剤を調合する段階を含み、これは受手の血液に対し等張性であることが望ましい（例えば、生理的な食塩溶液）。かかるフォーミュレーションは、懸濁剤および濃縮剤、または血液成分、または１または複数の器官に対して化合物を標的決めし得るようにしたその他の微粒子系を含むことができる。このようなフォーミュレーションは、単位投与量または多数投与量の形態で提供することもできる。

鼻噴霧機フォーミュレーションは、防腐剤および等張性剤にして活性化合物を精製した水溶液を含む。かかるフォーミュレーションは鼻の粘膜に適合したｐＨおよび等張性の状態に調整することが好ましい。

腸投与のためのフォーミュレーションは、ココアバター、水和化油脂または水和化油脂カルボキシル酸のような適当な担体と共に、座薬として提供することができる。

眼炎用フォーミュレーションは、ｐＨおよび等長性ファクタを眼の状態に適合するよう調整することが望ましい点を除いて、鼻噴霧の同様の方法で調合することができる。

局所用フォーミュレーションは、鉱物油、石油、ポリヒドロキシル・アルコールまたは局所用薬剤フォーミュレーションに使用されるその他の基のような１または複数の媒体中に溶融しまたは懸濁させた活性化合物を含む。

上述の成分に加えて、本発明のフォーミュレーションは、希釈剤、緩衝剤、風味剤、崩壊剤、表面活性剤、濃縮剤、平滑剤、防腐剤（酸化防腐剤を含む）等から選択した１または複数の補助的成分を更に含むことができる。

本発明の治療以外の適用例において、重合体−ペプチド接合体は、ペプチドと重合体成分との共有結合、またはそれと代替的に、非共有的な結合関係を利用することができる。更に、本発明の共有結合した重合体−ペプチド接合体の説明に関係して以下に説明するような適当な投与方法により、治療用ペプチド剤を投与するときに関係付けられたペプチドおよび重合体成分を利用することができる。

かかる治療以外の適用例において、関係付けられたペプチド−重合体成分、即ち、ペプチドおよび重合体成分は、最初に相互に調合して、安定性および劣化抵抗性を向上させることができる。これと代替的に、これらの成分は、例えば、多数成分の別個の成分とし、その成分を使用時点で混合し、その成分が形成される混合体中で重合体とペプチドとが関係可能に結合しないとき、迅速に劣化しまたはその他の劣化作用を受けるようにする。関係したペプチドおよび重合体組成物の形態に関係なく、本発明はかかる関係可能な重合体が存在しないとき、ペプチドの何らかの特性または形態を改善し、或いは、ペプチドの成分に関してペプチドの効果を向上させる関係を対象とする。

従って、本発明は治療以外の適用例の好適な一例として、溶液内のペプチドを生体外で安定化させる適当な重合体を提供することを目的とする。例えば、重合体は、ペプチドの熱安定性を増し且つ酵素による劣化抵抗性を増すために採用することができる。本発明の方法による共有結合を介してペプチドの熱安定特性を促進する結果、貯蔵寿命、室温の安定性、診断および研究用試薬、および例えば、免疫検定キットのようなキットの堅牢さを改善する手段が得られる。具体的な一例として、本発明に従い、アルカリフォスファターゼを適当な重合体に共有結合し、または関係可能に結合させ、生物流体中の抗体または抗原を比色検出するキットの試薬として使用するとき、かかるフォスファターゼに安定性を付与することもできる。

以下に、本発明を実施例を挙げてさらに詳細に説明する。以下の実施例は、本発明を限定するものではない。

［実験例Ｉ］
［接合体１］
ポリソルベート・トリオレート・ｐ−ニトロフェニル・カーボネート ５０ｍｌの無水アセトニトリル中のｐ−ニトロフェニルクロロフォルメート溶液（０．８ｇ、４モル）に乾燥ポリソルベート・トリオレート（７ｇ、４モル）を添加し、次に、ジメチルラミノピリジン（０．５ｇ、４モル）を添加する。この反応混合体は、室温で２４時間攪拌する。低圧下にて溶剤を除去し、形成される析出物は、乾燥ベンゼンで希釈し、セルーテを通じてろ過する。残留物は、乾燥ベンゼン中で一昼夜、冷蔵し、更なる析出物は、ろ過により除去する。溶剤は低圧下にて除去し、残留ベンゼンは低圧にて排出することにより除去し、６．４ｇのポリソルベート・トリオレー卜ｐ−ニトロフェニル・カーボネートが得られるようにする。

インシュリンと活性重合体との結合 蒸留水中の活性ポリソルベート・トリオレートｐ−ニトロフェニル・クロロフォルメート（１ｇ）の溶液に０．１Ｍｐ、Ｈ８．８のリン酸塩緩衝液中のウシインシュリン溶液（５０ｍｇ）を添加する。必要に応じて１Ｎ・ＮａＯＨを添加することにより、ｐＨを保つ。反応混合体は、室温で２．５時間攪拌する。この時点で、混合体はセファデックスＧ−７５を使用して、ゲルろ過クロマトグラフィを行う。０．１Ｍｐ、Ｈ７．０のリン酸塩緩衝液により、溶離させて精製し、自動成分採取器により成分を採取すれば、接合体１が得られる。この重合体の成分は、トリニトロベンゼン・スルホン酸（ＴＮＢＳ）分析により重合体の成分を測定し、また、ビューレット法によりタンパク質の濃度を測定する。重合体とインシュリンとのモル比率は、１対１と測定する。

［実験例II］
［接合体２］
ポリエチレングリコール・モノスチアレートの端末ヒドロキシル基を上述のように、ｐ−ニトロフェニル・クロロフォルメートと反応させることにより、活性化させる。蒸留水中の活性重合体（１ｇ）の溶液に、ｐＨ８．８にて０．１ＭｐＨリン酸塩緩衝液中に溶融させたウシインシュリン（８０ｍｇ）を添加する。

このｐＨは、１Ｎ・ＮａＯＨにより慎重に調整することにより維持する。３時間の攪拌後、反応混合体は余剰なグリシンで急冷して、セファデックスＧ−７５を使用して、ゲルろ過クロマトグラフィを行う。インシュリン−重合体の接合体を採取し、凍結乾燥させた。タンパク質成分は、ビューレット分析法により測定し、定量値を求める。

［実験例III］
［接合体３］
テトラヒドロ−２−（12-bromododecanoxy）−２Ｈピロン ピリジニウムｐ−トルエンスルホン酸塩（Ｐ−ＴＳＡ）を含むジクロロメタン中の１２−ブロモ−１−ドデカノール（１モル）の溶液に、ジヒドロピラン（２モル）を添加する。反応混合体は、２４時間攪拌し、次に水で２回洗浄し、無水ＭｇＳＯ4により乾燥させる。ジクロロメタンを低圧下で除去する。必要であれば、形成される生成物は、シリカゲルによりクロマトグラフィにより精製する。

ポリエチレングリコールとテトラヒドロピラン誘導体との結合 乾燥ベンゼン中に溶融した上述のテトラヒドロピラン誘導体をＮａＨ（１モル）を含む乾燥ベンゼン中のポリエチレングリコール（１モル）の溶液に添加する。反応混合体は、室温にて２４時間攪拌する。その時間後、混合体はベンゼンによりシリカゲルカラムを通じて溶離させる。必要であれば、カラムクロマトグラフィにより更に精製する。保護テトラヒドロピラン基を室温にてｐ−ＴＳＡで処理することにより除去する。必要であれば、カラムクロマトグラフィにより最終生成物を精製する。重合体のヒドロキシル基は、上述のように、ｐ−ニトロフェニル・クロロフォルメートとの反応により活性化させる。インシュリンとの接合は、接合体１に関して説明したように行う。

［実験例IV］
重合体−インシュリン接合体、および自然のインシュリンについてウシインシュリンを使用して比較試験を行い、動物におけるその相対的安定性およびその活性を判断した。動物について研究した場合、重合体−インシュリンの血圧降下の効果を自然のインシュリンの効果と比較した。平均体重２５ｇの雌および雄の白子鼠を一昼夜断食させ、２日間に亘り各種の段階で行った各治療に対し、５匹を１つの群として使用した。

各試験動物による自然のインシュリン（群１、１００μｇ／ｋｇ、皮下注射）、自然のインシュリン（群２、１．５ｍｇ／ｋｇ、ガバージュ）。

接合体１） 群３、１００μｇ／ｋｇ、経口投与）、または接合体１（群４、１００μｇ／ｋｇ、皮下注射）を１回、時間零の時点で投与した。追加の群（群５）には、何れの種類のインシュリンも投与せず、所定の採取時間の３０分前にグリコース３０の負荷を加えた。動物は治療前、一昼夜および研究期間中、断食させた。

試験材料は、リン酸塩緩衝食塩水ｐＨ７．４内で調合した。インシュリンで治療した後、０．５、１、２、４、８および２４時間の所定の採取時間の３０分前に、動物には大量のグルコースの負荷を加えた（５０％溶液として５ｇ／ｋｇ、経口投与）。各動物にインシュリン、または接合体１の１回の投与量、および１回のグルコース負荷量のみが投与されるようにした。所定の採取時間にて、血液を尾血管から採取し、ワンタッチ・デジタル・グルコース・メータ（ライフ・スキャン）を使用して、血糖値を直ちに分析した。その試験結果は、群１−５について、図１に掲げてある。

群１の動物（自然のインシュリン、皮下注射）の血糖値は、３０分の試験時点にて、対照（群５、非処理）動物の約３０％であった。この低血糖効果は、群１の動物にて僅か３．５時間しか継続しなかった。経口投与した自然のインシュリン（群２）は、血糖値を対照の最大６０％まで低下させ、この最大の応答性は、インシュリンで治療した後、３０分の時点で生じる。一方、群３の動物（接合体１、１００μｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）における血糖値は、低血糖活性の見かけの遅延した開始に伴い低下した。群３の動物の低血糖活性は、群３に投与されたインシュリンの投与量が群２に投与された僅か１／１５にも拘らず、群２の動物よりも顕著であった。３時間後の全ての時点にて、群３の動物の血糖値は、その他の治療群よりも低く、４時間乃至８時間の採取時点にて最大の差が生じる。群４の動物（接合体１、１００μｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）の血糖値は、研究の最初の４時間、群１の動物の血糖値と同一の経過であった。４時間後、群２の血糖値は、対照（非処理、群５）の値よりも上廻る一方、８時間にて、群４の血糖値は群５の血糖値の６２％にて以下し、群５の血糖値よりも低い状態を保った。

［実験例Ｖ］
非接合形態のインシュリンおよび接合体１を試験材料として使用して、雄および雌白子鼠についてインシュリンの効果実験を行った。この実験の１つの目的は、接合体１の形態によるインシュリンを皮下注射したときに、インシュリンと同様の方法で血糖値に対する効果があるか否かを判断することである。第２の目的は、自由インシュリンと異なり、接合体１のインシュリン複合体が経口投与したとき、血液の血糖値を低下させる作用があるかどうかを判断することである。その結果は図２に掲げてあり、この場合「インシュリン複合体」は、接合体１を意味する。

断食し未治療の１０匹の白子鼠（雄、雌５匹ずつ）から採取した基準血液検体を採取して、血漿グルコース分析を行った。図２に基準値は、符号「Ｏ」で示してある。３つの追加の群（それぞれ雄、雌５匹ずつ）一昼夜断食させ、ガバーシュによる経口投与でのみグルコースを投与した（体重１ｋｇ当り５ｇ）。投与後、３０分、６０分および１２０分の時点にて、３回、１０匹の動物から血液検体を採取してグルコースの分析を行った。断食した鼠群（雄、雌５匹ずつ、３回の時点の各々で殺して血液分析される）に対して経口投与（ｐ．ｏ．）および非経口（ｓ．ｃ．）の双方で、各投与毎に市販のインシュリンおよび接合体１を投与し、異なる治療群が得られるようにした。この治療、投与経路および図２の実験結果について示した符号は次の通りである。

（i）グルコース（５ｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）、記号「●」、（ii）インシュリン（１００μｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）およびグルコース（５ｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）、記号「▽」、（iii）インシュリン（１．５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）およびグルコース（５ｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）、記号「▽」、（iv）接合体１（１００μｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）およびグルコース（５ｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）、記号「□」、（ｖ）接合体１（２５０μｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）およびグルコース（５ｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）、記号「□」、（vi）接合体（１．５ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）およびグルコース（５ｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）、記号「△」。接合体１のこうした試験において、投与した溶液中のタンパク質の濃度は、０．１ｍｇタンパク質／ｍｌ溶液であり、比較の目的のため、０．７８ｍｇタンパク質／ｍｌ溶液の投与した溶液中のタンパク質濃度である変性共有結合によるインシュリン−重合体接合体が含まれる。（vii）変性結合体１（１００ｐｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）およびグルコース（５ｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）、記号「△」。

インシュリンは、グルコースの負荷を加える前の１５分の時点で投与した。グルコースは、５ｇ／ｋｇの投与量にて、基準動物群を除く全ての群に、ガバージュにより経口投与した（標準的な食塩水中の５０％ｗ／ｖ溶液の１０ｍｇ／ｋｇ）。インシュリンをガバージュにより経口投与したとき、その投与量は１．５ｍｇ／ｋｇとした（標準的食塩水中の０．００８％ｗ／ｖ溶液の１８．８５ｍｌ／ｋｇ）。インシュリンを皮下注射で投与したときその投与量は１００μｇ／ｋｇとした（標準的食塩水中の０．００４％ｗ／ｖ溶液の２．５μｌ／ｋｇ）。

接合体１重合体−インシュリン複合体をｇａｖａｇｅにより経口投与したとき、その投与量は１．５６ｍｇ／ｋｇ（非希釈試験材料の２．０ｍｌ／ｋｇ）の投与量で投与した。接合体１の重合体−インシュリン複合体を皮下注射により投与したとき、その投与量は、１００μｇ／ｋｇ（投与した０．７８ｍｇ／ｍｌ溶液を１対１０で希釈した１．２８μｌ／ｋｇ）。または２５０μｇ／ｋｇ（投与した溶液の１対１０で希釈した分の３．２０ｍｌ／ｋｇ）。変性した接合対１は、０．１ｍｌ／ｋｇのインシュリン／ｍｌを含み、１．０ｍｌ／ｋｇの量にて投与し、１００μｇ／ｋｇの投与量とした。

ジェミニ遠心力分析、および市販のグルコース試薬キットを使用して、グルコースを測定した。この分析と共に、ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅにより触媒作用を加えたＡＴＰとグルコースとの反応に基づき、酵素分析を行い、また、グルコース−６−リン酸塩脱水反応を行い、ＮＡＯＨを得た。同様の検体を分析し、その平均値を求めた。一部の血漿検体は、特定の検体における極めて高いグルコース濃度を判断するため、希釈（１対２または１対４）が必要であった。

グルコースの負荷を加えた後、３０分にて平均血漿グルコース値は、高濃度となり、６０分にて低下し、１２０分にて基準値以下となった。市販のインシュリンを皮下注射で投与した場合（体重１ｋｇ当り１００μｇ。これは、血糖値の上昇を防止するのに極めて効果的であった）。しかしながら、インシュリンを経口投与したとき（１．５ｍｇ／ｋｇの多量の投与量にて）、血糖値の上昇に対する効果は全くなかった。インシュリン、タンパク質は、消化経路内で容易に加水分解され、血流中に完全な状態で吸収されないから、このことは予想された。

接合体１を１００または２５０μｇ／ｋｇの投与量の何れかにて皮下注射したとき、該接合体はグルコースの負荷を加えた後、血糖値の上昇を制限するのに極めて効果的であった。３０分および６０分双方の時点にて、接合体１を１００μｇ／ｋｇ投与した後、１００μｇ／ｋｇの自由インシュリンを投与した場合よりも平均血漿血糖値は著しく低下した。接合体１を２５０μｇ／ｋｇ投与したときの平均血漿血糖値は低く、３０分の時点で著しくはないが、６０分の時点では著しく低く、１２０分の時点で基準値に戻った。自由インシュリンを１００μｇ／ｋｇ、および接合体１を１００μｇ／ｋｇの双方共に投与したとき、１２０分の時点での血糖値は基準値以下であった。

変性接合体１を１００μｇ／ｋｇの投与量で投与したとき、３０分の時点で血糖値は著しく低下した。

［実験例VI］
［ポリソルベート・モノパルミテートのパラーニトロフェニル・カルボネートの調合］
最初に乾燥ベンゼンを使用する共沸により、ポリソルベート・モノパルミテートを乾燥させる。

１０ｍｌの乾燥ピリジン内の乾燥重合体（２ｇ、２モル）の溶液に、パラ−ニトロフェニルクロロフォルメート（０．６ｇ、３モル）を添加する。この混合体を室温にて２４時間、攪拌する。反応混合体は、氷で冷却し、乾燥ベンゼンで希釈して、フィルタを使用してろ過する。この手順を反復し、最終的に、回転蒸発器にて溶剤を除去する。残留する溶剤は、真空吸引器で除去する。生成物の量は１．８ｇである。

［実験例VII］
［インシュリンとのポリソルベート・モノパルミテート接合体の調合］
上述した実験例１の接合反応手順に従い、１ｇの量のポリソルベート・モノパルミテートおよび８０ｍｇのインシュリンを使用し、反応生成物をＨＰＬＣで分離すると、インシュリン−ポリソルベート・モノパルミテートの共有結合した接合体が得られる。

［実験例VIII］
［酵素−重合体接合体の調合］
実験例１の接合体１に関して説明した方法と同一の方法を使用して、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）を重合体に結合させた、更に、重合体対タンパク質の比率を高くするかまたは低くする何れかが有利かを判断するため、１４０モルの重合体／酸素モルと、１４モルの重合体／酵素モルを使用して接合体を調合した。接合体ＡＰの分子当りの重合体群の数は、重合体の高および低比率に対し、それぞれ３０および５である。

アルカリフォスファターゼの約５群／分子を得るために、次の手順を採用した。０．０５Ｍナトリウム・バイカーボネートに４．１ｍｇ（無塩分）を溶融させた。水／ジメチル−スルホキシド内でこの溶液に活性重合体（０．７５ｍｇ）を添加し、その溶液を室温にて３乃至１２時間、攪拌した。形成された反応混合体を、透析管（ＭＷカットオフ１２，０００−１４，０００）内で１２時間に亘り塩溶液（０．３Ｎ・ＮａＣｌ）に対して透析し、透析溶液は４乃至６回交換した。高比率に対して同一の手順を行った。透析材料の総タンパク質濃度は、ビューレット法により測定した。

［活性の測定および安定性の試験］
Ａ．ボーラー（ｖｏｌｌｅｒ）その他の者の文献ＷＨＯ、５３、５５（１９７６）方法に従い、フォスファターゼ分析を行った。マイクロウェルのアリコット（５０μｌ）を添加し、２００μｌの基礎溶液（２０％のエタノラミン緩衝液内の４−ニトロフェニルリン酸塩、１０ｇ／ｌ、ｐＨ９．３）と混合させ、室温にて４５時間、保温した。５０μｌの３Ｍ・ＮａＯＨにより反応を停止させた。この吸収率は、マイクロプレート読取り装置内で４０５ｎｍにて測定した。

フォスファターゼの活性を各種の条件下で天然の酵素と比較した。同様の濃度のアルカリフォスファターゼおよびアルカリフォスファターゼ−重合体接合体を含む希釈溶液を各種の温度で貯蔵した。酵素の活性を定期的に試験した。５℃、１５℃、３５℃および５５℃で試験した２種類の重合体を５℃で貯蔵した対照アルカリ・リン酸塩と比較した。

表Ａから理解されるように、双方の重合体の最初の酵素活性は、対照剤よりも約３倍大きい値であった。双方の重合体−酵素接合体は、自然の酵素よりも熱安定性が優れていて、これは重合体対酵素の比率が高いことを特徴とする接合体の場合、特に顕著である。

［実験例IX］
［接合体１］
Ａ．ｐＨ９．２の０．０５Ｍナトリウム・バイカーボネート緩衝液中のインシュリン溶液（５０ｍｇ）に水−ジメチルスルホキシド中の活性重合体溶液（１ｇ）を添加し、室温にて３時間、攪拌した。この混合体のｐＨは、１Ｎ・ＮａＯＨにより慎重に調整することにより維持する。次に、この反応混合体を０．１Ｍ−ｐＨ７．０のリン酸塩緩衝液で透析する。精製された生成物を凍結乾燥する。ビューレット検定法により、タンパク質含有量（４８ｍｇ）を測定する。インシュリンに結合された重合体鎖の数は、ＴＮＢＳ検定により求め、重合対２モル対インシュリン１モルの比率となるようにする。

［実験例XVI］
次の方法にて、糖尿病（ＢＢ）鼠モデルにて、重合体−インシュリンを評価する。ＢＢ鼠は、人間のインシュリン依存性糖尿病の信頼性の高いモデルである。

ＢＢ鼠は、毎日、経皮的（ｓｃ）にインシュリン投与を行わないと、２日以内で死亡する。１４日間の試験中、ｓｃインシュリンを停止し、動物を、低（１００μｇ／ｋｇ／日）、中（３ｍｇ／ｋｇ／日）、高（６ｍｇ／ｋｇ／日）の量の経口投与による重合体−インシュリンの治療に切り替えた。その結果（平均生存時間）が図６に掲げてある。ｓｃから経口投与に急激に切り替えることは、重合体インシュリンの特に苛酷な試験である。その結果から、低投与量の動物は、生存するために十分なインシュリンが受けられず、中程度の投与量の群は、生存時間が多少伸び、高投与量群の一部の動物は、経口投与した重合体インシュリンの投与を受ける試験の期間中（１４日間）、生存したことが分かる。重合体インシュリンは、好適でないフォーミュレーションにてガバージュ投与した。また、この試験の結果から、ａｍ血糖値と比べてｐｍが著しく低下し、また、１回大量に投与するのではなく、１日に何回も分けて投与した場合、動物を一層良くコントロールし得ることが分かった。重合体−インシュリンを正常な（糖尿病でない）動物に毎日投与する結果、ａｍ血糖値が著しく低下する。

本発明を実施する最良の形態 本発明の現在の好適な接合体安定化によるポリペプチド重合体組成物およびフォーミュレーションは、共有結合したペプチド複合体に関し、ここでペプチドはその一体部分として例えば、線状ポリアルキレングリコールのような親水性成分を含む重合体の１または複数の分子に共有結合され、また、該重合体は、その一体部分として親油性成分を含む。

本発明の特に好適な形態は、重合体と共有結合した生理的に活性なペプチドを含む生理的に活性なペプチド組成物に関し、該重合体は次のものを含む。即ち、（Ｉ）線状ポリアルキレングリコール成分と、（II）親油性成分とである。ここで、ペプチド、線状ポリアルキレングリコール成分および親油性成分は、互いに関して調和状態に配置され、生理的に活性なペプチド組成分中の生理的に活性なペプチドは、生理的に活性なペプチド単独の場合と比較して（即ち、結合した重合体が存在しない接合体の形態のとき）、酵素による劣化に対する体内抵抗性が増大している。

更に、好適な形態において、本発明は、次のものを含むポリソルベート複合体と共有結合した生理的に活性なペプチドからなる３次元的に調和した生理的に活性なペプチド組成物に関する。即ち、（ｉ）線状ポリアルキレングリコール成分と（ii）親油性成分とであり、ここで生理的な活性なペプチドは、線形ポリアルキレングリコール成分および親油性成分は、互いに関して調和可能に配置され、親油性成分が３次元的に調和した状態で外部から利用可能であり、また、（ｂ）生理的に活性なペプチド組成物中の生理的に活性なペプチドは、生理的に活性なペプチド単独と比べて酵素による劣化に対する体内抵抗性が増大している。

更に別の好適な形態において、本発明はトリグリセリド本体成分と炭素原子にて結合されたポリアルキレングリコールスペーサ基を通じてトリグリセリド本体成分に共有結合された生物学的に活性なペプチドを有するトリグリセリド本体成分からなるマルチリガンド接合ペプチド複合体に関し、該複合体は、トリグリセリド本体成分の炭素原子に直接共有結合されるか、またポリアルキレングリコールスペーサ成分を通じて共有結合された少なくとも１つの脂肪酸成分からなっている。かかるマルチリガンド接合ペプチド複合体において、トリグリセリド生物学的活性成分のαおよびβ炭素原子は直接共有結合させて付着され、またはポリアルキレングリコールスペーサ成分を通じて間接的に共有結合された脂肪酸成分を含むことができる。これとは別に、脂肪酸成分は直接、またはポリアルキレングリコールスペーサ成分を通じてトリグリセリド本体成分のα炭素に共有結合することができ、生物学的に活性なペプチドは直接共有結合させ、またはポリアルキレンスペーサ成分を通じて間接的に共有結合されてトリグリセリド成分のβ炭素に共有結合される。

本発明の産業上の利用可能性 本発明は本明細書に開示された接合安定ペプチド組成分を薬剤の経口投与およびペプチドは不十分な病状の治療に使用することを目的とするものである。

図１は、インシュリン自体および複合体の形態にて投与するため、分を単位とする時間を関数として、血漿グルコース量をｍｇ／ｄＬの単位で示すグラフである。 図２は、インシュリンを各種の形態にて投与する時間（時間）を関数とする血漿グルコース量のｍｇ／ｄＬ単位で示す図である。 図３は、糖尿病の鼠における重合体−インシュリンの効果の棒グラフを示す図である。

Claims (12)

1. ペプチドが、１以上の天然に存在しないポリマー分子に接合されるように結合されたポリマーペプチド接合体であって、該ポリマー分子が、親油性の部分と親水性の部分を含み、該ポリマー分子が以下の式で表されるポリマーペプチド接合体。
   

   

   （式中、ｗ、ｘ、ｙ、ｚの合計は４〜１００であり、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₃は、ラウリン酸基、オレイン酸基、パルミチン酸基およびステアリン酸基からなる群からそれぞれ独立して選択され、または、Ｒ₁、Ｒ₂は各々ヒドロキシルである一方、Ｒ₃はラウリン酸基、パルミチン酸基、オレイン酸基またはステアリン酸基である）
2. 前記ペプチドが生理的に活性な治療用ペプチドである請求項１に記載のポリマーペプチド接合体。
3. 前記ペプチドが、インビボあるいはインビトロで、ある症状あるいはある成分の有無を反応により決定するために用いられる診断用ペプチドである請求項１に記載のポリマーペプチド接合体。
4. 前記ペプチドが、植物またはその成分中で活性である請求項１に記載のポリマーペプチド接合体。
5. 前記ペプチドが、生理的に活性なペプチドであって、該生理的に活性なペプチドが、生理的に活性なペプチド単独の場合と比較して、前記ポリマーペプチド接合体中で、増強されたインビボにおける酵素分解耐性を有するように、前記親油性の部分と前記親水性の部分とのコンフォメーションが決定されている請求項１に記載のポリマーペプチド接合体。
6. 前記ペプチドが、５００〜１００００ダルトンの分子量である請求項１に記載のポリマーペプチド接合体。
7. 前記ペプチドが、インシュリン、カルシトニン、ＡＣＴＨ、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、エリスロポエチン、視床下部放出因子、プロラクチン、甲状腺剌激ホルモン、エンドルフィン、エンケファリン、バソプレシン、天然に存在しないオピオイド、スーパーオキシドジムスターゼ、リボヌクレアーゼ、並びにパパインからなる群より選択される請求項１に記載のポリマーペプチド接合体。
8. 前記ペプチドが、インシュリンである請求項１に記載のポリマーペプチド接合体。
9. 前記ペプチドが、カルシトニンである請求項１に記載のポリマーペプチド接合体。
10. 生理的に活性なペプチドが、（i）親水性の線状ポリアルキレングリコール部分と、（ii）親油性部分とを含むポリソルベート複合体に共有結合的に結合されたポリマーペプチド接合体であって、該ポリソルベート複合体が、以下の化学式、
    

    

    （式中、ｗ、ｘ、ｙ、ｚの合計は４〜１００であり、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₃は、ラウリン酸基、オレイン酸基、パルミチン酸基およびステアリン酸基からなる群からそれぞれ独立して選択され、または、Ｒ₁、Ｒ₂は各々ヒドロキシルである一方、Ｒ₃はラウリン酸基、パルミチン酸基、オレイン酸基、またはステアリン酸基である）
    で表される重合体であり、
    前記生理的に活性なペプチドと、前記線状ポリアルキレングリコール部分と、前記親油性部分とが、（ａ）該線状ポリアルキレングリコール部分が、外側から利用できるように、また（ｂ）該生理的に活性なペプチドが、インビボにおいて、生理的に活性な治療用ペプチド単独のときと比べて増強された酵素分解耐性を有するように、相互のコンフォメーションが決定されている生理的活性ポリマーペプチド接合体。
11. 請求項１〜１０に記載の接合体のインシュリン欠乏症治療用経口製剤であって、前記ペプチドがインシュリンである製剤の製造のための使用方法。
12. 請求項１〜１０に記載の接合体と、担体または希釈剤とを含み、前記ペプチドがインシュリンである、インシュリン欠乏症治療用経口製剤。

Images