JP4014430B2 - Microorganism identification method, microorganism identification apparatus, method for creating database for microorganism identification, and microorganism identification program - Google Patents
Microorganism identification method, microorganism identification apparatus, method for creating database for microorganism identification, and microorganism identification program Download PDFInfo
- Publication number
- JP4014430B2 JP4014430B2 JP2002084562A JP2002084562A JP4014430B2 JP 4014430 B2 JP4014430 B2 JP 4014430B2 JP 2002084562 A JP2002084562 A JP 2002084562A JP 2002084562 A JP2002084562 A JP 2002084562A JP 4014430 B2 JP4014430 B2 JP 4014430B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- band
- microorganism
- identified
- intensity
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 579
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 262
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 120
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 94
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 73
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 65
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 63
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 47
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 47
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 43
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 36
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 27
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 claims description 17
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 13
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 5
- 230000005611 electricity Effects 0.000 claims 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 56
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 53
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 45
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 38
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 29
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 18
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 16
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 10
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 7
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 7
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 7
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 7
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 5
- 238000003702 image correction Methods 0.000 description 5
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 5
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 5
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 5
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 4
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 4
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 3
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 3
- 238000009264 composting Methods 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- -1 deoxyribonucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 239000005416 organic matter Substances 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000011425 standardization method Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical group CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- HGUFODBRKLSHSI-UHFFFAOYSA-N 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin Chemical compound O1C2=CC(Cl)=C(Cl)C=C2OC2=C1C=C(Cl)C(Cl)=C2 HGUFODBRKLSHSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 241000218645 Cedrus Species 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 description 1
- RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N arsenic atom Chemical compound [As] RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000010815 organic waste Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Image Analysis (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物識別方法、微生物識別装置および微生物識別プログラムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、家庭等から排出される有機系廃棄物（いわゆる生ゴミ）等をコンポスト化（肥料化）する生ゴミ処理機が活発に研究開発されている。生ゴミ処理機では、細菌、原生動物等の微生物群が有機物を分解することにより肥料が作成される。
【０００３】
このような生ゴミ処理機によるコンポスト化では、そのコンポスト化過程（有機物分解過程）において、温度等をモニタすることによりコンポスト化の度合いを評価する。そして、その評価に基づき良質な肥料が作成されるように生ゴミ処理機の状態を調節する。
【０００４】
しかしながら、より良質な肥料を作成するためには、生ゴミ処理機の内部で機能する微生物群（少なくとも微生物の種類）の情報が必要である。この微生物群の情報は、微生物により生ゴミの分解を良好に制御するためにも必要である。また、作成された肥料の添加により土壌の改良を進める上では、土壌中の微生物群の情報を知ることも重要である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従来、微生物群の情報、例えば細菌群の情報を得る方法としては、細菌群に含まれる個々の細菌を単離して生化学検査する方法等が用いられる。しかし、この方法は時間がかかる上に、単離の難しい細菌については調べることが困難であった。
【０００６】
一方、ＤＮＡ分析を行うことにより微生物群の情報を得る方法も考えられる。ＤＮＡ分析を行うにはＤＮＡを増幅する必要がある。ＤＮＡを増幅する方法としてＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction;ポリメラーゼ連鎖反応）法が用いられている（米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第４，９６５，１８８号、第５，０３８，８５２号および第５，３３３，６７５号）。このＰＣＲ法は、増幅しようとするＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）の両端の塩基配列に相補な塩基配列を有するプライマーおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用い、熱変性工程、アニーリング（熱処理）工程および伸長反応工程の３段階からなるサイクルを繰り返すことにより、鋳型ＤＮＡとほぼ同じＤＮＡ断片を増幅することを可能にするものである。このＰＣＲ法を用いると、微量にしか存在しない細菌の１個のＤＮＡ中の所定の断片を例えば１０万〜１００万倍に増幅することができる。
【０００７】
しかしながら、このＰＣＲ法を用いるためには、鋳型ＤＮＡの一領域の少なくとも両端の塩基配列が既知であることが必要である。したがって、従来のＰＣＲ法では、生ゴミ処理機の内部で機能する微生物や土壌に存在する微生物の種類および塩基配列が知られていないと、それらの微生物のＤＮＡ断片を増幅することはできない。
【０００８】
そこで、単一のプライマーで塩基配列の情報なしに一種類のＤＮＡから同時に多数の種類のＤＮＡ断片を増幅するＲＡＰＤ（Random Amplified Polymorphic ＤＮＡ）法もしくはＡＰ−ＰＣＲ（Arbitrarily Primed-Polymerase Chain Reaction) 法が提案されている。これらの方法では、ＰＣＲの反応時にプライマーのアニーリング温度を下げ、さらに反応液中のマグネシウムイオン濃度を上げることにより、プライマーの結合時の配列特異性を下げる。すると、プライマーはミスマッチを伴って微生物の染色体ＤＮＡに結合し、ＤＮＡ断片が複製される。
【０００９】
これらのＲＡＰＤ法もしくはＡＰ−ＰＣＲ法によれば、増幅しようとするＤＮＡの塩基配列の情報がなくても、単一のプライマーにより何らかのＤＮＡ断片が多量に増幅される。増幅されたＤＮＡ断片をゲル電気泳動法により分離することによりＤＮＡフィンガープリントが得られる。このＤＮＡフィンガープリントを分析することにより微生物の状態を分析することが可能となる。
【００１０】
その反面、従来のＲＡＰＤ法もしくはＡＰ−ＰＣＲ法を複数の微生物から構成される微生物群に適用する場合、増幅されるＤＮＡ断片の種類数が多すぎるために、増幅されたＤＮＡ断片と鋳型となった微生物との対応付けが困難となり、微生物群が形成する生態系を把握することが困難となる。また、増幅されたＤＮＡ断片から微生物群を構成する微生物を識別することはできない。
【００１１】
そこで特開２００１−２７５７００号公報には、ＰＣＲ法を利用し、最適化したＰＣＲ用のプライマーとＰＣＲ条件を用いて一種類の微生物から微生物固有のＤＮＡ断片を１カ所だけ取り出すことが可能なＳＳＣ−ＰＣＲ（Single Strain Counting-PCR）法が提案されている。しかしながら、複数の細菌に対してＳＳＣ−ＰＣＲ法を適用した場合、単一の細菌にＳＳＣ−ＰＣＲ法を適用した場合には十分得られていたＤＮＡ断片が少量しか増幅されない場合や、電気泳動像では観察できなくなることがある。これは、プライマーの結合力が強いＤＮＡ領域が集中的に増幅されるのに対して、プライマーの結合力が弱いＤＮＡ領域は増幅の競争に負けて、増幅効率が低くなるためであると考えられる。
【００１２】
以上のように、識別対象となる微生物が複数の微生物からなる微生物群である場合には、増幅の競争反応が起こるために増幅したバンドの強度をもとに細菌の検出または同定を行うことが難しくなる。
【００１３】
本発明の目的は、微生物群を構成する複数の微生物を同時にかつ容易に識別することが可能な微生物識別方法、微生物識別装置および微生物識別プログラムを提供することである。
【００１４】
【課題を解決するための手段および発明の効果】
第１の発明に係る微生物識別方法は、識別対象となる微生物を識別する微生物識別方法であって、塩基配列の異なる複数のプライマーを準備し、複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと、各プライマーに対応する電気泳動像を画像データに変換するステップと、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像のバンドを検出するステップと、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像における検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるステップと、複数のプライマーとバンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求めるステップと、照合対象となる微生物についての対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、識別対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドのうち、照合対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに識別対象となる微生物のバンドと照合対象となる微生物のバンドとの組を求めるステップと、識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に各組のバンドを配置するステップと、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとし、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち識別対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＢとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧（Ａ／Ｂ）・Ｘを満足する第１の領域を求めるステップと、Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求めるステップと、識別対象となる微生物を識別するステップとを備え、識別するステップは、第２の領域上に位置するバンドを抽出するステップと、抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａ i およびｂ i とし、抽出されたバンドの数をｎとし、抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
【数９】
第２の発明に係る微生物識別方法は、識別対象となる微生物を識別する微生物識別方法であって、塩基配列の異なる複数のプライマーを準備し、複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと、各プライマーに対応する電気泳動像を画像データに変換するステップと、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像のバンドを検出するステップと、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像における検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるステップと、複数のプライマーとバンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求めるステップと、照合対象となる微生物についての対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、識別対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドのうち 、照合対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに識別対象となる微生物のバンドと照合対象となる微生物のバンドとの組を求めるステップと、識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に各組のバンドを配置するステップと、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとし、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち識別対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＢとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧（Ａ／Ｂ）・Ｘを満足する第１の領域を求めるステップと、Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求めるステップと、識別対象となる微生物を識別するステップとを備え、識別するステップは、第２の領域上に位置するバンドを抽出するステップと、抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａ i およびｂ i とし、抽出されたバンドの数をｎとし、抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
【数１０】
【００１５】
識別対象が複数の微生物からなる微生物群の場合には、識別対象となる各微生物のバンド強度が照合対象となる微生物のバンド強度に比べて弱く現れる傾向がある。
【００１６】
そこで、識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面において、識別対象となる微生物のバンド強度が照合対象となる微生物のバンド強度よりも低くなる第１の領域を設定し、第１の領域上に位置するバンドに基づいて識別対象となる微生物を識別する。
【００１７】
したがって、複数の微生物からなる微生物群を識別対象として用いる場合において、微生物群を構成する複数の微生物を同時にかつ容易に識別することが可能となる。このため、微生物群を構成する微生物の種類の数および種類名を明らかにすることが可能となる。
【００１８】
ここで、この微生物識別方法においては、塩基配列の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対して一度にポリメラーゼ連鎖反応法を適用し、識別対象となる微生物からＤＮＡ断片を増幅してＤＮＡ分析を行うので、生化学検査のように微生物を単離および培養する工程が不要となる。このため、容易に識別および同定を行うことが可能になるとともに、単離の困難な微生物の識別および同定も可能になる。また、上記の複数のプライマーを用いたＤＮＡの増幅方法は、塩基配列が未知の識別対象に対して行うことが可能であるため、塩基配列の測定を行うことなく、識別対象となる微生物の識別および同定を行うことができる。
【００１９】
さらに、この微生物識別方法においては、複数のプライマーを用いてそれぞれポリメラーゼ連鎖反応法を行い、複数のポリメラーゼ連鎖反応の結果を用いて識別を行うため、諸条件によって個々のポリメラーゼ連鎖反応が良好に進まない場合においても、個々のポリメラーゼ連鎖反応の影響は小さい。このため、良好な識別を安定して行うことが可能となる。
【００２１】
また、第１の領域上に位置するバンドのうちバンドの強度の低い領域を除く第２の領域を設定し、第２の領域上に位置するバンドに基づいて識別対象となる微生物を識別する。それにより、識別対象となる微生物群から得られたバンドのうち再現性の低いバンドのデータを除去して微生物を識別することができる。その結果、さらに正確に微生物の識別を行うことが可能となる。
【００３３】
さらに、第２の領域上のバンドに基づいて各バンドの面積比率を算出する。強度の高いバンドほど面積比率が高くなるので、強度の高いバンドのデータを重視して識別を行うことができる。その結果、さらに正確に微生物を識別することが可能となる。
【００３４】
また、Ｘ−Ｙ平面上に配置されたバンドのうち、再現性の低いバンドのデータを除いた第２の領域上のバンドに基づいて面積比率を算出するので、さらに正確に微生物を識別することが可能となる。
【００４０】
バンドの強度に関する情報は、電気泳動像におけるバンドの発光強度分布のピークの高さまたは面積を表し、画像データの階調分布に基づいて算出されてもよい。
【００４１】
バンドの位置に関する情報は、電気泳動像上での所定の基準位置とバンドとの間の距離で表されてもよい。あるいは、バンドの位置に関する情報は、当該バンドに含まれるＤＮＡ断片のサイズで表されてもよい。
【００４２】
バンドの強度に関する情報は、電気泳動像におけるバンドの発光強度分布のピークの高さまたは面積を表し、画像データの階調分布に基づいて算出されてもよい。
【００４３】
複数のプライマーとバンドの位置および強度に関する情報との対応関係は、各プライマーごとに各バンドの位置に関する情報と各バンドの強度に関する情報との対応を示してもよい。
【００４４】
既知の塩基配列を有する参照用プライマーを用いて、参照用プライマーの塩基配列に相補な塩基配列を有する参照用ＤＮＡに対し、ポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより、参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、参照用プライマーを用いて増幅された参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を得るステップと、参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を画像データに変換するステップと、参照用ＤＮＡに対応する画像データに基づいて識別対象となる微生物に対応する画像データを補正するステップとをさらに備えてもよい。
【００４５】
この場合、参照用プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応法により、参照用ＤＮＡからＤＮＡ断片が確実に増幅される。このようにして増幅された参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片の電気泳動像に対応する画像データに基づいて、ポリメラーゼ連鎖反応における参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片の増幅効率を求めることが可能になる。このようにして求めた増幅効率は、識別対象となる微生物のＤＮＡ断片においても適用可能である。したがって、求めた増幅効率に基づいて識別対象となる微生物のＤＮＡ断片の電気泳動像に対応する画像データを補正し、ＤＮＡ断片の量を分析することが可能になる。
【００４６】
各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと同時に、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を得るステップと、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を画像データに変換するステップと、ＤＮＡサイズマーカに対応する画像データに基づいて識別対象となる微生物に対応する画像データを補正するステップとをさらに備えてもよい。
【００４７】
この場合、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像に対応する画像データに基づいて識別対象となる微生物に対応する画像データの階調を補正することにより、電気泳動像におけるバンドの発光強度の正確な比較が可能となる。
【００４８】
電気泳動像のバンドを検出するステップは、電気泳動像において参照用ＤＮＡから増幅されたＤＮＡ断片またはＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度に基づくしきい値を設定し、電気泳動像においてしきい値以上の発光強度を有するバンドを選択するステップを含んでもよい。
【００４９】
この場合、発光強度がしきい値未満であるバンドは増幅効率が低く再現性の低いＤＮＡ断片のバンドである。また、発光強度がしきい値以上であるバンドは増幅効率が高く再現性の高いＤＮＡ断片のバンドである。したがって、しきい値以上の発光強度を有するバンドを選択することにより、増幅効率が高く再現性の高いＤＮＡ断片のみを分析することが可能になる。それにより、識別結果の信頼性が向上する。
【００５０】
データベースには複数種類の微生物についての対応関係が記憶されてもよい。これにより、識別対象となる種々の微生物を識別することができる。
【００５１】
第３の発明に係る微生物識別方法は、識別対象となる微生物を識別する微生物識別方法であって、塩基配列の異なる複数のプライマーを準備し、複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと、各プライマーに対応する電気泳動像を画像データに変換するステップと、各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと同時に、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を得るステップと、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を画像データに変換するステップと、既知の塩基配列を有する参照用プライマーを用いて参照用プライマーの塩基配列に相補な塩基配列を有する参照用ＤＮＡに対し、ポリメラーゼ連鎖反応を適用することにより、参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を得るステップと、参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を画像データに変換するステップと、ＤＮＡサイズマーカに対応する画像データおよび参照用ＤＮＡに対応する画像データに基づいて各プライマーに対応する画像データを補正するステップと、補正された画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像のバンドを検出するステップと、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像における検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるステップと、複数のプライマーとバンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求めるステップと、照合対象となる微生物についての対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、識別対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドのうち、照合対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに識別対象となる微生物のバンドと照合対象となる微生物のバンドとの組を求めるステップと、識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に各組のバンドを配置するステップと、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧Ｘを満足する第１の領域を求めるステップと、Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求めるステップと、識別対象となる微生物を識別するステップとを備え、識別するステップは、第２の領域上に位置するバンドを抽出するステップと、抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａ i およびｂ i とし、抽出されたバンドの数をｎとし、抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
【数１１】
第４の発明に係る微生物識別方法は、識別対象となる微生物を識別する微生物識別方法であって、塩基配列の異なる複数のプライマーを準備し、複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと、各プライマーに対応する電気泳動像を画像データに変換するステップと、各プライマーに対応する電気泳動像を 得るステップと同時に、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を得るステップと、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を画像データに変換するステップと、既知の塩基配列を有する参照用プライマーを用いて参照用プライマーの塩基配列に相補な塩基配列を有する参照用ＤＮＡに対し、ポリメラーゼ連鎖反応を適用することにより、参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を得るステップと、参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を画像データに変換するステップと、ＤＮＡサイズマーカに対応する画像データおよび参照用ＤＮＡに対応する画像データに基づいて各プライマーに対応する画像データを補正するステップと、補正された画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像のバンドを検出するステップと、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像における検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるステップと、複数のプライマーとバンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求めるステップと、照合対象となる微生物についての対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、識別対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドのうち、照合対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに識別対象となる微生物のバンドと照合対象となる微生物のバンドとの組を求めるステップと、識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に各組のバンドを配置するステップと、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧Ｘを満足する第１の領域を求めるステップと、Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求めるステップと、識別対象となる微生物を識別するステップとを備え、識別するステップは、第２の領域上に位置するバンドを抽出するステップと、抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａ i およびｂ i とし、抽出されたバンドの数をｎとし、抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
【数１２】
【００５２】
識別対象が複数の微生物からなる微生物群の場合には、識別対象となる各微生物のバンド強度が照合対象となる微生物のバンド強度に比べて弱く現れる傾向がある。
【００５３】
そこで、識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面において、識別対象となる微生物のバンド強度が照合対象となる微生物のバンド強度よりも低くなる第１の領域を設定し、第１の領域上に位置するバンドに基づいて識別対象となる微生物を識別する。
【００５４】
したがって、複数の微生物からなる微生物群を識別対象として用いる場合において、微生物群を構成する複数の微生物を同時にかつ容易に識別することが可能となる。このため、微生物群を構成する微生物の種類の数および種類名を明らかにすることが可能となる。
【００５５】
ここで、この微生物識別方法においては、塩基配列の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対して一度にポリメラーゼ連鎖反応法を適用し、識別対象となる微生物からＤＮＡ断片を増幅してＤＮＡ分析を行うので、生化学検査のように微生物を単離および培養する工程が不要となる。このため、容易に識別および同定を行うことが可能になるとともに、単離の困難な微生物の識別および同定も可能になる。また、上記の複数のプライマーを用いたＤＮＡの増幅方法は、塩基配列が未知の識別対象に対して行うことが可能であるため、塩基配列の測定を行うことなく、識別対象となる微生物の識別および同定を行うことができる。
【００５６】
さらに、この微生物識別方法においては、複数のプライマーを用いてそれぞれポリメラーゼ連鎖反応法を行い、複数のポリメラーゼ連鎖反応の結果を用いて識別を行うため、諸条件によって個々のポリメラーゼ連鎖反応が良好に進まない場合においても、個々のポリメラーゼ連鎖反応の影響は小さい。このため、良好な識別を安定して行うことが可能となる。
【００５７】
また、参照用プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応法により、参照用ＤＮＡからＤＮＡ断片が確実に増幅される。このようにして増幅された参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片の電気泳動像に対応する画像データに基づいて、ポリメラーゼ連鎖反応における参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片の増幅効率を求めることが可能になる。このようにして求めた増幅効率は、識別対象となる微生物のＤＮＡ断片においても適用可能である。したがって、求めた増幅効率に基づいて識別対象となる微生物のＤＮＡ断片の電気泳動像に対応する画像データを補正し、ＤＮＡ断片の量を分析することが可能になる。
また、第１の領域上に位置するバンドのうちバンドの強度の低い領域を除く第２の領域を設定し、第２の領域上に位置するバンドに基づいて識別対象となる微生物を識別する。それにより、識別対象となる微生物群から得られたバンドのうち再現性の低いバンドのデータを除去して微生物を識別することができる。その結果、さらに正確に微生物の識別を行うことが可能となる。
さらに、第２の領域上のバンドに基づいて各バンドの面積比率を算出する。強度の高いバンドほど面積比率が高くなるので、強度の高いバンドのデータを重視して識別を行うことができる。その結果、さらに正確に微生物を識別することが可能となる。
また、Ｘ−Ｙ平面上に配置されたバンドのうち、再現性の低いバンドのデータを除いた第２の領域上のバンドに基づいて面積比率を算出するので、さらに正確に微生物を識別することが可能となる。
【００５８】
さらに、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像に対応する画像データに基づいて識別対象となる微生物に対応する画像データの階調を補正することにより、電気泳動像におけるバンドの発光強度の正確な比較が可能となる。
【００６０】
第５の発明に係る微生物識別装置は、識別対象となる微生物を識別する微生物識別装置であって、塩基配列の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅する増幅手段と、増幅手段により複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得る電気泳動手段と、電気泳動手段により得られた各プライマーに対応する電気泳動像を画像データに変換する画像データ変換手段と、画像データ変換手段により得られた画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像のバンドを検出するバンド検出手段と、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像における検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるバンド情報検出手段と、複数のプライマーとバンド情報検出手段により検出されたバンドの位置および強度に関する情報との対応関係を作成する対応関係作成手段と、照合対象となる微生物についての対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、識別対象となる微生物について作成された対応関係に含まれるバンドのうち、照合対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに識別対象となる微生物のバンドと照合対象となる微生物のバンドとの組を求める同一位置バンド選択手段と、識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に各組のバンドを配置するバンド配置手段と、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとし、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち識別対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＢとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧（Ａ／Ｂ）・Ｘを満足する第１の領域を求める第１の領域決定手段と、Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求める第２の領域決定手段と、識別対象となる微生物を識別する識別手段とを備え、識別手段は、第２の領域上に位置するバンドを抽出する手段と、抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａ i およびｂ i とし、抽出されたバンドの数をｎとし、抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
【数１３】
第６の発明に係る微生物識別方法は、識別対象となる微生物を識別する微生物識別装置であって、塩基配列の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅する増幅手段と、増幅手段により複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得る電気泳動手段と、電気泳動手段により得られた各プライマーに対応する電気泳動像を画像データに変換する画像データ変換手段と、画像データ変換手段により得られた画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像のバンドを検出するバンド検出手段と、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像における検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるバンド情報検出手段と、複数のプライマーとバンド情報検出手段により検出されたバンドの位置および強 度に関する情報との対応関係を作成する対応関係作成手段と、照合対象となる微生物についての対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、識別対象となる微生物について作成された対応関係に含まれるバンドのうち、照合対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに識別対象となる微生物のバンドと照合対象となる微生物のバンドとの組を求める同一位置バンド選択手段と、識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に各組のバンドを配置するバンド配置手段と、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとし、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち識別対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＢとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧（Ａ／Ｂ）・Ｘを満足する第１の領域を求める第１の領域決定手段と、Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求める第２の領域決定手段と、識別対象となる微生物を識別する識別手段とを備え、識別手段は、第２の領域上に位置するバンドを抽出する手段と、抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａ i およびｂ i とし、抽出されたバンドの数をｎとし、抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
【数１４】
【００６１】
識別対象が複数の微生物からなる微生物群の場合には、識別対象となる各微生物のバンド強度が照合対象となる微生物のバンド強度に比べて弱く現れる傾向がある。
【００６２】
そこで、識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面において、識別対象となる微生物のバンド強度が照合対象となる微生物のバンド強度よりも低くなる第１の領域を設定し、第１の領域上に位置するバンドに基づいて識別対象となる微生物を識別する。
【００６３】
したがって、複数の微生物からなる微生物群を識別対象として用いる場合において、微生物群を構成する複数の微生物を同時にかつ容易に識別することが可能となる。このため、微生物群を構成する微生物の種類の数および種類名を明らかにすることが可能となる。
【００６４】
この微生物識別装置においては、塩基配列の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対して一度にポリメラーゼ連鎖反応法を適用し、識別対象となる微生物からＤＮＡ断片を増幅してＤＮＡ分析を行うので、生化学検査のように微生物を単離および培養する工程が不要となる。このため、容易に識別および同定を行うことが可能になるとともに、単離の困難な微生物の識別および同定も可能になる。また、上記の複数のプライマーを用いたＤＮＡの増幅方法は、塩基配列が未知の識別対象に対して行うことが可能であるため、塩基配列の測定を行うことなく、識別対象となる微生物の識別および同定を行うことができる。
【００６５】
さらに、この微生物識別装置においては、複数のプライマーを用いてそれぞれポリメラーゼ連鎖反応法を行い、複数のポリメラーゼ連鎖反応の結果を用いて識別を行うため、諸条件によって個々のポリメラーゼ連鎖反応が良好に進まない場合においても、個々のポリメラーゼ連鎖反応の影響は小さい。このため、良好な識別を安定して行うことが可能となる。
また、第１の領域上に位置するバンドのうちバンドの強度の低い領域を除く第２の領域を設定し、第２の領域上に位置するバンドに基づいて識別対象となる微生物を識別する。それにより、識別対象となる微生物群から得られたバンドのうち再現性の低いバンドのデータを除去して微生物を識別することができる。その結果、さらに正確に微生物の識別を行うことが可能となる。
さらに、第２の領域上のバンドに基づいて各バンドの面積比率を算出する。強度の高いバンドほど面積比率が高くなるので、強度の高いバンドのデータを重視して識別を行うことができる。その結果、さらに正確に微生物を識別することが可能となる。
また、Ｘ−Ｙ平面上に配置されたバンドのうち、再現性の低いバンドのデータを除いた第２の領域上のバンドに基づいて面積比率を算出するので、さらに正確に微生物を識別することが可能となる。
【００６７】
第７の発明に係るコンピュータ読み取り可能な記録媒体は、識別対象となる微生物を識別するコンピュータ読み取り可能な微生物識別プログラムであって、塩基配列の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅し、複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用することにより得られた電気泳動像を画像データとして取り込む処理と、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像のバンドを検出する処理と、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像における検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求める処理と、複数のプライマーとバンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求める処理と、照合対象となる微生物についての対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、識別対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドのうち、照合対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに識別対象となる微生物のバンドと照合対象となる微生物のバンドとの組を求める処理と、識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に各組のバンドを配置する処理と、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとし、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち識別対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＢとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧（Ａ／Ｂ）・Ｘを満足する第１の領域を求める処理と、Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求める処理と、識別対象となる微生物を識別する処理とを、コンピュータに実行させ、識別する処理は、第２の領域上に位置するバンドを抽出する処理と、抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａ i およびｂ i とし、抽出されたバンドの数をｎとし、抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
【数１５】
第８の発明に係る微生物識別プログラムは、識別対象となる微生物を識別するコンピュータ読み取り可能な微生物識別プログラムであって、塩基配列の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅し、複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用することにより得られた電気泳動像を画像データとして取り込む処理と、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像のバンドを検出する処理と、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気泳動像における検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求める処理と、複数のプライマーとバンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求める処理と、照合対象となる微生物についての対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、識別対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドのうち、照合対象となる微生物について求められた対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに識別対象となる微生物のバンドと照合対象となる微生物のバンドとの組を求める処理と、識別対象となる微生物のバンドの強 度を表す第１の座標軸Ｘと照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に各組のバンドを配置する処理と、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとし、Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち識別対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＢとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧（Ａ／Ｂ）・Ｘを満足する第１の領域を求める処理と、Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求める処理と、識別対象となる微生物を識別する処理とを、コンピュータに実行させ、識別する処理は、第２の領域上に位置するバンドを抽出する処理と、抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａ i およびｂ i とし、抽出されたバンドの数をｎとし、抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
【数１６】
【００６８】
第７および第８の発明に係る微生物識別プログラムによれば、第１および第２の発明に係る微生物識別方法を容易に行うことができる。
【００７０】
【発明の実施の形態】
図１は本発明に係る微生物識別装置を示す図である。
【００７１】
図１に示すように、微生物識別装置は、ＳＳＣ- ＰＣＲ増幅・解析装置１、電気泳動イメージ入力部２、解析用コンピュータ３、データベース格納部４および結果表示手段５からなる。
【００７２】
ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１については後述する。電気泳動イメージ入力部２は、例えばＣＣＤカメラおよびスキャナにより構成される。解析用コンピュータ３は、後述する構成を有するパーソナルコンピュータからなる。データベース格納部４はハードディスク装置等からなり、結果表示手段５はディスプレイ等からなる。
【００７３】
なお、ＳＳＣ−ＰＣＲとはSingle Strain Counting Polymerase Chain Reactionのことであり、特定の塩基配列を有するプライマーを複数用いて未知の塩基配列を有する微生物群または単一の微生物からＤＮＡ断片を連鎖反応的に増幅する反応のことである。なお、ＳＳＣ−ＰＣＲの詳細については後述する。
【００７４】
図２は、図１の微生物識別装置を用いた微生物識別方法の一例を示すフローチャートである。
【００７５】
図２に示すように、まず図１のＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１を用いて、後述のＳＳＣ−ＰＣＲ法により、微生物の解析実験を行う（ステップＳ１）。なお、この解析実験においては、単離した単一の微生物をサンプルとして用いてもよく、また、複数の微生物を含む微生物群をサンプルとして用いてもよい。
【００７６】
ＳＳＣ−ＰＣＲ法による微生物の解析実験の詳細を図３に示す。まず、図３に示すように、微生物のＤＮＡ、ポリメラーゼ連鎖反応用バッファ溶液、プライマー、耐熱性の好熱菌ＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ2 および４種の基質となる５’デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）を所定量ずつ混合し、ＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する（ステップＳ１−１）。
【００７７】
なお、複数の微生物を含む微生物群をサンプルとして用いる場合においては、複数の微生物のＤＮＡが混合されたものを用いてＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する。
【００７８】
ここで、ＤＮＡポリメラーゼとは、４種の５’デオキシリボヌクレオチド三リン酸を基質とし、鋳型ＤＮＡに相補な塩基配列を有するＤＮＡ鎖の重合反応を触媒する酵素である。ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の重合の方向性は５’から３’の方向である。また、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼが作用するために不可欠な３’−ＯＨ基を末端に有するＤＮＡ断片（短鎖オリゴヌクレオチド）である。本発明では、特定の塩基配列および塩基長を有するプライマーを用いる。
【００７９】
なお、後述するようにＳＳＣ−ＰＣＲ法においては塩基配列の異なる複数のプライマーを用いるため、各々のプライマーについてＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する。例えば、この場合においては４６種類のプライマーを用いるので、異なるプライマーを含む４６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する。なお、４６種類のＰＣＲ用反応溶液は全て同時に調製するものとする。
【００８０】
上記のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液の調製と同時に、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを調製する（ステップＳ１−２）。
【００８１】
ここで、ポジティブコントロールとは、後述のＤＮＡ断片の増幅反応の一連の工程において生じる誤差を除去するためのコントロール実験に用いる試料である。一般に、ＤＮＡ断片の増幅反応における増幅効率は、一連の工程において生じる誤差、例えばＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液の調製時におけるＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウム等の濃度の誤差、用いた試薬の活性の度合い、ＤＮＡ断片増幅時における温度の誤差等により影響を受けると考えられる。このような誤差を除去するために、ポジティブコントロールとして、増幅されるＤＮＡ断片の種類が既知で定量可能なＤＮＡ断片を増幅するプライマーと、このプライマーに相補な塩基配列を有する鋳型ＤＮＡとを含む反応溶液を調製する。ポジティブコントロールにおいて増幅されるＤＮＡ断片は、電気泳動法により定量することが可能である。したがって、ポジティブコントロールにおいて増幅されるＤＮＡ断片の量から、ＤＮＡ断片の増幅効率を求めることができる。このようにして求めた増幅効率をもとにして４６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液のＤＮＡ断片の量を補正することにより、ＤＮＡ断片の増幅反応の一連の工程において生じる誤差の影響を除去することが可能となる。その結果、増幅されたＤＮＡ断片の量的な比較が可能となる。
【００８２】
一方、ネガティブコントロールとは、増幅されたＤＮＡ断片が分析対象とする微生物群または微生物のものであることを確認するためのコントロール実験に用いる試料である。一般に、細菌等の微生物は空気中等の様々な場所に存在する。このため、ＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液の調製時において反応溶液に微生物が混入する可能性がある。微生物が反応溶液に混入した場合、増幅されたＤＮＡ断片が分析対象とする微生物群由来のＤＮＡ断片かあるいは混入した微生物由来のＤＮＡ断片か判別不可能となる。そのため、ネガティブコントロールとして、プライマーを含むが鋳型ＤＮＡを含まないＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する。このネガティブコントロールを用いてＳＳＣ−ＰＣＲおよび電気泳動を行い、ネガティブコントロールの電気泳動像においてはバンドが現れないことを確認する。これにより、増幅されたＤＮＡ断片が分析対象である微生物群または微生物由来のものであることが確認できる。
【００８３】
なお、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールに用いるプライマーは、４６種類のプライマーのうちの１つもしくは２つと同じ塩基配列であってもよい。
【００８４】
上記のようにしてＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製した後、ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１により、ＤＮＡ断片の増幅反応を行う（ステップＳ１−３）。
【００８５】
図４は、ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１のＤＮＡ断片増幅装置の例を示す模式図である。図４のＤＮＡ断片増幅装置は、タイタプレートと呼ばれる支持プレート５０により構成される。
【００８６】
支持プレート５０の上面に複数の孔部５１が形成されている。この場合には、複数の孔部５１に、前述の塩基配列の異なるプライマーをそれぞれ含む４６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液がプライマーの増幅確率の順に連続的に配置される。また、孔部５１ａには、前述のネガティブコントロールが配置され、孔部５１ｂには、前述のポジティブコントロールが配置される。
【００８７】
このようなＤＮＡ断片増幅装置により、４６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールにおいて、以下のようなＳＳＣ−ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅が同時に行われる。
【００８８】
ＳＳＣ−ＰＣＲ法では、従来のＰＣＲ法と同様に、次の３段階の工程を繰り返し行う。ただし、ＳＳＣ−ＰＣＲ法では、未知の塩基配列を有する微生物または微生物群に対して特定の塩基配列を有するプライマーを用いることにより分析可能な量のＤＮＡ断片を増幅する。
【００８９】
（１）熱変性工程
ＤＮＡ（初期時）またはＤＮＡ断片を加熱変性し、１本鎖（ＤＮＡ鎖）にする。
【００９０】
（２）プライマーのアニーリング工程（プライマーの結合工程）
プライマーがＤＮＡ鎖の増幅領域の端に結合するように熱処理を行う。
【００９１】
（３）ポリメラーゼによる伸長反応工程（ポリメラーゼによる複製工程）
プライマーを起点としてポリメラーゼによって相補鎖を合成し、２本鎖化する。
【００９２】
上記（１）〜（３）の工程を１サイクルとしてこのサイクルを繰り返し行う。第１のサイクルとして、上記反応溶液を例えば９４℃で２分間保持する熱変性工程、上記反応溶液を例えば４５℃で２分間保持するプライマーのアニーリング工程、および上記反応溶液を例えば７２℃で３分間保持するポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で行う。なお、本サイクルの熱変性工程は、長い完全ＤＮＡを１本鎖に完全に分離するために下記サイクルの熱変性工程よりも長めに設定する。
【００９３】
引続き、第２のサイクルとして、上記反応溶液を例えば９４℃で１分間保持する熱変性工程、上記反応溶液を例えば４５℃で２分間保持するプライマーのアニーリング工程および上記反応溶液を例えば７２℃で３分間保持するポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で例えば３３回繰り返す。
【００９４】
最後に、第３のサイクルとして、上記反応溶液を例えば９４℃で１分間保持する熱変性工程、上記反応溶液を例えば４５℃で２分間保持するプライマーのアニーリング工程および上記反応溶液を７２℃で１０分間保持するポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で行う。なお、本サイクルのポリメラーゼによる伸長反応工程は、最後に複製を完全化するために第１および第２のサイクルのポリメラーゼによる伸長反応工程よりも長めに設定する。
【００９５】
ここで、上記第１のサイクル、第２のサイクルの第１回目のサイクル、および第２のサイクルの第２回目のサイクルを図５〜図７を用いて説明する。なお、図は模式的に示しており、ＤＮＡの１本鎖等はプライマーと結合する部分の塩基配列を示している。
【００９６】
図５〜図７では、ＧＧＣＴＴＣＧＡＡＴＣＧの塩基配列（配列番号１４）を有するプライマーを用いている。なお、Ｔはチミン、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシンを示す。
【００９７】
図５（ａ）に示すように最初、上記反応溶液中には複数の異なる微生物に含まれていた長いＤＮＡ（完全ＤＮＡ）１１が存在する。ここでは、１個の完全ＤＮＡに着目して説明する。
【００９８】
最初に、図５（ｂ）に示すように、第１のサイクルでは、第２および第３のサイクルの熱変性工程より長い熱変性工程を行うことにより、上記の長いＤＮＡ１１が加熱変性し、２本鎖が互いに離れ、２つの１本鎖（ＤＮＡ鎖）１２ａ，１２ｂの状態になる。
【００９９】
次に、図５（ｃ）に示すように、プライマーのアニーリング工程でプライマー２１ａがその塩基配列に適合する各１本鎖１２ａ，１２ｂの適合位置に配置（相補な配列）するように結合する。ここで、適合位置とはプライマーの塩基配列から見て結合すべき塩基配列の位置およびプライマーの塩基配列から見て結合すべき塩基配列と類似の塩基配列の位置である。上記ＳＳＣ−ＰＣＲ法では、プライマーのアニーリング工程のアニール温度を低く設定することにより、プライマーは、その塩基配列と類似の塩基配列を有するＤＮＡ鎖の部分にも結合する。すなわち、プライマーは、その塩基配列に完全に相補な塩基配列を有する１本鎖の位置に結合することができるのみならず、多少のミスマッチを伴って１本鎖に結合することもできる。なお、図５〜図７では、簡単のためにプライマーがその塩基配列から見て結合すべき塩基配列の位置に結合する場合を図示している。
【０１００】
続いて、図５（ｄ）に示すように、ポリメラーゼによる伸長反応工程でポリメラーゼによって伸長反応が起こり、１本鎖１２ａ，１２ｂにそれぞれ沿って１本鎖１２ｃ，１２ｄが伸長して２本鎖化した鎖１３ａ，１３ｂが形成される。
【０１０１】
第２のサイクルの１回目のサイクルでは、第１のサイクルで２本鎖化した鎖１３ａ，１３ｂが熱変性工程でそれぞれ１本鎖（ＤＮＡ鎖）１２ａ，１２ｃおよび１本鎖（ＤＮＡ鎖）１２ｂ，１２ｄとなるが、ここでは、鎖１３ａから分かれた１本鎖１２ｃに着目して説明する。
【０１０２】
図６に示すように、熱変性工程で分離した１本鎖１２ｃには次のプライマーのアニーリング工程でプライマー２１ｂが適合位置に配置するように結合する。その後、ポリメラーゼによる伸長反応工程でポリメラーゼによって伸長反応が起こり、１本鎖１２ｅに沿って１本鎖１２ｅが伸長して２本鎖化した鎖１３ｄとなる。
【０１０３】
その後、図７に示すように、第２のサイクルの第２回目のサイクルでは、上記２本鎖化した鎖１３ｄが熱変性工程でそれぞれ１本鎖１２ｃ，１２ｅとなるが、ここでは、鎖１３ｄから分かれた１本鎖１２ｅに着目して説明する。
【０１０４】
図７に示すように、熱変性工程で分離した１本鎖１２ｅには、次のプライマーのアニーリング工程で、同様に、プライマー２１ｃが適合位置に配置するように結合する。その後、ポリメラーゼによる伸長反応工程でポリメラーゼによって伸長反応が起こり、１本鎖１２ｅに沿って１本鎖１２ｆが伸長して２本鎖化した鎖（ＤＮＡ断片）１３ｅが形成される。
【０１０５】
このようにＤＮＡ断片が形成され、このＤＮＡ断片からＤＮＡ断片が形成されるとともに他の同種のＤＮＡからもＤＮＡ断片が形成され、同様の反応が連鎖反応的に続くので、この方法によりＤＮＡ断片が増幅される。
【０１０６】
その後、図３に示すように、ＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを用いて、電気泳動法により、各反応溶液において増幅されたＤＮＡ断片をサイズ（塩基対数）ごとに分画する。このとき、濃度が既知で定量可能なＤＮＡサイズマーカを同時に電気泳動させサイズごとに分画する（ステップＳ１−４）。
【０１０７】
さらに、電気泳動法により得られた電気泳動像を蛍光色素で染色し（ステップＳ１−５）、紫外線照射したときの蛍光像を撮影する（ステップＳ１−６）。撮影には、例えばＣＣＤカメラを用いる。このようにして得られた電気泳動像において、ＤＮＡ断片がバンド（帯）として現れる。
【０１０８】
なお、ここで、ネガティブコントロールの電気泳動像においてバンドが現れない場合、増幅されたＤＮＡ断片が分析対象である微生物または微生物群由来のものであることが確認できる。
【０１０９】
続いて、図２に示すように、撮影した電気泳動像を電気泳動イメージ入力部２（図１）のスキャナで解析用コンピュータ３（図１）に画像データとして取り込み（ステップＳ２）、画像データに基づいて電気泳動像の各バンドを検出する（ステップＳ３）。
【０１１０】
ところで、ＳＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を増幅する際において、所定の塩基配列を有する鋳型ＤＮＡの適合位置にプライマーが強く結合して配置する場合は、ＤＮＡ断片の増幅効率が高い。このようなプライマーにより増幅されたＤＮＡ断片は、電気泳動像において再現性の高い明瞭なバンドとして現れる。一方、プライマーと鋳型ＤＮＡの適合位置との結合が弱い場合、鋳型ＤＮＡの適合位置よりも結合が強い他の位置にプライマーが結合する。このように、ＤＮＡ断片の増幅反応においては競争的に反応が進行するため、プライマーと鋳型ＤＮＡとの結合が弱い場合にはＤＮＡ断片の増幅効率が低くなる。このような結合の弱いプライマーにより増幅されるＤＮＡ断片は、電気泳動像において再現性が低く不明瞭バンドとして現れる。上記のような再現性の低いＤＮＡ断片を含むことにより、ＳＳＣ−ＰＣＲ法により得られたデータは全体の信頼性が低くなる。
【０１１１】
そこで、ＳＳＣ−ＰＣＲ法により得られたデータの信頼性を向上させるために、解析コンピュータ３（図１）を用いて、以下のような電気泳動像の画像データの画像補正を行う（ステップＳ４）。
【０１１２】
図８は画像補正の工程の一例を示すフローチャートである。図８に示すように、画像データにおいて、ポジティブコントロールのバンドの発光強度と量が既知であるＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度とを比較することにより、ポジティブコントロールにおいて増幅されたＤＮＡ断片を定量する。さらにこの定量した値を用いてＤＮＡ増幅断片増幅反応の増幅効率を求める。この増幅効率に基づいて４６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液のバンドの発光強度を補正する（ステップＳ４−１）。それにより、ＤＮＡ増幅反応時における反応条件等の誤差がＤＮＡ断片の増幅効率に与える影響が除去される。
【０１１３】
なお、ここでの発光強度とは、発光強度分布におけるピークの高さのことである。
【０１１４】
また、ポジティブコントロールの定量方法としては、ＤＮＡ断片精製後に２６０ｎｍの紫外線吸収量を測定するなどの他の方法を用いることもできる。
【０１１５】
さらに、定量可能なＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度を基準として用い、４６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液のバンドの発光強度を補正する。このようにして、電気泳動像の画像データの階調補正を行う（ステップＳ４−２）。
【０１１６】
一般に、エチジウムブロマイド染色時の染色度合いおよび写真撮影時の露光の程度によって、得られる電気泳動像の階調に誤差が生じる。しかしながら、濃度が既知のＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度に基づいて電気泳動像の画像データの階調補正を行うことにより、このような誤差を除去することができる。
【０１１７】
続いて、定量可能なＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度に基づいてしきい値を設定し、しきい値未満の発光強度のバンドを削除する（ステップＳ４−３）。これにより、増幅効率が低く再現性の低いバンドを除去することができる。このようにして得られた増幅効率が高く再現性の高いバンドを分析することにより、信頼性の高いデータが得られる。
【０１１８】
図９は、上記のような画像補正を行った後の電気泳動像の画像データの例を示す図である。図９において、レーン１，１０は、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像のデータを示している。また、レーン２〜９は、配列番号１〜８のプライマーにおける電気泳動像のデータを示している。なお、配列番号９〜４６の各プライマーについても、図９に示すような電気泳動のデータがそれぞれ得られる。
【０１１９】
続いて、図２に示すように、各プライマーにおけるバンドの位置とＤＮＡサイズマーカにおけるバンドの位置とを比較することにより、各プライマーにおけるバンドの位置をバンドサイズ（塩基対数）に変換して測定する。さらに、各位置のバンドについて、バンド強度（バンドの発光強度）を測定する（ステップＳ５）。ここでのバンド強度とは、バンドの発光強度分布におけるピークの高さのことである。
【０１２０】
なお、このようなバンド位置およびバンド強度の測定は、解析用コンピュータ３（図１）により行う。
【０１２１】
さらに、解析用コンピュータ３を用いて、上記で得られた各プライマーにおけるバンド位置およびバンド強度のデータをまとめ、バンドデータの一欄を作成する（ステップＳ６）。
【０１２２】
通常、ＳＳＣ−ＰＣＲ法においては、種類の異なる複数のプライマーを用いて複数のＰＣＲ反応（ポリメラーゼ連鎖反応）を行う。このため、ＳＳＣ−ＰＣＲの結果、各プライマーにつき１つの電気泳動像が得られる。この場合においては４６種類のプライマーを用いているので、４６種類の電気泳動像が得られる。
【０１２３】
例えば、前述の図９のように１枚の写真に８種類のプライマーの電気泳動像を示す場合においては、合計６枚の写真に４６種類のプライマーの電気泳動像が示される。したがって、各写真について画像データが得られる。
【０１２４】
ここで、図１の微生物識別装置の解析用コンピュータ３においては、このような複数枚の写真にわたって示された４６種類のプライマーのバンドのデータを集め、１つのデータにまとめることが可能である。それにより、サンプルの微生物に関するＳＳＣ−ＰＣＲのバンドデータの一欄を作成することができる。
【０１２５】
解析用コンピュータ３により作成されたバンドデータの一欄には、プライマー名（配列番号）、サイズで表したバンド位置およびバンド強度が記載される。作成されたバンドデータの一欄を表１に示す。
【０１２６】
【表１】
なお、表１のプライマー名の項目においては、例えば、配列番号１のプライマーがPr１と記載される。
【０１２８】
上記においては、各プライマーにおけるバンドの位置をバンドサイズで表示する場合について説明したが、後述の実施例において説明するように、バンドの位置をバンドサイズで表示するのではなく、実測した距離に基づいて表示してもよい。この場合、バンドデータの一欄のバンド位置の項目には、例えば実測した距離の比が記載される。
【０１２９】
また、上記においては、バンド強度としてバンドの発光強度分布のピークの高さを測定する場合について説明したが、バンド強度として、バンドの発光強度分布の面積（容量）を測定してもよい。バンドの発光強度分布の面積はバンドに含まれるＤＮＡの含有量に対応するので、発光強度分布の面積をバンド強度として用いる方がより好ましいと考えられる。
【０１３０】
さらに、バンド検出、画像補正およびバンド位置・バンド強度の測定を行う順番は、上記に限定されるものではなく、必要に応じて逆転する場合もある。
【０１３１】
続いて、図２に示すように、解析用コンピュータ３（図１）を用いて、サンプルの微生物のデータ（表１）に基づいて、データベース格納部４（図１）のデータベースに登録されている複数の微生物のデータをサーチし、サンプルの微生物のバンドデータとデータベースの複数の微生物の配列番号１〜４６のプライマーPr１〜４６に関するバンドデータとを比較する。さらに、データベースからサンプルの微生物に該当する微生物を後述する方法１〜７のいずれかを用いて検索する（ステップＳ７）。
【０１３２】
以下に、データベース検索（ステップＳ７）の詳細について、順を追って説明する。
【０１３３】
まず、サンプルの微生物およびデータベースの微生物における同一のプライマーの同一位置のバンドを検索する。
【０１３４】
図１に示すように、微生物識別装置のデータベース格納部４のデータベースには、生化学検査等により同定された複数の微生物の各々に関して、ＳＳＣ−ＰＣＲのデータ、例えば電気泳動像の画像データやバンドデータの一欄が登録されている。なお、データベースに登録されているバンドデータの一欄の構成は、上記において作成したサンプルの微生物のバンドデータの一欄（表１）の構成と同様である。
【０１３５】
例えば、表２は、データベースに登録されている微生物Ａのバンドデータの一欄を示すものである。なお、この微生物Ａは細菌である。
【０１３６】
【表２】
このようなデータベースに登録されている複数の微生物のバンドデータの一欄から、サンプルの微生物のバンドデータの一欄（表１）に基づいて、同一のプライマーにおける同一位置のバンドを検索する。
【０１３８】
なお、この検索において、データベースの微生物のバンドの位置がサンプルの微生物のバンドの位置からある範囲内でずれて存在する場合、両者は同一位置のバンドであるとみなす。この同一位置のバンドとみなす範囲は、実験の誤差に基づいて決定されるものであり、必要に応じて変更する。
【０１３９】
例えば、図１０に示すように、サンプルの微生物のバンドデータ（表１）に基づいてデータベースの微生物Ａのバンドデータ（表２）をサーチした場合には、図中の矢印で示したバンドが同一プライマーにおける同一位置のバンドとして検索される。
【０１４０】
データベースに登録されている微生物Ａ以外の複数の微生物の各々についても、このような同一プライマーにおける同一位置のバンドの検索を行う。
【０１４１】
次に、サンプルの微生物のバンドデータとデータベースの微生物のバンドデータとを１つにまとめ、サンプルの微生物およびデータベースの微生物について、各プライマーPr１〜４６における全てのバンドの位置（サイズ）および強度のデータの一欄を作成する。
【０１４２】
例えば、表３は、サンプルの微生物のデータ（表１）と、データベースの微生物Ａのデータ（表２）とをまとめてバンドデータ一欄を作成したものである。
【０１４３】
【表３】
表３に示すように、検索したサンプルの微生物およびデータベースの微生物Ａにおける同一プライマーの同一位置のバンド（図１０の矢印で示したバンド）に関しては、表中のバンドサイズの項目に、サンプルの微生物のバンドサイズが記載される。
【０１４５】
また、例えばプライマーPr１のサイズ１２９８のバンドのように、サンプルの微生物には存在するがデータベースの微生物Ａには存在しないバンドに関しては、データベースの微生物Ａのバンド強度を０とする。一方、例えばプライマーPr２のサイズ３４３２のバンドのように、データベースの微生物Ａには存在するがサンプルの微生物には存在しないバンドに関しては、サンプルの微生物のバンド強度を０とする。
【０１４６】
データベースに登録されている微生物Ａ以外の複数の微生物についても、それぞれ表３に示すようなバンドデータの一欄を作成する。
【０１４７】
（方法１）：バンド一致率の算出方法
上記の工程において作成したバンドデータ一覧をもとに、データベースに登録されている微生物Ａの総バンド数に対するサンプルの微生物のうち微生物Ａのバンドに一致するバンド数の割合を求める。
【０１４８】
（方法２）：サンプルの微生物およびデータベースの微生物における相関係数の算出方法
ここでは、上記において作成したバンドデータの一欄（表３）に基づいて、各バンドにおけるサンプルの微生物およびデータベースの微生物のバンド強度を比較し、両者の相関関係を調べる。
【０１４９】
例えば、サンプルの微生物およびデータベースの微生物Ａにおけるバンドデータの一欄（表３）に基づいて、各バンドについてサンプルの微生物のバンド強度とデータベースの微生物Ａのバンド強度とを比較すると、図１１に示すような相関関係が得られる。図１１においては、横軸にサンプルの微生物のバンド強度をとり、縦軸にデータベースの微生物Ａのバンド強度をとっている。なお、図１１においては全てのバンドに関するプロットを行っていないが、実際には全てのバンドに関してプロットを行って相関関係を調べる。
【０１５０】
このようにサンプルの微生物のバンド強度とデータベースの微生物Ａのバンド強度とを比較することにより、サンプルの微生物およびデータベースの微生物Ａにおける相関係数を算出する。
【０１５１】
また、データベースに登録されている微生物Ａ以外の複数の微生物の各々についても、上記と同様の比較を行ってサンプルの微生物との相関関係を調べ、相関係数をそれぞれ算出する。なお、このような相関係数の算出は、解析用コンピュータ３（図１）を用いて行う。
【０１５２】
ここで、相関係数の算出方法は、算出に用いるデータのとり方により、図１２（ａ）〜（ｃ）に示す３つの方法が上げられる。以下に、３つの方法を説明する。
【０１５３】
（ａ）サンプルの微生物およびデータベースの微生物の全データを用いた相関係数の算出方法
図１２（ａ）に示すように、この方法は、サンプルの微生物のバンド強度およびデータベースの微生物のバンド強度のデータを０のデータも含め全て用いて相関係数を算出するものである。すなわち、相関図における縦軸上のプロットおよび横軸上のプロットを含め、全てのプロットを考慮して相関係数を求めるものである。
【０１５４】
ここで、サンプルが複数の微生物の混合物である場合にこの方法を適用すると、サンプルとデータベースの所定の微生物との間に相関関係があっても、算出により求められた相関係数は小さな値となる。したがって、この（ａ）の方法は、サンプルが単一の微生物の場合に適用することが好ましい。
【０１５５】
（ｂ）サンプルの微生物とデータベースの微生物との両方に存在するバンドのデータのみを用いた相関係数の算出方法
図１２（ｂ）に示すように、この方法は、サンプルの微生物のバンド強度のデータおよびデータベースの微生物のバンド強度のデータにおいて、０のデータを全て除いて相関係数を算出するものである。すなわち、相関図における縦軸上のプロットおよび横軸上のプロットを考慮せず、これ以外のプロットを考慮して相関係数を算出するものである。
【０１５６】
上記の（ａ）の方法において前述したように、サンプルが複数の微生物の混合物である場合には、データベースの微生物のバンド強度が０であるデータを除いた方が、高い相関係数が得られるので好ましい。また、ＰＣＲ反応においては何らかの原因で現れるべきバンドが現れないケースがあり、この場合においては、サンプルの微生物のバンド強度が０であるデータ除いた方が高い相関係数が得られるので好ましい。
【０１５７】
（ｃ）データベースの微生物に存在するバンドのデータを全て用いた相関係数の算出方法
図１２（ｃ）に示すように、この方法は、０のデータを含むサンプルの微生物のデータと、０のデータを含まないデータベースの微生物のデータとを用いて相関係数を算出するものである。すなわち、相関図における横軸上のプロットを考慮せず、縦軸上のプロットを含むこれ以外のプロットを考慮して相関係数を算出するものである。
【０１５８】
例えば、サンプルが複数の微生物の混合である場合には、サンプルを構成する微生物の種類を確認するために、０のデータも含めサンプルの微生物のバンドデータを全て用いて相関係数を算出すべきである。その理由は、データベースの微生物のバンドのうち数本のバンドのみがサンプルの微生物のバンドと一致し、さらにたまたまそれらのバンドが良好な相関関係を示す場合においては、サンプルの０のデータを考慮しない上記の（ｂ）の方法により相関係数を算出すると、相関関係のあるバンドが数本であるにも係わらず実質よりも高い値の相関係数が求められるからである。これに対して、このような場合に（ｃ）の方法を用いると、サンプルの微生物の０のデータを考慮するので、（ｂ）の方法を用いた場合ほど相関係数が高くならない。
【０１５９】
相関係数の算出式を以下に示す。
【０１６０】
【数１７】
なお、式（Ａ１）において、Ｎはデータベースの微生物とサンプルの微生物においてバンドのサイズが一致したバンドの数のうち（ａ）〜（ｃ）の方法の各々において対象となるバンドの数である。ａiはデータベースの微生物のバンド強度、ａｋはデータベースの微生物のバンド強度の平均、ｂiはサンプルの微生物のバンド強度、ｂｋはサンプルの微生物のバンド強度の平均（データベースの微生物のバンドと一致した場合のみ）である。ｉはバンドの識別番号であり、１〜Ｎの整数である。
【０１６２】
（方法３）：バンドの一致率の算出方法
前述したように、複数種類の微生物を含むサンプルの微生物から得られるバンド強度は、データベースに格納した微生物のバンド強度よりも弱くなる傾向がある。そこで、相関図を用いてバンドの一致率を算出する。
【０１６３】
なお、実験ごとに電気泳動ゲルを染色する色素の濃度や写真の露光状態でバンドの強度が異なる。そのため、本来、ＤＮＡサイズマーカーなどを用いて、バンド強度の標準化を行う必要がある。ここでは、簡便な方法として、バンド強度の最大値を用いて補正を行う。
【０１６４】
図１３は、データベースの微生物のバンド強度とサンプルの微生物のバンド強度との相関関係を示す相関図である。図１３において、Ｘ軸はサンプルの微生物のバンド強度を表し、Ｙ軸はデータベースの微生物のバンド強度を表す。
【０１６５】
サンプルの微生物のバンドのうちデータベースの微生物のバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置を有するサンプルの微生物のバンドとデータベースの微生物のバンドとの組を求め、図１３の相関図にプロットする。
【０１６６】
相関図に配置されたバンド（プロット）のうち、データベースの微生物のバンド強度が最大のプロットのＹ座標をＡとする。ここでは、データベースの微生物のバンド強度が最大のプロットをｃ３とする。このプロットｃ３を通るＸ軸に平行な直線Ｙ＝Ａを直線Ｓとする。
【０１６７】
また、相関図に配置されたバンド（プロット）のうち、サンプルの微生物のバンド強度が最大のプロットのＸ座標をＢとする。ここでは、サンプルの微生物のバンド強度が最大のプロットをｃ０とする。このプロットｃ０を通るＹ軸に平行な直線Ｘ＝Ｂを直線Ｔとする。
【０１６８】
なお、ここでは、Ａ＝１．０とし、Ｂ＝１．０とする。直線Ｓと直線Ｔとの交点Ｐ０の座標を（Ｂ，Ａ）とする。さらに、原点（０，０）と交点Ｐ０とを結ぶ直線Ｙ＝（Ａ／Ｂ）・Ｘを直線Ｕとする。
【０１６９】
ここで、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧（Ａ／Ｂ）・Ｘを満足するエリアをＶとする。ここで、エリアＶに位置するバンド数をｍとする。また、エリアＶでＹ軸上を除く範囲に位置するバンド数をＰとする。
【０１７０】
なお、前述したポジティブコントロールによる増幅効率の補正およびＤＮＡサイズマーカによる電気泳動像の輝度補正を行った場合、エリアＶは、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧Ｘを満足するエリアとする。
【０１７１】
このとき、バンドの一致率Ｃ１は、以下の式（１）により算出される。
Ｃ１＝Ｐ／ｍ ・・・（１）
例えば、図１３に示す相関図においては、エリアＶに位置するバンド（プロット）はｃ１〜ｃ６であり、ｍ＝６となる。また、エリアＶでＹ軸上を除く範囲に位置するプロットはｃ１〜ｃ３，ｃ５となり、Ｐ＝４となる。したがって、バンドの一致率Ｃ１はＰ／ｍ＝４／６≒０．６７となる。
【０１７２】
（方法４）：しきい値を設けた場合におけるバンドの一致率の算出方法
前述したように、複数種類の微生物を含むＤＮＡ断片をプライマーをＳＳＣ−ＰＣＲ法により増幅した場合、プライマーとの結合が弱いバンドは再現性が低い。そこで、信頼性を高めるためにしきい値Ｔｈを設け、エリアＶにおいてしきい値Ｔｈ以上の強度を示すバンドを用いてバンドの一致率を算出する。
【０１７３】
しきい値Ｔｈは、データベースの微生物の最大のバンド強度Ａの２分の1とする。本実施の形態においては、データベースの微生物の最大のバンド強度Ａは１．０であるので、しきい値はＴｈ＝Ａ／２＝１．０／２＝０．５となる。
【０１７４】
ここで、前述のエリアＶにおいてＹ≧Ｔｈをさらに満足するエリアをＩとし、エリアＶにおいてエリアＩを除くエリアをＩＩとする。さらに、エリアＩに位置するバンド数をｎとし、エリアＩでＹ軸上を除く範囲に位置するバンド数をＱとする。
【０１７５】
このとき、しきい値Ｔｈ以上の強度を有するバンドの一致率Ｃ２は、以下の式（２）により算出される。
【０１７６】
Ｃ２＝Ｑ／ｎ ・・・（２）
例えば、図１３に示す相関図においては、エリアＩに位置するバンド（プロット）はｃ１〜ｃ４であり、ｎ＝４となる。また、エリアＩでＹ軸上を除く範囲に位置するプロットはｃ１〜ｃ３となり、Ｑ＝３となる。したがって、しきい値Ｔｈ以上の強度を有するバンドの一致率Ｃ２はＱ／ｎ＝３／４＝０．７５となる。
【０１７７】
（方法５）：面積比率の算出方法
サンプルの微生物とデータベースの微生物のバンドとが一致するという情報だけではなく、一致するサンプルの微生物のバンド強度がデータベースの微生物のバンド強度に接近していることが有効な情報となる。そこで、図１３に示すエリアＩおよびエリアＩＩに位置する各バンド（プロット）に関する三角形の面積を求め、以下に示す方法でバンドの面積比率を算出する。
【０１７８】
各バンド（プロット）に関する三角形とは、そのプロットと、そのプロットと同じＹ座標におけるＹ軸上の点と、原点とを頂点とする三角形である。
【０１７９】
ここで、データベースの微生物のバンド強度をａi、サンプルの微生物のバンド強度をｂiとする。また、エリアＶに位置するバンド数をｍとし、エリアＶに位置するバンドの識別番号をｉとする。ｉは１〜ｍの整数である。
【０１８０】
このとき、面積比率Ｒ１は、以下の式（３）により算出される。
【０１８１】
【数１８】
例えば、プロットｃ１において、データベースの微生物のバンド強度ａiは０．７であり、サンプル微生物のバンド強度ｂiは０．４である場合、プロットｃ１に関する三角形の面積は０．７×０．４×１／２＝０．１４となる。エリアＶに位置する他のプロットｃ２〜ｃ６についても面積を求め、エリアＶに位置する全てのプロットｃ１〜ｃ６に関する面積の合計値を求める。
【０１８３】
また、データベースの微生物の最大のバンド強度Ａは１．０であり、サンプルの微生物の最大のバンド強度Ｂは１．０であるので、エリアＶの面積は１．０×１／２＝０．５となる。図１３の例では、エリアＶに位置するバンド数ｍは６であるので、エリアＶの面積にバンド数ｍを乗算すると、０．５×６＝３．０となる。
【０１８４】
エリアＶに位置する全てのプロットｃ１〜ｃ６に関する三角形の面積の合計値を、エリアＶの面積にバンド数ｍを乗算した値で割ることにより、面積比率Ｒ１を求めることができる。
【０１８５】
（方法６）：しきい値を設けた場合の面積比率の算出方法（その１）
データベースの微生物のバンド強度がしきい値Ｔｈ以上であるデータのみを用いて、図１４に示すように、方法５と同様にエリアＩのみにおける面積比率を算出する。
【０１８６】
ここで、データベースの微生物のバンド強度をａi、サンプルの微生物のバンド強度をｂiとする。また、エリアＩに位置するバンド数をｎとし、エリアＩに位置するバンドの識別番号をｉとする。ｉは１〜ｎの整数である。
【０１８７】
このとき、しきい値Ｔｈを設けた場合における面積比率Ｒ２は、以下の式（４）により算出される。
【０１８８】
【数１９】
例えば、プロットｃ１において、データベースの微生物のバンド強度ａiは０．７であり、サンプル微生物のバンド強度ｂiは０．４である場合、プロットｃ１に関する三角形の面積は０．７×０．４×１／２＝０．１４となる。エリアＩに位置する他のプロットｃ２〜ｃ４についても面積を求め、エリアＩに位置する全てのプロットｃ１〜ｃ４に関する面積の合計値を求める。
【０１９０】
また、データベースの微生物の最大のバンド強度Ａは１．０であり、サンプルの微生物の最大のバンド強度Ｂは１．０であるので、エリアＶの面積は１．０×１／２＝０．５となる。図１４の例では、エリアＩに位置するバンド数ｎは４であるので、エリアＶの面積にバンド数ｎを乗算すると、０．５×４＝２．０となる。
【０１９１】
エリアＩに位置する全てのプロットｃ１〜ｃ４に関する三角形の面積の合計値を、エリアＶの面積にバンド数ｎを乗算した値で割ることにより、面積比率Ｒ２を求めることができる。
【０１９２】
（方法７）：しきい値を設けた場合の面積比率の算出方法（その２）
方法５および方法６による面積比率の算出方法においては、エリアＶの面積（すなわち、サンプルの微生物の最大のバンド強度Ｂ×データベースの微生物の最大のバンド強度Ａ）に対する各バンド（プロット）に関する三角形の面積の合計値の割合を求めている。この場合、データベースの微生物のバンドのうち、バンド強度の強いものをより重視した解析になるのに対し、算出される値が小さくなる。そこで、方法７においては、図１５に示すように、エリアＩに位置するプロットについて、データベースの微生物の各バンドの強度ａiを通るＸ軸に平行な直線（Ｙ＝ａi）、Ｙ軸および直線Ｕから構成される三角形の面積の合計値に対する各バンド（プロット）に関する三角形の面積の合計値の割合を求める。
【０１９３】
ここで、データベースの微生物のバンド強度をａi、サンプルの微生物のバンド強度をｂiとする。また、エリアＩに位置するバンド数をｎとし、エリアＩに位置するバンドの識別番号をｉとする。ｉは１〜ｎの整数である。
【０１９４】
このとき、面積比率Ｒ３は、以下の式（５）により算出される。
【０１９５】
【数２０】
例えば、プロットｃ１において、データベースの微生物のバンド強度ａiは０．７であり、サンプル微生物のバンド強度ｂiは０．４である場合、プロットｃ１に関する三角形の面積は０．７×０．４×１／２＝０．１４となる。エリアＩに位置する他のプロットｃ２〜ｃ４についても面積を求め、エリアＩに位置する全てのプロットｃ１〜ｃ４に関する面積の合計値を求める。
【０１９７】
また、プロットｃ１について、直線Ｙ＝ａiとＹ軸との交点のｙ座標は０．７であり、直線Ｙ＝ａiと直線Ｕとの交点のＸ座標はａi・Ｂ／Ａ＝１．０×０．７／１．０＝０．７となる。したがって、プロットｃ１について、直線Ｙ＝ｂi、Ｙ軸および直線Ｕから構成される三角形の面積は、０．７×０．７×１／２＝０．２４５となる。エリアＩに位置する他のプロットｃ２〜ｃ４についても直線Ｙ＝ａi、Ｙ軸および直線Ｕから構成される三角形の面積を求め、エリアＩに位置する全てのプロットｃ１〜ｃ４について直線Ｙ＝ａi、Ｙ軸および直線Ｕから構成される三角形の面積の合計値を求める。
【０１９８】
エリアＩに位置する全てのプロットｃ１〜ｃ４に関する三角形の面積の合計値を、エリアＩに位置する全てのプロットｃ１〜ｃ４について直線Ｙ＝ａi、Ｙ軸および直線Ｕから構成される三角形の面積の合計値で割ることにより、面積比率Ｒ３を求めることができる。
【０１９９】
上記のようにして、サンプルの微生物とデータベースに登録されている複数の微生物の各々との相関係数、バンド一致率および面積比率を算出した後、求めた相関係数、バンド一致率および面積比率に関してそれぞれしきい値を設定する。このしきい値に基づいて、算出した値がしきい値よりも高いものを検索された微生物として選択する。
【０２００】
なお、相関係数に対するしきい値は０．２〜０．６の範囲、好ましくは０．２５〜０．３５の範囲の数値とする。また、方法６における面積比率に対するしきい値は、０．０５〜０．２０の範囲とする。さらに、方法７における面積比率に対するしきい値は、０．０７〜０．３０の範囲とする。
【０２０１】
しきい値が高いほど検索の正確性が高くなる。一方、しきい値を低くすると、可能性のある微生物をデータベースから広く検索することが可能となる。
【０２０２】
最後に、図２に示すように、結果表示手段５（図１）により、しきい値より高い値を示した微生物の名称を相関係数の高い順に検索結果として表示する（ステップＳ８）。
【０２０３】
なお、必要に応じて以下の工程（ステップＳ９）を設けてもよい。
例えば、図２に示すように、画像データの比較等による確認の工程を設けてもよい。この工程においては、検索結果として表示された微生物がサンプルの微生物と同一であること、あるいはサンプルを構成する微生物の１つであることを以下のような方法により確認する。
【０２０４】
例えば、サンプルの微生物の電気泳動像の画像データを読み出すとともに、検索された微生物の電気泳動像の画像データをデータベース格納部４から読み出し、両者の電気泳動像の画像データの比較を行ってもよい。また、図１１に示すようなサンプルの微生物のバンド強度と検索された微生物のバンド強度との相関図を表示することにより、両者の相関の状態を調べてもよい。これらの方法により、検索結果の確認を行うことが可能となる。
【０２０５】
また、データベースへの登録工程を設けてもよい。この工程は、単一の微生物をサンプルに用いてデータ検索を行った結果、データベースに同じ微生物が存在しないことが明らかとなった場合に、このサンプルの微生物に関するデータを新たにデータベース格納部４のデータベースに登録するものである。それにより、検索可能な微生物の範囲がより広がる。
【０２０６】
また、パラメータ等を変更して再び検索を行う工程を設けてもよい。この工程においては、例えば、データベース検索（ステップＳ７）の工程において説明した同一位置のバンドと見なすバンド位置の範囲や、データベース検索（ステップＳ７）の工程において説明した検索のためのしきい値の設定を変更し、再検索を行う。あるいは、データベース検索（ステップＳ７）の工程において説明した相関係数の算出方法を変更し、再検索を行う。それにより、サンプルの微生物に適した検索を行って結果を得ることができる。
【０２０７】
さらに、サンプルの微生物と検索された微生物との間の不一致バンドの一欄を作成してこれを表示する工程を設けてもよい。この工程においては、検索された微生物のバンドとは一致しなかったサンプルの微生物のバンド（不一致バンド）の一欄を作成して表示する。
【０２０８】
ここで、サンプルに単一の微生物を用いて１種類の微生物が検索された場合においては、サンプルの微生物と検索された微生物との間の不一致バンドが、サンプルの微生物と検索された微生物との区別を可能にする多型（異なる性質）に相当する可能性がある。一方、サンプルが複数の微生物の混合物である場合、サンプルの微生物と検索された微生物との間の不一致バンドは、データベース４に登録されていない微生物のバンドである可能性が高い。このように、不一致バンドはサンプルの微生物に関する重要な情報となり得るので、データとして残すことが好ましい。
【０２０９】
以上のような本発明に係る微生物識別方法によれば、単一の微生物および複数の微生物から構成される微生物群のいずれをサンプルとして用いる場合においても、微生物の識別を行うことが可能となり、さらに同定を行うことも可能となる。
【０２１０】
特に、微生物群をサンプルとして用いる場合においては、微生物群を構成する複数の微生物を同時に識別し、さらに同定することが可能となる。このため、微生物群を構成する微生物の種類の数および種類名を明らかにすることが可能となる。
【０２１１】
一方、単一の微生物をサンプルとして用いる場合においては、サンプルの微生物とデータベースの微生物との多型を検出することも可能となる。また、サンプルの微生物と類似した微生物を見い出すこともできる。
【０２１２】
ここで、この微生物識別方法においては、ＳＳＣ−ＰＣＲによりサンプルの微生物（または微生物群）のＤＮＡ分析を行うので、生化学検査のように微生物を単離および培養する工程が不要となる。このため、容易に識別および同定を行うことが可能になるとともに、単離が困難な微生物の識別および同定も可能になる。また、ＳＳＣ−ＰＣＲは塩基配列が未知のサンプルに対して行うことが可能であるため、塩基配列の測定を行うことなくサンプルの微生物の識別および同定を行うことができる。
【０２１３】
さらに、この微生物識別方法においては、複数のプライマーを用いてそれぞれＰＣＲ反応を行い、複数のＰＣＲ反応の結果を用いて分析を行うため、諸条件によって個々のＰＣＲ反応が良好に進まない場合においても、個々のＰＣＲ反応の影響は小さい。このため、良好な分析を安定して行うことが可能となる。
【０２１４】
例えば、上記の微生物識別方法を生ごみ処理機の処理槽内または土壌中から採取した複数の微生物に適用することにより、生ごみ処理機の処理槽内または土壌中の微生物を同定することができる。また、この結果にしたがって生ごみ処理機の処理槽の条件を変えることにより、生ごみの処理を良好に行えるとともに良好な肥料を作製することができる。
【０２１５】
さらに、このような微生物識別方法は、水銀、砒素、ダイオキシン、環境ホルモン等の有害な汚染物質に汚染された土壌、食品等の発見、およびこれらの汚染状態を知るのに有効である。すなわち、この微生物識別方法により検索された微生物の中に汚染物質に関係のある微生物が含まれている場合には、微生物を採取した土壌等にこの汚染物質が含まれる可能性が示唆される。また、汚染物質に関係のある微生物の存在の程度により、汚染状態が示唆される。
【０２１６】
図１６は図１の解析用コンピュータ３として用いられるパーソナルコンピュータの構成を示すブロック図である。
【０２１７】
図１６のパーソナルコンピュータは、ＣＰＵ（中央演算処理装置）３１０、ディスプレイ３２０、入力装置３３０、ＲＯＭ（リードオンリメモリ）３４０、ＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）３５０、記録媒体駆動装置３６０、スキャナ３７０および外部記憶装置３８０を備える。
【０２１８】
ディスプレイ３２０は、液晶表示パネル、ＣＲＴ（陰極線管）等からなり、図１の結果表示手段５として用いられる。入力装置３３０は、キーボード、マウス等からなり、各種データおよび各種指令を入力するために用いられる。ＲＯＭ３４０にはシステムプログラムが記憶される。
【０２１９】
記録媒体駆動装置３６０は、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、フロッピィディスクドライブ等からなり、ＣＤ−ＲＯＭ、フロッピィディスク等の記録媒体３９０に対してデータの読み書きを行う。記録媒体３９０には、図２の微生物識別方法におけるステップＳ２〜Ｓ８の処理を行う微生物識別プログラムが記録されている。
【０２２０】
スキャナ３７０はＣＣＤカメラにより撮影された電気泳動像を画像データとして入力し、外部記憶装置３８０に格納する。スキャナ３７０は図１の電気泳動イメージ入力部２として働く。
【０２２１】
外部記憶装置３８０は、ハードディスク装置等からなり、記録媒体駆動装置３６０を介して記録媒体３９０から読み込まれた微生物識別プログラムを記憶する。また、外部記憶装置３８０は、上記のデータベースを記憶する。図１のデータベース格納部４は外部記憶装置３６０により構成される。ＣＰＵ３１０は、外部記憶装置３８０に記憶された微生物識別プログラムをＲＡＭ３５０上で実行する。
【０２２２】
なお、微生物識別プログラムを記録する記録媒体３９０として、ＲＯＭ等の半導体メモリ、ハードディスク等の種々の記録媒体を用いることができる。また、微生物識別プログラムを通信回線等の通信媒体を介して外部記憶装置３６０にダウンロードし、ＲＡＭ３５０上で実行してもよい。この場合、通信媒体が記録媒体に相当する。
【０２２３】
本実施の形態では、図１のＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１が増幅手段に相当し、電気泳動イメージ入力部２が画像データ変換手段に相当し、解析用コンピュータ３がバンド検出手段、バンド情報検出手段、対応関係作成手段、同一バンド位置選択手段、バンド配置手段、第１の領域決定手段、第２の領域決定手段、識別手段および第２の識別手段を構成する。
【０２２４】
なお、データベース格納部４に格納されるデータベースは、照合対象となる微生物について図２のステップＳ１〜Ｓ６の処理を行うことにより作成される。
【０２２５】
【実施例】
実施例においては、まず生ゴミ処理機から単離した１２種類の細菌および１２種類のうちの５種類の細菌を混合したモデル菌叢の各々についてＳＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮＡの分析を行い、得られたデータをデータベースに登録した。
【０２２６】
次に、データベースの作成に用いた１２種類の細菌およびモデル菌叢と同一の細菌およびモデル菌叢をサンプルとして用いて、ＳＳＣ−ＰＣＲ法により再度ＤＮＡ分析を行った。このサンプルの分析データに基づいて、上記で作成したデータベースからサンプルの細菌の種類を検索し、サンプルの細菌と検索された細菌とが一致するか調べた。以下に詳細を説明する。
【０２２７】
１．データベースの作成
▲１▼生ゴミ処理機の運転方法
家庭用生ゴミ処理機である三洋電機株式会社製ＳＮＳ−Ｔ１（外形寸法：５８０×４５０×７９５ｍｍ）を用い、この生ゴミ処理機に取り付けられている排水口へエアポンプおよび空気量調整器を接続する改良を加えた。この生ゴミ処理機を温度変化の小さい実験室に設置した。
【０２２８】
生ゴミ処理機の処理槽内に処理担体として２５ｋｇ（含水率７０％）の木質チップ（平均粒度１．５ｍｍの杉材）を入れた。処理槽内に野菜４５０ｇ、果物３００ｇ、魚４０ｇ、肉３０ｇおよび米飯１８０ｇからなる１ｋｇの生ゴミを１日に１回ずつ週５回投入し、生ゴミの投入後、生ゴミ処理機の攪拌羽根で処理槽内を攪拌した。
【０２２９】
処理槽内の木質チップの含水率を３５〜４５％に調節することにより良好な処理状態を保った。エアポンプからの通気の量を空気量調整器で調整することにより含水率の微調整を行った。
【０２３０】
▲２▼生ゴミ処理細菌の単離
細菌培養用の寒天培地を５種類作成した。細菌培養用の各寒天培地の組成を以下の表４〜表８に示す。
【０２３１】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
生ゴミ処理機を運転してから４９０日目の処理槽内の木質チップを１０ｇ採取し、滅菌した０．８５％食塩水を９０ｍＬ加えて細菌が木質チップから十分に遊離するまで懸濁した。その懸濁液をさらに１０-6に希釈し、希釈した懸濁液の１００μＬを各寒天培地上に均一に接種した。３日間、３７℃で培養後、すべてのコロニーを新しい寒天培地に移し替えることで細菌の単離を行った。
【０２３７】
単離したコロニーのうち種類の異なる１２種類の細菌をＳＳＣ−ＰＣＲ用のサンプルとした。単離した細菌はそれぞれＮｏ．１０２８，Ｎｏ．１０３０，Ｎｏ．４００４，Ｎｏ．５０６３，Ｎｏ．７００４，Ｎｏ．１００１，Ｎｏ．１０４１，Ｎｏ．１０４８，Ｎｏ．２００１，Ｎｏ．４００８，Ｎｏ．４０１４，Ｎｏ．４０２０であり、細菌Ｎｏ．１００１，Ｎｏ．１０２８，Ｎｏ．１０３０、Ｎｏ．１０４１およびＮｏ．１０４８は表４に示す組成の培地を用い、細菌Ｎｏ．２００１は表５に示す組成の培地を用い、細菌Ｎｏ．４００４，Ｎｏ．４００８，Ｎｏ．４０１４およびＮｏ．４０２０は表６に示す組成の培地を用い、細菌Ｎｏ．５０６３は表７に示す組成の培地を用い、細菌Ｎｏ．７００４は表８に示す組成の培地を用いてそれぞれ単離した。また、１２種類のうちＮｏ．１０２８，Ｎｏ．１０３０，Ｎｏ．４００４，Ｎｏ．５０６３，Ｎｏ．７００４の５種類の細菌の染色体ＤＮＡを等濃度（各１０ｐｇ／μＬ）で混合し、モデル菌叢を調製した。
【０２３８】
各細菌の染色体ＤＮＡはCurrent Protocols in Molecular Biology (published by Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience) の2.4.1 〜2.4.2 に記載の“Preparation of Genomic DNA from Bacteria”の方法に従って調製した。
【０２３９】
▲３▼生ゴミ処理機から単離した１２種類の細菌およびモデル菌叢のＤＮＡ分析
ここでは、PE Applied Biosystemの PCR System 9700および三洋電機株式会社製ＤＮＡ増幅器ＭＩＲ−Ｄ４０を用いて、以下に示すＳＳＣ−ＰＣＲ法により、各細菌について分析を行った。
【０２４０】
ＳＳＣ−ＰＣＲ法においては、以下の表９に示す４６種類のプライマー（配列番号１〜４６）を用いた。
【０２４１】
【表９】
また、ＳＳＣ−ＰＣＲ法に用いた反応溶液の組成を表１０に示す。
【０２４３】
【表１０】
表１０において、ｄＮＴＰｍｉｘはｄＡＴＰ(2--デオキシアデノシン-5--三燐酸）、ｄＣＴＰ(2--デオキシシチジン- 5-- 三燐酸) 、ｄＧＴＰ(2--デオキシグアノシン-5--三燐酸) 、ｄＴＴＰ(2--デオキシチミジン-5--三燐酸) の等濃度混合溶液である。反応溶液量は、２０μＬとした。
【０２４５】
ここでは、１２種類の細菌およびモデル菌叢の各々について、プライマーとして配列番号１〜４６の各プライマーをそれぞれ含む５５２（１２×４６）種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を同時に調製した。また、配列番号１４のプライマーとこれに対応する塩基配列を有する鋳型ＤＮＡとを含む反応溶液をポジティブコントロールとして、また、配列番号１４のプライマーを含むがＤＮＡを含まない反応溶液をネガティブコントロールとして４６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液と同時に調製した。
【０２４６】
次に、上記のようにして調製した５５２種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を図４に示すＤＮＡ断片増幅装置の孔部５１にそれぞれ収納するとともに、孔部５１ａおよび孔部５１ｂにネガティブコントロールおよびポジティブコントロールをそれぞれ収納した。このＤＮＡ断片増幅装置を用いてＳＳＣ−ＰＣＲを行った。
【０２４７】
ＳＳＣ−ＰＣＲのサイクルを表１１に示す。
【０２４８】
【表１１】
続いて、ＳＳＣ−ＰＣＲ後の反応溶液、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールの５μＬを１．５％アガロースゲル電気泳動法で分析した。電気泳動条件は、３．３Ｖ／ｃｍ定電圧とした。また、この場合においては、増幅されたＤＮＡ断片のバンドの位置を測定するために、濃度が既知で定量可能なＤＮＡサイズマーカ（ニッポンジーン株式会社製Smart Ladder）を反応溶液と同時に電気泳動させた。
【０２５０】
電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマイド染色し、波長２５４ｎｍの紫外線を照射したときのエチジウムブロマイド蛍光像をインスタントフィルムに撮影した後、スキャナーでコンピュータに取り込んだ。
【０２５１】
コンピュータに取込んだ電気泳動像の画像データを、ソフトウェア（Genomic Solutions Advanced Quantifier 1-D Match ）を用いて解析し、細菌およびモデル菌叢の各プライマーにおけるバンドサイズおよびバンド強度を求めた。
【０２５２】
なお、この場合においては行っていないが、次のような画像補正の工程をさらに行ってもよい。画像補正として、ポジティブコントロールのバンドの発光強度をもとにして他のバンドの発光強度を補正することが考えられる。例えば、測定したポジティブコントロールのバンドの発光強度が７０％であった場合、このバンドの発光強度が１００％になるように補正するとともに、他のバンドの発光強度も同様の割合で補正する。これにより、ＤＮＡ断片増幅反応時における反応条件等の誤差がＤＮＡ断片の増幅効率に与える影響を除去することができる。
【０２５３】
また、各々の電気泳動像の画像データにおいて、測定により求めたＤＮＡサイズマーカの１０００ｂｐのバンドの発光強度が１００％になるような割合で補正するとともに、他のバンドの発光強度についても同様の割合で補正を行うことも考えられる。このように画像データの階調の補正を行うことにより、各々の画像データにおける階調の誤差を除去することができる。
【０２５４】
さらに、測定により求めたＤＮＡサイズマーカの２００ｂｐのバンドの発光強度の２分の１の発光強度をしきい値として定め、各プライマーにおけるバンドのうち発光強度がしきい値よりも小さなバンドを削除することも考えられる。このようにして発光強度が小さなバンドを削除することにより、ＳＳＣ−ＰＣＲにおいて再現性の低いバンドを削除することができる。それにより、ＳＳＣ−ＰＣＲにおける再現性の向上が図られ、得られたデータの信頼性を向上させることができる。
【０２５５】
▲４▼バンド強度とバンド位置の測定
上記で用いたＤＮＡサイズマーカは、電気泳動によりバンドサイズ（塩基対の数）の異なる１４本のバンドに分離される。この１４本のバンドのサイズは、大きいものから１００００、８０００、６０００、５０００、４０００、３０００、２５００、２０００、１５００、１０００、８００、６００、４００および２００ｂｐである。なお、この場合においては１．５％アガロースゲルを用いて電気泳動を行っているため、１００００ｂｐのバンドと８０００ｂｐのバンドとは分離しない。したがって、１３本のバンドが現れる。１３本のバンド間の間隔は均一ではなく、サイズが大きいバンド程、バンド間の間隔が小さくなる。
【０２５６】
ところで、各プライマーにおけるバンドの位置を表示する方法として、ＤＮＡサイズマーカのバンドの位置と各プライマーにおけるバンドの位置とを比較することにより各プライマーにおけるバンドの位置をバンドサイズ（塩基対の数）に変換して表示する方法がある。しかしながら、この方法においては、以下のような問題が生じる。
【０２５７】
例えば、２００ｂｐ付近のバンドにおいては、電気泳動像におけるバンドの位置が１ｍｍ異なると、バンドサイズが４０ｂｐ異なる。これに対して、５０００ｂｐ付近のバンドにおいては、電気泳動像におけるバンドの位置が１ｍｍ異なると、バンドサイズが１０００ｂｐ異なる。このように、５０００ｂｐ付近では１ｍｍが１０００ｂｐに相当するのに対して、２００ｂｐ付近では１ｍｍが４０ｂｐに相当する。また、スキャナで取り込んだ電気泳動像の画像データの解像度はせいぜいサブｍｍである。
【０２５８】
以上のことから、各プライマーにおけるバンドの位置をバンドサイズ（塩基対の数）で表示する場合には、バンドサイズの大きなもの程誤差が大きくなる。したがって、この場合においては、バンドサイズによって誤差の大きさを変える必要がでてくる。
【０２５９】
以上のことから、各プライマーにおいて得られたバンドの位置を、バンドサイズで表示するのではなく、泳動距離方向の実測値に基づいて表示する方が、バンド位置の誤差が一定の大きさになるので好ましい。
【０２６０】
なお、電気泳動においては、泳動時間や泳動時の温度で泳動距離が変化する。このため、電気泳動における泳動距離方向の実測値に基づいてバンドの位置を表示するためには、規格化を行う必要がある。以下に、規格化の方法を示す。
【０２６１】
なお、ここでは、規格化を行うために新たにＤＮＡサイズマーカを電気泳動させ、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を撮影した１２枚の電気泳動写真を別途用意した。
【０２６２】
まず、この１２枚の電気泳動写真（Ｎｏ．１〜１２）の画像データの各々において、ＤＮＡサイズマーカの１０００ｂｐのバンドを基準とし、このバンドから他の１２本のバンドまでの距離を測定した。その結果を表１２に示す。
【０２６３】
【表１２】
なお、この場合においては、前述のように、８０００ｂｐのバンドと１００００ｂｐのバンドとが分離しないため、８０００−１００００ｂｐの１つのバンドとして処理している。また、この場合においては１０００ｂｐのバンドの実測距離を０．００とし、１０００ｂｐよりもサイズの小さなバンドの実測距離を負の値で表している。
【０２６５】
次に、１２枚の写真（Ｎｏ．１〜１２）の画像データの各々において、１０００ｂｐのバンドから１００００ｂｐのバンドまでの実測距離を１とし、これを基準として他のバンドの位置の規格化を行った。
【０２６６】
例えば、Ｎｏ．１の写真のデータにおいては、１０００ｂｐのバンドから１００００ｂｐのバンドまでの実測距離が１．６６ｃｍである。したがって、この値１．６６で他のバンドの実測距離の値を割り、それぞれのバンドの位置の規格化を行った。この操作を他のＮｏ．２〜Ｎｏ．１２の写真のデータについても行った。その結果を表１３に示す。
【０２６７】
【表１３】
さらに、表１３に示すように、各サイズのバンドについて、１２枚の電気泳動写真（Ｎｏ．１〜１２）のデータにおける平均を求めた。以上のようにして、ＤＮＡサイズマーカにおいて１０００ｂｐのバンドの位置を基準として他のバンドの相対的な位置（比）を求めた。
【０２６９】
さらに、上記で得られた値を見やすくするため、基準とした１０００ｂｐのバンドの位置を１０００とし、１０００ｂｐからの相対的な距離が１．００である８０００〜１００００ｂｐのバンドの位置を２０００とした。以下、これに基づいて、他のバンドについてもバンド位置を導き出した。このようにして、ＤＮＡサイズマーカの１３本のバンドについて、バンド位置（基準値）を求めた。その結果を表１４に示す。
【０２７０】
【表１４】
なお、上記においては、ＤＮＡサイズマーカの１０００ｂｐのバンドの位置を基準とするとともに８０００−１００００ｂｐのバンドの位置を１とする規格化の方法について説明したが、規格化の方法はこれ以外であってもよい。
【０２７２】
次に、上記のようにして得られたＤＮＡサイズマーカのバンド位置（基準値）に基づいて、１２種類の細菌の各々について、４６種類のプライマーの各々におけるバンドの位置およびバンド強度を測定した。さらに、測定により得られたデータをまとめ、細菌ごとにバンドデータの一欄を作成した。この場合においては、バンドの発光分布のピークの高さをバンド強度とした。
【０２７３】
なお、前述のようにこの場合においては、電気泳動像の画像データの各バンドについてポジティブコントロールのバンドの発光強度をもとにして他のバンドの発光強度を補正することは行わず、また、ＤＮＡサイズマーカの発光強度による階調補正は行わず、また、発光強度がしきい値より小さいバンドの削除を行わなかった。
【０２７４】
なお、このようなバンド位置およびバンド強度の測定には、前述のソフトウェア（Genomic Solutions Advanced Quantifier 1-D Match ）を用いた。また、６枚の電気泳動写真の画像データのバンド位置およびバンド強度のデータを集計して一欄を作成する工程には、本発明者がMicrosoft Visual Basicで作成したソフトウェアを用いた。
【０２７５】
例えば表１５〜表１８は、細菌Ｎｏ．７００４，Ｎｏ．１０２８，Ｎｏ．１０３０，Ｎｏ．４００４，Ｎｏ．５０６３およびモデル菌叢に関するバンドデータの一欄を示したものである。
【０２７６】
【表１５】
【表１６】
【表１７】
【表１８】
表１５〜表１８において、”５ｍｉｘ”は、５種類の細菌の混合を示す。
他の７種類の細菌Ｎｏ．１００１，Ｎｏ．１０４１，Ｎｏ．１０４８，Ｎｏ．２００１，Ｎｏ．４００８，Ｎｏ．４０１４，およびＮｏ．４０２０についても、このようなバンドデータの一欄を作成した。
【０２８１】
▲５▼細菌のバンドデータ一欄のデータベースへの登録
上記の表１５〜１８に示すＮｏ．７００４，Ｎｏ．１０２８，Ｎｏ．１０３０，Ｎｏ．４００４，Ｎｏ．５０６３およびモデル菌叢のバンドデータの一欄を検索用のデータとしてデータベースに登録した。同様にして、他の７種類の細菌、Ｎｏ．１００１，Ｎｏ．１０４１，Ｎｏ．１０４８，Ｎｏ．２００１，Ｎｏ．４００８，Ｎｏ．４０１４，およびＮｏ．４０２０についても、バンドデータの一欄を検索用のデータとしてデータベースに登録した。
【０２８２】
２．複数の細菌の混合物をサンプルとして用いた場合のデータ検索
ここでは、複数の細菌の混合物をサンプルとした場合の検索をテストするために、上記のデータベースの作成時に単離した５種類の細菌（Ｎｏ．１０２８,Ｎｏ．１０３０,Ｎｏ．４００４,Ｎｏ．５０６３,Ｎｏ．７００４）を含むモデル菌叢を用意した。モデル菌叢を用いて前述のＳＳＣ−ＰＣＲを行ってＤＮＡの分析を再度行い、得られたサンプルのデータに基づいて、上記で作成したデータベースから検索を行った。
【０２８３】
なお、モデル菌叢を用いてＳＳＣ−ＰＣＲを行う場合においては、上記５種類の細菌の染色体ＤＮＡをそれぞれ濃度１０μｇ／Ｌずつ含むＳＳＣ−ＰＣＲ反応溶液を調製した。
【０２８４】
また、この場合のＤＮＡの分析方法およびバンド強度・バンド位置の測定方法に関しては、データベースの作成時の工程において前述した通りである。この場合においても、前述のソフトウェア（Genomic Solutions Advanced Quantifier 1-D Match ）および本発明者が作成したソフトウェアを用いた。
【０２８５】
モデル菌叢から得られた電気泳動像とデータベースに登録している細菌Ｎｏ．７００４とのプライマ別のデータを表１９および表２０に示す。
【０２８６】
【表１９】
【表２０】
さらに、表１９および表２０をもとに、モデル菌叢から得られたバンドのサイズとデータベースに登録されている細菌NO．７００４のバンドサイズとを比較し、バンドサイズの比較を行った。バンドサイズの比較結果を表２１〜表２３に示す。
【０２８９】
【表２１】
【表２２】
【表２３】
次に、表２１〜表２３をもとにモデル菌叢のバンド強度と細菌Ｎｏ．７００４のバンド強度との相関図を作成し、モデル菌叢のバンド強度と細菌Ｎｏ．７００４とにおける相関係数、バンド一致率および面積比率を算出した。図１７にモデル菌叢のバンド強度と細菌Ｎｏ．７００４のバンド強度との相関図を示す。
【０２９３】
なお、相関係数の算出は、本発明者がMicrosoft Visual Basicで作成したソフトウェアを用いて行った。また、この場合のパラメータは、バンド位置の誤差（同一位置のバンドとみなすバンド位置の範囲）を±４３とした。また、相関係数の算出方法は、方法２の図１２（ｃ）に示す方法により算出した。また、バンド一致率は、方法１、方法３および方法４に示すバンド一致率の算出方法により算出した。面積比率は、方法５、方法６および方法７に示す面積比率の算出方法により算出した。方法１〜方法７により相関係数、バンド一致率および面積比率を算出したところ、表２４に示す結果が得られた。
【０２９４】
【表２４】
表２４では、サンプルとして用いたモデル菌叢に含まれる５種類の細菌（Ｎｏ．１０２８，Ｎｏ．１０３０，Ｎｏ．４００４，Ｎｏ．５０６３およびＮｏ．７００４）を上から上５列に示した。
【０２９６】
方法1、３、４においては細菌Ｎｏ．１０４１のバンド一致率が、モデル菌叢に含まれる細菌のうち最も低いバンド一致率の値を上回った。
【０２９７】
また、方法２においては、細菌Ｎｏ．４０１４の相関係数の値がモデル菌叢に含まれる細菌のうち最も低い相関係数の値を上回った。
【０２９８】
それに対して、方法６および方法７においては、モデル菌叢に含まれる５種類の細菌における面積比率とモデル菌叢に含まれない他の7種類の細菌における面積比率との間で顕著な差を得ることができ、サンプルのモデル菌叢に含まれる５種類の細菌を正確に識別することができた。
また、方法6においては、しきい値を０．０５から０．２０の範囲で設定することができ、例えば、０．１０に設定することが可能である。
さらに、方法7においては、しきい値を０．０７から０．３０の範囲で設定することができ、例えば、０．１７に設定可能である。
【０２９９】
以上のように、複数種類の細菌を含む細菌群を識別対象とする場合においては、前述の方法１から方法７を用いて相関係数、バンド一致率および面積比率を算出し、算出した値をもとに総合的に解析することにより、細菌群に含まれる細菌を正確に識別することが可能となる。
【０３００】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る微生物識別装置の一例を示す模式図である。
【図２】本発明に係る微生物識別方法の一例を示すフローチャートである。
【図３】図２の微生物識別方法に用いるＳＳＣ−ＰＣＲ法の一例を示すフローチャートである。
【図４】図３のＳＳＣ−ＰＣＲ法に用いるＤＮＡ断片増幅装置の例を示す模式図である。
【図５】ＳＳＣ−ＰＣＲ法における第１のサイクル中の過程を示す模式図である。
【図６】ＳＳＣ−ＰＣＲ法における第２のサイクルの１回目のサイクル中の過程を示す模式図である。
【図７】ＳＳＣ−ＰＣＲ法における第２のサイクルの２回目のサイクル中の過程を示す模式図である。
【図８】図２の微生物識別方法に用いる画像処理法の一例を示すフローチャートである。
【図９】図８の画像処理法を用いて処理を行った電気泳動像の画像データである。
【図１０】サンプルの微生物のバンドデータおよびデータベースのバンドデータにおける同一プライマーの同一位置のバンドの検索方法を示す図である。
【図１１】サンプルの微生物のバンド強度とデータベースの微生物のバンド強度との相関関係を示す図である。
【図１２】相関係数の算出方法を示す図である。
【図１３】モデル菌叢のバンド強度と細菌Ａのバンド強度との相関関係を示す図である。
【図１４】サンプルの微生物のバンド強度とデータベースの微生物のバンド強度との面積比率の算出方法を示す図である。
【図１５】サンプルの微生物のバンド強度とデータベースの微生物のバンド強度との面積比率の算出方法を示す図である。
【図１６】図１の解析用コンピュータとして用いられるパーソナルコンピュータの構成を示すブロック図である。
【図１７】モデル菌叢のバンド強度と細菌Ｎｏ．７００４のバンド強度との相関関係を示す図である。
【符号の説明】
１ ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置
２ 電気泳動イメージ入力部
３ 解析用コンピュータ
４ データベース格納部
５ 結果表示手段
１１ ＤＮＡ
１２ａ，１２ｂ，１２ｃ，１２ｄ，１２ｅ １本鎖
１３ａ，１３ｂ，１３ｃ，１３ｄ，１３ｅ ２本鎖
２１ａ，２１ｂ，２１ｃ プライマー
５０ 支持プレート
５１，５１ａ，５１ｂ 孔部[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a microorganism identification method, a microorganism identification apparatus, and a microorganism identification program.
[0002]
[Prior art]
In recent years, garbage disposal machines that compost (fertilize) organic waste (so-called garbage) discharged from households and the like have been actively researched and developed. In the garbage processing machine, fertilizers are created by decomposing organic matter by microorganisms such as bacteria and protozoa.
[0003]
In such composting by a garbage disposal machine, the degree of composting is evaluated by monitoring temperature or the like in the composting process (organic matter decomposition process). And the state of a garbage processing machine is adjusted so that a good-quality fertilizer may be created based on the evaluation.
[0004]
However, in order to create a better quality fertilizer, information on the group of microorganisms (at least the type of microorganisms) functioning inside the garbage processor is required. Information on this microbial group is also necessary for controlling the decomposition of garbage by microorganisms. In addition, it is important to know the information of microbial groups in the soil in order to improve the soil by adding the prepared fertilizer.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
Conventionally, as a method for obtaining information on a microorganism group, for example, information on a bacterial group, a method in which individual bacteria contained in the bacterial group are isolated and biochemically tested is used. However, this method is time consuming and difficult to examine for bacteria that are difficult to isolate.
[0006]
On the other hand, a method for obtaining information on a microorganism group by performing DNA analysis is also conceivable. In order to perform DNA analysis, it is necessary to amplify DNA. PCR (Polymerase Chain Reaction) is used as a method for amplifying DNA (US Pat. Nos. 4,683,195, 4,683,202, 4,965,188, 5,038,852 and 5,333,675). This PCR method uses a primer having a base sequence complementary to the base sequence at both ends of the DNA to be amplified (template DNA) and a heat-resistant DNA polymerase, and includes a heat denaturation step, an annealing (heat treatment) step, and an extension reaction step. By repeating a cycle consisting of stages, it is possible to amplify a DNA fragment almost identical to the template DNA. When this PCR method is used, a predetermined fragment in one DNA of bacteria present only in a trace amount can be amplified, for example, 100,000 to 1,000,000 times.
[0007]
However, in order to use this PCR method, it is necessary that the base sequences of at least both ends of one region of the template DNA are known. Therefore, in the conventional PCR method, unless the types and base sequences of microorganisms functioning inside the garbage processing machine and microorganisms existing in the soil are known, DNA fragments of those microorganisms cannot be amplified.
[0008]
Therefore, the RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) method or the AP-PCR (Arbitrarily Primed-Polymerase Chain Reaction) method for amplifying many types of DNA fragments simultaneously from one type of DNA with a single primer without base sequence information. Proposed. In these methods, the primer specificity is lowered during primer binding by lowering the primer annealing temperature and further increasing the magnesium ion concentration in the reaction solution. The primer then binds to the chromosomal DNA of the microorganism with a mismatch, and the DNA fragment is replicated.
[0009]
According to these RAPD methods or AP-PCR methods, even if there is no information on the base sequence of the DNA to be amplified, some DNA fragment is amplified in large quantities by a single primer. A DNA fingerprint is obtained by separating the amplified DNA fragments by gel electrophoresis. By analyzing this DNA fingerprint, the state of the microorganism can be analyzed.
[0010]
On the other hand, when the conventional RAPD method or AP-PCR method is applied to a group of microorganisms composed of a plurality of microorganisms, the number of types of DNA fragments to be amplified is too large. It becomes difficult to associate with the microorganisms, and it is difficult to grasp the ecosystem formed by the microorganism group. In addition, the microorganisms constituting the microorganism group cannot be identified from the amplified DNA fragments.
[0011]
Therefore, Japanese Patent Laid-Open No. 2001-275700 discloses an SSC that uses a PCR method and can extract only one DNA fragment unique to a microorganism from one type of microorganism using optimized PCR primers and PCR conditions. -PCR (Single Strain Counting-PCR) method has been proposed. However, when the SSC-PCR method is applied to a plurality of bacteria, the DNA fragment that has been sufficiently obtained when the SSC-PCR method is applied to a single bacterium is amplified only in a small amount, or an electrophoretic image Then you may not be able to observe. This is thought to be because DNA regions with strong primer binding strength are intensively amplified, whereas DNA regions with low primer binding strength lose the competition for amplification and lower amplification efficiency. .
[0012]
As described above, when the microorganism to be identified is a group of microorganisms composed of a plurality of microorganisms, the detection or identification of the bacteria can be performed based on the intensity of the amplified band because of a competitive amplification reaction. It becomes difficult.
[0013]
An object of the present invention is to provide a microorganism identification method, a microorganism identification apparatus, and a microorganism identification program capable of simultaneously and easily identifying a plurality of microorganisms constituting a microorganism group.
[0014]
[Means for Solving the Problems and Effects of the Invention]
A microorganism identification method according to a first invention is a microorganism identification method for identifying a microorganism to be identified, wherein a plurality of primers having different base sequences are prepared, and each of the plurality of primers is used as an identification object. By applying the polymerase chain reaction method, which repeats the thermal denaturation process, primer annealing process, and polymerase extension reaction process in this order to the microbial DNA, the DNA fragments of the microbial DNA to be identified are amplified. Applying an electrophoresis method to a DNA fragment amplified using each of a plurality of primers, obtaining an electrophoretic image corresponding to each primer, and displaying an electrophoretic image corresponding to each primer. The step of converting to data and the band of the electrophoretic image corresponding to each primer based on the image data A correspondence relationship between the step of obtaining, information on the position and intensity of the detected band in the electrophoretic image corresponding to each primer based on the image data, and information on the position and intensity of the plurality of primers A database in which the correspondence relationship for the microorganism to be verified and the correspondence target is stored in advance is searched, and the target microorganism is determined from the bands included in the correspondence determined for the identification target microorganism. Selecting a band at the same position as the band included in the correspondence, obtaining a pair of a microorganism band to be identified for each band at the same position and a band of a microorganism to be verified; The first coordinate axis X representing the band intensity and the band intensity of the microorganism to be verified A step of arranging each set of bands on the XY plane defined by two coordinate axes Y, and the maximum value of the intensity of the band of the microorganism to be verified among the bands arranged on the XY plane as A When the maximum intensity of the band of the microorganism to be identified among the bands arranged on the XY plane is B, X ≧ 0, Y ≦ A and Y ≧ (A / B) · X are satisfied. Determining a first region;A step of obtaining a second region that further satisfies Y ≧ Th on the first region when Th is a threshold value greater than 0 and less than A; and a step of identifying a microorganism to be identified And the step of identifying comprises: extracting a band located on the second region; and extracting the Y coordinate and X coordinate of the extracted band a i And b i When the number of extracted bands is n and the identification number i of the extracted band is 1 to n,
[Equation 9]
A microorganism identification method according to a second invention is a microorganism identification method for identifying a microorganism to be identified, wherein a plurality of primers having different base sequences are prepared, and each of the plurality of primers is used as an identification object. By applying the polymerase chain reaction method, which repeats the thermal denaturation process, primer annealing process, and polymerase extension reaction process in this order to the microbial DNA, the DNA fragments of the microbial DNA to be identified are amplified. Applying an electrophoresis method to a DNA fragment amplified using each of a plurality of primers, obtaining an electrophoretic image corresponding to each primer, and displaying an electrophoretic image corresponding to each primer. The step of converting to data and the band of the electrophoretic image corresponding to each primer based on the image data A correspondence relationship between the step of obtaining, information on the position and intensity of the detected band in the electrophoretic image corresponding to each primer based on the image data, and information on the position and intensity of the plurality of primers Searching a database in which the correspondence relationship for the microorganism to be verified and the correspondence target microorganism is stored in advance, and among the bands included in the correspondence relationship determined for the microorganism to be identified , Select a band at the same position as the band included in the correspondence obtained for the microorganism to be verified, and for each band at the same position, set a pair of the microorganism band to be identified and the band of the microorganism to be verified Each set is set on an XY plane defined by a step of obtaining and a first coordinate axis X representing the intensity of the band of the microorganism to be identified and a second coordinate axis Y representing the intensity of the band of the microorganism to be identified. The step of arranging the band, and the maximum value of the intensity of the band of the microorganism to be verified among the bands arranged on the XY plane is A, and the microorganism to be identified among the bands arranged on the XY plane When the maximum value of the intensity of the band of B is B, a step of obtaining a first region satisfying X ≧ 0, Y ≦ A and Y ≧ (A / B) · X, Th is greater than 0 and greater than A Is too small A second region that further satisfies Y ≧ Th on the first region, and a step of identifying a microorganism to be identified, the step of identifying the second region The step of extracting the band located above, and the Y coordinate and X coordinate of the extracted band a i And b i When the number of extracted bands is n and the identification number i of the extracted band is 1 to n,
[Expression 10]
[0015]
When the identification target is a group of microorganisms composed of a plurality of microorganisms, the band intensity of each microorganism to be identified tends to appear weaker than the band intensity of the microorganism to be verified.
[0016]
In view of this, it becomes an identification target on the XY plane defined by the first coordinate axis X representing the intensity of the band of the microorganism to be identified and the second coordinate axis Y representing the intensity of the band of the microorganism to be verified. A first area where the band intensity of the microorganism is lower than the band intensity of the microorganism to be collated is set, and the microorganism to be identified is identified based on the band located on the first area.
[0017]
Therefore, when a group of microorganisms composed of a plurality of microorganisms is used as an identification target, a plurality of microorganisms constituting the group of microorganisms can be simultaneously and easily identified. For this reason, it becomes possible to clarify the number and type names of the types of microorganisms constituting the microorganism group.
[0018]
Here, in this microorganism identification method, the polymerase chain reaction method is applied to the DNA of the microorganism to be identified at a time using each of a plurality of primers having different base sequences, and the DNA from the microorganism to be identified is DNA. Since DNA analysis is performed by amplifying fragments, a step of isolating and culturing microorganisms as in biochemical tests is not necessary. As a result, identification and identification can be easily performed, and microorganisms that are difficult to isolate can be identified and identified. In addition, since the DNA amplification method using a plurality of primers described above can be performed on an identification target whose base sequence is unknown, the identification of the microorganism to be identified is performed without measuring the base sequence. And identification can be performed.
[0019]
Furthermore, in this microorganism identification method, the polymerase chain reaction method is performed using a plurality of primers, and identification is performed using the results of the plurality of polymerase chain reactions. Therefore, each polymerase chain reaction proceeds well depending on various conditions. Even in the absence, the effect of individual polymerase chain reactions is small. For this reason, it is possible to stably perform good identification.
[0021]
AlsoA second region excluding a region having a low band intensity is set out of the bands located on the first region, and a microorganism to be identified is identified based on the band located on the second region. Thereby, it is possible to identify a microorganism by removing data of a band having low reproducibility among bands obtained from a group of microorganisms to be identified. As a result, it becomes possible to more accurately identify microorganisms.
[0033]
furtherThen, the area ratio of each band is calculated based on the band on the second region. Since the band has a higher intensity, the area ratio becomes higher. Therefore, the identification can be performed with emphasis on the data of the high intensity band. As a result, it becomes possible to identify microorganisms more accurately.
[0034]
Moreover, since the area ratio is calculated based on the band on the second region excluding the data of the band having low reproducibility among the bands arranged on the XY plane, the microorganism can be identified more accurately. Is possible.
[0040]
The information regarding the band intensity represents the peak height or area of the emission intensity distribution of the band in the electrophoretic image, and may be calculated based on the gradation distribution of the image data.
[0041]
Information regarding the position of the band may be represented by a distance between a predetermined reference position on the electrophoretic image and the band. Or the information regarding the position of a band may be represented by the size of the DNA fragment contained in the said band.
[0042]
The information regarding the band intensity represents the peak height or area of the emission intensity distribution of the band in the electrophoretic image, and may be calculated based on the gradation distribution of the image data.
[0043]
The correspondence between the plurality of primers and the information on the position and intensity of the band may indicate the correspondence between the information on the position of each band and the information on the intensity of each band for each primer.
[0044]
Using a reference primer with a known base sequence, a DNA fragment of the reference DNA is amplified by applying the polymerase chain reaction method to the reference DNA having a base sequence complementary to the base sequence of the reference primer. Applying an electrophoresis method to the DNA fragment of the reference DNA amplified using the reference primer, obtaining an electrophoretic image corresponding to the reference DNA, and applying the electrophoresis to the reference DNA. The method may further include a step of converting the electrophoretic image into image data and a step of correcting the image data corresponding to the microorganism to be identified based on the image data corresponding to the reference DNA.
[0045]
In this case, the DNA fragment is reliably amplified from the reference DNA by the polymerase chain reaction method using the reference primer. Based on the image data corresponding to the electrophoretic image of the DNA fragment of the reference DNA thus amplified, the amplification efficiency of the DNA fragment of the reference DNA in the polymerase chain reaction can be determined. The amplification efficiency obtained in this way can also be applied to a DNA fragment of a microorganism to be identified. Therefore, it is possible to correct the image data corresponding to the electrophoretic image of the DNA fragment of the microorganism to be identified based on the obtained amplification efficiency and analyze the amount of the DNA fragment.
[0046]
Simultaneously with the step of obtaining the electrophoresis image corresponding to each primer, the step of obtaining the electrophoresis image of the DNA size marker, the step of converting the electrophoresis image of the DNA size marker into image data, and the image data corresponding to the DNA size marker And correcting the image data corresponding to the microorganisms to be identified based on the above.
[0047]
In this case, by correcting the gradation of the image data corresponding to the identification target microorganism based on the image data corresponding to the electrophoresis image of the DNA size marker, an accurate comparison of the emission intensity of the bands in the electrophoresis image can be performed. It becomes possible.
[0048]
The step of detecting the band of the electrophoretic image is performed by setting a threshold value based on the emission intensity of the DNA fragment amplified from the reference DNA or the DNA size marker band in the electrophoretic image, and exceeding the threshold value in the electrophoretic image. The step of selecting a band having a light emission intensity of
[0049]
In this case, the band whose emission intensity is less than the threshold is a DNA fragment band with low amplification efficiency and low reproducibility. In addition, the band whose emission intensity is equal to or higher than the threshold is a DNA fragment band with high amplification efficiency and high reproducibility. Therefore, it is possible to analyze only DNA fragments with high amplification efficiency and high reproducibility by selecting a band having a light emission intensity equal to or higher than a threshold value. Thereby, the reliability of the identification result is improved.
[0050]
The database may store correspondences for a plurality of types of microorganisms. Thereby, various microorganisms to be identified can be identified.
[0051]
ThirdThe microorganism identification method according to the invention is a microorganism identification method for identifying a microorganism to be identified, wherein a plurality of primers having different base sequences are prepared, and each of the plurality of primers is used to identify the DNA of the microorganism to be identified On the other hand, the step of amplifying the DNA fragment of the microorganism DNA to be identified by applying the polymerase chain reaction method in which the thermal denaturation step, the primer annealing step and the polymerase extension reaction step are repeated in this order at a time; Applying electrophoresis to DNA fragments amplified using each of multiple primers, obtaining an electrophoretic image corresponding to each primer, and converting the electrophoretic image corresponding to each primer into image data Simultaneously with the step of obtaining an electrophoretic image corresponding to each primer, A step of obtaining an electrophoretic image of a mosquito, a step of converting an electrophoretic image of a DNA size marker into image data, and a base sequence complementary to the base sequence of the reference primer using a reference primer having a known base sequence Applying a polymerase chain reaction to a reference DNA having a step, obtaining an electrophoretic image corresponding to the reference DNA, converting an electrophoretic image corresponding to the reference DNA into image data, DNA Correcting the image data corresponding to each primer based on the image data corresponding to the size marker and the image data corresponding to the reference DNA, and the band of the electrophoretic image corresponding to each primer based on the corrected image data In the electrophoresis image corresponding to each primer based on the image data A database in which a step for obtaining information on the position and intensity of the issued band, a step for obtaining a correspondence relationship between the plurality of primers and information on the position and intensity of the band, and a correspondence relationship for microorganisms to be collated are stored in advance. And select a band at the same position as the band included in the correspondence obtained for the microorganism to be verified from the bands included in the correspondence obtained for the microorganism to be identified, and the band at the same position. A step of obtaining a set of a band of a microorganism to be identified and a band of a microorganism to be verified for each, a first coordinate axis X representing the intensity of the band of the microorganism to be identified and a band of the microorganism to be verified Placing each set of bands on an XY plane defined by a second coordinate axis Y representing intensity; Of the bands arranged on the Y plane, when A is the maximum intensity of the band of the microorganism to be verified, X ≧ 0, Y ≦ A, and Y ≧ X are satisfied.A step of obtaining a first region, a step of obtaining a second region further satisfying Y ≧ Th on the first region when Th is set to a threshold value greater than 0 and smaller than A, and identification Identifying a target microorganism, wherein the identifying step includes a step of extracting a band located on the second region, and a Y coordinate and an X coordinate of the extracted band are respectively a i And b i When the number of extracted bands is n and the identification number i of the extracted band is 1 to n,
## EQU11 ##
A microorganism identification method according to a fourth invention is a microorganism identification method for identifying a microorganism to be identified, wherein a plurality of primers having different base sequences are prepared, and each of the plurality of primers is used as an identification object. By applying the polymerase chain reaction method, which repeats the thermal denaturation process, primer annealing process, and polymerase extension reaction process in this order to the microbial DNA, the DNA fragments of the microbial DNA to be identified are amplified. Applying an electrophoresis method to a DNA fragment amplified using each of a plurality of primers, obtaining an electrophoretic image corresponding to each primer, and displaying an electrophoretic image corresponding to each primer. Step to convert to data and electrophoretic image corresponding to each primer Simultaneously with the obtaining step, a step of obtaining an electrophoretic image of the DNA size marker, a step of converting the electrophoretic image of the DNA size marker into image data, and a base of the reference primer using a reference primer having a known base sequence A step of obtaining an electrophoretic image corresponding to the reference DNA by applying a polymerase chain reaction to the reference DNA having a base sequence complementary to the sequence, and an electrophoretic image corresponding to the reference DNA as image data A step of converting, a step of correcting the image data corresponding to each primer based on the image data corresponding to the DNA size marker and the image data corresponding to the reference DNA, and corresponding to each primer based on the corrected image data A band of an electrophoretic image to be detected, and each plate based on the image data. A step of obtaining information on the position and intensity of the detected band in the electrophoretic image corresponding to the marker, a step of obtaining a correspondence relationship between the information on the position and intensity of the plurality of primers and the band, and a microorganism to be verified A band in the same position as the band included in the correspondence obtained for the microorganism to be verified among the bands included in the correspondence obtained for the microorganism to be identified is searched by searching a database in which the correspondence is stored in advance. And obtaining a pair of a microorganism band to be identified and a microorganism band to be collated for each band at the same position, and a first coordinate axis X representing the intensity of the microorganism band to be identified; Each XY plane defined by the second coordinate axis Y representing the intensity of the band of the microorganism to be verified Satisfying X ≧ 0, Y ≦ A and Y ≧ X, where A is the maximum intensity of the band of the microorganism to be verified among the bands arranged in the XY plane. A step of obtaining a first region, a step of obtaining a second region further satisfying Y ≧ Th on the first region when Th is a threshold value greater than 0 and smaller than A; Identifying a microorganism to be identified, wherein the identifying step includes a step of extracting a band located on the second region, and a Y coordinate and an X coordinate of the extracted band are a i And b i When the number of extracted bands is n and the identification number i of the extracted band is 1 to n,
[Expression 12]
[0052]
When the identification target is a group of microorganisms composed of a plurality of microorganisms, the band intensity of each microorganism to be identified tends to appear weaker than the band intensity of the microorganism to be verified.
[0053]
In view of this, it becomes an identification target on the XY plane defined by the first coordinate axis X representing the intensity of the band of the microorganism to be identified and the second coordinate axis Y representing the intensity of the band of the microorganism to be verified. A first area where the band intensity of the microorganism is lower than the band intensity of the microorganism to be collated is set, and the microorganism to be identified is identified based on the band located on the first area.
[0054]
Therefore, when a group of microorganisms composed of a plurality of microorganisms is used as an identification target, a plurality of microorganisms constituting the group of microorganisms can be simultaneously and easily identified. For this reason, it becomes possible to clarify the number and type names of the types of microorganisms constituting the microorganism group.
[0055]
Here, in this microorganism identification method, the polymerase chain reaction method is applied to the DNA of the microorganism to be identified at a time using each of a plurality of primers having different base sequences, and the DNA from the microorganism to be identified is DNA. Since DNA analysis is performed by amplifying fragments, a step of isolating and culturing microorganisms as in biochemical tests is not necessary. As a result, identification and identification can be easily performed, and microorganisms that are difficult to isolate can be identified and identified. In addition, since the DNA amplification method using a plurality of primers described above can be performed on an identification target whose base sequence is unknown, the identification of the microorganism to be identified is performed without measuring the base sequence. And identification can be performed.
[0056]
Furthermore, in this microorganism identification method, the polymerase chain reaction method is performed using a plurality of primers, and identification is performed using the results of the plurality of polymerase chain reactions. Therefore, each polymerase chain reaction proceeds well depending on various conditions. Even in the absence, the effect of individual polymerase chain reactions is small. For this reason, it is possible to stably perform good identification.
[0057]
Further, a DNA fragment is reliably amplified from the reference DNA by the polymerase chain reaction method using the reference primer. Based on the image data corresponding to the electrophoretic image of the DNA fragment of the reference DNA thus amplified, the amplification efficiency of the DNA fragment of the reference DNA in the polymerase chain reaction can be determined. The amplification efficiency obtained in this way can also be applied to a DNA fragment of a microorganism to be identified. Therefore, it is possible to correct the image data corresponding to the electrophoretic image of the DNA fragment of the microorganism to be identified based on the obtained amplification efficiency and analyze the amount of the DNA fragment.
Moreover, the 2nd area | region except the area | region where the intensity | strength of a band is low is set among the bands located on a 1st area | region, and the microorganisms used as identification object are identified based on the band located on a 2nd area | region. Thereby, it is possible to identify a microorganism by removing data of a band having low reproducibility among bands obtained from a group of microorganisms to be identified. As a result, it becomes possible to more accurately identify microorganisms.
Furthermore, the area ratio of each band is calculated based on the band on the second region. Since the area ratio becomes higher as the band has a higher intensity, the identification can be performed with emphasis on the data of the band with a higher intensity. As a result, it becomes possible to identify microorganisms more accurately.
Moreover, since the area ratio is calculated based on the band on the second region excluding the data of the band having low reproducibility among the bands arranged on the XY plane, the microorganism can be identified more accurately. Is possible.
[0058]
Furthermore, by correcting the gradation of the image data corresponding to the microorganism to be identified based on the image data corresponding to the electrophoresis image of the DNA size marker, it is possible to accurately compare the emission intensity of the bands in the electrophoresis image. It becomes.
[0060]
5thA microorganism identification apparatus according to the invention is a microorganism identification apparatus for identifying a microorganism to be identified, and using each of a plurality of primers having different base sequences, a thermal denaturation step on the DNA of the microorganism to be identified; By applying the polymerase chain reaction method in which the primer annealing step and the polymerase extension reaction step are repeated in this order at a time, an amplification means for amplifying the DNA fragment of the microorganism to be identified, and a plurality of amplification means Electrophoretic means for obtaining an electrophoretic image corresponding to each primer by applying electrophoresis to DNA fragments amplified using each of the primers, and electrophoresis corresponding to each primer obtained by the electrophoretic means Image data converting means for converting an image into image data, and image data obtained by the image data converting means. Band detection means for detecting the band of the electrophoretic image corresponding to each primer based on the band information detection for obtaining information on the position and intensity of the detected band in the electrophoretic image corresponding to each primer based on the image data Correspondence creation means for creating correspondence relation between the means, information on the position and intensity of the bands detected by the plurality of primers and the band information detection means, and a database in which correspondence relations for microorganisms to be collated are stored in advance And select the band at the same position as the band included in the correspondence obtained for the microorganism to be verified from the bands included in the correspondence created for the microorganism to be identified, and the band at the same position. Each pair of microbial bands to be identified and microbial bands to be verified X-Y defined by the same-position band selection means, the first coordinate axis X representing the intensity of the band of the microorganism to be identified, and the second coordinate axis Y representing the intensity of the band of the microorganism to be verified Band arrangement means for arranging each set of bands on the plane, and A band that is arranged on the XY plane, where A is the maximum intensity of the band of the microorganism to be verified among the bands arranged on the XY plane The first region for obtaining the first region satisfying X ≧ 0, Y ≦ A and Y ≧ (A / B) · X, where B is the maximum intensity of the band of the microorganism to be identified With decision means, Second region determining means for obtaining a second region that further satisfies Y ≧ Th on the first region when Th is set to a threshold value greater than 0 and smaller than A; Identification means for identifying microorganisms, the identification means extracts the band located on the second region, and the Y and X coordinates of the extracted band are a i And b i When the number of extracted bands is n and the identification number i of the extracted band is 1 to n,
[Formula 13]
A microorganism identification method according to a sixth aspect of the present invention is a microorganism identification apparatus for identifying a microorganism to be identified, wherein each of a plurality of primers having different base sequences is used to heat the DNA of the microorganism to be identified. Amplification means for amplifying a DNA fragment of the DNA of the microorganism to be identified by applying the polymerase chain reaction method in which the transformation step, the primer annealing step and the polymerase extension reaction step are repeated in this order at once, and the amplification means Applying electrophoresis to DNA fragments amplified using each of a plurality of primers in order to obtain an electrophoresis image corresponding to each primer, and corresponding to each primer obtained by the electrophoresis means Image data conversion means for converting an electrophoretic image into image data, and an image obtained by the image data conversion means Band detection means for detecting the band of the electrophoretic image corresponding to each primer based on the data, and band information for obtaining information on the position and intensity of the detected band in the electrophoretic image corresponding to each primer based on the image data The position and strength of the band detected by the detection means, the plurality of primers and the band information detection means. Bands included in the correspondence created for the identification target microorganisms by searching a database in which correspondence relations for the microorganisms to be collated are stored in advance, and correspondence creation means for creating correspondence relations with information about the degree Among them, the band at the same position as the band included in the correspondence relationship obtained for the microorganism to be verified is selected, and the band of the microorganism to be identified and the band of the microorganism to be verified are identified for each band at the same position. X-position defined by the same-position band selection means for obtaining a set, a first coordinate axis X representing the intensity of the band of the microorganism to be identified, and a second coordinate axis Y representing the intensity of the band of the microorganism to be verified Band arrangement means for arranging each set of bands on the Y plane, and the maximum intensity of the band of the microorganism to be verified among the bands arranged on the XY plane Where A is A and B is the maximum intensity of the band of the microorganism to be identified among the bands arranged on the XY plane, X ≧ 0, Y ≦ A and Y ≧ (A / B) · X A first region determining means for obtaining a first region that satisfies the above, and a second region that further satisfies Y ≧ Th on the first region when Th is a threshold value greater than 0 and smaller than A. A second region determining unit for obtaining the region of the target region, and an identifying unit for identifying the microorganism to be identified. The identifying unit includes a unit for extracting a band located on the second region; Y coordinate and X coordinate are a i And b i When the number of extracted bands is n and the identification number i of the extracted band is 1 to n,
[Expression 14]
[0061]
When the identification target is a group of microorganisms composed of a plurality of microorganisms, the band intensity of each microorganism to be identified tends to appear weaker than the band intensity of the microorganism to be verified.
[0062]
In view of this, it becomes an identification target on the XY plane defined by the first coordinate axis X representing the intensity of the band of the microorganism to be identified and the second coordinate axis Y representing the intensity of the band of the microorganism to be verified. A first area where the band intensity of the microorganism is lower than the band intensity of the microorganism to be collated is set, and the microorganism to be identified is identified based on the band located on the first area.
[0063]
Therefore, when a group of microorganisms composed of a plurality of microorganisms is used as an identification target, a plurality of microorganisms constituting the group of microorganisms can be simultaneously and easily identified. For this reason, it becomes possible to clarify the number and type names of the types of microorganisms constituting the microorganism group.
[0064]
In this microorganism identification device, the polymerase chain reaction method is applied to the DNA of microorganisms to be identified at a time using each of a plurality of primers having different base sequences to amplify DNA fragments from the microorganisms to be identified. Thus, since the DNA analysis is performed, a step of isolating and culturing the microorganism as in the case of biochemical examination is not necessary. As a result, identification and identification can be easily performed, and microorganisms that are difficult to isolate can be identified and identified. In addition, since the DNA amplification method using a plurality of primers described above can be performed on an identification target whose base sequence is unknown, the identification of the microorganism to be identified is performed without measuring the base sequence. And identification can be performed.
[0065]
Furthermore, in this microorganism identification device, the polymerase chain reaction method is performed using a plurality of primers, and identification is performed using the results of the plurality of polymerase chain reactions. Therefore, each polymerase chain reaction proceeds well depending on various conditions. Even in the absence, the effect of individual polymerase chain reactions is small. For this reason, it is possible to stably perform good identification.
Moreover, the 2nd area | region except the area | region where the intensity | strength of a band is low is set among the bands located on a 1st area | region, and the microorganisms used as identification object are identified based on the band located on a 2nd area | region. Thereby, it is possible to identify a microorganism by removing data of a band having low reproducibility among bands obtained from a group of microorganisms to be identified. As a result, it becomes possible to more accurately identify microorganisms.
Furthermore, the area ratio of each band is calculated based on the band on the second region. Since the area ratio becomes higher as the band has a higher intensity, the identification can be performed with emphasis on the data of the band with a higher intensity. As a result, it becomes possible to identify microorganisms more accurately.
Moreover, since the area ratio is calculated based on the band on the second region excluding the data of the band having low reproducibility among the bands arranged on the XY plane, the microorganism can be identified more accurately. Is possible.
[0067]
7thA computer-readable recording medium according to the invention is a computer-readable microorganism identification program for identifying a microorganism to be identified, and each of a plurality of primers having different base sequences is used to identify the DNA of the microorganism to be identified. On the other hand, by applying the polymerase chain reaction method in which the heat denaturation step, the primer annealing step and the polymerase extension reaction step are repeated in this order at a time, a DNA fragment of the DNA of the microorganism to be identified is amplified. A process of taking an electrophoretic image obtained by applying an electrophoresis method to a DNA fragment amplified using each of the primers of the above as image data, and an electrophoretic image corresponding to each primer based on the image data Each band based on the image data Processing for obtaining information on the position and intensity of the detected band in the electrophoretic image corresponding to, processing for obtaining information on the correspondence between multiple primers and information on the position and intensity of the band, and correspondence on the microorganisms to be verified A database in which the relationship is stored in advance is searched, and a band at the same position as the band included in the correspondence obtained for the microorganism to be verified is selected among the bands included in the correspondence obtained for the microorganism to be identified. A process of selecting and obtaining a pair of a microorganism band to be identified and a microorganism band to be collated for each band at the same position, and collation with the first coordinate axis X representing the intensity of the microorganism band to be identified Each set of bands is arranged on the XY plane defined by the second coordinate axis Y representing the intensity of the band of the target microorganism. And the maximum intensity of the band of the microorganism to be verified among the bands arranged on the XY plane is A, and the band of the microorganism to be identified among the bands arranged on the XY plane When the maximum intensity value is B, a process for obtaining a first region that satisfies X ≧ 0, Y ≦ A and Y ≧ (A / B) · X;A process for obtaining a second area that further satisfies Y ≧ Th on the first area, and a process for identifying a microorganism to be identified, when Th is a threshold value greater than 0 and smaller than A The,The process to be executed and identified by the computer includes a process of extracting a band located on the second area and a Y coordinate and an X coordinate of the extracted band a i And b i When the number of extracted bands is n and the identification number i of the extracted band is 1 to n,
[Expression 15]
A microorganism identification program according to an eighth invention is a computer-readable microorganism identification program for identifying a microorganism to be identified, and using each of a plurality of primers having different base sequences, the DNA of the microorganism to be identified On the other hand, by applying the polymerase chain reaction method in which the thermal denaturation step, the primer annealing step and the polymerase extension reaction step are repeated in this order at a time, the DNA fragments of the DNA of microorganisms to be identified are amplified, A process of taking an electrophoretic image obtained by applying an electrophoresis method to a DNA fragment amplified using each of the primers of the above as image data, and an electrophoretic image corresponding to each primer based on the image data Processing to detect the band of each and corresponding to each primer based on the image data A process for obtaining information on the position and intensity of the detected band in the electrophoretic image, a process for obtaining the correspondence between information on the position and intensity of the plurality of primers and the band, and a correspondence relation for the microorganism to be verified. Search the database stored in advance and select the band at the same position as the band included in the correspondence obtained for the microorganism to be verified among the bands included in the correspondence obtained for the microorganism to be identified. For each band at the same position, a process for obtaining a pair of a microorganism band to be identified and a microorganism band to be verified, and a strength of the microorganism band to be identified A process of arranging each set of bands on the XY plane defined by the first coordinate axis X representing the degree and the second coordinate axis Y representing the intensity of the band of the microorganism to be collated; When the maximum intensity of the band of the microorganisms to be collated among the arranged bands is A and the maximum value of the intensity of the band of the microorganisms to be identified among the bands arranged on the XY plane is B , X ≧ 0, Y ≦ A and Y ≧ (A / B) · X is obtained, and when Th is a threshold value greater than 0 and smaller than A, the first A process for obtaining a second area that further satisfies Y ≧ Th and a process for identifying a microorganism to be identified are executed by the computer, and the identification process is located on the second area. The process of extracting the band, the Y coordinate of the extracted band, and Coordinates each a i And b i When the number of extracted bands is n and the identification number i of the extracted band is 1 to n,
[Expression 16]
[0068]
7th and 8thAccording to the microorganism identification program according to the invention, the firstAnd secondThe microorganism identification method according to the invention can be easily performed.
[0070]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
FIG. 1 is a diagram showing a microorganism identification apparatus according to the present invention.
[0071]
As shown in FIG. 1, the microorganism identification apparatus includes an SSC-PCR amplification /
[0072]
The SSC-PCR amplification /
[0073]
SSC-PCR is Single Strain Counting Polymerase Chain Reaction, which uses a plurality of primers having a specific base sequence to chain-react DNA fragments from a microorganism group having an unknown base sequence or a single microorganism. A reaction that amplifies. Details of SSC-PCR will be described later.
[0074]
FIG. 2 is a flowchart showing an example of a microorganism identification method using the microorganism identification apparatus of FIG.
[0075]
As shown in FIG. 2, first, a microbe analysis experiment is performed by the SSC-PCR method described later using the SSC-PCR amplification /
[0076]
Details of the microbe analysis experiment by the SSC-PCR method are shown in FIG. First, as shown in FIG. 3, microbial DNA, polymerase chain reaction buffer solution, primer, heat-resistant thermophilic DNA polymerase, MgCl 22A predetermined amount of 5 ′ deoxyribonucleotide triphosphates (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) serving as four substrates are mixed to prepare a reaction solution for SSC-PCR (step S1-1).
[0077]
In the case where a group of microorganisms containing a plurality of microorganisms is used as a sample, a reaction solution for SSC-PCR is prepared using a mixture of DNAs of a plurality of microorganisms.
[0078]
Here, the DNA polymerase is an enzyme that catalyzes a polymerization reaction of a DNA chain having a base sequence complementary to a template DNA using four types of 5 'deoxyribonucleotide triphosphates as substrates. The direction of DNA strand polymerization by DNA polymerase is from 5 'to 3'. The primer is a DNA fragment (short oligonucleotide) having a 3'-OH group indispensable for the action of DNA polymerase at the terminal. In the present invention, a primer having a specific base sequence and base length is used.
[0079]
As will be described later, since a plurality of primers having different base sequences are used in the SSC-PCR method, a reaction solution for SSC-PCR is prepared for each primer. For example, since 46 types of primers are used in this case, 46 types of SSC-PCR reaction solutions containing different primers are prepared. All 46 kinds of PCR reaction solutions are prepared simultaneously.
[0080]
Simultaneously with the preparation of the above reaction solution for SSC-PCR, a positive control and a negative control are prepared (step S1-2).
[0081]
Here, the positive control is a sample used for a control experiment for removing an error that occurs in a series of steps of a DNA fragment amplification reaction described later. In general, the amplification efficiency in the amplification reaction of DNA fragments is the error that occurs in a series of steps, for example, the concentration error of DNA polymerase, magnesium, etc. during the preparation of the reaction solution for SSC-PCR, the degree of activity of the reagents used, the DNA fragment It is considered that it is affected by temperature errors during amplification. In order to eliminate such errors, as a positive control, a reaction comprising a primer for amplifying a DNA fragment whose type of DNA fragment to be amplified is known and quantifiable, and a template DNA having a base sequence complementary to this primer Prepare the solution. The DNA fragment amplified in the positive control can be quantified by electrophoresis. Therefore, the amplification efficiency of the DNA fragment can be determined from the amount of the DNA fragment amplified in the positive control. By correcting the amount of DNA fragments in 46 kinds of reaction solutions for SSC-PCR based on the amplification efficiency thus obtained, the influence of errors generated in a series of steps of the amplification reaction of DNA fragments is eliminated. It becomes possible. As a result, quantitative comparison of the amplified DNA fragments becomes possible.
[0082]
On the other hand, the negative control is a sample used for a control experiment for confirming that the amplified DNA fragment belongs to a microorganism group or a microorganism to be analyzed. In general, microorganisms such as bacteria are present in various places such as in the air. For this reason, there is a possibility that microorganisms may be mixed in the reaction solution when preparing the reaction solution for SSC-PCR. When microorganisms are mixed in the reaction solution, it is impossible to determine whether the amplified DNA fragment is a DNA fragment derived from the microorganism group to be analyzed or a DNA fragment derived from the mixed microorganism. Therefore, as a negative control, a reaction solution for SSC-PCR containing a primer but no template DNA is prepared. SSC-PCR and electrophoresis are performed using this negative control, and it is confirmed that no band appears in the electrophoretic image of the negative control. Thereby, it can be confirmed that the amplified DNA fragment is derived from the microbial group or microorganism to be analyzed.
[0083]
The primer used for positive control and negative control may have the same base sequence as one or two of 46 types of primers.
[0084]
After preparing a reaction solution for SSC-PCR as described above, a DNA fragment amplification reaction is performed by the SSC-PCR amplification / analysis apparatus 1 (step S1-3).
[0085]
FIG. 4 is a schematic diagram showing an example of a DNA fragment amplification device of the SSC-PCR amplification /
[0086]
A plurality of
[0087]
With such a DNA fragment amplification apparatus, amplification of DNA fragments by the following SSC-PCR method is simultaneously performed in 46 types of SSC-PCR reaction solutions, positive control and negative control.
[0088]
In the SSC-PCR method, the following three steps are repeated as in the conventional PCR method. However, in the SSC-PCR method, an amount of DNA fragment that can be analyzed is amplified by using a primer having a specific base sequence for a microorganism or group of microorganisms having an unknown base sequence.
[0089]
(1) Thermal denaturation process
The DNA (initial stage) or DNA fragment is denatured by heating to form a single strand (DNA strand).
[0090]
(2) Primer annealing step (primer binding step)
Heat treatment is performed so that the primer binds to the end of the amplified region of the DNA strand.
[0091]
(3) Extension reaction step with polymerase (replication step with polymerase)
A complementary strand is synthesized by a polymerase using a primer as a starting point, and then double-stranded.
[0092]
The above steps (1) to (3) are set as one cycle, and this cycle is repeated. As a first cycle, for example, a heat denaturation step of holding the reaction solution at 94 ° C. for 2 minutes, a primer annealing step of holding the reaction solution at 45 ° C. for 2 minutes, and the reaction solution at 72 ° C. for 3 minutes, for example. The extension reaction step by the polymerase to be held is performed in this order. The heat denaturation step of this cycle is set longer than the heat denaturation step of the following cycle in order to completely separate long complete DNA into single strands.
[0093]
Subsequently, as a second cycle, a heat denaturation step in which the reaction solution is held at 94 ° C. for 1 minute, a primer annealing step in which the reaction solution is held at 45 ° C. for 2 minutes, and the reaction solution, for example, at 72 ° C. for 3 minutes. The extension reaction step with a polymerase held for a minute is repeated, for example, 33 times in this order.
[0094]
Finally, as a third cycle, a heat denaturation step of holding the reaction solution at 94 ° C. for 1 minute, a primer annealing step of holding the reaction solution at 45 ° C. for 2 minutes, and the reaction solution at 72 ° C. for 10 minutes, respectively. The extension reaction step with a polymerase held for a minute is performed in this order. In addition, the extension reaction step by the polymerase in this cycle is set longer than the extension reaction step by the polymerase in the first and second cycles in order to finally complete replication.
[0095]
Here, the first cycle of the first cycle, the first cycle of the second cycle, and the second cycle of the second cycle will be described with reference to FIGS. In addition, the figure has shown typically and the single strand of DNA etc. has shown the base sequence of the part couple | bonded with a primer.
[0096]
5-7, the primer which has the base sequence (sequence number 14) of GGCTTCGAATCG is used. T represents thymine, A represents adenine, G represents guanine, and C represents cytosine.
[0097]
As shown in FIG. 5A, first, long DNA (complete DNA) 11 contained in a plurality of different microorganisms exists in the reaction solution. Here, description will be given focusing on one complete DNA.
[0098]
First, as shown in FIG. 5 (b), in the first cycle, the
[0099]
Next, as shown in FIG. 5 (c), in the primer annealing step, the
[0100]
Subsequently, as shown in FIG. 5 (d), an extension reaction is caused by the polymerase in the extension reaction step by the polymerase, and the
[0101]
In the first cycle of the second cycle, the
[0102]
As shown in FIG. 6, the
[0103]
Thereafter, as shown in FIG. 7, in the second cycle of the second cycle, the double-stranded
[0104]
As shown in FIG. 7, similarly to the
[0105]
In this way, a DNA fragment is formed, a DNA fragment is formed from this DNA fragment and a DNA fragment is also formed from other homologous DNA, and a similar reaction continues in a chain reaction. Amplified.
[0106]
Thereafter, as shown in FIG. 3, using the SSC-PCR reaction solution, positive control and negative control, the DNA fragments amplified in each reaction solution are fractionated by size (base pair number) by electrophoresis. . At this time, DNA size markers whose concentration is known and can be quantified are simultaneously electrophoresed and fractionated for each size (step S1-4).
[0107]
Further, the electrophoretic image obtained by the electrophoresis method is stained with a fluorescent dye (step S1-5), and the fluorescent image when irradiated with ultraviolet rays is photographed (step S1-6). For photographing, for example, a CCD camera is used. In the electrophoresis image thus obtained, DNA fragments appear as bands.
[0108]
Here, when no band appears in the electrophoretic image of the negative control, it can be confirmed that the amplified DNA fragment is derived from the microorganism or group of microorganisms to be analyzed.
[0109]
Subsequently, as shown in FIG. 2, the captured electrophoretic image is captured as image data into the analysis computer 3 (FIG. 1) by the scanner of the electrophoretic image input unit 2 (FIG. 1) (step S2). Based on this, each band of the electrophoretic image is detected (step S3).
[0110]
By the way, when a DNA fragment is amplified by the SSC-PCR method, the amplification efficiency of the DNA fragment is high when the primer is strongly bound to the template DNA having a predetermined base sequence. A DNA fragment amplified by such a primer appears as a clear band with high reproducibility in an electrophoretic image. On the other hand, when the binding between the primer and the compatible position of the template DNA is weak, the primer binds to another position where the binding is stronger than the compatible position of the template DNA. Thus, since the reaction proceeds competitively in the amplification reaction of the DNA fragment, the amplification efficiency of the DNA fragment is lowered when the binding between the primer and the template DNA is weak. A DNA fragment amplified with such a weakly binding primer has low reproducibility in an electrophoretic image and appears as an indistinct band. By including a DNA fragment having low reproducibility as described above, the overall reliability of the data obtained by the SSC-PCR method is lowered.
[0111]
Therefore, in order to improve the reliability of the data obtained by the SSC-PCR method, the image data of the electrophoretic image is corrected as follows using the analysis computer 3 (FIG. 1) (step S4). .
[0112]
FIG. 8 is a flowchart showing an example of the image correction process. As shown in FIG. 8, in the image data, the DNA fragment amplified in the positive control is quantified by comparing the emission intensity of the positive control band and the emission intensity of the DNA size marker band whose amount is known. . Further, the amplification efficiency of the DNA amplification fragment amplification reaction is determined using the determined value. Based on this amplification efficiency, the emission intensity of the 46 kinds of SSC-PCR reaction solutions is corrected (step S4-1). This eliminates the influence of errors such as reaction conditions during the DNA amplification reaction on the amplification efficiency of the DNA fragment.
[0113]
Here, the emission intensity is the peak height in the emission intensity distribution.
[0114]
As a positive control quantification method, other methods such as measuring the amount of UV absorption at 260 nm after DNA fragment purification can also be used.
[0115]
Furthermore, using the luminescence intensity of the quantifiable DNA size marker band as a reference, the luminescence intensity of the 46 kinds of SSC-PCR reaction solution bands is corrected. In this way, tone correction of the electrophoretic image data is performed (step S4-2).
[0116]
In general, an error occurs in the gradation of the obtained electrophoretic image depending on the degree of staining during ethidium bromide staining and the degree of exposure during photography. However, such an error can be eliminated by performing gradation correction of the image data of the electrophoretic image based on the emission intensity of the band of the DNA size marker whose concentration is known.
[0117]
Subsequently, a threshold is set based on the luminescence intensity of the band of the DNA size marker that can be quantified, and the band having the luminescence intensity less than the threshold is deleted (step S4-3). Thereby, a band with low amplification efficiency and low reproducibility can be removed. By analyzing the band having high amplification efficiency and high reproducibility thus obtained, highly reliable data can be obtained.
[0118]
FIG. 9 is a diagram illustrating an example of image data of an electrophoretic image after performing the image correction as described above. In FIG. 9,
[0119]
Subsequently, as shown in FIG. 2, by comparing the position of the band in each primer and the position of the band in the DNA size marker, the position of the band in each primer is converted into a band size (number of base pairs) and measured. . Further, the band intensity (band emission intensity) is measured for the band at each position (step S5). Here, the band intensity is the peak height in the emission intensity distribution of the band.
[0120]
Such measurement of the band position and band intensity is performed by the analysis computer 3 (FIG. 1).
[0121]
Further, using the
[0122]
Usually, in the SSC-PCR method, a plurality of PCR reactions (polymerase chain reaction) are performed using a plurality of different types of primers. For this reason, as a result of SSC-PCR, one electrophoresis image is obtained for each primer. In this case, since 46 types of primers are used, 46 types of electrophoresis images are obtained.
[0123]
For example, when electrophoretic images of eight types of primers are shown in one photo as shown in FIG. 9, 46 types of electrophoretic images of primers are shown in a total of six photos. Therefore, image data is obtained for each photograph.
[0124]
Here, in the
[0125]
In one column of band data created by the
[0126]
[Table 1]
In the primer name item in Table 1, for example, the primer of SEQ ID NO: 1 is described as Pr1.
[0128]
In the above, the case where the position of the band in each primer is displayed with the band size has been described. However, as described in the examples below, the position of the band is not displayed with the band size, but based on the actually measured distance. May be displayed. In this case, for example, a ratio of actually measured distances is described in the item of band position in one column of the band data.
[0129]
In the above description, the peak height of the emission intensity distribution of the band is measured as the band intensity. However, the area (capacity) of the emission intensity distribution of the band may be measured as the band intensity. Since the area of the emission intensity distribution of the band corresponds to the content of DNA contained in the band, it is considered more preferable to use the area of the emission intensity distribution as the band intensity.
[0130]
Furthermore, the order of performing band detection, image correction, and band position / band intensity measurement is not limited to the above, and may be reversed as necessary.
[0131]
Subsequently, as shown in FIG. 2, the analysis computer 3 (FIG. 1) is used to register in the database of the database storage unit 4 (FIG. 1) based on the sample microorganism data (Table 1). The data of a plurality of microorganisms are searched, and the band data of the sample microorganisms are compared with the band data related to the primers Pr1 to 46 of SEQ ID NOS: 1 to 46 of the plurality of microorganisms in the database. Furthermore, a microorganism corresponding to the sample microorganism is searched from the database using any one of
[0132]
Details of the database search (step S7) will be described below in order.
[0133]
First, the band at the same position of the same primer in the sample microorganism and the database microorganism is searched.
[0134]
As shown in FIG. 1, the database in the
[0135]
For example, Table 2 shows one column of the band data of the microorganism A registered in the database. The microorganism A is a bacterium.
[0136]
[Table 2]
A band at the same position in the same primer is searched from one column of band data of a plurality of microorganisms registered in such a database based on one column (Table 1) of the band data of the microorganism of the sample.
[0138]
In this search, if the position of the microbial band in the database is deviated within a certain range from the position of the microbial band of the sample, both are considered to be bands at the same position. The range regarded as the band at the same position is determined based on experimental error and is changed as necessary.
[0139]
For example, as shown in FIG. 10, when the band data (Table 2) of the microorganism A in the database is searched based on the band data (Table 1) of the sample microorganism, the bands indicated by the arrows in the figure are the same. Searched as a band at the same position in the primer.
[0140]
For each of a plurality of microorganisms other than the microorganism A registered in the database, a search is made for the band at the same position in the same primer.
[0141]
Next, the band data of the microorganisms of the sample and the band data of the microorganisms of the database are combined into one, and the position (size) and intensity data of all the bands in each of the primers Pr1 to 46 for the sample microorganism and the microorganisms of the database. Create a column.
[0142]
For example, Table 3 is a table in which one column of band data is created by collecting the data of the microbe of the sample (Table 1) and the data of the microbe A of the database (Table 2).
[0143]
[Table 3]
As shown in Table 3, regarding the band of the same primer in the microorganism of the searched sample and the microorganism A of the database (the band indicated by the arrow in FIG. 10), the sample microorganism is included in the band size item in the table. The band size is described.
[0145]
For a band that exists in the sample microorganism but does not exist in the microorganism A in the database, such as a band of the
[0146]
One column of band data as shown in Table 3 is created for each of a plurality of microorganisms other than the microorganism A registered in the database.
[0147]
(Method 1): Band matching rate calculation method
Based on the band data list created in the above process, the ratio of the number of bands that match the band of microorganism A among the microorganisms of the sample to the total number of bands of microorganism A registered in the database is obtained.
[0148]
(Method 2): Method for calculating correlation coefficient in sample microorganism and database microorganism
Here, based on the column of the band data created above (Table 3), the band intensities of the sample microorganism and the database microorganism in each band are compared, and the correlation between the two is examined.
[0149]
For example, when the band intensity of the sample microorganism and the band intensity of the microorganism A in the database are compared for each band based on the column of band data in the microorganism A of the sample and the microorganism A in the database (Table 3), FIG. Such a correlation is obtained. In FIG. 11, the horizontal axis represents the band intensity of the sample microorganism, and the vertical axis represents the band intensity of the microorganism A in the database. In FIG. 11, the plots for all the bands are not performed. However, the correlation is actually examined by plotting for all the bands.
[0150]
Thus, by comparing the band intensity of the microorganism of the sample with the band intensity of the microorganism A of the database, the correlation coefficient for the microorganism of the sample and the microorganism A of the database is calculated.
[0151]
For each of a plurality of microorganisms other than the microorganism A registered in the database, the same comparison as described above is performed to check the correlation with the microorganism of the sample, and the correlation coefficient is calculated. Note that such calculation of the correlation coefficient is performed using the analysis computer 3 (FIG. 1).
[0152]
Here, as the correlation coefficient calculation method, three methods shown in FIGS. 12A to 12C are raised depending on how to take data used for the calculation. In the following, three methods will be described.
[0153]
(A) Correlation coefficient calculation method using all data of sample microorganisms and database microorganisms
As shown in FIG. 12A, in this method, the correlation coefficient is calculated using all the data of the band intensity of the microorganism of the sample and the band intensity of the microorganism of the database including the data of 0. That is, the correlation coefficient is obtained in consideration of all plots including the plot on the vertical axis and the plot on the horizontal axis in the correlation diagram.
[0154]
Here, when this method is applied when the sample is a mixture of a plurality of microorganisms, the correlation coefficient obtained by calculation is a small value even if there is a correlation between the sample and a predetermined microorganism in the database. Become. Therefore, the method (a) is preferably applied when the sample is a single microorganism.
[0155]
(B) Correlation coefficient calculation method using only data of bands existing in both the sample microorganism and the database microorganism
As shown in FIG. 12B, in this method, the correlation coefficient is calculated by removing all the data of 0 from the band intensity data of the sample microorganism and the band intensity data of the microorganism in the database. That is, the correlation coefficient is calculated in consideration of other plots without considering the plot on the vertical axis and the plot on the horizontal axis in the correlation diagram.
[0156]
As described above in the method (a), when the sample is a mixture of a plurality of microorganisms, a higher correlation coefficient can be obtained by excluding data in which the band intensity of microorganisms in the database is zero. Therefore, it is preferable. In some cases, a band that should appear for some reason does not appear in the PCR reaction. In this case, it is preferable to remove data in which the band intensity of the microorganism of the sample is 0, because a higher correlation coefficient is obtained.
[0157]
(C) Correlation coefficient calculation method using all band data present in the microorganisms in the database
As shown in FIG. 12 (c), this method calculates the correlation coefficient using the microbe data of the sample including the data of 0 and the microbe data of the database not including the data of 0. . That is, the correlation coefficient is calculated in consideration of other plots including the plot on the vertical axis without considering the plot on the horizontal axis in the correlation diagram.
[0158]
For example, when the sample is a mixture of a plurality of microorganisms, the correlation coefficient should be calculated using all the band data of the sample microorganisms including zero data in order to confirm the type of microorganisms constituting the sample. It is. The reason for this is that if only a few of the microbial bands in the database match the microbial bands of the sample, and if they happen to show good correlation, the zero data of the sample is not taken into account. This is because when the correlation coefficient is calculated by the above method (b), a correlation coefficient having a value higher than the actual value is obtained despite the fact that there are several correlated bands. On the other hand, when the method (c) is used in such a case, since the data of the
[0159]
The correlation coefficient calculation formula is shown below.
[0160]
[Expression 17]
In the formula (A1), N is the number of bands to be targeted in each of the methods (a) to (c) among the number of bands having the same band size in the database microorganism and the sample microorganism. aiIs the microbial band intensity of the database, ak is the average of the microbial band intensity of the database, biIs the microbial band intensity of the sample, and bk is the average of the microbial band intensity of the sample (only if it matches the microbial band of the database). i is an identification number of the band, and is an integer from 1 to N.
[0162]
(Method 3): Method for calculating the band matching rate
As described above, the band intensity obtained from the microorganism of the sample including a plurality of types of microorganisms tends to be weaker than the band intensity of the microorganism stored in the database. Therefore, a band matching rate is calculated using a correlation diagram.
[0163]
In addition, the intensity | strength of a band changes with the density | concentration of the pigment | dye which dye | stains an electrophoresis gel for every experiment, and the exposure state of a photograph. Therefore, it is originally necessary to standardize band intensity using a DNA size marker or the like. Here, as a simple method, correction is performed using the maximum value of the band intensity.
[0164]
FIG. 13 is a correlation diagram showing the correlation between the band intensity of the microorganism in the database and the band intensity of the microorganism in the sample. In FIG. 13, the X axis represents the microbial band intensity of the sample, and the Y axis represents the microbial band intensity of the database.
[0165]
A band at the same position as the microbial band of the database is selected from among the microbial bands of the sample, a set of the microbial band of the sample having the same position and the microbial band of the database is obtained, and plotted in the correlation diagram of FIG. .
[0166]
Among the bands (plots) arranged in the correlation diagram, A is the Y coordinate of the plot with the maximum band intensity of the microorganisms in the database. Here, a plot with the maximum band intensity of the microorganism in the database is set as c3. A straight line Y = A passing through the plot c3 and parallel to the X axis is defined as a straight line S.
[0167]
Further, among the bands (plots) arranged in the correlation diagram, the X coordinate of the plot with the maximum band intensity of the microorganism of the sample is defined as B. Here, a plot with the maximum band intensity of the microorganism of the sample is defined as c0. A straight line X = B passing through the plot c0 and parallel to the Y axis is defined as a straight line T.
[0168]
Here, A = 1.0 and B = 1.0. The coordinates of the intersection point P0 between the straight line S and the straight line T are (B, A). Further, a straight line Y = (A / B) · X connecting the origin (0, 0) and the intersection point P0 is defined as a straight line U.
[0169]
Here, an area satisfying X ≧ 0, Y ≦ A and Y ≧ (A / B) · X is defined as V. Here, the number of bands located in area V is m. Also, let P be the number of bands located in a range excluding the Y axis in area V.
[0170]
When the amplification efficiency correction by the positive control and the luminance correction of the electrophoretic image by the DNA size marker are performed, the area V is an area satisfying X ≧ 0, Y ≦ A and Y ≧ X.
[0171]
At this time, the band matching rate C1 is calculated by the following equation (1).
C1 = P / m (1)
For example, in the correlation diagram shown in FIG. 13, the bands (plots) located in the area V are c1 to c6, and m = 6. In the area V, the plots located in the range excluding the Y axis are c1 to c3 and c5, and P = 4. Therefore, the band coincidence ratio C1 is P / m = 4 / 6≈0.67.
[0172]
(Method 4): Calculation method of band coincidence rate when threshold is provided
As described above, when a primer comprising a DNA fragment containing a plurality of types of microorganisms is amplified by the SSC-PCR method, a band with weak binding to the primer has low reproducibility. Therefore, in order to increase the reliability, a threshold value Th is provided, and the band coincidence rate is calculated using a band showing an intensity equal to or higher than the threshold value Th in the area V.
[0173]
The threshold value Th is set to one half of the maximum band intensity A of microorganisms in the database. In the present embodiment, since the maximum band intensity A of microorganisms in the database is 1.0, the threshold value is Th = A / 2 = 1.0 / 2 = 0.5.
[0174]
Here, in the area V, an area that further satisfies Y ≧ Th is I, and an area other than the area I in the area V is II. Further, n is the number of bands located in area I, and Q is the number of bands located in the area I excluding on the Y axis.
[0175]
At this time, the coincidence rate C2 of the band having an intensity equal to or greater than the threshold Th is calculated by the following equation (2).
[0176]
C2 = Q / n (2)
For example, in the correlation diagram shown in FIG. 13, the bands (plots) located in area I are c1 to c4, and n = 4. Also, the plots located in the area I excluding the area on the Y axis are c1 to c3, and Q = 3. Therefore, the coincidence rate C2 of the band having an intensity equal to or greater than the threshold Th is Q / n = 3/4 = 0.75.
[0177]
(Method 5): Method for calculating area ratio
Not only the information that the sample microorganism and the band of the microorganism in the database match, but also the fact that the band intensity of the matching sample microorganism is close to the band intensity of the microorganism in the database is effective information. Therefore, the area of the triangle for each band (plot) located in area I and area II shown in FIG. 13 is obtained, and the area ratio of the bands is calculated by the following method.
[0178]
The triangle for each band (plot) is a triangle whose apex is the plot, a point on the Y axis at the same Y coordinate as the plot, and the origin.
[0179]
Here, the band intensity of the microorganism in the database is ai, The microbial band intensity of the sample biAnd Further, the number of bands located in the area V is m, and the identification number of the band located in the area V is i. i is an integer of 1 to m.
[0180]
At this time, the area ratio R1 is calculated by the following equation (3).
[0181]
[Expression 18]
For example, in plot c1, the band intensity a of the microorganism in the databaseiIs 0.7 and the band intensity b of the sample microorganismiIs 0.4, the area of the triangle with respect to the plot c1 is 0.7 × 0.4 × 1/2 = 0.14. The area is also obtained for the other plots c2 to c6 located in the area V, and the total value of the areas for all the plots c1 to c6 located in the area V is obtained.
[0183]
Further, since the maximum band intensity A of the microorganisms in the database is 1.0 and the maximum band intensity B of the microorganisms in the sample is 1.0, the area of the area V is 1.0 × 1/2 = 0. 5 In the example of FIG. 13, since the number of bands m located in the area V is 6, when the area of the area V is multiplied by the number of bands m, 0.5 × 6 = 3.0.
[0184]
The area ratio R1 can be obtained by dividing the total value of the triangular areas related to all plots c1 to c6 located in the area V by the value obtained by multiplying the area V by the number of bands m.
[0185]
(Method 6): Method for calculating the area ratio when a threshold is provided (part 1)
As shown in FIG. 14, the area ratio only in area I is calculated as shown in FIG. 14 using only data in which the band intensity of microorganisms in the database is equal to or greater than the threshold value Th.
[0186]
Here, the band intensity of the microorganism in the database is ai, The microbial band intensity of the sampleiAnd The number of bands located in area I is n, and the identification number of the band located in area I is i. i is an integer of 1 to n.
[0187]
At this time, the area ratio R2 when the threshold value Th is provided is calculated by the following equation (4).
[0188]
[Equation 19]
For example, in plot c1, the band intensity a of the microorganism in the databaseiIs 0.7 and the band intensity b of the sample microorganismiIs 0.4, the area of the triangle with respect to the plot c1 is 0.7 × 0.4 × 1/2 = 0.14. The area is also obtained for the other plots c2 to c4 located in the area I, and the total value of the areas for all the plots c1 to c4 located in the area I is obtained.
[0190]
Further, since the maximum band intensity A of the microorganisms in the database is 1.0 and the maximum band intensity B of the microorganisms in the sample is 1.0, the area of the area V is 1.0 × 1/2 = 0. 5 In the example of FIG. 14, the number of bands n located in the area I is 4. Therefore, when the area of the area V is multiplied by the number of bands n, 0.5 × 4 = 2.0.
[0191]
The area ratio R2 can be obtained by dividing the total value of the triangular areas related to all plots c1 to c4 located in the area I by the value obtained by multiplying the area V by the number of bands n.
[0192]
(Method 7): Method for calculating the area ratio when a threshold is provided (part 2)
In the method of calculating the area ratio according to the
[0193]
Here, the band intensity of the microorganism in the database is ai, The microbial band intensity of the sampleiAnd The number of bands located in area I is n, and the identification number of the band located in area I is i. i is an integer of 1 to n.
[0194]
At this time, the area ratio R3 is calculated by the following equation (5).
[0195]
[Expression 20]
For example, in plot c1, the band intensity a of the microorganism in the databaseiIs 0.7 and the band intensity b of the sample microorganismiIs 0.4, the area of the triangle with respect to the plot c1 is 0.7 × 0.4 × 1/2 = 0.14. The area is also obtained for the other plots c2 to c4 located in the area I, and the total value of the areas for all the plots c1 to c4 located in the area I is obtained.
[0197]
For the plot c1, the straight line Y = aiThe y coordinate of the intersection of the Y axis and the Y axis is 0.7, and the straight line Y = aiAnd the X coordinate of the intersection of the straight line U and aiB / A = 1.0 × 0.7 / 1.0 = 0.7 Therefore, for plot c1, the straight line Y = bi, The area of the triangle composed of the Y axis and the straight line U is 0.7 × 0.7 × 1/2 = 0.245. For other plots c2 to c4 located in area I, straight line Y = ai, The area of the triangle composed of the Y axis and the straight line U is obtained, and the straight line Y = a for all plots c1 to c4 located in the area Ii, The total area of the triangle composed of the Y axis and the straight line U is obtained.
[0198]
The total area of the triangles for all plots c1 to c4 located in area I is the straight line Y = a for all plots c1 to c4 located in area I.iThe area ratio R3 can be obtained by dividing by the total value of the areas of the triangles composed of the Y axis and the straight line U.
[0199]
After calculating the correlation coefficient, band matching rate and area ratio between the sample microorganism and each of the plurality of microorganisms registered in the database as described above, the correlation coefficient, band matching ratio and area ratio obtained are calculated. Set a threshold for each. Based on this threshold value, those having a calculated value higher than the threshold value are selected as searched microorganisms.
[0200]
The threshold value for the correlation coefficient is a value in the range of 0.2 to 0.6, preferably in the range of 0.25 to 0.35. In addition, the threshold value for the area ratio in Method 6 is in the range of 0.05 to 0.20. Furthermore, the threshold value for the area ratio in
[0201]
The higher the threshold, the higher the search accuracy. On the other hand, if the threshold value is lowered, possible microorganisms can be widely searched from the database.
[0202]
Finally, as shown in FIG. 2, the result display means 5 (FIG. 1) displays the names of microorganisms having values higher than the threshold as search results in descending order of correlation coefficient (step S8).
[0203]
In addition, you may provide the following processes (step S9) as needed.
For example, as shown in FIG. 2, a confirmation step by comparing image data may be provided. In this step, it is confirmed by the following method that the microorganism displayed as the search result is the same as the microorganism of the sample or is one of the microorganisms constituting the sample.
[0204]
For example, the image data of the electrophoresis image of the microorganism of the sample may be read out, and the image data of the electrophoretic image of the searched microorganism may be read out from the
[0205]
Moreover, you may provide the registration process to a database. In this process, when it is determined that the same microorganism does not exist in the database as a result of performing a data search using a single microorganism as a sample, data on the microorganism of this sample is newly stored in the
[0206]
Moreover, you may provide the process of changing a parameter etc. and performing a search again. In this step, for example, the band position range that is regarded as the band at the same position described in the database search (step S7) and the threshold value for the search described in the database search (step S7) are set. Change and search again. Alternatively, the correlation coefficient calculation method described in the database search (step S7) step is changed, and the search is performed again. Thereby, a search suitable for the microorganism of the sample can be performed to obtain the result.
[0207]
Further, there may be provided a step of creating and displaying a column of a mismatch band between the sample microorganism and the searched microorganism. In this step, a column of the microbial band (mismatch band) of the sample that does not match the searched microbial band is created and displayed.
[0208]
Here, when one type of microorganism is searched using a single microorganism in the sample, a mismatch band between the sample microorganism and the searched microorganism is found between the sample microorganism and the searched microorganism. May correspond to polymorphisms (different properties) that allow distinction. On the other hand, when the sample is a mixture of a plurality of microorganisms, the mismatch band between the microorganisms of the sample and the searched microorganisms is highly likely to be a band of microorganisms not registered in the
[0209]
According to the microorganism identification method according to the present invention as described above, it is possible to identify microorganisms when using either a single microorganism or a group of microorganisms composed of a plurality of microorganisms as a sample. Identification can also be performed.
[0210]
In particular, when a microorganism group is used as a sample, a plurality of microorganisms constituting the microorganism group can be simultaneously identified and further identified. For this reason, it becomes possible to clarify the number and type names of the types of microorganisms constituting the microorganism group.
[0211]
On the other hand, when a single microorganism is used as a sample, polymorphisms between the sample microorganism and the database microorganism can be detected. It is also possible to find microorganisms similar to the sample microorganisms.
[0212]
Here, in this microorganism identification method, DNA analysis of a sample microorganism (or a group of microorganisms) is performed by SSC-PCR, so that a step of isolating and culturing microorganisms as in biochemical examination is not necessary. For this reason, it is possible to easily identify and identify, and also to identify and identify microorganisms that are difficult to isolate. In addition, since SSC-PCR can be performed on a sample whose base sequence is unknown, the microorganism of the sample can be identified and identified without measuring the base sequence.
[0213]
Furthermore, in this microorganism identification method, PCR reactions are performed using a plurality of primers, and analysis is performed using the results of the plurality of PCR reactions, so even if individual PCR reactions do not proceed well depending on various conditions. The effect of individual PCR reactions is small. For this reason, it becomes possible to perform a favorable analysis stably.
[0214]
For example, by applying the above-described microorganism identification method to a plurality of microorganisms collected from the treatment tank of the garbage treatment machine or from the soil, the microorganisms in the treatment tank of the garbage treatment machine or in the soil can be identified. . Moreover, by changing the conditions of the treatment tank of the garbage processing machine according to this result, it is possible to treat the garbage well and to produce a good fertilizer.
[0215]
Further, such a microorganism identification method is effective for finding soil, food, etc. contaminated with harmful pollutants such as mercury, arsenic, dioxin, and environmental hormones, and knowing the state of contamination thereof. That is, when a microorganism related to the pollutant is included in the microorganisms searched by this microorganism identification method, it is suggested that the pollutant may be included in the soil from which the microorganism was collected. Also, the state of contamination is suggested by the degree of presence of microorganisms related to the pollutant.
[0216]
FIG. 16 is a block diagram showing the configuration of a personal computer used as the
[0217]
16 includes a CPU (Central Processing Unit) 310, a
[0218]
The
[0219]
The recording
[0220]
The
[0221]
The
[0222]
As the
[0223]
In the present embodiment, the SSC-PCR amplification /
[0224]
The database stored in the
[0225]
【Example】
In the examples, DNA was analyzed by SSC-PCR method for each of 12 types of bacteria isolated from a garbage disposal machine and a model flora mixed with 5 types of 12 types of bacteria. Registered data in the database.
[0226]
Next, DNA analysis was performed again by the SSC-PCR method using the same bacteria and model flora as the 12 types of bacteria and model flora used to create the database as samples. Based on the analysis data of this sample, the type of bacteria in the sample was searched from the database created above, and it was checked whether the bacteria in the sample matched the searched bacteria. Details will be described below.
[0227]
1. Create database
(1) How to operate the garbage processor
Using an SNS-T1 (outside dimension: 580 x 450 x 795 mm) manufactured by Sanyo Electric Co., Ltd., which is a household garbage disposal machine, an air pump and an air amount regulator are connected to the drain outlet attached to this garbage disposal machine Added an improvement. This garbage disposal machine was installed in a laboratory where the temperature change was small.
[0228]
25 kg (moisture content of 70%) of wood chips (cedar wood having an average particle size of 1.5 mm) was placed as a treatment carrier in a treatment tank of a garbage disposal machine. 1 kg of raw garbage consisting of 450 g of vegetables, 300 g of fruits, 40 g of fish, 30 g of meat and 180 g of cooked rice is put into the treatment tank once a day, 5 times a week. The inside of the treatment tank was stirred.
[0229]
A good treatment state was maintained by adjusting the moisture content of the wood chips in the treatment tank to 35 to 45%. The water content was finely adjusted by adjusting the amount of ventilation from the air pump with an air amount adjuster.
[0230]
(2) Isolation of garbage processing bacteria
Five types of agar medium for bacterial culture were prepared. The composition of each agar medium for bacterial culture is shown in Tables 4 to 8 below.
[0231]
[Table 4]
[Table 5]
[Table 6]
[Table 7]
[Table 8]
10 g of the wood chips in the treatment tank on the 490th day after the operation of the garbage processing machine was collected, and 90 mL of sterilized 0.85% saline was added to suspend until the bacteria were sufficiently released from the wood chips. 10 more suspensions-6And 100 μL of the diluted suspension was evenly inoculated on each agar medium. After culturing at 37 ° C. for 3 days, bacteria were isolated by transferring all colonies to a new agar medium.
[0237]
Of the isolated colonies, 12 different types of bacteria were used as samples for SSC-PCR. The isolated bacteria are No. 1028, no. 1030, no. 4004, no. 5063, no. 7004, no. 1001, no. 1041, no. 1048, no. 2001, no. 4008, no. 4014, no. 4020, and bacteria No. 1001, no. 1028, no. 1030, no. 1041 and no. No. 1048 uses a medium having the composition shown in Table 4. 2001 uses a culture medium having the composition shown in Table 5 and bacteria No. 4004, No. 4 4008, no. 4014 and no. No. 4020 uses a medium having the composition shown in Table 6. No. 5063 uses a medium having the composition shown in Table 7. 7004 was isolated using media having the composition shown in Table 8. In addition, no. 1028, no. 1030, no. 4004, No. 4 5063, no. 7004 chromosomal DNAs of 5 kinds of bacteria were mixed at equal concentrations (each 10 pg / μL) to prepare a model flora.
[0238]
Chromosomal DNA of each bacterium was prepared according to the method of “Preparation of Genomic DNA from Bacteria” described in 2.4.1 to 2.4.2 of Current Protocols in Molecular Biology (published by Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience).
[0239]
(3) DNA analysis of 12 types of bacteria and model flora isolated from garbage processing machines
Here, each bacteria was analyzed by the following SSC-PCR method using PE Applied Biosystem's PCR System 9700 and Sanyo Denki's DNA amplifier MIR-D40.
[0240]
In the SSC-PCR method, 46 types of primers (SEQ ID NOs: 1 to 46) shown in Table 9 below were used.
[0241]
[Table 9]
Table 10 shows the composition of the reaction solution used in the SSC-PCR method.
[0243]
[Table 10]
In Table 10, dNTPmix is dATP (2-deoxyadenosine-5-triphosphate), dCTP (2-deoxycytidine-5-triphosphate), dGTP (2-deoxyguanosine-5-triphosphate) , DTTP (2-deoxythymidine-5-triphosphate). The reaction solution volume was 20 μL.
[0245]
Here, 552 (12 × 46) types of reaction solutions for SSC-PCR containing each of the primers of SEQ ID NOs: 1 to 46 as primers were prepared simultaneously for each of the 12 types of bacteria and model flora. In addition, 46 kinds of reaction solutions containing the primer of SEQ ID NO: 14 and a template DNA having a corresponding base sequence as a positive control, and 46 reaction solutions containing the primer of SEQ ID NO: 14 but containing no DNA as a negative control The SSC-PCR reaction solution was prepared at the same time.
[0246]
Next, 552 kinds of SSC-PCR reaction solutions prepared as described above were respectively stored in the
[0247]
The SSC-PCR cycle is shown in Table 11.
[0248]
[Table 11]
Subsequently, 5 μL of the reaction solution after SSC-PCR, positive control, and negative control were analyzed by 1.5% agarose gel electrophoresis. The electrophoresis conditions were a constant voltage of 3.3 V / cm. In this case, in order to measure the position of the band of the amplified DNA fragment, a DNA size marker (Smart Ladder manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) having a known concentration and quantifiable was electrophoresed simultaneously with the reaction solution.
[0250]
After electrophoresis, the gel was stained with ethidium bromide, and an ethidium bromide fluorescence image when irradiated with ultraviolet light having a wavelength of 254 nm was photographed on an instant film, and then taken into a computer with a scanner.
[0251]
The electrophoretic image data captured in the computer was analyzed using software (Genomic Solutions Advanced Quantifier 1-D Match) to determine the band size and band intensity of each primer of the bacteria and model flora.
[0252]
Although not performed in this case, the following image correction process may be further performed. As image correction, it is conceivable to correct the emission intensity of other bands based on the emission intensity of the positive control band. For example, when the measured emission intensity of the positive control band is 70%, the emission intensity of this band is corrected to 100%, and the emission intensity of other bands is also corrected at the same rate. Thereby, it is possible to eliminate the influence of errors such as reaction conditions during the DNA fragment amplification reaction on the amplification efficiency of the DNA fragment.
[0253]
In addition, in the image data of each electrophoretic image, correction is performed so that the emission intensity of the 1000 bp band of the DNA size marker obtained by measurement is 100%, and the emission ratios of other bands are the same ratio. It is also conceivable to make corrections with. By correcting the gradation of the image data in this way, the gradation error in each image data can be removed.
[0254]
Furthermore, the light emission intensity that is half the light emission intensity of the 200 bp band of the DNA size marker obtained by the measurement is set as a threshold value, and the band whose light emission intensity is smaller than the threshold value is deleted from the bands in each primer. It is also possible. In this way, by deleting a band with low emission intensity, a band with low reproducibility in SSC-PCR can be deleted. Thereby, the reproducibility in SSC-PCR is improved, and the reliability of the obtained data can be improved.
[0255]
(4) Band strength and band position measurement
The DNA size marker used above is separated into 14 bands having different band sizes (number of base pairs) by electrophoresis. The sizes of these 14 bands are from the largest to 10,000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 800, 600, 400 and 200 bp. In this case, since electrophoresis is performed using a 1.5% agarose gel, the 10000 bp band and the 8000 bp band are not separated. Therefore, 13 bands appear. The interval between the 13 bands is not uniform, and the larger the band, the smaller the interval between the bands.
[0256]
By the way, as a method of displaying the position of the band in each primer, the position of the band in each primer is changed to the band size (number of base pairs) by comparing the position of the band of the DNA size marker with the position of the band in each primer. There is a way to convert and display. However, this method has the following problems.
[0257]
For example, in the band near 200 bp, the band size is different by 40 bp if the position of the band in the electrophoretic image is different by 1 mm. On the other hand, in the band near 5000 bp, the band size differs by 1000 bp if the position of the band in the electrophoretic image differs by 1 mm. Thus, 1 mm corresponds to 1000 bp near 5000 bp, whereas 1 mm corresponds to 40 bp near 200 bp. Further, the resolution of the image data of the electrophoretic image captured by the scanner is at most sub mm.
[0258]
From the above, when the position of the band in each primer is displayed by band size (number of base pairs), the larger the band size, the larger the error. Therefore, in this case, it is necessary to change the magnitude of the error depending on the band size.
[0259]
From the above, the band position error is more constant when displaying the position of the band obtained for each primer based on the actual measurement value in the migration distance direction rather than displaying the band size. Therefore, it is preferable.
[0260]
In electrophoresis, the migration distance varies depending on the migration time and the temperature at the time of migration. For this reason, in order to display the band position based on the actually measured value in the migration distance direction in electrophoresis, it is necessary to perform normalization. The standardization method is shown below.
[0261]
Here, in order to perform standardization, a new DNA size marker was electrophoresed, and twelve electrophoretic photographs obtained by taking an electrophoretic image of the DNA size marker were separately prepared.
[0262]
First, in each of the twelve electrophoretic photographs (Nos. 1 to 12) of image data, the 1000 bp band of the DNA size marker was used as a reference, and the distance from this band to the other 12 bands was measured. The results are shown in Table 12.
[0263]
[Table 12]
In this case, as described above, since the band of 8000 bp and the band of 10,000 bp are not separated, the band is processed as one band of 8000 to 10000 bp. In this case, the actually measured distance of a 1000 bp band is 0.00, and the actually measured distance of a band smaller than 1000 bp is expressed as a negative value.
[0265]
Next, in each of the image data of 12 photos (No. 1 to 12), the actual distance from the 1000 bp band to the 10,000 bp band is set to 1, and the position of other bands is normalized based on this. It was.
[0266]
For example, no. In the data of one photograph, the actually measured distance from the 1000 bp band to the 10,000 bp band is 1.66 cm. Therefore, the value of the measured distance of other bands was divided by this value 1.66, and the position of each band was normalized. This operation is repeated with other No. 2-No. The data of 12 photographs was also used. The results are shown in Table 13.
[0267]
[Table 13]
Furthermore, as shown in Table 13, the average of the data of 12 electrophoretic photographs (No. 1 to 12) was determined for each size band. As described above, the relative position (ratio) of other bands was determined with reference to the position of the 1000 bp band in the DNA size marker.
[0269]
Furthermore, in order to make the values obtained above easy to see, the position of a 1000 bp band as a reference was set to 1000, and the position of a band of 8000 to 10000 bp whose relative distance from 1000 bp was 1.00 was set to 2000. Hereinafter, based on this, band positions were derived for other bands. In this way, band positions (reference values) were obtained for 13 bands of the DNA size marker. The results are shown in Table 14.
[0270]
[Table 14]
In the above description, the standardization method is described in which the position of the 1000 bp band of the DNA size marker is the reference and the position of the band of 8000-10000 bp is 1. However, the normalization method is other than this. Also good.
[0272]
Next, based on the band position (reference value) of the DNA size marker obtained as described above, the position of the band and the band intensity in each of the 46 kinds of primers were measured for each of the 12 kinds of bacteria. Furthermore, the data obtained by the measurement were collected, and a column of band data was created for each bacterium. In this case, the peak intensity of the light emission distribution of the band was defined as the band intensity.
[0273]
As described above, in this case, the emission intensity of other bands is not corrected based on the emission intensity of the positive control band for each band of the image data of the electrophoretic image. The gradation correction based on the emission intensity of the size marker was not performed, and the band whose emission intensity was smaller than the threshold value was not deleted.
[0274]
The above-mentioned software (Genomic Solutions Advanced Quantifier 1-D Match) was used for the measurement of such band position and band intensity. Further, software created by Microsoft Visual Basic by the present inventor was used in the step of creating a column by summing up the band position and band intensity data of the image data of six electrophoretic photographs.
[0275]
For example, Table 15 to Table 18 show bacteria No. 7004, no. 1028, no. 1030, no. 4004, No. 4 The column of the band data regarding 5063 and the model flora is shown.
[0276]
[Table 15]
[Table 16]
[Table 17]
[Table 18]
In Tables 15 to 18, “5mix” indicates a mixture of five types of bacteria.
The other seven types of bacteria No. 1001, no. 1041, No. 104. 1048, no. 2001, no. 4008, no. 4014, and no. Also for 4020, a column of such band data was created.
[0281]
(5) Bacteria band data registration in the database
No. shown in Tables 15-18 above. 7004, no. 1028, no. 1030, no. 4004, No. 4 A column of 5063 and model flora band data was registered in the database as search data. Similarly, other seven types of bacteria, No. 1001, no. 1041, No. 104. 1048, no. 2001, no. 4008, no. 4014, and no. Also for 4020, one column of band data was registered in the database as search data.
[0282]
2. Data retrieval when a mixture of bacteria is used as a sample
Here, in order to test a search when a mixture of a plurality of bacteria is used as a sample, five types of bacteria (No. 1028, No. 1030, No. 4004, No. 5063) isolated at the time of creating the above database are used. , No. 7004) was prepared. The above-described SSC-PCR was performed using the model flora, DNA was analyzed again, and a search was performed from the database created above based on the obtained sample data.
[0283]
In addition, when performing SSC-PCR using a model microflora, the SSC-PCR reaction solution which contains 10 micrograms / L each of said 5 types of bacterial chromosomal DNA was prepared.
[0284]
Further, the DNA analysis method and the band intensity / band position measurement method in this case are as described above in the process of creating the database. Also in this case, the above-described software (Genomic Solutions Advanced Quantifier 1-D Match) and software created by the present inventors were used.
[0285]
Electrophoresis image obtained from model flora and bacteria No. registered in database. Table 19 and Table 20 show data for each primer of 7004.
[0286]
[Table 19]
[Table 20]
Furthermore, based on Table 19 and Table 20, the size of the band obtained from the model flora and the bacterial NO. The band size was compared with 7004 band size. Tables 21 to 23 show the comparison results of the band sizes.
[0289]
[Table 21]
[Table 22]
[Table 23]
Next, based on Tables 21 to 23, the band intensity of the model flora and the bacteria No. A correlation diagram with the band intensity of 7004 was created. The correlation coefficient, band coincidence rate and area ratio with 7004 were calculated. FIG. 17 shows the band intensity and bacterial no. A correlation diagram with the band intensity of 7004 is shown.
[0293]
The correlation coefficient was calculated using software created by the present inventor with Microsoft Visual Basic. In addition, the parameter in this case is set to ± 43 for the band position error (the band position range regarded as the same position band). Moreover, the calculation method of the correlation coefficient was calculated by the method shown in FIG. The band matching rate was calculated by the band matching rate calculation method shown in
[0294]
[Table 24]
In Table 24, five types of bacteria (No. 1028, No. 1030, No. 4004, No. 5063, and No. 7004) included in the model flora used as samples are shown in the top five rows from the top.
[0296]
In
[0297]
In
[0298]
In contrast, in
In method 6, the threshold value can be set in the range of 0.05 to 0.20, and can be set to 0.10, for example.
Further, in the
[0299]
As described above, when a bacterial group including a plurality of types of bacteria is to be identified, the correlation coefficient, the band coincidence rate, and the area ratio are calculated using the
[0300]
[Sequence Listing]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of a microorganism identification apparatus according to the present invention.
FIG. 2 is a flowchart showing an example of a microorganism identification method according to the present invention.
FIG. 3 is a flowchart showing an example of an SSC-PCR method used in the microorganism identification method of FIG.
4 is a schematic diagram showing an example of a DNA fragment amplification apparatus used in the SSC-PCR method of FIG.
FIG. 5 is a schematic diagram showing a process in the first cycle in the SSC-PCR method.
FIG. 6 is a schematic diagram showing a process in the first cycle of the second cycle in the SSC-PCR method.
FIG. 7 is a schematic diagram showing a process in the second cycle of the second cycle in the SSC-PCR method.
FIG. 8 is a flowchart showing an example of an image processing method used in the microorganism identification method of FIG.
9 is image data of an electrophoretic image processed using the image processing method of FIG.
FIG. 10 is a diagram showing a method of searching for bands at the same position of the same primer in the band data of the microorganism of the sample and the band data of the database.
FIG. 11 is a diagram showing a correlation between the band intensity of a sample microorganism and the band intensity of a database microorganism;
FIG. 12 is a diagram illustrating a correlation coefficient calculation method.
FIG. 13 is a diagram showing a correlation between the band intensity of the model flora and the band intensity of bacteria A.
FIG. 14 is a diagram showing a method of calculating the area ratio between the band intensity of a sample microorganism and the band intensity of a microorganism in a database.
FIG. 15 is a diagram showing a method of calculating the area ratio between the band intensity of a sample microorganism and the band intensity of a microorganism in a database.
16 is a block diagram showing a configuration of a personal computer used as the analysis computer in FIG. 1. FIG.
FIG. 17 shows the band intensity and bacterial No. of the model flora. It is a figure which shows correlation with 7004 band intensity | strength.
[Explanation of symbols]
1 SSC-PCR amplification and analysis equipment
2 Electrophoresis image input part
3 Computer for analysis
4 database storage
5 Result display means
11 DNA
12a, 12b, 12c, 12d, 12e single strand
13a, 13b, 13c, 13d, 13e duplex
21a, 21b, 21c Primer
50 Support plate
51, 51a, 51b hole
Claims (16)
塩基配列の異なる複数のプライマーを準備し、前記複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、前記識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、
前記複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと、
各プライマーに対応する前記電気泳動像を画像データに変換するステップと、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像のバンドを検出するステップと、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像における前記検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるステップと、
前記複数のプライマーと前記バンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求めるステップと、
照合対象となる微生物についての前記対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、前記識別対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドのうち、前記照合対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに前記識別対象となる微生物のバンドと前記照合対象となる微生物のバンドとの組を求めるステップと、
前記識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと前記照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に前記各組のバンドを配置するステップと、
前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとし、前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記識別対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＢとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧（Ａ／Ｂ）・Ｘを満足する第１の領域を求めるステップと、
Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、前記第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求めるステップと、
前記識別対象となる微生物を識別するステップとを備え、
前記識別するステップは、
前記第２の領域上に位置するバンドを抽出するステップと、
前記抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａ i およびｂ i とし、前記抽出されたバンドの数をｎとし、前記抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
前記面積比率Ｒ２に基づいて前記識別対象となる微生物を識別するステップとを含むことを特徴とする微生物識別方法。A microorganism identification method for identifying a microorganism to be identified,
Prepare a plurality of primers with different base sequences, and repeat the thermal transformation process, primer annealing process and polymerase extension process in this order for the DNA of the microorganism to be identified using each of the primers. Amplifying a DNA fragment of the DNA of the microorganism to be identified by applying the polymerase chain reaction method to be performed at once;
Applying an electrophoresis method to a DNA fragment amplified using each of the plurality of primers to obtain an electrophoretic image corresponding to each primer;
Converting the electrophoretic image corresponding to each primer into image data;
Detecting a band of the electrophoretic image corresponding to each primer based on the image data;
Obtaining information on the position and intensity of the detected band in the electrophoretic image corresponding to each primer based on the image data;
Obtaining a correspondence relationship between the plurality of primers and information on the position and intensity of the band;
A database in which the correspondence relationship for the microorganism to be collated is stored in advance is searched, and among the bands included in the correspondence relationship obtained for the microorganism to be identified, the microorganism to be collated is obtained. Selecting a band at the same position as the band included in the correspondence, and obtaining a set of the microorganism band to be identified and the microorganism band to be collated for each band at the same position;
Each set of bands on an XY plane defined by a first coordinate axis X representing the intensity of the band of the microorganism to be identified and a second coordinate axis Y representing the intensity of the band of the microorganism to be verified. A step of placing
Among the bands arranged on the XY plane, A is the maximum value of the intensity of the band of the microorganism to be collated, and among the bands arranged on the XY plane, the band of the microorganism to be identified A step of obtaining a first region satisfying X ≧ 0, Y ≦ A and Y ≧ (A / B) · X, where B is the maximum intensity;
Obtaining a second region that further satisfies Y ≧ Th on the first region when Th is a threshold value greater than 0 and less than A;
Identifying the microorganisms to be identified,
The identifying step comprises:
Extracting a band located on the second region;
When the Y and X coordinates of the extracted band are a i and b i respectively , the number of the extracted bands is n, and the identification number i of the extracted band is 1 to n,
And identifying a microorganism to be identified based on the area ratio R2 .
塩基配列の異なる複数のプライマーを準備し、前記複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、前記識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅する ステップと、
前記複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと、
各プライマーに対応する前記電気泳動像を画像データに変換するステップと、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像のバンドを検出するステップと、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像における前記検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるステップと、
前記複数のプライマーと前記バンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求めるステップと、
照合対象となる微生物についての前記対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、前記識別対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドのうち、前記照合対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに前記識別対象となる微生物のバンドと前記照合対象となる微生物のバンドとの組を求めるステップと、
前記識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと前記照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に前記各組のバンドを配置するステップと、
前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとし、前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記識別対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＢとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧（Ａ／Ｂ）・Ｘを満足する第１の領域を求めるステップと、
Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、前記第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求めるステップと、
前記識別対象となる微生物を識別するステップとを備え、
前記識別するステップは、
前記第２の領域上に位置するバンドを抽出するステップと、
前記抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａ i およびｂ i とし、前記抽出されたバンドの数をｎとし、前記抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
前記面積比率Ｒ３に基づいて前記識別対象となる微生物を識別するステップとを含むことを特徴とする微生物識別方法。 A microorganism identification method for identifying a microorganism to be identified,
Prepare a plurality of primers with different base sequences, and repeat the thermal transformation process, primer annealing process, and polymerase extension reaction process in this order for each of the plurality of primers. Amplifying a DNA fragment of the DNA of the microorganism to be identified by applying the polymerase chain reaction method to be performed at once ;
Applying an electrophoresis method to a DNA fragment amplified using each of the plurality of primers to obtain an electrophoretic image corresponding to each primer;
Converting the electrophoretic image corresponding to each primer into image data;
Detecting a band of the electrophoretic image corresponding to each primer based on the image data;
Obtaining information on the position and intensity of the detected band in the electrophoretic image corresponding to each primer based on the image data;
Obtaining a correspondence relationship between the plurality of primers and information on the position and intensity of the band;
A database in which the correspondence relationship for the microorganisms to be collated is stored in advance is searched for the microorganisms to be collated among the bands included in the correspondence relationship obtained for the microorganisms to be identified. Selecting a band at the same position as the band included in the correspondence, and obtaining a set of the microorganism band to be identified and the microorganism band to be collated for each band at the same position;
Each set of bands on an XY plane defined by a first coordinate axis X representing the intensity of the band of the microorganism to be identified and a second coordinate axis Y representing the intensity of the band of the microorganism to be identified. A step of placing
Among the bands arranged on the XY plane, A is the maximum intensity of the band of the microorganism to be collated, and among the bands arranged on the XY plane, the band of the microorganism to be identified When the maximum intensity value is B, obtaining a first region satisfying X ≧ 0, Y ≦ A and Y ≧ (A / B) · X;
Obtaining a second region that further satisfies Y ≧ Th on the first region when Th is a threshold value greater than 0 and less than A;
Identifying the microorganisms to be identified,
The identifying step comprises:
Extracting a band located on the second region;
When the Y and X coordinates of the extracted band are a i and b i respectively , the number of the extracted bands is n, and the identification number i of the extracted band is 1 to n,
Identifying a microorganism to be identified based on the area ratio R3 .
前記参照用プライマーを用いて増幅された前記参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、前記参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を得るステップと、
前記参照用ＤＮＡに対応する前記電気泳動像を画像データに変換するステップと、
前記参照用ＤＮＡに対応する画像データに基づいて前記識別対象となる微生物に対応する画像データを補正するステップとをさらに備えたことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の微生物識別方法。By applying the polymerase chain reaction method to a reference DNA having a base sequence complementary to the base sequence of the reference primer using a reference primer having a known base sequence, the DNA of the reference DNA Amplifying the fragment;
Applying an electrophoresis method to a DNA fragment of the reference DNA amplified using the reference primer to obtain an electrophoretic image corresponding to the reference DNA;
Converting the electrophoretic image corresponding to the reference DNA into image data;
Microbial identification according to any one of claims 1 to 6, further comprising a step of correcting the image data corresponding to the microorganism to be the identification object based on the image data corresponding to the reference DNA Method.
前記ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を画像データに変換するステップと、
前記ＤＮＡサイズマーカに対応する画像データに基づいて前記識別対象となる微生物に対応する画像データを補正するステップとをさらに備えたことを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の微生物識別方法。Obtaining an electrophoretic image of a DNA size marker simultaneously with obtaining an electrophoretic image corresponding to each primer; and
Converting an electrophoretic image of the DNA size marker into image data;
The microorganism identification according to any one of claims 1 to 7 , further comprising a step of correcting image data corresponding to the identification target microorganism based on image data corresponding to the DNA size marker. Method.
塩基配列の異なる複数のプライマーを準備し、前記複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、前記識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、
前記複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと、
各プライマーに対応する前記電気泳動像を画像データに変換するステップと、
各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと同時に、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を得るステップと、
前記ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を画像データに変換するステップと、
既知の塩基配列を有する参照用プライマーを用いて前記参照用プライマーの塩基配列に相補な塩基配列を有する参照用ＤＮＡに対し、前記ポリメラーゼ連鎖反応を適用することにより、前記参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を得るステップと、
前記参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を画像データに変換するステップと、
前記ＤＮＡサイズマーカに対応する画像データおよび前記参照用ＤＮＡに対応する画像データに基づいて各プライマーに対応する前記画像データを補正するステップと、
前記補正された画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像のバンドを検出するステップと、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像における前記検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるステップと、
前記複数のプライマーと前記バンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求めるステップと、
照合対象となる微生物についての前記対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、前記識別対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドのうち、前記照合対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに前記識別対象となる微生物のバンドと前記照合対象となる微生物のバンドとの組を求めるステップと、
前記識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと前記照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に前記各組のバンドを配置するステップと、
前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧Ｘを満足する第１の領域を求めるステップと、
Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、前記第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求めるステップと、
前記識別対象となる微生物を識別するステップとを備え、
前記識別するステップは、
前記第２の領域上に位置するバンドを抽出するステップと、
前記抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａ i およびｂ i とし、前記抽出されたバンドの数をｎとし、前記抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
前記面積比率Ｒ２に基づいて前記識別対象となる微生物を識別するステップとを含むことを特徴とする微生物識別方法。A microorganism identification method for identifying a microorganism to be identified,
Prepare a plurality of primers with different base sequences, and repeat the thermal transformation process, primer annealing process and polymerase extension process in this order for the DNA of the microorganism to be identified using each of the primers. Amplifying a DNA fragment of the DNA of the microorganism to be identified by applying the polymerase chain reaction method to be performed at once;
Applying an electrophoresis method to a DNA fragment amplified using each of the plurality of primers to obtain an electrophoretic image corresponding to each primer;
Converting the electrophoretic image corresponding to each primer into image data;
Obtaining an electrophoretic image of a DNA size marker simultaneously with obtaining an electrophoretic image corresponding to each primer; and
Converting an electrophoretic image of the DNA size marker into image data;
By applying the polymerase chain reaction to a reference DNA having a base sequence complementary to the base sequence of the reference primer using a reference primer having a known base sequence, the electricity corresponding to the reference DNA is obtained. Obtaining an electrophoretic image;
Converting an electrophoretic image corresponding to the reference DNA into image data;
Correcting the image data corresponding to each primer based on image data corresponding to the DNA size marker and image data corresponding to the reference DNA;
Detecting a band of the electrophoretic image corresponding to each primer based on the corrected image data;
Obtaining information on the position and intensity of the detected band in the electrophoretic image corresponding to each primer based on the image data;
Obtaining a correspondence relationship between the plurality of primers and information on the position and intensity of the band;
A database in which the correspondence relationship for the microorganism to be collated is stored in advance is searched, and among the bands included in the correspondence relationship obtained for the microorganism to be identified, the microorganism to be collated is obtained. Selecting a band at the same position as the band included in the correspondence, and obtaining a set of the microorganism band to be identified and the microorganism band to be collated for each band at the same position;
Each set of bands on an XY plane defined by a first coordinate axis X representing the intensity of the band of the microorganism to be identified and a second coordinate axis Y representing the intensity of the band of the microorganism to be verified. A step of placing
A first region that satisfies X ≧ 0, Y ≦ A, and Y ≧ X, where A is the maximum intensity of the band of the microorganism to be verified among the bands arranged on the XY plane, Seeking steps,
Obtaining a second region that further satisfies Y ≧ Th on the first region when Th is a threshold value greater than 0 and less than A;
Identifying the microorganisms to be identified,
The identifying step comprises:
Extracting a band located on the second region;
When the Y and X coordinates of the extracted band are a i and b i respectively , the number of the extracted bands is n, and the identification number i of the extracted band is 1 to n,
And identifying a microorganism to be identified based on the area ratio R2 .
塩基配列の異なる複数のプライマーを準備し、前記複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、前記識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、
前記複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと、
各プライマーに対応する前記電気泳動像を画像データに変換するステップと、
各プライマーに対応する電気泳動像を得るステップと同時に、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を得るステップと、
前記ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を画像データに変換するステップと、
既知の塩基配列を有する参照用プライマーを用いて前記参照用プライマーの塩基配列に相補な塩基配列を有する参照用ＤＮＡに対し、前記ポリメラーゼ連鎖反応を適用することにより、前記参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を得るステップと、
前記参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を画像データに変換するステップと、
前記ＤＮＡサイズマーカに対応する画像データおよび前記参照用ＤＮＡに対応する画像 データに基づいて各プライマーに対応する前記画像データを補正するステップと、
前記補正された画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像のバンドを検出するステップと、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像における前記検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるステップと、
前記複数のプライマーと前記バンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求めるステップと、
照合対象となる微生物についての前記対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、前記識別対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドのうち、前記照合対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに前記識別対象となる微生物のバンドと前記照合対象となる微生物のバンドとの組を求めるステップと、
前記識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと前記照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に前記各組のバンドを配置するステップと、
前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧Ｘを満足する第１の領域を求めるステップと、
Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、前記第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求めるステップと、
前記識別対象となる微生物を識別するステップとを備え、
前記識別するステップは、
前記第２の領域上に位置するバンドを抽出するステップと、
前記抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａ i およびｂ i とし、前記抽出されたバンドの数をｎとし、前記抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
前記面積比率Ｒ３に基づいて前記識別対象となる微生物を識別するステップとを含むことを特徴とする微生物識別方法。 A microorganism identification method for identifying a microorganism to be identified,
Prepare a plurality of primers with different base sequences, and repeat the thermal transformation process, primer annealing process and polymerase extension process in this order for the DNA of the microorganism to be identified using each of the primers. Amplifying a DNA fragment of the DNA of the microorganism to be identified by applying the polymerase chain reaction method to be performed at once;
Applying an electrophoresis method to a DNA fragment amplified using each of the plurality of primers to obtain an electrophoretic image corresponding to each primer;
Converting the electrophoretic image corresponding to each primer into image data;
Obtaining an electrophoretic image of a DNA size marker simultaneously with obtaining an electrophoretic image corresponding to each primer; and
Converting an electrophoretic image of the DNA size marker into image data;
By applying the polymerase chain reaction to a reference DNA having a base sequence complementary to the base sequence of the reference primer using a reference primer having a known base sequence, the electricity corresponding to the reference DNA is obtained. Obtaining an electrophoretic image;
Converting an electrophoretic image corresponding to the reference DNA into image data;
Correcting the image data corresponding to each primer based on image data corresponding to the DNA size marker and image data corresponding to the reference DNA ;
Detecting a band of the electrophoretic image corresponding to each primer based on the corrected image data;
Obtaining information on the position and intensity of the detected band in the electrophoretic image corresponding to each primer based on the image data;
Obtaining a correspondence relationship between the plurality of primers and information on the position and intensity of the band;
A database in which the correspondence relationship for the microorganisms to be collated is stored in advance is searched for the microorganisms to be collated among the bands included in the correspondence relationship obtained for the microorganisms to be identified. Selecting a band at the same position as the band included in the correspondence, and obtaining a set of the microorganism band to be identified and the microorganism band to be collated for each band at the same position;
Each set of bands on an XY plane defined by a first coordinate axis X representing the intensity of the band of the microorganism to be identified and a second coordinate axis Y representing the intensity of the band of the microorganism to be identified. A step of placing
A first region that satisfies X ≧ 0, Y ≦ A, and Y ≧ X, where A is the maximum intensity of the band of the microorganism to be verified among the bands arranged on the XY plane, Seeking steps,
Obtaining a second region that further satisfies Y ≧ Th on the first region when Th is a threshold value greater than 0 and less than A;
Identifying the microorganisms to be identified,
The identifying step comprises:
Extracting a band located on the second region;
When the Y and X coordinates of the extracted band are a i and b i respectively , the number of the extracted bands is n, and the identification number i of the extracted band is 1 to n,
Identifying a microorganism to be identified based on the area ratio R3 .
塩基配列の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、前記識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅する増幅手段と、
前記増幅手段により前記複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得る電気泳動手段と、
前記電気泳動手段により得られた各プライマーに対応する前記電気泳動像を画像データに変換する画像データ変換手段と、
前記画像データ変換手段により得られた前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像のバンドを検出するバンド検出手段と、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像における前記検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるバンド情報検出手段と、
前記複数のプライマーと前記バンド情報検出手段により検出された前記バンドの位置および強度に関する情報との対応関係を作成する対応関係作成手段と、
照合対象となる微生物についての前記対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、前記識別対象となる微生物について作成された前記対応関係に含まれるバンドのうち、前記照合対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに前記識別対象となる微生物のバンドと前記照合対象となる微生物のバンドとの組を求める同一位置バンド選択手段と、
前記識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと前記照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に前記各組のバンドを配置するバンド配置手段と、
前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとし、前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記識別対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＢとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧（Ａ／Ｂ）・Ｘを満足する第１の領域を求める第１の領域決定手段と、
Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、前記第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求める第２の領域決定手段と、
前記識別対象となる微生物を識別する識別手段とを備え、
前記識別手段は、
前記第２の領域上に位置するバンドを抽出する手段と、
前記抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａ i およびｂ i とし、前記抽出されたバンドの数をｎとし、前記抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
前記面積比率Ｒ２に基づいて前記識別対象となる微生物を識別する手段とを含むことを特徴とする微生物識別装置。A microorganism identification device for identifying a microorganism to be identified,
Using each of a plurality of primers having different base sequences, the polymerase chain reaction method in which the heat denaturation step, primer annealing step, and polymerase extension reaction step are repeated in this order on the DNA of the microorganism to be identified at once. Amplifying means for amplifying a DNA fragment of the DNA of the microorganism to be identified by applying;
An electrophoresis unit that applies an electrophoresis method to a DNA fragment amplified by each of the plurality of primers by the amplification unit, and obtains an electrophoresis image corresponding to each primer;
Image data conversion means for converting the electrophoretic image corresponding to each primer obtained by the electrophoresis means into image data;
Band detecting means for detecting a band of the electrophoretic image corresponding to each primer based on the image data obtained by the image data converting means;
Band information detection means for obtaining information on the position and intensity of the detected band in the electrophoresis image corresponding to each primer based on the image data;
A correspondence creating means for creating a correspondence between the plurality of primers and information on the position and intensity of the band detected by the band information detecting means;
A database in which the correspondence relationship for the microorganism to be collated is stored in advance is searched, and among the bands included in the correspondence relationship created for the microorganism to be identified, the microorganism to be collated is obtained. A same-position band selecting means for selecting a band at the same position as the band included in the correspondence relationship and obtaining a set of the microorganism band to be identified and the microorganism band to be collated for each band at the same position; ,
Each set of bands on an XY plane defined by a first coordinate axis X representing the intensity of the band of the microorganism to be identified and a second coordinate axis Y representing the intensity of the band of the microorganism to be verified. Band arranging means for arranging
Among the bands arranged on the XY plane, A is the maximum value of the intensity of the band of the microorganism to be collated, and among the bands arranged on the XY plane, the band of the microorganism to be identified When the maximum intensity value is B, first area determination means for obtaining a first area that satisfies X ≧ 0, Y ≦ A and Y ≧ (A / B) · X ;
Second region determining means for obtaining a second region that further satisfies Y ≧ Th on the first region when Th is a threshold value greater than 0 and smaller than A;
An identification means for identifying the microorganism to be identified,
The identification means includes
Means for extracting a band located on the second region;
When the Y and X coordinates of the extracted band are a i and b i respectively , the number of the extracted bands is n, and the identification number i of the extracted band is 1 to n,
And a means for identifying a microorganism to be identified based on the area ratio R2 .
塩基配列の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、前記識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅する増幅手段と、
前記増幅手段により前記複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を得る電気泳動手段と、
前記電気泳動手段により得られた各プライマーに対応する前記電気泳動像を画像データに変換する画像データ変換手段と、
前記画像データ変換手段により得られた前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像のバンドを検出するバンド検出手段と、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像における前記検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求めるバンド情報検出手段と、
前記複数のプライマーと前記バンド情報検出手段により検出された前記バンドの位置および強度に関する情報との対応関係を作成する対応関係作成手段と、
照合対象となる微生物についての前記対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、前記識別対象となる微生物について作成された前記対応関係に含まれるバンドのうち、前記照合対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに前記識別対象となる微生物のバンドと前記照 合対象となる微生物のバンドとの組を求める同一位置バンド選択手段と、
前記識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと前記照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に前記各組のバンドを配置するバンド配置手段と、
前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとし、前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記識別対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＢとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧（Ａ／Ｂ）・Ｘを満足する第１の領域を求める第１の領域決定手段と、
Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、前記第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求める第２の領域決定手段と、
前記識別対象となる微生物を識別する識別手段とを備え、
前記識別手段は、
前記第２の領域上に位置するバンドを抽出する手段と、
前記抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａ i およびｂ i とし、前記抽出されたバンドの数をｎとし、前記抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
前記面積比率Ｒ３に基づいて前記識別対象となる微生物を識別する手段とを含むことを特徴とする微生物識別装置。 A microorganism identification device for identifying microorganisms to be identified,
Using each of a plurality of primers having different base sequences, the polymerase chain reaction method in which the heat denaturation step, primer annealing step, and polymerase extension reaction step are repeated in this order on the DNA of the microorganism to be identified at once. Amplifying means for amplifying a DNA fragment of the DNA of the microorganism to be identified by applying;
An electrophoresis means for applying an electrophoresis method to a DNA fragment amplified by each of the plurality of primers by the amplification means, and obtaining an electrophoresis image corresponding to each primer;
Image data conversion means for converting the electrophoretic image corresponding to each primer obtained by the electrophoresis means into image data;
Band detection means for detecting the band of the electrophoretic image corresponding to each primer based on the image data obtained by the image data conversion means;
Band information detection means for obtaining information on the position and intensity of the detected band in the electrophoretic image corresponding to each primer based on the image data;
A correspondence creating means for creating a correspondence between the plurality of primers and information on the position and intensity of the band detected by the band information detecting means;
A database in which the correspondence relationship for the microorganism to be collated is stored in advance is searched, and among the bands included in the correspondence relationship created for the microorganism to be identified, the microorganism to be collated is obtained. the correspondence relation select a band at the same position as the band included in the same position band selection means for finding a set of the microorganism band to be the identification object for each band in the same position the microorganism band and the collation object When,
Each set of bands on an XY plane defined by a first coordinate axis X representing the intensity of the band of the microorganism to be identified and a second coordinate axis Y representing the intensity of the band of the microorganism to be verified. Band arranging means for arranging,
Among the bands arranged on the XY plane, A is the maximum intensity of the band of the microorganism to be collated, and among the bands arranged on the XY plane, the band of the microorganism to be identified When the maximum value of the intensity is B, a first region determining means for obtaining a first region satisfying X ≧ 0, Y ≦ A and Y ≧ (A / B) · X;
Second region determining means for obtaining a second region that further satisfies Y ≧ Th on the first region when Th is a threshold value greater than 0 and smaller than A;
An identification means for identifying the microorganism to be identified,
The identification means includes
Means for extracting a band located on the second region;
When the Y and X coordinates of the extracted band are a i and b i respectively , the number of the extracted bands is n, and the identification number i of the extracted band is 1 to n,
Means for identifying a microorganism to be identified based on the area ratio R3 .
塩基配列の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、前記識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅し、前記複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用することにより得られた電気泳動像を画像データとして取り込む処理と、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像のバンドを検出する処理と、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像における前記検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求める処理と、
前記複数のプライマーと前記バンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求める処理と、
照合対象となる微生物についての前記対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、前記識別対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドのうち、前記照合対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに前記識別対象となる微生物のバンドと前記照合対象となる微生物のバンドとの組を求める処理と、
前記識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと前記照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に前記各組のバンドを配置する処理と、
前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとし、前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記識別対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＢとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧（Ａ／Ｂ）・Ｘを満足する第１の領域を求める処理と、
Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、前記第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求める処理と、
前記識別対象となる微生物を識別する処理とを、
前記コンピュータに実行させ、
前記識別する処理は、
前記第２の領域上に位置するバンドを抽出する処理と、
前記抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａ i およびｂ i とし、前記抽出されたバンドの数をｎとし、前記抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
前記面積比率Ｒ２に基づいて前記識別対象となる微生物を識別する処理とを含むことを特徴とする微生物識別プログラム。A computer-readable microorganism identification program for identifying microorganisms to be identified,
Using each of a plurality of primers having different base sequences, the polymerase chain reaction method in which the heat denaturation step, primer annealing step, and polymerase extension reaction step are repeated in this order on the DNA of the microorganism to be identified at once. Electrophoresis obtained by amplifying a DNA fragment of the DNA of the microorganism to be identified by applying, and applying an electrophoresis method to the DNA fragment amplified using each of the plurality of primers Processing to capture an image as image data;
A process for detecting a band of the electrophoretic image corresponding to each primer based on the image data;
Processing for obtaining information on the position and intensity of the detected band in the electrophoresis image corresponding to each primer based on the image data;
Processing for obtaining a correspondence relationship between the plurality of primers and information on the position and intensity of the band;
A database in which the correspondence relationship for the microorganism to be collated is stored in advance is searched, and among the bands included in the correspondence relationship obtained for the microorganism to be identified, the microorganism to be collated is obtained. A process of selecting a band at the same position as the band included in the correspondence, and obtaining a set of the microorganism band to be identified and the microorganism band to be collated for each band at the same position;
Each set of bands on an XY plane defined by a first coordinate axis X representing the intensity of the band of the microorganism to be identified and a second coordinate axis Y representing the intensity of the band of the microorganism to be verified. The process of placing
Among the bands arranged on the XY plane, A is the maximum value of the intensity of the band of the microorganism to be collated, and among the bands arranged on the XY plane, the band of the microorganism to be identified When the maximum intensity value is B, a process for obtaining a first region that satisfies X ≧ 0, Y ≦ A and Y ≧ (A / B) · X;
A process of obtaining a second region that further satisfies Y ≧ Th on the first region when Th is a threshold value greater than 0 and less than A;
A process of identifying the identification target microorganism ,
Causing the computer to execute,
The identifying process is:
A process of extracting a band located on the second region;
When the Y and X coordinates of the extracted band are a i and b i respectively , the number of the extracted bands is n, and the identification number i of the extracted band is 1 to n,
And a process for identifying a microorganism to be identified based on the area ratio R2 .
塩基配列の異なる複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、前記識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅し、前記複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用することにより得られた電気泳動像を画像データとして取り込む処理と、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像のバンドを検出する処理と、
前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記電気泳動像における前記検出されたバンドの位置および強度に関する情報を求める処理と、
前記複数のプライマーと前記バンドの位置および強度に関する情報との対応関係を求める処理と、
照合対象となる微生物についての前記対応関係が予め記憶されたデータベースを検索し、前記識別対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドのうち、前記照合対象となる微生物について求められた前記対応関係に含まれるバンドと同じ位置のバンドを選択し、同じ位置のバンドごとに前記識別対象となる微生物のバンドと前記照合対象となる微生物のバンドとの組を求める処理と、
前記識別対象となる微生物のバンドの強度を表す第１の座標軸Ｘと前記照合対象となる微生物のバンドの強度を表す第２の座標軸Ｙとにより規定されるＸ−Ｙ平面に前記各組のバンドを配置する処理と、
前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記照合対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＡとし、前記Ｘ−Ｙ平面に配置されたバンドのうち前記識別対象となる微生物のバンドの強度の最大値をＢとした場合、Ｘ≧０、Ｙ≦ＡおよびＹ≧（Ａ／Ｂ）・Ｘを満足する第１の領域を求める処理と、
Ｔｈを０よりも大きくＡよりも小さいしきい値とした場合に、前記第１の領域上でＹ≧Ｔｈをさらに満足する第２の領域を求める処理と、
前記識別対象となる微生物を識別する処理とを、
前記コンピュータに実行させ、
前記識別する処理は、
前記第２の領域上に位置するバンドを抽出する処理と、
前記抽出されたバンドのＹ座標およびＸ座標をそれぞれａ i およびｂ i とし、前記抽出されたバンドの数をｎとし、前記抽出されたバンドの識別番号ｉを１からｎとした場合、
前記面積比率Ｒ３に基づいて前記識別対象となる微生物を識別する処理とを含むことを特徴とする微生物識別プログラム。 A computer-readable microorganism identification program for identifying microorganisms to be identified,
Using each of a plurality of primers having different base sequences, the polymerase chain reaction method in which the heat denaturation step, primer annealing step, and polymerase extension reaction step are repeated in this order on the DNA of the microorganism to be identified at once. Electrophoresis obtained by amplifying a DNA fragment of the DNA of the microorganism to be identified by applying, and applying an electrophoresis method to the DNA fragment amplified using each of the plurality of primers Processing to capture an image as image data;
A process for detecting a band of the electrophoretic image corresponding to each primer based on the image data;
Processing for obtaining information on the position and intensity of the detected band in the electrophoresis image corresponding to each primer based on the image data;
Processing for obtaining a correspondence relationship between the plurality of primers and information on the position and intensity of the band;
A database in which the correspondence relationship for the microorganism to be collated is stored in advance is searched, and among the bands included in the correspondence relationship obtained for the microorganism to be identified, the microorganism to be collated is obtained. A process of selecting a band at the same position as the band included in the correspondence, and obtaining a set of the microorganism band to be identified and the microorganism band to be collated for each band at the same position;
Each set of bands on an XY plane defined by a first coordinate axis X representing the intensity of the band of the microorganism to be identified and a second coordinate axis Y representing the intensity of the band of the microorganism to be verified. The process of placing
Among the bands arranged on the XY plane, A is the maximum value of the intensity of the band of the microorganism to be collated, and among the bands arranged on the XY plane, the band of the microorganism to be identified When the maximum intensity value is B, a process for obtaining a first region that satisfies X ≧ 0, Y ≦ A and Y ≧ (A / B) · X;
A process of obtaining a second region that further satisfies Y ≧ Th on the first region when Th is a threshold value greater than 0 and less than A;
A process of identifying the identification target microorganism ,
Causing the computer to execute,
The identifying process is:
A process of extracting a band located on the second region;
When the Y and X coordinates of the extracted band are a i and b i respectively , the number of the extracted bands is n, and the identification number i of the extracted band is 1 to n,
And a process of identifying a microorganism to be identified based on the area ratio R3 .
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002084562A JP4014430B2 (en) | 2002-03-25 | 2002-03-25 | Microorganism identification method, microorganism identification apparatus, method for creating database for microorganism identification, and microorganism identification program |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002084562A JP4014430B2 (en) | 2002-03-25 | 2002-03-25 | Microorganism identification method, microorganism identification apparatus, method for creating database for microorganism identification, and microorganism identification program |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003274998A JP2003274998A (en) | 2003-09-30 |
| JP4014430B2 true JP4014430B2 (en) | 2007-11-28 |
Family
ID=29207022
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002084562A Expired - Fee Related JP4014430B2 (en) | 2002-03-25 | 2002-03-25 | Microorganism identification method, microorganism identification apparatus, method for creating database for microorganism identification, and microorganism identification program |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4014430B2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3708646A4 (en) * | 2017-11-10 | 2021-07-21 | Yokogawa Electric Corporation | DEVICE, SYSTEM, METHOD AND PROGRAM FOR SELECTION OF MICROBIAL CONTAMINATION countermeasures |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3628232B2 (en) * | 2000-03-31 | 2005-03-09 | 三洋電機株式会社 | Microorganism identification method, microorganism identification device, method for creating a database for microorganism identification, and recording medium on which a microorganism identification program is recorded |
-
2002
- 2002-03-25 JP JP2002084562A patent/JP4014430B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2003274998A (en) | 2003-09-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yi et al. | Unravelling the enigma of the human microbiome: Evolution and selection of sequencing technologies | |
| EP2518162A1 (en) | Multitag sequencing and ecogenomics analysis | |
| CN110257547B (en) | Corn core SNP marker developed based on KASP technology and application thereof | |
| US20180208974A1 (en) | Method for genotyping mycobacterium tuberculosis | |
| CN107760789B (en) | A genotyping detection kit for yak paternity testing and individual identification | |
| CN113881789B (en) | Probe and primer pair composition for detecting cryptococcus and detection method and application | |
| JP2016518822A (en) | Characterization of biological materials using unassembled sequence information, probabilistic methods, and trait-specific database catalogs | |
| Li et al. | Beyond water and soil: air emerges as a major reservoir of human pathogens | |
| Kumar et al. | Amplified fragment length polymorphism: an adept technique for genome mapping, genetic differentiation, and intraspecific variation in protozoan parasites | |
| JP3628232B2 (en) | Microorganism identification method, microorganism identification device, method for creating a database for microorganism identification, and recording medium on which a microorganism identification program is recorded | |
| CN115786541B (en) | SNP molecular marker, primer probe, kit, method and application for identifying Brucella vaccine strain A19 | |
| JPH11341989A (en) | Dna fragment amplification, dna fragment amplifier, microorganism group measurement, microorganism group analysis and pollutant measurement | |
| JP4014430B2 (en) | Microorganism identification method, microorganism identification apparatus, method for creating database for microorganism identification, and microorganism identification program | |
| JP4020640B2 (en) | Microorganism identification method and microorganism identification apparatus | |
| CN116179754B (en) | KASP markers for allelic variation of the wheat low-affinity nitrate transporter gene TaNPF7.6-1A and their application | |
| Schmerer et al. | STR-genotyping of archaeological human bone: Experimental design to improve reproducibility by optimisation of DNA extraction | |
| Seemani et al. | DNA barcoding confirms the presence of invasive Parachanna obscura and rare species in the Mweru-Luapula fishery | |
| Thies | Molecular methods for studying soil ecology | |
| CN1144880C (en) | Biological variety genome DNA fingerprint atlas | |
| CN118147320A (en) | A SNP molecular marker highly correlated with sheep body and its amplification primer and application | |
| CN117965779A (en) | Application of SNP molecular marker for detecting purity of pepper variety, KASP primer combination and application thereof | |
| CN108504771A (en) | A method of exploitation sugarcane SSR marker and identification Sugarcane Breeding affiliation | |
| Blackwood | Analysing microbial community structure by means of terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP). | |
| CN119799919B (en) | A molecular marker for polymorphic SNPs in the Yangtze finless porpoise, its development method and application | |
| JP3947053B2 (en) | Purification method of contaminated soil and determination method thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040802 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070410 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070607 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070828 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070911 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100921 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100921 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110921 Year of fee payment: 4 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |