JP4013333B2 - Method for measuring skin aging and measuring kit - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、皮膚の老化度の測定方法に関する。より詳細には、皮膚細胞から抽出したＤＮＡを増幅させ、増副産物の平均分子量を測定し、テロメア長を求めることによって、皮膚の老化度を測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生物では、加齢に伴って生理的機能の変化、通常は生理的機能の低下、すなわち老化が起こる。個々の細胞レベルにおいても、細胞の形質、機能の退行とそれに続く細胞死あるいは増殖停止が起こるまでの過程と定義される老化が起こる。こうした老化現象の原因は、細胞の代謝障害等の他に、細胞内ＤＮＡの傷害と修復機能の低下などが一因であると考えられている。
【０００３】
このような細胞の老化については、すでにいくつかの知見が得られている。すなわち、Goldsteinの総説では、ヒト二倍体繊維芽細胞においては、細胞周期のG1/S境界の停止が起こるために、複製による老化、すなわち分裂加齢が速いことが報告されている(S.Goldstein, Science, 249:1129-1132(1990)) 。また、異なるヒトのドナーから得られたヒトの繊維芽細胞をin vitroで培養できる株として樹立して増殖させると、細胞の継代を重ねたときにテロメアが短くなり、この短縮が細胞の寿命と関連することも報告されている(R.C.Allsop, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10114-10118(1992))。ここで、テロメアとは、末端小粒ともいわれる染色体の末端領域をいい、多くの場合には単純な反復配列からなる。真核生物の染色体の安定性に必須の領域である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
したがってテロメア長から老化度を推定できると考えられるが、このようなテロメア長を、簡便かつ迅速に測定することができる方法はこれまで知られていない。
Allsopらは、外科手術やバイオプシーによって得られた皮膚細胞を初代培養し、継代を繰り返して老化させたときに、テロメアにどのような影響が現れるかを通常のＰＣＲ法およびプローブ法によって調べている。
【０００５】
具体的には、Allsopらは、細胞の継代を繰り返した後に、ＤＮＡを抽出して制限酵素で消化し、Matherらの方法を改変した方法で放射性同位体（ＲＩ）標識プローブをハイブリダイズさせ、ＸＡＲ−フィルムを１〜２日間感光させた後にデンシトメトリーでオートラジオグラムを検出する方法を採用している。この方法では、かなりの量のＤＮＡを必要とし、また、標識としてＲＩを使用するために時間と手間がかかる。
したがって、少量のＤＮＡを使用してテロメア長を短時間のうちに正確に知ることができる方法を確立し、老化とテロメア長との関連を明確にすることに対する要請がある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明の発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、痛みもなく、痕跡も残らないように採取した微量の皮膚組織細胞からのＤＮＡを用いて、テロメア長を簡易かつ迅速に測定することができる方法を見出し、本発明を完成したものである。
【０００７】
すなわち、本発明は、皮膚擦過屑片から抽出したＤＮＡを制限酵素処理して得た１つの付着末端とテロメア特有3'突出末端とを有する断片の両末端を末端修飾によってリンカーを含む平滑末端断片とする工程と、前記平滑末端断片をＰＣＲで増幅する工程と、ここで得られた少なくともテロメア全配列を一部に含む増幅産物を泳動分離し、その分布を標識プローブで検出して平均テロメア長を求める工程とを備える、皮膚の老化度の測定方法であって、付着末端側のリンカーのプラス鎖が塩基配列
5' AATCCGTCGAGCAGAGTTC 3' （配列番号３）
を含み、増幅工程で用いるセンスプライマーが、前記付着末端側のリンカーに含まれるヌクレオチド配列を有し、増幅工程で用いるアンチセンスプライマーが、前記突出末端側のリンカーに含まれるヌクレオチド配列を有する皮膚の老化度の測定方法である。
【０００８】
ここで、上記制限酵素は、HinfI、MspI/HpaII、およびRsaIからなる群から選ばれる制限酵素であることを特徴とする。さらに、上記平滑末端断片は、上記付着末端と相補的な付着末端を有する二本鎖オリゴヌクレオチドからなるリンカーを上記付着末端と結合させ、かつ、上記突出末端を有する断片の突出末端の3'側から６〜24塩基の配列に相補的な5'-CCCTAA-3'の反復配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチド部分の5'側に二本鎖の３〜12塩基対のオリゴヌクレオチドを連結させ、これをプライマーとしてＤＮＡポリメラーゼで両端が平滑末端の二本鎖オリゴヌクレオチドとして得られることを特徴とする。
【０００９】
本発明においては、上記制限処理したＤＮＡを、前記リンカーとＤＮＡポリメラーゼとを用いて平滑末端としてもよく、上記付着末端および突出末端と相補的な配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチドをリンカーとして用いて平滑末端としてもよい。
【００１０】
また、上記増幅工程で用いるセンスプライマーとアンチセンスプライマーとは、上記の二種のリンカーに各々含まれるヌクレオチド配列を有することを特徴とする。
具体的には、上記プライマーは、配列番号３および４に記載のヌクレオチド配列を有することが好適である。
【００１１】
本発明はまた、皮膚擦過屑片から抽出したＤＮＡを制限酵素処理して得たテロメア含有ＤＮＡ断片を、放射性同位体、蛍光化合物及び化学発光化合物からなる群から選ばれる標識で標識されたテロメア検出用標識プローブで検出する皮膚の老化度の測定方法である。
【００１２】
具体的には、上記テロメア標識プローブは、配列番号５〜13に記載のヌクレオチド配列を有することが好適である。
上記テロメア標識プローブは、放射性同位体、蛍光化合物及び化学発光化合物からなる群から選ばれる標識で標識された 5'-(TTAGGG)n -3'および／または5'- (TAACCC)n -3'（ｎは３〜５の整数を表す）であることが、さらに好適である。
【００１３】
また、上記標識プローブは、標識プローブとしての 5'-(TTAGGG)n-3'および／または 5'-(TAACCC)n-3' （ｎは３〜５の整数を表す）と相補的な塩基配列と前記塩基配列に隣接する制限酵素認識配列とを有するテンプレート、当該制限酵素認識配列を含むプライマー、および［α-3Ｈ］dNTPを少なくとも含有する基質にＤＮＡポリメラーゼを作用させて反応産物を得、当該反応産物に当該制限酵素を作用させて得られることを特徴とする。
【００１４】
本発明はまた、皮膚擦過屑片採取用器具と、ＤＮＡ抽出用溶液とを含むチューブとの少なくとも２つを含み、上述した方法を実施するための皮膚の老化度測定用キットである。このキットはさらに、ＤＮＡ増幅用ミックスを含むチューブを含んでもよい。このキットの増幅用反応ミックスは、EGTAと、内部標準品と、TS遺伝子タンパク質と、配列番号３のプライマーを含むＰＣＲ溶液をワックス上層とし、配列番号４に記載のプライマーを含むＰＣＲ溶液をワックス下層として反応容器内に含むことを特徴とする。
【００１５】
本発明は、さらに、ソーンを植え込んだ様式の頭部と、頭部と連結された把持部とを含むラスプを皮膚擦過屑片採取用器具とすることを特徴とする皮膚の老化度測定用キットである。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本明細書において「老化」とは、 紫外線・過酸化脂質・虚血などによって誘発されるＤＮＡの障害もしくは細胞の障害、及びＤＮＡの複製、細胞分裂に伴う細胞増殖速度の低下、増殖余力の低下によるものをいい、光老化、フリーラジカル老化などが含まれる。
ここで、「増殖余力の低下」とは、通常、遺伝的に定まっている細胞の増殖可能な分裂回数（累積回数）に対して、ある細胞が今後増殖できる回数をいう。
【００１７】
本発明では、テロメア長を測定するために、皮膚擦過屑片又は皮膚細胞から抽出したＤＮＡを使用するが、これらの皮膚擦過屑片は生体から得られたものである。「皮膚擦過屑片」とは、任意の部位の皮膚表面を、痛みもなく、出血もせず、また、痕跡も残らずに擦過して得た角化細胞などの細胞又はその一部をいう。また、本発明においては、in vitroで継代が可能な株化細胞、及び摘出生体組織から取得した初代培養細胞組織から得られたＤＮＡを使用してもよい。これらの材料から得られたサンプルを、以下、「皮膚擦過屑片等」という。
【００１８】
また、これらの皮膚擦過屑片等は、いかなる方法によって得られたものであってもよい。例えば、後述するラスプやサンドペーパーなどで皮膚表面を擦過して得ても良く、また、外科的手術やバイオプシーなどによって得られた組織又はその一部を使用してもよい。
本発明においては微量のＤＮＡのテロメア長を測定することが可能であるため、皮膚擦過屑片等を好適に使用することができる。
【００１９】
これらの皮膚擦過屑片等を採取する部位は、顔、上腕部、背部、臀部、大腿部その他の各種部位を挙げることができるが、これらの部位に限定されるものではない。したがって、顔などのように日光に曝されることが多い部位と、臀部などのように日光に曝されることが少ない部位とから採取した皮膚から得たＤＮＡの各テロメア長を比較することによって、細胞の光老化度等を調べることが可能となる。
また、頬骨頂部上、起立位または座位での目尻の鉛直線と小鼻上端の水平線との交叉部位の皮膚等を選択（図３）すると、美容のための皮膚の老化度を測定することもできる。
【００２０】
皮膚擦過屑片は、例えば、採取専用の器具（ラスプ）を用いると、痛みも出血もなく、痕跡も残らずに採取することができる。以下に、ラスプを用いて皮膚擦過細胞屑片を採取する場合を例に挙げて説明する。
すなわち、ラスプは、図１Ａに示すような構造を有する皮膚擦過用の器具である。ラスプ10は、ソーン２を植え込んだ頭部４およびこの頭部と連結された把持部６とからなり、頭部と把持部とは分離し得るように連結されている。
【００２１】
ここで、ソーンとは、皮膚擦過片を得るためにラスプの頭部に植え込まれる繊維をいう。ソーンの材質は、皮膚を痛みも出血もなく、痕跡も残らないように擦過して皮膚擦過屑片等を採取することができるものであればよく、特に限定されないが、滅菌可能であること及び製造コストの面から、ポリプロピレン、ポリアクリル、ポリエチレン、アルミニウム、ステンレス18-8などを使用することが好ましい。
【００２２】
また、ソーンの先端部分は、図１Ｃに示すように直径約1〜10μmの繊維状物質からなり、その先端は鋭角状をなしている。この角度は最大30°であり、0.2〜５°とすると、皮膚を痛みも出血もなく、痕跡も残らないように擦過して皮膚屑片を採取する上で好適である。
【００２３】
ラスプの頭部の形状は、円盤状、楕円盤状、正方板状、直方体など、いかなる形状であってもよく、特に限定されない。大きさは、採取できるＤＮＡの量の関係から、円盤状または正方板状の場合には直径が５〜20mmまたは一辺が５〜20mm、楕円盤状の場合には長軸半径が５〜20mmかつ短軸半径が１〜５mm、または長方形板状体の場合には一辺が１〜５mm×５〜20mm程度であることが好ましい。
【００２４】
厚みは、後述する把持部と結合できる程度であればよく、特に限定されないが、１〜８mm程度が好ましい。
皮膚を擦過して皮膚擦過屑片を採取するために、上記のような形状の頭部に上述したソーンを約25〜225本/cm2、頭部の植え込み面からの長さが約１〜５mmとなるように、植え込む。植え込みは、当業者に公知の方法で行えばよい。
【００２５】
このように形成した頭部に、手で持つことができる把持部を、頭部と分離し得るように連結する。把持部の大きさは、手で持つことができる程度であればよく、特に限定されないが、具体的には、長さが30〜100mm、直径２〜８mmの円柱状、長軸半径が５〜20mmかつ短軸半径が２〜10mmの楕円柱状、または一辺３〜15mmの角柱状などのものを挙げることができる。
【００２６】
このような把持部は、ラスプの頭部とは別個に成形してもよく、頭部と一体成形してもよい。頭部と別個に成形する場合には、例えば、上記の頭部のソーンを植え込んでいない面に把持部の一端をはめ込むか、または捩じ込むように連結することができる。また、一体成形する場合には、例えば、ピンセットなどで外力を加えることにより、この頭部を容易に切り離すことができるように、頭部と把持部との間に適当な深さの切り込み８（図１Ｂ参照）を入れておくことが好ましい。
【００２７】
ラスプの作製に使用する材料は特に限定されないが、入手、成形及び成形品の滅菌が容易であること、また、使い捨てであるラスプの製造コストを抑える必要があることから、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリル、ポリ塩化ビニルなどのプラスチック、アルミニウム、スチール、ステンレスなどの金属を好適に使用することができる。
特に、ポリプロピレンまたはアルミニウムなどで作製すると、ラスプの製造コストが安く、又は滅菌が容易であるという利点がある。
【００２８】
上述したラスプの具体例としては、約３×10×15mmの直方体状の頭部、直径約５mm、長さ約100mmの把持部とからなるポリプロピレン製のものを挙げることができる（図１参照）。このラスプの頭部には、尖端角度が約0.8度であるソーンを、約100本/cm2の密度で、植え込み面から先端までの長さが約2mmとなるように、均一に植え込むとよい。
上記のようにして作製したラスプを無菌袋に詰め、例えば、γ線照射などによって殺菌する。
【００２９】
上記のラスプを清浄にした適当な部位に軽く当てて、この部位を数回軽く擦過し、皮膚擦過屑片を採取する。
ついで、ソーンの尖端に皮膚擦過屑片がついたラスプの頭部を、例えば、ピンセットで挟んでねじるようにして把持部と切り離し、このラスプの頭部をピンセットなどを用いて、水溶液を入れた適当な大きさの容器中に移し、採取された皮膚擦過屑片を回収する。
【００３０】
ここで使用する水溶液は、微生物由来のDNaseを排除するために殺菌水であることが好ましく、アジ化ナトリウムなどの防腐剤を適宜添加してもよい。また、ＤＮＡの回収効率の面から、約0.5〜２mL容量の容器内に、約0.3〜1.6mLの上記水溶液を入れて、ここに皮膚細胞を集めることが好ましい。
【００３１】
例えば、1.5mLの蓋付きのエッペンドルフチューブに0.1％のアジ化ナトリムを含有する1.3mLのMilliQ超純水を入れ、ここに上記の皮膚擦過細胞屑片を採取したラスプの頭部を入れる。このときに使用するエッペンドルフチューブの内径を７mm以内とすると、皮膚擦過屑片を効率よく集めることができる。
【００３２】
以上のようにして集めた皮膚擦過細胞屑片は、以下のような公知の方法によって破砕することができるが、特に限定されるものではない。例えば、界面活性剤、アルカリもしくは酵素などを用いて化学的に破砕してもよく、凍結融解やウルトラソニック等の装置を用いたソニケーションなどによって物理的に破砕してもよく、さらに、これらを組み合わせて破砕してもよい。
【００３３】
抽出するＤＮＡの損傷が少ないことから、上記の採取細胞を含む水溶液を凍結融解し、ついで濃厚アルカリを用いて完全に破砕することが好ましい。凍結融解は繰り返して行ってもよい。
アルカリとしては水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどを挙げることができ、これらを最終濃度が約５〜20mMになるように上記の水溶液に添加してボルテックスミキサーなどによって激しく攪拌すると、ＤＮＡの抽出効率を高めることができる。
【００３４】
細胞の破砕は、例えば、上述した1.5mLの蓋付きのエッペンドルフチューブを液体窒素と温水とに交互に迅速に浸けて、凍結融解を２回繰り返す。ついで、アルカリを最終濃度12mMとなるように濃NaOHを少量添加して、ボルテックスミキサーで激しく攪拌することによって行うことができる。チューブ中のラスプの頭部は、スピンダウンしてからピンセットで取り出す。
【００３５】
細胞の破砕は、上述のような凍結融解によるものの他、ラウロイルサルコシネート、Triton X-100、ラウリル硫酸ナトリウム(SDS)などの界面活性剤、プロテイナーゼＫ、プロナーゼなどのプロテアーゼ、RNaseその他の酵素、ヨーダイドナトリウム・イソプロピルアルコール、エタノールなどの沈殿剤を用いた通常の方法によって行ってもよい。
【００３６】
本発明において、少ない液量でＤＮＡの抽出を行う場合には、上記のように細胞を破砕し、破砕片を沈殿させた後に所定の量の鉱物油を重層すると、この後に行う加熱操作中における水溶液の蒸発を防ぐ上で好適である。
このような鉱物油としては、ライトミネラルオイルM-5904（Sigma社製）などを挙げることができ、重層量は約10％程度とすることが、水分の蒸発を防ぎ、ＤＮＡを安定に抽出する上で好ましい。
【００３７】
アルカリを用いた場合には、上記のＤＮＡを含む水溶液を、高濃度の酸または緩衝液で中和する。このような酸としては、例えば、塩酸などを挙げることができ、緩衝液としては、例えば、トリス塩酸緩衝液(pH7.0)などを挙げることができる。
例えば、１Ｍのトリス塩酸緩衝液(pH7.0)で中和した後に、油層下の溶液をピペットで正確に吸い出すとよい。
以上のようにして得た皮膚細胞からのＤＮＡは、そのまま後述する処理に供してもよく、また、例えば、凍結保存しておいてもよい。
【００３８】
得られたＤＮＡを、HinfI、MspI/HpaII、およびRsaIからなる群から選択される制限酵素で消化し、末端制限ＤＮＡ断片（TRF: terminal restriction fragment）を得る。これらの制限酵素で消化することにより、付着末端と突出末端とを有するＴＲＦを得ることができる（図２）。ここで、「テロメア特有3'突出末端」とは、ＴＲＦの3'側に存在する、約10〜20ヌクレオチドからなる一本鎖オリゴヌクレオチド部分をいう。図２中、Ｅはエンドフィリングする部分、Ａはセンスプライマーと同一の配列からなる部分、Ｂはアンチセンスプライマーと同一の配列からなる部分をそれぞれ表す。また、付着末端の長さは１〜５塩基であり、多くの場合４塩基である。
本発明においては形成される制限末端の塩基配列からHinfIで消化することが好ましい。しかし、経時的にテロメア長を調べる必要がある場合には、同一の採取箇所から１回に採取できる皮膚擦過屑片の量を制限する必要があるため、MspIで消化することが好ましい。
【００３９】
ついで、この付着末端とテロメア特有3'突出末端とを有するＴＲＦを以下のような末端修飾法で平滑末端断片にする。
第一の方法では、このＴＲＦの付着末端と相補的な付着末端を有する第一の二本鎖オリゴヌクレオチドをリンカーとして作製し、このオリゴヌクレオチドを上記ＴＲＦの付着末端に結合させる。ついで、上記ＴＲＦのテロメア特有3'突出末端を有する他方の端を、突出末端の3'側から６〜24塩基の配列に相補的なオリゴヌクレオチド部分の5'側に、二本鎖の３〜12塩基対のオリゴヌクレオチドをプライマーとして連結させ、これを、例えば、ＤＮＡポリメラーゼなどを用いて常法に従ってエンドフィリングする。
このエンドフィリングした突出末端に、両端が平滑末端となっている第二の二本鎖オリゴヌクレオチド（リンカー）を常法に従ってライゲートさせ、平滑末端断片とする。
【００４０】
第二の方法では、上記のようにして得たＴＲＦの付着末端とテロメア特有3'突出末端とに、これらと相補的な付着末端と突出末端とを有する２つの二本鎖オリゴヌクレオチドからなるリンカーを常法に従って結合させ、平滑末端断片とする。付着末端と突出末端とを有する２つの二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＴＲＦの両末端に同時に結合させてもよく、一方ずつ結合させてもよい。
【００４１】
第三の方法では、上記のようにして得たＴＲＦの付着末端と突出末端とを第一の方法の場合と同様にしてエンドフィリングして平滑末端を形成させ、ここに平滑末端を有する２つのリンカーを結合させて、平滑末端断片を得る。ここで使用する２つのリンカーは、ＴＲＦの両末端に同時に結合させてもよく、一方ずつ結合させてもよい。
【００４２】
上記の二本鎖オリゴヌクレオチドからなるリンカーのプラス鎖に、後述する増幅工程で使用するプライマーのヌクレオチド配列が結合する配列を含めておくと、これらの平滑末端断片を正確かつ迅速に増幅することができ、検出も容易となる。
本発明において使用するリンカーは、サブテロメア側に結合するリンカーのプラス鎖中に5'-AGAGTT-3'という配列を含むことが好ましく、
5' AATCCGTCGAGCAGAGTTC 3'
の配列（配列番号３）を含むことがさらに好ましい。
【００４３】
本発明で皮膚擦過屑片から抽出したＤＮＡのサブテロメア側に結合させる上で好適なリンカーは、
5' AATCCGTCGAGCAGAGTTC 3'
3' TTAGGCAGCTCGTCTCAAGTGA 5'
で表される付着末端を有するもの（配列番号１）である。
【００４４】
また、本発明においては、テロメア特有3'突出末端のテロメア側（すなわち、テロメア特有3'突出末端の3'側から６〜24塩基の配列に相補的な、5'-CCCTAA-3'の配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチド部分の5'側（図２））に結合させるリンカーは、
5' (CCCTAA)3CCCTAA 3'
を含むもの（配列番号４）であることが好ましい。テロメア側に結合させるリンカーをこのような配列とすると、サブテロメア側に結合させるヌクレオチド配列のAGAGTTとミスマッチとなるので、プライマー・ダイマーアーティファクトを防止することができるためである。
【００４５】
テロメア特有3'突出末端のテロメア側に結合させる具体的なリンカーとしては、
5' （CCCTAA)3CCCTAA 3'
3' （GGGATT)3GGGATT 5'
という配列を有する平滑末端を有するもの（配列番号２）が好ましい。
【００４６】
このようなリンカーは化学合成によって各鎖を作製し、これら二本の合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせてもよく、または、合成したプラス鎖とＤＮＡポリメラーゼとを用いて酵素合成してもよい。
例えば、ＤＮＡシンセサイザー（Pharmacia Biotech製）を用いて、ホスホルアミダイト(Phosphoramidite)法に従って、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドからなるリンカーを合成することができる。合成したオリゴヌクレオチドは、アルカリによってカラムから切り出した後に、７Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動やChroma Spin-10 column(Clontech製)を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)などによって精製すればよい。
【００４７】
本発明においては、上述したように平滑末端断片の作製に用いられる二本鎖オリゴヌクレオチドからなるリンカーの中に、この平滑末端断片のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーの配列が含まれている。これらのプライマーは、常法に従いＤＮＡシンセサイザーを用いて合成することができる。また、クレノウ断片を作用させ、マルチプライマー法（ランダムプライマー法）、ニックトランスレーション法などによって、上記のプライマーを合成することもできる。
【００４８】
また、これらのプライマーの塩基配列の長さは特に限定されないが、合成が容易であること及びプライマーダイマーアーティファクトを起こさないといった面から、約15〜35塩基の長さであることが好ましい。
ここで、「プライマーダイマーアーティファクト」とは、プライマー同士が互いにアニールしてダイマーを形成することをいう。
合成されたプライマーは、上述したようにポリアクリルアミドゲルもしくはChroma Spin-10 column（Clontech製）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）などを用いて常法に従って精製し、ＰＣＲにおいて使用する。
【００４９】
本発明で使用する二本鎖オリゴヌクレオチドからなるリンカーとプライマーの例としては、配列番号１と２とにそれぞれ記載されたリンカーとプライマーなどを挙げることができる。
このようなヌクレオチド配列を有するプライマーは、プライマーダイマーアーティファクトを起こさず、増幅工程においても、効率良くかつ精度良く鋳型となるヌクレオチド配列を増幅させることができる。
【００５０】
本発明においては、上記のように処理して得た平滑末端断片をテンプレート（鋳型）と、下記の配列を有するTSプライマー（センスプライマー、配列番号３）
5' AATCCGTCGAGCAGAGTTC 3'
とCXプライマー（アンチセンスプライマー、配列番号４）
5' （CCCTAA)3CCCTAA 3'
とを用いて、通常の条件に従い、ＰＣＲを行うことによりＴＲＦを増幅する。
【００５１】
本発明で使用するＣＸプライマーの配列は、テロメア反復配列と完全に相補的な配列ではなく、アニールしたときにミスマッチとなる塩基を含んでいる。このようなミスマッチの塩基を含むことにより、鋳型のテロメア配列部分とアニールしてプライマーダイマーが形成されるのを防ぐことができるとともに、ＰＣＲの２サイクル目以降のアニーリングでは優先的にこの配列にアニールさせることにより、増幅断片の短縮を防止することができる。
【００５２】
こうして得られた増幅産物は、アガロースゲル電気泳動、SDS-PAGEなどの各種の電気泳動法によって泳動分離し、メンブランフィルターに転写した後に、標識プローブで検出する。
本発明においては、
(TTAGGG)n（ここでｎは３〜５の整数を表す、配列番号５〜８）
または
(TAACCC)m（ここでmは２〜６の整数を表す、配列番号９〜13）
を含むプローブを使用することが好ましい。
【００５３】
ｎが２以下では結合親和力が弱いという問題があり、逆に６以上ではプローブとしての取り扱いが難しくなるからである。また、ｍが１の場合及び７以上の場合にも同様の問題があるからである。
(TTAGGG)n（配列番号５〜８）または(TAACCC)n（配列番号９〜13）をプローブとして使用すると、テロメア検出の際に精度、感度、および操作性が向上するという効果がある。
【００５４】
ここで使用するテンプレートには、少なくとも、5'- (TTAGGG)3-3'および／または5'-(TAACCC)3-3'と相補的な塩基配列、この配列に隣接する制限酵素認識配列とが含まれる。「制限酵素認識配列」とは制限酵素によって認識され切断される塩基配列をいい、具体的には、HinfI、MspI/HpaIIおよびRsaIから選ばれる制限酵素によって認識される塩基配列が好ましい。
プライマーもまた、上記の制限酵素によって認識される塩基配列を含む。
【００５５】
上記のテンプレート、プライマーおよび［α-3Ｈ］dNTPからなる基質にＤＮＡポリメラーゼを通常の条件下で作用させると、［α-3Ｈ］dNTPを含む反応産物を得ることができる。この反応産物に上記の制限酵素を通常の条件に従って作用させると、高標識率のプローブを得ることができる（例えば、Harleyらの方法（Harley C.B. et al.,Nature 345:458-460(1990); Vaziri H. et al,EMBO J. 16:6018-6033(1997); Kruk P.A. etal.,BBRC 224:487-492(1996) ）を参照のこと）。
【００５６】
ここで、「高標識率のプローブ」とは、放射性同位体を標識として使用した場合には、約0.5〜９×107cpm/pmolの放射活性を有するものをいう。蛍光化合物を標識として用いた場合、または化学発光化合物を標識として用いた場合には、従来の5'末端標識のような一箇所の標識ではなく、二箇所以上が標識され、蛍光強度または発光強度が高くなっているプローブをいう。
【００５７】
本発明で使用する標識化合物としては、以下のものを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。放射性標識としては、[3Ｈ] 、 [32Ｐ] もしくは [14Ｃ] などが挙げられる。
また、非放射性標識としては、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、赤色系のテトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)などの蛍光化合物、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）、ルシフェラーゼなどの化学発光化合物を挙げることができる。
【００５８】
これら非放射性標識を用いた標識プローブは、Langer-Saferらの方法(P.R.Langer -Safer, M.Levine, and D.C.Ward, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79:4381-4385)、Rigby らの方法(T.W.J.,Rigby, M.Dieckmann, C.Rhodes, and P.Berg, J. Molec.Biol. 113:237-251(1977))などによって作製することができる。
【００５９】
本発明においては、ビオチン標識dCTP、ジゴキシゲニン標識dUTP、FITC標識dGTP、TRITC標識dCTPなどの蛍光標識ヌクレオチド、［α-3Ｈ］dNTP、［γ-3Ｐ］dNTPもしくは［α-14Ｃ］dNTPなどの放射性標識ヌクレオチド、又は西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヌクレオチド、ルシフェラーゼ標識ヌクレオチドなどの酵素標識ヌクレオチドを使用することが、皮膚擦過屑片等からの少量のＤＮＡを高感度で検出する上で好ましい。
【００６０】
これらの標識プローブのうち蛍光プローブを用いた場合には、増感剤を加えると一層高感度の検出が可能となる。例えば、ビオチン標識dCTPを用いた場合には、ストレプトアビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を標識プローブに結合させ、ついで過酸化水素と増感剤とを用いると蛍光強度が増大する。
増感剤としては、フルオレセイン−チラミド(NEN Life Science Products製)、ビオチン、フロレスチン（モレキュラープローブ製）などを好適に使用することができる。
【００６１】
ビオチン標識dCTP、ジゴキシゲニン標識dUTPなどの上述のような非放射性標識プローブを使用すると、放射能安全管理施設外における操作が可能となり、皮膚の老化の測定を簡便に行うことができる。
【００６２】
また、本発明の放射性標識プローブは、 [γ-32Ｐ]ATPとT4ポリヌクレオチドキナーゼなどによって5'末端標識された従来の標識プローブ(Harley C.B.ら（前出))の比活性が１〜３×106cpm/pmolであるのに比べて、比活性が２〜７×107cpm/pmolと数倍高いため、少量の皮膚擦過屑片から抽出したＤＮＡで精度良くテロメア長を測定することができる。さらに、[3Ｈ］標識を使用するとこれらを使用する研究者に対する安全性も高いという利点がある。
【００６３】
本発明においては、皮膚擦過屑片から上述のようにしてＤＮＡを抽出し、所望の制限酵素で処理し、末端修飾によって平滑末端とする。ここに所望の配列を含有する二本鎖オリゴヌクレオチドからなるリンカーを結合させ、ＰＣＲによりテロメア全配列を一部に含む増幅産物を得る。この増幅産物を泳動分離して、メンブランフィルターに転写して上述のように作製した標識プローブと結合させると、エレクトロフォログラムが得られる。
【００６４】
得られたエレクトロフォログラムを、例えば、Molecular Imager（BioRad社製）などの画像解析装置に取り込み、蛍光標識プローブを用いた場合には、蛍光を発しているバンドのマスセンターを求める。ここで、加重平均したＤＮＡ長をマスセンターという。マスセンターは同時に電気泳動を行ったマーカーＤＮＡの分子量を基準として、以下の式（１）に基づいて算出する。
【００６５】
MCav＝Σ( MWi×FIi)／Σ( FIi )
ここで、MCavはマスセンターを表し、MWは同時に電気泳動を行ったマーカーＤＮＡより求めるＤＮＡ長である。FIは蛍光強度を、また、Ｉはバンドの位置を表す。
上記の式に基づいて、平均テロメア長を平均値±標準偏差(kb)として求めることができ、この値から皮膚の老化度を知ることができる。
【００６６】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６７】
（実施例１）皮膚の採取
（１）採取部位の選択
皮膚の採取部位は、以下のようにして選択する。
顔の場合には、鏡で顔を見ながら、起立位か座位で、目尻の鉛直線と小鼻上端の水平線との交叉部位の頬皮膚（図３）を選択するか、または、鏡を見ないで、清潔な指による感触で頬骨頂部をさぐりあててこの上の皮膚を選択する。
顔以外の部位には、臀部や大腿部など日光に曝されない部位を選択する。
【００６８】
（２）皮膚の採取の準備
皮膚の採取部位が顔の場合には、石鹸で頬の付近を充分に洗い、水で濯ぐ。好ましくは、さらに消毒用アルコール（約70％）を含ませたコットンで、頬の付近を拭いた。
皮膚の採取部位が顔以外の場合も、顔の場合と同様に、石鹸で洗浄した後に水で濯ぎ、同様にアルコールで拭いた。
【００６９】
（３）皮膚の採取
上記（２）で決定した皮膚の採取部位に、ラスプをあてて同一部位を軽く数回擦り、皮膚擦過屑片を採取した。
採取した皮膚擦過屑片を入れるために、1.3mLの殺菌水（0.1％アザイド含有MilliQ超純水）を入れた1.5mLの蓋付きエッペンドルフチューブ（内径７mm以内）を用意した。上記のように皮膚を擦り取ったラスプの頭部と柄とを切り離し、頭部を付属のピンセットでつまんで、このエッペンドルフチューブの中に入れて密栓した。
【００７０】
（実施例２）採取した皮膚試料の処理
（１）細胞の破砕
皮膚擦過屑片を含むエッペンドルフチューブを、液体窒素に浸けて凍結し、次に温水に浸けて融解するという凍結融解操作を２回繰り返した。ついで、最終濃度が12mMとなるように濃厚NaOHを少量加えて、ボルテックス・ミキサーで激しく攪拌して細胞の破砕を行った。この破砕の後に、ラスプの頭部をチューブから取り出した。
【００７１】
（２）被験試料の調製
破砕物をスピンダウンしてから、ライトミネラルオイルM-5904（Sigma製）を10％容量となるように重層し、95℃のヒートブロックで10分間加熱した。
この後に、１Ｍのトリス塩酸緩衝液（pH7.0）を加えて試料を含む水溶液を中和し、オイルの下にある試料をピペットで正確に吸い出して、エッペンドルフチューブに移し、−80℃で凍結した。
【００７２】
−80℃で凍結した試料を常温に戻した後に、IsoQuick Nucleic Acid Extraction Kit (ORCA Research Inc.)を用いて抽出を行った。抽出したＤＮＡをTE(1mMのEDTAを含む10mMのTris-HCl(pH8.0))に溶解し、４℃で保存した。
【００７３】
ＤＮＡの濃度測定はMupidのミニゲル泳動槽（コスモバイオ製）、0.35％のアガロース(TYPE H、和光純薬製)ゲル、および5％のグリセリン、0.025％のブロモフェノールブルー(BPB)、0.025％のキシレンシアノールFFを含むローディングバッファーを使用した。１μLのＤＮＡ溶液に５μLのTEを加えて重くしたＤＮＡ試料と、対照試料用に調製した10μLのλDNA(100ng/mL)とをそれぞれ別のゲルにアプライし、１×TAEバッファー（５mMの酢酸と１mMのEDTAとを含有する40mMのTris-HCl(pH8.0) ）中で泳動させ、BPBがゲルの2/3まで進んだところで泳動を止めた。
【００７４】
このゲルを2μg/mLのエチジウムブロマイドで染色し、ＵＶトランスイルミネーター(VILBER LOURMAT TF-40M)にのせてそれぞれ写真撮影を行った。
この写真について画像解析(NIH Image)を行い、対照と比較して、ＤＮＡ濃度を求めた。
【００７５】
（３）被験試料の保存
採取された試料を、角化細胞の量およびＤＮＡの量について測定した。角化細胞の量はCoulter粒度カウンターで測定し、平均値としてならすと皮膚組織1mgから1.5〜６×106個が得られた。被験試料ごとのこの範囲のばらつきは、テロメア長の測定に影響しない。Hoechst33258をＤＮＡ結合性指示薬として用い、蛍光プレートリーダー（Millipore製）で測定したところ、3.2〜9.6μgのＤＮＡが得られた。
採取された試料の数がある程度まとまるまで、上記のＤＮＡ含有チューブを-70℃で保存した。
【００７６】
（実施例３）サザンブロット法による末端制限ＤＮＡ断片ＴＲＦ長の解析
（１）試料の調製
1.5mLのチューブに２μLの10×Ｈバッファー（宝酒造製）、２μLのＤＮＡ溶液、および滅菌水を総量19μLとなるように加え、最後にHinf I（６U/μL、宝酒造製）を加えた。
37℃で３〜４時間反応させ、電気泳動にかけた。反応後直ちに電気泳動しなかった試料については−20℃で保存した。
【００７７】
（２）アガロースゲル電気泳動
アガロース（TYPE I、Sigma製）ゲルは、ブリッジ部分のゲル濃度が１％、ベット部分が0.8％になるように作製した（マリソルKS-8405、20cm×14cm）。泳動用バッファーとしては、１×Boyerバッファー（20mMの酢酸ナトリウム、２mMのEDTA、18mMのNaClを含む50mMのTris-HCl(pH8.0)）を使用した。
【００７８】
マーカーとしては、0.5μg/レーンに調整した１kbのDNA Ladder（GIBCO BRL製）と、0.3μg/レーンに調整したλDNA/Hind III digest(NIPPON GENE製)とを使用した。
マーカーとローディングバッファーとを３μLずつ加えた試料を上記のように調整した0.8％のアガロースゲルにアプライし、85ボルトで引き込んだ後に、35ボルトで泳動を行った。
【００７９】
（３）サザントランスファー
電気泳動終了後、アガロースゲルを切り出し、２μg/mLのエチジウムブロマイドで15分間染色し、ＵＶトランスイルミネーターにのせてスケールとともに写真撮影を行った。
写真撮影の後に、ゲルを0.25ＮのHClに浸して室温で15分間振盪し、ついで蒸留水で２回洗浄した。
【００８０】
ついで、0.2 ＭのNaOHと0.6 ＭのNaClとを含む変性(Denaturalization)溶液にゲルを浸して室温で25分間振盪し、その後に蒸留水で３回洗浄した。
このゲルを中和(Neutralization)溶液（0.6 ＭのNaClを含む0.2 ＭのTris-HCl(pH7.4) ）に浸して室温で30分間振盪し、蒸留水で軽く１回洗浄した。この後、再びNeutralization溶液に浸して室温で30分間振盪した。
【００８１】
６×SSCを満たしたブロッティング装置にセットした３MMろ紙上に空気が入らないように、ゲル、６×SSCに浸しておいたニトロセルロースメンブレンフィルター(OPTITRAN BA-S 85、Schleicher＆ Schuel製)、６×SSCに浸しておいた３MMろ紙、ペーパータオル、ガラス板、重り（２kg）の順に載せ、一晩ブロッティングを行った。
ブロッティングの終了後、メンブレンフィルターを３×SSCに浸し、軽く水分を切ってからUVトランスイルミネーター上でウェルの位置を記入した。
ろ紙にはさみ、80℃で一晩加熱(ベーキング(baking))した。
【００８２】
（４）ＤＮＡハイブリダイゼーション
プレハイブリダイゼーション用のプローブとしては、 5'-(TTAGGG)4-3'（宝酒造製）を使用した。このプローブを MEGALABELTM DNA 5'-End Labeling kit（宝酒造製）を用いて、［γ-32Ｐ］ATP (Amersham 製)で5'末端標識を行った。標識したプローブは、Chroma Spin-10 Column(Clontech製)を用いて常法に従い逆相HPLCで回収した。
【００８３】
ベーキングしたフィルターを３×SSCに浸した後に、ハイブリダイゼーションバッファー（１×デンハルト溶液、１Ｍ NaCl、50mM Tris-HCl、10mM EDTA、0.1％SDS、50μg/mL変性サケ精子ＤＮＡを含む）に浸して、65℃で３〜４時間振盪し、上記のプローブとともにプレハイブリダイゼーションを行った。
【００８４】
プレハイブリダイゼーションが終了した後に、シールドバッグにメンブレンフィルターを入れ、標識プローブと１μLの変性サケ精子DNA(10mg/mL)とを加えたハイブリダイゼーションバッファーを２mL加えて、泡が入らないようにシールした。
50℃で一晩インキュベートし、ハイブリダイゼーションを行った。
【００８５】
（５）洗浄およびオートラジオグラフィー
ハイブリダイゼーションをした後、フィルターを洗浄バッファー（４×SSC、0.1％SDS）に浸し、55℃で15分間振盪した。この操作を４回繰り返した後に、フィルターの水分をよく切ってサランラップでくるみ、増感紙をつけたカセットにX線フィルム(Scientific Imaging Film, Kodak製)とともにセットして、−80℃で一晩オートラジオグラフィーを行った。
【００８６】
（６）データ解析
現像したフィルムとフィルターの位置を合わせ、マジックでウェルの位置を記入した。ＴＲＦはスメア上に現れるので、このスメアの濃さのピークをデンシトメトリー(Ultra Scan XL Laser Densitometer, Pharmacia製)で検出した。ウェルからピークまでの距離を移動度とし、その移動度とマーカーとで作成した検量線より、ＴＲＦの長さを求めた。
【００８７】
（実施例４）アルカリホスファターゼ(AP)標識及び／又はビオチン標識プローブを用いた平均テロメア長の測定
（１）二本鎖合成オリゴヌクレオチドからなるリンカーおよびＰＣＲ用プライマーの合成
（１−１）リンカーの合成
平滑末端断片を得るために使用する二本鎖オリゴヌクレオチドからなるリンカー（配列番号１及び２）をＤＮＡシンセサイザー(Pharmacia Biotech製)を用いて、ホスホルアミダイト法により合成した。すなわち、反応基質であるアミダイトをカラムに固定されたヌクレオチドの3'末端に結合させ、未反応基質を除去するとともに官能基をキャッピングし、酸処理してトリチル基をはずし、ここに再びアミダイトを結合させ、上記の手順を繰り返して合成した。アルカリ処理によって合成したオリゴヌクレオチドをカラムから切り出し、脱保護して、逆相HPLCにより精製し、以下の実施例でリンカーとして使用するオリゴヌクレオチドの画分を分取した。
【００８８】
（１−２）ＰＣＲ用プライマーの合成
ＰＣＲで使用するTSプライマー（サブテロメア側プライマー、配列番号３）およびCXプライマー（テロメア側プライマー、配列番号４）をＤＮＡシンセサイザーによって作製した。
同様に合成した(TTAGGG)4プローブを架橋剤(bifunctional reagent)であるホルムアルデヒドで処理し、アルカリホスファターゼ(AP)を化学的に直接結合させて標識した。この標識には、AlkPhos Direct(Pharmacia製)を使用した。
実施例３（１）で得たＴＲＦを実施例３（２）に示すようにアガロースゲル電気泳動して分画した。マーカーには、１kbのDNA ladder(BioRad製)を使用した。
【００８９】
（２）ＴＲＦの検出
上記のように電気泳動したゲルをトランスブロッター（BioRad製）を用いて、ニトロセルロースメンブランフィルター（OPTITRAN BA-S、Schleicher & Schuel製）に転写した。
このフィルターに、0.2μg/mLの上記のようにして得たAP標識プローブ、もしくはビオチン標識プローブを結合させた。ビオチン標識プローブは、0.3μg/mLのビオチン標識dCTP(Pharmacia Biotech製)とdNTPとを添加し、0.1μg/mLのクレノウ断片（宝酒造製）で反応させた後、制限酵素SmaIで切断して得た。
【００９０】
ついで、AP標識プローブの場合には、CDP-Starと反応させて化学発光を生じさせ、ビオチン標識プローブの場合には、0.4μg/mLのストレプトアビジン結合HRP（ベーリンガーマンハイム製）と25℃で15分間結合させた。この後に、100μMの過酸化水素と0.8μg/mLのフルオレセイン−チラミド(NEN Life Science Products製)及び／又は0.3μg/mLの1,4-ビシクロ[2,2,2]オクタン(1,4-diazobicyclo[2,2,2] octane、DABCO)(モレキュラープローブ製)を添加して、蛍光強度を増強させた。
この蛍光をCDP-Star(Pharmacia製)で検出した。
【００９１】
（実施例５）放射性標識プローブを用いた平均テロメア長の測定
（１）二本鎖オリゴヌクレオチドからなるリンカー及びＰＣＲプライマーの合成実施例４の（１）と同様にして、リンカー（配列番号１及び２）およびＰＣＲ用プライマー（配列番号３及び４）を、ＤＮＡシンセサイザー(Pharmacia Biotech製)を用いて合成した。
【００９２】
（２）ＴＲＦ平滑末端の取得
実施例１で得た皮膚擦過屑片から得られたＤＮＡをHinfI(宝酒造製)を用いて37℃で３〜４時間処理し、付着末端と突出末端とを有するＤＮＡ断片を得た。上記（１）で得た付着末端と突出末端とを有するＤＮＡ断片(TRF)のサブテロメア側に、以下の配列
5' AATCCGTCGAGCAGAGTTC 3'
3' TTAGGCAGCTCGTCTCAAGTGA 5' （配列番号１）
を有するリンカーＳを結合させた（図２参照）。
【００９３】
ついで、このサブテロメア側平滑末端化したＴＲＦのテロメア側の3'突出末端にリンカーＴ（図２参照）を咬ませた後、ＤＮＡポリメラーゼでエンドフィリングし、下記のテロメア側末端を有するＴＲＦ平滑末端を得た。このリンカーＴの中には、後述するＰＣＲ増幅工程用のプライマーの塩基配列を含めておく。
…GGTTAGGGTTAG 3'
…CCAATCCCAATC 5'
【００９４】
DNA Ligation Kit ver.1(宝酒造製)を用いてＤＮＡ連結させた。
両端を平滑末端化したＴＲＦサンプルをマイクロチューブに入れ、DNA Ligation Kit ver.1（宝酒造製）を用いて、常法に従ってインキュベーションした後に、このマイクロチューブに等容のフェノールを加え、ついで、４容の氷冷エタノールを加えて沈殿させ、平滑末端断片を分離した。
【００９５】
（３）増幅
この平滑末端断片を鋳型として、実施例４の（１−２）で合成したTSプライマー（センスプライマー、配列番号３）とＣＸプライマー（アンチセンスプライマー、配列番号４）とを用いて、サーマルサイクラーPC-800(Astec製)にて、以下の組成のＰＣＲミックス中でＰＣＲを行った。
20mM Tris-HCl(pH8.3)、68mM KCl、1.5mM MgCl2、１mM EGTA 、1.05％ Tween 20、５μg ITAS（テロメラーゼアッセイ内部標準品）、0.1μg ＴＳプライマー（宝酒造製）、0.5μM T4 gene 32 protein(Boehringer Mannheim)、50μM dNTPs、２Ｕ Taqポリメラーゼ（宝酒造製）、４μCi [α-32Ｐ］dCTP(Amersham製)、0.1μg ＣＸプライマー、ＰＣＲ用Wax(GIBCO/BRL製)を含むＰＣＲ用反応ミックスを調製した。
【００９６】
CXプライマーはワックスによってチューブの底に隔離し、その上に他の成分を含む反応ミックスを重層した。この反応ミックスの総容量は80μLとした。
サーマルサイクラーPC-800(Astec製)を用いて、94℃40秒/50℃40秒/72℃50秒を１サイクルとして32サイクル、ＰＣＲを行った。
【００９７】
（４）増副産物の泳動分離と検出
（４−１）増副産物の分離と検出
上記（３）で増幅した増幅産物を処理して、皮膚由来のＤＮＡから得たＴＲＦをアガロースゲル電気泳動して分画した。マーカーには、１kbのDNA ladder(BioRad製)を使用した。電気泳動したテロメア含有ＤＮＡ断片などをゲルトランスブロッター（Bio Rad製）を用いて、ニトロセルロースメンブランフィルター（OPTITRANBA-S、Schleicher & Schuel製）に転写した。このフィルターに、0.2μg/mLの放射性標識プローブを結合させた。
【００９８】
（４−２）平均テロメア長の検出
上記（４−１）のようにして得られたエレクトロフォログラムを、デンシトメトリー(NIH Image 1.59)で解析して、Molecular Imager(BioRad製)に取り込み、下記の式（１）に従ってマスセンターを算出した。
MCav＝Σ( MWi×FIi)／Σ( FIi) …式（１）
ここで、MCavはマスセンターを表し、MWは同時に電気泳動を行ったマーカーＤＮＡより求めるＤＮＡ長である。FIは蛍光強度を、また、Ｉはバンドの位置を表す。
【００９９】
測定した、頬骨頂部上、眼より下でオトガイ部より上の部位（以下、頬骨頂部上以外の顔の部分という）、および臀部の皮膚擦過屑片から得られたＤＮＡの平均テロメア長をＴＲＦの平均値±標準偏差(kb)として表１に示す。
【０１００】
【表１】
表１から明らかなように、いずれの部位の平均テロメア長も年齢が高くなるにつれて短くなっていた。また、頬骨頂部上の平均テロメア長を除き、年齢に比例して平均テロメア長の標準偏差(SD)が大きくなっていた。さらに、頬骨頂部上の平均テロメア長の短縮がもっとも大きかったが、SDの増加は小さかった。また、臀部のテロメアの短縮がもっとも緩慢であった。さらに、平均テロメア長を見ると、頬骨頂部上＜頬骨頂部上以外の顔の部分＜臀部となっていた。
【０１０２】
上記の結果より、
（１）年齢とともに、いずれの部位の皮膚のテロメアも短縮すること
（２）皮膚のテロメアの短縮の程度は、年齢が高くなるにつれて個人差が大きくなること
（３）顔のどの部分でも同様なテロメアの短縮を起こすのではないこと
【０１０３】
（４）頬骨頂部上ではテロメア短縮のバラツキが少なく、特定の部位を選択することで皮膚の老化度の良い指標とすることができること
（５）平均テロメア長の短縮の程度から、臀部は光老化をあまり受けていないことが示唆されること
（６）臀部の平均テロメア長は同一個人の加齢に伴う皮膚の老化度を計測する場合の良好な基準にできること
が明らかになった。
【０１０４】
（実施例６）高比活性放射性標識プローブの作製
（１）テロメア検出用プローブとテンプレートの作製
テロメアを以下のように作製した。5'末端標識をせず、後の工程で制限酵素によってテロメアと切り離すことができる、テロメアをＤＮＡ合成するためのプライマー
5' CACGTGCTCGAGCCC 3' （配列番号14）
を、ＤＮＡシンセサイザー（Pharmacia Biotech製）で合成した。
また、テンプレート
3' GTGCACGAGCTCGGG(CCCAAT)4TCTAATCTGA 5' （配列番号15）
も上記プライマーと同様に合成した。
【０１０５】
（２）テロメア検出用プローブの合成
6.7mMのMgCl2と１mMの2-メルカプトエタノールとを含有する67mMのリン酸カリウム緩衝液(pH7.4)に、20μMの上記（１）で合成したプライマー及びテンプレートと、5'-AGATTAGACT-3'の配列を有するオリゴヌクレオチド、33μMの［α-3Ｈ］dGTP、22μMの［α-3Ｈ］dTTP、及び11μMの［α-3Ｈ］dATPを、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩの大断片であるKlenow断片（宝酒造製）0.37ユニットとを含む溶液10μL(pH7.4)中で混合し、10℃で60分間反応させた。5'-AGATTAGACT-3'の配列を有するオリゴヌクレオチドで挟むことによって、後の工程で使用するテロメア検出用プローブをＰＣＲ増幅することができる（図４参照のこと）。図４中、14は配列番号14のオリゴヌクレオチドを表し、15は配列番号15のオリゴヌクレオチドを表す。また、SmaI及びHindIIIはそれぞれの制限酵素の切断部位と、これらの認識部位とを表す。
【０１０６】
この標識生成物を、ゲルろ過カラムであるQuick Spin Column Sephadex G-25(Boehringer Mannheim製)と、10mMのトリス緩衝液(pH8.0)-20mMのKClとを用いて精製した。
ついで、10mMのトリス緩衝液(pH8.0)-20mMのKCl中で制限酵素SmaI（宝酒造製）を６ユニット/10μLに添加し、30℃で40分間反応させた。
【０１０７】
この制限酵素消化物をさらに、Chroma Spin-10カラム(Clontech製)と、ポリアクリルアミドゲル電気泳動とを用いて上記と同様に精製し、さらに制限酵素HindIII（宝酒造製）でＤＮＡ切断し、この制限酵素消化物を７Ｍの尿素存在下で同様に精製した。
このようにして精製された放射性標識プローブを、液体シンチレーションカウンターで計測した結果、２〜７×107cpm/pmolという放射能の比活性が得られた。
【０１０８】
この値は、従来の［γ- 32Ｐ］dATPによる末端標識プローブの１〜３×106という比活性に比べて最低６倍、最高では20倍以上となった。したがって、この放射性標識プローブを用いると、アガロースゲル電気泳動に供するＴＲＦの量を従来のプローブを用いた場合の1/6〜1/20まで減少させることができる。このため、顔の皮膚等、特に痕跡を残さずに皮膚の老化度を測定したい場合、又はごく少量の皮膚擦過屑片しか得られない場合等に有用である。
【０１０９】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、少量のＤＮＡを用いて迅速かつ正確に、皮膚の老化度を測定することができる。
また、本発明においては放射性標識を使用しないか、または少量の放射性標識を使用することにより、迅速かつ安全に高感度で皮膚の老化度を測定することができる。
【０１１０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のラスプを表す図である。
【図２】ＴＲＦの構造を示す図である。
【図３】顔における皮膚擦過屑片の採取部位を示す図である。
【図４】テロメア検出用プローブの作製を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for measuring the degree of skin aging. More specifically, the present invention relates to a method for measuring the degree of skin aging by amplifying DNA extracted from skin cells, measuring the average molecular weight of increased by-products, and determining the telomere length.
[0002]
[Prior art]
In living organisms, physiological functions change with aging, usually a decrease in physiological functions, that is, aging. Even at the individual cell level, aging, which is defined as the process until cell trait, functional regression and subsequent cell death or growth arrest occurs. The cause of such an aging phenomenon is considered to be due to damage of intracellular DNA and a decrease in repair function in addition to cell metabolism disorders and the like.
[0003]
Some knowledge about such cell aging has already been obtained. In other words, Goldstein's review reports that in human diploid fibroblasts, the G1 / S boundary of the cell cycle occurs and aging due to replication, that is, aging in division, is fast (S. Goldstein, Science,249: 1129-1132 (1990)). In addition, when human fibroblasts obtained from different human donors are established and grown as strains that can be cultured in vitro, the telomeres are shortened when the cells are passaged, and this shortening reduces cell life. (RCAllsop, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89:10114-10118 (1992)). Here, the telomere refers to a terminal region of a chromosome, also called a terminal particle, and is often composed of a simple repetitive sequence. This region is essential for eukaryotic chromosome stability.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, it is considered that the degree of aging can be estimated from the telomere length, but no method has been known so far that can easily and quickly measure such telomere length.
Allsop et al. Examined the effects of telomeres on primary culturing of skin cells obtained by surgery and biopsy and repeated aging to examine the effects of telomeres using conventional PCR and probe methods. Yes.
[0005]
Specifically, Allsop et al. Repeated cell passage, extracted DNA, digested with restriction enzymes, and hybridized with a radioisotope (RI) -labeled probe by a modified method of Mather et al. A method of detecting autoradiogram by densitometry after exposing XAR-film for 1-2 days is employed. This method requires a significant amount of DNA and takes time and effort to use RI as a label.
Therefore, there is a need to establish a method that can accurately determine the telomere length in a short time using a small amount of DNA, and to clarify the relationship between aging and telomere length.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The inventors of the present invention have intensively studied to solve the above-mentioned problems. As a result, telomere length can be simplified by using a small amount of DNA from skin tissue cells collected without pain and no trace. The present invention has been completed by finding a method capable of rapid measurement.
[0007]
That is, in the present invention, both ends of a fragment having one sticky end and a telomere-specific 3 ′ protruding end obtained by restriction enzyme treatment of DNA extracted from skin scraping fragments are subjected to end modification.Includes linkerA blunt end fragment and the blunt end fragmentPAmplifying with CR, and separating the amplification product obtained at least partially containing the entire telomere sequence.,Its distributionDetected with a labeled probeAverage telomere lengthAskA method for measuring the degree of skin aging comprisingThe plus sequence of the linker on the sticking end side is the base sequence
5 'AATCCGTCGAGCAGAGTTC 3' (SEQ ID NO: 3)
A sense primer used in the amplification step has a nucleotide sequence contained in the linker on the sticky end side, and an antisense primer used in the amplification step has a nucleotide sequence contained in the linker on the protruding end side. How to measure agingIt is.
[0008]
Here, the restriction enzyme is a restriction enzyme selected from the group consisting of HinfI, MspI / HpaII, and RsaI. Further, the blunt end fragment is a 3 ′ side of the protruding end of the fragment having a sticking end by binding a linker comprising a double-stranded oligonucleotide having a sticking end complementary to the sticking end to the sticking end. A double-stranded 3-12 base pair oligonucleotide is ligated to the 5 ′ side of the single-stranded oligonucleotide portion containing a 5′-CCCTAA-3 ′ repeat sequence complementary to the 6-24 base sequence from It is characterized by being obtained as a double-stranded oligonucleotide with blunt ends at the DNA polymerase using this as a primer.
[0009]
In the present invention, the restriction-treated DNA may be blunt ended using the linker and DNA polymerase, and a double-stranded oligonucleotide having a sequence complementary to the sticky end and protruding end is used as a linker. It may be a blunt end.
[0010]
In addition, the sense primer and the antisense primer used in the amplification step have a nucleotide sequence included in each of the two types of linkers.
Specifically, the primer preferably has the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NOs: 3 and 4.
[0011]
The present invention also provides telomere detection in which a telomere-containing DNA fragment obtained by restriction enzyme treatment of DNA extracted from a scraping chip is labeled with a label selected from the group consisting of a radioisotope, a fluorescent compound, and a chemiluminescent compound. It is a measuring method of the aging degree of the skin detected with the labeling probe.
[0012]
Specifically, the telomere-labeled probe preferably has the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NOs: 5-13.
The telomere labeled probe is 5 ′-(TTAGGG) labeled with a label selected from the group consisting of a radioisotope, a fluorescent compound, and a chemiluminescent compound.n-3 'and / or 5'- (TAACCC)nMore preferably, it is −3 ′ (n represents an integer of 3 to 5).
[0013]
In addition, the labeled probe is 5 ′-(TTAGGG) as a labeled probe.n-3 'and / or 5'-(TAACCC)n-3 ′ (n represents an integer of 3 to 5) and a template having a complementary base sequence and a restriction enzyme recognition sequence adjacent to the base sequence, a primer containing the restriction enzyme recognition sequence, and [α−ThreeH] It is characterized in that a reaction product is obtained by allowing DNA polymerase to act on a substrate containing at least dNTP, and the restriction enzyme is allowed to act on the reaction product.
[0014]
The present invention is also a skin aging measurement kit for carrying out the above-described method, comprising at least two of a device for collecting skin scraping pieces and a tube containing a DNA extraction solution. The kit may further include a tube containing the DNA amplification mix. The amplification reaction mix of this kit is a PCR solution containing EGTA, internal standard, TS gene protein, and the primer of SEQ ID NO: 3 as a wax upper layer, and the PCR solution containing the primer of SEQ ID NO: 4 as a wax lower layer. As contained in a reaction vessel.
[0015]
The present invention further includes a skin aging degree measuring kit characterized in that a rasp including a head having a thorn implanted style and a gripping part connected to the head is used as a device for collecting skin scraps. It is.
[0016]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention is described in detail below.
In this specification, “aging” means DNA damage or cell damage induced by ultraviolet rays, lipid peroxides, ischemia, and the like, and DNA replication, a decrease in cell growth rate associated with cell division, and a decrease in growth potential. This includes things such as photoaging and free radical aging.
Here, “decrease in the growth potential” usually refers to the number of times that a cell can proliferate in comparison to the genetically determined number of divisions (cumulative number) that can proliferate.
[0017]
In the present invention, in order to measure the telomere length, skin scraping pieces or DNA extracted from skin cells is used. These skin scraping pieces are obtained from a living body. “Skin scraping scraps” refers to cells such as keratinocytes obtained by rubbing the skin surface of an arbitrary site without pain, bleeding, and no traces, or a part thereof. In the present invention, a cell line that can be passaged in vitro and a DNA obtained from primary cultured cell tissue obtained from an isolated living tissue may be used. Hereinafter, the samples obtained from these materials are referred to as “skin abrasion scraps”.
[0018]
Further, these skin abrasion scraps and the like may be obtained by any method. For example, it may be obtained by rubbing the skin surface with a rasp or sandpaper, which will be described later, or a tissue obtained by a surgical operation or biopsy or a part thereof may be used.
In the present invention, since it is possible to measure the telomere length of a small amount of DNA, a skin scraping piece or the like can be suitably used.
[0019]
Examples of the site for collecting the skin abrasion scraps and the like include the face, the upper arm, the back, the buttocks, the thighs, and other various sites, but are not limited to these sites. Therefore, by comparing each telomere length of DNA obtained from skin collected from a part that is often exposed to sunlight such as a face and a part that is not exposed to sunlight such as a buttocks It becomes possible to examine the photoaging degree of the cells.
Moreover, the skin aging degree for cosmetics can be measured by selecting the skin or the like at the intersection of the vertical line of the corner of the eye and the horizontal line of the upper end of the nose in the standing position or sitting position on the top of the cheekbone (FIG. 3). .
[0020]
For example, if a scrubbing scrap (rasp) is used, it can be collected without pain, bleeding, and no trace. Below, the case where a skin abrasion cell waste piece is extract | collected using a rasp is mentioned as an example, and is demonstrated.
In other words, the rasp is a skin abrasion device having a structure as shown in FIG. 1A. The
[0021]
Here, the thorn refers to a fiber that is implanted in the head of the rasps in order to obtain a skin abrasion piece. The material of the thorn is not particularly limited as long as it can scrape the skin so that there is no pain, no bleeding, and no traces, and the skin scraps can be collected. From the viewpoint of production cost, it is preferable to use polypropylene, polyacryl, polyethylene, aluminum, stainless steel 18-8, or the like.
[0022]
Further, as shown in FIG. 1C, the tip portion of the thorn is made of a fibrous material having a diameter of about 1 to 10 μm, and the tip has an acute angle. This angle is 30 ° at the maximum, and 0.2 to 5 ° is suitable for collecting skin debris by rubbing the skin so that there is no pain, no bleeding, and no trace.
[0023]
The shape of the head of the rasp may be any shape such as a disc shape, an oval disc shape, a square plate shape, a rectangular parallelepiped shape, and is not particularly limited. From the relationship of the amount of DNA that can be collected, the size is 5 to 20 mm in diameter or 5 to 20 mm on a side in the case of a disc or square plate, and the major axis radius is 5 to 20 mm in the case of an ellipse. In the case of a short axis radius of 1 to 5 mm or a rectangular plate-like body, one side is preferably about 1 to 5 mm × 5 to 20 mm.
[0024]
The thickness is not particularly limited as long as it can be combined with a gripping portion to be described later, but is preferably about 1 to 8 mm.
In order to scrape the skin and collect skin scraping debris, about 25 to 225 of the above-mentioned thorn is applied to the head having the above shape.2Then, implant so that the length from the implantation surface of the head is about 1 to 5 mm. Implantation may be performed by methods known to those skilled in the art.
[0025]
The gripping part that can be held by hand is connected to the head thus formed so as to be separated from the head. The size of the gripping part is not particularly limited as long as it can be held by hand, and specifically, a columnar shape with a length of 30 to 100 mm and a diameter of 2 to 8 mm, and a major axis radius of 5 to 5. Examples thereof include an elliptical columnar shape having a minor axis radius of 20 mm and a short axis radius of 2 to 10 mm, or a rectangular columnar shape having a side of 3 to 15 mm.
[0026]
Such a gripping part may be formed separately from the head of the rasp or may be formed integrally with the head. In the case of molding separately from the head, for example, one end of the gripping portion can be fitted or screwed into a surface of the head that is not implanted with the thorn. Further, in the case of integral molding, for example, by applying an external force with tweezers or the like, an incision 8 (appropriate depth between the head and the gripping part is provided so that the head can be easily separated. (See FIG. 1B).
[0027]
The material used to make the rasps is not particularly limited, but it is easy to obtain, mold and sterilize the molded product, and it is necessary to reduce the manufacturing cost of the disposable rasps, so polyethylene, polystyrene, polypropylene, Plastics such as polyacryl and polyvinyl chloride, and metals such as aluminum, steel, and stainless steel can be preferably used.
In particular, production of polypropylene or aluminum has the advantage that the manufacturing cost of the rasps is low or sterilization is easy.
[0028]
As a specific example of the above-mentioned rasp, there can be mentioned a polypropylene made of a rectangular parallelepiped head of about 3 × 10 × 15 mm, a gripping portion having a diameter of about 5 mm and a length of about 100 mm (see FIG. 1). . On the head of this rasp, there are about 100 thorns with a tip angle of about 0.8 degrees.2It is good to plant uniformly so that the length from the planting surface to the tip is about 2 mm.
The rasp produced as described above is packed in a sterile bag and sterilized by, for example, γ-ray irradiation.
[0029]
Gently apply the above-mentioned rasp to a clean, appropriate site and gently rub this site several times to collect skin scraps.
Next, the head of the rasp with the scrubbing piece at the tip of the thorn is separated from the gripping part by, for example, pinching with tweezers and separated from the gripping part, and the aqueous solution is put into the head of this rasp using tweezers etc. Transfer to an appropriately sized container and collect the scraped skin scraps.
[0030]
The aqueous solution used here is preferably sterilized water to eliminate microorganism-derived DNase, and a preservative such as sodium azide may be added as appropriate. From the viewpoint of DNA recovery efficiency, it is preferable to collect about 0.3 to 1.6 mL of the aqueous solution in a container having a capacity of about 0.5 to 2 mL and collect the skin cells here.
[0031]
For example, an Eppendorf tube with a 1.5 mL lid is charged with 1.3 mL of MilliQ ultrapure water containing 0.1% sodium azide, and the head of the rasp from which the above-mentioned scraping cell debris is collected is added. When the inner diameter of the Eppendorf tube used at this time is within 7 mm, it is possible to efficiently collect the scrubbing scraps.
[0032]
The scraped cell debris collected as described above can be crushed by the following known methods, but is not particularly limited. For example, it may be chemically crushed using a surfactant, alkali or enzyme, or physically crushed by freeze-thawing, sonication using an apparatus such as ultrasonic, etc. You may crush in combination.
[0033]
Since the DNA to be extracted is less damaged, it is preferable to freeze and thaw the aqueous solution containing the collected cells, and then crush it completely using concentrated alkali. Freezing and thawing may be repeated.
Examples of the alkali include sodium hydroxide and potassium hydroxide. When these are added to the above aqueous solution so that the final concentration is about 5 to 20 mM and stirred vigorously with a vortex mixer or the like, the DNA extraction efficiency is increased. Can be increased.
[0034]
For cell disruption, for example, the above-mentioned 1.5 mL Eppendorf tube with a lid is immersed rapidly in liquid nitrogen and hot water alternately, and freeze-thaw is repeated twice. Next, alkali can be added by adding a small amount of concentrated NaOH to a final concentration of 12 mM and vigorously stirring with a vortex mixer. The head of the rasp in the tube is spun down and removed with tweezers.
[0035]
In addition to freeze-thawing as described above, the disruption of the cells may include surfactants such as lauroyl sarcosinate, Triton X-100, sodium lauryl sulfate (SDS), proteases such as proteinase K and pronase, RNase and other enzymes, You may carry out by the normal method using precipitation agents, such as iodide sodium isopropyl alcohol and ethanol.
[0036]
In the present invention, when DNA is extracted with a small amount of liquid, cells are crushed as described above, and a predetermined amount of mineral oil is overlaid after the fragments are precipitated. This is suitable for preventing evaporation of the aqueous solution.
Examples of such mineral oils include light mineral oil M-5904 (manufactured by Sigma), and the amount of the layer is about 10% to prevent moisture evaporation and stably extract DNA. Preferred above.
[0037]
When an alkali is used, the aqueous solution containing the DNA is neutralized with a high concentration acid or buffer. Examples of such an acid include hydrochloric acid and the like, and examples of a buffer include tris hydrochloric acid buffer (pH 7.0).
For example, after neutralizing with 1 M Tris-HCl buffer (pH 7.0), the solution under the oil layer may be accurately sucked out with a pipette.
The DNA from the skin cells obtained as described above may be directly subjected to the treatment described later, or may be stored frozen, for example.
[0038]
The obtained DNA is digested with a restriction enzyme selected from the group consisting of HinfI, MspI / HpaII, and RsaI to obtain a terminal restriction DNA fragment (TRF). By digesting with these restriction enzymes, TRF having sticky ends and protruding ends can be obtained (FIG. 2). Here, “telomere-specific 3 ′ overhanging end” refers to a single-stranded oligonucleotide moiety consisting of about 10 to 20 nucleotides present on the 3 ′ side of TRF. In FIG. 2, E represents a part to be endfilled, A represents a part having the same sequence as the sense primer, and B represents a part having the same sequence as the antisense primer. In addition, the length of the sticky end is 1 to 5 bases, and in
In the present invention, it is preferable to digest with HinfI from the base sequence of the restriction end to be formed. However, when it is necessary to examine the telomere length over time, it is preferable to digest with MspI because it is necessary to limit the amount of skin scraping pieces that can be collected at one time from the same collection location.
[0039]
Subsequently, the TRF having the sticky end and the telomere-specific 3 ′ protruding end is converted into a blunt end fragment by the following end modification method.
In the first method, a first double-stranded oligonucleotide having a sticky end complementary to the sticky end of the TRF is prepared as a linker, and the oligonucleotide is bound to the sticky end of the TRF. Next, the other end having the 3 ′ protruding end peculiar to the TRF telomere is placed on the 5 ′ side of the oligonucleotide portion complementary to the sequence of 6 to 24 bases from the 3 ′ side of the protruding end, and the double-stranded 3− A 12 base pair oligonucleotide is ligated as a primer, and this is endfilled according to a conventional method using, for example, a DNA polymerase.
A second double-stranded oligonucleotide (linker) having blunt ends at both ends is ligated to the end-filled protruding ends according to a conventional method to obtain blunt-ended fragments.
[0040]
In the second method, a linker comprising two double-stranded oligonucleotides having a sticky end and a sticky end complementary to the sticky end and telomere-specific 3 ′ sticking end of TRF obtained as described above Are bound according to a conventional method to obtain blunt-ended fragments. Two double-stranded oligonucleotides having a sticky end and a protruding end may be bound to both ends of the TRF at the same time, or one at a time.
[0041]
In the third method, the sticky end and the protruding end of the TRF obtained as described above are endfilled in the same manner as in the first method to form a blunt end, and two blunt ends are formed here. Linkers are attached to obtain blunt end fragments. The two linkers used here may be simultaneously bonded to both ends of the TRF, or may be bonded one by one.
[0042]
The inclusion of a sequence that binds to the nucleotide sequence of the primer used in the amplification step described later in the plus strand of the linker composed of the above double-stranded oligonucleotide enables accurate and rapid amplification of these blunt-ended fragments. Can be detected easily.
The linker used in the present invention preferably contains the
5 'AATCCGTCGAGCAGAGTTC 3'
More preferably, the sequence (SEQ ID NO: 3) is included.
[0043]
A linker suitable for binding to the subtelomere side of the DNA extracted from the skin abrasion scraps in the present invention,
5 'AATCCGTCGAGCAGAGTTC 3'
3 'TTAGGCAGCTCGTCTCAAGTGA 5'
It has a sticky end represented by (SEQ ID NO: 1).
[0044]
Further, in the present invention, the sequence of 5′-CCCTAA-3 ′ that is complementary to the sequence of 6 to 24 bases from the telomere-specific 3 ′ protruding end telomere side (that is, 3 ′ side of the telomere-specific 3 ′ protruding
5 '(CCCTAA)ThreeCCCTAA 3 '
(SEQ ID NO: 4) is preferable. This is because, when such a linker linked to the telomere side has such a sequence, it becomes a mismatch with the AGAGTT of the nucleotide sequence to be bound to the subtelomere side, so that primer-dimer artifacts can be prevented.
[0045]
As a specific linker to be attached to the telomere side of the 3 'protruding end specific to telomere,
5 '(CCCTAA)ThreeCCCTAA 3 '
3 '(GGGATT)ThreeGGGATT 5 '
Those having a blunt end having the sequence (SEQ ID NO: 2) are preferred.
[0046]
Such a linker may produce each chain by chemical synthesis and hybridize these two synthetic oligonucleotides, or may perform enzymatic synthesis using the synthesized plus strand and DNA polymerase.
For example, a linker composed of the double-stranded oligonucleotide of the present invention can be synthesized using a DNA synthesizer (Pharmacia Biotech) according to the Phosphoramidite method. The synthesized oligonucleotide can be cut out from the column with alkali and then purified by polyacrylamide gel electrophoresis containing 7M urea or reversed-phase high-performance liquid chromatography (HPLC) using Chroma Spin-10 column (Clontech). Good.
[0047]
In the present invention, the sense primer and the antisense primer used in the polymerase chain reaction (PCR) of the blunt-ended fragment are included in the linker consisting of the double-stranded oligonucleotide used for the production of the blunt-ended fragment as described above. Contains an array. These primers can be synthesized using a DNA synthesizer according to a conventional method. In addition, the above-mentioned primers can be synthesized by allowing a Klenow fragment to act and by a multi-primer method (random primer method), a nick translation method, or the like.
[0048]
The lengths of the base sequences of these primers are not particularly limited, but are preferably about 15 to 35 bases in view of easy synthesis and the absence of primer dimer artifacts.
Here, “primer dimer artifact” means that primers anneal to each other to form a dimer.
As described above, the synthesized primer is purified according to a conventional method using polyacrylamide gel or reverse phase high performance liquid chromatography (HPLC) using Chroma Spin-10 column (manufactured by Clontech) and used in PCR.
[0049]
Examples of linkers and primers composed of double-stranded oligonucleotides used in the present invention include linkers and primers described in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.
A primer having such a nucleotide sequence does not cause primer dimer artifact, and can efficiently amplify a nucleotide sequence serving as a template even in an amplification step.
[0050]
In the present invention, the blunt-ended fragment obtained by the treatment as described above is a template (template) and a TS primer (sense primer, SEQ ID NO: 3) having the following sequence:
5 'AATCCGTCGAGCAGAGTTC 3'
And CX primer (antisense primer, SEQ ID NO: 4)
5 '(CCCTAA)ThreeCCCTAA 3 '
TRF is amplified by performing PCR according to normal conditions.
[0051]
The sequence of the CX primer used in the present invention is not a sequence that is completely complementary to the telomere repeat sequence, but includes a base that becomes a mismatch when annealed. By including such a mismatched base, it is possible to prevent the primer dimer from being formed by annealing with the telomere sequence portion of the template, and preferentially anneal to this sequence during the second and subsequent cycles of PCR. By doing so, shortening of the amplified fragment can be prevented.
[0052]
The amplification product thus obtained is electrophoretically separated by various electrophoresis methods such as agarose gel electrophoresis and SDS-PAGE, transferred to a membrane filter, and then detected with a labeled probe.
In the present invention,
(TTAGGG)n(Where n represents an integer of 3 to 5, SEQ ID NOs: 5 to 8)
Or
(TAACCC)m(Here, m represents an integer of 2 to 6, SEQ ID NOs: 9 to 13)
It is preferred to use a probe comprising
[0053]
This is because when n is 2 or less, there is a problem that the binding affinity is weak. Conversely, when n is 6 or more, handling as a probe becomes difficult. This is also because there is a similar problem when m is 1 and when it is 7 or more.
(TTAGGG)n(SEQ ID NO: 5-8) or (TAACCC)nUse of (SEQ ID NOs: 9 to 13) as a probe has an effect of improving accuracy, sensitivity, and operability during telomere detection.
[0054]
The template used here must be at least 5'- (TTAGGG)Three-3 'and / or 5'-(TAACCC)Three-3 'and a complementary nucleotide sequence, and a restriction enzyme recognition sequence adjacent to this sequence are included. “Restriction enzyme recognition sequence” refers to a base sequence that is recognized and cleaved by a restriction enzyme. Specifically, a base sequence recognized by a restriction enzyme selected from HinfI, MspI / HpaII, and RsaI is preferable.
The primer also contains a base sequence recognized by the restriction enzyme.
[0055]
Template, primer and [α-ThreeH] When DNA polymerase is allowed to act on a substrate consisting of dNTP under normal conditions, [α-ThreeH] A reaction product containing dNTPs can be obtained. When the above restriction enzyme is allowed to act on the reaction product according to the usual conditions, a probe with a high labeling rate can be obtained (for example, the method of Harley et al. (Harley C.B. et al., Nature345:458-460 (1990); Vaziri H. et al, EMBO J.16:6018-6033 (1997); Kruk P.A. etal., BBRC224:487-492 (1996))).
[0056]
Here, “a probe with a high labeling rate” means about 0.5 to 9 × 10 6 when a radioisotope is used as a label.7It has a radioactivity of cpm / pmol. When a fluorescent compound is used as a label, or when a chemiluminescent compound is used as a label, two or more locations are labeled instead of a single location such as the conventional 5 'end label, and the fluorescence intensity or emission intensity Refers to a probe that is high.
[0057]
Examples of the labeling compound used in the present invention include, but are not limited to, the following. Radioactive labels include [ThreeH], [32P] or [14C] and the like.
Examples of non-radioactive labels include fluorescent compounds such as fluorescein isothiocyanate (FITC) and red tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), and chemiluminescent compounds such as horseradish peroxidase (HRP) and luciferase.
[0058]
Labeled probes using these non-radioactive labels are prepared by the method of Langer-Safer et al. (P.R.Langer-Safer, M.Levine, and D.C.Ward, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.79: 4381-4385), Rigby et al. (T.W.J., Rigby, M. Dieckmann, C. Rhodes, and P. Berg, J. Molec. Biol.113: 237-251 (1977)).
[0059]
In the present invention, fluorescently labeled nucleotides such as biotin-labeled dCTP, digoxigenin-labeled dUTP, FITC-labeled dGTP, TRITC-labeled dCTP, [α-ThreeH] dNTP, [γ-ThreeP] dNTP or [α-14C] Use of radiolabeled nucleotides such as dNTPs, or enzyme-labeled nucleotides such as horseradish peroxidase-labeled nucleotides and luciferase-labeled nucleotides is preferable for detecting a small amount of DNA from skin scraps with high sensitivity.
[0060]
When a fluorescent probe is used among these labeled probes, detection with higher sensitivity is possible by adding a sensitizer. For example, when biotin-labeled dCTP is used, the fluorescence intensity increases when streptavidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) is bound to the labeled probe and then hydrogen peroxide and a sensitizer are used.
As the sensitizer, fluorescein-tyramide (manufactured by NEN Life Science Products), biotin, phlorestin (manufactured by molecular probe) and the like can be preferably used.
[0061]
When a non-radioactive labeled probe such as biotin-labeled dCTP or digoxigenin-labeled dUTP is used, it can be operated outside the radioactive safety management facility, and skin aging can be easily measured.
[0062]
Further, the radiolabeled probe of the present invention has [γ-32The specific activity of a conventional labeled probe (Harley C.B. et al. (Supra)) 5′-end labeled with P] ATP and T4 polynucleotide kinase is 1-3 × 106Compared to cpm / pmol, the specific activity is 2-7 × 107Since it is several times higher than cpm / pmol, telomere length can be measured with high accuracy using DNA extracted from a small amount of skin scraping pieces. further,[ThreeThe use of H] labels has the advantage of high safety for researchers using them.
[0063]
In the present invention, DNA is extracted from the skin scraping pieces as described above, treated with a desired restriction enzyme, and made blunt ended by end modification. A linker consisting of a double-stranded oligonucleotide containing the desired sequence is bound thereto, and an amplification product partially containing the entire telomere sequence is obtained by PCR. When this amplified product is electrophoretically separated, transferred to a membrane filter and bound to the labeled probe prepared as described above, an electrophorogram is obtained.
[0064]
The obtained electrophorogram is taken into, for example, an image analysis apparatus such as Molecular Imager (manufactured by BioRad), and when a fluorescently labeled probe is used, the mass center of the fluorescent band is obtained. Here, the weighted average DNA length is called mass center. The mass center is calculated based on the following formula (1) based on the molecular weight of the marker DNA subjected to electrophoresis at the same time.
[0065]
MCav= Σ (MWi× FIi) / Σ (FIi)
Where MCavRepresents a mass center, and MW is a DNA length obtained from marker DNA subjected to electrophoresis at the same time. FI represents the fluorescence intensity, and I represents the position of the band.
Based on the above formula, the average telomere length can be obtained as an average value ± standard deviation (kb), and the skin aging degree can be known from this value.
[0066]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited to these.
[0067]
(Example 1) Collection of skin
(1) Selection of collection site
The skin collection site is selected as follows.
In the case of a face, while looking at the face in the mirror, in the standing or sitting position, select the cheek skin (Figure 3) at the intersection of the vertical line of the corner of the eye and the horizontal line of the upper edge of the nose, or do not look in the mirror Then, touch the top of the cheekbone with a clean finger touch and select the skin above it.
For a part other than the face, a part that is not exposed to sunlight, such as the buttocks and thighs, is selected.
[0068]
(2) Preparation for collecting skin
If the skin is collected on the face, thoroughly wash the area near the cheeks with soap and rinse with water. Preferably, the area near the cheeks was wiped with a cotton soaked with alcohol for disinfection (about 70%).
When the skin was collected at a location other than the face, as with the face, the skin was washed with soap, rinsed with water, and similarly wiped with alcohol.
[0069]
(3) Collection of skin
A rasp was applied to the skin collection site determined in (2) above, and the same site was lightly rubbed several times to collect skin scraps.
A 1.5 mL Eppendorf tube with a lid (within 7 mm inner diameter) containing 1.3 mL of sterilized water (MilliQ ultrapure water containing 0.1% azide) was prepared in order to put the collected skin scraps. The head and handle of the rasp that had been scraped off the skin as described above were separated, the head was pinched with the attached tweezers, put into this Eppendorf tube, and sealed.
[0070]
(Example 2) Treatment of collected skin sample
(1) Cell disruption
The freeze-thaw operation in which the Eppendorf tube containing the skin scraping pieces was frozen by immersing in liquid nitrogen and then immersing in hot water to melt was repeated twice. Next, a small amount of concentrated NaOH was added so that the final concentration was 12 mM, and the cells were disrupted by vigorous stirring with a vortex mixer. After this crushing, the head of the rasp was removed from the tube.
[0071]
(2) Preparation of test sample
After spinning down the crushed material, light mineral oil M-5904 (manufactured by Sigma) was layered to a volume of 10% and heated in a heat block at 95 ° C. for 10 minutes.
After this, 1M Tris-HCl buffer (pH 7.0) is added to neutralize the aqueous solution containing the sample, and the sample under the oil is accurately sucked out with a pipette, transferred to an Eppendorf tube, and frozen at −80 ° C. did.
[0072]
After returning the sample frozen at −80 ° C. to room temperature, extraction was performed using IsoQuick Nucleic Acid Extraction Kit (ORCA Research Inc.). The extracted DNA was dissolved in TE (10 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 1 mM EDTA) and stored at 4 ° C.
[0073]
DNA concentration measurement is Mupid's mini gel electrophoresis tank (Cosmo Bio), 0.35% agarose (TYPE H, Wako Pure Chemical) gel, 5% glycerin, 0.025% bromophenol blue (BPB), 0.025% A loading buffer containing xylene cyanol FF was used. A DNA sample made heavy by adding 5 μL of TE to 1 μL of DNA solution and 10 μL of λDNA (100 ng / mL) prepared for the control sample were applied to separate gels, and 1 × TAE buffer (5 mM acetic acid and Electrophoresis was performed in 40 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 1 mM EDTA, and the electrophoresis was stopped when BPB had reached 2/3 of the gel.
[0074]
This gel was stained with 2 μg / mL ethidium bromide and placed on a UV transilluminator (VILBER LOURMAT TF-40M), and each photograph was taken.
Image analysis (NIH Image) was performed on this photograph, and the DNA concentration was determined by comparison with the control.
[0075]
(3) Storage of test sample
The collected samples were measured for the amount of keratinocytes and the amount of DNA. The amount of keratinocytes is measured with a Coulter particle size counter and averaged from 1 mg to 1.5-6
The DNA-containing tube was stored at -70 ° C. until the number of samples collected was collected to some extent.
[0076]
(Example 3) Analysis of terminal restriction DNA fragment TRF length by Southern blotting
(1) Sample preparation
To a 1.5 mL tube, 2 μL of 10 × H buffer (Takara Shuzo), 2 μL of DNA solution, and sterilized water were added to a total volume of 19 μL, and finally Hinf I (6 U / μL, Takara Shuzo) was added.
The mixture was reacted at 37 ° C. for 3 to 4 hours and subjected to electrophoresis. Samples that were not electrophoresed immediately after the reaction were stored at -20 ° C.
[0077]
(2) Agarose gel electrophoresis
An agarose (TYPE I, Sigma) gel was prepared so that the gel concentration in the bridge portion was 1% and the bed portion was 0.8% (Marisol KS-8405, 20 cm × 14 cm). As the electrophoresis buffer, 1 × Boyer buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 20 mM sodium acetate, 2 mM EDTA, 18 mM NaCl) was used.
[0078]
As markers, 1 kb DNA Ladder (GIBCO BRL) adjusted to 0.5 μg / lane and λDNA / Hind III digest (NIPPON GENE) adjusted to 0.3 μg / lane were used.
A sample to which 3 μL each of a marker and a loading buffer was added was applied to a 0.8% agarose gel prepared as described above, drawn at 85 volts, and then run at 35 volts.
[0079]
(3) Southern transfer
After the electrophoresis was completed, the agarose gel was cut out, stained with 2 μg / mL ethidium bromide for 15 minutes, placed on a UV transilluminator and photographed with a scale.
After photography, the gel was soaked in 0.25N HCl, shaken at room temperature for 15 minutes, and then washed twice with distilled water.
[0080]
The gel was then immersed in a denaturalization solution containing 0.2 M NaOH and 0.6 M NaCl, shaken at room temperature for 25 minutes, and then washed three times with distilled water.
The gel was immersed in a neutralization solution (0.2 M Tris-HCl (pH 7.4) containing 0.6 M NaCl), shaken at room temperature for 30 minutes, and washed once with distilled water. Thereafter, it was again immersed in the Neutralization solution and shaken at room temperature for 30 minutes.
[0081]
Nitrocellulose membrane filter (OPTITRAN BA-S 85, manufactured by Schleicher & Schuel) soaked in gel and 6x SSC to prevent air from entering 3MM filter paper set in a blotting device filled with 6x SSC, 6x 3MM filter paper soaked in SSC, paper towel, glass plate, weight (2 kg) were placed in this order, and blotting was performed overnight.
After the blotting was completed, the membrane filter was immersed in 3 × SSC, lightly drained, and the position of the well was recorded on the UV transilluminator.
The paper was sandwiched between filter papers and heated at 80 ° C. overnight (baking).
[0082]
(4) DNA hybridization
5 '-(TTAGGG) as a prehybridization probeFour-3 '(Takara Shuzo) was used. Connect this probe to MEGALABELTM Using DNA 5'-End Labeling kit (Takara Shuzo), [γ-32P] ATP (Amersham) was used for 5 ′ end labeling. The labeled probe was recovered by reverse phase HPLC using a Chroma Spin-10 Column (Clontech) according to a conventional method.
[0083]
The baked filter is immersed in 3 × SSC, and then immersed in a hybridization buffer (containing 1 × Denhardt's solution, 1M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 0.1% SDS, 50 μg / mL denatured salmon sperm DNA). The mixture was shaken at 65 ° C. for 3 to 4 hours, and prehybridization was performed with the above probe.
[0084]
After pre-hybridization, the membrane filter was placed in a shield bag, and 2 mL of hybridization buffer containing a labeled probe and 1 μL of denatured salmon sperm DNA (10 mg / mL) was added to seal against bubbles. .
Hybridization was performed by incubation overnight at 50 ° C.
[0085]
(5) Cleaning and autoradiography
After hybridization, the filter was immersed in a washing buffer (4 × SSC, 0.1% SDS) and shaken at 55 ° C. for 15 minutes. After repeating this operation four times, drain the filter well, wrap it with Saran wrap, set it with a X-ray film (Scientific Imaging Film, manufactured by Kodak) in a cassette with intensifying screen, and overnight at -80 ° C. Autoradiography was performed.
[0086]
(6) Data analysis
The position of the developed film and the filter were aligned, and the position of the well was marked with magic. Since TRF appears on the smear, the peak of the darkness of this smear was detected by densitometry (Ultra Scan XL Laser Densitometer, manufactured by Pharmacia). The distance from the well to the peak was defined as mobility, and the length of TRF was determined from a calibration curve created using the mobility and the marker.
[0087]
(Example 4) Measurement of average telomere length using alkaline phosphatase (AP) label and / or biotin label probe
(1) Synthesis of linkers and PCR primers composed of double-stranded synthetic oligonucleotides
(1-1) Synthesis of linker
Linkers (SEQ ID NOs: 1 and 2) consisting of double-stranded oligonucleotides used to obtain blunt-ended fragments were synthesized by the phosphoramidite method using a DNA synthesizer (manufactured by Pharmacia Biotech). That is, the reaction substrate amidite is bonded to the 3 ′ end of the nucleotide fixed to the column, the unreacted substrate is removed and the functional group is capped, the acid treatment is performed to remove the trityl group, and the amidite is bonded again here. And the above procedure was repeated for synthesis. Oligonucleotides synthesized by alkali treatment were excised from the column, deprotected, purified by reverse phase HPLC, and fractions of oligonucleotides used as linkers in the following examples were collected.
[0088]
(1-2) Synthesis of PCR primers
A TS primer (subtelomere side primer, SEQ ID NO: 3) and CX primer (telomere side primer, SEQ ID NO: 4) used in PCR were prepared by a DNA synthesizer.
Synthesized in the same way (TTAGGG)FourThe probe was treated with formaldehyde, a bifunctional reagent, and alkaline phosphatase (AP) was chemically coupled directly and labeled. For this labeling, AlkPhos Direct (Pharmacia) was used.
The TRF obtained in Example 3 (1) was fractionated by agarose gel electrophoresis as shown in Example 3 (2). As a marker, a 1 kb DNA ladder (manufactured by BioRad) was used.
[0089]
(2) TRF detection
The gel electrophoresed as described above was transferred to a nitrocellulose membrane filter (OPTITRAN BA-S, Schleicher & Schuel) using a transblotter (BioRad).
To this filter, 0.2 μg / mL of the AP-labeled probe or biotin-labeled probe obtained as described above was bound. The biotin-labeled probe was obtained by adding 0.3 μg / mL biotin-labeled dCTP (Pharmacia Biotech) and dNTP, reacting with 0.1 μg / mL Klenow fragment (Takara Shuzo), and cleaving with restriction enzyme SmaI. It was.
[0090]
Then, in the case of an AP-labeled probe, it is reacted with CDP-Star to produce chemiluminescence. In the case of a biotin-labeled probe, 0.4 μg / mL streptavidin-conjugated HRP (Boehringer Mannheim) and 15 ° C. at 15 ° C. Allowed to bind for minutes. This is followed by 100 μM hydrogen peroxide and 0.8 μg / mL fluorescein-tyramide (NEN Life Science Products) and / or 0.3 μg /
This fluorescence was detected with CDP-Star (Pharmacia).
[0091]
(Example 5) Measurement of average telomere length using radiolabeled probe
(1) Synthesis of linker and PCR primer consisting of double-stranded oligonucleotide In the same manner as in (1) of Example 4, the linker (SEQ ID NO: 1 and 2) and PCR primer (SEQ ID NO: 3 and 4) were used as DNA. The synthesis was performed using a synthesizer (Pharmacia Biotech).
[0092]
(2) Acquisition of TRF blunt ends
The DNA obtained from the scraped skin pieces obtained in Example 1 was treated with HinfI (Takara Shuzo) at 37 ° C. for 3 to 4 hours to obtain a DNA fragment having a sticky end and a protruding end. On the subtelomere side of the DNA fragment (TRF) having a sticky end and a protruding end obtained in (1) above, the following sequence:
5 'AATCCGTCGAGCAGAGTTC 3'
3 'TTAGGCAGCTCGTCTCAAGTGA 5' (SEQ ID NO: 1)
Linker S having a linkage was attached (see FIG. 2).
[0093]
Next, after the linker T (see FIG. 2) was bitten into the 3 ′ protruding end of the telomere side of the TRF that had been blunted on the subtelomere side, endfilling was performed with DNA polymerase, and the TRF blunt end having the following telomere side end was obtained. Obtained. In this linker T, the base sequence of the primer for the PCR amplification process described later is included.
… GGTTAGGGTTAG 3 '
… CCAATCCCAATC 5 '
[0094]
DNA ligation was performed using DNA Ligation Kit ver.1 (Takara Shuzo).
A TRF sample with blunt ends at both ends is put into a microtube and incubated according to a conventional method using DNA Ligation Kit ver.1 (Takara Shuzo). Then, an equal volume of phenol is added to the microtube, and then 4 volumes. The ice-cold ethanol was added and precipitated to separate blunt-ended fragments.
[0095]
(3) Amplification
Using this blunt-ended fragment as a template, a thermal cycler PC was prepared using the TS primer (sense primer, SEQ ID NO: 3) synthesized in (1-2) of Example 4 and the CX primer (antisense primer, SEQ ID NO: 4). PCR was performed in a PCR mix of the following composition at -800 (Astec).
20 mM Tris-HCl (pH 8.3), 68 mM KCl, 1.5
[0096]
The CX primer was sequestered at the bottom of the tube with wax and overlaid with a reaction mix containing other components. The total volume of this reaction mix was 80 μL.
Using a thermal cycler PC-800 (manufactured by Astec), PCR was performed for 32 cycles with 94 ° C. for 40 seconds / 50 ° C. for 40 seconds / 72 ° C. for 50 seconds as one cycle.
[0097]
(4) Electrophoretic separation and detection of increased by-products
(4-1) Separation and detection of increased by-products
The amplified product amplified in (3) above was processed, and TRF obtained from skin-derived DNA was fractionated by agarose gel electrophoresis. As a marker, a 1 kb DNA ladder (manufactured by BioRad) was used.. ElectricThe electrophoresed telomere-containing DNA fragment and the like were transferred to a nitrocellulose membrane filter (OPTITRANBA-S, Schleicher & Schuel) using a gel transblotter (manufactured by Bio Rad). To this filter, 0.2 μg / mL of radiolabeled probe was bound.
[0098]
(4-2) Detection of average telomere length
The electrophorogram obtained as described in (4-1) above is analyzed by densitometry (NIH Image 1.59), taken into Molecular Imager (manufactured by BioRad), and the mass center is calculated according to the following formula (1) did.
MCav= Σ (MWi× FIi) / Σ (FIi) ... Formula (1)
Where MCavRepresents a mass center, and MW is a DNA length obtained from marker DNA subjected to electrophoresis at the same time. FI represents the fluorescence intensity, and I represents the position of the band.
[0099]
The measured average telomere length of DNA obtained from the top of the cheekbone, below the eye and above the genital area (hereinafter referred to as the part of the face other than the top of the cheekbone), and the scrubbing piece of the buttocks. It shows in Table 1 as an average value +/- standard deviation (kb).
[0100]
[Table 1]
As is clear from Table 1, the average telomere length of any part was shortened as the age increased. In addition, except for the average telomere length on the top of the cheekbone, the standard deviation (SD) of the average telomere length was increased in proportion to the age. In addition, the average telomere length reduction on the top of the cheekbone was the largest, but the increase in SD was small. In addition, telomere shortening in the buttocks was the slowest. Further, looking at the average telomere length, it was found that the top of the cheekbone <the face other than the top of the cheekbone <the buttocks.
[0102]
From the above results,
(1) Shorten telomere in any part of skin with age
(2) The degree of shortening of the telomere on the skin increases with individual differences as the age increases
(3) It should not cause the same telomere shortening in any part of the face
[0103]
(4) There is little variation in telomere shortening on the top of the cheekbone, and it can be used as a good index of skin aging by selecting a specific site
(5) The degree of shortening of the average telomere length suggests that the buttocks are not subject to much photoaging
(6) The average telomere length of the buttocks can be a good standard when measuring the age of skin with age of the same individual
Became clear.
[0104]
(Example 6) Preparation of high specific activity radioactively labeled probe
(1) Preparation of telomere detection probe and template
Telomeres were made as follows. Primer for DNA synthesis of telomeres without 5 'end labeling and can be separated from telomeres by restriction enzymes in a later step
5 'CACGTGCTCGAGCCC 3' (SEQ ID NO: 14)
Was synthesized with a DNA synthesizer (Pharmacia Biotech).
Also template
3 'GTGCACGAGCTCGGG (CCCAAT)FourTCTAATCTGA 5 '(SEQ ID NO: 15)
Was synthesized in the same manner as the above primer.
[0105]
(2) Synthesis of telomere detection probe
6.7 mM MgCl2And 67 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) containing 1 mM 2-mercaptoethanol, 20 μM of the primer and template synthesized in (1) above, and 5′-AGATTAGACT-3 ′ sequence Oligonucleotide, 33 μM [α-ThreeH] dGTP, 22 μM [α-ThreeH] dTTP, and 11 μM [α-ThreeH] dATP was mixed in 10 μL (pH 7.4) of a solution containing 0.37 units of Klenow fragment (Takara Shuzo), which is a large fragment of Escherichia coli DNA polymerase I, and reacted at 10 ° C. for 60 minutes. By sandwiching with an oligonucleotide having the
[0106]
The labeled product was purified using Quick Spin Column Sephadex G-25 (manufactured by Boehringer Mannheim), which is a gel filtration column, and 10 mM Tris buffer (pH 8.0) -20 mM KCl.
Then, 6 units / 10 μL of restriction enzyme SmaI (Takara Shuzo) was added in 10 mM Tris buffer (pH 8.0) -20 mM KCl and reacted at 30 ° C. for 40 minutes.
[0107]
This restriction enzyme digest was further purified in the same manner as described above using a Chroma Spin-10 column (Clontech) and polyacrylamide gel electrophoresis, and further digested with the restriction enzyme HindIII (Takara Shuzo). The enzyme digest was similarly purified in the presence of 7M urea.
The radiolabeled probe thus purified was measured with a liquid scintillation counter.7A specific activity of radioactivity of cpm / pmol was obtained.
[0108]
This value is the same as the conventional [γ-32P] dATP end-labeled probes 1-3 × 106Compared to the specific activity of at least 6 times, the maximum was 20 times or more. Therefore, when this radiolabeled probe is used, the amount of TRF to be subjected to agarose gel electrophoresis can be reduced to 1/6 to 1/20 when using a conventional probe. For this reason, it is useful when it is desired to measure the aging degree of the skin without leaving a trace, such as the facial skin, or when only a very small amount of scraped skin can be obtained.
[0109]
【The invention's effect】
According to the method of the present invention, the degree of skin aging can be measured quickly and accurately using a small amount of DNA.
In the present invention, the aging degree of the skin can be measured quickly and safely with high sensitivity by using no radioactive label or using a small amount of radioactive label.
[0110]
[Sequence Listing]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a rasp of the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing a structure of a TRF.
FIG. 3 is a view showing a collection site of skin scraping pieces on the face.
FIG. 4 is a diagram showing the production of a telomere detection probe.
Claims (8)
5' AATCCGTCGAGCAGAGTTC 3' （配列番号３）
を含み、増幅工程で用いるセンスプライマーが、前記付着末端側のリンカーに含まれるヌクレオチド配列を有し、増幅工程で用いるアンチセンスプライマーが、前記突出末端側のリンカーに含まれるヌクレオチド配列を有する皮膚の老化度の測定方法。Both ends of a fragment having one sticky end and a telomere-specific 3 'protruding end obtained by restriction enzyme treatment of DNA extracted from the rubbing scrap collected from the rasp according to any one of claims 1 to 3 To a blunt-ended fragment containing a linker by terminal modification, a step of amplifying the blunt-ended fragment by PCR, and amplifying and separating the obtained amplification product partially including the entire telomeric sequence and labeling the distribution A method for measuring the degree of aging of a skin comprising a step of obtaining an average telomere length by detecting with a probe, wherein the plus chain of the linker on the sticky end side is a base sequence
5 'AATCCGTCGAGCAGAGTTC 3' (SEQ ID NO: 3)
A sense primer used in the amplification step has a nucleotide sequence contained in the linker on the sticky end side, and an antisense primer used in the amplification step has a nucleotide sequence contained in the linker on the protruding end side. A method for measuring the degree of aging.
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