JP4017966B2 - キャンディダ・ユティリス酵母由来の制御配列 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、キャンディダ・ユティリスに関する再現性のある形質転換系に関し、より具体的には、組換えＤＮＡによる酵母キャンディダ・ユティリスの形質転換、およびその結果得られた新規な形質転換体における異種遺伝子の発現に関する。また、本発明は、形質転換において選択マーカー遺伝子として利用可能な新規ＤＮＡ配列、異種遺伝子の発現のためのプロモーター、およびターミネーターとして利用可能な新規ＤＮＡ配列にも関する。さらに、本発明は、酵母染色体への異種遺伝子の効率的な組み込み法にも関する。
【０００２】
また、さらに本発明はキャンディダ・ユティリスにおいて自律複製機能を有し、形質転換効率を上げる機能を持つＤＮＡ断片、およびそれを利用した、選択マーカー遺伝子を含まないＤＮＡ断片を染色体に組み込む方法、ならびにプロモーター活性を有するＤＮＡ配列の取得法にも関する。
【０００３】
背景技術
遺伝子組換え技術の発展は、微生物を利用して有用な蛋白質を大量に製造することを可能にしてきた。このための宿主として大腸菌や枯草菌などの原核生物の系は簡便であり、特に大腸菌は最も頻繁に利用される宿主である。しかし、大腸菌で生産される蛋白質は不溶性となることが多く、また分泌させても糖鎖付加を受けないなどの制約から、多様なニーズを十分に満足するものではない。また、生産された有用蛋白質を医薬品として用いる場合には、大腸菌の生産する発熱性毒性因子の除去が問題となる。
【０００４】
これら原核生物の系に対して、真核生物である酵母を組換えＤＮＡによる有用蛋白質生産の宿主として使用することは以下の点で魅力的である。まず、酵母のうちサッカロマイセス属酵母は古くから酒類など発酵性食品の生産に利用されてきており、またキャンディダ・ユティリス酵母は食飼料用に生産されていることから、これらの酵母については安全性が高いことが知られている。さらに、酵母は一般に細菌よりも高い細胞密度で培養することができ、かつ連続培養も可能である。また、酵母は蛋白質を培地中に分泌し、分泌された蛋白質は糖鎖による修飾を受ける。このため、酵母による蛋白質の生産は、このような修飾が生物活性に重要である場合に価値がある。
【０００５】
酵母のうち、今日まで最も良く研究されて遺伝学的知見が蓄積している酵母にはサッカロマイセス属酵母があり、この酵母は種々の物質生産の宿主として検討がなされている。また、近年、サッカロマイセス属酵母以外の酵母としてピキア属酵母、ハンセヌラ属酵母、クルイベロマイセス属酵母、キャンディダ属酵母などいくつかの種について、それらを形質転換する手法が開発され、有用物質生産の宿主として検討されている。このうち、キャンディダ属酵母は、特に、炭素資化域が広いなど、サッカロミセス属酵母にない特性を有し実用上有利である。このことから、キャンディダ属酵母は組換えＤＮＡによる有用物質の生産にとってその利用が期待される。
【０００６】
キャンディダ属酵母のなかでもキャンディダ・ユティリス(Candida utilis)は、キシロースを始めとするペントースに対する優れた資化性を示す。また、サッカロマイセス酵母と異なり、好気的条件下での培養でエタノールを生成せず、それによる増殖阻害も受けないことから、高密度での連続培養による効率的な菌体製造が可能である。従って、かつて蛋白質源として注目され、ペントースを多く含む広葉樹の糖化液や亜硫酸パルプ廃液を糖源とした菌体の工業生産が実施されたことがある。また、この酵母はアメリカＦＤＡ（Food and Drug Administration）により、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・フラジリスとともに、食品添加物として安全に使用できる酵母として認められている。実際にキャンディダ・ユティリスは現在でもドイツを始めとしてアメリカや台湾、ブラジルなど世界各国で生産され、食飼料として使用されており、安全性についてはすでに確認されているといえる。
【０００７】
以上のような微生物蛋白質としての利用以外にも、キャンディダ・ユティリスは、ペントースやキシロースの発酵株、エチルアセテート、Ｌ−グルタミン、グルタチオン、インベルターゼ等の生産株として広く産業界で利用されてきた。
【０００８】
しかしながら、今日までこのように有用なキャンディダ・ユティリスの形質転換に成功し、それを証明した報告はない。これは、キャンディダ・ユティリスが２倍体以上の倍数体であり、従来のニトロソグアニジンやエチルメタンスルホン酸などの変異源を用いた突然変異誘起処理によって適当な栄養要求性などの選択符号が付加された変異株の取得が著しく困難であったことによる、と考えられる。このことは、過去においてキャンディダ・ユティリスのＡＤＥ１やＬＥＵ２など、他の酵母で形質転換の選択マーカーとして頻繁に使用される遺伝子が取得されながら（西矢ら、特開平４−６６０８９号公報、小林ら、特公平１−４２６７３号公報）、対応する遺伝子に変異をもつキャンディダ・ユティリス宿主株が得られたという報告が現在までなかったことからも推察することができる。すなわち、キャンディダ・ユティリスには、栄養要求性株を宿主としてその栄養要求性を相補する遺伝子を導入し形質転換体を直接選択するという、従来より各種酵母における形質転換系の開発に用いられてきた手法の適用ができなかったのである。
【０００９】
さらに、キャンディダ・ユティリスは、その倍数性が高く、胞子形成しないため遺伝学的特性が未だ十分に明らかにされていない。そのため、形質転換条件、さらにはベクター系が満たすべき条件も不明であり、その宿主／ベクター系の確立も極めて困難なものであることが予想される。
【００１０】
なお、キャンディダ・ユティリスに関する薬剤耐性マーカーを用いた予備的な形質転換の検討例は、ホーらにより紹介されている(HO, N.W.Y. et. al.Biotechnology and Bioengineering Symp. No.14, 295-301,1984 ) 。しかしながら、この報告においては、形質転換実験の条件、形質転換体であると主張する薬剤耐性株についてその証明に不可欠なサザン解析などのデータが開示されておらず、不十分な報告である。
【００１１】
このことから、依然として、キャンディダ・ユティリスに関する再現性ある形質転換系、さらにそれを利用した有用物質の生産技術の確立が望まれているといえる。
【００１２】
【発明の概要】
本発明者らは、今般、キャンディダ・ユティリス酵母から再現性よく形質転換体を取得することに成功し、形質転換体における異種遺伝子の発現について種々の知見を得た。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【００１３】
従って、本発明は、キャンディダ・ユティリスの再現性のある形質転換系の提供をその目的としている。
【００１４】
また本発明は、キャンディダ・ユティリス形質転換系で利用可能な、選択マーカーとなる遺伝子、プラスミドが染色体への組み込まれる際のターゲット配列となる遺伝子、異種遺伝子の発現に必要なプロモーター、ターミネーターなど新規ＤＮＡ配列の提供をその目的としている。
【００１５】
さらに本発明は、キャンディダ・ユティリスにおける異種遺伝子の発現を可能にするベクター系の提供をその目的としている。
【００１６】
また本発明は、異種遺伝子を染色体に複数コピーでかつ安定に組み込ませることのできる宿主／ベクター系の提供をその目的としている。
【００１７】
さらにまた本発明は、キャンディダ・ユティリスにおける異種遺伝子の発現法の提供をその目的としている。
【００１８】
また、さらに本発明はキャンディダ・ユティリスで自律複製機能を有し、形質転換効率を上げる機能を持つＤＮＡ断片、およびそれを含むプラスミドベクター、その利用による選択マーカー遺伝子を含まないＤＮＡ断片を染色体に組み込む方法、ならびにプロモーター活性を有するＤＮＡ配列の取得法、それにより得られたプロモーター活性を有する新規ＤＮＡ配列の提供をその目的としている。
【００１９】
本発明による新規ＤＮＡ配列群は、キャンディダ・ユティリスのリボソーム構成蛋白質Ｌ４１をコードする遺伝子、ならびにそのプロモーターおよびターミネーター配列；シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子；ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列；グリセロアルデヒド−３−リン酸- デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列；原形質膜プロトンＡＴＰａｓｅ（ＰＭＡ）遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列；ＵＲＡ３遺伝子、ならびにそのプロモーターおよびターミネーター配列；二種類の自律複製能を有するＤＮＡ断片；プロモーター活性を有するＤＮＡ断片の配列；そして、キャンディダ・ユティリスのリボソームＲＮＡをコードするｒＲＮＡ遺伝子である。
【００２０】
本発明によるキャンディダ・ユティリスの形質転換系で利用可能なベクターは、キャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡと相同な配列と、選択マーカー遺伝子とを含んでなり、相同組換えによって異種遺伝子をキャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡに組み込むことができるもの、あるいは、キャンディダ・ユティリスで自律複製機能を有するＤＮＡ配列と、選択マーカー遺伝子とを含んでなり、高い頻度でキャンディダ・ユティリスを形質転換できるもの、である。
【００２１】
また、本発明によるキャンディダ・ユティリスの形質転換系で利用可能なベクターは、選択マーカー遺伝子を含まず、キャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡと相同な配列を含んでなり、相同組換えによって異種遺伝子をキャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡに組み込むことができるもの、である。このプラスミドは、この自律複製機能を有するＤＮＡ配列と、選択マーカー遺伝子とを含んでなるプラスミドと同時に形質転換に用いることができる。
【００２２】
さらにまた、本発明によるキャンディダ・ユティリスの形質転換系で利用可能な選択マーカー遺伝子は、キャンディダ・ユティリスで機能し得る薬剤耐性マーカー、好ましくはシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子、Ｇ４１８耐性を付与する遺伝子、またはハイグロマイシンＢ耐性を付与する遺伝子である。
【００２３】
さらに、本発明によるキャンディダ・ユティリスにおける異種遺伝子の発現法は、異種遺伝子を含む前記本発明によるベクターでキャンディダ・ユティリスを形質転換し、得られた形質転換体を培養し、該培養物から異種遺伝子の発現産物を単離、精製することを含んでなるものである。
【００２４】
そして、本発明によるキャンディダ・ユティリスの形質転換系とは、これらの本発明による新規ＤＮＡ群、ベクター系などの機能的組み合わせによって得られるものである。
【００２５】
【発明の具体的説明】
キャンディダ・ユティリス酵母
本発明による形質転換系が適用されるキャンディダ・ユティリスの具体的菌株としては、例えばＡＴＣＣ９２５６（ＩＦＯ ０６２６）、ＡＴＣＣ９２２６（ＩＦＯ １０８６）、ＡＴＣＣ９９５０（ＩＦＯ ０９８８）、ＩＦＯ ０３９６、ＩＦＯ ０６１９、ＩＦＯ ０６３９、ＫＰ−２０５９Ｐ株などが挙げられる。
【００２６】
なお、キャンディダ・ユティリスは株によってその染色体泳動パターンが異なり、染色体の長さの多型性を示すことが報告されている(Stoltenburg et. al. Curr. Genet. 22 441-446(1992) ）。従って、本発明による形質転換系はその多型性に起因して適用が制限されることが予想された。しかし、後記する実施例において使用した３株についてはそれぞれ染色体多型が認められたものの、いずれについても形質転換体が得られ、また異種遺伝子の発現も確認できた。このことから、本発明による形質転換系がキャンディダ・ユティリス全般について適用可能であることは、当業者にとって容易に推測できるものと考える。
【００２７】
形質転換系
一般に生物の形質転換系を開発するためには、（ａ）形質転換体を選別するための選択マーカー遺伝子および形質転換体の選択方法、（ｂ）プラスミドＤＮＡが宿主細胞内で核外遺伝子として存在するために必要な自律複製能を有するＤＮＡ配列（ＡＲＳ）、またはプラスミドを効率的に染色体に組み込ませるために必要な適当な染色体ＤＮＡ相同配列（すなわち、プラスミドＤＮＡの組み込みターゲットの確立）、さらに、（ｃ）宿主細胞を細胞外ＤＮＡを取り込み可能な状態にする処理方法、の３つの要素が必要となり、これら３つの要素がそろって形質転換体を取得することが可能となる。したがって、遺伝学的な情報がほとんど得られていないキャンディダ・ユティリスの形質転換系の確立にあたっては、これらすべての要素について検討し、開発することが必要不可欠であった。
【００２８】
（ａ）選択マーカー遺伝子および形質転換体の選択
形質転換体を選別するための選択マーカー遺伝子としては、変異処理により栄養要求性となった宿主株が利用できる場合、その栄養要求性を相補する遺伝子を選択マーカー遺伝子として用いることができる。この場合、培地から当該栄養素を除いた最少培地で形質転換体を直接選択することが可能である。しかし、キャンディダ・ユティリスの場合には、前記したように、適当な栄養要求性などの選択符号が付加された変異株の取得が著しく困難であり、栄養要求性の相補遺伝子を選択マーカーとした形質転換システムの開発が不可能であった。
【００２９】
発明者らは、キャンディダ・ユティリスが、抗生物質Ｇ４１８やハイグロマイシンＢ、シクロヘキシミドなどに感受性であり、培地中にそれらの薬剤を添加することによって菌の生育を抑えることが可能であることを見出した。そこで、形質転換体選択マーカー遺伝子として、それらの薬剤に耐性を与える遺伝子を利用することを試みることとした。
【００３０】
ここでＧ４１８耐性遺伝子（アミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ遺伝子）やハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（ハイグロマイシンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝子）などの、他の生物由来の遺伝子を利用する場合、遺伝子の発現を確実にするためにキャンディダ・ユティリスで機能する転写のプロモーターおよびターミネーター配列を利用するのが好ましい。
【００３１】
キャンディダ・アルビカンスなどの一部のキャンディダ属酵母においては、一部コドンの翻訳のされ方が他の生物とは異なっていることも報告されており(Ohama et. al. Nucleic Acids Res. 21 4039 - 4045 1993)、異種遺伝子を選択マーカー遺伝子とする場合には、それが宿主内で機能を持つ蛋白質に翻訳されるという保証はない。一方で、シクロヘキシミドに対する感受性はリボソーム蛋白質であるＬ４１蛋白質の５６番目残基により決定されるという興味深い事実が報告されている（Kawai et. al. J Bacteriol. 174 254-262 (1992) ）。
【００３２】
そこで本発明者らは、シクロヘキシミドに感受性であるキャンディダ・ユティリスのＬ４１蛋白質の遺伝子を取得し、それを部位特異的変異法によりシクロヘキシミド耐性型に変換して選択マーカー遺伝子とし、それを利用した。ここで、この遺伝子は宿主由来であるため、発現のプロモーターおよびターミネーター配列はその遺伝子自身の配列をそのまま用いることとした。よって本態様は、遺伝子の確実な発現が期待できる点で極めて有利である。
【００３３】
従って、本発明によるキャンディダ・ユティリスの形質転換系において用いられる選択マーカーとしての薬剤耐性遺伝子マーカーは、好ましくはシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子である。Ｌ４１遺伝子、ならびにプロモーターおよびターミネーター配列を含んだＤＮＡ断片の塩基配列は図１３（配列番号：５）に示される通りであり、さらにその塩基配列から推定されるアミノ酸配列は図１４（配列番号：６）に示される通りである。また、シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子は、図１３に示される配列の１６４４番目のヌクレオチドＣがＡに変換されたものであり、その結果、図１４に示される配列の５６番目のアミノ酸はＰｒｏがＧｌｎに置換される。
【００３４】
また、本発明による形質転換系における他の好ましい薬剤耐性遺伝子マーカーとして、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与するアミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ（ＡＰＴ）遺伝子もまた使用できる。アミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ遺伝子にはトランスポゾンＴｎ９０３とトランスポゾンＴｎ５由来の２種類が知られており、いずれの遺伝子も本発明において使用可能である。また、抗生物質ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与する大腸菌由来のハイグロマイシンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝子もまた本発明による形質転換系において使用できる。このＧ４１８耐性遺伝子やハイグロマイシンＢ耐性遺伝子など異種遺伝子の場合は、遺伝子発現のためにキャンディダ・ユティリスで機能する転写のプロモーターおよびターミネーター配列をそれぞれ異種遺伝子の５´上流と３´下流とに組み込むのが好ましい。
【００３５】
この転写のプロモーターおよびターミネーター配列としては、キャンディダ・ユティリスの遺伝子由来であるのがより好ましく、例えば、後記するキャンディダ・ユティリスのホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列；グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列；および原形質膜プロトンＡＴＰａｓｅ（ＰＭＡ）遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列などが利用出来る。また、後述するプロモータークローニング用ベクターにより取得されるプロモーター活性を有するＤＮＡ配列なども利用できる。
【００３６】
また、上記系において利用可能な他のプロモーターおよびターミネーター配列の例としては、サッカロマイセス酵母で公知のＡＤＨ、ＥＮＯ、ＧＡＬ、ＳＵＣなどの遺伝子のキャンディダ・ユティリスにおける相同遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列などを挙げることができる。
【００３７】
さらに、形質転換体の選択マーカーとして利用可能な細菌由来の薬剤耐性遺伝子としては、前記したＧ４１８耐性遺伝子およびハイグロマイシンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝子のほかに、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（クロラムフェニコール耐性)(Hadfield, C. et.al. Gene, 45, 149-158(1986))、ブラストサイジンデアミナーゼ（ブラストサイジン耐性）（Izumi, M. et. al. Exp. Cell Res., 197, 229-233 （1991) ）、フレオマイシン耐性遺伝子（Wenzel, T.J.et. al. Yeast, 8, 667-668 (1992) ）などの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。この他に、ディハイドロフォレートレダクターゼ遺伝子（メトトレキセート耐性） （Miyajima, A. et. al. Mol. Cell Biol. 4, 407-414 (1984)）や、酵母由来の優性遺伝子スルホメツロンメチル耐性遺伝子（Casey, G.P. et. al. J. Inst. Brew. 94, 93-97 (1988)）、CUP1遺伝子（銅耐性）(Henderson，R.C.A. et. al. Current Genet. 9, 133-138 (1985)）、CYH2遺伝子（シクロヘキシミド耐性）（Delgado, M. et．al. EBC congress, 23, 281-288 (1991)）など、公知の薬剤耐性遺伝子も利用できる。このうちマーカー遺伝子が細菌やトランスポゾンの遺伝子など異種生物由来である場合には、上記したようなキャンディダ・ユティリス内で機能するプロモーター、およびターミネーター配列を利用するのが好ましい。
【００３８】
（ｂ）プラスミドＤＮＡの組み込みターゲットの確立
シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子をはじめとする利用可能な選択マーカーが前記のように本発明によって確立されたことから、これらの配列に限らずキャンディダ・ユティリス染色体由来の種々の配列がターゲット配列としての利用可能であることが期待される。
【００３９】
本発明の好ましい態様によれば、プラスミドを染色体に組み込ませるために必要な適当な染色体ＤＮＡ断片として、リボソームＲＮＡをコードする遺伝子であるｒＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）、ＵＲＡ３遺伝子、Ｌ４１遺伝子、およびＰＧＫ遺伝子を好ましく使用することができることが見出された。
【００４０】
ｒＲＮＡ遺伝子については、サッカロマイセス・セレビシエにおいてｒＤＮＡが染色体上にタンデムに１００コピー以上存在し、その反復単位のなかに自律複製配列（ＡＲＳ）が存在することが報告されている（Saffer &Miller, JR. Molec. Cell. Biol. 6, 1148-1157, (1986) ）。また、このｒＤＮＡ領域をプラスミド組み込みの ターゲットとすることにより、組み込みの形質転換頻度を高くできることが報告されている（Lopes, et. al. Gene 79, 199-206 (1989) ）。
【００４１】
本発明者らは、キャンディダ・ユティリスにおいてもｒＤＮＡが染色体上に反復して存在することを見出した。これにより、サッカロマイセス・セレビシエ同様、キャンディダ・ユティリスのｒＤＮＡ配列は、高頻度組み込みのためのターゲット配列としての利用が可能であることが示唆され、事実、キャンディダ・ユティリスの形質転換系において組換えターゲットとして有利に利用することができた。
【００４２】
興味あることに、ｒＲＮＡ遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、Ｌ４１遺伝子、およびＰＧＫ遺伝子などのキャンディダ・ユティリス染色体をターゲットとし、後記する本発明によるベクター系を用いて、キャンディダ・ユディリス酵母を形質転換すると、ＤＮＡ断片が染色体上に組み込まれ、酵母に安定に保持されることが観察された。従って、このターゲットとベクター系との組み合わせにより、異種遺伝子が自律複製を続ける染色体外プラスミドとして保持される場合の外来遺伝子の不安定性の問題を排除することができる。
【００４３】
本発明において、形質転換体により組み込まれたＤＮＡ断片の存在様態を詳しく解析した結果、ＤＮＡ断片のキャンディダ・ユティリス染色体への組み込みは主に相同組換えによって起きることが明らかとなった。これは、宿主染色体ターゲット配列に対するホモロジーを有するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子であれば、それを任意の染色体ターゲットに組み込むことが可能であることを意味する。
【００４４】
具体的には、ターゲット配列に対するホモロジーを有するＤＮＡ配列を、その相同ＤＮＡ配列内の適当な制限酵素サイトで分解して直鎖状としたプラスミドＤＮＡをベクターとして使用し、あるＤＮＡ断片をキャンディダ・ユティリス染色体のターゲット配列上に組み込むことができる。この場合、選択マーカーをシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子にすることにより、後述するように複数のプラスミド分子が同時に組み込まれた形質転換体が効率的に選択される。
【００４５】
また、染色体ターゲット配列に対するホモロジーを有するＤＮＡ配列の内部に選択マーカー遺伝子を含んだ形態の線状ＤＮＡ断片を用いることも可能である。
【００４６】
本発明による本態様の形質転換において、プラスミドは、染色体上の相同な遺伝子と置き換わる形で挿入される。このため、挿入されたＤＮＡ断片の前後には、ターゲット配列の反復配列が形成されず、よって、組み込まれたＤＮＡのより高い安定性が期待される。
【００４７】
ここで、ＵＲＡ３遺伝子、Ｌ４１遺伝子、ＰＧＫ遺伝子などは、他の多くの遺伝子と同様に１細胞あたり２コピーしか存在しない遺伝子であるが、ＤＮＡ断片組み込みのターゲットとして用いることが可能であることが本発明によって示された。また、一般に酵母のｒＲＮＡ遺伝子は１８Ｓ、５．８Ｓ、２５Ｓ、５Ｓの各ｒＲＮＡ遺伝子を含む反復ＤＮＡ単位が１倍体あたり１００コピー以上存在する（Schweizer, E. et. al. J. Mol. Biol. 40, 261-277 (1969)）。そこで、このｒＤＮＡを組換えのターゲット配列としての利用には、他の遺伝子配列を利用した場合と比較して、（１）形質転換頻度が上昇することが期待される、（２）組み込みによるターゲット配列の変化は無視できる、などの利点がある。発明者らは、キャンディダユティリスにおいてもｒＲＮＡ遺伝子が、約１３．５ｋｂのＤＮＡ配列を反復単位としてタンデムに反復して存在していること、を明らかにするとともに（詳細後記）、ｒＤＮＡ配列を組換えのターゲット配列とすることで、細胞あたり２コピー存在するＬ４１遺伝子をターゲットとするよりも形質転換頻度が１０倍から５０倍程度高くなることを明らかにした。また、ｒＤＮＡ座に組み込まれたＤＮＡ断片の安定性も高く、ｒＤＮＡ配列は優れた組み込みターゲットであることが明らかとなった。
【００４８】
本発明においてＤＮＡ断片組み込みのターゲット配列としてｒＤＮＡ配列を用いたことは、このように形質転換頻度を高める効果をもたらし、酵母の処理条件を検討してそのなかから適切な形質転換条件を発見するうえで重要な役割を果たした。しかし、興味あることに、ｒＤＮＡの領域によっては形質転換のターゲットとして用いた場合に形質転換頻度が著しく低くなることが明らかにされ、ｒＤＮＡ断片であればどこでも効率的なプラスミドの組み込みターゲットとして利用できるものではないことが示唆された。
【００４９】
さらに本発明の好ましい態様によれば、シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子を選択マーカーとすることにより、プラスミドが複数個組み込まれた形質転換体を効率的に取得できる。この理由は次のように考えられる。すなわち、シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子を含むＤＮＡ断片が複数コピー組み込まれた場合にのみ、内在性のシクロヘキシミド感受性型Ｌ４１蛋白質が耐性型のものに置き換えられ、シクロヘキシミドによる機能阻害を受けないリボソーム分子の割合が増える。これによって、形質転換体がシクロヘキシミドを含む培地で生育できることとなると考えられる。この場合の組み込みのターゲット部位としてはＵＲＡ３遺伝子座、Ｌ４１遺伝子座などのキャンディダ・ユティリス染色体由来のＤＮＡ配列であれば基本的にいずれの配列も利用できる。また、興味深いことに、このうち特にｒＲＮＡ遺伝子座をその組み込みのターゲット配列とすることによって、他遺伝子座をターゲット配列とした場合に比較してＤＮＡ断片がより多く組み込まれる傾向があることが示された。
【００５０】
（ｃ）形質転換方法
形質転換方法、すなわち宿主細胞を細胞外ＤＮＡを取り込み可能な状態にする処理方法としては、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、電気パルス法、およびそれらの改変法などの、サッカロマイセス・セレビシエの形質転換に従来用いられている方法の利用が考えられる。このうちプロトプラスト法は広く使用されている形質転換法であるが、操作がやや煩雑であり、薬剤耐性で形質転換体を選択する際には、非形質転換体であるバックグランドコロニーの出現がしばしば問題となる。
【００５１】
そこで本発明者らは、酢酸リチウム法ならびに電気パルス法を用いて、先に述べたシクロヘキシミド耐性Ｌ４１遺伝子とｒＤＮＡ断片を組み合わせたプラスミドによって、キャンディダ・ユティリスの形質転換を試み、再現性良く形質転換体を得ることのできる条件を見出した。
【００５２】
キャンディダ・ユティリスの形質転換は、電気パルス法によるのが好ましい。菌体を対数増殖期にまで増殖させた後、洗浄して１Ｍソルビトールに懸濁する。電気パルスの条件は、タイムコンスタント値（電圧が最大値の約３７％にまで減衰するまでの時間）が約１０から２０ミリ秒であり、パルス後の生菌率が約１０−４０％となる条件であれば良い。例えば、本発明の好ましい態様によれば、電気容量が２５μＦ、抵抗値が６００〜１０００オーム、電圧が３．７５〜５ＫＶ／ｃｍの条件で、上記のタイムコンスタント値と生菌率が得られ、１μｇＤＮＡあたり約５００〜１４００個の形質転換体が得られることが示された。
【００５３】
また、電気パルスを加えた後、菌液に１Ｍソルビトールを含むＹＰＤ培地を加え３０℃で振盪培養することが好ましく、培養せずに菌を直接シクロヘキシミドを含む選択プレートに塗布するとコロニーが得られない場合があることが見出だされた。また、培養時間は４〜６時間程度が適当であり、その後は形質転換体の増殖が無視できなくなる。このほか、ＤＮＡと菌体を接触する際にサーモンスパームＤＮＡなどのキャリアＤＮＡを添加することやポリエチレングリコールを添加することなどによって形質転換頻度を高めることも本発明による形質転換系にあっても好ましい。
【００５４】
また、酢酸リチウム法(Ito et al. J. Bacteriol. 153, 163-168 1983)はその簡便さから広くサッカロミセス属酵母の形質転換に用いられており、さまざまな改良法が報告されている。これらの方法を用いてもキャンディダ・ユティリスの形質転換が可能であることが確認された。特に、エタノールを添加するリチウム法変法(Soni et. al. Current Genet. 1993 24, 455-459)によってキャンディダ・ユティリスの形質転換が好ましく可能である。また、集菌時の菌体密度、リチウムの濃度、ポリエチレングリコールの種類と濃度、キャリアＤＮＡの種類、形態、量など異なる条件を試みることにより、酢酸リチウム法によるキャンディダユティリスの形質転換の至適条件を決定して、形質転換頻度を高めることが可能である。上記した本発明による（ａ）選択マーカー遺伝子および（ｂ）組み込みターゲットが確定されたことから、これらは当業者にとり容易であると考える。
【００５５】
なお、形質転換条件を見出す過程で、サッカロマイセス・セレビシエで機能するキャンディダ・ユティリス由来ＡＲＳ配列８種類と、同じくサッカロマイセス・セレビシエで機能するＧ４１８耐性遺伝子発現ユニットとを組み合わせたプラスミドを用いて形質転換を試みたが、形質転換体は取得できなかった。この結果はホーらによるキャンディダユティリスの形質転換の報告(HO, N.W.Y．et. al. 前掲）の再現性を疑わせるものであるといえる。
【００５６】
発現ベクター系および異種遺伝子の発現
本発明によれば、キャンディダ・ユティリスの形質転換に使用される発現ベクター系が提供される。
【００５７】
本発明によるベクターの一つの態様は、キャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡと相同な配列（以下、「相同ＤＮＡ配列」ということがある）を含み、この部分において相同組換えを起こすことにより、プラスミドＤＮＡを染色体に組み込むことを可能にし、かつ形質転換体の選別を可能とする選択マーカー遺伝子を含んでなる、プラスミドＤＮＡである。
【００５８】
ここで、相同ＤＮＡ配列とは好ましくはｒＲＮＡ遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、Ｌ４１遺伝子、ＰＧＫ遺伝子、ＧＡＰ遺伝子、ＰＭＡ遺伝子などが挙げられ、それらはキャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡ由来のものであることが好ましい。用いる配列に依存して染色体上の任意の位置に異種遺伝子を組み込むことが可能である。このプラスミドは、プラスミド分子内の相同ＤＮＡ配列内の適当な制限酵素サイトでの分解によりプラスミドＤＮＡを直鎖状として使用される。その結果、プラスミドＤＮＡ断片はキャンディダ・ユディリス染色体に相同組換えにより組み込まれる。
【００５９】
さらに本発明の好ましい態様によれば、このプラスミドＤＮＡ中で、マーカー遺伝子および異種遺伝子を含むＤＮＡ配列は、その両端において前記相同ＤＮＡ配列に挟まれてなる。この態様では、このプラスミドＤＮＡを相同ＤＮＡ配列において制限酵素切断し、相同ＤＮＡ配列をその両端に有するマーカー遺伝子および異種遺伝子を含むＤＮＡ断片を得る。こうして得たＤＮＡ断片も、また、相同組換えによりキャンディダ・ユディリス染色体ＤＮＡに相同組換えにより組み込まれ得るものである。
【００６０】
なお、本明細書において、「ＤＮＡ断片（または配列）が、キャンディダ・ユディリス染色体に相同組換えにより組み込まれる」とは、ＤＮＡ断片がキャンディダ・ユディリス染色体に組み込まれる限りにおいて、その組み込みの態様は限定されないが、少なくとも次の二つの態様を含む意味に用いることとする。すなわち、（１）キャンディダ・ユディリス染色体のＤＮＡ配列と、ＤＮＡ断片の両端にある相同ＤＮＡ配列部分とが相同組換えを生じ、開裂部分にＤＮＡ断片が”挿入”されて染色体ＤＮＡに組み込まれる態様、および（２）キャンディダ・ユディリス染色体のＤＮＡ配列と、ＤＮＡ断片の両端にある相同ＤＮＡ配列との相同組換えによって、プラスミドＤＮＡ断片がキャンディダ・ユディリス染色体の一部と”置換”されて染色体ＤＮＡに組み込まれる態様のいずれも少なくとも意味するものとする。（２）の態様においては、挿入されたＤＮＡ断片の前後に、ターゲット配列の反復配列が形成されないため、組み込まれたＤＮＡ断片が安定に染色体に存在することが期待される。
【００６１】
また、選択マーカー遺伝子としては前記した薬剤耐性マーカーを利用するのが好ましく、より好ましい薬剤耐性マーカーとしては、シクロヘキシミド耐性を付与する遺伝子、例えばシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子；抗生物質Ｇ４１８耐性を付与する遺伝子、例えばバクテリアトランスポゾンＴｎ９０３由来のＡＰＴ遺伝子；抗生物質ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子などが挙げられる。これら選択マーカー遺伝子が微生物由来である場合は、それらの発現を確かなものとするためにキャンディダ・ユティリスで機能するプロモーターに連結することが好ましい。
【００６２】
また、本発明のもう一つの態様によるベクターは、キャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡと相同な配列（相同ＤＮＡ配列）を含み、この部分において相同組換えを起こすことにより、プラスミドＤＮＡを染色体に組み込むことを可能とするものであり、一方で形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子を持たないプラスミドＤＮＡである。このプラスミドは、プラスミド分子中の相同ＤＮＡ配列内の適当な制限酵素サイトでの分解により直鎖状とし使用される。
【００６３】
また、この態様のプラスミドにおいても、このプラスミドＤＮＡは、異種遺伝子を含むＤＮＡ配列が、その両端において前記相同ＤＮＡ配列に挟まれてなるよう構成されてよい。そして、このプラスミドＤＮＡを相同ＤＮＡ配列において制限酵素切断することによって、相同ＤＮＡ配列をその両端に有するＤＮＡ断片が得られる。こうして得られたＤＮＡ断片も相同組換えによりキャンディダ・ユディリス染色体ＤＮＡに相同組換えにより組み込まれうるものである。
【００６４】
これら直鎖状とされたＤＮＡ断片は、上記した選択マーカー遺伝子を含んでなるプラスミドＤＮＡの場合と同様に、キャンディダ・ユディリス染色体に相同組換えにより組み込まれる。本態様のプラスミドにおいても、上記（２）の態様による組み込みにすることで、組み込まれたＤＮＡ断片が安定に染色体に存在することが期待される。
【００６５】
ここで、相同ＤＮＡ配列とは好ましくはｒＲＮＡ遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、Ｌ４１遺伝子、ＰＧＫ遺伝子、ＧＡＰ遺伝子、ＰＭＡ遺伝子などが挙げられる。それらはキャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡ由来のものであることが好ましい。また、用いる配列に依存して染色体上の任意の位置に外来ＤＮＡ断片を組み込むことが可能である。
【００６６】
このベクターは、後述する自律複製配列を含むＤＮＡ配列と選択マーカー遺伝子とを持つプラスミドと同時に形質転換に用いられる。すなわち、自律複製能を有するプラスミドが導入されたことにより選択される形質転換体のなかから、さらに選択マーカー遺伝子を持たないＤＮＡ断片が染色体上に組み込まれた株を二次的に選択することが可能である。選択された株に存在するプラスミドは、その後非選択条件下で菌を培養することによって脱落させることが可能であり、結果として、挿入ＤＮＡ断片だけを染色体上に保持する株を取得することができる。この手法を用いることにより、例えば異種遺伝子のみを保持し、微生物由来の薬剤耐性遺伝子のように余分な配列を含まない株を育種することが可能になる。
【００６７】
またさらに、この自律複製配列を含むＤＮＡ配列と選択マーカー遺伝子とを持つプラスミド自体も、キャンディダ・ユティリス酵母形質転換用のベクターとして利用可能である。このプラスミドは非選択条件下で菌を培養することによって脱落しやすい特徴をもつが、安定性を高めるＤＮＡ断片が後述するように取得でき、このＤＮＡ断片と組み合わせてベクターとして利用することが可能である。
【００６８】
これら本発明によるベクターに異種遺伝子を連結して、異種遺伝子を保持したベクターとすることができる。このベクターによってキャンディダ・ユティリスを形質転換すると、それらの異種遺伝子をキャンディダ・ユティリス染色体に安定に組み込むことが可能である。こうして得られた形質転換体を適当な培地中で培養し、該培養物から異種遺伝子の発現産物を、その発現産物に適した方法で単離、精製することによって、異種遺伝子をキャンディダ・ユティリスで発現させることができる。すなわち、キャンディダ・ユティリスにおける異種遺伝子の発現法が提供される。ここで、異種遺伝子とは通常は宿主のキャンディダユティリス染色体上に本来存在しない遺伝子またはその一部のＤＮＡを意味するものとする。
【００６９】
異種遺伝子は、好ましくは、その異種遺伝子の発現を独立して制御する調節領域と組み合わせるか、または、形質転換の過程で破壊された遺伝子自身の調節領域の影響下にその異種遺伝子を発現させる。そのような配列はキャンディダ・ユティリスで機能する必要があり、その好ましい具体例としては後記する本発明によるＰＧＫ遺伝子、ＧＡＰ遺伝子、およびＰＭＡ遺伝子のプロモーター配列およびターミネーター配列、さらには後述するプロモータークローニング用ベクターにより取得されるプロモーター活性を有するＤＮＡ配列が挙げられる。
【００７０】
後記する実施例から明らかなように、本発明により、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のプロモーター配列およびターミネーター配列を用いて、グルコアミラーゼ遺伝子、アミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ハイグロマイシンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝子などの異種遺伝子の発現に成功した。また、さらにグリセロアルデヒド- ３- リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列、ならびに原形質膜プロトンＡＴＰａｓｅ遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列を用いて、アミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ遺伝子の発現にも成功した。これらの異種タンパク質のうち、グルコアミラーゼは分泌蛋白質であり、アミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼやβ−ガラクトシダーゼは菌体内酵素である。このことは、本発明によるキャンディダ・ユティリスでの異種蛋白質の生産は、それが菌体内あるいは分泌蛋白質いずれであっても可能であることを意味する。さらに、グルコアミラーゼについてはその高レベルの分泌発現が認められ、キャンディダ・ユティリスが異種蛋白質の高生産のための優れた宿主となりうることが明らかにされたといえる。
【００７１】
さらにキャンディダ・マルトーサ、アルビカンスなど一部のキャンディダ属酵母においては、一部コドンの翻訳のされ方が他の生物とは異なっていることも報告されている(Ohama et. al. Nucleic Acids Res. 21 4039 - 4045(1993)) 。キャンディダ・マルトーサを宿主として得られた大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現産物が活性を示さないことは、そのためであるとされている。後記実施例から明らかなように、キャンディダ・ユティリスで産生された、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子産物はその活性を保持していた。このことは、キャンディダ・ユティリスが正常なコドン認識をすることを示しており、これはキャンディダ・ユティリスが異種ポリペプチド生産において好ましい宿主であることを示している。
【００７２】
また、キャンディダ・ユティリスで異種遺伝子を発現することによってキャンディダ・ユティリスの性質を改変することができる。従って、本発明によれば、新たなキャンディダ・ユティリス株の作出法が提供される。例えばその発酵特性を改良し、工業的有用性を増大することが可能である。特にグルコアミラーゼ遺伝子を発現するキャンディダユティリス株は、澱粉資化性が付与されることにより利用可能な炭素源スペクトルが拡大されたといえる。
【００７３】
さらに、本発明によるベクターは、キャンディダ・ユティリス以外の細胞の形質転換に利用することも可能である。キャンディダ・ユティリス以外の細胞を宿主とする場合、形質転換の実施に際して適当なＤＮＡ断片を選択するのが好ましい。そのようなＤＮＡ断片としては、大腸菌の場合、例えばpBluescript やｐＵＣ１９のような細菌のプラスミドＤＮＡが挙げられる。また、サッカロマイセス属酵母の場合、例えばＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０（Methods in Enzymology, 194, p195-230, Academic Press(1991)) などの酵母−大腸菌シャトルベクターが挙げられる。
【００７４】
キャンディダ・ユティリス酵母内で自律複製能を有するＤＮＡ配列のクローニング法
さらに本発明によれば、キャンディダ・ユティリス酵母内で自律複製能を持つＤＮＡ配列をクローン化する手法が提供される。使用するＤＮＡはいかなる生物種由来のものであってもよいが、キャンディダ・ユティリス由来であるのが好ましい。また、このためのベクターとしては、薬剤耐性マーカー遺伝子を含むものが利用でき、好ましくはキャンディダユティリスで機能するプロモーターとターミネーターとにより発現するＧ４１８耐性遺伝子であるＡＰＴ遺伝子を含むベクターを用いることができる。具体的には、ＰＧＫ遺伝子プロモーターで発現するＡＰＴ遺伝子を有するプラスミドをベクターとして用いて、キャンディダ・ユティリス酵母染色体ＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーＤＮＡでキャンディダ・ユティリスを形質転換する。そして、例えばＧ４１８耐性で選択される形質転換体酵母から全ＤＮＡを抽出して、大腸菌を形質転換することにより、形質転換酵母体で、染色体外因子として存在していたプラスミドＤＮＡを回収することができる。このプラスミドＤＮＡに挿入されたキャンディダ・ユティリス由来の染色体ＤＮＡ断片から、自律複製配列（ＡＲＳ）としての機能配列を分離することができる。
【００７５】
驚くべきことに、薬剤耐性マーカーとしてシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子を含むプラスミドをベクターとした場合は、自律複製能を持つＤＮＡ配列をクローン化することはできなかった。すなわち、このプラスミドを用いてキャンディダ・ユティリス酵母染色体ＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーＤＮＡでキャンディダ・ユティリスを形質転換しても、シクロヘキシミド耐性の形質転換体は得られなかった。これは、キャンディダ・ユティリスのＡＲＳの特徴として、それを含むプラスミドの細胞あたりのコピー数が低く、形質転換体を選択するために数コピー必要なシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子と組み合わせても形質転換体を選択できないことを示唆している。これは後に、取得したＡＲＳとシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子とを含むプラスミドによってキャンディダ・ユティリスの形質転換を行っても、形質転換体が得られなかったことからも確認された。後記する実施例に示されるように、分離したＡＲＳを含むＤＮＡ配列の性質を詳しく解析することにより、ＡＲＳを有するプラスミドはキャンディダ・ユティリス酵母内で１細胞あたり約１コピーしか存在しないことが明らかにされた。この他に、分離したＡＲＳの特徴として、それを含むプラスミドが不安定であることがあげられる。非選択条件下で約２．５〜３．５世代培養することにより、プラスミドを保持する菌の割合は全体の２０〜３０％にまで低下していた。
【００７６】
キャンディダ・ユティリス酵母内でプロモーター活性を有するＤＮＡ配列の分離法
前記の自律複製能を有するＤＮＡ配列の利用により、キャンディダ・ユティリスにおいて転写のプロモーター活性を有するＤＮＡ配列のクローン化法が提供される。このためのベクターとしては、自律複製能を有するＤＮＡ配列の他に、転写のためのプロモーター配列を持たない薬剤耐性マーカー遺伝子を含むものであれば用いることができ、好ましくはＧ４１８耐性遺伝子であるＡＰＴ遺伝子を含むものを用いることができる。また、使用するＤＮＡはいかなる生物種由来であってもよいが、キャンディダ・ユティリス由来であるのが好ましい。また、ライブラリー作成のためにＤＮＡは制限酵素やＤＮＡアーゼなどの酵素処理あるいは超音波などの機械的剪断により低分子化する必要があるが、好ましくは、４塩基認識でかつ平滑末端を生じる３種類の制限酵素AluI、HaeIII、RsaIを組み合わせて染色体ＤＮＡの部分分解に使用する。これにより、より多くの染色体領域がライブラリーにクローン化されるからである。
【００７７】
より具体的には、プロモーター配列を含まないＡＰＴ遺伝子の５’側に、前記の制限酵素により部分分解した約０. ８〜１. ８ｋｂのＤＮＡ断片を連結してキャンディダ・ユティリス酵母染色体ＤＮＡライブラリーを通常法によって作製する。そして、このライブラリーＤＮＡでキャンディダ・ユティリスを形質転換する。プロモーター活性を有するＤＮＡ配列がＡＰＴ遺伝子の直前にクローン化されたプラスミドにより形質転換された酵母はＧ４１８耐性となる。よって、Ｇ４１８耐性を示す形質転換体から全ＤＮＡを抽出して、大腸菌を形質転換することにより、プロモーター活性を有するＤＮＡ配列を効率的に分離することができる。この際、プレートに含まれるＧ４１８濃度を高くする、またはプレート上で比較的大きなコロニーを形成する株を選択することによって、より転写活性の高いプロモーター配列を分離することが可能である。本発明によるこの方法は、前述したようにキャンディダ・ユティリスにおけるＡＲＳを含むプラスミドのコピー数は細胞あたり１コピー程度であるため、活性の高いプロモーター配列を分離するのに好都合であるといえる。
【００７８】
キャンディダ・ユティリスのその他機能遺伝子の分離法
また、前述の本発明によるキャンディダ・ユティリス酵母内でプロモーター活性をするＤＮＡを分離する方法は、同時に、ＡＲＳを含んだプラスミドの安定性を高める機能を有するＤＮＡ配列の分離法を提供する。キャンディダ・ユティリスにおけるＡＲＳを含むプラスミドの存在様式のひとつの特徴として、その安定性が低く、非選択条件下で約３〜４世代培養することにより、プラスミドを保持する菌体の割合が全体の２０〜３０％にまで低下する。このため、選択薬剤を含むプレート上においては、薬剤耐性遺伝子を持つＡＲＳプラスミドを保持する株は、薬剤耐性遺伝子が染色体上に組み込まれた株と比較して、細胞あたりのコピー数が同じであってもやや小さいコロニーを形成する。本発明においては、活性の高いプロモーター配列を分離するために比較的大きなコロニーを形成する株を選択したために、後記する実施例で示すように分離されたプロモーター活性を有するＤＮＡ配列のなかには、同時に、プラスミドの安定性を改善し、より安定にする機能を持つＤＮＡ配列も取得することができた。またさらに、当業者にとり、この形質転換系を利用することによって、このほかセントロメア配列など種々の機能を有するＤＮＡ配列の取得が可能であることは容易に想到可能と考える。
【００７９】
薬剤耐性マーカー遺伝子を含まない形質転換体の作出法
前述の本発明による自律複製能を有するＤＮＡ配列の利用により、更に、薬剤耐性マーカー遺伝子を含まない形質転換体の作出法が提供される。具体的には、薬剤耐性マーカー遺伝子を含まない形質転換体は、以下の手順により取得可能である。始めに前記の形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子を持たず、染色体ＤＮＡと相同な配列（相同ＤＮＡ配列）を含むプラスミドＤＮＡを、この相同ＤＮＡ配列内の適当な制限酵素サイトで分解することにより直鎖状とする。これにより、この直鎖状プラスミドＤＮＡはキャンディダ・ユティリス染色体の相同ＤＮＡ配列上に組み込まれる得るものとなる。その後、この直鎖状プラスミドＤＮＡを、ＡＲＳを含むＤＮＡ配列と選択マーカー遺伝子とを持つプラスミドと同時に酵母の形質転換に用いる。次にＡＲＳを含むプラスミドが導入されたことにより選択される形質転換体のなかから、同時に形質転換に用いたＤＮＡ断片が染色体上に組み込まれた株を、ＤＮＡ断片に含まれる異種遺伝子などの発現をみるか、またはＰＣＲ、サザン解析などでＤＮＡ断片の組み込みを確認することなどして、二次的に選択する。さらに選択された株に存在する自律複製能プラスミドは、非選択条件下で菌を培養することによって容易に脱落させることが可能である。これにより、選択マーカー遺伝子を保持せず、挿入ＤＮＡ断片だけを染色体上に保持する株を取得することが可能である。
【００８０】
キャンディダ・ユティリス染色体の部位特異的変異法
本発明の別の態様によれば、キャンディダ・ユティリス染色体の部位特異的変異法が提供される。この方法は、選択マーカー遺伝子をターゲット遺伝子に挿入して機能を失わせた遺伝子分断カセットを、染色体のターゲット遺伝子の置換体として使用することに基づく。このカセットは、その両端に染色体ターゲット遺伝子に相同で組換え可能なＤＮＡ配列（相同ＤＮＡ配列）を含み、かつそれらの間に少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を含んでなる、線状ＤＮＡ構造をなすものである。このうち挿入可能なＤＮＡ断片は、それが染色体上に存在するときと同じ方向であることが重要である。このカセットを用いて酵母を形質転換することにより、このマーカー遺伝子とその両側に存在する挿入可能なＤＮＡ配列とが宿主に取り込まれる。この形質転換の結果として、組み込み部位のターゲット遺伝子が破壊され、新規な形質を有する酵母株が得られる。選択マーカー遺伝子は好ましくは薬剤耐性遺伝子であり、遺伝子が破壊された形質転換体は薬剤耐性により選択できる。遺伝子修飾のターゲットになりうる遺伝子は、キャンディダ・ユティリス染色体由来の遺伝子であるのが好ましい。具体的にはＵＲＡ３、ＡＤＥ１、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８１】
例えば、キャンディダ・ユティリスＵＲＡ３遺伝子を、シクロヘキシミド耐性Ｌ４１遺伝子などの選択マーカー遺伝子により分断して、機能を持たない遺伝子とした後、形質転換に用いる。得られたシクロヘキシミド耐性の形質転換体は、染色体上のＵＲＡ３遺伝子２個のうち１個が破壊されている。続いてＧ４１８耐性遺伝子など他の選択マーカー遺伝子により分断されたＵＲＡ３遺伝子断片を用いて、１個のＵＲＡ３遺伝子が破壊された前記株を形質転換することにより、ＵＲＡ３遺伝子が２個とも破壊された株を得ることができる。ｕｒａ３変異株はウラシル生合成経路中間体の毒性類似体である５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）に耐性となることが知られている。よって、２個のうち１個のＵＲＡ３遺伝子が破壊された株を遺伝子置換することで得られた、ＵＲＡ３遺伝子が２個とも機能を失ったｕｒａ３変異株を、５−ＦＯＡ耐性株として取得することも可能である。これによって得られるｕｒａ３変異株を宿主として用いることにより、ＵＲＡ３遺伝子を選択マーカー遺伝子とした、薬剤耐性遺伝子マーカーによらない形質転換体取得も可能になる。さらにこうして得られる栄養要求性変異株は化学的突然変異法により作製された株のように、その他の遺伝子座に生じうる二次突然変異の影響を受ける可能性がきわめて低いという利点を有する。
【００８２】
Ｌ４１遺伝子
本発明によれば、キャンディダ・ユティリスのリボソーム構成蛋白質Ｌ４１、ならびに、それをコードする遺伝子、そのプロモーター、およびターミネーター配列が提供される。
【００８３】
本発明によるキャンディダ・ユティリスの蛋白質Ｌ４１は、具体的には図１４に記載のアミノ酸配列（配列番号：６）を有するものである。従って、本発明によるＬ４１遺伝子は、図１４に記載のアミノ酸配列をコードするものである。さらに、この遺伝子と、そのプロモーター、およびターミネーター配列とを含んでなる塩基配列の具体例は、図１３（配列番号：５）に示される塩基配列である。
【００８４】
また、さらに本発明によれば、部位特異的変異作製法により、56番目のアミノ酸残基がプロリンからグルタミンに変換されたシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１蛋白質をコードする変異型Ｌ４１遺伝子が提供される。このシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子は、前記したように、キャンディダ・ユティリスの形質転換の選択マーカー遺伝子として有用であるほか、他の酵母、たとえばサッカロマイセス属酵母の形質転換マーカー遺伝子としても使用できる。また、さらにこの遺伝子のプロモーター、ターミネーター配列は異種遺伝子の発現にも使用可能であるのは言うまでもない。
【００８５】
ＰＧＫ遺伝子
本発明によれば、また、ＰＧＫ遺伝子のプロモーター配列、およびターミネーター配列が提供される。
【００８６】
プロモーター配列の好ましい具体例としては、図３に記載の塩基配列（配列番号：２）の内、少なくとも９４６番〜１３４６番までの配列を有する配列、およびプロモーター活性を保持するその部分配列が挙げられる。
【００８７】
また、ターミネーター配列の好ましい具体例としては、図２に記載の塩基配列（配列番号：１）、およびターミネーター活性を保持するその部分配列が挙げられる。
【００８８】
このプロモーター配列とターミネーター配列とを適当なプラスミドベクターに接続することにより、キャンディダ・ユティリスで利用可能な発現ベクターを得ることができる。このためのプラスミドベクターとしてはpBluescript 、ｐＵＣ１９など公知の大腸菌プラスミド、または、シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子などの選択マーカー遺伝子と、さらに必要に応じて染色体ターゲット遺伝子に相同で組換え可能なＤＮＡ配列とを含む酵母−大腸菌シャトルプラスミドが利用できる。また、他の宿主細胞、特にサッカロマイセス属酵母、においても、プロモーター、またはターミネーターとして利用することも可能であることは当業者に明らかであると考える。
【００８９】
ＰＧＫ遺伝子は解糖系酵素の遺伝子であり、その他の解糖系酵素の遺伝子と共にキャンディダ・ユティリスで大量に発現していることから、強力なプロモーターであることが期待される。後記する実施例では、作製した発現ベクターを用いて異種遺伝子であるグルコアミラーゼ遺伝子、アミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子などの発現に、このプロモーターが有利に利用できることが明らかにされている。
【００９０】
また、本発明によるＰＧＫ遺伝子プロモーター配列とターミネーター配列とに連結した遺伝子の発現量が減少しなければ、それらの一部を欠損させることによって、発現ベクターを小型化することも可能であることは当業者に自明の事項であろう。
【００９１】
ＧＡＰ遺伝子
本発明によれば、ＧＡＰ遺伝子のプロモーター配列およびターミネーター配列が提供される。
【００９２】
プロモーター配列の好ましい具体例としては、図３０に記載の塩基配列（配列番号：７）、およびプロモーター活性を保持するその部分配列が挙げられる。
【００９３】
また、ターミネーター配列の好ましい具体例としては、図３１に記載の塩基配列（配列番号：８）、およびターミネーター活性を保持するその部分配列が挙げられる。
【００９４】
このプロモーター配列とターミネーター配列とを適当なプラスミドベクターに接続することにより、キャンディダ・ユティリスで利用可能な発現ベクターを得ることができる。このためのプラスミドベクターとしてはpBluescript 、ｐＵＣ１９など公知の大腸菌プラスミド、または、シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子などの選択マーカー遺伝子と、さらに必要に応じて染色体ターゲット遺伝子に相同で組換え可能なＤＮＡ配列とを含む酵母−大腸菌シャトルプラスミドが利用できる。また、他の宿主細胞、特にサッカロマイセス属酵母、においても、プロモーター、またはターミネーターとして利用することも可能であることは当業者に明らかであると考える。
【００９５】
ＧＡＰ遺伝子は解糖系酵素の遺伝子であり、その他の解糖系酵素の遺伝子と共にキャンディダ・ユティリスで大量に発現していることから、強力なプロモーターを有することが期待される。後記する実施例では、作製した発現ベクターを用いて異種遺伝子であるアミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ遺伝子の発現に、このプロモーターが有利に利用できることが明らかにされている。
【００９６】
また、本発明によるＧＡＰ遺伝子プロモーター配列とターミネーター配列とに連結した遺伝子の発現量が減少しなければ、それらの一部を欠損させることによって、発現ベクターを小型化することも可能であることは当業者に自明の事項であろう。
【００９７】
ＰＭＡ遺伝子
本発明によれば、ＰＭＡ遺伝子のプロモーター配列、およびターミネーター配列が提供される。
【００９８】
プロモーター配列の好ましい具体例としては、図３４に記載の塩基配列（配列番号：９）、およびプロモーター活性を保持するその部分配列が挙げられる。
【００９９】
また、ターミネーター配列の好ましい具体例としては、図３５に記載の塩基配列（配列番号：１０）、およびターミネーター活性を保持するその部分配列が挙げられる。
【０１００】
このプロモーター配列とターミネーター配列とを適当なプラスミドベクターに接続することにより、キャンディダ・ユティリスで利用可能な発現ベクターを得ることができる。このためのプラスミドベクターとしてはpBluescript 、ｐＵＣ１９など公知の大腸菌プラスミド、または、シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子などの選択マーカー遺伝子と、さらに必要に応じて染色体ターゲット遺伝子に相同で組換え可能なＤＮＡ配列とを含む酵母ー大腸菌シャトルプラスミドが利用できる。また、他の宿主細胞、特にサッカロマイセス属酵母、においても、プロモーター、またはターミネーターとして利用することも可能であることは当業者に明らかであると考える。
【０１０１】
ＰＭＡ遺伝子は原形質膜酵素の遺伝子であり、サッカロマイセス酵母においては原形質膜タンパク質の約１０％を占めている主要タンパク質であることが知られている。従って、このＰＭＡ遺伝子は、強力なプロモーターを有していることが期待される。後記する実施例では、作製した発現ベクターを用いて異種遺伝子であるアミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ遺伝子の発現に、このプロモーターが有利に利用できることが明らかにされている。
【０１０２】
また、本発明によるＰＭＡ遺伝子プロモーター配列とターミネーター配列とに連結した遺伝子の発現量が減少しなければ、それらの一部を欠損させることによって、発現ベクターを小型化することも可能であることは当業者に自明の事項であろう。
【０１０３】
プロモーター活性を有するＤＮＡ配列
本発明によれば、プロモーター活性を有するＤＮＡ配列が提供される。このＤＮＡ配列は、自律複製能を有するＤＮＡ配列と、転写のためのプロモーター配列を持たない薬剤耐性マーカー遺伝子とを含んでなるベクターを利用して分離される。プロモーター活性を有するＤＮＡ配列の好ましい具体例としては、図４８に記載の塩基配列（配列番号：１３）、およびプロモーター活性を保持するその部分配列が挙げられる。また、後記する実施例で詳述するように、このベクターを利用して、図４８に記載の塩基配列が明らかにされたプロモーター活性を有するＤＮＡ配列以外に、８種類のＤＮＡ配列が取得された。この転写のためのプロモーター配列を持たない薬剤耐性遺伝子を例えばハイグロマイシンＢ耐性遺伝子など他の遺伝子に置き換えることによっても同様に、プロモーター活性を有するＤＮＡ配列を分離できる。また、さらに形質転換体を選択するプレートに含まれる糖の種類や、その他の培地組成など選択条件を変更することにより、ある特異的な条件下で転写活性が誘導されるプロモーターを取得することが可能である。これらのことは、本明細書の開示を参照すれば、当業者に容易に理解される事項であろう。
【０１０４】
このプロモーター配列を適当なターミネーター配列とともに適当なプラスミドベクターに接続することによりキャンディダ・ユティリスで利用可能な発現ベクターを得ることができる。このためのプラスミドベクターとしてはpBluescript 、ｐＵＣ１９など公知の大腸菌プラスミド、または、シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子などの選択マーカー遺伝子と、さらに必要に応じて染色体ターゲット遺伝子に相同で組換え可能なＤＮＡ配列とを含む酵母−大腸菌シャトルプラスミドが利用できる。また、他の宿主細胞、特にサッカロマイセス属酵母、においても、プロモーターとして利用することも可能であることは当業者に明らかであると考える。
【０１０５】
後記する実施例では、作製した発現ベクターを用いて異種遺伝子であるアミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ遺伝子の発現に、このプロモーターが有利に利用できることが明らかにされている。
【０１０６】
また、本発明によるプロモーター配列に連結した遺伝子の発現量が減少しなければ、それらの一部を欠損させることによって、発現ベクターを小型化することも可能であることは当業者に自明の事項であろう。
【０１０７】
ｒＲＮＡ遺伝子
本発明によれば、さらに、キャンディダユティリスのｒＲＮＡ遺伝子を含んでなる、約１３．５ｋｂのＤＮＡ断片、およびその断片が反復されてなるＤＮＡ配列が提供される。
【０１０８】
この約１３．５ｋｂの断片は、図６（ｂ）に示される制限酵素地図で表されるものである。このＤＮＡ配列のうち１８Ｓ、５．８Ｓ、２５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置は図６（ｂ）に示される通りであった。
【０１０９】
このｒＲＮＡ遺伝子の一部の領域をＤＮＡ断片の染色体組み込みのためのターゲット配列として用いることにより、効率的で多コピーの組み込みが達成される。この約１３．５ｋｂのＤＮＡ断片を４個の断片に分けてプラスミドを構築し、それぞれ、形質転換に用いたところ、興味あることに、組み込みターゲット配列として使用する領域によって、得られる形質転換頻度に差が認められた。すなわち、図２０の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の３´側一部と５．８５ｒＲＮＡ遺伝子、さらに２５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５´側一部を含む３．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含むプラスミドｐＣＬＲＥ４、または２５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の３´側一部を含む３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含むプラスミドｐＣＬＲＥ６と１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５´側一部を含む４．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含むプラスミドｐＣＬＥ７では、高頻度で形質転換体が得られたが、一方、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含む２．４ｋｂＥｃｏＲＩ断片を含むプラスミドｐＣＬＲＥ５では得られる形質転換頻度が低かった。
【０１１０】
ＵＲＡ３遺伝子
本発明によれば、さらにまた、サッカロミセス・セレビシエ酵母のｕｒａ３変異を相補する、キャンディダ・ユティリスのＵＲＡ３遺伝子が提供される。この遺伝子は、前記したように、ＤＮＡ断片の組み込みターゲットとして用いられるほか、染色体ＵＲＡ３遺伝子の遺伝子破壊によるｕｒａ３変異株の作出に使用できる。これによって得られるｕｒａ３変異株を宿主として用いることにより、ＵＲＡ３遺伝子を選択マーカー遺伝子とした薬剤耐性遺伝子マーカーによらない形質転換体の取得も可能になる。また、さらにこの遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列は、異種遺伝子の発現にも使用可能であるのは言うまでもない。
【０１１１】
具体的なＵＲＡ３遺伝子は、図１０および図１１に示されるアミノ酸配列（配列番号：４）をコードするものである。好ましいＵＲＡ３遺伝子は図９に示される塩基配列（配列番号：３）を有するもの、またはサッカロミセス・セレビシエ酵母のｕｒａ３変異を相補する機能を保持するその部分配列を有するものである。
【０１１２】
自律複製能を有するＤＮＡ配列（ＡＲＳ）
本発明によれば、自律複製機能を有するＤＮＡ配列であって、キャンディダ・ユティリス内で、当該ＤＮＡ配列を含むベクターを、染色体外要素としてのプラスミドとして保持させ、宿主の形質転換頻度を上昇させることができるＤＮＡ配列が提供される。このＤＮＡ断片としてはどのような生物由来でも良いが、好ましくはキャンディダ・ユティリス由来である。ＡＲＳの好ましい具体例としては、図４１および図４２に記載の塩基配列（配列番号：１１）、あるいは図４３および図４４に記載の塩基配列（配列番号１２）、および自律複製機能を有するその部分配列が挙げられる。後記する実施例から明らかなように、短縮化したＤＮＡ断片を含むプラスミドによっても、頻度は低下するものの、キャンディダ・ユティリス酵母を形質転換することができる。
【０１１３】
このＡＲＳと、適当な選択マーカー遺伝子とを使用することにより、キャンディダ・ユティリス内においてプラスミドとして存在し得るベクターが提供される。さらに、このベクターを利用することにより、プロモーター活性を有するＤＮＡ配列や、その他の機能を有するＤＮＡ配列を分離することが可能である。また、キャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡと相同な配列（相同ＤＮＡ配列）を含み、かつ特に形質転換体を選択するための選択マーカー遺伝子を持たないプラスミドＤＮＡとともに、ＡＲＳと適当な選択マーカー遺伝子とを含むプラスミドを形質転換に用いることにより、選択マーカー遺伝子を含まず、異種遺伝子を含むＤＮＡ断片のみを染色体上に保持する形質転換酵母の作出が可能である。
【０１１４】
【実施例】
本発明を以下の実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。
【０１１５】
なお、各種遺伝子の制限酵素地図における制限酵素サイトについては以下の略号で示してある。
【０１１６】
Ａａ；ＡａｔII、Ａｆ；ＡｆlII 、Ａｌ；ＡｆｌIII 、Ａｐ；ＡｐａＩ、Ｂ；ＢａｍＨＩ、Ｂｇ；ＢｇｌII、Ｃ；ＣｌａＩ、Ｅ；ＥｃｏＲＩ、ＲＶ；ＥｃｏＲＶ、Ｈ； ＨｉｎｄIII 、Ｈｐ；ＨｐａＩ、Ｋ；ＫｐｎＩ、Ｐ；ＰｓｔＩ、Ｐｖ；ＰｖｕII、Ｓ；ＳａｌＩ、Ｓｅ；ＳｐｅＩ、Ｓｍ；ＳｍａＩ、Ｓｃ；ＳａｃＩ、ＳｃII； ＳａｃII、Ｓｐ；ＳｐｈＩ、Ｘ；ＸｂａＩ、およびＸｈ；ＸｈｏＩである。
【０１１７】
また、以下に記載する実施例において共通に使用される方法は以下のとおりである。
【０１１８】
１）ＥｘｏIII ヌクレアーゼ及びマングビーンヌクレアーゼを用いた欠失変異処理とＤＮＡ配列の決定
プラスミド１０μｇを適当な制限酵素消化した後、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。ＤＮＡを１００μｌのＥｘｏIII 緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，１００ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール) に溶解し、１８０ユニットのＥｘｏIII ヌクレアーゼを加え、３７℃で保温した。１分ごとに１０μｌをサンプリングし、２サンプル分ずつまとめて、２０μｌのＭＢバッファー（４０ｍＭ Ｎａ−Acetate, １００ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＺｎＣｌ2 ，１０％グリセロール ｐＨ４．５）の入った氷冷したチューブに移した。得られた５本のチューブを６５℃１０分間保温して酵素を失活させた後、５ユニットのマングビーンヌクレアーゼを加えて、３７℃で３０分間反応した。反応後、アガロースゲル電気泳動により欠失の程度が異なる５種類のＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡはクレノウ酵素で末端を平滑化し、１６℃で一晩ライゲーション反応した後、大腸菌を形質転換した。
【０１１９】
得られた種々のプラスミドの挿入断片について、アプライドバイオシステムズ（株）の蛍光プライマーサイクルシークエンスキットを用いてシークエンス反応を行い、自動ＤＮＡシークエンサーを用いてＤＮＡ配列を決定した。
【０１２０】
２）ハイブリダイゼーション
ＤＮＡはアガロースゲル電気泳動後、ハイボンドＮ＋フィルター（Amersham）に、添付のプロトコールにしたがってアルカリトランスファーして、サザンハイブリダイゼーション用のフィルターを作製した。
【０１２１】
ＤＮＡが固定化されたフィルターは、ハイブリダイゼーション溶液（６ｘＳＳＣ，５ｘDenhardt Solution,０．２％ ＳＤＳ，２０μｇ／ｍｌ Salmon sperm ＤＮＡ）中で６５℃、２時間プレハイブリダイゼーションを行った。次にMegaprime ＤＮＡ labelling systems （Amersham）と［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（１１０ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）とを用いて標識化したプローブＤＮＡを、ハイブリダイゼーション溶液に加え、６５℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、フィルターは１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中で、６５℃、２時間洗浄した後、オートラジオグラフィーに供してシグナルを検出した。
【０１２２】
３）培地組成
酵母を培養するためのＹＰＤ培地の組成は１％酵母エキス、２％バクトペプトン、２％グルコースであり、プレートの場合は寒天を２％になるように加えた。ＳＤ培地の組成は、０．６７％アミノ酸不含イーストニトロジェンベース、２％グルコースであり、使用した酵母の栄養要求性に応じて、アミノ酸を添加した。プレートの場合は寒天を２％になるように加えた。
【０１２３】
４）酵素処理
制限酵素反応、クレノウ酵素処理、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応など、種々の酵素による反応は、メーカーの推奨する反応条件、あるいはMolecular Cloning 2nd edition Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) に記載の方法に従って行った。
【０１２４】
実施例１：キャンディダユティリス染色体ＤＮＡの調製
キャンディダ・ユティリス(Candida utilis)の染色体ＤＮＡ抽出は、以下に示す方法で行った。３０ｍｌのＹＰＤ培地に、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０株を植菌し、３０℃で定常期初期になるまで培養した。遠心分離により菌体を集めて滅菌水で洗浄した後、再度遠心分離により集菌した。菌体は３ｍｌのザイモリアーゼバッファー（０．９Ｍソルビトール、０．１Ｍ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５）に懸濁した後、２５ｍｇ／ｍｌのザイモリアーゼ１００Ｔを含む０．９Ｍソルビトールを２００μｌを加え、３７℃で振とう保温した。顕微鏡下でプロトプラスト化を確認した後、遠心分離してプロトプラスト化した菌を回収した。３ｍｌの溶菌バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加え、穏やかに、かつ十分に懸濁してから０．３ｍｌの１０％ＳＤＳを混合し、６５℃で一夜保温した。続いて１ｍｌの５Ｍ酢酸カリウム液を加え、氷上で１時間放置した。その後遠心分離により凝集物を除き、４ｍｌの冷却したエタノールを加え、遠心分離してＤＮＡ等を沈殿させた。沈殿は５０％のエタノールで洗浄し、乾燥した後、３ｍｌのＲＮａｓｅ Ａバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ、ｐＨ７．５）に溶解して、３７℃で３０分保温した。最後に３ｍｌの２−プロパノールを加え、遠心分離して上清を除いた後、沈殿を５０％の２−プロパノールで洗浄し、乾燥させた。この沈殿を０．５ｍｌのＴＥバッファーに溶解したものをキャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡ試料とした。
【０１２５】
実施例２：ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子のクローニング
キャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分消化した後、０．８Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含む１０−５０％ショ糖密度勾配に重層して、120,000 x ｇ、１４時間の遠心分離によりＤＮＡ断片を分画した。このうち１０〜２０ｋｂの染色体ＤＮＡ断片と、ＢａｍＨＩ消化した後脱リン酸化したλファージベクターDASHTMII（Stratagene Cloning Systems)とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより一晩連結した。続いてGigapackII Gold Packaging Extract(Stratagene Cloning Systems) を用いてインビトロパッケージングし、キャンディダユティリス染色体ＤＮＡライブラリーを構築した。
【０１２６】
キャンディダ・ユティリスのＰＧＫ遺伝子のクローニングは、他生物の既知のＰＧＫ遺伝子をプローブとしたハイブリダイゼーション法を用いて行った。すなわち、Molecular Cloning 2nd edition Sambrook et. al. p2.108-121,Cold Spring Harbor Laboratory (1989) に記載された方法に従い、上記のＤＮＡライブラリーの約20,000プラークのファージＤＮＡを吸着させたフィルターを作製した。次に、サッカロマイセス・セレビシエのＰＧＫ遺伝子を保持するプラスミドｐＳＴ２（Yamano et. al. Journal of Biotechnology.32, 165-171(1994)) からＰＧＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、２ｋｂのＣｌａＩ断片として切り出した。この断片を32Ｐ標識して、これをプローブとしてハイブリダイゼーションを行った。その結果４つの陽性プラークが分離できた。更にこれらプラークから調製したファージＤＮＡについてさまざまな制限酵素で消化後、同じプローブを用いてサザン解析を行った。その結果、プローブにハイブリダイズした２．６ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片と２．５ｋｂ ＳａｌＩ断片を単離した。
【０１２７】
実施例３：ＰＧＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列決定と、構造遺伝子及び制御領域の特定
単離した２．６ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を、プラスミドベクターBluescriptIISK+ のＥｃｏＲＩサイトに組み込み、ベクターに対する挿入断片の方向性が互いに逆向きのプラスミドｐＰＧＫＥ１、ｐＰＧＫＥ２を作製した。また、２．５ｋｂＳａｌＩ断片を同様にベクターBluescriptIISK+ のＳａｌＩサイトに組み込み、ベクターに対する挿入断片の方向性が互いに逆向きのプラスミドｐＰＧＫＳ１、ｐＰＧＫＳ２を作製した（図１）。
【０１２８】
このうち、プラスミドｐＰＧＫＥ１、ｐＰＧＫＥ２の２種のプラスミドについて、ＨｉｎｄIII 、ＫｐｎＩ、ＳａｌＩなどの制限酵素サイトでの欠失変異体の作製や、ＥｘｏIII ヌクレアーゼ及びマングビーンヌクレアーゼを用いて欠失変異体を作製することにより、種々の欠失変異をもつプラスミドを作製し、２５３０ｂｐからなるＥｃｏＲＩ断片の配列を決定した。
【０１２９】
予想される構造遺伝子領域の解析を行ったところ、１２４８ｂｐからなるオープンリーディングフレームが存在し、そこから推定される遺伝子産物のアミノ酸配列についてサッカロマイセス・セレビシエのＰＧＫ遺伝子に対するホモロジーを調べた。両配列は互いに８６．８％のホモロジーを示したことから、単離した遺伝子がキャンディダ・ユティリスのＰＧＫ遺伝子であると断定した。
【０１３０】
またこのＥｃｏＲＩ断片には、遺伝子制御領域については、開始コドンＡＴＧの上流４０１ｂｐ、終止コドンＴＡＡの下流８８０ｂｐが含まれていた。このうち、転写のターミネーターを含むと推測される終止コドンＴＡＡの直後からＥｃｏＲＩサイトまでの８８０ｂｐの配列は図２に示される通りであった。またさらに、プラスミドｐＰＧＫＳ１、ｐＰＧＫＳ２についても、ＥｘｏIII ヌクレアーゼ及びマングビーンヌクレアーゼを用いた欠失変異体作製により種々の欠失変異をもつプラスミドを作製し、ＨｉｎｄIII サイトからＥｃｏＲＩサイトまでの塩基配列を決定した（図１）。転写のプロモーターを含むと推測されるＨｉｎｄIII サイトから開始コドンＡＴＧの直前までの１３４６ｂｐの配列は図３に示される通りであった。
【０１３１】
実施例４：ＰＧＫ遺伝子プロモーターとターミネーターとを使った発現ベクターの構築
キャンディダ・ユティリス内で異種遺伝子を発現させるためには、キャンディダ・ユティリス内で機能する遺伝子発現因子、転写プロモーター及びターミネーターが必要となる。そこで、キャンディダ・ユティリスのＰＧＫ遺伝子プロモーターと、ターミネーターとの間に、マルチクローニングサイトを持つ発現ベクタープラスミドを作製した。
【０１３２】
まず、Polymerase Chain Reaction （ＰＣＲ）によリ、プロモーターとターミネーターとを含む断片をそれぞれ取得した（図１）。
【０１３３】
プロモーターとしては、プラスミドｐＰＧＫＳ１を鋳型として、開始コドンの２．３ｋｂ上流に位置するＳａｌＩサイトから開始コドンＡＴＧ直前までの断片を取得した。プライマーとして、
5'-GGTCGACATATCGTGGTAAGCGCCTTGTCA-3' （配列番号：１４）
5'-TTCTAGACTTTATCCGCCAGTATGTTAGTC-3' （配列番号：１５）
を用い、３’下流側開始コドン直前にＸｂａＩ部位をもつ様にデザインして合成した。
【０１３４】
次に、ターミネーターとしては、プラスミドｐＰＧＫＥ１を鋳型として、終止コドン直後から８８０ｂｐ下流のＥｃｏＲＩサイトまでの断片を取得した。プライマーとして、
5'-GGGTACCTAACTGCAAGCTACTTTGTAATTAAC-3' （配列番号：１６）
5'-GGAATTCAACATGAATGACACGACGAAGGT-3' （配列番号：１７）
を用い、５’上流側終止コドン直後にＫｐｎＩサイトをもつ様にデザインし合成した。
【０１３５】
ＰＣＲプロセスは、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene Cloning Systems）を使い、添付のバッファーを使用して、３０サイクル行った。
【０１３６】
ＰＣＲ合成したプロモーター及びターミネーター断片は、それぞれＳａｌＩとＸｂａＩ、またはＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで消化した。その断片を、ｐＵＣ１９のＳａｌＩ−ＸｂａＩサイトとＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩサイトとに順に組み込み、プラスミドｐＰＧＫＰＴ１を構築した（図４）。続いて、ターミネーター下流末端のＥｃｏＲＩサイトをクレノウ酵素処理により平滑化した後、ＮｏｔＩリンカー(5'AGCGGCCGCT3´:配列番号：１８）を連結してから、ＰｓｔＩ消化により約０．９ｋｂのＰｓｔＩ−ＮｏｔＩ断片を切り出した。この断片を、プラスミドｐＰＧＫＳ１から切り出した１．２ｋｂＨｉｎｄIII −ＰｓｔＩ断片と共に、pBluescriptSK-のＨｉｎｄIII サイトとＮｏｔＩサイトとの間に挿入して、プラスミドｐＰＧＫＰＴ２を構築した。さらに、ｐＰＧＫＰＴ２をＢｇｌII消化して、クレノウ酵素処理、そして再環状化することにより、ターミネーター断片中のＢｇｌIIサイトを除去して、プラスミドｐＰＧＫＰＴ３を構築した。続いてｐＰＧＫＰＴ３のＨｉｎｄIII サイトをクレノウ酵素処理により平滑化した後、ＮｏｔＩリンカー（5'AGCGGCCGCT3'：配列番号：１８）を連結して、プラスミドｐＰＧＫＰＴ４を構築した。また、プラスミドｐＰＧＫＰＴ４をＫｐｎＩで部分消化して、プロモーター上流のＫｐｎＩサイトを欠失させて、プラスミドｐＰＧＫＰＴ５を構築した（図４）。
【０１３７】
実施例５：ｒＲＮＡ遺伝子の単離
実施例２に記載の庶糖密度勾配遠心分離によって得られた、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０のゲノムＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ部分消化断片のうち、５〜１０ｋｂの分画のＤＮＡ断片４００ｎｇと、ＢａｍＨＩ消化した後脱リン酸化したベクタープラスミドｐＢＲ３２２、２００ｎｇとを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより一晩連結した。このＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５を形質転換して、キャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡライブラリーを完成した。
【０１３８】
このうち約10,000コロニーについて、 Molecular Cloning 2nd edition Sambrook et. al. p12.21-23, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)に従ってフィルターを作製し、サッカロミセス・セレビシエの１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含む１．８ｋｂのＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩ断片を32Ｐ標識し、これをプローブとしてスクリーニングを行った。このプローブとして用いたｒＤＮＡ断片は、サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ［α，ｓｕｃ２，ｍａｌ，ｇａｌ２，ＣＵＰ１］より作製した染色体ＤＮＡライブラリーから、５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５´末端の４〜３２番目の塩基に対応するオリゴマーを32Ｐ標識したものをプローブとして取得したものである（曽根ら、特公平６−１４８６５号公報）。
【０１３９】
その結果、２００個以上のポジティブクローンが得られた。このうち７個のクローンｐＣＲ１、ｐＣＲ４、ｐＣＲ５、ｐＣＲ６、ｐＣＲ７、ｐＣＲ８、およびｐＣＲ９についてプラスミドの制限酵素地図を作製し、整列させ比較したところ、両端の制限酵素地図が一致した（図５）。このことから、キャンディダ・ユティリスのｒＲＮＡ遺伝子を含む領域が、約１３ｋｂからなる繰り返し構造をとっていることが明らかとなった。
【０１４０】
これらのプラスミドより、ＥｃｏＲＩまたはＸｂａＩ消化により切り出される断片をpBluescriptSK-にサブクローン化して、プラスミドｐＣＲＥ１、ｐＣＲＥ２、ｐＣＲＥ３、ｐＣＲＸ１、ｐＣＲＸ２、ｐＣＲＸ３、およびｐＣＲＸ４を構築した（図６（ａ））。さらに、これらのプラスミドをさまざまな制限酵素により消化した後、再環状化することにより、各種の欠失プラスミドを構築した。これらプラスミドの挿入断片について図６に矢印で示した領域について塩基配列を決定したところ、１８Ｓ、５．８Ｓ、および２５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に高いホモロジーを示す領域が認められ、これによって３つのｒＲＮＡ遺伝子の存在位置、転写方向などが明らかとなった（図６（ｂ））。
【０１４１】
実施例６：オルチジン−５´−フォスフェート デカルボキシラーゼ遺伝子 （ＵＲＡ３遺伝子）の単離
実施例２に記載の庶糖密度勾配遠心分離によって得られた、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０のゲノムＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ部分消化断片の内、５〜１０ｋｂの分画のＤＮＡ断片１００ｎｇと、ＢａｍＨＩ消化した後脱リン酸化したベクタープラスミドＹＥｐ１３(Methods in Enzymol. 194, 195-230, 1991)１００ｎｇとを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより一晩連結した。このＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５を形質転換して、染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。形質転換体よりプラスミド混合物を抽出後、得られたＤＮＡでｕｒａ３−株であるサッカロマイセス・セレビシエＹＰＨ５００（αｈｉｓ３，ｔｒｐ１，ｌｅｕ２，ａｄｅ２，ｌｙｓ２，ｕｒａ３）(Stratagene Cloning Systems)を形質転換し、最少培地で生育するウラシル非要求性の形質転換株を選択した。サッカロマイセス・セレビシエ株の形質転換はMethods in Yeast Genetics - A laboratory Course Manual - Rose M.D et al.P122-123Cold Spring Harbor Laboratory Press NY (1990) 記載のリチウム法に従った。
【０１４２】
この方法により１０μｇのＤＮＡから、５株のＵｒａ+ 株が得られた。これら形質転換株より、Methods in Yeast Genetics - A laboratory Course Manual - Rose M.D et al. P130 Cold Spring Harbor Laboratory Press NY (1990)記載の方法に従いプラスミドＤＮＡを調製した。これで大腸菌を形質転換してプラスミドＤＮＡを回収した。これらのプラスミドＤＮＡのうち、ＹＥｐ１３のＢａｍＨＩ部位に６．１ｋｂのインサートを含むプラスミドｐＣＵＲＡ３−３と、８．１ｋｂのインサートを含むｐＣＵＲＡ３−５とについて、制限酵素地図を作製した。その地図は図７に示される通りである。
【０１４３】
実施例７：ＵＲＡ３遺伝子領域の特定化と塩基配列の決定
ＵＲＡ３遺伝子領域を特定化するために、プラスミドｐＣＵＲＡ３−３とｐＣＵＲＡ３−５に共通する領域を含む５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、プラスミドｐＣＵＲＡ３−５より切り出し、プラスミドｐＲＳ３１４（Stratagene Cloning Systems) のＥｃｏＲＩ部位に連結して、プラスミドｐＵＲＡＥ１を作製した（図７）。このプラスミドでＹＰＨ５００株をリチウム法により形質転換したところ、高頻度でＵＲＡ+ の形質転換体が得られた。これより、この５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片中にＵＲＡ３遺伝子が存在し、１コピーでサッカロマイセス・セレビシエのｕｒａ３- 変異を相補することが明らかにされた。
【０１４４】
次に、プラスミドｐＵＲＡＥ１をＸｈｏＩ、またはＰｓｔＩ消化して、再びＴ４リガーゼ反応により再環状化することにより、プラスミドｐＵＲＡＥ１ΔＸｈｏ、およびｐＵＲＡＥ１ΔＰｓｔを得た。
【０１４５】
さらにプラスミドｐＵＲＡＥ１より切り出された３．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ断片、および２．３ｋｂのＨｉｎｄIII 断片を、それぞれプラスミドｐＲＳ３１４のＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ間、およびＨｉｎｄIII 部位に挿入して、プラスミドｐＵＲＡＥＣ１、およびｐＵＲＡＨ１を作製した（図７）。
【０１４６】
以上、５種類のプラスミドを用いてＹＰＨ５００株をリチウム法により形質転換し、ｕｒａ３- 変異の相補能を調べることにより、これらの断片がＵＲＡ３遺伝子を含むかどうかを調べた。その結果は、図７に示される通りであった。これより、ＵＲＡ３遺伝子をＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII 間の２．３ｋｂに限定することができた。
【０１４７】
さらにＵＲＡ３遺伝子を含む２．３ｋｂのＨｉｎｄIII 断片を、プラスミドpBluescript SK- のＨｉｎｄIII 部位に連結して、プラスミドｐＵＲＡＨ２を作製した。つぎに挿入断片の両側からＥｘｏIII ヌクレアーゼおよびマングビーンヌクレアーゼを用いた欠失変異作製法により、種々の欠失変異をもつプラスミドを作製し、塩基配列を決定した。そのシークエンスストラテジーと塩基配列の解析から明らかにされた制限酵素地図は、図８に示される通りであった。また、得られた２３３０ｂｐからなるＤＮＡ配列は図９に、また推定される２６７アミノ酸残基からなるポリペプチドのアミノ酸配列は図１０および図１１に示される通りである。
【０１４８】
推定されたポリペプチドのアミノ酸配列を他の酵母のＵＲＡ３蛋白質と比較したところ、サッカロマイセス・セレビシエとでは７３．４％、クルイベロマイセス・ラクティスとでは７６．３％、キャンディダ・アルビカンスでは７５．１％と、高い相同性を示した。
【０１４９】
実施例８：Ｌ４１遺伝子のクローニングとＬ４１遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列決定
実施例５で作製したライブラリーの約30,000コロニーについて、Molecular Cloning 2nd edition p12.21-23,Cold Spring Harbor Laboratory (1989) に従ってフィルターを作製し、32Ｐ標識したキャンディダ・マルトーサのＬ４１遺伝子ＲＩＭ−Ｃを含む、１．１ｋｂのＸｂａＩ−Ｓａｕ３ＡＩ断片（KAWAI et. al. J Bacteriol. 174, 254-262 (1992)）をプローブとしてスクリーニングを行った。
【０１５０】
その結果、５個のポジティブクローンが得られ、このうち３個のクローンｐＣＬ４１−１、ｐＣＬ４１−２、およびｐＣＬ４１−５について制限酵素地図を作製し、それを比較したところ、これらのクローンが４ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を共有することが示された（図１２）。さらにこれらプラスミドＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション解析により、キャンディダ・マルトーサのＬ４１遺伝子に相同性を示す領域が、この４ｋｂのＥｃｏＲＩ断片内の１．４ｋｂＣｌａＩ−ＰｓｔＩ断片内にあることが示された。
【０１５１】
そこで４ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、pBluescript SK- のＥｃｏＲＩサイトに挿入し、挿入断片が互いに逆向きのプラスミドｐＣＬＥ１、およびｐＣＬＥ２を作製した。この２種のプラスミドについてＥｃｏＲＩ断片内にサイトをもつＨｉｎｄIII 、ＸｈｏＩ、ＣｌａＩなどによる欠失変異体の作製や、ＥｘｏIII ヌクレアーゼおよびマングビーンヌクレアーゼを用いた欠失変異体の作製により、種々の欠失変異をもつプラスミドを作製し、ＢａｍＨＩサイトからＳａｃＩサイトまでの２０８６ｂｐからなるＤＮＡ配列を決定した（図１３）。
【０１５２】
この配列を解析すると、サザン解析によりＬ４１造遺伝子が存在すると推定された領域に３６７ｂｐのイントロンで分断された３１８ｂｐからなるオープンリーディングフレームが存在した（図１２および図１４）。イントロンと推定された領域の５´と３´端および３´端近傍にはイントロンに共通する配列GTATGT--TACTAAC--AG が認められた。また、その位置も報告されている他の酵母由来の６種類のＬ４１遺伝子（KAWAI et. al. J Bacteriol. 174, 254-262 (1992)、POZO et. al. Eur. J. Biochem. 213, 849-857 (1993) ）と同様、開始コドンの直後に存在していた。キャンディダ・ユティリスＬ４１ポリペプチドの推定されるアミノ酸配列を他のいくつかのＬ４１蛋白質と比較したところ、サッカロマイセス・セレビシエＬ４１ａとの間では９３．４％、キャンディダ・トロピカリスＬ４１との間では８９．６％、キャンディダ・マルトーサのＬ４１との間では８５．８％と、高い相同性を示した。
【０１５３】
実施例９ 部位特異的変異法によるシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子の作製
シクロヘキシミド耐性を示す酵母のＬ４１蛋白質の５６番目のアミノ酸はグルタミンであり、一方、シクロヘキシミド感受性酵母のＬ４１蛋白質においてはこの位置のアミノ酸はプロリンである。そしてこのアミノ酸残基がそのＬ４１蛋白質をもつ酵母のシクロヘキシミドに対する感受性を決定していると報告されている（KAWAI et. al. J Bacteriol. 174 254-262 (1992) ）。ここで、シクロヘキシミド感受性であるキャンディダ・ユティリスのＬ４１蛋白質の５６番目のアミノ酸はシクロヘキシミド感受性のサッカロマイセスセレビシエと同様にプロリンであった。そこで、部位特異的突然変異導入によりＬ４１遺伝子の５６番目のプロリンをコードするコドンをグルタミンコドンに変更することによって、この遺伝子がコードするＬ４１蛋白質をシクロヘキシミド耐性型へと変換し、形質転換の選択マーカーとして利用した。
【０１５４】
まず、プラスミドｐＣＬＥ１から得られる２．１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片をｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ−ＳａｃＩサイト間に挿入して、プラスミドｐＣＬＢＳ１を作製した（図１５）。
【０１５５】
また、プラスミドｐＣＬＥ１をＡｆｌII消化し、クレノウ酵素処理により平滑化した後、さらにＸｈｏＩ消化することによって得られる０．６ｋｂの断片を、pBluescript SK- のＳｍａＩとＸｈｏＩ間に挿入して、ｐＣＬＡＸ１を作製した。このプラスミドにおいては、０．６ｋｂ断片の平滑化されたＡｆｌII末端とベクターのＳｍａＩ末端とのライゲーションにより、ＡｆｌII切断部位が再生される。ヘルパーファージを用いてｐＣＬＸＡ１から一本鎖ＤＮＡを調製し、合成した変異用オリゴヌクレオチド5'TTG TGG AAA ACT TGC TTG GTT TGA3' を用いて、Sculptorインビトロミュータジェネシスキット(Amersham)により、変異プラスミドを作製した。得られた候補プラスミドについて０．６ｋｂ挿入断片の全塩基配列を決定し、５６番目のプロリンをコードするコドンCCA がグルタミンのコドンCAA に変異され、その他の配列に変異のないプラスミドｐＣＬＡＸ２０を得た。ｐＣＬＡＸ２０から０．６ｋｂの挿入断片をＣｌａＩ−ＡｆｌII断片として切り出し、これと、プラスミドｐＣＬＢＳ１をＣｌａＩとＡｆｌIIと消化して得られる４．４ｋｂの断片とライゲーションして、変異型Ｌ４１遺伝子を含むプラスミドｐＣＬＢＳ１０を構築した。
【０１５６】
また、プラスミドｐＣＬＢＳ１０をＢａｍＨＩとＳｐｈＩとで消化して、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理により平滑末端とした後、ＮｏｔＩリンカー(5'AGCGGCCGCT3')を挿入して、プラスミドｐＣＬＢＳ１２を構築した（図１５）。
【０１５７】
次に、作成した変異型Ｌ４１遺伝子が酵母にシクロヘキシミド耐性を付与するかどうかを調べた。ＹＥｐ型ベクターであるＹＥｐ１３Ｋ（Sone et. al. Appl. Environ. Microbiol. 54, 38-42 (1988)）のＢａｍＨＩ−ＳａｃＩサイト間に、プラスミドｐＣＬＢＳ１０から得られる２．１ｋｂの変異型Ｌ４１遺伝子を含むＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片を挿入して、プラスミドｐＹＥＣＬ１０を作製した。一方、コントロールとしてｐＣＬＢＳ１から得られる２．１ｋｂの野生型Ｌ４１遺伝子を含むＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片をＹＥｐ１３Ｋにクローン化したプラスミドｐＹＥＣＬ１を作製した。
【０１５８】
これらのプラスミドを用いてサッカロミセス酵母ＹＰＨ５００株をMethods in Yeast Genetics - A laboratory Course Manual - Rose M.D et al. P122-123 Cold Spring Harbor Laboratory Press NY (1990) 記載の酢酸リチウム法に従って形質転換した。形質転換体として、ロイシン非要求性になった株を選択した。これらの形質転換体についてシクロヘキシミドを含むＹＰＤプレートでの生育を調べたところ、ｐＹＥＣＬ１０を保持する株は、５０および１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを含むＹＰＤプレートで増殖することが示された。一方、ｐＹＥＣＬ１を保持する株は同濃度のシクロヘキシミドを含むプレート上ではまったく増殖しなかった。これによって、作成した変異型Ｌ４１遺伝子がシクロヘキシミド感受性酵母に耐性を付与することが示された。
【０１５９】
実施例１０：形質転換用プラスミドの構築とキャンディダユティリス形質転換条件の決定
始めにサッカロマイセス・セレビシエで機能することが既に明らかにされているＧ４１８耐性遺伝子（アミノグリコシドフォスフォトランスフェラーゼ（ＡＰＴ）遺伝子）の発現カセットを含むプラスミドを用いて、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を試みた。この発現カセットは、Yamanoらの記載した１．０ｋｂのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域、０．４ｋｂのホスホグリセレートキナーゼ遺伝子のターミネーター領域 （Yamano et al. J. Biotechnol. 32, 165-171(1994)）の間に、プラスミドｐＵＣ４Ｋ (Pharmacia)からＸｈｏＩ−ＰｓｔＩ断片として切り出される、１．１ｋｂＧ４１８耐性遺伝子を平滑末端化して連結して作製したものである。このプラスミドとしては、(1) 上記発現カセットをＹＥｐ型ベクターＹＥｐ１３Ｋ（Sone et.al. Appl. Env. Microbiol., 54, 38-42 (1998) ）連結したプラスミド、および(2) 上記発現カセットをプラスミドpBluescript SK- に連結したプラスミドｐＧＰＤＡＰＨ１のＢａｍＨＩサイトに実施例２に記載のキャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０株のＳａｎ３ＡＩ部分消化染色体ＤＮＡ断片（５−１０ｋｂ）を挿入したＤＮＡライブラリー、さらに(3) サッカロマイセス・セレビシエで機能するＡＲＳ配列を含むｐＧＰＤＡＰＨ１プラスミドの８種類を用いた。(3) のプラスミドは、(2) のライブラリーでサッカロマイセス・セレビシエＹＰＨ５００を形質転換して得られた酵母コロニーから単離したプラスミドである。これらのプラスミドあるいはライブラリーＤＮＡを用いて抵抗値、電圧をさまざまに組み合わせた電気パルス法、あるいは酢酸リチウム法によりキャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を試みた。しかしなから、Ｇ４１８耐性を示すコロニーは得られなかった。
【０１６０】
次に、実施例９記載のプラスミドｐＣＬＢＳ１０（図１５）のＥｃｏＲＩサイトとＸｂａＩサイトに、実施例５で示したプラスミドｐＣＲＥ２、ｐＣＲＥ３、ｐＣＲＸ１、およびｐＣＲＸ２（図６）からそれぞれＥｃｏＲＩまたはＸｂａＩにより切り出される４種類のｒＤＮＡ断片を挿入して、プラスミドｐＣＬＲＥ２、ｐＣＬＲＥ３、ｐＣＬＲＸ１、およびｐＣＬＲＸ２を構築した（図１６）。
【０１６１】
これらシクロヘキシミド耐性遺伝子を選択マーカーとするプラスミド４種類、およびプラスミドｐＣＬＢＳ１０のＢａｍＨＩ部位に、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０株の染色体ＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ部分消化ＤＮＡ断片（５−１０ｋｂ）を挿入して作製したライブラリーＤＮＡを用いて、抵抗値、電圧をさまざまに組み合わせた電気パルス法、あるいは酢酸リチウム法により、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を試みた。しかしながら、これらのプラスミドを閉環状のまま用いた場合は形質転換体は得られなかった。この形質転換実験において、弱いシクロヘキシミド耐性、またはＧ４１８耐性を示す偽耐性コロニーの出現が観察された。この偽耐性コロニーとは、低濃度のＧ４１８やシクロヘキシミドなど抗生物質を添加したプレートで形質転換体を選択する場合にしばしば観察される、選択マーカーの薬剤耐性遺伝子の存在によらず自発的に耐性を獲得するコロニーである。
【０１６２】
この実験のなかで、シクロヘキシミドを形質転換体の選択に用いる場合、ＹＰＤプレートのシクロヘキシミド濃度を４０μｇ／ｍｌとすること、そしてプレートのインキュベーション温度を３０℃ではなく２８℃とすることで、偽耐性コロニーの出現を抑えられることがわかった。そこで、プラスミドＤＮＡの染色体への組み込みを促進するために、プラスミドｐＣＬＲＥ２、ｐＣＬＲＸ１、およびｐＣＬＲＸ２について、ＤＮＡのｒＲＮＡ遺伝子領域内の制限酵素サイトのそれぞれＢｇｌII、ＥｃｏＲＶ、ＢｇｌIIでプラスミドを消化してから、形質転換実験に用いた。その結果、ＢｇｌII消化したプラスミドｐＣＬＲＥ２およびｐＣＬＲＸ２について、電気容量を２５μＦとし、抵抗値を６００オーム、電圧を５ＫＶ／ｃｍとすることにより、シクロヘキシミド耐性株を得ることができた。これらの耐性株は、プラスミドＤＮＡを添加しないコントロール実験でまれに得られる微小な偽耐性株に比べて明らかにサイズが大きく、また実施例１２に示すサザン解析により形質転換体であることが明らかにされた。
【０１６３】
次に形質転換の最適条件を見いだすために、ＢｇｌII消化したプラスミドｐＣＬＲＥ２を用いて、電気容量を２５μＦに固定し、抵抗値、電圧をさまざまに組み合わせて電気パルスの最適条件を検討した。結果は図１７に示される通りであった。図には、パルス後の生菌率と、得られたシクロヘキシミド耐性株数とが示されている。
【０１６４】
この結果から、電気容量が２５μＦで抵抗値が６００、８００、または１０００オーム、電圧が３．７５、または５ＫＶ／ｃｍの条件で、１μｇＤＮＡあたり約５００−１４００個という高い頻度で形質転換体が得られることが分かった。これらの条件下でのパルス後の生菌率は約１０−４０％であった。また、抵抗値が２００、または４００オームでも生菌率が４０％以下になる条件はあるが、高い形質転換頻度は得られなかった。抵抗値が２００、または４００オームではタイムコンスタント （電圧が最大値の約３７％にまで減衰するまでの時間）が１０ミリ秒以下であり、６００、８００、または１０００オームで、パルス後の生菌率が約１０−４０％となる条件では、タイムコンスタントが約１０から２０ミリ秒であった。以上のことから、パルス後の生菌率が約１０−４０％となり、かつタイムコンスタントが１０ミリ秒以上である電気パルスを菌に与えることが高い形質転換頻度を得るために重要であることが示唆された。
【０１６５】
また、電気パルスを加えた後、菌液に１Ｍソルビトールを含むＹＰＤ培地を加え、３０℃で振盪培養することが好ましく、培養せずに菌を直接シクロヘキシミドを含む選択プレートに塗布するとコロニーが得られなかった。
【０１６６】
また、生菌数と形質転換体数の変化を経時的に調べてそれらの増加率を比較することにより、最適培養時間を決定した。
【０１６７】
その結果、培養時間が６時間までは形質転換体の増加が生菌数の増加率を上回るが、それ以後は生菌数と形質転換体数が同じ割合で増加することが明らかにされ、培養時間は６時間が最適であることが示された。
【０１６８】
キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０株の電気パルスによる標準的な形質転換法は実施例１１に示される通りである。
【０１６９】
実施例１１：電気パルスによるキャンディダ・ユティリス株の形質転換法
ＹＰＤプレート上のコロニーを、５ｍｌのＹＰＤ液体培地で、３０℃、約８時間振盪培養した後、２００ｍｌのＹＰＤ液体培地にＯＤ600 ＝0.0024になるよう植菌して３０℃振盪培養する。約１６時間後、対数増殖期（ＯＤ600 ＝２．５）にまで菌体が増殖した後、1400 x gで５分間の遠心分離により集菌する。菌体は１００ｍｌの氷冷した滅菌水で１回、続いて４０ｍｌの氷冷した滅菌水で１回洗浄した後、氷冷した１Ｍソルビトール４０ｍｌで１回洗浄する。菌体を１０ｍｌの１Ｍソルビトールに懸濁した後、滅菌ポリプロピレンチューブに移し、再度1100 x gで５分間の遠心分離により集菌する。上清を除いた後、最終菌体液量が２．５ｍｌになるよう氷冷した１Ｍソルビトールに懸濁する。
【０１７０】
電気パルスによる形質転換実験はバイオラッド社のジーンパルサーを用いて行なう。５０μｌの菌液と５μｌのＤＮＡ試料とを混合した後、０．２ｃｍのディスポーザブルキュベットに入れ、適当な条件の電気パルスを加える。パルス後、１ｍｌの氷冷した１Ｍソルビトールを含むＹＰＤ培地を加え、滅菌ポリプロピレンチューブに移した後、３０℃で約６時間振盪培養する。培養後、菌液を４０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを含むＹＰＤ選択培地に塗布した後、プレートを２８℃で３−４日保温して、形質転換体コロニーを得る。
【０１７１】
実施例１２：サザン解析による形質転換体におけるプラスミドの検出
実施例１０で得られたシクロヘキシミド耐性株のうち７個についてサザン解析を行い、これらのクローンがプラスミドＤＮＡを保持するかどうかを調べた。染色体ＤＮＡの調製は、Methods in Yeast Genetics - A laboratory Course Manual - Rose M.D et al. P131-132 Cold Spring Harbor Laboratory Press NYに記載の方法に従った。調製したＤＮＡはＥｃｏＲＶあるいはＳａｌＩにより消化し、32Ｐ標識したＬ４１遺伝子を含む１．８ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 断片（図１２）をプローブとしてハイブリダイゼーションを行った（図１８）。
【０１７２】
この結果、ＥｃｏＲＶ消化により、内在性のＬ４１遺伝子に由来する５ｋｂのバンドのほかに、２０ｋｂ以上のバンドが検出された。ＥｃｏＲＶはｒＲＮＡ遺伝子座を切断するが、プラスミドｐＣＬＲＥ２はＥｃｏＲＶで切断されないことから、プラスミドが染色体に組み込まれたことにより、この２０ｋｂ以上のバンドが検出されたものと考えられた。また、キャンディダ・ユティリス１細胞あたりのＬ４１遺伝子のコピー数が２であることは実施例１５のサザン解析により示されているので、デンシトメーターによるスキャニングの結果から組み込まれたプラスミドＤＮＡのコピー数は、およそ、６コピー（レーン７）から１５コピー（レーン２）であることが示された。
【０１７３】
一方、ＳａｌＩはプラスミドｐＣＬＲＥ２を１箇所消化するが、染色体ＤＮＡをＳａｌＩ消化した場合、内在性のＬ４１遺伝子に由来する７．５ｋｂのバンドのほかにプラスミドｐＣＬＲＥ２の長さに相当する８．５ｋｂのバンドが検出された。これは、プラスミドが染色体に複数個タンデムに組み込まれたことにより、ＳａｌＩ消化によってとなりあうプラスミドから生じたものであると考えられた。
【０１７４】
このほか１０個以上のシクロヘキシミド耐性株についてサザン解析を行なったところ、すべてのクローンでプラスミドＤＮＡの存在が確認され、実施例１０の形質転換実験で得られたシクロヘキシミド耐性株が形質転換体であることが証明された。
【０１７５】
実施例１３：その他のキャンディダ・ユティリス株の形質転換
キャンディダ・ユティリスは株によってその染色体泳動パターンが異なり、染色体の長さの多型性を示すことが報告されている(Stoltenburg et. al. Curr. Genet. 22 441-446(1992)) 。よって、株による遺伝的性質や、それによる形質転換頻度の違いも予想されることから、ＡＴＣＣ９９５０株以外にも、ＡＴＣＣ９２２６株、ＡＴＣＣ９２５６株について実施例１１に示した電気パルス法による形質転換を試みた。
【０１７６】
パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オームとし、電圧を２．５−６．２５ＫＶ／ｃｍとして行った。プラスミドＤＮＡはＢｇｌII消化したｐＣＬＲＥ２を２μｇ用いた。
【０１７７】
その結果は表１に示される通りであった。株によって頻度の差は認められたもののいずれの株でもシクロヘキシミド耐性コロニーが得られた。
【０１７８】
そこで、得られたＡＴＣＣ９２２６株、ならびにＡＴＣＣ９２５６株由来のシクロヘキシミド耐性株それぞれ４株づつ計８株、および対照としてＡＴＣＣ９９５０株由来のシクロヘキシミド耐性株２株について、染色体ＤＮＡを調製してＢｇｌII消化した後、32Ｐ標識したＬ４１遺伝子を含む１．８ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 断片（図１２）をプローブとして、サザン解析を行った。
【０１７９】
結果は図１９に示される通りであった。いずれの株においても染色体上のＬ４１遺伝子に由来する５．４ｋｂのバンドの他に、プラスミドＤＮＡ由来のバンドが認められた。これより、これら耐性株がプラスミドＤＮＡを保持する形質転換体であることが示された。
【０１８０】
また、ＡＴＣＣ９２２６株とＡＴＣＣ９２５６株由来の形質転換体については、クローンによってプラスミドＤＮＡサイズと同じ８．４ｋｂのバンド以外に高分子側にバンドが認められた（レーン２−４、および７）。これは、プラスミド上のｒＤＮＡ配列が組み込みターゲットである染色体上のｒＤＮＡ配列と異なる場合、染色体に組み込まれたプラスミドＤＮＡ分子末端のＢｇｌII部位が欠失することがあることを示している。
【０１８１】
キャンディダ・ユティリス１細胞あたりのＬ４１遺伝子のコピー数が２であることは実施例１５のサザン解析により示されているので、５．４ｋｂのバンドが２コピーのＬ４１遺伝子に対応するものとして、バンドの強さの比較から組み込まれたプラスミドのコピー数を求めた。バンドの濃さはイメージングアナライザーＢＡＳ２０００（FUJI FILM ）を用いて測定した。
【０１８２】
その結果、プラスミドｐＣＬＲＥ２のコピー数は、ＡＴＣＣ９２５６株では７コピー（レーン１）から２５コピー（レーン３）であり、ＡＴＣＣ９２２６株では３コピー（レーン５）から１１コピー（レーン６）であった。一方、ＡＴＣＣ９９５０株ではそれぞれ１１コピー（レーン９、および１０）と計算された。
【０１８３】
以上の結果は、ＡＴＣＣ９９５０株以外のＡＴＣＣ９２２６株、およびＡＴＣＣ９２５６株についても、シクロヘキシミド耐性Ｌ４１遺伝子を用いて形質転換体が取得可能であることを示し、プラスミドは複数個同時に染色体に組み込まれたことが示された。
【０１８４】
実施例１４：酢酸リチウム法、およびその変法によるキャンディダ・ユティリスの形質転換
酢酸リチウム法（Ito et al. J. Bacteriol. 153, 163-168 (1983)）はその簡便さから広くサッカロミセス属酵母の形質転換に用いられている。そこで、ＢｇｌII消化により直鎖状にしたプラスミドｐＣＬＲＥ２を用いて、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０株を酢酸リチウム法、およびエタノールまたはＤＭＳＯを添加する酢酸リチウム法変法(Soni et. al. Current Genet.1993 24, 455-459) に従って形質転換することを試みた。酢酸リチウム法変法ではエタノールはヒートショック開始１０分後に終濃度１０％になるように菌液に添加し、さらに１０分間保温した。また、ＤＭＳＯはポリエチレングリコール液と同時に終濃度１０％になるように菌液に添加した。処理した菌体はＹＰＤ溶液に懸濁して、３０℃４時間の振盪培養を行なってからシクロヘキシミドを含む選択プレートに塗布し、２８℃で６日間保温した。
【０１８５】
その結果、エタノールＤＮＡを添加するリチウム法変法によりプラスミドＤＮＡ ２μｇＤＮＡについてシクロヘキシミド耐性株が５個得られた。このうち２つのクローンについて染色体ＤＮＡを調製して実施例１３記載の方法でサザン解析を行ったところ、プラスミド由来のバンドが検出され、これらが形質転換体であることが示された。この結果から、形質転換頻度は電気パルス法に比較してかなり低いが、酢酸リチウムによって処理されたキャンディダユティリスもＤＮＡを取り込むことが可能であることが示された。
【０１８６】
本実験ではSoniらの報告にしたがって実験を行なったが、さらに処理条件を検討することにより形質転換頻度を高めることも可能である。
【０１８７】
実施例１５：異なるｒＲＮＡ遺伝子領域をターゲットとした形質転換
１）プラスミドの構築
実施例９に記載のプラスミドｐＣＬＢＳ１２（図１５）のＥｃｏＲＩサイトに、ｐＣＲＥ２（図６）から得られる３．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を挿入することによりｐＣＬＲＥ４を、ｐＣＲＥ３（図６）から得られる２．４ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を挿入することによりｐＣＬＲＥ５をそれぞれ構築した。
【０１８８】
また、７．５ｋｂのｒＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ断片がクローン化されたｐＣＲＥ１（図６）から切り出される３ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片と、４．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片とを、pBluescript SK- のＥｃｏＲＩとＸｂａＩ間に連結した後、それぞれのプラスミドのＸｂａＩサイトをＥｃｏＲＩリンカー(5'CCAAGCTTGG3')の挿入によりＥｃｏＲＩサイトに変換して、プラスミドｐＣＲＥ６とｐＣＲＥ７とを構築した。これらのプラスミドｐＣＲＥ６とｐＣＲＥ７とからそれそれ切り出した３ｋｂと４．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をプラスミドｐＣＬＢＳ１２のＥｃｏＲＩサイトに挿入することにより、プラスミドｐＣＬＲＥ６とｐＣＬＲＥ７を構築した。
【０１８９】
構築したプラスミドｐＣＬＲＥ４、ｐＣＬＲＥ５、ｐＣＬＲＥ６、およびｐＣＬＲＥ７の構造は図２０に示される通りである。
【０１９０】
２）形質転換
作製したプラスミドｐＣＬＲＥ４、ｐＣＬＲＥ５、ｐＣＬＲＥ６、およびｐＣＬＲＥ７は制限酵素で消化して直鎖状ＤＮＡとした後、各１μｇのＤＮＡを用いて実施例１１に示した電気パルス法によりＡＴＣＣ９９５０株を形質転換した。パルス条件は、電気容量を２５μＦ、電圧を５ＫＶ／ｃｍ、抵抗値を８００オームとし、パルス後の培養時間は１８時間とした。プラスミドの消化に用いた制限酵素はｒＲＮＡ遺伝子断片内にその切断サイトがある酵素で、ｐＣＬＲＥ４はＢｇｌII、ｐＣＬＲＥ５はＢａｍＨＩまたはＸｂａＩ、ｐＣＬＲＥ６はＢａｍＨＩ、そしてｐＣＬＲＥ７はＡｐａＩ、またはＥｃｏＲＶでそれぞれ消化した。プラスミドｐＣＬＲＥ４についてはＬ４１遺伝子内のＣｌａＩサイトにおいても消化して、組み込みのターゲット遺伝子の違いによる形質転換頻度の差を比較した。
実験は２回行った。その結果は、表２に示される通りであった。
【０１９１】
プラスミドｐＣＬＲＥ４、ｐＣＬＲＥ６、およびｐＣＬＲＥ７のｒＲＮＡ遺伝子断片内で消化した場合はいずれも１μｇＤＮＡあたり数百個と、高い形質転換頻度を示した。一方、プラスミドｐＣＬＲＥ５は、ＢａｍＨＩ、またはＸｂａＩどちらで消化した場合も、他のプラスミドを用いた場合に比較して形質転換頻度は非常に低かった。この結果は、ｒＲＮＡ遺伝子領域でも形質転換のターゲットとして用いる断片により、形質転換頻度が大きく異なることを示している。
【０１９２】
また、プラスミドｐＣＬＲＥ４について、Ｌ４１遺伝子内のＣｌａＩサイトで消化した場合、その形質転換頻度はｒＲＮＡ遺伝子内のＢｇｌIIサイトで消化した場合に比較して、約１０分の１から５０分の１程度であった。また、以下に記載したサザン解析により、プラスミド分子はＣｌａＩサイトで消化した場合にはＬ４１遺伝子座に、ＢｇｌIIサイトで消化した場合にはｒＲＮＡ遺伝子座に、それぞれ組み込まれたことが示された。
【０１９３】
以上より、染色体でのコピー数が多いｒＲＮＡ遺伝子をターゲット配列として用いることによって、高い形質転換頻度が得られることが明らかとなった。
【０１９４】
３）サザン解析
ＢｇｌIIまたはＣｌａＩ消化したｐＣＬＲＥ４、ＸｂａＩ消化したｐＣＬＲＥ５、ＢａｍＨＩ消化したｐＣＬＲＥ６、そしてＡｐａＩ消化したｐＣＬＲＥ７を用いて得られたシクロヘキシミド耐性株それぞれ４株ずつについて、染色体ＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡはＢｇｌII、またはＢｇｌIIおよびＮｏｔＩにより消化し、32Ｐ標識したＬ４１遺伝子を含む１．８ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 断片（図１２）をプローブとして、サザン解析を行った（図２１）。
【０１９５】
プラスミドｐＣＬＲＥ４が組み込まれた株では、ＢｇｌII消化によって、内在性のＬ４１遺伝子に由来する５．４ｋｂのバンドのほかに、プラスミドＤＮＡ分子内ＢｇｌIIサイトでの切断によりプラスミドＤＮＡと同じサイズの８．４ｋｂのバンドが認められた（図２１ （１）、レーン１−８）。また、ＣｌａＩ消化したプラスミドが組み込まれた株の場合は、これら２つのバンドの他に、７．４ｋｂと６．４ｋｂのバンドが認められた（レーン１−４）。これら２つのバンドは、染色体上のＬ４１遺伝子のうち１個がプラスミドの挿入により分断されたことにより、組み込まれたプラスミド分子の両末端に位置するプラスミド分子内のＢｇｌIIサイトとＬ４１遺伝子領域内のＢｇｌIIサイトとから生ずるものであることから、プラスミド分子が相同組換えによりＬ４１遺伝子座に組み込まれたことが示された。このことから、プラスミド分子は、ＣｌａＩサイトで切断された場合にはＬ４１遺伝子座に、ＢｇｌIIサイトで切断された場合にはｒＲＮＡ遺伝子座に、それぞれ組み込まれたことが示された。これにより、切断サイトを変更することでプラスミドの組み込み場所をコントロールすることが可能であることが示された。また、レーン１−４では５．４ｋｂ、７．４ｋｂ、および６．４ｋｂのバンドの濃さがほぼ同じであったことから、染色体にはＬ４１遺伝子が２コピー存在することが明らかにされた。
【０１９６】
プラスミドｐＣＬＲＥ５、ｐＣＬＲＥ６、およびｐＣＬＲＥ７が組み込まれた株では、ＢｇｌII＋ＮｏｔＩ消化により、内在性のＬ４１遺伝子に由来する５．４ｋｂのバンドのほかに、染色体に組み込まれたプラスミド由来のいくつかのバンドが認められた（図２１（２））。このうちサイズが各プラスミドと同一であるバンド、すなわちｐＣＬＲＥ５では７．３ｋｂ（レーン１−４）、ｐＣＬＲＥ６では８．０ｋｂ（レーン５−８）、そしてｐＣＬＲＥ７では９．４ｋｂのバンド（レーン９−１２）は、プラスミドが染色体にタンデムに組み込まれることにより、プラスミド内に１箇所サイトがあるＮｏｔＩ消化によって隣り合うプラスミドから生じたバンドである。また、それ以外にもｐＣＬＲＥ５では７ｋｂ（レーン１−４）、ｐＣＬＲＥ６では６．９ｋｂ（レーン５−８）、そしてｐＣＬＲＥ７では１１ｋｂ （レーン９−１２）のバンドが認められた。これらのサイズはプラスミドＤＮＡがｒＲＮＡ遺伝子座に相同組換えにより組み込まれた場合にＢｇｌII＋ＮｏｔＩ消化によりｒＲＮＡ遺伝子座内のＢｇｌIIサイトとプラスミドＤＮＡ内のＮｏｔＩサイトとから得られる断片の長さに一致する。これより、プラスミドＤＮＡが切断された部位で相同組換えにより染色体に組み込まれたことが示された。
【０１９７】
図２１（１）のレーン１−４の５．４ｋｂのバンドが１コピーのＬ４１遺伝子、レーン５−８および図２１ （２）のレーン１−１２の５．４ｋｂバンドが２コピーのＬ４１遺伝子に対応するものとして、各バンドの濃さの比較から組み込まれたプラスミドのコピー数を求めた。バンドの濃さはイメージングアナライザーＢＡＳ２０００（FUJI FILM ）を用いて測定した。
【０１９８】
その結果、プラスミドｐＣＬＲＥ４は、Ｌ４１遺伝子座には３コピー（レーン４）から５コピー（レーン１、および３）、ｒＲＮＡ遺伝子座には２コピー（レーン８）から８コピー（レーン５）挿入されたことが示された。この結果から、プラスミドＤＮＡがｒＲＮＡ遺伝子座に組み込まれた場合、組み込まれたプラスミド分子のコピー数が高い株が選択される傾向が認められた。これは、実施例１２においてプラスミドｐＣＬＲＥ２がｒＲＮＡ遺伝子座に組み込まれた株ではプラスミドＤＮＡのコピー数がおよそ６コピーから１５コピーであるが、実施例１６のＵＲＡ３遺伝子座へ組み込まれたプラスミドＤＮＡの場合はコピー数がおよそ３コピーから４コピーであったことからも示唆される。
【０１９９】
また、プラスミドｐＣＬＲＥ５、ｐＣＬＲＥ６、およびｐＣＬＲＥ７についてはそれぞれ３コピー（図２１ （２）、レーン４）から５コピー（レーン２）、３コピー（レーン８）から６コピー（レーン５、および６）、３コピー（レーン１２）から５コピー（レーン９）組み込まれたことが示された。
【０２００】
実施例１６：ＵＲＡ３遺伝子座へのプラスミドの組み込み
プラスミドｐＣＬＢＳ１２（図１５）のＥｃｏＲＩサイトに、ＵＲＡ３遺伝子を含む５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片（図７）を挿入して、プラスミドｐＣＬＵＲＡ１を構築した。このプラスミドをＵＲＡ３遺伝子座内のＰｓｔＩサイトで切断し、このプラスミドを用いて実施例１１記載の電気パルス法によりＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を試みた。パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値を８００オーム、電圧を５ＫＶ／ｃｍとして行った。これにより１μｇＤＮＡあたりシクロヘキシミド耐性コロニーが４０個得られた。
【０２０１】
得られたシクロヘキシミド耐性株４株について染色体ＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡはＢｇｌII、またはＳａｌＩ＋ＮｏｔＩにより消化し、サザン解析に供した。ＢｇｌII消化したＤＮＡについてはＬ４１遺伝子を含む１．８ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 断片（図１２）を、ＳａｌＩ＋ＮｏｔＩ消化したＤＮＡについてはＵＲＡ３遺伝子を含む２．３ｋｂのＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩ断片（図８）を、それぞれ32Ｐ標識してプローブとした。
【０２０２】
その結果は、図２２に示される通りであった。
【０２０３】
ＳａｌＩ＋ＮｏｔＩ消化したＤＮＡについてＵＲＡ３遺伝子をプローブとした場合、親株のＡＴＣＣ９９５０株では内在性ＵＲＡ３遺伝子由来の１３Ｋｂのバンドが認められた（図２２（１）、レーン１）。一方、耐性株ではこの１３ｋｂのバンドのほかに、タンデムに複数個組み込まれたプラスミドからＮｏｔＩ消化により生じる１０ｋｂのバンドと、染色体上のＵＲＡ３遺伝子のうち１個がプラスミドの挿入により分断されて生じる８．４ｋｂと１４ｋｂの２本のバンドが検出された（レーン２−５）。これら２本のバンドは、組み込まれたプラスミド分子の両末端に位置するプラスミド分子内のＮｏｔＩサイトとＵＲＡ３遺伝子領域内のＳａｌＩサイトとから生ずるものであることから、プラスミド分子が相同組換えによりＵＲＡ３遺伝子座に組み込まれたことが示された。
【０２０４】
また、形質転換体では内在性ＵＲＡ３遺伝子由来の１３ｋｂのバンドと染色体に組み込まれたプラスミド分子の両末端のプラスミド由来の８．４ｋｂと１４ｋｂのバンドの濃さがほぼ一致することから、ＵＲＡ３遺伝子もＬ４１遺伝子同様、細胞あたり２コピー存在し、形質転換体ではそのうち１コピーがプラスミドＤＮＡの挿入により分断されたことが示された。また、これらの４本のバンド（１４ｋｂ、１３ｋｂ、１０ｋｂ、および８．４ｋｂ）の濃さの比較から、組み込まれたプラスミドのコピー数は３コピー（レーン３、および５）から４コピー（レーン２、および４）であることが示された。
【０２０５】
また、ＢｇｌII消化したＤＮＡについてＬ４１遺伝子をプローブとした場合、親株のＡＴＣＣ９９５０株では内在性のＬ４１遺伝子に由来する５．４ｋｂのバンドが認められたが（図２２（２）、レーン１）、耐性株ではこのバンドのほかにプラスミドＤＮＡと同じサイズの１０ｋｂのバンドが認められた（レーン２−５）。
【０２０６】
実施例１７：キャンディダ・ユティリスでの異種遺伝子（グルコアミラーゼ遺伝子）の発現
（１）グルコアミラーゼ遺伝子（ＳＴＡ１遺伝子）発現用プラスミドの構築
ＳＴＡ１遺伝子発現用プラスミドを図２３に示されるように構築した。
【０２０７】
まず、ＳＴＡ１遺伝子をサッカロマイセス・ディアスタティカス５１０６−９Ａ（ａ ｌｅｕ２，ａｒｇ４，ＳＴＡ１）(Yamashita and Fukui Agric.Biol.Chem. 47，2689-2692)の染色体ＤＮＡライブラリーよりクローニングした。これは、以下に示した操作により行った。
【０２０８】
５１０６−９Ａ菌体から染色体ＤＮＡを調製してＳａｕ３ＡＩにより部分消化した後、アガロースゲル電気泳動により約２０−３０ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片と、ＢａｍＨＩ消化した後脱リン酸化したλファージベクターＥＭＢＬ３（Stratagene Cloning Systems）とを、Ｔ４リガーゼにより連結した。それを、GigapackII Gold Packaging Extract （StratageneCloning Systems ）を用いて、インビトロパッケージングし、染色体ＤＮＡの遺伝子ＤＮＡライブラリーを構築した。
【０２０９】
発表済みのＳＴＡ１遺伝子の塩基配列(Yamashita et. al. J Bacteriol. 161, 567-573 1985)に基づいて合成した２種類のオリゴヌクレオチド5'ACCACTATTACCACTACGGTTTGCTCTACA3'（配列番号：１９)、および5'GACACATCTCTGAGCAGCATGACTTGGTTG3'（配列番号２０）をＴ４キナーゼにより32Ｐ末端標識したものをプローブとして用いて、この染色体ＤＮＡライブラリー約20,000プラークをスクリーニングした。この結果、２種のプローブどちらにもポジティブシグナルを与えるクローン１個を得た。
【０２１０】
このＳＴＡ１遺伝子を含むファージクローンより、ＳＴＡ１遺伝子を含む４ｋｂのＢｇｌII−ＨｐａＩ断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩとＨｉｎｃII間にクローン化して、プラスミドｐＵＳＴＡ１（図２３）を構築した。
【０２１１】
続いて、ｐＵＳＴＡ１をＳＴＡ１遺伝子の開始コドンATG の５bp下流に存在するＳｔｕＩサイトで切断した後、ＸｂａＩサイトおよび開始コドンを含む合成アダプター（配列番号：２１）：5'-CTAGATGGTAGG-3' 3'-TACCATCC-5' を付加した。その後、さらにＳａｌＩで部分消化することにより、ＳＴＡ１遺伝子を２．７ｋｂのＸｂａＩ−ＳａｌＩ断片として得た。
【０２１２】
次に、ｐＵＣ１２をＰｓｔＩとＨｉｎｄIII で消化した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、ＢｇｌIIリンカーを付加して構築したプラスミドｐＵＣ１２ＢｇｌIIの、ＸｂａＩとＳａｌＩと間にＳＴＡ１遺伝子を含む２．７ｋｂのＸｂａＩ−ＳａｌＩ断片を挿入して、プラスミドｐＵＳＴＡ２を構築した。
【０２１３】
このｐＵＳＴＡ２から２．７ｋｂのＸｂａＩ−ＢｇｌII断片を切り出し、これを、発現ベクターｐＰＧＫＰＴ４のＸｂａＩとＢａｍＨＩサイト間に挿入して、プラスミドｐＧＫＳＴＡ１を構築した。
【０２１４】
さらにｐＧＫＳＴＡ１からＰＧＫ遺伝子プロモーターと、ＳＴＡ１遺伝子と、さらにＰＧＫ遺伝子ターミネーターとを含む４．９ｋｂのＮｏｔＩ断片を切り出し、この断片を、プラスミドｐＣＬＢＳ１２のＮｏｔＩサイトに挿入してプラスミドｐＣＬＳＴＡ１を、プラスミドｐＣＬＲＥ４のＮｏｔＩサイトに挿入してプラスミドｐＣＬＲＳＴＡ１を、それぞれ構築した。
【０２１５】
（２）キャンディダ・ユティリスの形質転換とグルコアミラーゼ発現
ＢｇｌII消化したプラスミドｐＣＬＲＳＴＡ１を用いて、ＡＴＣＣ９９５０株、ＡＴＣＣ９２２６株、およびＡＴＣＣ９２５６株の形質転換を、実施例１１記載の電気パルス法で行った。パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電圧を３．７５ＫＶ／ｃｍ、または６．２５ＫＶ／ｃｍとして行った。
【０２１６】
株によって頻度の差は認められたもののいずれの株でもシクロヘキシミド耐性コロニーが得られた。
【０２１７】
このうちそれぞれ２株ずつについて基質であるスターチが入ったプレート（３％ Soluble starch (Katayama)、２％ polypeptone 、１％ Yeast extract、３．３×１０-3％ Bromocresol purple、２％ Bacto agar）上でグルコアミラーゼ活性を調べた。その結果、３種の株由来の形質転換体すべてについて分泌されたグルコアミラーゼによるハローが観察され、遺伝子の発現が確認された。また、ＡｆｌII消化したプラスミドｐＣＬＳＴＡ１を用いてＡＴＣＣ９９５０株を形質転換した。この形質転換体について、Ｌ４１遺伝子座に組み込まれたグルコアミラーゼ遺伝子の発現も調べたところ、同様にハローの形成が確認された。
【０２１８】
さらにこれら形質転換体のグルコアミラーゼ活性を測定した。このため、菌体をＹＰＤ液体培地で一晩培養して、その上清を粗酵素液とした。反応は、４００μｌの粗酵素液と、０．５％の可溶性でんぷん、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を含む５００μｌの反応液で、５０℃、２０分間行った。反応後１００℃、５分間の熱処理で酵素を失活した後、遊離したグルコース濃度を市販のキット（グルコースB-テスト（和光純薬））を用いて測定した。
【０２１９】
グルコアミラーゼ活性は当反応条件下で遊離するグルコースの量が１００μｇである時、その活性を１ユニットとし表した。培養上清１ｍｌあたりの活性値は表３に示される通りであった。
【０２２０】
この結果から、調べたキャンディダユティリスＡＴＣＣ９９５０株、ＡＴＣＣ９２２６株、およびＡＴＣＣ９２５６株において、サッカロマイセス・ディアスタティカス由来の異種蛋白質であるグルコアミラーゼの分泌シグナル配列が認識され、グルコアミラーゼが培地中に分泌されることが明らかにされた。
【０２２１】
さらに、ＢｇｌII消化したプラスミドｐＣＬＳＴＡ１、またはＡｆｌII消化したプラスミドｐＣＬＳＴＡ１で形質転換したＡＴＣＣ９９５０株をそれぞれ２株ずつ４０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドと５％グルコースを含むＹＰＤ液体培地で３０℃４日間培養した。その後、それらの菌体培養液１０μｌを４−２０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、培養液中の蛋白質を分析した（図２４）。ゲルはクマシーブリリアントブルーにより染色した。また、対照としてＢｇｌII消化したプラスミドｐＣＬＲＥ２で形質転換した株の培養液を分析した（レーン１）。その結果、いずれの培養液においてもグルコアミラーゼに相当する約１００ｋＤａの蛋白質が認められ、蛋白量は、染色されたバンドの濃さから約２〜５μｇに相当すると判断された。このことから、グルコアミラーゼ遺伝子が高いレベルで発現し、培養液中に分泌されたことが示された。以上の結果から、分泌蛋白質生産用の好適な宿主／ベクター系としてキャンディダ・ユティリスが使用できることが明らかとなった。
【０２２２】
実施例１８：キャンディダユティリスでの異種遺伝子（ｌａｃＺ遺伝子）の発現
（１）ｌａｃＺ遺伝子発現用プラスミドの構築
ｌａｃＺ遺伝子発現用プラスミドを図２５に示されるように構築した。
【０２２３】
まず、プラスミドｐＭＣ１８７１（Pharmacia ）より、βガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子を３．１ｋｂのＢａｍＨＩ断片として切り出した。この断片を、プラスミドＹＥｐ１３Ｋ（ Sone et. al. Appl. Environ. Microbiol. 54, 38-42 (1988)）のＢｇｌIIサイトに連結し、遺伝子の5'側にＨｉｎｄIII サイトのあるプラスミドｐＺ４を選択した。
【０２２４】
このプラスミドから開始コドンATG を有するｌａｃＺ遺伝子を、３．１ｋｂのＨｉｎｄIII −ＸｈｏI 断片として切り出した。この断片を、pBluescript SK- のＨｉｎｄIII とＸｈｏＩサイト間に連結して、プラスミドｐＬＡＣＺ１を構築した。
【０２２５】
このプラスミドをＨｉｎｄIII ＋ＸｂａＩ消化し、クレノウ処理した後、再環状化してプラスミドｐＬＡＣＺ２を構築した。
【０２２６】
さらに、このプラスミドからｌａｃＺ遺伝子を３．１ｋｂのＸｂａＩ−ＫｐｎＩ断片として切り出し、これをプラスミドｐＰＧＫＰＴ５（図４）のＸｂａＩとＫｐｎＩ間に連結して、プラスミドｐＧＫＬＡＣ１を構築した。
【０２２７】
さらにｐＧＫＬＡＣ１からＰＧＫ遺伝子プロモーターと、ｌａｃＺ遺伝子と、さらにＰＧＫ遺伝子ターミネーターとを含む５．４ｋｂのＮｏｔＩ断片を切り出し、これをプラスミドｐＣＬＢＳ１２のＮｏｔＩサイトに挿入して、プラスミドｐＣＬＬＡＣ１を、またプラスミドｐＣＬＲＥ４のＮｏｔＩサイトに挿入してプラスミドｐＣＬＲＬＡＣ１を、それぞれ構築した。
【０２２８】
（２）キャンディダ・ユティリスの形質転換とβガラクトシダーゼ活性確認
ＢｇｌII消化したプラスミドｐＣＬＲＬＡＣ１、またはＡｆｌII消化したプラスミドｐＣＬＬＡＣ１を用いて実施例１１記載の電気パルス法によりＡＴＣＣ９９５０株を形質転換した。形質転換されたＡＴＣＣ９９５０株，それぞれ２株を、５ｍｌのＹＰＤ液体培地で６時間、対数増殖期（ＯＤ600 が約２から３）まで培養した。βガラクトシダーゼ活性はMethods in Yeast Genetics - A laboratory Course Manual - Rose M.D et al. P155-159 Cold Spring Harbor Laboratory Press NY (1990) に記載の方法に従って測定した。すなわち、集菌した菌体を１ｍｌのＺバッファーに懸濁した後、クロロホルム液を３滴、０．１％ＳＤＳを２滴加えて、１０秒ボルテックスした。２８℃で５分間インキュベートした後、０．２ｍｌのＯＮＰＧ液を加え、さらに１０分間インキュベートした。その後、０．５ｍｌのＮａ2 ＣＯ3 液を添加して反応を停止した。ＯＤ420 を測定した後、計算式に従ってβガラクトシダーゼ活性を求めた。βガラクトシダーゼ活性は２８℃で１分あたり１ｎｍｏｌのオルトニトロフェノールを生成する活性を１ユニットとした。得られた菌体１ＯＤ600 当たりの活性値は表４に示される通りであった。
【０２２９】
その結果、プラスミドｐＣＬＲＬＡＣ１およびプラスミドｐＣＬＬＡＣ１のいずれで形質転換されたＡＴＣＣ９９５０株もそれぞれ活性を示し、大腸菌由来のｌａｃＺ遺伝子がキャンディダユティリスで発現して、活性のあるβガラクトシダーゼが生産されることが示された。キャンディダ・マルトーサやアルビカンスなど一部のキャンディダ属酵母では、ロイシンコドンのCUG がセリンに翻訳されるため(Ohama et. al. Nucleic Acids Res. 21 4039 - 4045 1993)、大腸菌由来ｌａｃＺ遺伝子が、活性をもつβガラクトシダーゼに翻訳されないことが知られている（Sugiyama et.al. Yeast 11, 43-52 (1995)）。本実施例では、キャンディダ・ユティリスで活性のある大腸菌βガラクトシダーゼが生産されることが明らかにされ、また実施例１７で示したようにグルコアミラーゼが高生産されることからも、キャンディダ・ユティリスが異種遺伝子発現用の宿主として使用できることが示されたと考える。
【０２３０】
実施例１９：キャンディダ・ユティリスでの異種遺伝子（ＡＰＴ遺伝子）の発現
（１）ＡＰＴ遺伝子発現用プラスミドの構築
ＡＰＴ遺伝子発現用プラスミドを図２６に示されるように構築した。
【０２３１】
まず、トランスポゾンＴｎ９０３由来のアミノグリコシドフォスフォトランスフェラーゼ（ＡＰＴ遺伝子) を含むプラスミドｐＵＣ４Ｋ（Pharmacia ）から１．１ｋｂのＸｈｏＩ−ＰｓｔＩ断片を切り出し、これをｐＵＣ１９のＳａｌＩとＰｓｔＩ間に挿入して、プラスミドｐＡＰＨ１を構築した。
【０２３２】
続いてｐＡＰＨ１をＰｓｔＩ消化した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端とし、ＢｇｌIIリンカー(5'CAGATCTG3')を挿入して、プラスミドｐＡＰＨ２を構築した。
【０２３３】
さらに、ｐＡＰＨ２よりＡＰＴ遺伝子を１．１ｋｂのＸｂａＩ−ＢｇｌII断片として切り出し、これを発現ベクターｐＰＧＫＰＴ４（図４）のＸｂａＩとＢａｍＨＩサイト間に挿入して、プラスミドｐＧＫＡＰＨ１を構築した。
【０２３４】
さらにｐＧＫＡＰＨ１からＰＧＫ遺伝子プロモーターと、ＡＰＴ遺伝子、そしてＰＧＫ遺伝子ターミネーターとを含む３．３ｋｂのＮｏｔＩ断片を切り出し、これをプラスミドｐＣＬＢＳ１２のＮｏｔＩサイトに挿入して、プラスミドｐＣＬＡＰＨ１を、またプラスミドｐＣＬＲＥ４のＮｏｔＩサイトに挿入してプラスミドｐＣＬＲＡＰＨ１を、それぞれ構築した。
【０２３５】
（２）キャンディダ・ユティリスの形質転換とＧ４１８耐性の確認
ＢｇｌII消化したプラスミドｐＣＬＲＡＰＨ１を用いて、ＡＴＣＣ９９５０株、ＡＴＣＣ９２２６株、およびＡＴＣＣ９２５６株の形質転換を試みた。形質転換は実施例１１記載の電気パルス法で行った。パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電圧を３．７５ＫＶ／ｃｍ、または６．２５ＫＶ／ｃｍとして行った。
【０２３６】
その結果、株によって頻度の差は認められたもののいずれの株でもシクロヘキシミド耐性コロニーが得られた。このうちそれぞれ２株ずつについて、異なる濃度のＧ４１８を含むＹＰＤプレート上で菌の増殖を調べた。その結果、３種のキャンディダ・ユティリス株すべてについて形質転換体の増殖が確認され、これらの形質転換体においてＡＰＴ遺伝子が発現したことが確認された。
【０２３７】
また、ＡｆｌII消化したプラスミドｐＣＬＡＰＨ１を用いてＡＴＣＣ９９５０株を形質転換し、Ｌ４１遺伝子座に組み込まれた遺伝子の発現についても調べた。その結果、同様に形質転換体の増殖が確認され、Ｌ４１遺伝子座に組み込まれたＡＰＴ遺伝子についてもその発現が確認された。
【０２３８】
（３）組み込まれたプラスミドの安定性
ＢｇｌII消化されたプラスミドｐＣＬＲＡＰＨ１、またはＡｆｌII消化されたプラスミドｐＣＬＡＰＨ１で形質転換されたＡＴＣＣ９９５０株、それぞれ２株ずつについて、組み込まれたプラスミドＤＮＡの安定性を次のように調べた。まず、形質転換体を４０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを含む５ｍｌのＹＰＤ液体培地で定常期まで培養し、このときの世代数を０とした。次に、このうち５μｌを５ｍｌのＹＰＤ液体培地に植菌して定常期まで培養し、このときの世代数を１０と計算した。この操作を繰り返して２０世代まで菌を培養した。プラスミド保持率は、菌液を希釈後、ＹＰＤプレートと４０μｇ／mlのシクロヘキシミドを含むＹＰＤプレートとにそれぞれ塗布して、３０℃で２日培養後、生じたコロニー数を調べた。
結果は表５に示される通りであった。
【０２３９】
この結果から、ｒＲＮＡ遺伝子座、Ｌ４１遺伝子座に挿入されたＤＮＡ断片は安定であることが確認された。
【０２４０】
実施例２０：Ｇ４１８耐性を選択マーカーとしたキャンディダ・ユティリス形質転換体の取得
プラスミドｐＣＬＲＡＰＨ１は、形質転換体選択マーカーとしてシクロヘキシミド耐性を付与する変異型Ｌ４１遺伝子と、Ｇ４１８耐性を付与するＡＰＴ遺伝子を含んでいる。実施例１９に記載した実験によりＡＰＴ遺伝子がＰＧＫ遺伝子プロモーターにより発現することが確認されたので、形質転換体のＧ４１８耐性による直接選択を試みた。
【０２４１】
まず、プラスミドｐＣＬＲＡＰＨ１をＢｇｌIIにより消化し、直鎖状にした。これを用いて、実施例１１記載の電気パルス法によって、ＡＴＣＣ９９５０株を形質転換した。パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、または８００オーム、電圧を５ＫＶ／ｃｍとして行った。菌体は１Ｍソルビトールを含むＹＰＤ培地で６時間培養した後、４０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを含むＹＰＤプレートと、１５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤプレートとにそれぞれ塗布した。
結果は表６に示される通りであった。
【０２４２】
この結果より、Ｇ４１８耐性で選択されるコロニーの数がシクロヘキシミド耐性コロニー数に比較して１０倍程度多いことが分かる。
【０２４３】
Ｇ４１８耐性で選択した４個のコロニーと、シクロヘキシミド耐性で選択した４個のコロニーとについて、染色体ＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡはＢｇｌII＋ＮｏｔＩにより消化した後、32Ｐ標識したＬ４１遺伝子を含む１．８ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 断片（図１２）をプローブとして、サザン解析を行った（図２７）。その結果、内在性Ｌ４１遺伝子に由来する５．４ｋｂのバンドのほかに、プラスミドに由来する４．４ｋｂのバンドが認められた。イメージングアナライザーＢＡＳ２０００（FUJI FILM ）を用いてバンドの強度を測定し、プラスミド由来のバンドと内在性Ｌ４１遺伝子（２コピー／細胞）のバンドの比較から、組み込まれたプラスミドのコピー数を求めた。その結果、シクロヘキシミド耐性で選択された株ではプラスミドが４（レーン２）から７コピー（レーン５）存在することが示された。一方、Ｇ４１８耐性で選択した株では４株ともコピー数が１ （レーン６−９）であると計算された。この結果より、変異型Ｌ４１遺伝子を選択マーカーとして形質転換体を選択することによって形質転換の頻度は低くなるものの、プラスミドが複数個組み込まれた株を容易に取得できることが示された。
【０２４４】
また、ｐＧＫＡＰＨ１をＮｏｔＩ消化して、二つの断片に分けた。すなわち、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、ＡＰＴ遺伝子、およびＰＧＫ遺伝子ターミネーターを含む断片と、ベクター断片とに分けた。その後、これらをＡＴＣＣ９９５０株の形質転換に用いた。パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電圧を５ＫＶ／ｃｍとして行った。２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤプレートで形質転換体を選択したところ、１μｇＤＮＡあたり１５６個の形質転換体が得られた。この結果は、キャンディダ．ユティリス酵母においては、ＢｇｌII消化により直鎖状にしたプラスミドｐＣＬＲＡＰＨ１による遺伝子挿入型の形質転換に加え、遺伝子置換型の形質転換も起きることを示す。また、その形質転換頻度も比較的高く、遺伝子置換型の形質転換も効率良く起きることが明らかにされた。
【０２４５】
実施例２１：ＰＧＫ遺伝子プロモーターの短縮化と最小機能領域の同定
実施例１７−２０で使用したＰＧＫ遺伝子プロモーターを短縮化し、プロモーターの最小機能領域の同定を試みた。
【０２４６】
実施例１９記載のプラスミドｐＧＫＡＰＨ１のＰＧＫ遺伝子プロモーター断片内部に存在する制限酵素サイトを利用して、長さの異なるＰＧＫ遺伝子プロモーターとＡＰＴ遺伝子、さらにＰＧＫ遺伝子ターミネーターとを含む断片を５種類取得した。すなわちｐＧＫＡＰＨ１をＮｏｔＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩ＋ＳａｃＩ、またはＰｓｔＩ＋ＳａｃＩ消化して４種類の断片を得た。また、ｐＧＫＡＰＨ１をＳｐｈＩ消化してからＴ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理によって平滑末端とし、さらにＢａｍＨＩリンカー（5´CCGGATCCGG3´：配列番号：２２）を付加した後、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩ消化することにより、さらに１種類の断片を得た。
【０２４７】
また、実施例５記載のプラスミドｐＣＲＥ２をＨｉｎｄIII 消化して得られる０．７ｋｂと５．８ｋｂの断片のうち、５．８ｋｂの断片をライゲーションにより再環状化して、プラスミドｐＣＲＥ８を構築した（図２８）。このプラスミドｐＣＲＥ８をＮｏｔＩ、ＢａｍＨＩ＋ＮｏｔＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩ＋ＳａｃＩ、またはＰｓｔＩ＋ＳａｃＩ消化したのち、それぞれと上記の各種断片をライゲーションして、プラスミドｐＣＲＡＰＨ２、ｐＣＲＡＰＨ３、ｐＣＲＡＰＨ４、ｐＣＲＡＰＨ５、およびｐＣＲＡＰＨ６を構築した（図２８）。それぞれのプラスミドに含まれるＰＧＫ遺伝子プロモーター断片の長さは、ｐＣＲＡＰＨ２では１．３５ｋｂ、ｐＣＲＡＰＨ３では０．８３ｋｂ、ｐＣＲＡＰＨ４では０．４６ｋｂ、ｐＣＲＡＰＨ５では０．４０ｋｂ、そしてｐＣＲＡＰＨ６では０．１６ｋｂであった。
【０２４８】
構築したプラスミドｐＣＲＡＰＨ２、３、４、５、および６をＢｇｌII消化により直鎖状にした後、ＡＴＣＣ９９５０株の形質転換に使用した。形質転換は実施例１１記載の電気パルス法で行った。パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電圧を５ＫＶ／ｃｍとして行った。
【０２４９】
形質転換体の選択は２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤプレートで行った。その結果、プラスミドｐＣＲＡＰＨ２、ｐＣＲＡＰＨ３、ｐＣＲＡＰＨ４、およびｐＣＲＡＰＨ５を用いた場合、それぞれ１μｇＤＮＡあたり３００個程度の形質転換体が得られたが、一方プラスミドｐＣＲＡＰＨ６では形質転換体が得られなかった。この結果は、ＰＧＫ遺伝子の開始コドンＡＴＧの直前から、５’上流１６９ｂｐのＰｓｔＩサイトまでを含む断片は転写のプロモーターとしての機能を有しておらず、一方、４０１ｂｐ上流のＥｃｏＲＩサイトまでを含む断片、およびさらに長い領域を含む断片は転写のプロモーターとして機能することを示している。これより、図３に示されるＰＧＫ遺伝子のプロモーターを含む１３４６ｂｐの配列のうち、９４６番目のＥｃｏＲＩサイトからＡＴＧ直前の１３４６番目塩基までの４０１ｂｐの配列にプロモーターの機能を示すために必要な配列が含まれることが明らかにされた。
【０２５０】
実施例２２：グリセロアルデヒド-3- リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子のクローニングとＧＡＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列決定
キャンディダ・ユティリスのグリセロアルデヒド-3- リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子のクローニングは、遺伝子ライブラリーとして実施例２で構築したキャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡライブラリーを用い、他生物の既知のＧＡＰ遺伝子をプローブとしたハイブリダイゼーション法を用いて行った。Molecular Cloning 2nd edition p2.95-121,Cold Spring HarborLaboratory (1989) に記載された方法に従い、上記の遺伝子ライブラリーの約20,000プラークのファージＤＮＡを吸着させたフィルターを作製した。次に、サッカロマイセス・セレビシエのＧＡＰ遺伝子を含む2.1 ｋｂのＨｉｎｄIII 断片を保持するｐＵＣ18プラスミド（Yamano et al. Journal of Biotechnology 32, 165- 171 (1994)）から、ＧＡＰ遺伝子の大部分を占めるＤＮＡ断片として約1 ｋｂのＡｓｕII- ＡｆｌII断片を切り出した。この断片を32Ｐ標識して、これをプローブとしてハイブリダイゼーションを行った。その結果3 つの陽性プラークが分離できた。更にこれらプラークの1 つのファージＤＮＡについてサブクローニングを行い、このファージＤＮＡに含まれていた6.5 ｋｂＥｃｏＲＩ断片を単離し、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ＋のＥｃｏＲＩサイトに組込み、プラスミドｐＧＡＰ１および２を構築した（図２９）。
【０２５１】
制限酵素ＨｉｎｄIII 、ＣｌａＩ、ＳｍａＩ、あるいはＳｐｅＩを単独もしくは複数使用して、単離した6.5 ｋｂＥｃｏＲＩ断片を消化し、生じた断片に対してサッカロマイセス・セレビシエのＧＡＰ遺伝子をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、３．８ｋｂ ＨｉｎｄIII −ＳｐｅＩ断片に強くハイブリダイズした。そこで、３．８ｋｂ ＨｉｎｄIII −ＳｐｅＩ断片をプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ＋及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＫＳ＋のＨｉｎｄIII サイトとＳｐｅＩサイトとの間にそれぞれ組み込み、プラスミドｐＧAPＨ１、ｐＧAPＨ２を作製した。これらプラスミドについて、ＨｉｎｄIII 、ＣｌａＩ、ＳｍａＩ等の制限酵素サイトでの欠失変異体の作製や、エキソヌクレアーゼIII 及びマングビーンヌクレアーゼを用いた連続した欠失変異体を作製することにより、種々の欠失変異をもつプラスミドを作製し、３７４９ｂｐからなるＨｉｎｄIII −ＳｐｅＩ 断片の配列を決定した（図２９）。
【０２５２】
予想される構造遺伝子領域の解析を行ったところ、１００５ｂｐからなるオープンリーディングフレームが存在し、そこから推定される遺伝子産物のアミノ酸配列についてサッカロマイセス・セレビシエのＧＡＰ遺伝子産物に対するホモロジーを調べた。両配列は互いに７９．６％ホモロジーを示したことから、単離した遺伝子がキャンディダ・ユティリスのＧＡＰ遺伝子であると断定した。また制御領域については、開始コドンの上流９７５ｂｐ、終止コドンの下流１７６９ｂｐが含まれていた。このうち、転写のプロモーターを含むと推測されるＨｉｎｄIII サイトから開始コドンＡＴＧの直前までの９７５ｂｐの配列は図３０に、転写のターミネーターを含むと推測される終止コドンＴＡＡの直後からＡｆｌIII サイトまでの８０２ｂｐの配列は図３１に示される通りであった。
【０２５３】
実施例２３：ＧＡＰ遺伝子のプロモーターとターミネーターとを使った発現ベクターの構築
キャンディダ・ユティリスのＧＡＰ遺伝子制御領域からプロモーターとターミネーターを含むＤＮＡ断片をそれぞれPCR 法を用いて取得した（図２９）。
【０２５４】
プロモーターとしては、プラスミドｐＧＡＰ１を鋳型として、開始コドンの上流９７５ｂｐに位置するＨｉｎｄIII サイトから開始コドンＡＴＧ直前までの断片を取得した。プライマーとして、
5'-CCAAGCTTACAGCGAGCACTCAAATCTGCCC-3' （配列番号：２３）
5'-CCTCTAGATATGTTGTTTGTAAGTGTGTTTTGTATC-3' （配列番号：２４）
の２つを用い、３’下流側開始コドン直前にＸｂａＩ部位をもつ様にデザインして合成した。
【０２５５】
次に、ターミネーターとして、プラスミドｐＧＡＰ１を鋳型として、終止コドン直後からＳｐｅＩサイトまでの断片を取得した。プライマーとしては、
5'-GGGATCCATTGTATGACTTTTATTTATGGG-3' （配列番号：２５）
5'-GGACTAGTGAGATGACTCTAGGCATCTTCT-3' （配列番号：２６）
を用い、５’側終止コドン直後にはＢａｍＨＩサイトをもつ様にデザインし合成した。
【０２５６】
ＰＣＲプロセスは、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を使って３０サイクルで行った。ＰＣＲ合成したプロモーター断片をＨｉｎｄIII とＸｂａＩとで消化し、ｐＵＣ１９ベクターのＨｉｎｄIII サイトとＸｂａＩサイトとの間に組み込み、プラスミドｐＵＧｐｒｏを構築した（図３２）。一方、ターミネーター断片は、終止コドンの約０．８ｋｂ下流のＡｆｌIII サイトで消化し、クレノウ酵素でＤＮＡ末端の平滑化を行った後、ＢａｍＨＩで消化した。得られた０．８ｋｂのＤＮＡ断片をｐＵＣ１９ベクターのＢａｍＨＩサイトとＳｍａＩサイトの間に組み込み、プラスミドｐＵＧｔｅｒを構築した（図３２）。
【０２５７】
プラスミドｐＵＧｔｅｒのＧＡＰターミネーターの下流末端のＥｃｏＲＩサイトをクレノウ酵素処理により平滑化した後、ＮｏｔＩリンカー(5'AGCGGCCGCT3´:配列番号：１８）を連結して、プラスミドｐＵＧｔｅｒＮを構築した。次に、プラスミドｐＵＧｐｒｏから０．９５ｋｂのG ＡＰプロモーター断片をＨｉｎｄIII とＸｂａＩとで切り出し、プラスミドｐＵＧｔｅｒＮのＨｉｎｄIII サイトとＸｂａＩサイトとの間に挿入して、発現プラスミドｐＧＡＰＰＴ１を構築した。さらに、プロモーターの上流末端のＨｉｎｄIII サイトをクレノウ酵素処理により平滑化し、ＮｏｔＩリンカー(5'AGCGGCCGCT3´:配列番号：１８）を連結して、プラスミドｐＧＡＰＰＴ２を構築した（図３２）。
【０２５８】
さらに構築した発現プラスミドｐＧＡＰＰＴ２が実際にキャンディダ・ユティリス内で機能するか否かを確認するために、プラスミドｐＧＡＰＰＴ２のＸｂａＩサイトとＢａｍＨＩサイトの間に実施例１９記載のプラスミドｐＡＰＨ２からＸｂａＩとＢｇｌIIによって切り出される１．１ｋｂのＡＰＴ遺伝子断片を組み込み、プラスミドｐＧＡＰＡＰＨ１を構築した（図３２）。
【０２５９】
構築したプラスミドｐＧＡＰＡＰＨ１をＮｏｔＩで消化した後、ＡＴＣＣ９９５０株の形質転換に使用した。形質転換は電気パルス法で、パルス条件を電気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電圧を５ＫＶ／ｃｍとして行った。
【０２６０】
形質転換体の選択は２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤプレートで行い、０．１μｇのＤＮＡを使用して約４０個程度の形質転換体が得られた。これにより、ＧＡＰ遺伝子のプロモーター、ターミネーターが機能することが確認された。
【０２６１】
実施例２４：原形質膜プロトンＡＴＰａｓｅ（ＰＭＡ）遺伝子のクローニングとＰＭＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列決定
キャンディダ・ユティリスの原形質膜プロトンＡＴＰａｓｅ（ＰＭＡ）遺伝子のクローニングは、ＰＧＫ遺伝子やＰＭＡ遺伝子の場合と同様に、実施例２で構築したキャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡライブラリーを用い、他生物の既知のＰＭＡ遺伝子の一部分をプローブとしたハイブリダイゼーション法を用いて行った。Molecular Cloning 2nd edition p2.95-121,ColdSpring Harbor Laboratory (1989) に記載された方法に従い、上記した遺伝子ライブラリーの約２０．０００プラークのファージＤＮＡを吸着させたフィルターを作製した。次に、サッカロマイセス・セレビシエのＰＭＡ１遺伝子の塩基配列（Serrano et al. Nature 319, 689-693 (1986) ）をもとに合成した２つのプライマー：
5'-ATGACTGATACATCATCCTCTTCATC-3' （配列番号：２７）
5'-TAACGACAGCTGGCAAACCGACTGGGAC-3' （配列番号：２８）
を用い、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株（ＡＴＣＣ ３８６２６）の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法でＰＭＡ１構造遺伝子の５’末端＋１から＋１０２７（開始コドンＡＴＧのＡを＋１とする）に対応する約１ｋｂの領域を増幅した。染色体ＤＮＡはMethods in Yeast Genetics - A laboratory Course Manual - Rose M.D et al. P126-127 Cold Spring Harbor Laboratory Press NY (1990) 記載の方法に従って調製した。取得した断片は32Ｐ標識して、プローブとしてハイブリダイゼーションを行った。その結果、得られた４つの陽性プラークのうち１つのファージＤＮＡについてインサートＤＮＡをＸｂａＩ消化して、１０ｋｂ、４ｋｂ、２．８ｋｂ、２．６ｋｂの４つのＸｂａＩ断片を単離した。
【０２６２】
単離した４つの断片に対し、スクーリーニングに用いたサッカロマイセス・セレビシエのＰＭＡ１遺伝子の約１ｋｂ断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、２．６ｋｂのＸｂａＩ断片にハイブリダイズした。そこで、この断片をプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ＋のＸｂａＩサイトに組み込み、インサートの方向性が互いに逆のプラスミドｐＰＭＡＦ１、ｐＰＭＡＦ２を作製した（図３３）。
【０２６３】
これらプラスミドについて、ＢａｍＨＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ等の制限酵素サイトでの欠失変異体の作製や、エキソヌクレアーゼIII 及びマングビーンヌクレアーゼを用いた欠失変異体を作製することにより、種々の欠失変異をもつプラスミドを作製し、両末端から約１ｋｂずつの塩基配列を決定した（図３３）。予想される構造遺伝子領域の解析を行ったところ、図３３中左側のＸｂａＩサイトからＥｃｏＲＶサイトを含む約１ｋｂ内に、サッカロマイセス・セレビシエのＰＭＡ１構造遺伝子の５’末端領域と約５０％のホモロジーを示す３５２ｂｐのオープンリーディングフレームが存在した。もう一方側のＸｂａＩサイトからＢａｍＨＩサイトを含む約０．８ｋｂ内には、サッカロマイセス・セレビシエのＰＭＡ１遺伝子の＋１２９２番目から＋２０４６番目までの範囲 （開始コドンＡＴＧのＡを＋１とする）と約７０％のホモロジーを示す７５４ｂｐのオープンリーディングフレームが存在することが分かった。この結果から、単離した遺伝子がキャンディダ・ユティリスのＰＭＡ遺伝子であると判断した。また、この２．６ｋｂのＸｂａＩ断片には、開始コドンＡＴＧの上流５９９ｂｐが含まれていた。転写のプロモーターを含むと推測されるこの５９９ｂｐの配列は図３４に示される通りであった。
【０２６４】
転写のターミネーターについては、同じファージＤＮＡからＸｂａＩで切り出される他の３つの断片（１０ｋｂ、４ｋｂ、および２．８ｋｂ）をサブクローニングし、それぞれ両末端側から塩基配列決定を行い、サッカロマイセス・セレビシエのＰＭＡ１遺伝子の３’側領域とのホモロジーを調べた。その結果、２．８ｋｂのＸｂａＩ断片の片側に上記のＰＭＡ１遺伝子の３’末端側と高いホモロジーを示す領域が存在することが示された。このＸｂａＩ断片をプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ＋のＸｂａＩサイトに組み込み、インサートの方向性が互いに逆のプラスミドｐＰＭＡＬ１およびｐＰＭＡＬ２を作製した（図３３）。これらプラスミドについて、ＫｐｎＩ消化による欠失変異体の作製や、エキソヌクレアーゼIII 及びマングビーンヌクレアーゼを用いた欠失変異体を作製することにより、種々の欠失変異をもつプラスミドを作製し、ＸｂａＩサイトからＫｐｎＩサイトまでの１．９ｋｂの塩基配列を決定した（図３３）。この塩基配列には、サッカロマイセス・セレビシエのＰＭＡ１遺伝子の＋２０４１番目から＋２７５７番目までの範囲（開始コドンＡＴＧのＡを＋１とする）と約８２％のホモロジーを示す７１７ｂｐのオープンリーディングフレームと、終止コドンＴＡＡの３’下流１１８８ｂｐが含まれていた。転写のターミネーターを含むと推測される終止コドンＴＡＡ直後からＫｐｎＩサイトまでの１１８８ｂｐの配列は図３５に示される通りであった。
【０２６５】
実施例２５：ＰＭＡ遺伝子のプロモーターとターミネーターとを使った発現ベクターの構築
先ず、キャンディダ・ユティリスのＰＭＡ遺伝子制御領域からプロモーターまたはターミネーターを含むＤＮＡ断片をそれぞれＰＣＲ法を用いて取得した（図３３）。
【０２６６】
プロモーターとして、プラスミドｐＰＭＡＦ１を鋳型として、ＸｂａＩサイト下流２０ｂｐの位置から開始コドンＡＴＧ直前までの断片を取得した。プライマーとして、
5'-GGCGGCCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGAACGA-3' （配列番号：２９）
5'-TTCTAGACTATATCAATGGTTAGTATCACGTG-3' （配列番号：３０）
の２つを用い、５’上流側末端にはＮｏｔＩサイト、３’下流側開始コドン直前にＸｂａＩサイトをもつ様にデザインして合成した。
【０２６７】
ターミネーターとして、プラスミドｐＰＭＡＬ１を鋳型として、終止コドンＴＡＡ直後から終止コドン４０３ｂｐ下流までの断片を取得した。プライマーとして、
5'-CCGGTACCTAAGCCGCTAATACCCC-3' （配列番号：３１）
5'-GGGCGGCCGCACTCGCTGATCGAAA-3' （配列番号：３２）
を用い、５’上流側終止コドン直後にはＫｐｎＩサイト、３’下流側末端にはＮｏｔＩサイトをもつ様にデザインし合成した。
【０２６８】
ＰＣＲプロセスは、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を使って３０サイクルで行った。ＰＣＲ合成したプロモーター断片をＮｏｔＩとＸｂａＩとで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ＋ベクターのＮｏｔＩサイトとＸｂａＩサイトの間に組み込み、プラスミドｐＢＭｐｒｏを構築した。一方、ターミネーター断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ＋のＫｐｎＩサイトとＮｏｔＩサイトとの間に組み込み、プラスミドｐＢＭｔｅｒを構築した。プラスミドｐＢＭｔｅｒから得られる０．４ｋｂのＫｐｎＩ−ＮｏｔＩ断片を、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩサイトをクレノウ酵素処理により平滑化し、ＮｏｔＩリンカー(5'AGCGGCCGCT3´:配列番号：１８）を連結して構築したプラスミドｐＵＣ１９ＮのＫｐｎＩサイトとＮｏｔＩサイトとの間に組み込み、プラスミドｐＵＭｔｅｒを構築した（図３６）。
【０２６９】
次に、プラスミドｐＵＭｔｅｒからＸｂａＩとＮｏｔＩとの消化で得られる０．４ｋｂのターミネーター断片と、プラスミドｐＢＭｐｒｏからＮｏｔＩとＸｂａＩの消化で得られる０．６５ｋｂのプロモーター断片とを、実施例４で構築したプラスミドｐＰＧＫＰＴ５をＮｏｔＩ消化して得られる２．９ｋｂの断片に組み込み、プラスミドｐＭＡＰＨ１を構築した（図３６）。
【０２７０】
さらに構築した発現プラスミドｐＭＡＰＨ１が実際にキャンディダ・ユティリス内で機能するか否かを確認するために、プラスミｐＭＡＰＨ１のＸｂａＩサイトとＢａｍＨＩサイトとの間に実施例１９記載のプラスミドｐＡＰＨ２からＸｂａＩとＢｇｌIIによって切り出される１．１ｋｂのＡＰＴ遺伝子断片を組み込み、プラスミドｐＭＡＡＰＨ１を構築した（図３６）。
【０２７１】
構築したプラスミドｐＭＡＡＰＨ１をＮｏｔＩ消化した後、ＡＴＣＣ９９５０株の形質転換に使用した。形質転換は電気パルス法で、パルス条件を電気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電圧を５ＫＶ／ｃｍとして行った。
【０２７２】
形質転換体の選択は２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤプレートで行い、０．１μｇのＤＮＡを用いて約４０個程度の形質転換体が得られた。これにより、ＰＭＡ遺伝子のプロモーターおよびターミネーターが機能するものであることが確認された。
【０２７３】
実施例２６：自律複製機能を有する配列（ＡＲＳ）を含むＤＮＡ断片のクローン化
実施例１９で構築したプラスミドｐＧＫＡＰＨ１から、ＰＧＫ遺伝子プロモーターと、ＡＰＴ遺伝子と、そしてＰＧＫ遺伝子ターミネーターとを含む３．３ｋｂのＮｏｔＩ断片を切り出し、これをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ−(Stratagene)のＮｏｔＩサイトに挿入して、プラスミドｐＧＫＡＰＨ２を構築した（図３７）。ＢａｍＨＩ消化して脱リン酸化したプラスミドｐＧＫＡＰＨ２、２００ｎｇと、実施例２で得られたキャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０の３−７ｋｂのゲノムＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ部分消化断片２００ｎｇとを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。このＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５を形質転換して、得られた約３００００個の形質転換体よりプラスミドＤＮＡ混合物を抽出して染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。このライブラリーから調製したＤＮＡを用い、実施例１１記載の電気パルス法により、ＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を試みた。パルス条件は電気容量を２５μＦとし、抵抗値は８００オームまたは１０００オーム、電圧は３．７５ＫＶ／ｃｍまたは５ＫＶ／ｃｍとして計４通りとし、それぞれＤＮＡを３μｇ使用して行った。これによりＧ４１８耐性を示すコロニーが計７株得られた。これら耐性株を４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ培地で培養し、菌体より全ＤＮＡを調製し、大腸菌ＤＨ５を形質転換した。酵母染色体ＤＮＡの調製は、Methods in Yeast Genetics - A laboratory Course Manual - Rose M.D et al. P131-132 Cold Spring Harbor Laboratory Press NYに記載の方法に従った。大腸菌から回収された７種類のプラスミドＤＮＡ（ｐＣＡＲＳ１、ｐＣＡＲＳ４、ｐＣＡＲＳ５、ｐＣＡＲＳ６、ｐＣＡＲＳ７、ｐＣＡＲＳ８、およびｐＣＡＲＳ１０）はいずれも５−７ｋｂのインサートを含むことが各種制限酵素消化により明らかにされ、また、これらプラスミドＤＮＡを用いてＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を電気パルス法により試みたところ、いずれのプラスミドＤＮＡについてもＧ４１８耐性の形質転換体が得られた。このことから、これらプラスミド中に自律複製機能を有するＤＮＡ配列がクローン化されていることが確認された。各種制限酵素消化による解析により、これらのプラスミドのうちｐＣＡＲＳ７とｐＣＡＲＳ８とが同一のインサートを含むプラスミドであることが明らかにされた。これらの結果より、キャンディダ・ユティリス酵母内で自律複製機能を有するＤＮＡ断片が６種類クローニングされたことが明らかにされた。
【０２７４】
また、実施例９記載のプラスミドｐＣＬＢＳ１０（図１５）をベクターとしてキャンディダ・ユティリス酵母染色体ＤＮＡライブラリーを作製し、プラスミドｐＧＫＡＰＨ２ライオブラリーと同時に形質転換を行った。しかしながら、シクロヘキシミド耐性の形質転換体は全く得られなかった。この結果から、キャンディダ・ユティリスのＡＲＳの特徴として、それを含むプラスミドの細胞あたりのコピー数が低く、形質転換体を選択するために数コピー必要なシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子と組み合わせた場合形質転換体を選択できないことが示唆された。
【０２７５】
実施例２７：自律複製機能を有する配列（ＡＲＳ）を含むＤＮＡ断片の短縮化
実施例２６でクローニングされた自律複製機能を有するＤＮＡ断片を含むプラスミド７種類のうち、高頻度でキャンディダ・ユティリス酵母を形質転換することができたプラスミド３種類（ｐＣＡＲＳ５、ｐＣＡＲＳ６、およびｐＣＡＲＳ７）について、さらに詳しい解析を行った。
【０２７６】
まず、これら３種のプラスミドによる酵母形質転換頻度を実施例１９で作成した染色体組み込み型プラスミドｐＣＬＲＡＰＨ１をＢｇｌII消化したＤＮＡをコントロールとして調べた。パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電圧を５ＫＶ／ｃｍとし、ＤＮＡを０．１μｇ用いてＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を行った。電気パルス後の培養は４時間行った。その結果は表７に示される通りであった。
【０２７７】
表７ 各種ＡＲＳプラスミドの形質転換頻度
プラスミド コロニー数
ｐＣＡＲＳ５ １６４５０
ｐＣＡＲＳ６ ９５００
ｐＣＡＲＳ７ ４７００
ｐＣＬＲＡＰＨ１ ４００
注１）１μｇプラスミドＤＮＡあたりの形質転換体数
注２）ｐＣＬＲＡＰＨ１はＢｇIII で分解して用いた
この結果より、ＡＲＳを含んだプラスミドを用いることにより、ｒＤＮＡをターゲットとしたＤＮＡの組込みよりさらに１０倍から４０倍程度高い形質転換頻度が得られることが示された。
【０２７８】
また、これらプラスミドｐＣＡＲＳ５、ｐＣＡＲＳ６、およびｐＣＡＲＳ７をＮｏｔＩ消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより再び環状化することにより、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、ＡＰＴ遺伝子、およびＰＧＫ遺伝子ターミネーターを含む３．３ｋｂのＮｏｔＩ断片を除去したプラスミドｐＣＡＲＳ５０、ｐＣＡＲＳ６０、およびｐＣＡＲＳ７０を構築した。新たに得られた３種類のプラスミドについて種々の制限酵素消化によりインサートの長さを調べたところ、インサートの長さがいずれも約５−６ｋｂであったため、自律複製機能を有する領域をさらに限定することとした。そのためにｐＣＡＲＳ５０、ｐＣＡＲＳ６０、およびｐＣＡＲＳ７０それぞれをＳａｕ３ＡＩで部分消化し、１−３．５ｋｂのサイズの断片を回収して、ＢａｍＨＩ消化後、脱リン酸化したプラスミドｐＧＫＡＰＨ２とＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。これらの３種類のＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５を形質転換して、それぞれ得られた２，５００−６，０００個の形質転換体よりプラスミドＤＮＡ混合物を抽出して、ＤＮＡライブラリーを作製した。これらＤＮＡ５μｇずつを用いて実施例１１記載の電気パルス法により再びＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を行い、Ｇ４１８耐性形質転換体を得た。
【０２７９】
得られたＧ４１８耐性のコロニーはさまざまな大きさからなっていたが、３種類のライブラリーについて比較的大きなコロニーを形成した株それぞれ５株を２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ培地で培養した。得られた菌体より全ＤＮＡを調製し、大腸菌ＤＨ５を形質転換した。一部のＧ４１８耐性株については大腸菌形質転換体が得られなかった。また、これら回収されたプラスミドを用いて実施例１１記載の電気パルス法により再びＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を行ったところ、それらのうち一部は、元のプラスミドドｐＣＡＲＳ５、ｐＣＡＲＳ６、およびｐＣＡＲＳ７と比較して形質転換頻度が大幅に低かったため除外した。最終的にｐＣＡＲＳ５０、ｐＣＡＲＳ６０、ｐＣＡＲＳ７０いずれについても短縮化されたＤＮＡ断片を含み、かつ形質転換頻度が親プラスミドと同程度であるプラスミドが１種類ずつ得られた。そしてｐＣＡＲＳ５０由来のプラスミドをｐＣＡＲＳ５−２と、ｐＣＡＲＳ６０由来のプラスミドをｐＣＡＲＳ６−２と、そしてｐＣＡＲＳ７０由来のプラスミドをｐＣＡＲ７−２と、それぞれ命名した。得られた６種類のプラスミド中の、自律複製機能を有する配列を含む染色体ＤＮＡ断片の制限酵素地図は図３８に示される通りであった。
【０２８０】
これらのプラスミドのうち染色体ＤＮＡ断片の短縮化された３種類のプラスミドｐＣＡＲＳ５−２、ｐＣＡＲＳ６−２、およびｐＣＡＲ７−２について、さらに挿入ＤＮＡ断片を短縮化したプラスミドを構築し、形質転換頻度を調べた（実施例２８）。しかし、この過程で構築した一部のプラスミドについて部分塩基配列を決定したところ、図３８においてｐＣＡＲＳ５のＢｇｌIIサイトより左側の領域約７００ｂｐが、ｐＣＡＲＳ６−２のＥｃｏＲＩサイトより左側の領域約７００ｂｐと９０％以上の相同性を示した。この結果から、ｐＣＡＲＳ５とｐＣＡＲＳ６の挿入ＤＮＡ断片は互いに制限酵素地図は一致しないものの、それぞれ相同染色体または反復配列から由来することが推察されたため、以後の解析はｐＣＡＲＳ６とｐＣＡＲＳ７挿入ＤＮＡ断片とについて行うこととした。また、ｐＣＡＲＳ６に含まれるＡＲＳ活性を持つ配列をＣＵＡＲＳ１と、ｐＣＡＲＳ７に含まれるＡＲＳ活性を持つ配列をＣＵＡＲＳ２と、それぞれ命名した。
【０２８１】
実施例２８：ｐＣＡＲＳ６、ｐＣＡＲＳ７挿入ＤＮＡ断片の短縮化と形質転換頻度とプラスミド安定性
（１）ｐＣＡＲＳ６挿入ＤＮＡ断片の短縮化と形質転換頻度
プラスミドｐＣＡＲＳ６−２にクローン化されたＳａｕ３ＡＩ部分消化ＤＮＡ断片は約１．９ｋｂであった。よって、自律複製能を有する領域をさらに限定するために、ｐＣＡＲＳ６−２のインサート断片の一部を含む３種類のプラスミドを構築した。これらのプラスミドは以下のように構築した。
【０２８２】
ｐＣＡＲＳ６−２からＡＰＴ遺伝子発現カセットを含む３．３ｋｂのＮｏｔＩ断片を除去して、ｐＣＡＲＳ６−２０を構築した。ｐＣＡＲＳ６−２０をＡｆｌIIとＸｂａＩとで消化した後、クレノウ酵素で末端を平滑化してＴ４ＤＮＡリガーゼにより再環状化してプラスミドｐＣＡＲＳ６−２１０を構築した。このプラスミドに、実施例１９で構築したプラスミドｐＧＫＡＰＨ１のプロモーター断片内のＥｃｏＲＩサイトをクレノウ酵素処理により平滑化し、その後ＮｏｔＩリンカー（5'AGCGGCCGCT3'：配列番号：１８）を連結して構築したプラスミドｐＧＫＡＰＨ３から切り出される短縮化されたＰＧＫ遺伝子プロモーターによるＡＰＴ遺伝子発現カセットを含む２．３ｋｂのＮｏｔＩ断片を連結することによって、ｐＣＡＲＳ６−２１を構築した。また、ｐＣＡＲＳ６−２０とｐＣＡＲＳ６−２１をそれぞれＨｉｎｄIII 消化してＴ４ＤＮＡリガーゼにより再環状化した後、同様にＰＧＫ遺伝子プロモーターによるＡＰＴ遺伝子発現カセットを含む２．３ｋｂのＮｏｔＩ断片を連結することによって、ｐＣＡＲＳ６−２２およびｐＣＡＲＳ６−２３を構築した。これら５種類のプラスミドに含まれる挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図は図３９に示される通りであった。
【０２８３】
次に構築した各プラスミドを用いて、実施例１１記載の電気パルス法により、ＡＴＣＣ９９５０株の形質転換実験を行なった。パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電圧を５ＫＶ／ｃｍとし、ＤＮＡは１μｇ用いて行った。電気パルス後の培養は４時間行った。その結果は表８に示される通りであった。
【０２８４】
また、各プラスミドの酵母内安定性を次のように調べた。得られたＧ４１８耐性のコロニーを４ｍｌのＹＰＤ培地に植菌し、３０℃で８時間振とう培養した。
その後、ＹＰＤプレートと、Ｇ４１８を含むＹＰＤプレートとに菌をそれぞれ塗布して、２日後生じたコロニー数を比較することにより、プラスミドの保持率を求めた。結果は表８に示される通りであった。この間、菌は２．５−３．５回分裂したことが培養液の吸光度を調べることにより示された。この結果から、ｐＣＡＲＳ６−２の挿入ＤＮＡ断片を左右両側よりそれぞれ短縮化したプラスミドｐＣＡＲＳ６−２１およびｐＣＡＲＳ６−２２のうち、ｐＣＡＲＳ６−２１の安定性はｐＣＡＲＳ６−２と同程度であったが、どちらも形質転換頻度が大きく低下することが示された。また、挿入ＤＮＡ断片を０．６ｋｂｐまで短くしたＣＡＲＳ６−２３では形質転換頻度はさらに低下し、ｐＣＡＲＳ６の５０分の１以下に低下することが示された。これらの結果から、ｐＣＡＲＳ６に含まれるＣＵＡＲＳ１は、ｐＣＡＲＳ６−２の約１．９ｋｂ長さのＤＮＡ断片より短縮化することが困難であることが示唆された。
【０２８５】
（２）ｐＣＡＲＳ７挿入ＤＮＡ断片の短縮化と形質転換頻度
プラスミドｐＣＡＲＳ７−２にクローン化されたＳａｕ３ＡＩ部分消化ＤＮＡ断片は約３．５ｋｂであった。よって、自律複製能を有する領域をさらに限定するために、ｐＣＡＲＳ７−２のインサート断片の一部を含む５種類のプラスミドを構築した。これらのプラスミドは以下のように構築した。
【０２８６】
ｐＣＡＲＳ７−２から、ＡＰＴ遺伝子発現カセットを含む３．３ｋｂのＮｏｔＩ断片を除去したプラスミドｐＣＡＲＳ７−２０を構築した。このｐＣＡＲＳ７−２０をＸｂａＩ消化後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより再環状化し、その後２．３ｋｂのＡＰＴ遺伝子発現カセットを含むＮｏｔＩ断片を連結することによりｐＣＡＲＳ７−４を構築した。
【０２８７】
また、ｐＣＡＲＳ７−２０より、約１．８ｋｂのＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄIII 断片、約１．３ｋｂのＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII 断片、および約１．８ｋｂのＨｉｎｄIII −ＢｇｌII断片を切り出し、それぞれ、ＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄIII 、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄIII 、ならびにＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ−(Stratagene)に連結した。その後、短縮化されたＰＧＫ遺伝子プロモーターによるＡＰＴ遺伝子発現カセットを含む２．３ｋｂのＮｏｔＩ断片を連結することによりｐＣＡＲＳ７−６、ｐＣＡＲＳ７−７、およびｐＣＡＲＳ７−８を構築した。これら６種類のプラスミドに含まれる挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図は図４０に示される通りであった。
【０２８８】
構築した各プラスミドを用いて、実施例１１記載の電気パルス法により、ＡＴＣＣ９９５０株の形質転換実験を行なった。パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電圧を５ＫＶ／ｃｍとし、ＤＮＡを１μｇ用いて行った。電気パルス後の培養は４時間行った。その結果を表９に示した。
【０２８９】
また、各プラスミドの酵母内安定性を次のように調べた。得られたＧ４１８耐性のコロニーを４ｍｌのＹＰＤ培地に植菌し、３０℃で８時間振とう培養した。その後、ＹＰＤプレートと、Ｇ４１８を含むＹＰＤプレートとに菌をそれぞれ塗布して、２日後生じたコロニー数を比較することにより、プラスミドの保持率を求めた（表９）。この間、菌は２．５−３．５回分裂したことが培養液の吸光度変化を調べることにより示された。これらの結果から、ｐＣＡＲＳ７−２またはｐＣＡＲＳ７−６による形質転換頻度は、ｐＣＡＲＳ７のそれと比較して、それぞれ約７０％、および約３０％程度に低下した。しかし、安定性はそれほど悪化していないことが示された。さらにＤＮＡ断片を短くしたｐＣＡＲＳ７−７については、ｐＣＡＲＳ７−６の２分の１程度の形質転換頻度を示したものの、生じたコロニーは微小であり、また、安定性も悪かった（表９）。一方、ｐＣＡＲＳ７−８については頻度が悪く、ｐＣＡＲＳ７−４については全く形質転換体が得られなかった。これらの結果から、ｐＣＡＲＳ７に含まれるＣＵＡＲＳ２については、形質転換頻度はやや低下するものの、ｐＣＡＲＳ７−６の１．８ｋｂにまで短縮化できることが示された。
【０２９０】
これら２つのＡＲＳの短縮化に関する結果は、キャンディダ・ユティリス酵母のＡＲＳが自律複製能を示すには約２ｋｂ程度のかなり長い領域が必要であることを意味している。これはサッカロマイセス酵母のＡＲＳが約２００ｂｐで機能する事実（Newlon, C.R and Theis,J. Current Opinion in Genetics and Development1993 3, 752-758 ）と異なっており、興味深い特徴であるといえる。
【０２９１】
実施例２９：ｐＣＡＲＳ６−２およびｐＣＡＲＳ７−６の自律複製機能を有する配列を含むＤＮＡ断片の塩基配列決定とサザン解析
（１）自律複製機能を有する配列を含むＤＮＡ断片の塩基配列決定
ｐＣＡＲＳ６およびｐＣＡＲＳ７中の、ＡＲＳ、ＣＵＡＲＳ１、およびＣＵＡＲＳ２を含むＤＮＡ断片について、それぞれの塩基配列を決定した。ＣＵＡＲＳ１を含むＤＮＡとしてはｐＣＡＲＳ６−２の挿入ＤＮＡ断片について、ＣＵＡＲＳ２を含むＤＮＡとしてはｐＣＡＲＳ７−６の挿入ＤＮＡ断片について、それぞれ挿入ＤＮＡ断片の両側からＥｘｏIII ヌクレアーゼおよびマングビーンヌクレアーゼを用いた欠失変異作製法により、種々の欠失変異をもつプラスミドを作製して塩基配列を決定した。決定したｐＣＡＲＳ６−２の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列は図４１と４２とに、ｐＣＡＲＳ７−２の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列は図４３と４４とに示される通りであった。このうちｐＣＡＲＳ６−２の挿入ＤＮＡ断片は１９２１ｂｐからなりＡ+ Ｔの全塩基に対する割合は６９．５％であり、ｐＣＡＲＳ７−２の挿入ＤＮＡ断片は１７８８ｂｐからなりＡ+ Ｔの全塩基に対する割合は７０．８％であり、いずれのＤＮＡも非常にＡ+ Ｔの割合が高いことが示された。
【０２９２】
コンピューターによる解析により、ＡＲＳに認められる１１ｂｐの共通配列（Ｔ／Ａ）ＴＴＴＡ（Ｃ／Ｔ） （Ａ／Ｇ）ＴＴＴ（Ｔ／Ａ）（Newlon, C.R and Theis,J. Current Opinion in Genetics and Development1993 3, 752-758 ）と比べると、一塩基ずつ異なる配列が、ｐＣＡＲＳ６−２では９個分散して存在していること、また、ｐＣＡＲＳ７−６では１３個存在し、そのうち５個が互いに重なり合いながら存在していることが示された（図４１〜図４４）。
【０２９３】
（２）サザン解析によるコピー数算定
キャンディダ・ユティリス酵母細胞内において、ＡＲＳを含むプラスミドが何コピー存在するかを調べるために、ｐＣＡＲＳ６およびｐＣＡＲＳ７で形質転換したキャンディダ・ユティリス酵母から調製したＤＮＡについてサザン解析を行った（図４５−１）。また、コピー数算定のための内部標準としてＰＧＫ遺伝子を用いることとしたので、ＰＧＫ遺伝子コピー数算定のためのサザン解析も行った（図４５−２）。
【０２９４】
ＰＧＫ遺伝子コピー数算定のためのサザン解析は、実施例１８記載のプラスミド、ｐＣＬＬＡＣ１をＰＧＫプロモーター内のＳｐｈＩサイトで消化した後、このプラスミドで形質転換したＡＴＣＣ９９５０株、２株と、対照として親株とからそれぞれ調製したＤＮＡについて行った。ＳａｌＩ+ ＮｏｔＩ消化したＤＮＡについて実施例４記載のｐＧＫＰＴ４から切り出されるＰＧＫプロモーターを含む０．４ｋｂのＥｃｏＲＩ- ＸｂａＩ断片をプローブとした場合、親株のＡＴＣＣ９９５０株では内在性ＰＧＫ遺伝子由来の３．２ｋｂのバンドが認められた（図４５- ２、レーン１）。一方、ＰＧＫプロモーター内のＳｐｈＩサイトで消化したｐＣＬＬＡＣ１を組み込んだ株ではこの３．２ｋｂのバンドのほかに、タンデムに複数個組み込まれたプラスミドからＮｏｔＩ消化により生じる５．４ｋｂのバンドと、染色体上のＰＧＫ遺伝子のうち１個がプラスミドの挿入により分断されて生じる６．４ｋｂおよび２．１ｋｂの２本のバンドが検出された（レーン２、３）。これら６．４ｋｂおよび２．１ｋｂの２本のバンドは、組み込まれたプラスミド分子の両末端に位置するプラスミド分子内のＮｏｔＩサイトとＰＧＫ遺伝子領域内のＳａｌＩサイトとから生ずるものであることから、プラスミド分子が相同組換えによりＰＧＫ遺伝子座に組み込まれたことが示された。
【０２９５】
イメージングアナライザーＢＡＳ２０００（FUJIFILM）を用いて各バンドの強度を測定したところ、形質転換体では内在性ＰＧＫ遺伝子由来の３．２ｋｂのバンドと、染色体に組み込まれたプラスミド分子の両末端のプラスミド由来の６．４ｋｂおよび２．１ｋｂのバンドの濃さがほぼ一致することから、ＰＧＫ遺伝子は細胞あたり２コピー存在し、形質転換体ではそのうち１コピーがプラスミドＤＮＡの挿入により分断されたことが示された。また、プラスミドのタンデム組み込みによる５．４ｋｂのバンドと６．４ｋｂと２．１ｋｂのバンドの濃さの比較から、組み込まれたプラスミドのコピー数は約４コピーであることが示された。
【０２９６】
ｐＣＡＲＳ６およびｐＣＡＲＳ７で形質転換したＡＴＣＣ９９５０株ＤＮＡをＥｃｏＲＶ+ ＮｏｔＩ消化し、実施例４記載のｐＧＫＰＴ４から切り出されるＰＧＫターミネーターを含む０．９ｋｂＸｂａＩ- ＮｏｔＩ断片をプローブとしてサザン解析を行った。その結果は図４５−１に示される通りであった。親株のＡＴＣＣ９９５０株では内在性ＰＧＫ遺伝子由来の約７ｋｂのバンドが認められた（図４５−１、レーン３）形質転換体においては約７ｋｂのバンドの他にプラスミド由来の３．３ｋｂのバンドが認められた。７ｋｂと３．３ｋｂのバンドの濃さの比較から、ＰＧＫ遺伝子由来のバンドを２コピーとすると、ｐＣＡＲＳ６のコピー数は１（レーン１）、ｐＣＡＲＳ７のコピー数は０．４（レーン２）と計算された。ｐＣＡＲＳ７のコピー数が１以下となったのは、菌培養時のプラスミド分子の脱落によるものと考えられる。この結果から、ＣＵＡＲＳを含むプラスミドは細胞あたり、１コピー程度存在すると考えられた。
【０２９７】
（３） 染色体上でのＡＲＳの存在様式
ＨｉｎｄIII 消化したＡＴＣＣ９９５０株、９２２６株、９２５６株、ＫＰ−２０５９Ｐ株、およびサッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株の各種染色体ＤＮＡに対して、サザン解析を行った。プローブとして、ＣＵＡＲＳ１としてｐＣＡＲＳ６- ２２の１．３ｋｂ挿入ＤＮＡ断片をＸｂａＩとＨｉｎｄIII により切り出した断片（図３９）を、ＣＵＡＲＳ２としてｐＣＡＲＳ７−６の１．８ｋｂＥｃｏＲＶ- ＨｉｎｄIII 断片（図４０）を、それぞれ用いてハイブリダイゼーションを行った（図４６）。ＣＵＡＲＳ１については、ｐＣＡＲＳ６の制限酵素地図から予想される２ｋｂの主要なバンド以外にｐＣＡＲＳ５の制限酵素地図から予想されるＨｉｎｄIII 断片の長さに一致する１．６ｋｂのバンドが認められた（図４６−１）。一方、ＣＵＡＲＳ２についてはｐＣＡＲＳ７の制限酵素地図から予想される２．５ｋｂの主要なバンド以外にホモロジーの高いＤＮＡ配列がキャンディダ・ユティリス酵母染色体上に１０コピー程度存在すると共に、サッカロマイセス酵母にも多数存在することが示された（図４６−２）。この結果から、ＣＵＡＲＳ２は広く保存された配列である可能性が示唆された。また、洗浄条件を厳しくすることにより（０．１ｘＳＳＣ ６５℃）主要なバンド以外のシグナルはほとんど認められなくなった（図４６−２）。
【０２９８】
また、これらのＡＲＳが染色体ＤＮＡ由来であるかどうかを調べるために、パルスフィールドゲル電気泳動法で分離したキャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡに対してサザン解析を行った。ＡＴＣＣ９９５０株のＤＮＡは７本に分れたが、ＣＵＡＲＳ１は大きいほうから６番目の染色体に、ＣＵＡＲＳ２は３番目の染色体にそれぞれ位置することが明らかにされ、クローン化したＡＲＳは染色体由来であることが明らかにされた。また、ｐＣＡＲＳ５の挿入ＤＮＡ断片についてはＣＵＡＲＳ１と同様に６番目の染色体に位置することが示された。実施例２７記載のシークエンス解析からも示唆されたように、これらｐＣＡＲＳ５とｐＣＡＲＳ６にクローン化されたＡＲＳは相同染色体由来である可能性を支持する結果となった。
【０２９９】
実施例３０：ＡＲＳを利用したプロモーター活性を有するＤＮＡ断片のクローニング
（１）プロモーター検索ベクターの構築
実施例２８で構築したプラスミドｐＣＡＲＳ６−２０より、自律複製能を有する配列を含むＤＮＡを１．９ｋｂのＳａｃＩ−ＳｍａＩ断片として切り出した。この断片をＥｃｏＲＩサイトをクレノウ酵素処理により平滑化した後、さらにＳａｃＩ消化したプラスミドｐＡＰＨ１（実施例１９）と連結してプラスミドｐＰＣＶ１を構築した。続いてｐＰＣＶ１をＢａｍＨＩ消化してクレノウ酵素処理により平滑化した後、ＨｐａＩリンカー(5'GTTAAC3')を挿入して、プラスミドｐＰＣＶ２を構築した（図４７）。
【０３００】
（２）ライブラリーの構築とプロモーター活性を有するＤＮＡ断片のクローニング
キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０の染色体ＤＮＡを制限酵素ＲｓａＩ、ＨａｅIII 、および
ＡｌｕＩにより、同時に部分消化した。その後、ＤＮＡ断片を１％のアガロースゲルで電気泳動することにより分画し、０．９−１．８ｋｂの長さの断片を回収した。この部分消化ＤＮＡ断片と、ＨｐａＩ消化して脱リン酸化したプラスミドｐＰＣＶ２とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。このＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５を形質転換して、得られた約１００，０００個の形質転換体よりプラスミドＤＮＡ混合物を抽出して染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。このライブラリーから調製したＤＮＡを用いて実施例１１記載の電気パルス法によりＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を試みた。パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値は１０００オーム、電圧は５ＫＶ／ｃｍとし、ＤＮＡは１回のパルスあたり２０−２５μｇを使用して行った。形質転換体の選択は２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤプレートで行い、形質転換実験を繰り返すことにより、２８０μｇのＤＮＡを使用して合計３８０個の形質転換体を取得した。これらの形質転換体のうち比較的大きなコロニーを形成した８４株について、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤプレートでの増殖を調べた。このうち、増殖の良かった株１２株を１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ培地で培養し、菌体より全ＤＮＡを調製し、大腸菌ＤＨ５を形質転換した。
【０３０１】
大腸菌から回収された１２種類のプラスミドＤＮＡ、すなわちｐＰＣＶ１、３、９、１４、１９、３３、５１、５５、５７、６２、６４、および７８は、いずれも０．９−１．８ｋｂの挿入ＤＮＡ断片を含むことが制限酵素消化により明らかにされた。次に、プロモーター活性を有する配列を含むＤＮＡ断片をＸｂａＩ消化により切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ−(Stratagene)に連結して得られたプラスミドについて、それらの挿入ＤＮＡ断片の両側から一部塩基配列を決定した。その結果、ｐＰＣＶ３３およびｐＰＣＶ７８、ならびにｐＰＣＶ１４、ｐＰＣＶ５１、およびｐＰＣＶ５５が、それぞれ同一のＤＮＡ断片を含むことが明らかとなった。よって、最終的に９種類のプロモーター活性を有するＤＮＡ断片がクローン化されたことが示された。
【０３０２】
また、これら９種類のプラスミドｐＰＣＶ１、３、９、１４、１９、３３、５７、６２、および６４を用いてＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を電気パルス法により試みたところ、いずれのプラスミドＤＮＡについても１μｇＤＮＡあたり６，０００から１０，０００個のＧ４１８耐性コロニーが得られた。さらに、これら９種類のプラスミドと、対照として用いたｐＣＡＲＳ６−２とにより得られた１０種類のＧ４１８耐性株２株ずつの計２０クローンについて、５ｍｌのＹＰＤ液体培地で一晩培養した後、ＹＰＤプレート上で単一コロニーにした。これら２０クローンのおのおの１０コロニーずつをＧ４１８を含むＹＰＤプレート上での生育を調べることにより、プラスミドの保持率を調べた。その結果、ｐＣＡＲＳ６−２のプラスミド保持率は５％であったのに対し、その他すべてのプラスミドについて保持率が高まっていた。このうち特にプラスミドｐＰＣＶ１、ｐＰＣＶ１９、およびｐＰＣＶ６４については、プラスミド保持率が８０−８５％と高く、取得されたプロモーター活性を有する配列を含むＤＮＡ断片が、プラスミドの安定性を高める機能を有していることが示唆された。
【０３０３】
（３）プラスミドｐＰＣＶプロモーター活性を有するＤＮＡ断片の塩基配列決定
取得された９種類のプロモーター活性を有するＤＮＡ断片のうち、プラスミドｐＰＣＶ１９の挿入ＤＮＡ断片について、挿入ＤＮＡ断片の両側からＥｘｏIII ヌクレアーゼおよびマングビーンヌクレアーゼを用いた欠失変異作製法により、種々の欠失変異をもつプラスミドを作製して塩基配列を決定した。決定した１０５４ｂｐからなるｐＰＣＶ１９の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列は図４８に示される通りであった。
【０３０４】
実施例３１：ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子発現用プラスミドの構築とそれを利用した酵母の共形質転換体の選択
（１）ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子発現用プラスミドの構築とその機能確認
ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ
（ＨＰＴ）遺伝子は、プラスミドｐＢＩＢ−ＨＹＧ（Becker D. Nucl. Asids Res.18,203 (1990)）を鋳型として、すでに明らかにされているＨＰＴ遺伝子の塩基配列情報（Gritz L. and Davis J. Gene 25, 179-188 （1983) ）に基づき作成した２種類のプライマーを用いてＰＣＲにより取得した。プライマーとして、
5'-GGTCTAGATATGAAAAAGCCTGAAC-3' （配列番号：３３）
5'-GGAGATCTATTCCTTTGCCCTCGGA-3' （配列番号：３４）
を用いて、５’側末端開始コドン直前にＸｂａＩサイト、３’側末端終止コドン直後にＢｇｌIIサイトをもつ様にデザインして合成した。合成したＨＰＴ遺伝子断片はＸｂａＩとＢｇｌIIとで消化後、実施例４記載の発現ベクターｐＰＧＫＰＴ４（図４）のＸｂａＩサイトとＢａｍＨＩサイトと間に挿入して、プラスミドｐＧＫＨＰＴ１を構築した（図４９）。
【０３０５】
さらにｐＧＫＨＰＴ１からＰＧＫ遺伝子プロモーターと、ＨＰＴ遺伝子と、そしてＰＧＫ遺伝子ターミネーターとを含む３．３ｋｂのＮｏｔＩ断片を切り出し、これを実施例３０記載のプラスミドｐＰＣＶ１４のＮｏｔＩサイトに挿入して、プラスミドｐＡＨＧ１を構築した。
【０３０６】
構築したＨＰＴ遺伝子発現カセットが機能するかどうか確認するために、プラスミドｐＡＨＧ１によりＡＴＣＣ９９５０株を実施例１１記載の電気パルス法により形質転換した。Ｇ４１８耐性で選択した形質転換体は、２００、４００、および８００μｇ／ｍｌの濃度のハイグロマイシンＢを含むＹＰＤ液体培地で増殖したが、対照として用いた野生株はいずれの培地でも増殖せず、ハイグロマイシンＢ耐性を示すことが明らかにされた。
【０３０７】
また、プラスミドｐＧＫＨＰＴ１をＮｏｔＩ消化して、ＰＧＫ遺伝子プロモーターと、ＨＰＴ遺伝子と、そしてＰＧＫ遺伝子ターミネーターとを含む断片と、ベクター断片とに分けた後、ＡＴＣＣ９９５０株の形質転換に用いた。形質転換は実施例１１記載の電気パルス法により行い、形質転換体の選択は８００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むＹＰＤプレートで行った。その結果、１μｇＤＮＡあたり１６８個のハイグロマイシンＢ耐性コロニーが得られた。これは対照として用いたＮｏｔＩ消化プラスミドｐＧＫＡＰＨ１による形質転換頻度、１μｇＤＮＡあたり１５６個とほぼ同じであり、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子はＧ４１８耐性遺伝子同様、キャンディダ・ユティリス形質転換体の直接選択に用いることができることが示された。
【０３０８】
（２）酵母の共形質転換の実施
実施例３０で取得したＡＲＳを含むプラスミドｐＰＣＶ６４の０．１μｇと、ＮｏｔＩ消化してＰＧＫ遺伝子プロモーターと、ＨＰＴ遺伝子と、そしてＰＧＫ遺伝子ターミネーターとを含む断片とベクター断片とに分けたプラスミドｐＰＧＫＨＰＴ１の１μｇまたは１０μｇとを混合して、ＡＴＣＣ９９５０株の実施例１１記載の電気パルス法により形質転換に用いた。
【０３０９】
パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値は６００、８００、または１０００オーム、電圧は３．７５ＫＶ／ｃｍまたは５ＫＶ／ｃｍとして、ＤＮＡ混合物２種類に対してそれぞれ６通りのパルス条件で行った。形質転換体の選択は２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤプレートで行い、０．１μｇのｐＰＣＶ６４ＤＮＡ当たり、それぞれの条件で約２，０００から７，０００個の形質転換体を取得した。それぞれの条件で得られたＧ４１８耐性コロニー５００から２０００個を８００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むＹＰＤプレートにレプリカした。その結果、得られたＧ４１８耐性コロニーのうちハイグロマイシンＢ耐性を示すコロニーの割合はそれぞれのパルス条件で大きな差はなく、約１−２％であることが示された。つぎに、このＧ４１８耐性でかつハイグロマイシンＢ耐性を示した株についてＹＰＤ液体培地で一晩培養することによって、プラスミドとして存在するｐＰＣＶ６４が脱落してＧ４１８感受性となった株の取得を試みた。４０株について調べたところ、このうち１０株についてＧ４１８感受性でかつハイグロマイシンＢ耐性を示す株が得られた。これらの株においてはＰＧＫ遺伝子プロモーターと、ＨＰＴ遺伝子と、そしてＰＧＫ遺伝子ターミネーターとを含む断片が染色体上に保持されていることが期待された。そこでこの１０株より染色体ＤＮＡを調製した後、ＨＰＴ遺伝子発現カセットが染色体上に相同組換えにより組み込まれたかどうかをＰＣＲにより調べた。
【０３１０】
このためのプライマーとして、ＨＰＴ遺伝子発現に用いたＰＧＫ遺伝子プロモーター断片の５’端外側の塩基配列をもとに合成した、
プライマー１；5'CAAGTTGATCCTTCTCCGGA3' （配列番号：３５）及び、ＨＰＴ遺伝子内部の配列をもとに合成した、
プライマー２；5'GAAACTTCTCGACAGACGTC3' （配列番号：３６）及び、ＨＰＴ遺伝子発現に用いたＰＧＫ遺伝子ターミネーター断片内の配列をもとに合成した
プライマー３；5'CATCGGGTAAGGTCTACATG3' （配列番号：３７）の合計３種類のプライマーを使用した。
【０３１１】
ＰＣＲの条件は、９５℃１分、５５℃１分、７２℃５分とし、３０サイクル行った。その結果は図５０に示される通りであった。図５０（１）はプライマー１とプライマー３とを用いたＰＣＲ反応産物の電気泳動図である。この結果より、すべてのサンプルについて内在性のＰＧＫ遺伝子による２．７ｋｂの増幅断片が認められたほか、Ｎｏ．３、５、７、９、および１０の５つのサンプルについては２．６ｋｂの断片が認められた。これは形質転換に用いたＰＧＫ遺伝子プロモーターと、ＨＰＴ遺伝子と、そしてＰＧＫ遺伝子ターミネーターとを含む断片によって、内在性の２個のＰＧＫ遺伝子のうち１個が置き換えられたことにより生じたと考えられた。さらに、同じＤＮＡサンプルについてプライマー１とプライマー２とを用いてＰＣＲを行った結果は図５０（２）に示される通りであった。その結果より、２．６ｋｂの断片が認められた５個のサンプルについて１．４ｋｂの増幅断片が認められ、これら５クローンに関しては相同組換えによって、内在性ＰＧＫ遺伝子がＨＰＴ遺伝子に置き換えられたことが示された。
【０３１２】
本明細書に開示される発明は下記の通りである。
【０３１３】
（１） キャンディダ・ユティリスのリボソーム構成蛋白質Ｌ４１をコードする遺伝子配列を含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３１４】
（２） キャンディダ・ユティリスのリボソーム構成蛋白質Ｌ４１が図１４に記載のアミノ酸配列（配列番号：６）を有するものである、（１）記載のＤＮＡ配列。
【０３１５】
（３） プロモーター配列、およびターミネーター配列をさらに含んでなる、（１）または（２）記載のＤＮＡ配列。
【０３１６】
（４） 図１３に記載の塩基配列（配列番号：５）を有する、（３）記載のＤＮＡ配列。
【０３１７】
（５） 図１４に記載のアミノ酸配列（配列番号：６）の５６番目のプロリンがグルタミンに置換されたアミノ酸配列を有する蛋白質であって、酵母にシクロヘキシミド耐性を付与するシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１蛋白質をコードする遺伝子配列を含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３１８】
（６） （５）記載のＤＮＡ配列を含んでなる、プラスミド。
【０３１９】
（７） 図６（ｂ）の制限酵素地図で表される、キャンディダ・ユティリスのｒＲＮＡ遺伝子群を含んでなる、約１３．５ｋｂのＤＮＡ断片およびその部分ＤＮＡ配列。
【０３２０】
（８） （７）記載の約１３．５ｋｂのＤＮＡ断片を反復して含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３２１】
（９） （７）記載のＤＮＡ配列を含んでなる、プラスミド。
【０３２２】
（１０） サッカロミセス・セレビシエ酵母のｕｒａ３変異を相補する、キャンディダ・ユティリス由来のオルチジン−５´−フォスフェートデカルボキシラーゼ（ＵＲＡ３）蛋白質をコードする遺伝子配列を含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３２３】
（１１） キャンディダ・ユティリス由来のＵＲＡ３蛋白質が図１０および図１１に記載のアミノ酸配列（配列番号：４）である、（１０）記載のＤＮＡ配列。
【０３２４】
（１２） 図９に記載の塩基配列（配列番号：３）、またはサッカロミセス・セレビシエ酵母のｕｒａ３変異を相補する機能を保持するその部分配列を含んでなる、（１１）記載のＤＮＡ配列。
【０３２５】
（１３） （１２）記載のＤＮＡ配列を含んでなる、プラスミド。
【０３２６】
（１４） キャンディダ・ユティリスのホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子プロモーター配列。
【０３２７】
（１５） 図３に記載の塩基配列（配列番号：２）のうち少なくとも９４６番〜１３４６番までの配列を有する配列、またはＰＧＫ遺伝子プロモーター活性を有するその部分配列を含んでなる、（１４）記載のＰＧＫ遺伝子プロモーター配列。
【０３２８】
（１６） キャンディダ・ユティリスのＰＧＫ遺伝子ターミネーター配列。
【０３２９】
（１７） 図２に記載の塩基配列（配列番号：１）、またはＰＧＫ遺伝子ターミネーター活性を有するその部分配列を含んでなる、（１６）記載のＰＧＫ遺伝子ターミネーター配列。
【０３３０】
（１８） （１４）または（１５）記載のＰＧＫ遺伝子プロモーター配列と、（１６）または（１７）記載のＰＧＫ遺伝子ターミネーター配列とを含んでなる、遺伝子発現ユニット。
【０３３１】
（１９） （１８）記載の遺伝子発現ユニットを含んでなる、プラスミド。
【０３３２】
（２０） プラスミドｐＰＧＫＰＴ３、ｐＰＧＫＰＴ４、またはｐＰＧＫＰＴ５である、（１９）記載のプラスミド。
【０３３３】
（２１） （１４）または（１５）記載のＰＧＫ遺伝子プロモーター配列と、その配列の下流に連結されてなる異種遺伝子とを含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３３４】
（２２） （１４）または（１５）記載のＰＧＫ遺伝子プロモーター配列と、その配列の下流に連結されてなる異種遺伝子と、その異種遺伝子の下流に連結されてなる（１６）または（１７）記載のＰＧＫ遺伝子ターミネーター配列とを含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３３５】
（２３） キャンディダ・ユティリスのグリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子プロモーター配列。
【０３３６】
（２４） 図３０に記載の塩基配列（配列番号：７）、またはＧＡＰ遺伝子プロモーター活性を有するその部分配列を含んでなる、（２３）記載のＧＡＰ遺伝子プロモーター配列。
【０３３７】
（２５） キャンディダ・ユティリスのＧＡＰ遺伝子ターミネーター配列。
【０３３８】
（２６） 図３１に記載の塩基配列（配列番号：８）、またはＧＡＰ遺伝子ターミネーター活性を有するその部分配列を含んでなる、（２５）記載のＧＡＰ遺伝子ターミネーター配列。
【０３３９】
（２７） （２３）または（２４）記載のＧＡＰ遺伝子プロモーター配列と、（２５）または（２６）記載のＧＡＰ遺伝子ターミネーター配列とを含んでなる、遺伝子発現ユニット。
【０３４０】
（２８） （２７）記載の遺伝子発現ユニットを含んでなる、プラスミド。
【０３４１】
（２９） プラスミドｐＧＡＰＰＴ１またはｐＧＡＰＰＴ２である、（２６）記載のプラスミド。
【０３４２】
（３０） （２３）または（２４）記載のＧＡＰ遺伝子プロモーター配列と、その配列の下流に連結されてなる異種遺伝子とを含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３４３】
（３１） （２３）または（２４）記載のＧＡＰ遺伝子プロモーター配列と、その配列の下流に連結されてなる異種遺伝子と、その異種遺伝子の下流に連結されてなる（２５）または（２６）記載のＧＡＰ遺伝子ターミネーター配列とを含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３４４】
（３２） キャンディダ・ユティリスの原形質膜プロトンＡＴＰａｓｅ（ＰＭＡ）遺伝子プロモーター配列。
【０３４５】
（３３） 図３４に記載の塩基（配列配列番号：９）、またはＰＭＡ遺伝子プロモーター活性を有するその部分配列を含んでなる、（３２）記載のＰＭＡ遺伝子プロモーター配列。
【０３４６】
（３４） キャンディダ・ユティリスのＰＭＡ遺伝子ターミネーター配列。
【０３４７】
（３５） 図３５に記載の塩基配列（配列番号：１０）、またはＰＭＡ遺伝子ターミネーター活性を有するその部分配列を含んでなる、（３４）記載のＰＭＡ遺伝子ターミネーター配列。
【０３４８】
（３６） （３２）または（３３）記載のＰＭＡ遺伝子プロモーター配列と、（３４）または（３５）記載のＰＭＡ遺伝子ターミネーター配列とを含んでなる、遺伝子発現ユニット。
【０３４９】
（３７） （３６）記載の遺伝子発現ユニットを含んでなる、プラスミド。
【０３５０】
（３８） プラスミドｐＭＡＰＴ１である、（３７）記載のプラスミド。
【０３５１】
（３９） （３２）または（３３）記載のＰＭＡ遺伝子プロモーター配列と、その配列の下流に連結されてなる異種遺伝子とを含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３５２】
（４０） （３２）または（３３）記載のＰＭＡ遺伝子プロモーター配列と、その配列の下流に連結されてなる異種遺伝子と、その異種遺伝子の下流に連結されてなる（３４）または（３５）記載のＰＭＡ遺伝子ターミネーター配列とを含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３５３】
（４１） （２１）、（２２）、（３０）、（３１）、（３９）、（４０）のいずれか一項記載のＤＮＡ配列で宿主細胞を形質転換し、該形質転換細胞を培養して異種遺伝子を発現させることを含んでなる、異種遺伝子の発現法。
【０３５４】
（４２） 宿主細胞が酵母である、（４１）記載の異種遺伝子の発現法。
【０３５５】
（４３） 宿主細胞がキャンディダ・ユティリスである、（４２）記載の異種遺伝子の発現法。
【０３５６】
（４４） キャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡと相同な配列（「相同ＤＮＡ配列」）と、形質転換体選択のためのマーカー遺伝子と、そして場合によって異種遺伝子とを含んでなるベクターであって、前記相同ＤＮＡ配列内において制限酵素切断され直鎖状とされて、相同組換えによって異種遺伝子をキャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡに組み込むことができる、ベクター。
【０３５７】
（４５） 前記マーカー遺伝子と、場合によって前記異種遺伝子とを含んだＤＮＡ配列が、その両端において前記相同ＤＮＡ配列に挟まれてなり、該相同ＤＮＡ配列において制限酵素切断され直鎖状とされて、相同組換えによって前記ＤＮＡ配列をキャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡに組み込むことができる、（４４）記載のベクター。
【０３５８】
（４６） 前記相同ＤＮＡ配列が、（１）〜（５）いずれか一項記載のｒＲＮＡ遺伝子配列またはその一部のＤＮＡ配列を含んでなるものである、（４４）また（４５）記載のベクター。
【０３５９】
（４７） 前記相同ＤＮＡ配列が、（７）〜（８）いずれか一項記載のＵＲＡ３遺伝子配列またはその一部のＤＮＡ配列を含んでなるもの、である、（４４）または（４５）記載のベクター。
【０３６０】
（４８） 前記相同ＤＮＡ配列が、（１０）〜（１２）いずれか一項記載のＬ４１遺伝子配列またはその一部のＤＮＡ配列を含んでなるものである、（４４）または（４５）記載のベクター。
【０３６１】
（４９） 前記相同ＤＮＡ配列が、ＰＧＫ遺伝子配列を含んでなるものである、（４４）または（４５）記載のベクター。
【０３６２】
（５０） 前記相同ＤＮＡ配列が、ＧＡＰ遺伝子配列を含んでなるものである、（４４）または（４５）記載のベクター。
【０３６３】
（５１） 前記相同ＤＮＡ配列が、ＰＭＡ遺伝子配列を含んでなるものである、（４４）または（４５）記載のベクター。
【０３６４】
（５２） マーカー遺伝子が薬剤耐性マーカー遺伝子である、（４４）〜（５１）いずれか一項に記載のベクター。
【０３６５】
（５３） 薬剤耐性マーカー遺伝子がシクロヘキシミド耐性を付与する遺伝子である、（５２）記載のベクター。
【０３６６】
（５４） シクロヘキシミド耐性を付与する遺伝子がシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子である、（５３）記載のベクター。
【０３６７】
（５５） シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子として、（５）記載のＤＮＡ配列を含んでなる、（５４）記載のベクター。
【０３６８】
（５６） キャンディダ・ユティリスで機能するプロモーターで発現する薬剤耐性マーカー遺伝子を含んでなる、（５２）記載のベクター。
【０３６９】
（５７） 薬剤耐性マーカー遺伝子が抗生物質Ｇ４１８耐性を付与する遺伝子である、（５６）記載のベクター。
【０３７０】
（５８） 抗生物質Ｇ４１８耐性を付与する遺伝子が、バクテリアトランスポゾンＴｎ９０３由来のアミノグリコシド−３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＴ）遺伝子である、（５７）記載のベクター。
【０３７１】
（５９） 薬剤耐性マーカー遺伝子が抗生物質ハイグロマイシンＢ耐性を付与する遺伝子である、（５６）記載のベクター。
【０３７２】
（６０） 抗生物質ハイグロマイシンＢ耐性を付与する遺伝子が、大腸菌プラスミド由来のハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子である、（５９）記載のベクター。
【０３７３】
（６１） キャンディダ・ユティリスで機能するプロモーター配列と、該プロモーター配列により発現する異種遺伝子を含んでなり、場合によってさらにターミネーター配列を含んでなる、（４４）〜（６０）いずれか一項のベクター。
【０３７４】
（６２） プロモーター配列またはターミネーター配列がキャンディダ・ユティリス由来のものである、（６１）記載のベクター。
【０３７５】
（６３） プロモーター配列が（１４）、（１５）、（２３）、（２４）、（３２）、（３３）いずれか一項に記載のプロモーター配列であり、ターミネーター配列が（１６）、（１７）、（２５）、（２６）、（３４）、（３５）いずれか一項に記載のターミネーター配列である、（６２）記載のベクター。
【０３７６】
（６４） （４４）〜（６３）いずれか一項に記載のベクターでキャンディダ・ユティリスを形質転換し、薬剤耐性となった形質転換体を選択することを含んでなる、キャンディダ・ユティリスの形質転換法。
【０３７７】
（６５） （４４）〜（６３）いずれか一項記載のベクターのＤＮＡ配列がキャンディダ・ユティリスの染色体に保持される、（６４）記載の形質転換法。
【０３７８】
（６６） ベクターＤＮＡ配列がキャンディダ・ユティリスの染色体に多コピーで導入される、（６５）記載の形質転換法。
【０３７９】
（６７） マーカー遺伝子としてのシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子を含んでなるベクターを用いる、（６６）記載の形質転換法。
【０３８０】
（６８） ｒＲＮＡ遺伝子配列を含んでなるベクターを用い、その結果高頻度で形質転換体が得られる、（６７）記載の形質転換法。
【０３８１】
（６９） ベクターのマーカー遺伝子がシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子であるベクターを用いる（６８）記載の形質転換法。
【０３８２】
（７０） ベクターＤＮＡ配列が相同組換えによって染色体に導入される、（６４）〜（６９）いずれか一項記載の形質転換法。
【０３８３】
（７１） ベクターＤＮＡ配列がＵＲＡ３遺伝子座、Ｌ４１遺伝子座、ＰＧＫ遺伝子座、ＧＡＰ遺伝子座、またはＰＭＡ遺伝子座に保持される（７０）記載の形質転換法。
【０３８４】
（７２） キャンディダ・ユティリスがＡＴＣＣ９２５６、ＡＴＣＣ９２２６、およびＡＴＣＣ９９５０からなる群から選択されるものである、（６４）〜（７１）いずれか一項記載の形質転換法。
【０３８５】
（７３） 電気パルス法による、（６４）〜（７２）いずれか一項に記載の形質転換法。
【０３８６】
（７４） 電気パルス条件が、菌生存率が１０〜４０％であり、タイムコンスタントが１０〜２０ミリ秒である、（７３）記載の形質転換法。
【０３８７】
（７５） 自律複製機能を有するＤＮＡ断片であって、キャンディダ・ユティリス内で、当該ＤＮＡ断片を含むベクターを、染色体外要素であるプラスミドとして保持させ、宿主の形質転換頻度を増加させることができる、ＤＮＡ断片。
【０３８８】
（７６） 前記自律複製ＤＮＡ断片が酵母由来である、（７５）記載のＤＮＡ断片。
【０３８９】
（７７） 前記酵母がキャンディダ・ユティリスである、（７６）記載のＤＮＡ断片。
【０３９０】
（７８） 前記自律複製ＤＮＡ断片が図４１および４２に記載の塩基配列（配列番号：１１）、または自律複製機能を有するその部分配列を含んでなる、ＤＮＡ断片。
【０３９１】
（７９） 前記自律複製ＤＮＡ断片が図４３および４４に記載の塩基配列（配列番号：１２）、または自律複製機能を有するその部分配列を含んでなる、ＤＮＡ断片。
【０３９２】
（８０） キャンディダ・ユティリスを形質転換でき、さらに（７５）〜（７９）いずれか一項に記載のＤＮＡ断片を含んでなり、キャンディダ・ユティリス内でプラスミドとして存在し得る、ベクター。
【０３９３】
（８１） 選択マーカー遺伝子として（５６）〜（６０）いずれか一項に記載の薬剤耐性遺伝子を含んでなる、（８０）記載のベクター。
【０３９４】
（８２） キャンディダ・ユティリス酵母の形質転換法であって、（７５）〜（７９）いずれか一項に記載の自律複製能を有するＤＮＡ断片および選択マーカー遺伝子を含んでなるプラスミドと、キャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡと相同なＤＮＡ配列（「相同ＤＮＡ配列」）を両末端に有するＤＮＡ断片とでキャンディダ・ユティリス酵母を同時に形質転換し、該酵母のうち前記プラスミドによって形質転換された形質転換体を選択し、さらに相同なＤＮＡ配列を有する断片が染色体上に組み込まれた形質転換体を選択することからなる、形質転換法。
【０３９５】
（８３） （８２）で得られる形質転換体を、さらに非選択条件下で培養して前記プラスミドを脱落させることにより、外来ＤＮＡ断片を含むが、選択マーカー遺伝子を含まない株を選択する方法。
【０３９６】
（８４） 前記プラスミドが（８１）記載のベクターである、（８２）記載の形質転換法。
【０３９７】
（８５） 相同ＤＮＡ配列を両末端に有するＤＮＡ断片が異種遺伝子を含むものである、（８２）の形質転換法。
【０３９８】
（８６） 異種遺伝子を含むＤＮＡ配列と、キャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡと相同な配列（「相同ＤＮＡ配列」）とを含んでなり、かつマーカー遺伝子を含まないベクターであって、前記異種遺伝子を含むＤＮＡ配列がその両端において前記相同ＤＮＡ配列に挟まれてなり、前記相同ＤＮＡ配列において制限酵素切断され直鎖状とされて、相同組換えによって前記異種遺伝子を含むＤＮＡ配列をキャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡに組み込むことができる、ベクター。
【０３９９】
（８７） 相同ＤＮＡ配列が、（１）〜（５）いずれか一項に記載のｒＲＮＡ遺伝子配列、（７）〜（８）いずれか一項に記載のＰＭＡ遺伝子配列のＵＲＡ３遺伝子配列、（１０）〜（１２）いずれか一項に記載のＬ４１遺伝子配列、ＰＧＫ遺伝子配列、ＧＡＰ遺伝子配列、またはＰＭＡ遺伝子配列のうちいずれか、またはそれらの部分ＤＮＡ配列から選択される、（８６）記載のベクター。
【０４００】
（８８） 異種遺伝子を含むＤＮＡ配列で形質転換された、キャンディダ・ユティリス形質転換体。
【０４０１】
（８９） 異種遺伝子を含むＤＮＡ配列が（４４）〜（６３）いずれか一項に記載のベクターである、（８８）記載のキャンディダ・ユティリス形質転換体。
【０４０２】
（９０） 異種遺伝子を含むＤＮＡ配列が（８６）または（８７）記載のベクターである、（８８）記載のキャンディダ・ユティリス形質転換体。
【０４０３】
（９１） 選択マーカー遺伝子を含まない、（９０）記載のキャンディダ・ユティリス形質転換体。
【０４０４】
（９２） キャンディダ・ユティリスがＡＴＣＣ９２５６、ＡＴＣＣ９２２６、およびＡＴＣＣ９９５０からなる群から選択されるものである、（８８）〜（９１）いずれか一項に記載のキャンディダ・ユティリス形質転換体。
【０４０５】
（９３） 異種遺伝子によりコードされるペプチドの製造法であって、（８８）〜（９２）いずれか一項に記載のキャンディダ・ユティリス形質転換体を培養し、該培養物から異種遺伝子の発現産物を単離、精製することを含んでなる、方法。
【０４０６】
（９４） 選択マーカー遺伝子として、転写のためのプロモーター配列を持たない薬剤耐性遺伝子を含んでなり、キャンディダ・ユティリス酵母内で、プラスミドとして存在しうる、（８１）記載のプラスミド。
【０４０７】
（９５） 薬剤耐性遺伝子がＧ４１８耐性を与えるバクテリアトランスポゾンＴｎ９０３由来のＡＰＴ遺伝子である、（９４）記載のプラスミド。
【０４０８】
（９６） プラスミドｐＰＣＶ２である、（９５）記載のプラスミド。
【０４０９】
（９７） （９４）〜（９６）いずれか一項に記載のプラスミドの薬剤耐性遺伝子の５’側にＤＮＡの制限酵素部分分解断片をクローン化したＤＮＡライブラリーによって、キャンディダ・ユティリスを形質転換し、当該薬剤耐性となる形質転換体を選択し、その形質転換体から回収されるプラスミドＤＮＡからキャンディダ・ユティリス酵母内で機能する転写プロモーター活性を有するＤＮＡ断片を単離する、転写プロモーター活性を有するＤＮＡの単離方法。
【０４１０】
（９８） 制限酵素で部分分解されたＤＮＡがキャンディダ・ユティリス酵母染色体ＤＮＡである、（９７）記載の方法。
【０４１１】
（９９） （９７）または（９８）記載の方法により単離され得る、キャンディダ・ユティリス酵母内で転写プロモーター活性を有するＤＮＡ断片。
【０４１２】
（１００） ＤＮＡ断片が制限酵素ＡｌｕＩ、ＨａｅIII 、またはＲｓａＩ、もしくはその組み合わせの制限酵素分解により染色体から切り出され、かつ０．８〜１．８ｋｂの長さを有する、（９９）記載のＤＮＡ断片。
【０４１３】
（１０１） 図４８に記載の塩基配列（配列番号：１３）、またはキャンディダ・ユティリス酵母内で転写プロモーター活性を有するその部分配列を含んでなる、ＤＮＡ断片。
【０４１４】
（１０２） （９９）〜（１０１）いずれか１つに記載のプロモーター配列と、その下流に連結されてなる異種遺伝子とを含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０４１５】
（１０３） （１０２）記載のＤＮＡ配列で宿主細胞を形質転換し、当該形質転換細胞を培養して異種遺伝子を発現させることを含んでなる、異種遺伝子の発現法。
【０４１６】
（１０４） 宿主細胞がキャンディダ・ユティリスである、（１０３）記載の異種遺伝子の発現法。
【０４１７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子を含むプラスミドの制限酵素地図とＤＮＡ塩基配列決定のストラテジー、およびＰＣＲによるプロモーター、ターミネーター各断片の取得法を示す図である。
【図２】ＰＧＫ遺伝子ターミネーターを含むＤＮＡ断片の塩基配列を表す図である。
【図３】ＰＧＫ遺伝子プロモーターを含むＤＮＡ断片の塩基配列を表す図である。
【図４】ＰＧＫ遺伝子プロモーター、およびターミネーターを利用した発現ベクタープラスミドの構築の説明図である。
【図５】リボソームＤＮＡを含むプラスミドの制限酵素地図である。
【図６】リボソームＤＮＡの構造と、ＤＮＡ塩基配列決定のストラテジーおよびサブクローニングされたプラスミドの構造を表す図であって、図６（ａ）はプラスミドｐＣＲＥ１、ｐＣＲＥ２、ｐＣＲＥ３、ｐＣＲＸ１、ｐＣＲＸ２、ｐＣＲＸ３、およびｐＣＲＸ４プラスミドの構造を表し、図６（ｂ）はキャンディダ・ユティリスのリボソームＤＮＡを含んだ約１３．５ｋｂのＤＮＡフラグメントの制限酵素地図である。
【図７】ＵＲＡ３遺伝子を含むプラスミドの制限酵素地図と、それらプラスミドのサッカロマイセス・セレビシエｕｒａ３−変異の相補能を表す図である。
【図８】ＵＲＡ３遺伝子のＤＮＡ塩基配列決定のストラテジーと、制限酵素地図である。
【図９】ＵＲＡ３遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を表す図である。
【図１０】ＵＲＡ３遺伝子の塩基配列から推定されるアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡの塩基配列を表す図である。
【図１１】ＵＲＡ３遺伝子の塩基配列から推定されるアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡの塩基配列であって、図１０の続きの配列を表す図である。
【図１２】Ｌ４１遺伝子を含むプラスミドの制限酵素地図と、ＤＮＡ塩基配列決定のストラテジーを示す図である。
【図１３】Ｌ４１遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を表す図である。
【図１４】Ｌ４１遺伝子の塩基配列から推定されるアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡの塩基配列を表す図である。
【図１５】プラスミドｐＣＬＢＳ１０、およびｐＣＬＢＳ１２の構築の説明図である。
【図１６】プラスミドｐＣＬＲＥ２、ｐＣＬＲＥ３、ｐＣＬＲＸ１、およびｐＣＬＲＸ２の構築を表す図である。
【図１７】さまざまな電気パルス条件でのＡＴＣＣ９９５０生菌率、および形質転換体数を調べた結果を表す図である。
【図１８】プラスミドｐＣＬＲＥ２によって形質転換されたＡＴＣＣ９９５０株のＤＮＡのサザンブロッティング解析の結果を表す電気泳動図である。
【図１９】プラスミドｐＣＬＲＥ２によって形質転換されたＡＴＣＣ９２２６株、ＡＴＣＣ９２５６株、およびＡＴＣＣ９９５０株のＤＮＡのサザンブロッティング解析の結果を表す電気泳動図である。
【図２０】プラスミドｐＣＬＲＥ４、ｐＣＬＲＥ５、ｐＣＬＲＥ６、およびｐＣＬＲＥ７の構築を表す図である。
【図２１】プラスミドｐＣＬＲＥ４、ｐＣＬＲＥ５、ｐＣＬＲＥ６、およびｐＣＬＲＥ７によって形質転換されたＡＴＣＣ９９５０株のＤＮＡのサザンブロッティング解析の結果を表す電気泳動図である。
【図２２】プラスミドｐＣＬＵＲＡ１によって形質転換されたＡＴＣＣ９９５０株のＤＮＡのサザンブロッティング解析の結果を表す電気泳動図である。
【図２３】プラスミドｐＣＬＳＴＡ１、およびｐＣＬＲＳＴＡ１の構築の説明図である。
【図２４】プラスミドｐＣＬＲＳＴＡ１により形質転換されたＡＴＣＣ９９５０株の培養上清をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果を表わす電気泳動図である。
【図２５】プラスミドｐＣＬＬＡＣ１、およびｐＣＬＲＬＡＣ１の構築の説明図である。
【図２６】プラスミドｐＣＬＡＰＨ１、およびｐＣＬＲＡＰＨ１の構築の説明図である。
【図２７】異なる薬剤耐性マーカー（ＣＹＨｒ：シクロヘキシミド耐性、Ｇ４１８ｒ：Ｇ４１８耐性）により選択されたプラスミドｐＣＬＲＡＰＨ１によるＡＴＣＣ９９５０株形質転換体のＤＮＡのサザンブロッティング解析の結果を表す電気泳動図である。
【図２８】プラスミドｐＣＲＥ８、ｐＣＲＡＰＨ２、ｐＣＲＡＰＨ３、ｐＣＲＡＰＨ４、ｐＣＲＡＰＨ５、およびｐＣＲＡＰＨ６の構造を示した図である。
【図２９】グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子を含むプラスミドの制限酵素地図とＤＮＡ塩基配列決定のストラテジー、およびＰＣＲによるプロモーター、ターミネーター各断片の取得法を示す図である。
【図３０】ＧＡＰ遺伝子プロモーターを含むＤＮＡ断片の塩基配列を表す図である。
【図３１】ＧＡＰ遺伝子ターミネーターを含むＤＮＡ断片の塩基配列を表す図である。
【図３２】ＧＡＰ遺伝子プロモーター、およびターミネーターを利用した発現ベクタープラスミドの構築の説明図である。
【図３３】原形質膜プロトンＡＴＰａｓｅ（ＰＭＡ）遺伝子を含むプラスミドの制限酵素地図とＤＮＡ塩基配列決定のストラテジー、およびＰＣＲによるプロモーター、ターミネーター各断片の取得法を示す図である。
【図３４】ＰＭＡ遺伝子プロモーターを含むＤＮＡ断片の塩基配列を表す図である。
【図３５】ＰＭＡ遺伝子ターミネーターを含むＤＮＡ断片の塩基配列を表す図である。
【図３６】ＰＭＡ遺伝子プロモーター、およびターミネーターを利用した発現ベクタープラスミドの構築の説明図である。
【図３７】ＡＲＳを含むＤＮＡ断片のクローニングベクターｐＧＫＡＰＨ２の構造を示す図である。
【図３８】ＡＲＳを含むプラスミド６種類の挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を示した図である。
【図３９】プラスミドｐＣＡＲＳ６とその挿入ＤＮＡ断片がサブクローン化された４種類のプラスミドの挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を示した図である。
【図４０】プラスミドｐＣＡＲＳ７とその挿入ＤＮＡ断片がサブクローン化された５種類のプラスミドの挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を示した図である。
【図４１】プラスミドｐＣＡＲＳ６−２の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を表す図である。
【図４２】プラスミドｐＣＡＲＳ６−２の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を表す図であって、図４１の続きの配列を表す図である。
【図４３】プラスミドｐＣＡＲＳ７−６の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を表す図である。
【図４４】プラスミドｐＣＡＲＳ７−６の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を表す図であって、図４３の続きの配列を表す図である。
【図４５】プラスミドｐＣＡＲＳ６あるいはｐＣＡＲＳ７によって形質転換されたＡＴＣＣ９９５０株のＤＮＡ（１）あるいはプラスミドｐＣＬＡＣ１によって形質転換されたＡＴＣＣ９９５０株のＤＮＡ（２）のサザンブロッティング解析の結果を表す電気泳動図である。
【図４６】ＡＴＣＣ９９５０株、ＡＴＣＣ９２２６株、ＡＴＣＣ９２５６株、ＫＰ−２０５９Ｐ株、そしてＳ２８８Ｃ株のＤＮＡについてＣＵＡＲＳ１（１）、ＣＵＡＲＳ２｛（２）および（３）｝をプローブとしたサザンブロッティング解析の結果を表す電気泳動図である。
【図４７】プロモータークローニングベクターｐＰＣＶ２の構築の説明図である。
【図４８】プラスミドｐＰＣＲＶ１９のプロモーター活性を示すＤＮＡ断片の塩基配列を表す図である。
【図４９】プラスミドｐＧＫＨＰＴ１の構築の説明図である。
【図５０】共形質転換法により形質転換されたＡＴＣＣ９９５０株ＤＮＡのＰＣＲ解析の結果を表す電気泳動図である。
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、キャンディダ・ユティリスに関する再現性のある形質転換系に関し、より具体的には、組換えＤＮＡによる酵母キャンディダ・ユティリスの形質転換、およびその結果得られた新規な形質転換体における異種遺伝子の発現に関する。また、本発明は、形質転換において選択マーカー遺伝子として利用可能な新規ＤＮＡ配列、異種遺伝子の発現のためのプロモーター、およびターミネーターとして利用可能な新規ＤＮＡ配列にも関する。さらに、本発明は、酵母染色体への異種遺伝子の効率的な組み込み法にも関する。
【０００２】
また、さらに本発明はキャンディダ・ユティリスにおいて自律複製機能を有し、形質転換効率を上げる機能を持つＤＮＡ断片、およびそれを利用した、選択マーカー遺伝子を含まないＤＮＡ断片を染色体に組み込む方法、ならびにプロモーター活性を有するＤＮＡ配列の取得法にも関する。
【０００３】
背景技術
遺伝子組換え技術の発展は、微生物を利用して有用な蛋白質を大量に製造することを可能にしてきた。このための宿主として大腸菌や枯草菌などの原核生物の系は簡便であり、特に大腸菌は最も頻繁に利用される宿主である。しかし、大腸菌で生産される蛋白質は不溶性となることが多く、また分泌させても糖鎖付加を受けないなどの制約から、多様なニーズを十分に満足するものではない。また、生産された有用蛋白質を医薬品として用いる場合には、大腸菌の生産する発熱性毒性因子の除去が問題となる。
【０００４】
これら原核生物の系に対して、真核生物である酵母を組換えＤＮＡによる有用蛋白質生産の宿主として使用することは以下の点で魅力的である。まず、酵母のうちサッカロマイセス属酵母は古くから酒類など発酵性食品の生産に利用されてきており、またキャンディダ・ユティリス酵母は食飼料用に生産されていることから、これらの酵母については安全性が高いことが知られている。さらに、酵母は一般に細菌よりも高い細胞密度で培養することができ、かつ連続培養も可能である。また、酵母は蛋白質を培地中に分泌し、分泌された蛋白質は糖鎖による修飾を受ける。このため、酵母による蛋白質の生産は、このような修飾が生物活性に重要である場合に価値がある。
【０００５】
酵母のうち、今日まで最も良く研究されて遺伝学的知見が蓄積している酵母にはサッカロマイセス属酵母があり、この酵母は種々の物質生産の宿主として検討がなされている。また、近年、サッカロマイセス属酵母以外の酵母としてピキア属酵母、ハンセヌラ属酵母、クルイベロマイセス属酵母、キャンディダ属酵母などいくつかの種について、それらを形質転換する手法が開発され、有用物質生産の宿主として検討されている。このうち、キャンディダ属酵母は、特に、炭素資化域が広いなど、サッカロミセス属酵母にない特性を有し実用上有利である。このことから、キャンディダ属酵母は組換えＤＮＡによる有用物質の生産にとってその利用が期待される。
【０００６】
キャンディダ属酵母のなかでもキャンディダ・ユティリス(Candida utilis)は、キシロースを始めとするペントースに対する優れた資化性を示す。また、サッカロマイセス酵母と異なり、好気的条件下での培養でエタノールを生成せず、それによる増殖阻害も受けないことから、高密度での連続培養による効率的な菌体製造が可能である。従って、かつて蛋白質源として注目され、ペントースを多く含む広葉樹の糖化液や亜硫酸パルプ廃液を糖源とした菌体の工業生産が実施されたことがある。また、この酵母はアメリカＦＤＡ（Food and Drug Administration）により、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・フラジリスとともに、食品添加物として安全に使用できる酵母として認められている。実際にキャンディダ・ユティリスは現在でもドイツを始めとしてアメリカや台湾、ブラジルなど世界各国で生産され、食飼料として使用されており、安全性についてはすでに確認されているといえる。
【０００７】
以上のような微生物蛋白質としての利用以外にも、キャンディダ・ユティリスは、ペントースやキシロースの発酵株、エチルアセテート、Ｌ−グルタミン、グルタチオン、インベルターゼ等の生産株として広く産業界で利用されてきた。
【０００８】
しかしながら、今日までこのように有用なキャンディダ・ユティリスの形質転換に成功し、それを証明した報告はない。これは、キャンディダ・ユティリスが２倍体以上の倍数体であり、従来のニトロソグアニジンやエチルメタンスルホン酸などの変異源を用いた突然変異誘起処理によって適当な栄養要求性などの選択符号が付加された変異株の取得が著しく困難であったことによる、と考えられる。このことは、過去においてキャンディダ・ユティリスのＡＤＥ１やＬＥＵ２など、他の酵母で形質転換の選択マーカーとして頻繁に使用される遺伝子が取得されながら（西矢ら、特開平４−６６０８９号公報、小林ら、特公平１−４２６７３号公報）、対応する遺伝子に変異をもつキャンディダ・ユティリス宿主株が得られたという報告が現在までなかったことからも推察することができる。すなわち、キャンディダ・ユティリスには、栄養要求性株を宿主としてその栄養要求性を相補する遺伝子を導入し形質転換体を直接選択するという、従来より各種酵母における形質転換系の開発に用いられてきた手法の適用ができなかったのである。
【０００９】
さらに、キャンディダ・ユティリスは、その倍数性が高く、胞子形成しないため遺伝学的特性が未だ十分に明らかにされていない。そのため、形質転換条件、さらにはベクター系が満たすべき条件も不明であり、その宿主／ベクター系の確立も極めて困難なものであることが予想される。
【００１０】
なお、キャンディダ・ユティリスに関する薬剤耐性マーカーを用いた予備的な形質転換の検討例は、ホーらにより紹介されている(HO, N.W.Y. et. al.Biotechnology and Bioengineering Symp. No.14, 295-301,1984 ) 。しかしながら、この報告においては、形質転換実験の条件、形質転換体であると主張する薬剤耐性株についてその証明に不可欠なサザン解析などのデータが開示されておらず、不十分な報告である。
【００１１】
このことから、依然として、キャンディダ・ユティリスに関する再現性ある形質転換系、さらにそれを利用した有用物質の生産技術の確立が望まれているといえる。
【００１２】
【発明の概要】
本発明者らは、今般、キャンディダ・ユティリス酵母から再現性よく形質転換体を取得することに成功し、形質転換体における異種遺伝子の発現について種々の知見を得た。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【００１３】
従って、本発明は、キャンディダ・ユティリスの再現性のある形質転換系の提供をその目的としている。
【００１４】
また本発明は、キャンディダ・ユティリス形質転換系で利用可能な、選択マーカーとなる遺伝子、プラスミドが染色体への組み込まれる際のターゲット配列となる遺伝子、異種遺伝子の発現に必要なプロモーター、ターミネーターなど新規ＤＮＡ配列の提供をその目的としている。
【００１５】
さらに本発明は、キャンディダ・ユティリスにおける異種遺伝子の発現を可能にするベクター系の提供をその目的としている。
【００１６】
また本発明は、異種遺伝子を染色体に複数コピーでかつ安定に組み込ませることのできる宿主／ベクター系の提供をその目的としている。
【００１７】
さらにまた本発明は、キャンディダ・ユティリスにおける異種遺伝子の発現法の提供をその目的としている。
【００１８】
また、さらに本発明はキャンディダ・ユティリスで自律複製機能を有し、形質転換効率を上げる機能を持つＤＮＡ断片、およびそれを含むプラスミドベクター、その利用による選択マーカー遺伝子を含まないＤＮＡ断片を染色体に組み込む方法、ならびにプロモーター活性を有するＤＮＡ配列の取得法、それにより得られたプロモーター活性を有する新規ＤＮＡ配列の提供をその目的としている。
【００１９】
本発明による新規ＤＮＡ配列群は、キャンディダ・ユティリスのリボソーム構成蛋白質Ｌ４１をコードする遺伝子、ならびにそのプロモーターおよびターミネーター配列；シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子；ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列；グリセロアルデヒド−３−リン酸- デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列；原形質膜プロトンＡＴＰａｓｅ（ＰＭＡ）遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列；ＵＲＡ３遺伝子、ならびにそのプロモーターおよびターミネーター配列；二種類の自律複製能を有するＤＮＡ断片；プロモーター活性を有するＤＮＡ断片の配列；そして、キャンディダ・ユティリスのリボソームＲＮＡをコードするｒＲＮＡ遺伝子である。
【００２０】
本発明によるキャンディダ・ユティリスの形質転換系で利用可能なベクターは、キャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡと相同な配列と、選択マーカー遺伝子とを含んでなり、相同組換えによって異種遺伝子をキャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡに組み込むことができるもの、あるいは、キャンディダ・ユティリスで自律複製機能を有するＤＮＡ配列と、選択マーカー遺伝子とを含んでなり、高い頻度でキャンディダ・ユティリスを形質転換できるもの、である。
【００２１】
また、本発明によるキャンディダ・ユティリスの形質転換系で利用可能なベクターは、選択マーカー遺伝子を含まず、キャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡと相同な配列を含んでなり、相同組換えによって異種遺伝子をキャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡに組み込むことができるもの、である。このプラスミドは、この自律複製機能を有するＤＮＡ配列と、選択マーカー遺伝子とを含んでなるプラスミドと同時に形質転換に用いることができる。
【００２２】
さらにまた、本発明によるキャンディダ・ユティリスの形質転換系で利用可能な選択マーカー遺伝子は、キャンディダ・ユティリスで機能し得る薬剤耐性マーカー、好ましくはシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子、Ｇ４１８耐性を付与する遺伝子、またはハイグロマイシンＢ耐性を付与する遺伝子である。
【００２３】
さらに、本発明によるキャンディダ・ユティリスにおける異種遺伝子の発現法は、異種遺伝子を含む前記本発明によるベクターでキャンディダ・ユティリスを形質転換し、得られた形質転換体を培養し、該培養物から異種遺伝子の発現産物を単離、精製することを含んでなるものである。
【００２４】
そして、本発明によるキャンディダ・ユティリスの形質転換系とは、これらの本発明による新規ＤＮＡ群、ベクター系などの機能的組み合わせによって得られるものである。
【００２５】
【発明の具体的説明】
キャンディダ・ユティリス酵母
本発明による形質転換系が適用されるキャンディダ・ユティリスの具体的菌株としては、例えばＡＴＣＣ９２５６（ＩＦＯ ０６２６）、ＡＴＣＣ９２２６（ＩＦＯ １０８６）、ＡＴＣＣ９９５０（ＩＦＯ ０９８８）、ＩＦＯ ０３９６、ＩＦＯ ０６１９、ＩＦＯ ０６３９、ＫＰ−２０５９Ｐ株などが挙げられる。
【００２６】
なお、キャンディダ・ユティリスは株によってその染色体泳動パターンが異なり、染色体の長さの多型性を示すことが報告されている(Stoltenburg et. al. Curr. Genet. 22 441-446(1992) ）。従って、本発明による形質転換系はその多型性に起因して適用が制限されることが予想された。しかし、後記する実施例において使用した３株についてはそれぞれ染色体多型が認められたものの、いずれについても形質転換体が得られ、また異種遺伝子の発現も確認できた。このことから、本発明による形質転換系がキャンディダ・ユティリス全般について適用可能であることは、当業者にとって容易に推測できるものと考える。
【００２７】
形質転換系
一般に生物の形質転換系を開発するためには、（ａ）形質転換体を選別するための選択マーカー遺伝子および形質転換体の選択方法、（ｂ）プラスミドＤＮＡが宿主細胞内で核外遺伝子として存在するために必要な自律複製能を有するＤＮＡ配列（ＡＲＳ）、またはプラスミドを効率的に染色体に組み込ませるために必要な適当な染色体ＤＮＡ相同配列（すなわち、プラスミドＤＮＡの組み込みターゲットの確立）、さらに、（ｃ）宿主細胞を細胞外ＤＮＡを取り込み可能な状態にする処理方法、の３つの要素が必要となり、これら３つの要素がそろって形質転換体を取得することが可能となる。したがって、遺伝学的な情報がほとんど得られていないキャンディダ・ユティリスの形質転換系の確立にあたっては、これらすべての要素について検討し、開発することが必要不可欠であった。
【００２８】
（ａ）選択マーカー遺伝子および形質転換体の選択
形質転換体を選別するための選択マーカー遺伝子としては、変異処理により栄養要求性となった宿主株が利用できる場合、その栄養要求性を相補する遺伝子を選択マーカー遺伝子として用いることができる。この場合、培地から当該栄養素を除いた最少培地で形質転換体を直接選択することが可能である。しかし、キャンディダ・ユティリスの場合には、前記したように、適当な栄養要求性などの選択符号が付加された変異株の取得が著しく困難であり、栄養要求性の相補遺伝子を選択マーカーとした形質転換システムの開発が不可能であった。
【００２９】
発明者らは、キャンディダ・ユティリスが、抗生物質Ｇ４１８やハイグロマイシンＢ、シクロヘキシミドなどに感受性であり、培地中にそれらの薬剤を添加することによって菌の生育を抑えることが可能であることを見出した。そこで、形質転換体選択マーカー遺伝子として、それらの薬剤に耐性を与える遺伝子を利用することを試みることとした。
【００３０】
ここでＧ４１８耐性遺伝子（アミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ遺伝子）やハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（ハイグロマイシンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝子）などの、他の生物由来の遺伝子を利用する場合、遺伝子の発現を確実にするためにキャンディダ・ユティリスで機能する転写のプロモーターおよびターミネーター配列を利用するのが好ましい。
【００３１】
キャンディダ・アルビカンスなどの一部のキャンディダ属酵母においては、一部コドンの翻訳のされ方が他の生物とは異なっていることも報告されており(Ohama et. al. Nucleic Acids Res. 21 4039 - 4045 1993)、異種遺伝子を選択マーカー遺伝子とする場合には、それが宿主内で機能を持つ蛋白質に翻訳されるという保証はない。一方で、シクロヘキシミドに対する感受性はリボソーム蛋白質であるＬ４１蛋白質の５６番目残基により決定されるという興味深い事実が報告されている（Kawai et. al. J Bacteriol. 174 254-262 (1992) ）。
【００３２】
そこで本発明者らは、シクロヘキシミドに感受性であるキャンディダ・ユティリスのＬ４１蛋白質の遺伝子を取得し、それを部位特異的変異法によりシクロヘキシミド耐性型に変換して選択マーカー遺伝子とし、それを利用した。ここで、この遺伝子は宿主由来であるため、発現のプロモーターおよびターミネーター配列はその遺伝子自身の配列をそのまま用いることとした。よって本態様は、遺伝子の確実な発現が期待できる点で極めて有利である。
【００３３】
従って、本発明によるキャンディダ・ユティリスの形質転換系において用いられる選択マーカーとしての薬剤耐性遺伝子マーカーは、好ましくはシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子である。Ｌ４１遺伝子、ならびにプロモーターおよびターミネーター配列を含んだＤＮＡ断片の塩基配列は図１３（配列番号：５）に示される通りであり、さらにその塩基配列から推定されるアミノ酸配列は図１４（配列番号：６）に示される通りである。また、シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子は、図１３に示される配列の１６４４番目のヌクレオチドＣがＡに変換されたものであり、その結果、図１４に示される配列の５６番目のアミノ酸はＰｒｏがＧｌｎに置換される。
【００３４】
また、本発明による形質転換系における他の好ましい薬剤耐性遺伝子マーカーとして、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与するアミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ（ＡＰＴ）遺伝子もまた使用できる。アミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ遺伝子にはトランスポゾンＴｎ９０３とトランスポゾンＴｎ５由来の２種類が知られており、いずれの遺伝子も本発明において使用可能である。また、抗生物質ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与する大腸菌由来のハイグロマイシンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝子もまた本発明による形質転換系において使用できる。このＧ４１８耐性遺伝子やハイグロマイシンＢ耐性遺伝子など異種遺伝子の場合は、遺伝子発現のためにキャンディダ・ユティリスで機能する転写のプロモーターおよびターミネーター配列をそれぞれ異種遺伝子の５´上流と３´下流とに組み込むのが好ましい。
【００３５】
この転写のプロモーターおよびターミネーター配列としては、キャンディダ・ユティリスの遺伝子由来であるのがより好ましく、例えば、後記するキャンディダ・ユティリスのホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列；グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列；および原形質膜プロトンＡＴＰａｓｅ（ＰＭＡ）遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列などが利用出来る。また、後述するプロモータークローニング用ベクターにより取得されるプロモーター活性を有するＤＮＡ配列なども利用できる。
【００３６】
また、上記系において利用可能な他のプロモーターおよびターミネーター配列の例としては、サッカロマイセス酵母で公知のＡＤＨ、ＥＮＯ、ＧＡＬ、ＳＵＣなどの遺伝子のキャンディダ・ユティリスにおける相同遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列などを挙げることができる。
【００３７】
さらに、形質転換体の選択マーカーとして利用可能な細菌由来の薬剤耐性遺伝子としては、前記したＧ４１８耐性遺伝子およびハイグロマイシンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝子のほかに、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（クロラムフェニコール耐性)(Hadfield, C. et.al. Gene, 45, 149-158(1986))、ブラストサイジンデアミナーゼ（ブラストサイジン耐性）（Izumi, M. et. al. Exp. Cell Res., 197, 229-233 （1991) ）、フレオマイシン耐性遺伝子（Wenzel, T.J.et. al. Yeast, 8, 667-668 (1992) ）などの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。この他に、ディハイドロフォレートレダクターゼ遺伝子（メトトレキセート耐性） （Miyajima, A. et. al. Mol. Cell Biol. 4, 407-414 (1984)）や、酵母由来の優性遺伝子スルホメツロンメチル耐性遺伝子（Casey, G.P. et. al. J. Inst. Brew. 94, 93-97 (1988)）、CUP1遺伝子（銅耐性）(Henderson，R.C.A. et. al. Current Genet. 9, 133-138 (1985)）、CYH2遺伝子（シクロヘキシミド耐性）（Delgado, M. et．al. EBC congress, 23, 281-288 (1991)）など、公知の薬剤耐性遺伝子も利用できる。このうちマーカー遺伝子が細菌やトランスポゾンの遺伝子など異種生物由来である場合には、上記したようなキャンディダ・ユティリス内で機能するプロモーター、およびターミネーター配列を利用するのが好ましい。
【００３８】
（ｂ）プラスミドＤＮＡの組み込みターゲットの確立
シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子をはじめとする利用可能な選択マーカーが前記のように本発明によって確立されたことから、これらの配列に限らずキャンディダ・ユティリス染色体由来の種々の配列がターゲット配列としての利用可能であることが期待される。
【００３９】
本発明の好ましい態様によれば、プラスミドを染色体に組み込ませるために必要な適当な染色体ＤＮＡ断片として、リボソームＲＮＡをコードする遺伝子であるｒＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）、ＵＲＡ３遺伝子、Ｌ４１遺伝子、およびＰＧＫ遺伝子を好ましく使用することができることが見出された。
【００４０】
ｒＲＮＡ遺伝子については、サッカロマイセス・セレビシエにおいてｒＤＮＡが染色体上にタンデムに１００コピー以上存在し、その反復単位のなかに自律複製配列（ＡＲＳ）が存在することが報告されている（Saffer &Miller, JR. Molec. Cell. Biol. 6, 1148-1157, (1986) ）。また、このｒＤＮＡ領域をプラスミド組み込みの ターゲットとすることにより、組み込みの形質転換頻度を高くできることが報告されている（Lopes, et. al. Gene 79, 199-206 (1989) ）。
【００４１】
本発明者らは、キャンディダ・ユティリスにおいてもｒＤＮＡが染色体上に反復して存在することを見出した。これにより、サッカロマイセス・セレビシエ同様、キャンディダ・ユティリスのｒＤＮＡ配列は、高頻度組み込みのためのターゲット配列としての利用が可能であることが示唆され、事実、キャンディダ・ユティリスの形質転換系において組換えターゲットとして有利に利用することができた。
【００４２】
興味あることに、ｒＲＮＡ遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、Ｌ４１遺伝子、およびＰＧＫ遺伝子などのキャンディダ・ユティリス染色体をターゲットとし、後記する本発明によるベクター系を用いて、キャンディダ・ユディリス酵母を形質転換すると、ＤＮＡ断片が染色体上に組み込まれ、酵母に安定に保持されることが観察された。従って、このターゲットとベクター系との組み合わせにより、異種遺伝子が自律複製を続ける染色体外プラスミドとして保持される場合の外来遺伝子の不安定性の問題を排除することができる。
【００４３】
本発明において、形質転換体により組み込まれたＤＮＡ断片の存在様態を詳しく解析した結果、ＤＮＡ断片のキャンディダ・ユティリス染色体への組み込みは主に相同組換えによって起きることが明らかとなった。これは、宿主染色体ターゲット配列に対するホモロジーを有するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子であれば、それを任意の染色体ターゲットに組み込むことが可能であることを意味する。
【００４４】
具体的には、ターゲット配列に対するホモロジーを有するＤＮＡ配列を、その相同ＤＮＡ配列内の適当な制限酵素サイトで分解して直鎖状としたプラスミドＤＮＡをベクターとして使用し、あるＤＮＡ断片をキャンディダ・ユティリス染色体のターゲット配列上に組み込むことができる。この場合、選択マーカーをシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子にすることにより、後述するように複数のプラスミド分子が同時に組み込まれた形質転換体が効率的に選択される。
【００４５】
また、染色体ターゲット配列に対するホモロジーを有するＤＮＡ配列の内部に選択マーカー遺伝子を含んだ形態の線状ＤＮＡ断片を用いることも可能である。
【００４６】
本発明による本態様の形質転換において、プラスミドは、染色体上の相同な遺伝子と置き換わる形で挿入される。このため、挿入されたＤＮＡ断片の前後には、ターゲット配列の反復配列が形成されず、よって、組み込まれたＤＮＡのより高い安定性が期待される。
【００４７】
ここで、ＵＲＡ３遺伝子、Ｌ４１遺伝子、ＰＧＫ遺伝子などは、他の多くの遺伝子と同様に１細胞あたり２コピーしか存在しない遺伝子であるが、ＤＮＡ断片組み込みのターゲットとして用いることが可能であることが本発明によって示された。また、一般に酵母のｒＲＮＡ遺伝子は１８Ｓ、５．８Ｓ、２５Ｓ、５Ｓの各ｒＲＮＡ遺伝子を含む反復ＤＮＡ単位が１倍体あたり１００コピー以上存在する（Schweizer, E. et. al. J. Mol. Biol. 40, 261-277 (1969)）。そこで、このｒＤＮＡを組換えのターゲット配列としての利用には、他の遺伝子配列を利用した場合と比較して、（１）形質転換頻度が上昇することが期待される、（２）組み込みによるターゲット配列の変化は無視できる、などの利点がある。発明者らは、キャンディダユティリスにおいてもｒＲＮＡ遺伝子が、約１３．５ｋｂのＤＮＡ配列を反復単位としてタンデムに反復して存在していること、を明らかにするとともに（詳細後記）、ｒＤＮＡ配列を組換えのターゲット配列とすることで、細胞あたり２コピー存在するＬ４１遺伝子をターゲットとするよりも形質転換頻度が１０倍から５０倍程度高くなることを明らかにした。また、ｒＤＮＡ座に組み込まれたＤＮＡ断片の安定性も高く、ｒＤＮＡ配列は優れた組み込みターゲットであることが明らかとなった。
【００４８】
本発明においてＤＮＡ断片組み込みのターゲット配列としてｒＤＮＡ配列を用いたことは、このように形質転換頻度を高める効果をもたらし、酵母の処理条件を検討してそのなかから適切な形質転換条件を発見するうえで重要な役割を果たした。しかし、興味あることに、ｒＤＮＡの領域によっては形質転換のターゲットとして用いた場合に形質転換頻度が著しく低くなることが明らかにされ、ｒＤＮＡ断片であればどこでも効率的なプラスミドの組み込みターゲットとして利用できるものではないことが示唆された。
【００４９】
さらに本発明の好ましい態様によれば、シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子を選択マーカーとすることにより、プラスミドが複数個組み込まれた形質転換体を効率的に取得できる。この理由は次のように考えられる。すなわち、シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子を含むＤＮＡ断片が複数コピー組み込まれた場合にのみ、内在性のシクロヘキシミド感受性型Ｌ４１蛋白質が耐性型のものに置き換えられ、シクロヘキシミドによる機能阻害を受けないリボソーム分子の割合が増える。これによって、形質転換体がシクロヘキシミドを含む培地で生育できることとなると考えられる。この場合の組み込みのターゲット部位としてはＵＲＡ３遺伝子座、Ｌ４１遺伝子座などのキャンディダ・ユティリス染色体由来のＤＮＡ配列であれば基本的にいずれの配列も利用できる。また、興味深いことに、このうち特にｒＲＮＡ遺伝子座をその組み込みのターゲット配列とすることによって、他遺伝子座をターゲット配列とした場合に比較してＤＮＡ断片がより多く組み込まれる傾向があることが示された。
【００５０】
（ｃ）形質転換方法
形質転換方法、すなわち宿主細胞を細胞外ＤＮＡを取り込み可能な状態にする処理方法としては、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、電気パルス法、およびそれらの改変法などの、サッカロマイセス・セレビシエの形質転換に従来用いられている方法の利用が考えられる。このうちプロトプラスト法は広く使用されている形質転換法であるが、操作がやや煩雑であり、薬剤耐性で形質転換体を選択する際には、非形質転換体であるバックグランドコロニーの出現がしばしば問題となる。
【００５１】
そこで本発明者らは、酢酸リチウム法ならびに電気パルス法を用いて、先に述べたシクロヘキシミド耐性Ｌ４１遺伝子とｒＤＮＡ断片を組み合わせたプラスミドによって、キャンディダ・ユティリスの形質転換を試み、再現性良く形質転換体を得ることのできる条件を見出した。
【００５２】
キャンディダ・ユティリスの形質転換は、電気パルス法によるのが好ましい。菌体を対数増殖期にまで増殖させた後、洗浄して１Ｍソルビトールに懸濁する。電気パルスの条件は、タイムコンスタント値（電圧が最大値の約３７％にまで減衰するまでの時間）が約１０から２０ミリ秒であり、パルス後の生菌率が約１０−４０％となる条件であれば良い。例えば、本発明の好ましい態様によれば、電気容量が２５μＦ、抵抗値が６００〜１０００オーム、電圧が３．７５〜５ＫＶ／ｃｍの条件で、上記のタイムコンスタント値と生菌率が得られ、１μｇＤＮＡあたり約５００〜１４００個の形質転換体が得られることが示された。
【００５３】
また、電気パルスを加えた後、菌液に１Ｍソルビトールを含むＹＰＤ培地を加え３０℃で振盪培養することが好ましく、培養せずに菌を直接シクロヘキシミドを含む選択プレートに塗布するとコロニーが得られない場合があることが見出だされた。また、培養時間は４〜６時間程度が適当であり、その後は形質転換体の増殖が無視できなくなる。このほか、ＤＮＡと菌体を接触する際にサーモンスパームＤＮＡなどのキャリアＤＮＡを添加することやポリエチレングリコールを添加することなどによって形質転換頻度を高めることも本発明による形質転換系にあっても好ましい。
【００５４】
また、酢酸リチウム法(Ito et al. J. Bacteriol. 153, 163-168 1983)はその簡便さから広くサッカロミセス属酵母の形質転換に用いられており、さまざまな改良法が報告されている。これらの方法を用いてもキャンディダ・ユティリスの形質転換が可能であることが確認された。特に、エタノールを添加するリチウム法変法(Soni et. al. Current Genet. 1993 24, 455-459)によってキャンディダ・ユティリスの形質転換が好ましく可能である。また、集菌時の菌体密度、リチウムの濃度、ポリエチレングリコールの種類と濃度、キャリアＤＮＡの種類、形態、量など異なる条件を試みることにより、酢酸リチウム法によるキャンディダユティリスの形質転換の至適条件を決定して、形質転換頻度を高めることが可能である。上記した本発明による（ａ）選択マーカー遺伝子および（ｂ）組み込みターゲットが確定されたことから、これらは当業者にとり容易であると考える。
【００５５】
なお、形質転換条件を見出す過程で、サッカロマイセス・セレビシエで機能するキャンディダ・ユティリス由来ＡＲＳ配列８種類と、同じくサッカロマイセス・セレビシエで機能するＧ４１８耐性遺伝子発現ユニットとを組み合わせたプラスミドを用いて形質転換を試みたが、形質転換体は取得できなかった。この結果はホーらによるキャンディダユティリスの形質転換の報告(HO, N.W.Y．et. al. 前掲）の再現性を疑わせるものであるといえる。
【００５６】
発現ベクター系および異種遺伝子の発現
本発明によれば、キャンディダ・ユティリスの形質転換に使用される発現ベクター系が提供される。
【００５７】
本発明によるベクターの一つの態様は、キャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡと相同な配列（以下、「相同ＤＮＡ配列」ということがある）を含み、この部分において相同組換えを起こすことにより、プラスミドＤＮＡを染色体に組み込むことを可能にし、かつ形質転換体の選別を可能とする選択マーカー遺伝子を含んでなる、プラスミドＤＮＡである。
【００５８】
ここで、相同ＤＮＡ配列とは好ましくはｒＲＮＡ遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、Ｌ４１遺伝子、ＰＧＫ遺伝子、ＧＡＰ遺伝子、ＰＭＡ遺伝子などが挙げられ、それらはキャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡ由来のものであることが好ましい。用いる配列に依存して染色体上の任意の位置に異種遺伝子を組み込むことが可能である。このプラスミドは、プラスミド分子内の相同ＤＮＡ配列内の適当な制限酵素サイトでの分解によりプラスミドＤＮＡを直鎖状として使用される。その結果、プラスミドＤＮＡ断片はキャンディダ・ユディリス染色体に相同組換えにより組み込まれる。
【００５９】
さらに本発明の好ましい態様によれば、このプラスミドＤＮＡ中で、マーカー遺伝子および異種遺伝子を含むＤＮＡ配列は、その両端において前記相同ＤＮＡ配列に挟まれてなる。この態様では、このプラスミドＤＮＡを相同ＤＮＡ配列において制限酵素切断し、相同ＤＮＡ配列をその両端に有するマーカー遺伝子および異種遺伝子を含むＤＮＡ断片を得る。こうして得たＤＮＡ断片も、また、相同組換えによりキャンディダ・ユディリス染色体ＤＮＡに相同組換えにより組み込まれ得るものである。
【００６０】
なお、本明細書において、「ＤＮＡ断片（または配列）が、キャンディダ・ユディリス染色体に相同組換えにより組み込まれる」とは、ＤＮＡ断片がキャンディダ・ユディリス染色体に組み込まれる限りにおいて、その組み込みの態様は限定されないが、少なくとも次の二つの態様を含む意味に用いることとする。すなわち、（１）キャンディダ・ユディリス染色体のＤＮＡ配列と、ＤＮＡ断片の両端にある相同ＤＮＡ配列部分とが相同組換えを生じ、開裂部分にＤＮＡ断片が”挿入”されて染色体ＤＮＡに組み込まれる態様、および（２）キャンディダ・ユディリス染色体のＤＮＡ配列と、ＤＮＡ断片の両端にある相同ＤＮＡ配列との相同組換えによって、プラスミドＤＮＡ断片がキャンディダ・ユディリス染色体の一部と”置換”されて染色体ＤＮＡに組み込まれる態様のいずれも少なくとも意味するものとする。（２）の態様においては、挿入されたＤＮＡ断片の前後に、ターゲット配列の反復配列が形成されないため、組み込まれたＤＮＡ断片が安定に染色体に存在することが期待される。
【００６１】
また、選択マーカー遺伝子としては前記した薬剤耐性マーカーを利用するのが好ましく、より好ましい薬剤耐性マーカーとしては、シクロヘキシミド耐性を付与する遺伝子、例えばシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子；抗生物質Ｇ４１８耐性を付与する遺伝子、例えばバクテリアトランスポゾンＴｎ９０３由来のＡＰＴ遺伝子；抗生物質ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子などが挙げられる。これら選択マーカー遺伝子が微生物由来である場合は、それらの発現を確かなものとするためにキャンディダ・ユティリスで機能するプロモーターに連結することが好ましい。
【００６２】
また、本発明のもう一つの態様によるベクターは、キャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡと相同な配列（相同ＤＮＡ配列）を含み、この部分において相同組換えを起こすことにより、プラスミドＤＮＡを染色体に組み込むことを可能とするものであり、一方で形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子を持たないプラスミドＤＮＡである。このプラスミドは、プラスミド分子中の相同ＤＮＡ配列内の適当な制限酵素サイトでの分解により直鎖状とし使用される。
【００６３】
また、この態様のプラスミドにおいても、このプラスミドＤＮＡは、異種遺伝子を含むＤＮＡ配列が、その両端において前記相同ＤＮＡ配列に挟まれてなるよう構成されてよい。そして、このプラスミドＤＮＡを相同ＤＮＡ配列において制限酵素切断することによって、相同ＤＮＡ配列をその両端に有するＤＮＡ断片が得られる。こうして得られたＤＮＡ断片も相同組換えによりキャンディダ・ユディリス染色体ＤＮＡに相同組換えにより組み込まれうるものである。
【００６４】
これら直鎖状とされたＤＮＡ断片は、上記した選択マーカー遺伝子を含んでなるプラスミドＤＮＡの場合と同様に、キャンディダ・ユディリス染色体に相同組換えにより組み込まれる。本態様のプラスミドにおいても、上記（２）の態様による組み込みにすることで、組み込まれたＤＮＡ断片が安定に染色体に存在することが期待される。
【００６５】
ここで、相同ＤＮＡ配列とは好ましくはｒＲＮＡ遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、Ｌ４１遺伝子、ＰＧＫ遺伝子、ＧＡＰ遺伝子、ＰＭＡ遺伝子などが挙げられる。それらはキャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡ由来のものであることが好ましい。また、用いる配列に依存して染色体上の任意の位置に外来ＤＮＡ断片を組み込むことが可能である。
【００６６】
このベクターは、後述する自律複製配列を含むＤＮＡ配列と選択マーカー遺伝子とを持つプラスミドと同時に形質転換に用いられる。すなわち、自律複製能を有するプラスミドが導入されたことにより選択される形質転換体のなかから、さらに選択マーカー遺伝子を持たないＤＮＡ断片が染色体上に組み込まれた株を二次的に選択することが可能である。選択された株に存在するプラスミドは、その後非選択条件下で菌を培養することによって脱落させることが可能であり、結果として、挿入ＤＮＡ断片だけを染色体上に保持する株を取得することができる。この手法を用いることにより、例えば異種遺伝子のみを保持し、微生物由来の薬剤耐性遺伝子のように余分な配列を含まない株を育種することが可能になる。
【００６７】
またさらに、この自律複製配列を含むＤＮＡ配列と選択マーカー遺伝子とを持つプラスミド自体も、キャンディダ・ユティリス酵母形質転換用のベクターとして利用可能である。このプラスミドは非選択条件下で菌を培養することによって脱落しやすい特徴をもつが、安定性を高めるＤＮＡ断片が後述するように取得でき、このＤＮＡ断片と組み合わせてベクターとして利用することが可能である。
【００６８】
これら本発明によるベクターに異種遺伝子を連結して、異種遺伝子を保持したベクターとすることができる。このベクターによってキャンディダ・ユティリスを形質転換すると、それらの異種遺伝子をキャンディダ・ユティリス染色体に安定に組み込むことが可能である。こうして得られた形質転換体を適当な培地中で培養し、該培養物から異種遺伝子の発現産物を、その発現産物に適した方法で単離、精製することによって、異種遺伝子をキャンディダ・ユティリスで発現させることができる。すなわち、キャンディダ・ユティリスにおける異種遺伝子の発現法が提供される。ここで、異種遺伝子とは通常は宿主のキャンディダユティリス染色体上に本来存在しない遺伝子またはその一部のＤＮＡを意味するものとする。
【００６９】
異種遺伝子は、好ましくは、その異種遺伝子の発現を独立して制御する調節領域と組み合わせるか、または、形質転換の過程で破壊された遺伝子自身の調節領域の影響下にその異種遺伝子を発現させる。そのような配列はキャンディダ・ユティリスで機能する必要があり、その好ましい具体例としては後記する本発明によるＰＧＫ遺伝子、ＧＡＰ遺伝子、およびＰＭＡ遺伝子のプロモーター配列およびターミネーター配列、さらには後述するプロモータークローニング用ベクターにより取得されるプロモーター活性を有するＤＮＡ配列が挙げられる。
【００７０】
後記する実施例から明らかなように、本発明により、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のプロモーター配列およびターミネーター配列を用いて、グルコアミラーゼ遺伝子、アミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ハイグロマイシンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝子などの異種遺伝子の発現に成功した。また、さらにグリセロアルデヒド- ３- リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列、ならびに原形質膜プロトンＡＴＰａｓｅ遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列を用いて、アミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ遺伝子の発現にも成功した。これらの異種タンパク質のうち、グルコアミラーゼは分泌蛋白質であり、アミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼやβ−ガラクトシダーゼは菌体内酵素である。このことは、本発明によるキャンディダ・ユティリスでの異種蛋白質の生産は、それが菌体内あるいは分泌蛋白質いずれであっても可能であることを意味する。さらに、グルコアミラーゼについてはその高レベルの分泌発現が認められ、キャンディダ・ユティリスが異種蛋白質の高生産のための優れた宿主となりうることが明らかにされたといえる。
【００７１】
さらにキャンディダ・マルトーサ、アルビカンスなど一部のキャンディダ属酵母においては、一部コドンの翻訳のされ方が他の生物とは異なっていることも報告されている(Ohama et. al. Nucleic Acids Res. 21 4039 - 4045(1993)) 。キャンディダ・マルトーサを宿主として得られた大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現産物が活性を示さないことは、そのためであるとされている。後記実施例から明らかなように、キャンディダ・ユティリスで産生された、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子産物はその活性を保持していた。このことは、キャンディダ・ユティリスが正常なコドン認識をすることを示しており、これはキャンディダ・ユティリスが異種ポリペプチド生産において好ましい宿主であることを示している。
【００７２】
また、キャンディダ・ユティリスで異種遺伝子を発現することによってキャンディダ・ユティリスの性質を改変することができる。従って、本発明によれば、新たなキャンディダ・ユティリス株の作出法が提供される。例えばその発酵特性を改良し、工業的有用性を増大することが可能である。特にグルコアミラーゼ遺伝子を発現するキャンディダユティリス株は、澱粉資化性が付与されることにより利用可能な炭素源スペクトルが拡大されたといえる。
【００７３】
さらに、本発明によるベクターは、キャンディダ・ユティリス以外の細胞の形質転換に利用することも可能である。キャンディダ・ユティリス以外の細胞を宿主とする場合、形質転換の実施に際して適当なＤＮＡ断片を選択するのが好ましい。そのようなＤＮＡ断片としては、大腸菌の場合、例えばpBluescript やｐＵＣ１９のような細菌のプラスミドＤＮＡが挙げられる。また、サッカロマイセス属酵母の場合、例えばＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０（Methods in Enzymology, 194, p195-230, Academic Press(1991)) などの酵母−大腸菌シャトルベクターが挙げられる。
【００７４】
キャンディダ・ユティリス酵母内で自律複製能を有するＤＮＡ配列のクローニング法
さらに本発明によれば、キャンディダ・ユティリス酵母内で自律複製能を持つＤＮＡ配列をクローン化する手法が提供される。使用するＤＮＡはいかなる生物種由来のものであってもよいが、キャンディダ・ユティリス由来であるのが好ましい。また、このためのベクターとしては、薬剤耐性マーカー遺伝子を含むものが利用でき、好ましくはキャンディダユティリスで機能するプロモーターとターミネーターとにより発現するＧ４１８耐性遺伝子であるＡＰＴ遺伝子を含むベクターを用いることができる。具体的には、ＰＧＫ遺伝子プロモーターで発現するＡＰＴ遺伝子を有するプラスミドをベクターとして用いて、キャンディダ・ユティリス酵母染色体ＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーＤＮＡでキャンディダ・ユティリスを形質転換する。そして、例えばＧ４１８耐性で選択される形質転換体酵母から全ＤＮＡを抽出して、大腸菌を形質転換することにより、形質転換酵母体で、染色体外因子として存在していたプラスミドＤＮＡを回収することができる。このプラスミドＤＮＡに挿入されたキャンディダ・ユティリス由来の染色体ＤＮＡ断片から、自律複製配列（ＡＲＳ）としての機能配列を分離することができる。
【００７５】
驚くべきことに、薬剤耐性マーカーとしてシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子を含むプラスミドをベクターとした場合は、自律複製能を持つＤＮＡ配列をクローン化することはできなかった。すなわち、このプラスミドを用いてキャンディダ・ユティリス酵母染色体ＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーＤＮＡでキャンディダ・ユティリスを形質転換しても、シクロヘキシミド耐性の形質転換体は得られなかった。これは、キャンディダ・ユティリスのＡＲＳの特徴として、それを含むプラスミドの細胞あたりのコピー数が低く、形質転換体を選択するために数コピー必要なシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子と組み合わせても形質転換体を選択できないことを示唆している。これは後に、取得したＡＲＳとシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子とを含むプラスミドによってキャンディダ・ユティリスの形質転換を行っても、形質転換体が得られなかったことからも確認された。後記する実施例に示されるように、分離したＡＲＳを含むＤＮＡ配列の性質を詳しく解析することにより、ＡＲＳを有するプラスミドはキャンディダ・ユティリス酵母内で１細胞あたり約１コピーしか存在しないことが明らかにされた。この他に、分離したＡＲＳの特徴として、それを含むプラスミドが不安定であることがあげられる。非選択条件下で約２．５〜３．５世代培養することにより、プラスミドを保持する菌の割合は全体の２０〜３０％にまで低下していた。
【００７６】
キャンディダ・ユティリス酵母内でプロモーター活性を有するＤＮＡ配列の分離法
前記の自律複製能を有するＤＮＡ配列の利用により、キャンディダ・ユティリスにおいて転写のプロモーター活性を有するＤＮＡ配列のクローン化法が提供される。このためのベクターとしては、自律複製能を有するＤＮＡ配列の他に、転写のためのプロモーター配列を持たない薬剤耐性マーカー遺伝子を含むものであれば用いることができ、好ましくはＧ４１８耐性遺伝子であるＡＰＴ遺伝子を含むものを用いることができる。また、使用するＤＮＡはいかなる生物種由来であってもよいが、キャンディダ・ユティリス由来であるのが好ましい。また、ライブラリー作成のためにＤＮＡは制限酵素やＤＮＡアーゼなどの酵素処理あるいは超音波などの機械的剪断により低分子化する必要があるが、好ましくは、４塩基認識でかつ平滑末端を生じる３種類の制限酵素AluI、HaeIII、RsaIを組み合わせて染色体ＤＮＡの部分分解に使用する。これにより、より多くの染色体領域がライブラリーにクローン化されるからである。
【００７７】
より具体的には、プロモーター配列を含まないＡＰＴ遺伝子の５’側に、前記の制限酵素により部分分解した約０. ８〜１. ８ｋｂのＤＮＡ断片を連結してキャンディダ・ユティリス酵母染色体ＤＮＡライブラリーを通常法によって作製する。そして、このライブラリーＤＮＡでキャンディダ・ユティリスを形質転換する。プロモーター活性を有するＤＮＡ配列がＡＰＴ遺伝子の直前にクローン化されたプラスミドにより形質転換された酵母はＧ４１８耐性となる。よって、Ｇ４１８耐性を示す形質転換体から全ＤＮＡを抽出して、大腸菌を形質転換することにより、プロモーター活性を有するＤＮＡ配列を効率的に分離することができる。この際、プレートに含まれるＧ４１８濃度を高くする、またはプレート上で比較的大きなコロニーを形成する株を選択することによって、より転写活性の高いプロモーター配列を分離することが可能である。本発明によるこの方法は、前述したようにキャンディダ・ユティリスにおけるＡＲＳを含むプラスミドのコピー数は細胞あたり１コピー程度であるため、活性の高いプロモーター配列を分離するのに好都合であるといえる。
【００７８】
キャンディダ・ユティリスのその他機能遺伝子の分離法
また、前述の本発明によるキャンディダ・ユティリス酵母内でプロモーター活性をするＤＮＡを分離する方法は、同時に、ＡＲＳを含んだプラスミドの安定性を高める機能を有するＤＮＡ配列の分離法を提供する。キャンディダ・ユティリスにおけるＡＲＳを含むプラスミドの存在様式のひとつの特徴として、その安定性が低く、非選択条件下で約３〜４世代培養することにより、プラスミドを保持する菌体の割合が全体の２０〜３０％にまで低下する。このため、選択薬剤を含むプレート上においては、薬剤耐性遺伝子を持つＡＲＳプラスミドを保持する株は、薬剤耐性遺伝子が染色体上に組み込まれた株と比較して、細胞あたりのコピー数が同じであってもやや小さいコロニーを形成する。本発明においては、活性の高いプロモーター配列を分離するために比較的大きなコロニーを形成する株を選択したために、後記する実施例で示すように分離されたプロモーター活性を有するＤＮＡ配列のなかには、同時に、プラスミドの安定性を改善し、より安定にする機能を持つＤＮＡ配列も取得することができた。またさらに、当業者にとり、この形質転換系を利用することによって、このほかセントロメア配列など種々の機能を有するＤＮＡ配列の取得が可能であることは容易に想到可能と考える。
【００７９】
薬剤耐性マーカー遺伝子を含まない形質転換体の作出法
前述の本発明による自律複製能を有するＤＮＡ配列の利用により、更に、薬剤耐性マーカー遺伝子を含まない形質転換体の作出法が提供される。具体的には、薬剤耐性マーカー遺伝子を含まない形質転換体は、以下の手順により取得可能である。始めに前記の形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子を持たず、染色体ＤＮＡと相同な配列（相同ＤＮＡ配列）を含むプラスミドＤＮＡを、この相同ＤＮＡ配列内の適当な制限酵素サイトで分解することにより直鎖状とする。これにより、この直鎖状プラスミドＤＮＡはキャンディダ・ユティリス染色体の相同ＤＮＡ配列上に組み込まれる得るものとなる。その後、この直鎖状プラスミドＤＮＡを、ＡＲＳを含むＤＮＡ配列と選択マーカー遺伝子とを持つプラスミドと同時に酵母の形質転換に用いる。次にＡＲＳを含むプラスミドが導入されたことにより選択される形質転換体のなかから、同時に形質転換に用いたＤＮＡ断片が染色体上に組み込まれた株を、ＤＮＡ断片に含まれる異種遺伝子などの発現をみるか、またはＰＣＲ、サザン解析などでＤＮＡ断片の組み込みを確認することなどして、二次的に選択する。さらに選択された株に存在する自律複製能プラスミドは、非選択条件下で菌を培養することによって容易に脱落させることが可能である。これにより、選択マーカー遺伝子を保持せず、挿入ＤＮＡ断片だけを染色体上に保持する株を取得することが可能である。
【００８０】
キャンディダ・ユティリス染色体の部位特異的変異法
本発明の別の態様によれば、キャンディダ・ユティリス染色体の部位特異的変異法が提供される。この方法は、選択マーカー遺伝子をターゲット遺伝子に挿入して機能を失わせた遺伝子分断カセットを、染色体のターゲット遺伝子の置換体として使用することに基づく。このカセットは、その両端に染色体ターゲット遺伝子に相同で組換え可能なＤＮＡ配列（相同ＤＮＡ配列）を含み、かつそれらの間に少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を含んでなる、線状ＤＮＡ構造をなすものである。このうち挿入可能なＤＮＡ断片は、それが染色体上に存在するときと同じ方向であることが重要である。このカセットを用いて酵母を形質転換することにより、このマーカー遺伝子とその両側に存在する挿入可能なＤＮＡ配列とが宿主に取り込まれる。この形質転換の結果として、組み込み部位のターゲット遺伝子が破壊され、新規な形質を有する酵母株が得られる。選択マーカー遺伝子は好ましくは薬剤耐性遺伝子であり、遺伝子が破壊された形質転換体は薬剤耐性により選択できる。遺伝子修飾のターゲットになりうる遺伝子は、キャンディダ・ユティリス染色体由来の遺伝子であるのが好ましい。具体的にはＵＲＡ３、ＡＤＥ１、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８１】
例えば、キャンディダ・ユティリスＵＲＡ３遺伝子を、シクロヘキシミド耐性Ｌ４１遺伝子などの選択マーカー遺伝子により分断して、機能を持たない遺伝子とした後、形質転換に用いる。得られたシクロヘキシミド耐性の形質転換体は、染色体上のＵＲＡ３遺伝子２個のうち１個が破壊されている。続いてＧ４１８耐性遺伝子など他の選択マーカー遺伝子により分断されたＵＲＡ３遺伝子断片を用いて、１個のＵＲＡ３遺伝子が破壊された前記株を形質転換することにより、ＵＲＡ３遺伝子が２個とも破壊された株を得ることができる。ｕｒａ３変異株はウラシル生合成経路中間体の毒性類似体である５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）に耐性となることが知られている。よって、２個のうち１個のＵＲＡ３遺伝子が破壊された株を遺伝子置換することで得られた、ＵＲＡ３遺伝子が２個とも機能を失ったｕｒａ３変異株を、５−ＦＯＡ耐性株として取得することも可能である。これによって得られるｕｒａ３変異株を宿主として用いることにより、ＵＲＡ３遺伝子を選択マーカー遺伝子とした、薬剤耐性遺伝子マーカーによらない形質転換体取得も可能になる。さらにこうして得られる栄養要求性変異株は化学的突然変異法により作製された株のように、その他の遺伝子座に生じうる二次突然変異の影響を受ける可能性がきわめて低いという利点を有する。
【００８２】
Ｌ４１遺伝子
本発明によれば、キャンディダ・ユティリスのリボソーム構成蛋白質Ｌ４１、ならびに、それをコードする遺伝子、そのプロモーター、およびターミネーター配列が提供される。
【００８３】
本発明によるキャンディダ・ユティリスの蛋白質Ｌ４１は、具体的には図１４に記載のアミノ酸配列（配列番号：６）を有するものである。従って、本発明によるＬ４１遺伝子は、図１４に記載のアミノ酸配列をコードするものである。さらに、この遺伝子と、そのプロモーター、およびターミネーター配列とを含んでなる塩基配列の具体例は、図１３（配列番号：５）に示される塩基配列である。
【００８４】
また、さらに本発明によれば、部位特異的変異作製法により、56番目のアミノ酸残基がプロリンからグルタミンに変換されたシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１蛋白質をコードする変異型Ｌ４１遺伝子が提供される。このシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子は、前記したように、キャンディダ・ユティリスの形質転換の選択マーカー遺伝子として有用であるほか、他の酵母、たとえばサッカロマイセス属酵母の形質転換マーカー遺伝子としても使用できる。また、さらにこの遺伝子のプロモーター、ターミネーター配列は異種遺伝子の発現にも使用可能であるのは言うまでもない。
【００８５】
ＰＧＫ遺伝子
本発明によれば、また、ＰＧＫ遺伝子のプロモーター配列、およびターミネーター配列が提供される。
【００８６】
プロモーター配列の好ましい具体例としては、図３に記載の塩基配列（配列番号：２）の内、少なくとも９４６番〜１３４６番までの配列を有する配列、およびプロモーター活性を保持するその部分配列が挙げられる。
【００８７】
また、ターミネーター配列の好ましい具体例としては、図２に記載の塩基配列（配列番号：１）、およびターミネーター活性を保持するその部分配列が挙げられる。
【００８８】
このプロモーター配列とターミネーター配列とを適当なプラスミドベクターに接続することにより、キャンディダ・ユティリスで利用可能な発現ベクターを得ることができる。このためのプラスミドベクターとしてはpBluescript 、ｐＵＣ１９など公知の大腸菌プラスミド、または、シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子などの選択マーカー遺伝子と、さらに必要に応じて染色体ターゲット遺伝子に相同で組換え可能なＤＮＡ配列とを含む酵母−大腸菌シャトルプラスミドが利用できる。また、他の宿主細胞、特にサッカロマイセス属酵母、においても、プロモーター、またはターミネーターとして利用することも可能であることは当業者に明らかであると考える。
【００８９】
ＰＧＫ遺伝子は解糖系酵素の遺伝子であり、その他の解糖系酵素の遺伝子と共にキャンディダ・ユティリスで大量に発現していることから、強力なプロモーターであることが期待される。後記する実施例では、作製した発現ベクターを用いて異種遺伝子であるグルコアミラーゼ遺伝子、アミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子などの発現に、このプロモーターが有利に利用できることが明らかにされている。
【００９０】
また、本発明によるＰＧＫ遺伝子プロモーター配列とターミネーター配列とに連結した遺伝子の発現量が減少しなければ、それらの一部を欠損させることによって、発現ベクターを小型化することも可能であることは当業者に自明の事項であろう。
【００９１】
ＧＡＰ遺伝子
本発明によれば、ＧＡＰ遺伝子のプロモーター配列およびターミネーター配列が提供される。
【００９２】
プロモーター配列の好ましい具体例としては、図３０に記載の塩基配列（配列番号：７）、およびプロモーター活性を保持するその部分配列が挙げられる。
【００９３】
また、ターミネーター配列の好ましい具体例としては、図３１に記載の塩基配列（配列番号：８）、およびターミネーター活性を保持するその部分配列が挙げられる。
【００９４】
このプロモーター配列とターミネーター配列とを適当なプラスミドベクターに接続することにより、キャンディダ・ユティリスで利用可能な発現ベクターを得ることができる。このためのプラスミドベクターとしてはpBluescript 、ｐＵＣ１９など公知の大腸菌プラスミド、または、シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子などの選択マーカー遺伝子と、さらに必要に応じて染色体ターゲット遺伝子に相同で組換え可能なＤＮＡ配列とを含む酵母−大腸菌シャトルプラスミドが利用できる。また、他の宿主細胞、特にサッカロマイセス属酵母、においても、プロモーター、またはターミネーターとして利用することも可能であることは当業者に明らかであると考える。
【００９５】
ＧＡＰ遺伝子は解糖系酵素の遺伝子であり、その他の解糖系酵素の遺伝子と共にキャンディダ・ユティリスで大量に発現していることから、強力なプロモーターを有することが期待される。後記する実施例では、作製した発現ベクターを用いて異種遺伝子であるアミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ遺伝子の発現に、このプロモーターが有利に利用できることが明らかにされている。
【００９６】
また、本発明によるＧＡＰ遺伝子プロモーター配列とターミネーター配列とに連結した遺伝子の発現量が減少しなければ、それらの一部を欠損させることによって、発現ベクターを小型化することも可能であることは当業者に自明の事項であろう。
【００９７】
ＰＭＡ遺伝子
本発明によれば、ＰＭＡ遺伝子のプロモーター配列、およびターミネーター配列が提供される。
【００９８】
プロモーター配列の好ましい具体例としては、図３４に記載の塩基配列（配列番号：９）、およびプロモーター活性を保持するその部分配列が挙げられる。
【００９９】
また、ターミネーター配列の好ましい具体例としては、図３５に記載の塩基配列（配列番号：１０）、およびターミネーター活性を保持するその部分配列が挙げられる。
【０１００】
このプロモーター配列とターミネーター配列とを適当なプラスミドベクターに接続することにより、キャンディダ・ユティリスで利用可能な発現ベクターを得ることができる。このためのプラスミドベクターとしてはpBluescript 、ｐＵＣ１９など公知の大腸菌プラスミド、または、シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子などの選択マーカー遺伝子と、さらに必要に応じて染色体ターゲット遺伝子に相同で組換え可能なＤＮＡ配列とを含む酵母ー大腸菌シャトルプラスミドが利用できる。また、他の宿主細胞、特にサッカロマイセス属酵母、においても、プロモーター、またはターミネーターとして利用することも可能であることは当業者に明らかであると考える。
【０１０１】
ＰＭＡ遺伝子は原形質膜酵素の遺伝子であり、サッカロマイセス酵母においては原形質膜タンパク質の約１０％を占めている主要タンパク質であることが知られている。従って、このＰＭＡ遺伝子は、強力なプロモーターを有していることが期待される。後記する実施例では、作製した発現ベクターを用いて異種遺伝子であるアミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ遺伝子の発現に、このプロモーターが有利に利用できることが明らかにされている。
【０１０２】
また、本発明によるＰＭＡ遺伝子プロモーター配列とターミネーター配列とに連結した遺伝子の発現量が減少しなければ、それらの一部を欠損させることによって、発現ベクターを小型化することも可能であることは当業者に自明の事項であろう。
【０１０３】
プロモーター活性を有するＤＮＡ配列
本発明によれば、プロモーター活性を有するＤＮＡ配列が提供される。このＤＮＡ配列は、自律複製能を有するＤＮＡ配列と、転写のためのプロモーター配列を持たない薬剤耐性マーカー遺伝子とを含んでなるベクターを利用して分離される。プロモーター活性を有するＤＮＡ配列の好ましい具体例としては、図４８に記載の塩基配列（配列番号：１３）、およびプロモーター活性を保持するその部分配列が挙げられる。また、後記する実施例で詳述するように、このベクターを利用して、図４８に記載の塩基配列が明らかにされたプロモーター活性を有するＤＮＡ配列以外に、８種類のＤＮＡ配列が取得された。この転写のためのプロモーター配列を持たない薬剤耐性遺伝子を例えばハイグロマイシンＢ耐性遺伝子など他の遺伝子に置き換えることによっても同様に、プロモーター活性を有するＤＮＡ配列を分離できる。また、さらに形質転換体を選択するプレートに含まれる糖の種類や、その他の培地組成など選択条件を変更することにより、ある特異的な条件下で転写活性が誘導されるプロモーターを取得することが可能である。これらのことは、本明細書の開示を参照すれば、当業者に容易に理解される事項であろう。
【０１０４】
このプロモーター配列を適当なターミネーター配列とともに適当なプラスミドベクターに接続することによりキャンディダ・ユティリスで利用可能な発現ベクターを得ることができる。このためのプラスミドベクターとしてはpBluescript 、ｐＵＣ１９など公知の大腸菌プラスミド、または、シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子などの選択マーカー遺伝子と、さらに必要に応じて染色体ターゲット遺伝子に相同で組換え可能なＤＮＡ配列とを含む酵母−大腸菌シャトルプラスミドが利用できる。また、他の宿主細胞、特にサッカロマイセス属酵母、においても、プロモーターとして利用することも可能であることは当業者に明らかであると考える。
【０１０５】
後記する実施例では、作製した発現ベクターを用いて異種遺伝子であるアミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ遺伝子の発現に、このプロモーターが有利に利用できることが明らかにされている。
【０１０６】
また、本発明によるプロモーター配列に連結した遺伝子の発現量が減少しなければ、それらの一部を欠損させることによって、発現ベクターを小型化することも可能であることは当業者に自明の事項であろう。
【０１０７】
ｒＲＮＡ遺伝子
本発明によれば、さらに、キャンディダユティリスのｒＲＮＡ遺伝子を含んでなる、約１３．５ｋｂのＤＮＡ断片、およびその断片が反復されてなるＤＮＡ配列が提供される。
【０１０８】
この約１３．５ｋｂの断片は、図６（ｂ）に示される制限酵素地図で表されるものである。このＤＮＡ配列のうち１８Ｓ、５．８Ｓ、２５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置は図６（ｂ）に示される通りであった。
【０１０９】
このｒＲＮＡ遺伝子の一部の領域をＤＮＡ断片の染色体組み込みのためのターゲット配列として用いることにより、効率的で多コピーの組み込みが達成される。この約１３．５ｋｂのＤＮＡ断片を４個の断片に分けてプラスミドを構築し、それぞれ、形質転換に用いたところ、興味あることに、組み込みターゲット配列として使用する領域によって、得られる形質転換頻度に差が認められた。すなわち、図２０の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の３´側一部と５．８５ｒＲＮＡ遺伝子、さらに２５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５´側一部を含む３．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含むプラスミドｐＣＬＲＥ４、または２５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の３´側一部を含む３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含むプラスミドｐＣＬＲＥ６と１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５´側一部を含む４．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含むプラスミドｐＣＬＥ７では、高頻度で形質転換体が得られたが、一方、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含む２．４ｋｂＥｃｏＲＩ断片を含むプラスミドｐＣＬＲＥ５では得られる形質転換頻度が低かった。
【０１１０】
ＵＲＡ３遺伝子
本発明によれば、さらにまた、サッカロミセス・セレビシエ酵母のｕｒａ３変異を相補する、キャンディダ・ユティリスのＵＲＡ３遺伝子が提供される。この遺伝子は、前記したように、ＤＮＡ断片の組み込みターゲットとして用いられるほか、染色体ＵＲＡ３遺伝子の遺伝子破壊によるｕｒａ３変異株の作出に使用できる。これによって得られるｕｒａ３変異株を宿主として用いることにより、ＵＲＡ３遺伝子を選択マーカー遺伝子とした薬剤耐性遺伝子マーカーによらない形質転換体の取得も可能になる。また、さらにこの遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列は、異種遺伝子の発現にも使用可能であるのは言うまでもない。
【０１１１】
具体的なＵＲＡ３遺伝子は、図１０および図１１に示されるアミノ酸配列（配列番号：４）をコードするものである。好ましいＵＲＡ３遺伝子は図９に示される塩基配列（配列番号：３）を有するもの、またはサッカロミセス・セレビシエ酵母のｕｒａ３変異を相補する機能を保持するその部分配列を有するものである。
【０１１２】
自律複製能を有するＤＮＡ配列（ＡＲＳ）
本発明によれば、自律複製機能を有するＤＮＡ配列であって、キャンディダ・ユティリス内で、当該ＤＮＡ配列を含むベクターを、染色体外要素としてのプラスミドとして保持させ、宿主の形質転換頻度を上昇させることができるＤＮＡ配列が提供される。このＤＮＡ断片としてはどのような生物由来でも良いが、好ましくはキャンディダ・ユティリス由来である。ＡＲＳの好ましい具体例としては、図４１および図４２に記載の塩基配列（配列番号：１１）、あるいは図４３および図４４に記載の塩基配列（配列番号１２）、および自律複製機能を有するその部分配列が挙げられる。後記する実施例から明らかなように、短縮化したＤＮＡ断片を含むプラスミドによっても、頻度は低下するものの、キャンディダ・ユティリス酵母を形質転換することができる。
【０１１３】
このＡＲＳと、適当な選択マーカー遺伝子とを使用することにより、キャンディダ・ユティリス内においてプラスミドとして存在し得るベクターが提供される。さらに、このベクターを利用することにより、プロモーター活性を有するＤＮＡ配列や、その他の機能を有するＤＮＡ配列を分離することが可能である。また、キャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡと相同な配列（相同ＤＮＡ配列）を含み、かつ特に形質転換体を選択するための選択マーカー遺伝子を持たないプラスミドＤＮＡとともに、ＡＲＳと適当な選択マーカー遺伝子とを含むプラスミドを形質転換に用いることにより、選択マーカー遺伝子を含まず、異種遺伝子を含むＤＮＡ断片のみを染色体上に保持する形質転換酵母の作出が可能である。
【０１１４】
【実施例】
本発明を以下の実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。
【０１１５】
なお、各種遺伝子の制限酵素地図における制限酵素サイトについては以下の略号で示してある。
【０１１６】
Ａａ；ＡａｔII、Ａｆ；ＡｆlII 、Ａｌ；ＡｆｌIII 、Ａｐ；ＡｐａＩ、Ｂ；ＢａｍＨＩ、Ｂｇ；ＢｇｌII、Ｃ；ＣｌａＩ、Ｅ；ＥｃｏＲＩ、ＲＶ；ＥｃｏＲＶ、Ｈ； ＨｉｎｄIII 、Ｈｐ；ＨｐａＩ、Ｋ；ＫｐｎＩ、Ｐ；ＰｓｔＩ、Ｐｖ；ＰｖｕII、Ｓ；ＳａｌＩ、Ｓｅ；ＳｐｅＩ、Ｓｍ；ＳｍａＩ、Ｓｃ；ＳａｃＩ、ＳｃII； ＳａｃII、Ｓｐ；ＳｐｈＩ、Ｘ；ＸｂａＩ、およびＸｈ；ＸｈｏＩである。
【０１１７】
また、以下に記載する実施例において共通に使用される方法は以下のとおりである。
【０１１８】
１）ＥｘｏIII ヌクレアーゼ及びマングビーンヌクレアーゼを用いた欠失変異処理とＤＮＡ配列の決定
プラスミド１０μｇを適当な制限酵素消化した後、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。ＤＮＡを１００μｌのＥｘｏIII 緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，１００ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール) に溶解し、１８０ユニットのＥｘｏIII ヌクレアーゼを加え、３７℃で保温した。１分ごとに１０μｌをサンプリングし、２サンプル分ずつまとめて、２０μｌのＭＢバッファー（４０ｍＭ Ｎａ−Acetate, １００ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＺｎＣｌ2 ，１０％グリセロール ｐＨ４．５）の入った氷冷したチューブに移した。得られた５本のチューブを６５℃１０分間保温して酵素を失活させた後、５ユニットのマングビーンヌクレアーゼを加えて、３７℃で３０分間反応した。反応後、アガロースゲル電気泳動により欠失の程度が異なる５種類のＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡはクレノウ酵素で末端を平滑化し、１６℃で一晩ライゲーション反応した後、大腸菌を形質転換した。
【０１１９】
得られた種々のプラスミドの挿入断片について、アプライドバイオシステムズ（株）の蛍光プライマーサイクルシークエンスキットを用いてシークエンス反応を行い、自動ＤＮＡシークエンサーを用いてＤＮＡ配列を決定した。
【０１２０】
２）ハイブリダイゼーション
ＤＮＡはアガロースゲル電気泳動後、ハイボンドＮ＋フィルター（Amersham）に、添付のプロトコールにしたがってアルカリトランスファーして、サザンハイブリダイゼーション用のフィルターを作製した。
【０１２１】
ＤＮＡが固定化されたフィルターは、ハイブリダイゼーション溶液（６ｘＳＳＣ，５ｘDenhardt Solution,０．２％ ＳＤＳ，２０μｇ／ｍｌ Salmon sperm ＤＮＡ）中で６５℃、２時間プレハイブリダイゼーションを行った。次にMegaprime ＤＮＡ labelling systems （Amersham）と［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（１１０ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）とを用いて標識化したプローブＤＮＡを、ハイブリダイゼーション溶液に加え、６５℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、フィルターは１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中で、６５℃、２時間洗浄した後、オートラジオグラフィーに供してシグナルを検出した。
【０１２２】
３）培地組成
酵母を培養するためのＹＰＤ培地の組成は１％酵母エキス、２％バクトペプトン、２％グルコースであり、プレートの場合は寒天を２％になるように加えた。ＳＤ培地の組成は、０．６７％アミノ酸不含イーストニトロジェンベース、２％グルコースであり、使用した酵母の栄養要求性に応じて、アミノ酸を添加した。プレートの場合は寒天を２％になるように加えた。
【０１２３】
４）酵素処理
制限酵素反応、クレノウ酵素処理、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応など、種々の酵素による反応は、メーカーの推奨する反応条件、あるいはMolecular Cloning 2nd edition Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) に記載の方法に従って行った。
【０１２４】
実施例１：キャンディダユティリス染色体ＤＮＡの調製
キャンディダ・ユティリス(Candida utilis)の染色体ＤＮＡ抽出は、以下に示す方法で行った。３０ｍｌのＹＰＤ培地に、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０株を植菌し、３０℃で定常期初期になるまで培養した。遠心分離により菌体を集めて滅菌水で洗浄した後、再度遠心分離により集菌した。菌体は３ｍｌのザイモリアーゼバッファー（０．９Ｍソルビトール、０．１Ｍ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５）に懸濁した後、２５ｍｇ／ｍｌのザイモリアーゼ１００Ｔを含む０．９Ｍソルビトールを２００μｌを加え、３７℃で振とう保温した。顕微鏡下でプロトプラスト化を確認した後、遠心分離してプロトプラスト化した菌を回収した。３ｍｌの溶菌バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加え、穏やかに、かつ十分に懸濁してから０．３ｍｌの１０％ＳＤＳを混合し、６５℃で一夜保温した。続いて１ｍｌの５Ｍ酢酸カリウム液を加え、氷上で１時間放置した。その後遠心分離により凝集物を除き、４ｍｌの冷却したエタノールを加え、遠心分離してＤＮＡ等を沈殿させた。沈殿は５０％のエタノールで洗浄し、乾燥した後、３ｍｌのＲＮａｓｅ Ａバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ、ｐＨ７．５）に溶解して、３７℃で３０分保温した。最後に３ｍｌの２−プロパノールを加え、遠心分離して上清を除いた後、沈殿を５０％の２−プロパノールで洗浄し、乾燥させた。この沈殿を０．５ｍｌのＴＥバッファーに溶解したものをキャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡ試料とした。
【０１２５】
実施例２：ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子のクローニング
キャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分消化した後、０．８Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含む１０−５０％ショ糖密度勾配に重層して、120,000 x ｇ、１４時間の遠心分離によりＤＮＡ断片を分画した。このうち１０〜２０ｋｂの染色体ＤＮＡ断片と、ＢａｍＨＩ消化した後脱リン酸化したλファージベクターDASHTMII（Stratagene Cloning Systems)とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより一晩連結した。続いてGigapackII Gold Packaging Extract(Stratagene Cloning Systems) を用いてインビトロパッケージングし、キャンディダユティリス染色体ＤＮＡライブラリーを構築した。
【０１２６】
キャンディダ・ユティリスのＰＧＫ遺伝子のクローニングは、他生物の既知のＰＧＫ遺伝子をプローブとしたハイブリダイゼーション法を用いて行った。すなわち、Molecular Cloning 2nd edition Sambrook et. al. p2.108-121,Cold Spring Harbor Laboratory (1989) に記載された方法に従い、上記のＤＮＡライブラリーの約20,000プラークのファージＤＮＡを吸着させたフィルターを作製した。次に、サッカロマイセス・セレビシエのＰＧＫ遺伝子を保持するプラスミドｐＳＴ２（Yamano et. al. Journal of Biotechnology.32, 165-171(1994)) からＰＧＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、２ｋｂのＣｌａＩ断片として切り出した。この断片を32Ｐ標識して、これをプローブとしてハイブリダイゼーションを行った。その結果４つの陽性プラークが分離できた。更にこれらプラークから調製したファージＤＮＡについてさまざまな制限酵素で消化後、同じプローブを用いてサザン解析を行った。その結果、プローブにハイブリダイズした２．６ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片と２．５ｋｂ ＳａｌＩ断片を単離した。
【０１２７】
実施例３：ＰＧＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列決定と、構造遺伝子及び制御領域の特定
単離した２．６ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を、プラスミドベクターBluescriptIISK+ のＥｃｏＲＩサイトに組み込み、ベクターに対する挿入断片の方向性が互いに逆向きのプラスミドｐＰＧＫＥ１、ｐＰＧＫＥ２を作製した。また、２．５ｋｂＳａｌＩ断片を同様にベクターBluescriptIISK+ のＳａｌＩサイトに組み込み、ベクターに対する挿入断片の方向性が互いに逆向きのプラスミドｐＰＧＫＳ１、ｐＰＧＫＳ２を作製した（図１）。
【０１２８】
このうち、プラスミドｐＰＧＫＥ１、ｐＰＧＫＥ２の２種のプラスミドについて、ＨｉｎｄIII 、ＫｐｎＩ、ＳａｌＩなどの制限酵素サイトでの欠失変異体の作製や、ＥｘｏIII ヌクレアーゼ及びマングビーンヌクレアーゼを用いて欠失変異体を作製することにより、種々の欠失変異をもつプラスミドを作製し、２５３０ｂｐからなるＥｃｏＲＩ断片の配列を決定した。
【０１２９】
予想される構造遺伝子領域の解析を行ったところ、１２４８ｂｐからなるオープンリーディングフレームが存在し、そこから推定される遺伝子産物のアミノ酸配列についてサッカロマイセス・セレビシエのＰＧＫ遺伝子に対するホモロジーを調べた。両配列は互いに８６．８％のホモロジーを示したことから、単離した遺伝子がキャンディダ・ユティリスのＰＧＫ遺伝子であると断定した。
【０１３０】
またこのＥｃｏＲＩ断片には、遺伝子制御領域については、開始コドンＡＴＧの上流４０１ｂｐ、終止コドンＴＡＡの下流８８０ｂｐが含まれていた。このうち、転写のターミネーターを含むと推測される終止コドンＴＡＡの直後からＥｃｏＲＩサイトまでの８８０ｂｐの配列は図２に示される通りであった。またさらに、プラスミドｐＰＧＫＳ１、ｐＰＧＫＳ２についても、ＥｘｏIII ヌクレアーゼ及びマングビーンヌクレアーゼを用いた欠失変異体作製により種々の欠失変異をもつプラスミドを作製し、ＨｉｎｄIII サイトからＥｃｏＲＩサイトまでの塩基配列を決定した（図１）。転写のプロモーターを含むと推測されるＨｉｎｄIII サイトから開始コドンＡＴＧの直前までの１３４６ｂｐの配列は図３に示される通りであった。
【０１３１】
実施例４：ＰＧＫ遺伝子プロモーターとターミネーターとを使った発現ベクターの構築
キャンディダ・ユティリス内で異種遺伝子を発現させるためには、キャンディダ・ユティリス内で機能する遺伝子発現因子、転写プロモーター及びターミネーターが必要となる。そこで、キャンディダ・ユティリスのＰＧＫ遺伝子プロモーターと、ターミネーターとの間に、マルチクローニングサイトを持つ発現ベクタープラスミドを作製した。
【０１３２】
まず、Polymerase Chain Reaction （ＰＣＲ）によリ、プロモーターとターミネーターとを含む断片をそれぞれ取得した（図１）。
【０１３３】
プロモーターとしては、プラスミドｐＰＧＫＳ１を鋳型として、開始コドンの２．３ｋｂ上流に位置するＳａｌＩサイトから開始コドンＡＴＧ直前までの断片を取得した。プライマーとして、
5'-GGTCGACATATCGTGGTAAGCGCCTTGTCA-3' （配列番号：１４）
5'-TTCTAGACTTTATCCGCCAGTATGTTAGTC-3' （配列番号：１５）
を用い、３’下流側開始コドン直前にＸｂａＩ部位をもつ様にデザインして合成した。
【０１３４】
次に、ターミネーターとしては、プラスミドｐＰＧＫＥ１を鋳型として、終止コドン直後から８８０ｂｐ下流のＥｃｏＲＩサイトまでの断片を取得した。プライマーとして、
5'-GGGTACCTAACTGCAAGCTACTTTGTAATTAAC-3' （配列番号：１６）
5'-GGAATTCAACATGAATGACACGACGAAGGT-3' （配列番号：１７）
を用い、５’上流側終止コドン直後にＫｐｎＩサイトをもつ様にデザインし合成した。
【０１３５】
ＰＣＲプロセスは、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene Cloning Systems）を使い、添付のバッファーを使用して、３０サイクル行った。
【０１３６】
ＰＣＲ合成したプロモーター及びターミネーター断片は、それぞれＳａｌＩとＸｂａＩ、またはＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで消化した。その断片を、ｐＵＣ１９のＳａｌＩ−ＸｂａＩサイトとＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩサイトとに順に組み込み、プラスミドｐＰＧＫＰＴ１を構築した（図４）。続いて、ターミネーター下流末端のＥｃｏＲＩサイトをクレノウ酵素処理により平滑化した後、ＮｏｔＩリンカー(5'AGCGGCCGCT3´:配列番号：１８）を連結してから、ＰｓｔＩ消化により約０．９ｋｂのＰｓｔＩ−ＮｏｔＩ断片を切り出した。この断片を、プラスミドｐＰＧＫＳ１から切り出した１．２ｋｂＨｉｎｄIII −ＰｓｔＩ断片と共に、pBluescriptSK-のＨｉｎｄIII サイトとＮｏｔＩサイトとの間に挿入して、プラスミドｐＰＧＫＰＴ２を構築した。さらに、ｐＰＧＫＰＴ２をＢｇｌII消化して、クレノウ酵素処理、そして再環状化することにより、ターミネーター断片中のＢｇｌIIサイトを除去して、プラスミドｐＰＧＫＰＴ３を構築した。続いてｐＰＧＫＰＴ３のＨｉｎｄIII サイトをクレノウ酵素処理により平滑化した後、ＮｏｔＩリンカー（5'AGCGGCCGCT3'：配列番号：１８）を連結して、プラスミドｐＰＧＫＰＴ４を構築した。また、プラスミドｐＰＧＫＰＴ４をＫｐｎＩで部分消化して、プロモーター上流のＫｐｎＩサイトを欠失させて、プラスミドｐＰＧＫＰＴ５を構築した（図４）。
【０１３７】
実施例５：ｒＲＮＡ遺伝子の単離
実施例２に記載の庶糖密度勾配遠心分離によって得られた、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０のゲノムＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ部分消化断片のうち、５〜１０ｋｂの分画のＤＮＡ断片４００ｎｇと、ＢａｍＨＩ消化した後脱リン酸化したベクタープラスミドｐＢＲ３２２、２００ｎｇとを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより一晩連結した。このＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５を形質転換して、キャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡライブラリーを完成した。
【０１３８】
このうち約10,000コロニーについて、 Molecular Cloning 2nd edition Sambrook et. al. p12.21-23, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)に従ってフィルターを作製し、サッカロミセス・セレビシエの１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含む１．８ｋｂのＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩ断片を32Ｐ標識し、これをプローブとしてスクリーニングを行った。このプローブとして用いたｒＤＮＡ断片は、サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ［α，ｓｕｃ２，ｍａｌ，ｇａｌ２，ＣＵＰ１］より作製した染色体ＤＮＡライブラリーから、５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５´末端の４〜３２番目の塩基に対応するオリゴマーを32Ｐ標識したものをプローブとして取得したものである（曽根ら、特公平６−１４８６５号公報）。
【０１３９】
その結果、２００個以上のポジティブクローンが得られた。このうち７個のクローンｐＣＲ１、ｐＣＲ４、ｐＣＲ５、ｐＣＲ６、ｐＣＲ７、ｐＣＲ８、およびｐＣＲ９についてプラスミドの制限酵素地図を作製し、整列させ比較したところ、両端の制限酵素地図が一致した（図５）。このことから、キャンディダ・ユティリスのｒＲＮＡ遺伝子を含む領域が、約１３ｋｂからなる繰り返し構造をとっていることが明らかとなった。
【０１４０】
これらのプラスミドより、ＥｃｏＲＩまたはＸｂａＩ消化により切り出される断片をpBluescriptSK-にサブクローン化して、プラスミドｐＣＲＥ１、ｐＣＲＥ２、ｐＣＲＥ３、ｐＣＲＸ１、ｐＣＲＸ２、ｐＣＲＸ３、およびｐＣＲＸ４を構築した（図６（ａ））。さらに、これらのプラスミドをさまざまな制限酵素により消化した後、再環状化することにより、各種の欠失プラスミドを構築した。これらプラスミドの挿入断片について図６に矢印で示した領域について塩基配列を決定したところ、１８Ｓ、５．８Ｓ、および２５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に高いホモロジーを示す領域が認められ、これによって３つのｒＲＮＡ遺伝子の存在位置、転写方向などが明らかとなった（図６（ｂ））。
【０１４１】
実施例６：オルチジン−５´−フォスフェート デカルボキシラーゼ遺伝子 （ＵＲＡ３遺伝子）の単離
実施例２に記載の庶糖密度勾配遠心分離によって得られた、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０のゲノムＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ部分消化断片の内、５〜１０ｋｂの分画のＤＮＡ断片１００ｎｇと、ＢａｍＨＩ消化した後脱リン酸化したベクタープラスミドＹＥｐ１３(Methods in Enzymol. 194, 195-230, 1991)１００ｎｇとを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより一晩連結した。このＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５を形質転換して、染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。形質転換体よりプラスミド混合物を抽出後、得られたＤＮＡでｕｒａ３−株であるサッカロマイセス・セレビシエＹＰＨ５００（αｈｉｓ３，ｔｒｐ１，ｌｅｕ２，ａｄｅ２，ｌｙｓ２，ｕｒａ３）(Stratagene Cloning Systems)を形質転換し、最少培地で生育するウラシル非要求性の形質転換株を選択した。サッカロマイセス・セレビシエ株の形質転換はMethods in Yeast Genetics - A laboratory Course Manual - Rose M.D et al.P122-123Cold Spring Harbor Laboratory Press NY (1990) 記載のリチウム法に従った。
【０１４２】
この方法により１０μｇのＤＮＡから、５株のＵｒａ+ 株が得られた。これら形質転換株より、Methods in Yeast Genetics - A laboratory Course Manual - Rose M.D et al. P130 Cold Spring Harbor Laboratory Press NY (1990)記載の方法に従いプラスミドＤＮＡを調製した。これで大腸菌を形質転換してプラスミドＤＮＡを回収した。これらのプラスミドＤＮＡのうち、ＹＥｐ１３のＢａｍＨＩ部位に６．１ｋｂのインサートを含むプラスミドｐＣＵＲＡ３−３と、８．１ｋｂのインサートを含むｐＣＵＲＡ３−５とについて、制限酵素地図を作製した。その地図は図７に示される通りである。
【０１４３】
実施例７：ＵＲＡ３遺伝子領域の特定化と塩基配列の決定
ＵＲＡ３遺伝子領域を特定化するために、プラスミドｐＣＵＲＡ３−３とｐＣＵＲＡ３−５に共通する領域を含む５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、プラスミドｐＣＵＲＡ３−５より切り出し、プラスミドｐＲＳ３１４（Stratagene Cloning Systems) のＥｃｏＲＩ部位に連結して、プラスミドｐＵＲＡＥ１を作製した（図７）。このプラスミドでＹＰＨ５００株をリチウム法により形質転換したところ、高頻度でＵＲＡ+ の形質転換体が得られた。これより、この５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片中にＵＲＡ３遺伝子が存在し、１コピーでサッカロマイセス・セレビシエのｕｒａ３- 変異を相補することが明らかにされた。
【０１４４】
次に、プラスミドｐＵＲＡＥ１をＸｈｏＩ、またはＰｓｔＩ消化して、再びＴ４リガーゼ反応により再環状化することにより、プラスミドｐＵＲＡＥ１ΔＸｈｏ、およびｐＵＲＡＥ１ΔＰｓｔを得た。
【０１４５】
さらにプラスミドｐＵＲＡＥ１より切り出された３．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ断片、および２．３ｋｂのＨｉｎｄIII 断片を、それぞれプラスミドｐＲＳ３１４のＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ間、およびＨｉｎｄIII 部位に挿入して、プラスミドｐＵＲＡＥＣ１、およびｐＵＲＡＨ１を作製した（図７）。
【０１４６】
以上、５種類のプラスミドを用いてＹＰＨ５００株をリチウム法により形質転換し、ｕｒａ３- 変異の相補能を調べることにより、これらの断片がＵＲＡ３遺伝子を含むかどうかを調べた。その結果は、図７に示される通りであった。これより、ＵＲＡ３遺伝子をＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII 間の２．３ｋｂに限定することができた。
【０１４７】
さらにＵＲＡ３遺伝子を含む２．３ｋｂのＨｉｎｄIII 断片を、プラスミドpBluescript SK- のＨｉｎｄIII 部位に連結して、プラスミドｐＵＲＡＨ２を作製した。つぎに挿入断片の両側からＥｘｏIII ヌクレアーゼおよびマングビーンヌクレアーゼを用いた欠失変異作製法により、種々の欠失変異をもつプラスミドを作製し、塩基配列を決定した。そのシークエンスストラテジーと塩基配列の解析から明らかにされた制限酵素地図は、図８に示される通りであった。また、得られた２３３０ｂｐからなるＤＮＡ配列は図９に、また推定される２６７アミノ酸残基からなるポリペプチドのアミノ酸配列は図１０および図１１に示される通りである。
【０１４８】
推定されたポリペプチドのアミノ酸配列を他の酵母のＵＲＡ３蛋白質と比較したところ、サッカロマイセス・セレビシエとでは７３．４％、クルイベロマイセス・ラクティスとでは７６．３％、キャンディダ・アルビカンスでは７５．１％と、高い相同性を示した。
【０１４９】
実施例８：Ｌ４１遺伝子のクローニングとＬ４１遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列決定
実施例５で作製したライブラリーの約30,000コロニーについて、Molecular Cloning 2nd edition p12.21-23,Cold Spring Harbor Laboratory (1989) に従ってフィルターを作製し、32Ｐ標識したキャンディダ・マルトーサのＬ４１遺伝子ＲＩＭ−Ｃを含む、１．１ｋｂのＸｂａＩ−Ｓａｕ３ＡＩ断片（KAWAI et. al. J Bacteriol. 174, 254-262 (1992)）をプローブとしてスクリーニングを行った。
【０１５０】
その結果、５個のポジティブクローンが得られ、このうち３個のクローンｐＣＬ４１−１、ｐＣＬ４１−２、およびｐＣＬ４１−５について制限酵素地図を作製し、それを比較したところ、これらのクローンが４ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を共有することが示された（図１２）。さらにこれらプラスミドＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション解析により、キャンディダ・マルトーサのＬ４１遺伝子に相同性を示す領域が、この４ｋｂのＥｃｏＲＩ断片内の１．４ｋｂＣｌａＩ−ＰｓｔＩ断片内にあることが示された。
【０１５１】
そこで４ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、pBluescript SK- のＥｃｏＲＩサイトに挿入し、挿入断片が互いに逆向きのプラスミドｐＣＬＥ１、およびｐＣＬＥ２を作製した。この２種のプラスミドについてＥｃｏＲＩ断片内にサイトをもつＨｉｎｄIII 、ＸｈｏＩ、ＣｌａＩなどによる欠失変異体の作製や、ＥｘｏIII ヌクレアーゼおよびマングビーンヌクレアーゼを用いた欠失変異体の作製により、種々の欠失変異をもつプラスミドを作製し、ＢａｍＨＩサイトからＳａｃＩサイトまでの２０８６ｂｐからなるＤＮＡ配列を決定した（図１３）。
【０１５２】
この配列を解析すると、サザン解析によりＬ４１造遺伝子が存在すると推定された領域に３６７ｂｐのイントロンで分断された３１８ｂｐからなるオープンリーディングフレームが存在した（図１２および図１４）。イントロンと推定された領域の５´と３´端および３´端近傍にはイントロンに共通する配列GTATGT--TACTAAC--AG が認められた。また、その位置も報告されている他の酵母由来の６種類のＬ４１遺伝子（KAWAI et. al. J Bacteriol. 174, 254-262 (1992)、POZO et. al. Eur. J. Biochem. 213, 849-857 (1993) ）と同様、開始コドンの直後に存在していた。キャンディダ・ユティリスＬ４１ポリペプチドの推定されるアミノ酸配列を他のいくつかのＬ４１蛋白質と比較したところ、サッカロマイセス・セレビシエＬ４１ａとの間では９３．４％、キャンディダ・トロピカリスＬ４１との間では８９．６％、キャンディダ・マルトーサのＬ４１との間では８５．８％と、高い相同性を示した。
【０１５３】
実施例９ 部位特異的変異法によるシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子の作製
シクロヘキシミド耐性を示す酵母のＬ４１蛋白質の５６番目のアミノ酸はグルタミンであり、一方、シクロヘキシミド感受性酵母のＬ４１蛋白質においてはこの位置のアミノ酸はプロリンである。そしてこのアミノ酸残基がそのＬ４１蛋白質をもつ酵母のシクロヘキシミドに対する感受性を決定していると報告されている（KAWAI et. al. J Bacteriol. 174 254-262 (1992) ）。ここで、シクロヘキシミド感受性であるキャンディダ・ユティリスのＬ４１蛋白質の５６番目のアミノ酸はシクロヘキシミド感受性のサッカロマイセスセレビシエと同様にプロリンであった。そこで、部位特異的突然変異導入によりＬ４１遺伝子の５６番目のプロリンをコードするコドンをグルタミンコドンに変更することによって、この遺伝子がコードするＬ４１蛋白質をシクロヘキシミド耐性型へと変換し、形質転換の選択マーカーとして利用した。
【０１５４】
まず、プラスミドｐＣＬＥ１から得られる２．１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片をｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ−ＳａｃＩサイト間に挿入して、プラスミドｐＣＬＢＳ１を作製した（図１５）。
【０１５５】
また、プラスミドｐＣＬＥ１をＡｆｌII消化し、クレノウ酵素処理により平滑化した後、さらにＸｈｏＩ消化することによって得られる０．６ｋｂの断片を、pBluescript SK- のＳｍａＩとＸｈｏＩ間に挿入して、ｐＣＬＡＸ１を作製した。このプラスミドにおいては、０．６ｋｂ断片の平滑化されたＡｆｌII末端とベクターのＳｍａＩ末端とのライゲーションにより、ＡｆｌII切断部位が再生される。ヘルパーファージを用いてｐＣＬＸＡ１から一本鎖ＤＮＡを調製し、合成した変異用オリゴヌクレオチド5'TTG TGG AAA ACT TGC TTG GTT TGA3' を用いて、Sculptorインビトロミュータジェネシスキット(Amersham)により、変異プラスミドを作製した。得られた候補プラスミドについて０．６ｋｂ挿入断片の全塩基配列を決定し、５６番目のプロリンをコードするコドンCCA がグルタミンのコドンCAA に変異され、その他の配列に変異のないプラスミドｐＣＬＡＸ２０を得た。ｐＣＬＡＸ２０から０．６ｋｂの挿入断片をＣｌａＩ−ＡｆｌII断片として切り出し、これと、プラスミドｐＣＬＢＳ１をＣｌａＩとＡｆｌIIと消化して得られる４．４ｋｂの断片とライゲーションして、変異型Ｌ４１遺伝子を含むプラスミドｐＣＬＢＳ１０を構築した。
【０１５６】
また、プラスミドｐＣＬＢＳ１０をＢａｍＨＩとＳｐｈＩとで消化して、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理により平滑末端とした後、ＮｏｔＩリンカー(5'AGCGGCCGCT3')を挿入して、プラスミドｐＣＬＢＳ１２を構築した（図１５）。
【０１５７】
次に、作成した変異型Ｌ４１遺伝子が酵母にシクロヘキシミド耐性を付与するかどうかを調べた。ＹＥｐ型ベクターであるＹＥｐ１３Ｋ（Sone et. al. Appl. Environ. Microbiol. 54, 38-42 (1988)）のＢａｍＨＩ−ＳａｃＩサイト間に、プラスミドｐＣＬＢＳ１０から得られる２．１ｋｂの変異型Ｌ４１遺伝子を含むＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片を挿入して、プラスミドｐＹＥＣＬ１０を作製した。一方、コントロールとしてｐＣＬＢＳ１から得られる２．１ｋｂの野生型Ｌ４１遺伝子を含むＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片をＹＥｐ１３Ｋにクローン化したプラスミドｐＹＥＣＬ１を作製した。
【０１５８】
これらのプラスミドを用いてサッカロミセス酵母ＹＰＨ５００株をMethods in Yeast Genetics - A laboratory Course Manual - Rose M.D et al. P122-123 Cold Spring Harbor Laboratory Press NY (1990) 記載の酢酸リチウム法に従って形質転換した。形質転換体として、ロイシン非要求性になった株を選択した。これらの形質転換体についてシクロヘキシミドを含むＹＰＤプレートでの生育を調べたところ、ｐＹＥＣＬ１０を保持する株は、５０および１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを含むＹＰＤプレートで増殖することが示された。一方、ｐＹＥＣＬ１を保持する株は同濃度のシクロヘキシミドを含むプレート上ではまったく増殖しなかった。これによって、作成した変異型Ｌ４１遺伝子がシクロヘキシミド感受性酵母に耐性を付与することが示された。
【０１５９】
実施例１０：形質転換用プラスミドの構築とキャンディダユティリス形質転換条件の決定
始めにサッカロマイセス・セレビシエで機能することが既に明らかにされているＧ４１８耐性遺伝子（アミノグリコシドフォスフォトランスフェラーゼ（ＡＰＴ）遺伝子）の発現カセットを含むプラスミドを用いて、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を試みた。この発現カセットは、Yamanoらの記載した１．０ｋｂのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域、０．４ｋｂのホスホグリセレートキナーゼ遺伝子のターミネーター領域 （Yamano et al. J. Biotechnol. 32, 165-171(1994)）の間に、プラスミドｐＵＣ４Ｋ (Pharmacia)からＸｈｏＩ−ＰｓｔＩ断片として切り出される、１．１ｋｂＧ４１８耐性遺伝子を平滑末端化して連結して作製したものである。このプラスミドとしては、(1) 上記発現カセットをＹＥｐ型ベクターＹＥｐ１３Ｋ（Sone et.al. Appl. Env. Microbiol., 54, 38-42 (1998) ）連結したプラスミド、および(2) 上記発現カセットをプラスミドpBluescript SK- に連結したプラスミドｐＧＰＤＡＰＨ１のＢａｍＨＩサイトに実施例２に記載のキャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０株のＳａｎ３ＡＩ部分消化染色体ＤＮＡ断片（５−１０ｋｂ）を挿入したＤＮＡライブラリー、さらに(3) サッカロマイセス・セレビシエで機能するＡＲＳ配列を含むｐＧＰＤＡＰＨ１プラスミドの８種類を用いた。(3) のプラスミドは、(2) のライブラリーでサッカロマイセス・セレビシエＹＰＨ５００を形質転換して得られた酵母コロニーから単離したプラスミドである。これらのプラスミドあるいはライブラリーＤＮＡを用いて抵抗値、電圧をさまざまに組み合わせた電気パルス法、あるいは酢酸リチウム法によりキャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を試みた。しかしなから、Ｇ４１８耐性を示すコロニーは得られなかった。
【０１６０】
次に、実施例９記載のプラスミドｐＣＬＢＳ１０（図１５）のＥｃｏＲＩサイトとＸｂａＩサイトに、実施例５で示したプラスミドｐＣＲＥ２、ｐＣＲＥ３、ｐＣＲＸ１、およびｐＣＲＸ２（図６）からそれぞれＥｃｏＲＩまたはＸｂａＩにより切り出される４種類のｒＤＮＡ断片を挿入して、プラスミドｐＣＬＲＥ２、ｐＣＬＲＥ３、ｐＣＬＲＸ１、およびｐＣＬＲＸ２を構築した（図１６）。
【０１６１】
これらシクロヘキシミド耐性遺伝子を選択マーカーとするプラスミド４種類、およびプラスミドｐＣＬＢＳ１０のＢａｍＨＩ部位に、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０株の染色体ＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ部分消化ＤＮＡ断片（５−１０ｋｂ）を挿入して作製したライブラリーＤＮＡを用いて、抵抗値、電圧をさまざまに組み合わせた電気パルス法、あるいは酢酸リチウム法により、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を試みた。しかしながら、これらのプラスミドを閉環状のまま用いた場合は形質転換体は得られなかった。この形質転換実験において、弱いシクロヘキシミド耐性、またはＧ４１８耐性を示す偽耐性コロニーの出現が観察された。この偽耐性コロニーとは、低濃度のＧ４１８やシクロヘキシミドなど抗生物質を添加したプレートで形質転換体を選択する場合にしばしば観察される、選択マーカーの薬剤耐性遺伝子の存在によらず自発的に耐性を獲得するコロニーである。
【０１６２】
この実験のなかで、シクロヘキシミドを形質転換体の選択に用いる場合、ＹＰＤプレートのシクロヘキシミド濃度を４０μｇ／ｍｌとすること、そしてプレートのインキュベーション温度を３０℃ではなく２８℃とすることで、偽耐性コロニーの出現を抑えられることがわかった。そこで、プラスミドＤＮＡの染色体への組み込みを促進するために、プラスミドｐＣＬＲＥ２、ｐＣＬＲＸ１、およびｐＣＬＲＸ２について、ＤＮＡのｒＲＮＡ遺伝子領域内の制限酵素サイトのそれぞれＢｇｌII、ＥｃｏＲＶ、ＢｇｌIIでプラスミドを消化してから、形質転換実験に用いた。その結果、ＢｇｌII消化したプラスミドｐＣＬＲＥ２およびｐＣＬＲＸ２について、電気容量を２５μＦとし、抵抗値を６００オーム、電圧を５ＫＶ／ｃｍとすることにより、シクロヘキシミド耐性株を得ることができた。これらの耐性株は、プラスミドＤＮＡを添加しないコントロール実験でまれに得られる微小な偽耐性株に比べて明らかにサイズが大きく、また実施例１２に示すサザン解析により形質転換体であることが明らかにされた。
【０１６３】
次に形質転換の最適条件を見いだすために、ＢｇｌII消化したプラスミドｐＣＬＲＥ２を用いて、電気容量を２５μＦに固定し、抵抗値、電圧をさまざまに組み合わせて電気パルスの最適条件を検討した。結果は図１７に示される通りであった。図には、パルス後の生菌率と、得られたシクロヘキシミド耐性株数とが示されている。
【０１６４】
この結果から、電気容量が２５μＦで抵抗値が６００、８００、または１０００オーム、電圧が３．７５、または５ＫＶ／ｃｍの条件で、１μｇＤＮＡあたり約５００−１４００個という高い頻度で形質転換体が得られることが分かった。これらの条件下でのパルス後の生菌率は約１０−４０％であった。また、抵抗値が２００、または４００オームでも生菌率が４０％以下になる条件はあるが、高い形質転換頻度は得られなかった。抵抗値が２００、または４００オームではタイムコンスタント （電圧が最大値の約３７％にまで減衰するまでの時間）が１０ミリ秒以下であり、６００、８００、または１０００オームで、パルス後の生菌率が約１０−４０％となる条件では、タイムコンスタントが約１０から２０ミリ秒であった。以上のことから、パルス後の生菌率が約１０−４０％となり、かつタイムコンスタントが１０ミリ秒以上である電気パルスを菌に与えることが高い形質転換頻度を得るために重要であることが示唆された。
【０１６５】
また、電気パルスを加えた後、菌液に１Ｍソルビトールを含むＹＰＤ培地を加え、３０℃で振盪培養することが好ましく、培養せずに菌を直接シクロヘキシミドを含む選択プレートに塗布するとコロニーが得られなかった。
【０１６６】
また、生菌数と形質転換体数の変化を経時的に調べてそれらの増加率を比較することにより、最適培養時間を決定した。
【０１６７】
その結果、培養時間が６時間までは形質転換体の増加が生菌数の増加率を上回るが、それ以後は生菌数と形質転換体数が同じ割合で増加することが明らかにされ、培養時間は６時間が最適であることが示された。
【０１６８】
キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０株の電気パルスによる標準的な形質転換法は実施例１１に示される通りである。
【０１６９】
実施例１１：電気パルスによるキャンディダ・ユティリス株の形質転換法
ＹＰＤプレート上のコロニーを、５ｍｌのＹＰＤ液体培地で、３０℃、約８時間振盪培養した後、２００ｍｌのＹＰＤ液体培地にＯＤ600 ＝0.0024になるよう植菌して３０℃振盪培養する。約１６時間後、対数増殖期（ＯＤ600 ＝２．５）にまで菌体が増殖した後、1400 x gで５分間の遠心分離により集菌する。菌体は１００ｍｌの氷冷した滅菌水で１回、続いて４０ｍｌの氷冷した滅菌水で１回洗浄した後、氷冷した１Ｍソルビトール４０ｍｌで１回洗浄する。菌体を１０ｍｌの１Ｍソルビトールに懸濁した後、滅菌ポリプロピレンチューブに移し、再度1100 x gで５分間の遠心分離により集菌する。上清を除いた後、最終菌体液量が２．５ｍｌになるよう氷冷した１Ｍソルビトールに懸濁する。
【０１７０】
電気パルスによる形質転換実験はバイオラッド社のジーンパルサーを用いて行なう。５０μｌの菌液と５μｌのＤＮＡ試料とを混合した後、０．２ｃｍのディスポーザブルキュベットに入れ、適当な条件の電気パルスを加える。パルス後、１ｍｌの氷冷した１Ｍソルビトールを含むＹＰＤ培地を加え、滅菌ポリプロピレンチューブに移した後、３０℃で約６時間振盪培養する。培養後、菌液を４０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを含むＹＰＤ選択培地に塗布した後、プレートを２８℃で３−４日保温して、形質転換体コロニーを得る。
【０１７１】
実施例１２：サザン解析による形質転換体におけるプラスミドの検出
実施例１０で得られたシクロヘキシミド耐性株のうち７個についてサザン解析を行い、これらのクローンがプラスミドＤＮＡを保持するかどうかを調べた。染色体ＤＮＡの調製は、Methods in Yeast Genetics - A laboratory Course Manual - Rose M.D et al. P131-132 Cold Spring Harbor Laboratory Press NYに記載の方法に従った。調製したＤＮＡはＥｃｏＲＶあるいはＳａｌＩにより消化し、32Ｐ標識したＬ４１遺伝子を含む１．８ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 断片（図１２）をプローブとしてハイブリダイゼーションを行った（図１８）。
【０１７２】
この結果、ＥｃｏＲＶ消化により、内在性のＬ４１遺伝子に由来する５ｋｂのバンドのほかに、２０ｋｂ以上のバンドが検出された。ＥｃｏＲＶはｒＲＮＡ遺伝子座を切断するが、プラスミドｐＣＬＲＥ２はＥｃｏＲＶで切断されないことから、プラスミドが染色体に組み込まれたことにより、この２０ｋｂ以上のバンドが検出されたものと考えられた。また、キャンディダ・ユティリス１細胞あたりのＬ４１遺伝子のコピー数が２であることは実施例１５のサザン解析により示されているので、デンシトメーターによるスキャニングの結果から組み込まれたプラスミドＤＮＡのコピー数は、およそ、６コピー（レーン７）から１５コピー（レーン２）であることが示された。
【０１７３】
一方、ＳａｌＩはプラスミドｐＣＬＲＥ２を１箇所消化するが、染色体ＤＮＡをＳａｌＩ消化した場合、内在性のＬ４１遺伝子に由来する７．５ｋｂのバンドのほかにプラスミドｐＣＬＲＥ２の長さに相当する８．５ｋｂのバンドが検出された。これは、プラスミドが染色体に複数個タンデムに組み込まれたことにより、ＳａｌＩ消化によってとなりあうプラスミドから生じたものであると考えられた。
【０１７４】
このほか１０個以上のシクロヘキシミド耐性株についてサザン解析を行なったところ、すべてのクローンでプラスミドＤＮＡの存在が確認され、実施例１０の形質転換実験で得られたシクロヘキシミド耐性株が形質転換体であることが証明された。
【０１７５】
実施例１３：その他のキャンディダ・ユティリス株の形質転換
キャンディダ・ユティリスは株によってその染色体泳動パターンが異なり、染色体の長さの多型性を示すことが報告されている(Stoltenburg et. al. Curr. Genet. 22 441-446(1992)) 。よって、株による遺伝的性質や、それによる形質転換頻度の違いも予想されることから、ＡＴＣＣ９９５０株以外にも、ＡＴＣＣ９２２６株、ＡＴＣＣ９２５６株について実施例１１に示した電気パルス法による形質転換を試みた。
【０１７６】
パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オームとし、電圧を２．５−６．２５ＫＶ／ｃｍとして行った。プラスミドＤＮＡはＢｇｌII消化したｐＣＬＲＥ２を２μｇ用いた。
【０１７７】
その結果は表１に示される通りであった。株によって頻度の差は認められたもののいずれの株でもシクロヘキシミド耐性コロニーが得られた。
【０１７８】
【０１７９】
結果は図１９に示される通りであった。いずれの株においても染色体上のＬ４１遺伝子に由来する５．４ｋｂのバンドの他に、プラスミドＤＮＡ由来のバンドが認められた。これより、これら耐性株がプラスミドＤＮＡを保持する形質転換体であることが示された。
【０１８０】
また、ＡＴＣＣ９２２６株とＡＴＣＣ９２５６株由来の形質転換体については、クローンによってプラスミドＤＮＡサイズと同じ８．４ｋｂのバンド以外に高分子側にバンドが認められた（レーン２−４、および７）。これは、プラスミド上のｒＤＮＡ配列が組み込みターゲットである染色体上のｒＤＮＡ配列と異なる場合、染色体に組み込まれたプラスミドＤＮＡ分子末端のＢｇｌII部位が欠失することがあることを示している。
【０１８１】
キャンディダ・ユティリス１細胞あたりのＬ４１遺伝子のコピー数が２であることは実施例１５のサザン解析により示されているので、５．４ｋｂのバンドが２コピーのＬ４１遺伝子に対応するものとして、バンドの強さの比較から組み込まれたプラスミドのコピー数を求めた。バンドの濃さはイメージングアナライザーＢＡＳ２０００（FUJI FILM ）を用いて測定した。
【０１８２】
その結果、プラスミドｐＣＬＲＥ２のコピー数は、ＡＴＣＣ９２５６株では７コピー（レーン１）から２５コピー（レーン３）であり、ＡＴＣＣ９２２６株では３コピー（レーン５）から１１コピー（レーン６）であった。一方、ＡＴＣＣ９９５０株ではそれぞれ１１コピー（レーン９、および１０）と計算された。
【０１８３】
以上の結果は、ＡＴＣＣ９９５０株以外のＡＴＣＣ９２２６株、およびＡＴＣＣ９２５６株についても、シクロヘキシミド耐性Ｌ４１遺伝子を用いて形質転換体が取得可能であることを示し、プラスミドは複数個同時に染色体に組み込まれたことが示された。
【０１８４】
実施例１４：酢酸リチウム法、およびその変法によるキャンディダ・ユティリスの形質転換
酢酸リチウム法（Ito et al. J. Bacteriol. 153, 163-168 (1983)）はその簡便さから広くサッカロミセス属酵母の形質転換に用いられている。そこで、ＢｇｌII消化により直鎖状にしたプラスミドｐＣＬＲＥ２を用いて、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０株を酢酸リチウム法、およびエタノールまたはＤＭＳＯを添加する酢酸リチウム法変法(Soni et. al. Current Genet.1993 24, 455-459) に従って形質転換することを試みた。酢酸リチウム法変法ではエタノールはヒートショック開始１０分後に終濃度１０％になるように菌液に添加し、さらに１０分間保温した。また、ＤＭＳＯはポリエチレングリコール液と同時に終濃度１０％になるように菌液に添加した。処理した菌体はＹＰＤ溶液に懸濁して、３０℃４時間の振盪培養を行なってからシクロヘキシミドを含む選択プレートに塗布し、２８℃で６日間保温した。
【０１８５】
その結果、エタノールＤＮＡを添加するリチウム法変法によりプラスミドＤＮＡ ２μｇＤＮＡについてシクロヘキシミド耐性株が５個得られた。このうち２つのクローンについて染色体ＤＮＡを調製して実施例１３記載の方法でサザン解析を行ったところ、プラスミド由来のバンドが検出され、これらが形質転換体であることが示された。この結果から、形質転換頻度は電気パルス法に比較してかなり低いが、酢酸リチウムによって処理されたキャンディダユティリスもＤＮＡを取り込むことが可能であることが示された。
【０１８６】
本実験ではSoniらの報告にしたがって実験を行なったが、さらに処理条件を検討することにより形質転換頻度を高めることも可能である。
【０１８７】
実施例１５：異なるｒＲＮＡ遺伝子領域をターゲットとした形質転換
１）プラスミドの構築
実施例９に記載のプラスミドｐＣＬＢＳ１２（図１５）のＥｃｏＲＩサイトに、ｐＣＲＥ２（図６）から得られる３．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を挿入することによりｐＣＬＲＥ４を、ｐＣＲＥ３（図６）から得られる２．４ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を挿入することによりｐＣＬＲＥ５をそれぞれ構築した。
【０１８８】
また、７．５ｋｂのｒＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ断片がクローン化されたｐＣＲＥ１（図６）から切り出される３ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片と、４．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片とを、pBluescript SK- のＥｃｏＲＩとＸｂａＩ間に連結した後、それぞれのプラスミドのＸｂａＩサイトをＥｃｏＲＩリンカー(5'CCAAGCTTGG3')の挿入によりＥｃｏＲＩサイトに変換して、プラスミドｐＣＲＥ６とｐＣＲＥ７とを構築した。これらのプラスミドｐＣＲＥ６とｐＣＲＥ７とからそれそれ切り出した３ｋｂと４．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をプラスミドｐＣＬＢＳ１２のＥｃｏＲＩサイトに挿入することにより、プラスミドｐＣＬＲＥ６とｐＣＬＲＥ７を構築した。
【０１８９】
構築したプラスミドｐＣＬＲＥ４、ｐＣＬＲＥ５、ｐＣＬＲＥ６、およびｐＣＬＲＥ７の構造は図２０に示される通りである。
【０１９０】
２）形質転換
作製したプラスミドｐＣＬＲＥ４、ｐＣＬＲＥ５、ｐＣＬＲＥ６、およびｐＣＬＲＥ７は制限酵素で消化して直鎖状ＤＮＡとした後、各１μｇのＤＮＡを用いて実施例１１に示した電気パルス法によりＡＴＣＣ９９５０株を形質転換した。パルス条件は、電気容量を２５μＦ、電圧を５ＫＶ／ｃｍ、抵抗値を８００オームとし、パルス後の培養時間は１８時間とした。プラスミドの消化に用いた制限酵素はｒＲＮＡ遺伝子断片内にその切断サイトがある酵素で、ｐＣＬＲＥ４はＢｇｌII、ｐＣＬＲＥ５はＢａｍＨＩまたはＸｂａＩ、ｐＣＬＲＥ６はＢａｍＨＩ、そしてｐＣＬＲＥ７はＡｐａＩ、またはＥｃｏＲＶでそれぞれ消化した。プラスミドｐＣＬＲＥ４についてはＬ４１遺伝子内のＣｌａＩサイトにおいても消化して、組み込みのターゲット遺伝子の違いによる形質転換頻度の差を比較した。
実験は２回行った。その結果は、表２に示される通りであった。
【０１９１】
【０１９２】
また、プラスミドｐＣＬＲＥ４について、Ｌ４１遺伝子内のＣｌａＩサイトで消化した場合、その形質転換頻度はｒＲＮＡ遺伝子内のＢｇｌIIサイトで消化した場合に比較して、約１０分の１から５０分の１程度であった。また、以下に記載したサザン解析により、プラスミド分子はＣｌａＩサイトで消化した場合にはＬ４１遺伝子座に、ＢｇｌIIサイトで消化した場合にはｒＲＮＡ遺伝子座に、それぞれ組み込まれたことが示された。
【０１９３】
以上より、染色体でのコピー数が多いｒＲＮＡ遺伝子をターゲット配列として用いることによって、高い形質転換頻度が得られることが明らかとなった。
【０１９４】
３）サザン解析
ＢｇｌIIまたはＣｌａＩ消化したｐＣＬＲＥ４、ＸｂａＩ消化したｐＣＬＲＥ５、ＢａｍＨＩ消化したｐＣＬＲＥ６、そしてＡｐａＩ消化したｐＣＬＲＥ７を用いて得られたシクロヘキシミド耐性株それぞれ４株ずつについて、染色体ＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡはＢｇｌII、またはＢｇｌIIおよびＮｏｔＩにより消化し、32Ｐ標識したＬ４１遺伝子を含む１．８ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 断片（図１２）をプローブとして、サザン解析を行った（図２１）。
【０１９５】
プラスミドｐＣＬＲＥ４が組み込まれた株では、ＢｇｌII消化によって、内在性のＬ４１遺伝子に由来する５．４ｋｂのバンドのほかに、プラスミドＤＮＡ分子内ＢｇｌIIサイトでの切断によりプラスミドＤＮＡと同じサイズの８．４ｋｂのバンドが認められた（図２１ （１）、レーン１−８）。また、ＣｌａＩ消化したプラスミドが組み込まれた株の場合は、これら２つのバンドの他に、７．４ｋｂと６．４ｋｂのバンドが認められた（レーン１−４）。これら２つのバンドは、染色体上のＬ４１遺伝子のうち１個がプラスミドの挿入により分断されたことにより、組み込まれたプラスミド分子の両末端に位置するプラスミド分子内のＢｇｌIIサイトとＬ４１遺伝子領域内のＢｇｌIIサイトとから生ずるものであることから、プラスミド分子が相同組換えによりＬ４１遺伝子座に組み込まれたことが示された。このことから、プラスミド分子は、ＣｌａＩサイトで切断された場合にはＬ４１遺伝子座に、ＢｇｌIIサイトで切断された場合にはｒＲＮＡ遺伝子座に、それぞれ組み込まれたことが示された。これにより、切断サイトを変更することでプラスミドの組み込み場所をコントロールすることが可能であることが示された。また、レーン１−４では５．４ｋｂ、７．４ｋｂ、および６．４ｋｂのバンドの濃さがほぼ同じであったことから、染色体にはＬ４１遺伝子が２コピー存在することが明らかにされた。
【０１９６】
プラスミドｐＣＬＲＥ５、ｐＣＬＲＥ６、およびｐＣＬＲＥ７が組み込まれた株では、ＢｇｌII＋ＮｏｔＩ消化により、内在性のＬ４１遺伝子に由来する５．４ｋｂのバンドのほかに、染色体に組み込まれたプラスミド由来のいくつかのバンドが認められた（図２１（２））。このうちサイズが各プラスミドと同一であるバンド、すなわちｐＣＬＲＥ５では７．３ｋｂ（レーン１−４）、ｐＣＬＲＥ６では８．０ｋｂ（レーン５−８）、そしてｐＣＬＲＥ７では９．４ｋｂのバンド（レーン９−１２）は、プラスミドが染色体にタンデムに組み込まれることにより、プラスミド内に１箇所サイトがあるＮｏｔＩ消化によって隣り合うプラスミドから生じたバンドである。また、それ以外にもｐＣＬＲＥ５では７ｋｂ（レーン１−４）、ｐＣＬＲＥ６では６．９ｋｂ（レーン５−８）、そしてｐＣＬＲＥ７では１１ｋｂ （レーン９−１２）のバンドが認められた。これらのサイズはプラスミドＤＮＡがｒＲＮＡ遺伝子座に相同組換えにより組み込まれた場合にＢｇｌII＋ＮｏｔＩ消化によりｒＲＮＡ遺伝子座内のＢｇｌIIサイトとプラスミドＤＮＡ内のＮｏｔＩサイトとから得られる断片の長さに一致する。これより、プラスミドＤＮＡが切断された部位で相同組換えにより染色体に組み込まれたことが示された。
【０１９７】
図２１（１）のレーン１−４の５．４ｋｂのバンドが１コピーのＬ４１遺伝子、レーン５−８および図２１ （２）のレーン１−１２の５．４ｋｂバンドが２コピーのＬ４１遺伝子に対応するものとして、各バンドの濃さの比較から組み込まれたプラスミドのコピー数を求めた。バンドの濃さはイメージングアナライザーＢＡＳ２０００（FUJI FILM ）を用いて測定した。
【０１９８】
その結果、プラスミドｐＣＬＲＥ４は、Ｌ４１遺伝子座には３コピー（レーン４）から５コピー（レーン１、および３）、ｒＲＮＡ遺伝子座には２コピー（レーン８）から８コピー（レーン５）挿入されたことが示された。この結果から、プラスミドＤＮＡがｒＲＮＡ遺伝子座に組み込まれた場合、組み込まれたプラスミド分子のコピー数が高い株が選択される傾向が認められた。これは、実施例１２においてプラスミドｐＣＬＲＥ２がｒＲＮＡ遺伝子座に組み込まれた株ではプラスミドＤＮＡのコピー数がおよそ６コピーから１５コピーであるが、実施例１６のＵＲＡ３遺伝子座へ組み込まれたプラスミドＤＮＡの場合はコピー数がおよそ３コピーから４コピーであったことからも示唆される。
【０１９９】
また、プラスミドｐＣＬＲＥ５、ｐＣＬＲＥ６、およびｐＣＬＲＥ７についてはそれぞれ３コピー（図２１ （２）、レーン４）から５コピー（レーン２）、３コピー（レーン８）から６コピー（レーン５、および６）、３コピー（レーン１２）から５コピー（レーン９）組み込まれたことが示された。
【０２００】
実施例１６：ＵＲＡ３遺伝子座へのプラスミドの組み込み
プラスミドｐＣＬＢＳ１２（図１５）のＥｃｏＲＩサイトに、ＵＲＡ３遺伝子を含む５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片（図７）を挿入して、プラスミドｐＣＬＵＲＡ１を構築した。このプラスミドをＵＲＡ３遺伝子座内のＰｓｔＩサイトで切断し、このプラスミドを用いて実施例１１記載の電気パルス法によりＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を試みた。パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値を８００オーム、電圧を５ＫＶ／ｃｍとして行った。これにより１μｇＤＮＡあたりシクロヘキシミド耐性コロニーが４０個得られた。
【０２０１】
得られたシクロヘキシミド耐性株４株について染色体ＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡはＢｇｌII、またはＳａｌＩ＋ＮｏｔＩにより消化し、サザン解析に供した。ＢｇｌII消化したＤＮＡについてはＬ４１遺伝子を含む１．８ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 断片（図１２）を、ＳａｌＩ＋ＮｏｔＩ消化したＤＮＡについてはＵＲＡ３遺伝子を含む２．３ｋｂのＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩ断片（図８）を、それぞれ32Ｐ標識してプローブとした。
【０２０２】
その結果は、図２２に示される通りであった。
【０２０３】
ＳａｌＩ＋ＮｏｔＩ消化したＤＮＡについてＵＲＡ３遺伝子をプローブとした場合、親株のＡＴＣＣ９９５０株では内在性ＵＲＡ３遺伝子由来の１３Ｋｂのバンドが認められた（図２２（１）、レーン１）。一方、耐性株ではこの１３ｋｂのバンドのほかに、タンデムに複数個組み込まれたプラスミドからＮｏｔＩ消化により生じる１０ｋｂのバンドと、染色体上のＵＲＡ３遺伝子のうち１個がプラスミドの挿入により分断されて生じる８．４ｋｂと１４ｋｂの２本のバンドが検出された（レーン２−５）。これら２本のバンドは、組み込まれたプラスミド分子の両末端に位置するプラスミド分子内のＮｏｔＩサイトとＵＲＡ３遺伝子領域内のＳａｌＩサイトとから生ずるものであることから、プラスミド分子が相同組換えによりＵＲＡ３遺伝子座に組み込まれたことが示された。
【０２０４】
また、形質転換体では内在性ＵＲＡ３遺伝子由来の１３ｋｂのバンドと染色体に組み込まれたプラスミド分子の両末端のプラスミド由来の８．４ｋｂと１４ｋｂのバンドの濃さがほぼ一致することから、ＵＲＡ３遺伝子もＬ４１遺伝子同様、細胞あたり２コピー存在し、形質転換体ではそのうち１コピーがプラスミドＤＮＡの挿入により分断されたことが示された。また、これらの４本のバンド（１４ｋｂ、１３ｋｂ、１０ｋｂ、および８．４ｋｂ）の濃さの比較から、組み込まれたプラスミドのコピー数は３コピー（レーン３、および５）から４コピー（レーン２、および４）であることが示された。
【０２０５】
また、ＢｇｌII消化したＤＮＡについてＬ４１遺伝子をプローブとした場合、親株のＡＴＣＣ９９５０株では内在性のＬ４１遺伝子に由来する５．４ｋｂのバンドが認められたが（図２２（２）、レーン１）、耐性株ではこのバンドのほかにプラスミドＤＮＡと同じサイズの１０ｋｂのバンドが認められた（レーン２−５）。
【０２０６】
実施例１７：キャンディダ・ユティリスでの異種遺伝子（グルコアミラーゼ遺伝子）の発現
（１）グルコアミラーゼ遺伝子（ＳＴＡ１遺伝子）発現用プラスミドの構築
ＳＴＡ１遺伝子発現用プラスミドを図２３に示されるように構築した。
【０２０７】
まず、ＳＴＡ１遺伝子をサッカロマイセス・ディアスタティカス５１０６−９Ａ（ａ ｌｅｕ２，ａｒｇ４，ＳＴＡ１）(Yamashita and Fukui Agric.Biol.Chem. 47，2689-2692)の染色体ＤＮＡライブラリーよりクローニングした。これは、以下に示した操作により行った。
【０２０８】
５１０６−９Ａ菌体から染色体ＤＮＡを調製してＳａｕ３ＡＩにより部分消化した後、アガロースゲル電気泳動により約２０−３０ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片と、ＢａｍＨＩ消化した後脱リン酸化したλファージベクターＥＭＢＬ３（Stratagene Cloning Systems）とを、Ｔ４リガーゼにより連結した。それを、GigapackII Gold Packaging Extract （StratageneCloning Systems ）を用いて、インビトロパッケージングし、染色体ＤＮＡの遺伝子ＤＮＡライブラリーを構築した。
【０２０９】
発表済みのＳＴＡ１遺伝子の塩基配列(Yamashita et. al. J Bacteriol. 161, 567-573 1985)に基づいて合成した２種類のオリゴヌクレオチド5'ACCACTATTACCACTACGGTTTGCTCTACA3'（配列番号：１９)、および5'GACACATCTCTGAGCAGCATGACTTGGTTG3'（配列番号２０）をＴ４キナーゼにより32Ｐ末端標識したものをプローブとして用いて、この染色体ＤＮＡライブラリー約20,000プラークをスクリーニングした。この結果、２種のプローブどちらにもポジティブシグナルを与えるクローン１個を得た。
【０２１０】
このＳＴＡ１遺伝子を含むファージクローンより、ＳＴＡ１遺伝子を含む４ｋｂのＢｇｌII−ＨｐａＩ断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩとＨｉｎｃII間にクローン化して、プラスミドｐＵＳＴＡ１（図２３）を構築した。
【０２１１】
続いて、ｐＵＳＴＡ１をＳＴＡ１遺伝子の開始コドンATG の５bp下流に存在するＳｔｕＩサイトで切断した後、ＸｂａＩサイトおよび開始コドンを含む合成アダプター（配列番号：２１）：5'-CTAGATGGTAGG-3' 3'-TACCATCC-5' を付加した。その後、さらにＳａｌＩで部分消化することにより、ＳＴＡ１遺伝子を２．７ｋｂのＸｂａＩ−ＳａｌＩ断片として得た。
【０２１２】
次に、ｐＵＣ１２をＰｓｔＩとＨｉｎｄIII で消化した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、ＢｇｌIIリンカーを付加して構築したプラスミドｐＵＣ１２ＢｇｌIIの、ＸｂａＩとＳａｌＩと間にＳＴＡ１遺伝子を含む２．７ｋｂのＸｂａＩ−ＳａｌＩ断片を挿入して、プラスミドｐＵＳＴＡ２を構築した。
【０２１３】
このｐＵＳＴＡ２から２．７ｋｂのＸｂａＩ−ＢｇｌII断片を切り出し、これを、発現ベクターｐＰＧＫＰＴ４のＸｂａＩとＢａｍＨＩサイト間に挿入して、プラスミドｐＧＫＳＴＡ１を構築した。
【０２１４】
さらにｐＧＫＳＴＡ１からＰＧＫ遺伝子プロモーターと、ＳＴＡ１遺伝子と、さらにＰＧＫ遺伝子ターミネーターとを含む４．９ｋｂのＮｏｔＩ断片を切り出し、この断片を、プラスミドｐＣＬＢＳ１２のＮｏｔＩサイトに挿入してプラスミドｐＣＬＳＴＡ１を、プラスミドｐＣＬＲＥ４のＮｏｔＩサイトに挿入してプラスミドｐＣＬＲＳＴＡ１を、それぞれ構築した。
【０２１５】
（２）キャンディダ・ユティリスの形質転換とグルコアミラーゼ発現
ＢｇｌII消化したプラスミドｐＣＬＲＳＴＡ１を用いて、ＡＴＣＣ９９５０株、ＡＴＣＣ９２２６株、およびＡＴＣＣ９２５６株の形質転換を、実施例１１記載の電気パルス法で行った。パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電圧を３．７５ＫＶ／ｃｍ、または６．２５ＫＶ／ｃｍとして行った。
【０２１６】
株によって頻度の差は認められたもののいずれの株でもシクロヘキシミド耐性コロニーが得られた。
【０２１７】
このうちそれぞれ２株ずつについて基質であるスターチが入ったプレート（３％ Soluble starch (Katayama)、２％ polypeptone 、１％ Yeast extract、３．３×１０-3％ Bromocresol purple、２％ Bacto agar）上でグルコアミラーゼ活性を調べた。その結果、３種の株由来の形質転換体すべてについて分泌されたグルコアミラーゼによるハローが観察され、遺伝子の発現が確認された。また、ＡｆｌII消化したプラスミドｐＣＬＳＴＡ１を用いてＡＴＣＣ９９５０株を形質転換した。この形質転換体について、Ｌ４１遺伝子座に組み込まれたグルコアミラーゼ遺伝子の発現も調べたところ、同様にハローの形成が確認された。
【０２１８】
さらにこれら形質転換体のグルコアミラーゼ活性を測定した。このため、菌体をＹＰＤ液体培地で一晩培養して、その上清を粗酵素液とした。反応は、４００μｌの粗酵素液と、０．５％の可溶性でんぷん、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を含む５００μｌの反応液で、５０℃、２０分間行った。反応後１００℃、５分間の熱処理で酵素を失活した後、遊離したグルコース濃度を市販のキット（グルコースB-テスト（和光純薬））を用いて測定した。
【０２１９】
グルコアミラーゼ活性は当反応条件下で遊離するグルコースの量が１００μｇである時、その活性を１ユニットとし表した。培養上清１ｍｌあたりの活性値は表３に示される通りであった。
【０２２０】
【０２２１】
さらに、ＢｇｌII消化したプラスミドｐＣＬＳＴＡ１、またはＡｆｌII消化したプラスミドｐＣＬＳＴＡ１で形質転換したＡＴＣＣ９９５０株をそれぞれ２株ずつ４０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドと５％グルコースを含むＹＰＤ液体培地で３０℃４日間培養した。その後、それらの菌体培養液１０μｌを４−２０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、培養液中の蛋白質を分析した（図２４）。ゲルはクマシーブリリアントブルーにより染色した。また、対照としてＢｇｌII消化したプラスミドｐＣＬＲＥ２で形質転換した株の培養液を分析した（レーン１）。その結果、いずれの培養液においてもグルコアミラーゼに相当する約１００ｋＤａの蛋白質が認められ、蛋白量は、染色されたバンドの濃さから約２〜５μｇに相当すると判断された。このことから、グルコアミラーゼ遺伝子が高いレベルで発現し、培養液中に分泌されたことが示された。以上の結果から、分泌蛋白質生産用の好適な宿主／ベクター系としてキャンディダ・ユティリスが使用できることが明らかとなった。
【０２２２】
実施例１８：キャンディダユティリスでの異種遺伝子（ｌａｃＺ遺伝子）の発現
（１）ｌａｃＺ遺伝子発現用プラスミドの構築
ｌａｃＺ遺伝子発現用プラスミドを図２５に示されるように構築した。
【０２２３】
まず、プラスミドｐＭＣ１８７１（Pharmacia ）より、βガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子を３．１ｋｂのＢａｍＨＩ断片として切り出した。この断片を、プラスミドＹＥｐ１３Ｋ（ Sone et. al. Appl. Environ. Microbiol. 54, 38-42 (1988)）のＢｇｌIIサイトに連結し、遺伝子の5'側にＨｉｎｄIII サイトのあるプラスミドｐＺ４を選択した。
【０２２４】
このプラスミドから開始コドンATG を有するｌａｃＺ遺伝子を、３．１ｋｂのＨｉｎｄIII −ＸｈｏI 断片として切り出した。この断片を、pBluescript SK- のＨｉｎｄIII とＸｈｏＩサイト間に連結して、プラスミドｐＬＡＣＺ１を構築した。
【０２２５】
このプラスミドをＨｉｎｄIII ＋ＸｂａＩ消化し、クレノウ処理した後、再環状化してプラスミドｐＬＡＣＺ２を構築した。
【０２２６】
さらに、このプラスミドからｌａｃＺ遺伝子を３．１ｋｂのＸｂａＩ−ＫｐｎＩ断片として切り出し、これをプラスミドｐＰＧＫＰＴ５（図４）のＸｂａＩとＫｐｎＩ間に連結して、プラスミドｐＧＫＬＡＣ１を構築した。
【０２２７】
さらにｐＧＫＬＡＣ１からＰＧＫ遺伝子プロモーターと、ｌａｃＺ遺伝子と、さらにＰＧＫ遺伝子ターミネーターとを含む５．４ｋｂのＮｏｔＩ断片を切り出し、これをプラスミドｐＣＬＢＳ１２のＮｏｔＩサイトに挿入して、プラスミドｐＣＬＬＡＣ１を、またプラスミドｐＣＬＲＥ４のＮｏｔＩサイトに挿入してプラスミドｐＣＬＲＬＡＣ１を、それぞれ構築した。
【０２２８】
（２）キャンディダ・ユティリスの形質転換とβガラクトシダーゼ活性確認
ＢｇｌII消化したプラスミドｐＣＬＲＬＡＣ１、またはＡｆｌII消化したプラスミドｐＣＬＬＡＣ１を用いて実施例１１記載の電気パルス法によりＡＴＣＣ９９５０株を形質転換した。形質転換されたＡＴＣＣ９９５０株，それぞれ２株を、５ｍｌのＹＰＤ液体培地で６時間、対数増殖期（ＯＤ600 が約２から３）まで培養した。βガラクトシダーゼ活性はMethods in Yeast Genetics - A laboratory Course Manual - Rose M.D et al. P155-159 Cold Spring Harbor Laboratory Press NY (1990) に記載の方法に従って測定した。すなわち、集菌した菌体を１ｍｌのＺバッファーに懸濁した後、クロロホルム液を３滴、０．１％ＳＤＳを２滴加えて、１０秒ボルテックスした。２８℃で５分間インキュベートした後、０．２ｍｌのＯＮＰＧ液を加え、さらに１０分間インキュベートした。その後、０．５ｍｌのＮａ2 ＣＯ3 液を添加して反応を停止した。ＯＤ420 を測定した後、計算式に従ってβガラクトシダーゼ活性を求めた。βガラクトシダーゼ活性は２８℃で１分あたり１ｎｍｏｌのオルトニトロフェノールを生成する活性を１ユニットとした。得られた菌体１ＯＤ600 当たりの活性値は表４に示される通りであった。
【０２２９】
【０２３０】
実施例１９：キャンディダ・ユティリスでの異種遺伝子（ＡＰＴ遺伝子）の発現
（１）ＡＰＴ遺伝子発現用プラスミドの構築
ＡＰＴ遺伝子発現用プラスミドを図２６に示されるように構築した。
【０２３１】
まず、トランスポゾンＴｎ９０３由来のアミノグリコシドフォスフォトランスフェラーゼ（ＡＰＴ遺伝子) を含むプラスミドｐＵＣ４Ｋ（Pharmacia ）から１．１ｋｂのＸｈｏＩ−ＰｓｔＩ断片を切り出し、これをｐＵＣ１９のＳａｌＩとＰｓｔＩ間に挿入して、プラスミドｐＡＰＨ１を構築した。
【０２３２】
続いてｐＡＰＨ１をＰｓｔＩ消化した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端とし、ＢｇｌIIリンカー(5'CAGATCTG3')を挿入して、プラスミドｐＡＰＨ２を構築した。
【０２３３】
さらに、ｐＡＰＨ２よりＡＰＴ遺伝子を１．１ｋｂのＸｂａＩ−ＢｇｌII断片として切り出し、これを発現ベクターｐＰＧＫＰＴ４（図４）のＸｂａＩとＢａｍＨＩサイト間に挿入して、プラスミドｐＧＫＡＰＨ１を構築した。
【０２３４】
さらにｐＧＫＡＰＨ１からＰＧＫ遺伝子プロモーターと、ＡＰＴ遺伝子、そしてＰＧＫ遺伝子ターミネーターとを含む３．３ｋｂのＮｏｔＩ断片を切り出し、これをプラスミドｐＣＬＢＳ１２のＮｏｔＩサイトに挿入して、プラスミドｐＣＬＡＰＨ１を、またプラスミドｐＣＬＲＥ４のＮｏｔＩサイトに挿入してプラスミドｐＣＬＲＡＰＨ１を、それぞれ構築した。
【０２３５】
（２）キャンディダ・ユティリスの形質転換とＧ４１８耐性の確認
ＢｇｌII消化したプラスミドｐＣＬＲＡＰＨ１を用いて、ＡＴＣＣ９９５０株、ＡＴＣＣ９２２６株、およびＡＴＣＣ９２５６株の形質転換を試みた。形質転換は実施例１１記載の電気パルス法で行った。パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電圧を３．７５ＫＶ／ｃｍ、または６．２５ＫＶ／ｃｍとして行った。
【０２３６】
その結果、株によって頻度の差は認められたもののいずれの株でもシクロヘキシミド耐性コロニーが得られた。このうちそれぞれ２株ずつについて、異なる濃度のＧ４１８を含むＹＰＤプレート上で菌の増殖を調べた。その結果、３種のキャンディダ・ユティリス株すべてについて形質転換体の増殖が確認され、これらの形質転換体においてＡＰＴ遺伝子が発現したことが確認された。
【０２３７】
また、ＡｆｌII消化したプラスミドｐＣＬＡＰＨ１を用いてＡＴＣＣ９９５０株を形質転換し、Ｌ４１遺伝子座に組み込まれた遺伝子の発現についても調べた。その結果、同様に形質転換体の増殖が確認され、Ｌ４１遺伝子座に組み込まれたＡＰＴ遺伝子についてもその発現が確認された。
【０２３８】
（３）組み込まれたプラスミドの安定性
ＢｇｌII消化されたプラスミドｐＣＬＲＡＰＨ１、またはＡｆｌII消化されたプラスミドｐＣＬＡＰＨ１で形質転換されたＡＴＣＣ９９５０株、それぞれ２株ずつについて、組み込まれたプラスミドＤＮＡの安定性を次のように調べた。まず、形質転換体を４０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを含む５ｍｌのＹＰＤ液体培地で定常期まで培養し、このときの世代数を０とした。次に、このうち５μｌを５ｍｌのＹＰＤ液体培地に植菌して定常期まで培養し、このときの世代数を１０と計算した。この操作を繰り返して２０世代まで菌を培養した。プラスミド保持率は、菌液を希釈後、ＹＰＤプレートと４０μｇ／mlのシクロヘキシミドを含むＹＰＤプレートとにそれぞれ塗布して、３０℃で２日培養後、生じたコロニー数を調べた。
結果は表５に示される通りであった。
【０２３９】
【０２４０】
実施例２０：Ｇ４１８耐性を選択マーカーとしたキャンディダ・ユティリス形質転換体の取得
プラスミドｐＣＬＲＡＰＨ１は、形質転換体選択マーカーとしてシクロヘキシミド耐性を付与する変異型Ｌ４１遺伝子と、Ｇ４１８耐性を付与するＡＰＴ遺伝子を含んでいる。実施例１９に記載した実験によりＡＰＴ遺伝子がＰＧＫ遺伝子プロモーターにより発現することが確認されたので、形質転換体のＧ４１８耐性による直接選択を試みた。
【０２４１】
まず、プラスミドｐＣＬＲＡＰＨ１をＢｇｌIIにより消化し、直鎖状にした。これを用いて、実施例１１記載の電気パルス法によって、ＡＴＣＣ９９５０株を形質転換した。パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、または８００オーム、電圧を５ＫＶ／ｃｍとして行った。菌体は１Ｍソルビトールを含むＹＰＤ培地で６時間培養した後、４０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを含むＹＰＤプレートと、１５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤプレートとにそれぞれ塗布した。
結果は表６に示される通りであった。
【０２４２】
【０２４３】
Ｇ４１８耐性で選択した４個のコロニーと、シクロヘキシミド耐性で選択した４個のコロニーとについて、染色体ＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡはＢｇｌII＋ＮｏｔＩにより消化した後、32Ｐ標識したＬ４１遺伝子を含む１．８ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 断片（図１２）をプローブとして、サザン解析を行った（図２７）。その結果、内在性Ｌ４１遺伝子に由来する５．４ｋｂのバンドのほかに、プラスミドに由来する４．４ｋｂのバンドが認められた。イメージングアナライザーＢＡＳ２０００（FUJI FILM ）を用いてバンドの強度を測定し、プラスミド由来のバンドと内在性Ｌ４１遺伝子（２コピー／細胞）のバンドの比較から、組み込まれたプラスミドのコピー数を求めた。その結果、シクロヘキシミド耐性で選択された株ではプラスミドが４（レーン２）から７コピー（レーン５）存在することが示された。一方、Ｇ４１８耐性で選択した株では４株ともコピー数が１ （レーン６−９）であると計算された。この結果より、変異型Ｌ４１遺伝子を選択マーカーとして形質転換体を選択することによって形質転換の頻度は低くなるものの、プラスミドが複数個組み込まれた株を容易に取得できることが示された。
【０２４４】
また、ｐＧＫＡＰＨ１をＮｏｔＩ消化して、二つの断片に分けた。すなわち、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、ＡＰＴ遺伝子、およびＰＧＫ遺伝子ターミネーターを含む断片と、ベクター断片とに分けた。その後、これらをＡＴＣＣ９９５０株の形質転換に用いた。パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電圧を５ＫＶ／ｃｍとして行った。２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤプレートで形質転換体を選択したところ、１μｇＤＮＡあたり１５６個の形質転換体が得られた。この結果は、キャンディダ．ユティリス酵母においては、ＢｇｌII消化により直鎖状にしたプラスミドｐＣＬＲＡＰＨ１による遺伝子挿入型の形質転換に加え、遺伝子置換型の形質転換も起きることを示す。また、その形質転換頻度も比較的高く、遺伝子置換型の形質転換も効率良く起きることが明らかにされた。
【０２４５】
実施例２１：ＰＧＫ遺伝子プロモーターの短縮化と最小機能領域の同定
実施例１７−２０で使用したＰＧＫ遺伝子プロモーターを短縮化し、プロモーターの最小機能領域の同定を試みた。
【０２４６】
実施例１９記載のプラスミドｐＧＫＡＰＨ１のＰＧＫ遺伝子プロモーター断片内部に存在する制限酵素サイトを利用して、長さの異なるＰＧＫ遺伝子プロモーターとＡＰＴ遺伝子、さらにＰＧＫ遺伝子ターミネーターとを含む断片を５種類取得した。すなわちｐＧＫＡＰＨ１をＮｏｔＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩ＋ＳａｃＩ、またはＰｓｔＩ＋ＳａｃＩ消化して４種類の断片を得た。また、ｐＧＫＡＰＨ１をＳｐｈＩ消化してからＴ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理によって平滑末端とし、さらにＢａｍＨＩリンカー（5´CCGGATCCGG3´：配列番号：２２）を付加した後、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩ消化することにより、さらに１種類の断片を得た。
【０２４７】
また、実施例５記載のプラスミドｐＣＲＥ２をＨｉｎｄIII 消化して得られる０．７ｋｂと５．８ｋｂの断片のうち、５．８ｋｂの断片をライゲーションにより再環状化して、プラスミドｐＣＲＥ８を構築した（図２８）。このプラスミドｐＣＲＥ８をＮｏｔＩ、ＢａｍＨＩ＋ＮｏｔＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩ＋ＳａｃＩ、またはＰｓｔＩ＋ＳａｃＩ消化したのち、それぞれと上記の各種断片をライゲーションして、プラスミドｐＣＲＡＰＨ２、ｐＣＲＡＰＨ３、ｐＣＲＡＰＨ４、ｐＣＲＡＰＨ５、およびｐＣＲＡＰＨ６を構築した（図２８）。それぞれのプラスミドに含まれるＰＧＫ遺伝子プロモーター断片の長さは、ｐＣＲＡＰＨ２では１．３５ｋｂ、ｐＣＲＡＰＨ３では０．８３ｋｂ、ｐＣＲＡＰＨ４では０．４６ｋｂ、ｐＣＲＡＰＨ５では０．４０ｋｂ、そしてｐＣＲＡＰＨ６では０．１６ｋｂであった。
【０２４８】
構築したプラスミドｐＣＲＡＰＨ２、３、４、５、および６をＢｇｌII消化により直鎖状にした後、ＡＴＣＣ９９５０株の形質転換に使用した。形質転換は実施例１１記載の電気パルス法で行った。パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電圧を５ＫＶ／ｃｍとして行った。
【０２４９】
形質転換体の選択は２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤプレートで行った。その結果、プラスミドｐＣＲＡＰＨ２、ｐＣＲＡＰＨ３、ｐＣＲＡＰＨ４、およびｐＣＲＡＰＨ５を用いた場合、それぞれ１μｇＤＮＡあたり３００個程度の形質転換体が得られたが、一方プラスミドｐＣＲＡＰＨ６では形質転換体が得られなかった。この結果は、ＰＧＫ遺伝子の開始コドンＡＴＧの直前から、５’上流１６９ｂｐのＰｓｔＩサイトまでを含む断片は転写のプロモーターとしての機能を有しておらず、一方、４０１ｂｐ上流のＥｃｏＲＩサイトまでを含む断片、およびさらに長い領域を含む断片は転写のプロモーターとして機能することを示している。これより、図３に示されるＰＧＫ遺伝子のプロモーターを含む１３４６ｂｐの配列のうち、９４６番目のＥｃｏＲＩサイトからＡＴＧ直前の１３４６番目塩基までの４０１ｂｐの配列にプロモーターの機能を示すために必要な配列が含まれることが明らかにされた。
【０２５０】
実施例２２：グリセロアルデヒド-3- リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子のクローニングとＧＡＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列決定
キャンディダ・ユティリスのグリセロアルデヒド-3- リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子のクローニングは、遺伝子ライブラリーとして実施例２で構築したキャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡライブラリーを用い、他生物の既知のＧＡＰ遺伝子をプローブとしたハイブリダイゼーション法を用いて行った。Molecular Cloning 2nd edition p2.95-121,Cold Spring HarborLaboratory (1989) に記載された方法に従い、上記の遺伝子ライブラリーの約20,000プラークのファージＤＮＡを吸着させたフィルターを作製した。次に、サッカロマイセス・セレビシエのＧＡＰ遺伝子を含む2.1 ｋｂのＨｉｎｄIII 断片を保持するｐＵＣ18プラスミド（Yamano et al. Journal of Biotechnology 32, 165- 171 (1994)）から、ＧＡＰ遺伝子の大部分を占めるＤＮＡ断片として約1 ｋｂのＡｓｕII- ＡｆｌII断片を切り出した。この断片を32Ｐ標識して、これをプローブとしてハイブリダイゼーションを行った。その結果3 つの陽性プラークが分離できた。更にこれらプラークの1 つのファージＤＮＡについてサブクローニングを行い、このファージＤＮＡに含まれていた6.5 ｋｂＥｃｏＲＩ断片を単離し、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ＋のＥｃｏＲＩサイトに組込み、プラスミドｐＧＡＰ１および２を構築した（図２９）。
【０２５１】
制限酵素ＨｉｎｄIII 、ＣｌａＩ、ＳｍａＩ、あるいはＳｐｅＩを単独もしくは複数使用して、単離した6.5 ｋｂＥｃｏＲＩ断片を消化し、生じた断片に対してサッカロマイセス・セレビシエのＧＡＰ遺伝子をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、３．８ｋｂ ＨｉｎｄIII −ＳｐｅＩ断片に強くハイブリダイズした。そこで、３．８ｋｂ ＨｉｎｄIII −ＳｐｅＩ断片をプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ＋及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＫＳ＋のＨｉｎｄIII サイトとＳｐｅＩサイトとの間にそれぞれ組み込み、プラスミドｐＧAPＨ１、ｐＧAPＨ２を作製した。これらプラスミドについて、ＨｉｎｄIII 、ＣｌａＩ、ＳｍａＩ等の制限酵素サイトでの欠失変異体の作製や、エキソヌクレアーゼIII 及びマングビーンヌクレアーゼを用いた連続した欠失変異体を作製することにより、種々の欠失変異をもつプラスミドを作製し、３７４９ｂｐからなるＨｉｎｄIII −ＳｐｅＩ 断片の配列を決定した（図２９）。
【０２５２】
予想される構造遺伝子領域の解析を行ったところ、１００５ｂｐからなるオープンリーディングフレームが存在し、そこから推定される遺伝子産物のアミノ酸配列についてサッカロマイセス・セレビシエのＧＡＰ遺伝子産物に対するホモロジーを調べた。両配列は互いに７９．６％ホモロジーを示したことから、単離した遺伝子がキャンディダ・ユティリスのＧＡＰ遺伝子であると断定した。また制御領域については、開始コドンの上流９７５ｂｐ、終止コドンの下流１７６９ｂｐが含まれていた。このうち、転写のプロモーターを含むと推測されるＨｉｎｄIII サイトから開始コドンＡＴＧの直前までの９７５ｂｐの配列は図３０に、転写のターミネーターを含むと推測される終止コドンＴＡＡの直後からＡｆｌIII サイトまでの８０２ｂｐの配列は図３１に示される通りであった。
【０２５３】
実施例２３：ＧＡＰ遺伝子のプロモーターとターミネーターとを使った発現ベクターの構築
キャンディダ・ユティリスのＧＡＰ遺伝子制御領域からプロモーターとターミネーターを含むＤＮＡ断片をそれぞれPCR 法を用いて取得した（図２９）。
【０２５４】
プロモーターとしては、プラスミドｐＧＡＰ１を鋳型として、開始コドンの上流９７５ｂｐに位置するＨｉｎｄIII サイトから開始コドンＡＴＧ直前までの断片を取得した。プライマーとして、
5'-CCAAGCTTACAGCGAGCACTCAAATCTGCCC-3' （配列番号：２３）
5'-CCTCTAGATATGTTGTTTGTAAGTGTGTTTTGTATC-3' （配列番号：２４）
の２つを用い、３’下流側開始コドン直前にＸｂａＩ部位をもつ様にデザインして合成した。
【０２５５】
次に、ターミネーターとして、プラスミドｐＧＡＰ１を鋳型として、終止コドン直後からＳｐｅＩサイトまでの断片を取得した。プライマーとしては、
5'-GGGATCCATTGTATGACTTTTATTTATGGG-3' （配列番号：２５）
5'-GGACTAGTGAGATGACTCTAGGCATCTTCT-3' （配列番号：２６）
を用い、５’側終止コドン直後にはＢａｍＨＩサイトをもつ様にデザインし合成した。
【０２５６】
ＰＣＲプロセスは、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を使って３０サイクルで行った。ＰＣＲ合成したプロモーター断片をＨｉｎｄIII とＸｂａＩとで消化し、ｐＵＣ１９ベクターのＨｉｎｄIII サイトとＸｂａＩサイトとの間に組み込み、プラスミドｐＵＧｐｒｏを構築した（図３２）。一方、ターミネーター断片は、終止コドンの約０．８ｋｂ下流のＡｆｌIII サイトで消化し、クレノウ酵素でＤＮＡ末端の平滑化を行った後、ＢａｍＨＩで消化した。得られた０．８ｋｂのＤＮＡ断片をｐＵＣ１９ベクターのＢａｍＨＩサイトとＳｍａＩサイトの間に組み込み、プラスミドｐＵＧｔｅｒを構築した（図３２）。
【０２５７】
プラスミドｐＵＧｔｅｒのＧＡＰターミネーターの下流末端のＥｃｏＲＩサイトをクレノウ酵素処理により平滑化した後、ＮｏｔＩリンカー(5'AGCGGCCGCT3´:配列番号：１８）を連結して、プラスミドｐＵＧｔｅｒＮを構築した。次に、プラスミドｐＵＧｐｒｏから０．９５ｋｂのG ＡＰプロモーター断片をＨｉｎｄIII とＸｂａＩとで切り出し、プラスミドｐＵＧｔｅｒＮのＨｉｎｄIII サイトとＸｂａＩサイトとの間に挿入して、発現プラスミドｐＧＡＰＰＴ１を構築した。さらに、プロモーターの上流末端のＨｉｎｄIII サイトをクレノウ酵素処理により平滑化し、ＮｏｔＩリンカー(5'AGCGGCCGCT3´:配列番号：１８）を連結して、プラスミドｐＧＡＰＰＴ２を構築した（図３２）。
【０２５８】
さらに構築した発現プラスミドｐＧＡＰＰＴ２が実際にキャンディダ・ユティリス内で機能するか否かを確認するために、プラスミドｐＧＡＰＰＴ２のＸｂａＩサイトとＢａｍＨＩサイトの間に実施例１９記載のプラスミドｐＡＰＨ２からＸｂａＩとＢｇｌIIによって切り出される１．１ｋｂのＡＰＴ遺伝子断片を組み込み、プラスミドｐＧＡＰＡＰＨ１を構築した（図３２）。
【０２５９】
構築したプラスミドｐＧＡＰＡＰＨ１をＮｏｔＩで消化した後、ＡＴＣＣ９９５０株の形質転換に使用した。形質転換は電気パルス法で、パルス条件を電気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電圧を５ＫＶ／ｃｍとして行った。
【０２６０】
形質転換体の選択は２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤプレートで行い、０．１μｇのＤＮＡを使用して約４０個程度の形質転換体が得られた。これにより、ＧＡＰ遺伝子のプロモーター、ターミネーターが機能することが確認された。
【０２６１】
実施例２４：原形質膜プロトンＡＴＰａｓｅ（ＰＭＡ）遺伝子のクローニングとＰＭＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列決定
キャンディダ・ユティリスの原形質膜プロトンＡＴＰａｓｅ（ＰＭＡ）遺伝子のクローニングは、ＰＧＫ遺伝子やＰＭＡ遺伝子の場合と同様に、実施例２で構築したキャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡライブラリーを用い、他生物の既知のＰＭＡ遺伝子の一部分をプローブとしたハイブリダイゼーション法を用いて行った。Molecular Cloning 2nd edition p2.95-121,ColdSpring Harbor Laboratory (1989) に記載された方法に従い、上記した遺伝子ライブラリーの約２０．０００プラークのファージＤＮＡを吸着させたフィルターを作製した。次に、サッカロマイセス・セレビシエのＰＭＡ１遺伝子の塩基配列（Serrano et al. Nature 319, 689-693 (1986) ）をもとに合成した２つのプライマー：
5'-ATGACTGATACATCATCCTCTTCATC-3' （配列番号：２７）
5'-TAACGACAGCTGGCAAACCGACTGGGAC-3' （配列番号：２８）
を用い、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株（ＡＴＣＣ ３８６２６）の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法でＰＭＡ１構造遺伝子の５’末端＋１から＋１０２７（開始コドンＡＴＧのＡを＋１とする）に対応する約１ｋｂの領域を増幅した。染色体ＤＮＡはMethods in Yeast Genetics - A laboratory Course Manual - Rose M.D et al. P126-127 Cold Spring Harbor Laboratory Press NY (1990) 記載の方法に従って調製した。取得した断片は32Ｐ標識して、プローブとしてハイブリダイゼーションを行った。その結果、得られた４つの陽性プラークのうち１つのファージＤＮＡについてインサートＤＮＡをＸｂａＩ消化して、１０ｋｂ、４ｋｂ、２．８ｋｂ、２．６ｋｂの４つのＸｂａＩ断片を単離した。
【０２６２】
単離した４つの断片に対し、スクーリーニングに用いたサッカロマイセス・セレビシエのＰＭＡ１遺伝子の約１ｋｂ断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、２．６ｋｂのＸｂａＩ断片にハイブリダイズした。そこで、この断片をプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ＋のＸｂａＩサイトに組み込み、インサートの方向性が互いに逆のプラスミドｐＰＭＡＦ１、ｐＰＭＡＦ２を作製した（図３３）。
【０２６３】
これらプラスミドについて、ＢａｍＨＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ等の制限酵素サイトでの欠失変異体の作製や、エキソヌクレアーゼIII 及びマングビーンヌクレアーゼを用いた欠失変異体を作製することにより、種々の欠失変異をもつプラスミドを作製し、両末端から約１ｋｂずつの塩基配列を決定した（図３３）。予想される構造遺伝子領域の解析を行ったところ、図３３中左側のＸｂａＩサイトからＥｃｏＲＶサイトを含む約１ｋｂ内に、サッカロマイセス・セレビシエのＰＭＡ１構造遺伝子の５’末端領域と約５０％のホモロジーを示す３５２ｂｐのオープンリーディングフレームが存在した。もう一方側のＸｂａＩサイトからＢａｍＨＩサイトを含む約０．８ｋｂ内には、サッカロマイセス・セレビシエのＰＭＡ１遺伝子の＋１２９２番目から＋２０４６番目までの範囲 （開始コドンＡＴＧのＡを＋１とする）と約７０％のホモロジーを示す７５４ｂｐのオープンリーディングフレームが存在することが分かった。この結果から、単離した遺伝子がキャンディダ・ユティリスのＰＭＡ遺伝子であると判断した。また、この２．６ｋｂのＸｂａＩ断片には、開始コドンＡＴＧの上流５９９ｂｐが含まれていた。転写のプロモーターを含むと推測されるこの５９９ｂｐの配列は図３４に示される通りであった。
【０２６４】
転写のターミネーターについては、同じファージＤＮＡからＸｂａＩで切り出される他の３つの断片（１０ｋｂ、４ｋｂ、および２．８ｋｂ）をサブクローニングし、それぞれ両末端側から塩基配列決定を行い、サッカロマイセス・セレビシエのＰＭＡ１遺伝子の３’側領域とのホモロジーを調べた。その結果、２．８ｋｂのＸｂａＩ断片の片側に上記のＰＭＡ１遺伝子の３’末端側と高いホモロジーを示す領域が存在することが示された。このＸｂａＩ断片をプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ＋のＸｂａＩサイトに組み込み、インサートの方向性が互いに逆のプラスミドｐＰＭＡＬ１およびｐＰＭＡＬ２を作製した（図３３）。これらプラスミドについて、ＫｐｎＩ消化による欠失変異体の作製や、エキソヌクレアーゼIII 及びマングビーンヌクレアーゼを用いた欠失変異体を作製することにより、種々の欠失変異をもつプラスミドを作製し、ＸｂａＩサイトからＫｐｎＩサイトまでの１．９ｋｂの塩基配列を決定した（図３３）。この塩基配列には、サッカロマイセス・セレビシエのＰＭＡ１遺伝子の＋２０４１番目から＋２７５７番目までの範囲（開始コドンＡＴＧのＡを＋１とする）と約８２％のホモロジーを示す７１７ｂｐのオープンリーディングフレームと、終止コドンＴＡＡの３’下流１１８８ｂｐが含まれていた。転写のターミネーターを含むと推測される終止コドンＴＡＡ直後からＫｐｎＩサイトまでの１１８８ｂｐの配列は図３５に示される通りであった。
【０２６５】
実施例２５：ＰＭＡ遺伝子のプロモーターとターミネーターとを使った発現ベクターの構築
先ず、キャンディダ・ユティリスのＰＭＡ遺伝子制御領域からプロモーターまたはターミネーターを含むＤＮＡ断片をそれぞれＰＣＲ法を用いて取得した（図３３）。
【０２６６】
プロモーターとして、プラスミドｐＰＭＡＦ１を鋳型として、ＸｂａＩサイト下流２０ｂｐの位置から開始コドンＡＴＧ直前までの断片を取得した。プライマーとして、
5'-GGCGGCCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGAACGA-3' （配列番号：２９）
5'-TTCTAGACTATATCAATGGTTAGTATCACGTG-3' （配列番号：３０）
の２つを用い、５’上流側末端にはＮｏｔＩサイト、３’下流側開始コドン直前にＸｂａＩサイトをもつ様にデザインして合成した。
【０２６７】
ターミネーターとして、プラスミドｐＰＭＡＬ１を鋳型として、終止コドンＴＡＡ直後から終止コドン４０３ｂｐ下流までの断片を取得した。プライマーとして、
5'-CCGGTACCTAAGCCGCTAATACCCC-3' （配列番号：３１）
5'-GGGCGGCCGCACTCGCTGATCGAAA-3' （配列番号：３２）
を用い、５’上流側終止コドン直後にはＫｐｎＩサイト、３’下流側末端にはＮｏｔＩサイトをもつ様にデザインし合成した。
【０２６８】
ＰＣＲプロセスは、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を使って３０サイクルで行った。ＰＣＲ合成したプロモーター断片をＮｏｔＩとＸｂａＩとで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ＋ベクターのＮｏｔＩサイトとＸｂａＩサイトの間に組み込み、プラスミドｐＢＭｐｒｏを構築した。一方、ターミネーター断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ＋のＫｐｎＩサイトとＮｏｔＩサイトとの間に組み込み、プラスミドｐＢＭｔｅｒを構築した。プラスミドｐＢＭｔｅｒから得られる０．４ｋｂのＫｐｎＩ−ＮｏｔＩ断片を、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩサイトをクレノウ酵素処理により平滑化し、ＮｏｔＩリンカー(5'AGCGGCCGCT3´:配列番号：１８）を連結して構築したプラスミドｐＵＣ１９ＮのＫｐｎＩサイトとＮｏｔＩサイトとの間に組み込み、プラスミドｐＵＭｔｅｒを構築した（図３６）。
【０２６９】
次に、プラスミドｐＵＭｔｅｒからＸｂａＩとＮｏｔＩとの消化で得られる０．４ｋｂのターミネーター断片と、プラスミドｐＢＭｐｒｏからＮｏｔＩとＸｂａＩの消化で得られる０．６５ｋｂのプロモーター断片とを、実施例４で構築したプラスミドｐＰＧＫＰＴ５をＮｏｔＩ消化して得られる２．９ｋｂの断片に組み込み、プラスミドｐＭＡＰＨ１を構築した（図３６）。
【０２７０】
さらに構築した発現プラスミドｐＭＡＰＨ１が実際にキャンディダ・ユティリス内で機能するか否かを確認するために、プラスミｐＭＡＰＨ１のＸｂａＩサイトとＢａｍＨＩサイトとの間に実施例１９記載のプラスミドｐＡＰＨ２からＸｂａＩとＢｇｌIIによって切り出される１．１ｋｂのＡＰＴ遺伝子断片を組み込み、プラスミドｐＭＡＡＰＨ１を構築した（図３６）。
【０２７１】
構築したプラスミドｐＭＡＡＰＨ１をＮｏｔＩ消化した後、ＡＴＣＣ９９５０株の形質転換に使用した。形質転換は電気パルス法で、パルス条件を電気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電圧を５ＫＶ／ｃｍとして行った。
【０２７２】
形質転換体の選択は２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤプレートで行い、０．１μｇのＤＮＡを用いて約４０個程度の形質転換体が得られた。これにより、ＰＭＡ遺伝子のプロモーターおよびターミネーターが機能するものであることが確認された。
【０２７３】
実施例２６：自律複製機能を有する配列（ＡＲＳ）を含むＤＮＡ断片のクローン化
実施例１９で構築したプラスミドｐＧＫＡＰＨ１から、ＰＧＫ遺伝子プロモーターと、ＡＰＴ遺伝子と、そしてＰＧＫ遺伝子ターミネーターとを含む３．３ｋｂのＮｏｔＩ断片を切り出し、これをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ−(Stratagene)のＮｏｔＩサイトに挿入して、プラスミドｐＧＫＡＰＨ２を構築した（図３７）。ＢａｍＨＩ消化して脱リン酸化したプラスミドｐＧＫＡＰＨ２、２００ｎｇと、実施例２で得られたキャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０の３−７ｋｂのゲノムＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ部分消化断片２００ｎｇとを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。このＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５を形質転換して、得られた約３００００個の形質転換体よりプラスミドＤＮＡ混合物を抽出して染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。このライブラリーから調製したＤＮＡを用い、実施例１１記載の電気パルス法により、ＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を試みた。パルス条件は電気容量を２５μＦとし、抵抗値は８００オームまたは１０００オーム、電圧は３．７５ＫＶ／ｃｍまたは５ＫＶ／ｃｍとして計４通りとし、それぞれＤＮＡを３μｇ使用して行った。これによりＧ４１８耐性を示すコロニーが計７株得られた。これら耐性株を４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ培地で培養し、菌体より全ＤＮＡを調製し、大腸菌ＤＨ５を形質転換した。酵母染色体ＤＮＡの調製は、Methods in Yeast Genetics - A laboratory Course Manual - Rose M.D et al. P131-132 Cold Spring Harbor Laboratory Press NYに記載の方法に従った。大腸菌から回収された７種類のプラスミドＤＮＡ（ｐＣＡＲＳ１、ｐＣＡＲＳ４、ｐＣＡＲＳ５、ｐＣＡＲＳ６、ｐＣＡＲＳ７、ｐＣＡＲＳ８、およびｐＣＡＲＳ１０）はいずれも５−７ｋｂのインサートを含むことが各種制限酵素消化により明らかにされ、また、これらプラスミドＤＮＡを用いてＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を電気パルス法により試みたところ、いずれのプラスミドＤＮＡについてもＧ４１８耐性の形質転換体が得られた。このことから、これらプラスミド中に自律複製機能を有するＤＮＡ配列がクローン化されていることが確認された。各種制限酵素消化による解析により、これらのプラスミドのうちｐＣＡＲＳ７とｐＣＡＲＳ８とが同一のインサートを含むプラスミドであることが明らかにされた。これらの結果より、キャンディダ・ユティリス酵母内で自律複製機能を有するＤＮＡ断片が６種類クローニングされたことが明らかにされた。
【０２７４】
また、実施例９記載のプラスミドｐＣＬＢＳ１０（図１５）をベクターとしてキャンディダ・ユティリス酵母染色体ＤＮＡライブラリーを作製し、プラスミドｐＧＫＡＰＨ２ライオブラリーと同時に形質転換を行った。しかしながら、シクロヘキシミド耐性の形質転換体は全く得られなかった。この結果から、キャンディダ・ユティリスのＡＲＳの特徴として、それを含むプラスミドの細胞あたりのコピー数が低く、形質転換体を選択するために数コピー必要なシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子と組み合わせた場合形質転換体を選択できないことが示唆された。
【０２７５】
実施例２７：自律複製機能を有する配列（ＡＲＳ）を含むＤＮＡ断片の短縮化
実施例２６でクローニングされた自律複製機能を有するＤＮＡ断片を含むプラスミド７種類のうち、高頻度でキャンディダ・ユティリス酵母を形質転換することができたプラスミド３種類（ｐＣＡＲＳ５、ｐＣＡＲＳ６、およびｐＣＡＲＳ７）について、さらに詳しい解析を行った。
【０２７６】
まず、これら３種のプラスミドによる酵母形質転換頻度を実施例１９で作成した染色体組み込み型プラスミドｐＣＬＲＡＰＨ１をＢｇｌII消化したＤＮＡをコントロールとして調べた。パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電圧を５ＫＶ／ｃｍとし、ＤＮＡを０．１μｇ用いてＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を行った。電気パルス後の培養は４時間行った。その結果は表７に示される通りであった。
【０２７７】
表７ 各種ＡＲＳプラスミドの形質転換頻度
プラスミド コロニー数
ｐＣＡＲＳ５ １６４５０
ｐＣＡＲＳ６ ９５００
ｐＣＡＲＳ７ ４７００
ｐＣＬＲＡＰＨ１ ４００
注１）１μｇプラスミドＤＮＡあたりの形質転換体数
注２）ｐＣＬＲＡＰＨ１はＢｇIII で分解して用いた
この結果より、ＡＲＳを含んだプラスミドを用いることにより、ｒＤＮＡをターゲットとしたＤＮＡの組込みよりさらに１０倍から４０倍程度高い形質転換頻度が得られることが示された。
【０２７８】
また、これらプラスミドｐＣＡＲＳ５、ｐＣＡＲＳ６、およびｐＣＡＲＳ７をＮｏｔＩ消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより再び環状化することにより、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、ＡＰＴ遺伝子、およびＰＧＫ遺伝子ターミネーターを含む３．３ｋｂのＮｏｔＩ断片を除去したプラスミドｐＣＡＲＳ５０、ｐＣＡＲＳ６０、およびｐＣＡＲＳ７０を構築した。新たに得られた３種類のプラスミドについて種々の制限酵素消化によりインサートの長さを調べたところ、インサートの長さがいずれも約５−６ｋｂであったため、自律複製機能を有する領域をさらに限定することとした。そのためにｐＣＡＲＳ５０、ｐＣＡＲＳ６０、およびｐＣＡＲＳ７０それぞれをＳａｕ３ＡＩで部分消化し、１−３．５ｋｂのサイズの断片を回収して、ＢａｍＨＩ消化後、脱リン酸化したプラスミドｐＧＫＡＰＨ２とＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。これらの３種類のＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５を形質転換して、それぞれ得られた２，５００−６，０００個の形質転換体よりプラスミドＤＮＡ混合物を抽出して、ＤＮＡライブラリーを作製した。これらＤＮＡ５μｇずつを用いて実施例１１記載の電気パルス法により再びＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を行い、Ｇ４１８耐性形質転換体を得た。
【０２７９】
得られたＧ４１８耐性のコロニーはさまざまな大きさからなっていたが、３種類のライブラリーについて比較的大きなコロニーを形成した株それぞれ５株を２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ培地で培養した。得られた菌体より全ＤＮＡを調製し、大腸菌ＤＨ５を形質転換した。一部のＧ４１８耐性株については大腸菌形質転換体が得られなかった。また、これら回収されたプラスミドを用いて実施例１１記載の電気パルス法により再びＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を行ったところ、それらのうち一部は、元のプラスミドドｐＣＡＲＳ５、ｐＣＡＲＳ６、およびｐＣＡＲＳ７と比較して形質転換頻度が大幅に低かったため除外した。最終的にｐＣＡＲＳ５０、ｐＣＡＲＳ６０、ｐＣＡＲＳ７０いずれについても短縮化されたＤＮＡ断片を含み、かつ形質転換頻度が親プラスミドと同程度であるプラスミドが１種類ずつ得られた。そしてｐＣＡＲＳ５０由来のプラスミドをｐＣＡＲＳ５−２と、ｐＣＡＲＳ６０由来のプラスミドをｐＣＡＲＳ６−２と、そしてｐＣＡＲＳ７０由来のプラスミドをｐＣＡＲ７−２と、それぞれ命名した。得られた６種類のプラスミド中の、自律複製機能を有する配列を含む染色体ＤＮＡ断片の制限酵素地図は図３８に示される通りであった。
【０２８０】
これらのプラスミドのうち染色体ＤＮＡ断片の短縮化された３種類のプラスミドｐＣＡＲＳ５−２、ｐＣＡＲＳ６−２、およびｐＣＡＲ７−２について、さらに挿入ＤＮＡ断片を短縮化したプラスミドを構築し、形質転換頻度を調べた（実施例２８）。しかし、この過程で構築した一部のプラスミドについて部分塩基配列を決定したところ、図３８においてｐＣＡＲＳ５のＢｇｌIIサイトより左側の領域約７００ｂｐが、ｐＣＡＲＳ６−２のＥｃｏＲＩサイトより左側の領域約７００ｂｐと９０％以上の相同性を示した。この結果から、ｐＣＡＲＳ５とｐＣＡＲＳ６の挿入ＤＮＡ断片は互いに制限酵素地図は一致しないものの、それぞれ相同染色体または反復配列から由来することが推察されたため、以後の解析はｐＣＡＲＳ６とｐＣＡＲＳ７挿入ＤＮＡ断片とについて行うこととした。また、ｐＣＡＲＳ６に含まれるＡＲＳ活性を持つ配列をＣＵＡＲＳ１と、ｐＣＡＲＳ７に含まれるＡＲＳ活性を持つ配列をＣＵＡＲＳ２と、それぞれ命名した。
【０２８１】
実施例２８：ｐＣＡＲＳ６、ｐＣＡＲＳ７挿入ＤＮＡ断片の短縮化と形質転換頻度とプラスミド安定性
（１）ｐＣＡＲＳ６挿入ＤＮＡ断片の短縮化と形質転換頻度
プラスミドｐＣＡＲＳ６−２にクローン化されたＳａｕ３ＡＩ部分消化ＤＮＡ断片は約１．９ｋｂであった。よって、自律複製能を有する領域をさらに限定するために、ｐＣＡＲＳ６−２のインサート断片の一部を含む３種類のプラスミドを構築した。これらのプラスミドは以下のように構築した。
【０２８２】
ｐＣＡＲＳ６−２からＡＰＴ遺伝子発現カセットを含む３．３ｋｂのＮｏｔＩ断片を除去して、ｐＣＡＲＳ６−２０を構築した。ｐＣＡＲＳ６−２０をＡｆｌIIとＸｂａＩとで消化した後、クレノウ酵素で末端を平滑化してＴ４ＤＮＡリガーゼにより再環状化してプラスミドｐＣＡＲＳ６−２１０を構築した。このプラスミドに、実施例１９で構築したプラスミドｐＧＫＡＰＨ１のプロモーター断片内のＥｃｏＲＩサイトをクレノウ酵素処理により平滑化し、その後ＮｏｔＩリンカー（5'AGCGGCCGCT3'：配列番号：１８）を連結して構築したプラスミドｐＧＫＡＰＨ３から切り出される短縮化されたＰＧＫ遺伝子プロモーターによるＡＰＴ遺伝子発現カセットを含む２．３ｋｂのＮｏｔＩ断片を連結することによって、ｐＣＡＲＳ６−２１を構築した。また、ｐＣＡＲＳ６−２０とｐＣＡＲＳ６−２１をそれぞれＨｉｎｄIII 消化してＴ４ＤＮＡリガーゼにより再環状化した後、同様にＰＧＫ遺伝子プロモーターによるＡＰＴ遺伝子発現カセットを含む２．３ｋｂのＮｏｔＩ断片を連結することによって、ｐＣＡＲＳ６−２２およびｐＣＡＲＳ６−２３を構築した。これら５種類のプラスミドに含まれる挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図は図３９に示される通りであった。
【０２８３】
次に構築した各プラスミドを用いて、実施例１１記載の電気パルス法により、ＡＴＣＣ９９５０株の形質転換実験を行なった。パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電圧を５ＫＶ／ｃｍとし、ＤＮＡは１μｇ用いて行った。電気パルス後の培養は４時間行った。その結果は表８に示される通りであった。
【０２８４】
その後、ＹＰＤプレートと、Ｇ４１８を含むＹＰＤプレートとに菌をそれぞれ塗布して、２日後生じたコロニー数を比較することにより、プラスミドの保持率を求めた。結果は表８に示される通りであった。この間、菌は２．５−３．５回分裂したことが培養液の吸光度を調べることにより示された。この結果から、ｐＣＡＲＳ６−２の挿入ＤＮＡ断片を左右両側よりそれぞれ短縮化したプラスミドｐＣＡＲＳ６−２１およびｐＣＡＲＳ６−２２のうち、ｐＣＡＲＳ６−２１の安定性はｐＣＡＲＳ６−２と同程度であったが、どちらも形質転換頻度が大きく低下することが示された。また、挿入ＤＮＡ断片を０．６ｋｂｐまで短くしたＣＡＲＳ６−２３では形質転換頻度はさらに低下し、ｐＣＡＲＳ６の５０分の１以下に低下することが示された。これらの結果から、ｐＣＡＲＳ６に含まれるＣＵＡＲＳ１は、ｐＣＡＲＳ６−２の約１．９ｋｂ長さのＤＮＡ断片より短縮化することが困難であることが示唆された。
【０２８５】
（２）ｐＣＡＲＳ７挿入ＤＮＡ断片の短縮化と形質転換頻度
プラスミドｐＣＡＲＳ７−２にクローン化されたＳａｕ３ＡＩ部分消化ＤＮＡ断片は約３．５ｋｂであった。よって、自律複製能を有する領域をさらに限定するために、ｐＣＡＲＳ７−２のインサート断片の一部を含む５種類のプラスミドを構築した。これらのプラスミドは以下のように構築した。
【０２８６】
ｐＣＡＲＳ７−２から、ＡＰＴ遺伝子発現カセットを含む３．３ｋｂのＮｏｔＩ断片を除去したプラスミドｐＣＡＲＳ７−２０を構築した。このｐＣＡＲＳ７−２０をＸｂａＩ消化後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより再環状化し、その後２．３ｋｂのＡＰＴ遺伝子発現カセットを含むＮｏｔＩ断片を連結することによりｐＣＡＲＳ７−４を構築した。
【０２８７】
また、ｐＣＡＲＳ７−２０より、約１．８ｋｂのＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄIII 断片、約１．３ｋｂのＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII 断片、および約１．８ｋｂのＨｉｎｄIII −ＢｇｌII断片を切り出し、それぞれ、ＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄIII 、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄIII 、ならびにＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ−(Stratagene)に連結した。その後、短縮化されたＰＧＫ遺伝子プロモーターによるＡＰＴ遺伝子発現カセットを含む２．３ｋｂのＮｏｔＩ断片を連結することによりｐＣＡＲＳ７−６、ｐＣＡＲＳ７−７、およびｐＣＡＲＳ７−８を構築した。これら６種類のプラスミドに含まれる挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図は図４０に示される通りであった。
【０２８８】
構築した各プラスミドを用いて、実施例１１記載の電気パルス法により、ＡＴＣＣ９９５０株の形質転換実験を行なった。パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電圧を５ＫＶ／ｃｍとし、ＤＮＡを１μｇ用いて行った。電気パルス後の培養は４時間行った。その結果を表９に示した。
【０２８９】
【０２９０】
これら２つのＡＲＳの短縮化に関する結果は、キャンディダ・ユティリス酵母のＡＲＳが自律複製能を示すには約２ｋｂ程度のかなり長い領域が必要であることを意味している。これはサッカロマイセス酵母のＡＲＳが約２００ｂｐで機能する事実（Newlon, C.R and Theis,J. Current Opinion in Genetics and Development1993 3, 752-758 ）と異なっており、興味深い特徴であるといえる。
【０２９１】
実施例２９：ｐＣＡＲＳ６−２およびｐＣＡＲＳ７−６の自律複製機能を有する配列を含むＤＮＡ断片の塩基配列決定とサザン解析
（１）自律複製機能を有する配列を含むＤＮＡ断片の塩基配列決定
ｐＣＡＲＳ６およびｐＣＡＲＳ７中の、ＡＲＳ、ＣＵＡＲＳ１、およびＣＵＡＲＳ２を含むＤＮＡ断片について、それぞれの塩基配列を決定した。ＣＵＡＲＳ１を含むＤＮＡとしてはｐＣＡＲＳ６−２の挿入ＤＮＡ断片について、ＣＵＡＲＳ２を含むＤＮＡとしてはｐＣＡＲＳ７−６の挿入ＤＮＡ断片について、それぞれ挿入ＤＮＡ断片の両側からＥｘｏIII ヌクレアーゼおよびマングビーンヌクレアーゼを用いた欠失変異作製法により、種々の欠失変異をもつプラスミドを作製して塩基配列を決定した。決定したｐＣＡＲＳ６−２の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列は図４１と４２とに、ｐＣＡＲＳ７−２の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列は図４３と４４とに示される通りであった。このうちｐＣＡＲＳ６−２の挿入ＤＮＡ断片は１９２１ｂｐからなりＡ+ Ｔの全塩基に対する割合は６９．５％であり、ｐＣＡＲＳ７−２の挿入ＤＮＡ断片は１７８８ｂｐからなりＡ+ Ｔの全塩基に対する割合は７０．８％であり、いずれのＤＮＡも非常にＡ+ Ｔの割合が高いことが示された。
【０２９２】
コンピューターによる解析により、ＡＲＳに認められる１１ｂｐの共通配列（Ｔ／Ａ）ＴＴＴＡ（Ｃ／Ｔ） （Ａ／Ｇ）ＴＴＴ（Ｔ／Ａ）（Newlon, C.R and Theis,J. Current Opinion in Genetics and Development1993 3, 752-758 ）と比べると、一塩基ずつ異なる配列が、ｐＣＡＲＳ６−２では９個分散して存在していること、また、ｐＣＡＲＳ７−６では１３個存在し、そのうち５個が互いに重なり合いながら存在していることが示された（図４１〜図４４）。
【０２９３】
（２）サザン解析によるコピー数算定
キャンディダ・ユティリス酵母細胞内において、ＡＲＳを含むプラスミドが何コピー存在するかを調べるために、ｐＣＡＲＳ６およびｐＣＡＲＳ７で形質転換したキャンディダ・ユティリス酵母から調製したＤＮＡについてサザン解析を行った（図４５−１）。また、コピー数算定のための内部標準としてＰＧＫ遺伝子を用いることとしたので、ＰＧＫ遺伝子コピー数算定のためのサザン解析も行った（図４５−２）。
【０２９４】
ＰＧＫ遺伝子コピー数算定のためのサザン解析は、実施例１８記載のプラスミド、ｐＣＬＬＡＣ１をＰＧＫプロモーター内のＳｐｈＩサイトで消化した後、このプラスミドで形質転換したＡＴＣＣ９９５０株、２株と、対照として親株とからそれぞれ調製したＤＮＡについて行った。ＳａｌＩ+ ＮｏｔＩ消化したＤＮＡについて実施例４記載のｐＧＫＰＴ４から切り出されるＰＧＫプロモーターを含む０．４ｋｂのＥｃｏＲＩ- ＸｂａＩ断片をプローブとした場合、親株のＡＴＣＣ９９５０株では内在性ＰＧＫ遺伝子由来の３．２ｋｂのバンドが認められた（図４５- ２、レーン１）。一方、ＰＧＫプロモーター内のＳｐｈＩサイトで消化したｐＣＬＬＡＣ１を組み込んだ株ではこの３．２ｋｂのバンドのほかに、タンデムに複数個組み込まれたプラスミドからＮｏｔＩ消化により生じる５．４ｋｂのバンドと、染色体上のＰＧＫ遺伝子のうち１個がプラスミドの挿入により分断されて生じる６．４ｋｂおよび２．１ｋｂの２本のバンドが検出された（レーン２、３）。これら６．４ｋｂおよび２．１ｋｂの２本のバンドは、組み込まれたプラスミド分子の両末端に位置するプラスミド分子内のＮｏｔＩサイトとＰＧＫ遺伝子領域内のＳａｌＩサイトとから生ずるものであることから、プラスミド分子が相同組換えによりＰＧＫ遺伝子座に組み込まれたことが示された。
【０２９５】
イメージングアナライザーＢＡＳ２０００（FUJIFILM）を用いて各バンドの強度を測定したところ、形質転換体では内在性ＰＧＫ遺伝子由来の３．２ｋｂのバンドと、染色体に組み込まれたプラスミド分子の両末端のプラスミド由来の６．４ｋｂおよび２．１ｋｂのバンドの濃さがほぼ一致することから、ＰＧＫ遺伝子は細胞あたり２コピー存在し、形質転換体ではそのうち１コピーがプラスミドＤＮＡの挿入により分断されたことが示された。また、プラスミドのタンデム組み込みによる５．４ｋｂのバンドと６．４ｋｂと２．１ｋｂのバンドの濃さの比較から、組み込まれたプラスミドのコピー数は約４コピーであることが示された。
【０２９６】
ｐＣＡＲＳ６およびｐＣＡＲＳ７で形質転換したＡＴＣＣ９９５０株ＤＮＡをＥｃｏＲＶ+ ＮｏｔＩ消化し、実施例４記載のｐＧＫＰＴ４から切り出されるＰＧＫターミネーターを含む０．９ｋｂＸｂａＩ- ＮｏｔＩ断片をプローブとしてサザン解析を行った。その結果は図４５−１に示される通りであった。親株のＡＴＣＣ９９５０株では内在性ＰＧＫ遺伝子由来の約７ｋｂのバンドが認められた（図４５−１、レーン３）形質転換体においては約７ｋｂのバンドの他にプラスミド由来の３．３ｋｂのバンドが認められた。７ｋｂと３．３ｋｂのバンドの濃さの比較から、ＰＧＫ遺伝子由来のバンドを２コピーとすると、ｐＣＡＲＳ６のコピー数は１（レーン１）、ｐＣＡＲＳ７のコピー数は０．４（レーン２）と計算された。ｐＣＡＲＳ７のコピー数が１以下となったのは、菌培養時のプラスミド分子の脱落によるものと考えられる。この結果から、ＣＵＡＲＳを含むプラスミドは細胞あたり、１コピー程度存在すると考えられた。
【０２９７】
（３） 染色体上でのＡＲＳの存在様式
ＨｉｎｄIII 消化したＡＴＣＣ９９５０株、９２２６株、９２５６株、ＫＰ−２０５９Ｐ株、およびサッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株の各種染色体ＤＮＡに対して、サザン解析を行った。プローブとして、ＣＵＡＲＳ１としてｐＣＡＲＳ６- ２２の１．３ｋｂ挿入ＤＮＡ断片をＸｂａＩとＨｉｎｄIII により切り出した断片（図３９）を、ＣＵＡＲＳ２としてｐＣＡＲＳ７−６の１．８ｋｂＥｃｏＲＶ- ＨｉｎｄIII 断片（図４０）を、それぞれ用いてハイブリダイゼーションを行った（図４６）。ＣＵＡＲＳ１については、ｐＣＡＲＳ６の制限酵素地図から予想される２ｋｂの主要なバンド以外にｐＣＡＲＳ５の制限酵素地図から予想されるＨｉｎｄIII 断片の長さに一致する１．６ｋｂのバンドが認められた（図４６−１）。一方、ＣＵＡＲＳ２についてはｐＣＡＲＳ７の制限酵素地図から予想される２．５ｋｂの主要なバンド以外にホモロジーの高いＤＮＡ配列がキャンディダ・ユティリス酵母染色体上に１０コピー程度存在すると共に、サッカロマイセス酵母にも多数存在することが示された（図４６−２）。この結果から、ＣＵＡＲＳ２は広く保存された配列である可能性が示唆された。また、洗浄条件を厳しくすることにより（０．１ｘＳＳＣ ６５℃）主要なバンド以外のシグナルはほとんど認められなくなった（図４６−２）。
【０２９８】
また、これらのＡＲＳが染色体ＤＮＡ由来であるかどうかを調べるために、パルスフィールドゲル電気泳動法で分離したキャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡに対してサザン解析を行った。ＡＴＣＣ９９５０株のＤＮＡは７本に分れたが、ＣＵＡＲＳ１は大きいほうから６番目の染色体に、ＣＵＡＲＳ２は３番目の染色体にそれぞれ位置することが明らかにされ、クローン化したＡＲＳは染色体由来であることが明らかにされた。また、ｐＣＡＲＳ５の挿入ＤＮＡ断片についてはＣＵＡＲＳ１と同様に６番目の染色体に位置することが示された。実施例２７記載のシークエンス解析からも示唆されたように、これらｐＣＡＲＳ５とｐＣＡＲＳ６にクローン化されたＡＲＳは相同染色体由来である可能性を支持する結果となった。
【０２９９】
実施例３０：ＡＲＳを利用したプロモーター活性を有するＤＮＡ断片のクローニング
（１）プロモーター検索ベクターの構築
実施例２８で構築したプラスミドｐＣＡＲＳ６−２０より、自律複製能を有する配列を含むＤＮＡを１．９ｋｂのＳａｃＩ−ＳｍａＩ断片として切り出した。この断片をＥｃｏＲＩサイトをクレノウ酵素処理により平滑化した後、さらにＳａｃＩ消化したプラスミドｐＡＰＨ１（実施例１９）と連結してプラスミドｐＰＣＶ１を構築した。続いてｐＰＣＶ１をＢａｍＨＩ消化してクレノウ酵素処理により平滑化した後、ＨｐａＩリンカー(5'GTTAAC3')を挿入して、プラスミドｐＰＣＶ２を構築した（図４７）。
【０３００】
（２）ライブラリーの構築とプロモーター活性を有するＤＮＡ断片のクローニング
キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ９９５０の染色体ＤＮＡを制限酵素ＲｓａＩ、ＨａｅIII 、および
ＡｌｕＩにより、同時に部分消化した。その後、ＤＮＡ断片を１％のアガロースゲルで電気泳動することにより分画し、０．９−１．８ｋｂの長さの断片を回収した。この部分消化ＤＮＡ断片と、ＨｐａＩ消化して脱リン酸化したプラスミドｐＰＣＶ２とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。このＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５を形質転換して、得られた約１００，０００個の形質転換体よりプラスミドＤＮＡ混合物を抽出して染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。このライブラリーから調製したＤＮＡを用いて実施例１１記載の電気パルス法によりＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を試みた。パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値は１０００オーム、電圧は５ＫＶ／ｃｍとし、ＤＮＡは１回のパルスあたり２０−２５μｇを使用して行った。形質転換体の選択は２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤプレートで行い、形質転換実験を繰り返すことにより、２８０μｇのＤＮＡを使用して合計３８０個の形質転換体を取得した。これらの形質転換体のうち比較的大きなコロニーを形成した８４株について、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤプレートでの増殖を調べた。このうち、増殖の良かった株１２株を１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ培地で培養し、菌体より全ＤＮＡを調製し、大腸菌ＤＨ５を形質転換した。
【０３０１】
大腸菌から回収された１２種類のプラスミドＤＮＡ、すなわちｐＰＣＶ１、３、９、１４、１９、３３、５１、５５、５７、６２、６４、および７８は、いずれも０．９−１．８ｋｂの挿入ＤＮＡ断片を含むことが制限酵素消化により明らかにされた。次に、プロモーター活性を有する配列を含むＤＮＡ断片をＸｂａＩ消化により切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ−(Stratagene)に連結して得られたプラスミドについて、それらの挿入ＤＮＡ断片の両側から一部塩基配列を決定した。その結果、ｐＰＣＶ３３およびｐＰＣＶ７８、ならびにｐＰＣＶ１４、ｐＰＣＶ５１、およびｐＰＣＶ５５が、それぞれ同一のＤＮＡ断片を含むことが明らかとなった。よって、最終的に９種類のプロモーター活性を有するＤＮＡ断片がクローン化されたことが示された。
【０３０２】
また、これら９種類のプラスミドｐＰＣＶ１、３、９、１４、１９、３３、５７、６２、および６４を用いてＡＴＣＣ９９５０株の形質転換を電気パルス法により試みたところ、いずれのプラスミドＤＮＡについても１μｇＤＮＡあたり６，０００から１０，０００個のＧ４１８耐性コロニーが得られた。さらに、これら９種類のプラスミドと、対照として用いたｐＣＡＲＳ６−２とにより得られた１０種類のＧ４１８耐性株２株ずつの計２０クローンについて、５ｍｌのＹＰＤ液体培地で一晩培養した後、ＹＰＤプレート上で単一コロニーにした。これら２０クローンのおのおの１０コロニーずつをＧ４１８を含むＹＰＤプレート上での生育を調べることにより、プラスミドの保持率を調べた。その結果、ｐＣＡＲＳ６−２のプラスミド保持率は５％であったのに対し、その他すべてのプラスミドについて保持率が高まっていた。このうち特にプラスミドｐＰＣＶ１、ｐＰＣＶ１９、およびｐＰＣＶ６４については、プラスミド保持率が８０−８５％と高く、取得されたプロモーター活性を有する配列を含むＤＮＡ断片が、プラスミドの安定性を高める機能を有していることが示唆された。
【０３０３】
（３）プラスミドｐＰＣＶプロモーター活性を有するＤＮＡ断片の塩基配列決定
取得された９種類のプロモーター活性を有するＤＮＡ断片のうち、プラスミドｐＰＣＶ１９の挿入ＤＮＡ断片について、挿入ＤＮＡ断片の両側からＥｘｏIII ヌクレアーゼおよびマングビーンヌクレアーゼを用いた欠失変異作製法により、種々の欠失変異をもつプラスミドを作製して塩基配列を決定した。決定した１０５４ｂｐからなるｐＰＣＶ１９の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列は図４８に示される通りであった。
【０３０４】
実施例３１：ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子発現用プラスミドの構築とそれを利用した酵母の共形質転換体の選択
（１）ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子発現用プラスミドの構築とその機能確認
ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ
（ＨＰＴ）遺伝子は、プラスミドｐＢＩＢ−ＨＹＧ（Becker D. Nucl. Asids Res.18,203 (1990)）を鋳型として、すでに明らかにされているＨＰＴ遺伝子の塩基配列情報（Gritz L. and Davis J. Gene 25, 179-188 （1983) ）に基づき作成した２種類のプライマーを用いてＰＣＲにより取得した。プライマーとして、
5'-GGTCTAGATATGAAAAAGCCTGAAC-3' （配列番号：３３）
5'-GGAGATCTATTCCTTTGCCCTCGGA-3' （配列番号：３４）
を用いて、５’側末端開始コドン直前にＸｂａＩサイト、３’側末端終止コドン直後にＢｇｌIIサイトをもつ様にデザインして合成した。合成したＨＰＴ遺伝子断片はＸｂａＩとＢｇｌIIとで消化後、実施例４記載の発現ベクターｐＰＧＫＰＴ４（図４）のＸｂａＩサイトとＢａｍＨＩサイトと間に挿入して、プラスミドｐＧＫＨＰＴ１を構築した（図４９）。
【０３０５】
さらにｐＧＫＨＰＴ１からＰＧＫ遺伝子プロモーターと、ＨＰＴ遺伝子と、そしてＰＧＫ遺伝子ターミネーターとを含む３．３ｋｂのＮｏｔＩ断片を切り出し、これを実施例３０記載のプラスミドｐＰＣＶ１４のＮｏｔＩサイトに挿入して、プラスミドｐＡＨＧ１を構築した。
【０３０６】
構築したＨＰＴ遺伝子発現カセットが機能するかどうか確認するために、プラスミドｐＡＨＧ１によりＡＴＣＣ９９５０株を実施例１１記載の電気パルス法により形質転換した。Ｇ４１８耐性で選択した形質転換体は、２００、４００、および８００μｇ／ｍｌの濃度のハイグロマイシンＢを含むＹＰＤ液体培地で増殖したが、対照として用いた野生株はいずれの培地でも増殖せず、ハイグロマイシンＢ耐性を示すことが明らかにされた。
【０３０７】
また、プラスミドｐＧＫＨＰＴ１をＮｏｔＩ消化して、ＰＧＫ遺伝子プロモーターと、ＨＰＴ遺伝子と、そしてＰＧＫ遺伝子ターミネーターとを含む断片と、ベクター断片とに分けた後、ＡＴＣＣ９９５０株の形質転換に用いた。形質転換は実施例１１記載の電気パルス法により行い、形質転換体の選択は８００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むＹＰＤプレートで行った。その結果、１μｇＤＮＡあたり１６８個のハイグロマイシンＢ耐性コロニーが得られた。これは対照として用いたＮｏｔＩ消化プラスミドｐＧＫＡＰＨ１による形質転換頻度、１μｇＤＮＡあたり１５６個とほぼ同じであり、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子はＧ４１８耐性遺伝子同様、キャンディダ・ユティリス形質転換体の直接選択に用いることができることが示された。
【０３０８】
（２）酵母の共形質転換の実施
実施例３０で取得したＡＲＳを含むプラスミドｐＰＣＶ６４の０．１μｇと、ＮｏｔＩ消化してＰＧＫ遺伝子プロモーターと、ＨＰＴ遺伝子と、そしてＰＧＫ遺伝子ターミネーターとを含む断片とベクター断片とに分けたプラスミドｐＰＧＫＨＰＴ１の１μｇまたは１０μｇとを混合して、ＡＴＣＣ９９５０株の実施例１１記載の電気パルス法により形質転換に用いた。
【０３０９】
パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗値は６００、８００、または１０００オーム、電圧は３．７５ＫＶ／ｃｍまたは５ＫＶ／ｃｍとして、ＤＮＡ混合物２種類に対してそれぞれ６通りのパルス条件で行った。形質転換体の選択は２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤプレートで行い、０．１μｇのｐＰＣＶ６４ＤＮＡ当たり、それぞれの条件で約２，０００から７，０００個の形質転換体を取得した。それぞれの条件で得られたＧ４１８耐性コロニー５００から２０００個を８００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むＹＰＤプレートにレプリカした。その結果、得られたＧ４１８耐性コロニーのうちハイグロマイシンＢ耐性を示すコロニーの割合はそれぞれのパルス条件で大きな差はなく、約１−２％であることが示された。つぎに、このＧ４１８耐性でかつハイグロマイシンＢ耐性を示した株についてＹＰＤ液体培地で一晩培養することによって、プラスミドとして存在するｐＰＣＶ６４が脱落してＧ４１８感受性となった株の取得を試みた。４０株について調べたところ、このうち１０株についてＧ４１８感受性でかつハイグロマイシンＢ耐性を示す株が得られた。これらの株においてはＰＧＫ遺伝子プロモーターと、ＨＰＴ遺伝子と、そしてＰＧＫ遺伝子ターミネーターとを含む断片が染色体上に保持されていることが期待された。そこでこの１０株より染色体ＤＮＡを調製した後、ＨＰＴ遺伝子発現カセットが染色体上に相同組換えにより組み込まれたかどうかをＰＣＲにより調べた。
【０３１０】
このためのプライマーとして、ＨＰＴ遺伝子発現に用いたＰＧＫ遺伝子プロモーター断片の５’端外側の塩基配列をもとに合成した、
プライマー１；5'CAAGTTGATCCTTCTCCGGA3' （配列番号：３５）及び、ＨＰＴ遺伝子内部の配列をもとに合成した、
プライマー２；5'GAAACTTCTCGACAGACGTC3' （配列番号：３６）及び、ＨＰＴ遺伝子発現に用いたＰＧＫ遺伝子ターミネーター断片内の配列をもとに合成した
プライマー３；5'CATCGGGTAAGGTCTACATG3' （配列番号：３７）の合計３種類のプライマーを使用した。
【０３１１】
ＰＣＲの条件は、９５℃１分、５５℃１分、７２℃５分とし、３０サイクル行った。その結果は図５０に示される通りであった。図５０（１）はプライマー１とプライマー３とを用いたＰＣＲ反応産物の電気泳動図である。この結果より、すべてのサンプルについて内在性のＰＧＫ遺伝子による２．７ｋｂの増幅断片が認められたほか、Ｎｏ．３、５、７、９、および１０の５つのサンプルについては２．６ｋｂの断片が認められた。これは形質転換に用いたＰＧＫ遺伝子プロモーターと、ＨＰＴ遺伝子と、そしてＰＧＫ遺伝子ターミネーターとを含む断片によって、内在性の２個のＰＧＫ遺伝子のうち１個が置き換えられたことにより生じたと考えられた。さらに、同じＤＮＡサンプルについてプライマー１とプライマー２とを用いてＰＣＲを行った結果は図５０（２）に示される通りであった。その結果より、２．６ｋｂの断片が認められた５個のサンプルについて１．４ｋｂの増幅断片が認められ、これら５クローンに関しては相同組換えによって、内在性ＰＧＫ遺伝子がＨＰＴ遺伝子に置き換えられたことが示された。
【０３１２】
本明細書に開示される発明は下記の通りである。
【０３１３】
（１） キャンディダ・ユティリスのリボソーム構成蛋白質Ｌ４１をコードする遺伝子配列を含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３１４】
（２） キャンディダ・ユティリスのリボソーム構成蛋白質Ｌ４１が図１４に記載のアミノ酸配列（配列番号：６）を有するものである、（１）記載のＤＮＡ配列。
【０３１５】
（３） プロモーター配列、およびターミネーター配列をさらに含んでなる、（１）または（２）記載のＤＮＡ配列。
【０３１６】
（４） 図１３に記載の塩基配列（配列番号：５）を有する、（３）記載のＤＮＡ配列。
【０３１７】
（５） 図１４に記載のアミノ酸配列（配列番号：６）の５６番目のプロリンがグルタミンに置換されたアミノ酸配列を有する蛋白質であって、酵母にシクロヘキシミド耐性を付与するシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１蛋白質をコードする遺伝子配列を含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３１８】
（６） （５）記載のＤＮＡ配列を含んでなる、プラスミド。
【０３１９】
（７） 図６（ｂ）の制限酵素地図で表される、キャンディダ・ユティリスのｒＲＮＡ遺伝子群を含んでなる、約１３．５ｋｂのＤＮＡ断片およびその部分ＤＮＡ配列。
【０３２０】
（８） （７）記載の約１３．５ｋｂのＤＮＡ断片を反復して含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３２１】
（９） （７）記載のＤＮＡ配列を含んでなる、プラスミド。
【０３２２】
（１０） サッカロミセス・セレビシエ酵母のｕｒａ３変異を相補する、キャンディダ・ユティリス由来のオルチジン−５´−フォスフェートデカルボキシラーゼ（ＵＲＡ３）蛋白質をコードする遺伝子配列を含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３２３】
（１１） キャンディダ・ユティリス由来のＵＲＡ３蛋白質が図１０および図１１に記載のアミノ酸配列（配列番号：４）である、（１０）記載のＤＮＡ配列。
【０３２４】
（１２） 図９に記載の塩基配列（配列番号：３）、またはサッカロミセス・セレビシエ酵母のｕｒａ３変異を相補する機能を保持するその部分配列を含んでなる、（１１）記載のＤＮＡ配列。
【０３２５】
（１３） （１２）記載のＤＮＡ配列を含んでなる、プラスミド。
【０３２６】
（１４） キャンディダ・ユティリスのホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子プロモーター配列。
【０３２７】
（１５） 図３に記載の塩基配列（配列番号：２）のうち少なくとも９４６番〜１３４６番までの配列を有する配列、またはＰＧＫ遺伝子プロモーター活性を有するその部分配列を含んでなる、（１４）記載のＰＧＫ遺伝子プロモーター配列。
【０３２８】
（１６） キャンディダ・ユティリスのＰＧＫ遺伝子ターミネーター配列。
【０３２９】
（１７） 図２に記載の塩基配列（配列番号：１）、またはＰＧＫ遺伝子ターミネーター活性を有するその部分配列を含んでなる、（１６）記載のＰＧＫ遺伝子ターミネーター配列。
【０３３０】
（１８） （１４）または（１５）記載のＰＧＫ遺伝子プロモーター配列と、（１６）または（１７）記載のＰＧＫ遺伝子ターミネーター配列とを含んでなる、遺伝子発現ユニット。
【０３３１】
（１９） （１８）記載の遺伝子発現ユニットを含んでなる、プラスミド。
【０３３２】
（２０） プラスミドｐＰＧＫＰＴ３、ｐＰＧＫＰＴ４、またはｐＰＧＫＰＴ５である、（１９）記載のプラスミド。
【０３３３】
（２１） （１４）または（１５）記載のＰＧＫ遺伝子プロモーター配列と、その配列の下流に連結されてなる異種遺伝子とを含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３３４】
（２２） （１４）または（１５）記載のＰＧＫ遺伝子プロモーター配列と、その配列の下流に連結されてなる異種遺伝子と、その異種遺伝子の下流に連結されてなる（１６）または（１７）記載のＰＧＫ遺伝子ターミネーター配列とを含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３３５】
（２３） キャンディダ・ユティリスのグリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子プロモーター配列。
【０３３６】
（２４） 図３０に記載の塩基配列（配列番号：７）、またはＧＡＰ遺伝子プロモーター活性を有するその部分配列を含んでなる、（２３）記載のＧＡＰ遺伝子プロモーター配列。
【０３３７】
（２５） キャンディダ・ユティリスのＧＡＰ遺伝子ターミネーター配列。
【０３３８】
（２６） 図３１に記載の塩基配列（配列番号：８）、またはＧＡＰ遺伝子ターミネーター活性を有するその部分配列を含んでなる、（２５）記載のＧＡＰ遺伝子ターミネーター配列。
【０３３９】
（２７） （２３）または（２４）記載のＧＡＰ遺伝子プロモーター配列と、（２５）または（２６）記載のＧＡＰ遺伝子ターミネーター配列とを含んでなる、遺伝子発現ユニット。
【０３４０】
（２８） （２７）記載の遺伝子発現ユニットを含んでなる、プラスミド。
【０３４１】
（２９） プラスミドｐＧＡＰＰＴ１またはｐＧＡＰＰＴ２である、（２６）記載のプラスミド。
【０３４２】
（３０） （２３）または（２４）記載のＧＡＰ遺伝子プロモーター配列と、その配列の下流に連結されてなる異種遺伝子とを含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３４３】
（３１） （２３）または（２４）記載のＧＡＰ遺伝子プロモーター配列と、その配列の下流に連結されてなる異種遺伝子と、その異種遺伝子の下流に連結されてなる（２５）または（２６）記載のＧＡＰ遺伝子ターミネーター配列とを含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３４４】
（３２） キャンディダ・ユティリスの原形質膜プロトンＡＴＰａｓｅ（ＰＭＡ）遺伝子プロモーター配列。
【０３４５】
（３３） 図３４に記載の塩基（配列配列番号：９）、またはＰＭＡ遺伝子プロモーター活性を有するその部分配列を含んでなる、（３２）記載のＰＭＡ遺伝子プロモーター配列。
【０３４６】
（３４） キャンディダ・ユティリスのＰＭＡ遺伝子ターミネーター配列。
【０３４７】
（３５） 図３５に記載の塩基配列（配列番号：１０）、またはＰＭＡ遺伝子ターミネーター活性を有するその部分配列を含んでなる、（３４）記載のＰＭＡ遺伝子ターミネーター配列。
【０３４８】
（３６） （３２）または（３３）記載のＰＭＡ遺伝子プロモーター配列と、（３４）または（３５）記載のＰＭＡ遺伝子ターミネーター配列とを含んでなる、遺伝子発現ユニット。
【０３４９】
（３７） （３６）記載の遺伝子発現ユニットを含んでなる、プラスミド。
【０３５０】
（３８） プラスミドｐＭＡＰＴ１である、（３７）記載のプラスミド。
【０３５１】
（３９） （３２）または（３３）記載のＰＭＡ遺伝子プロモーター配列と、その配列の下流に連結されてなる異種遺伝子とを含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３５２】
（４０） （３２）または（３３）記載のＰＭＡ遺伝子プロモーター配列と、その配列の下流に連結されてなる異種遺伝子と、その異種遺伝子の下流に連結されてなる（３４）または（３５）記載のＰＭＡ遺伝子ターミネーター配列とを含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０３５３】
（４１） （２１）、（２２）、（３０）、（３１）、（３９）、（４０）のいずれか一項記載のＤＮＡ配列で宿主細胞を形質転換し、該形質転換細胞を培養して異種遺伝子を発現させることを含んでなる、異種遺伝子の発現法。
【０３５４】
（４２） 宿主細胞が酵母である、（４１）記載の異種遺伝子の発現法。
【０３５５】
（４３） 宿主細胞がキャンディダ・ユティリスである、（４２）記載の異種遺伝子の発現法。
【０３５６】
（４４） キャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡと相同な配列（「相同ＤＮＡ配列」）と、形質転換体選択のためのマーカー遺伝子と、そして場合によって異種遺伝子とを含んでなるベクターであって、前記相同ＤＮＡ配列内において制限酵素切断され直鎖状とされて、相同組換えによって異種遺伝子をキャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡに組み込むことができる、ベクター。
【０３５７】
（４５） 前記マーカー遺伝子と、場合によって前記異種遺伝子とを含んだＤＮＡ配列が、その両端において前記相同ＤＮＡ配列に挟まれてなり、該相同ＤＮＡ配列において制限酵素切断され直鎖状とされて、相同組換えによって前記ＤＮＡ配列をキャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡに組み込むことができる、（４４）記載のベクター。
【０３５８】
（４６） 前記相同ＤＮＡ配列が、（１）〜（５）いずれか一項記載のｒＲＮＡ遺伝子配列またはその一部のＤＮＡ配列を含んでなるものである、（４４）また（４５）記載のベクター。
【０３５９】
（４７） 前記相同ＤＮＡ配列が、（７）〜（８）いずれか一項記載のＵＲＡ３遺伝子配列またはその一部のＤＮＡ配列を含んでなるもの、である、（４４）または（４５）記載のベクター。
【０３６０】
（４８） 前記相同ＤＮＡ配列が、（１０）〜（１２）いずれか一項記載のＬ４１遺伝子配列またはその一部のＤＮＡ配列を含んでなるものである、（４４）または（４５）記載のベクター。
【０３６１】
（４９） 前記相同ＤＮＡ配列が、ＰＧＫ遺伝子配列を含んでなるものである、（４４）または（４５）記載のベクター。
【０３６２】
（５０） 前記相同ＤＮＡ配列が、ＧＡＰ遺伝子配列を含んでなるものである、（４４）または（４５）記載のベクター。
【０３６３】
（５１） 前記相同ＤＮＡ配列が、ＰＭＡ遺伝子配列を含んでなるものである、（４４）または（４５）記載のベクター。
【０３６４】
（５２） マーカー遺伝子が薬剤耐性マーカー遺伝子である、（４４）〜（５１）いずれか一項に記載のベクター。
【０３６５】
（５３） 薬剤耐性マーカー遺伝子がシクロヘキシミド耐性を付与する遺伝子である、（５２）記載のベクター。
【０３６６】
（５４） シクロヘキシミド耐性を付与する遺伝子がシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子である、（５３）記載のベクター。
【０３６７】
（５５） シクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子として、（５）記載のＤＮＡ配列を含んでなる、（５４）記載のベクター。
【０３６８】
（５６） キャンディダ・ユティリスで機能するプロモーターで発現する薬剤耐性マーカー遺伝子を含んでなる、（５２）記載のベクター。
【０３６９】
（５７） 薬剤耐性マーカー遺伝子が抗生物質Ｇ４１８耐性を付与する遺伝子である、（５６）記載のベクター。
【０３７０】
（５８） 抗生物質Ｇ４１８耐性を付与する遺伝子が、バクテリアトランスポゾンＴｎ９０３由来のアミノグリコシド−３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＴ）遺伝子である、（５７）記載のベクター。
【０３７１】
（５９） 薬剤耐性マーカー遺伝子が抗生物質ハイグロマイシンＢ耐性を付与する遺伝子である、（５６）記載のベクター。
【０３７２】
（６０） 抗生物質ハイグロマイシンＢ耐性を付与する遺伝子が、大腸菌プラスミド由来のハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子である、（５９）記載のベクター。
【０３７３】
（６１） キャンディダ・ユティリスで機能するプロモーター配列と、該プロモーター配列により発現する異種遺伝子を含んでなり、場合によってさらにターミネーター配列を含んでなる、（４４）〜（６０）いずれか一項のベクター。
【０３７４】
（６２） プロモーター配列またはターミネーター配列がキャンディダ・ユティリス由来のものである、（６１）記載のベクター。
【０３７５】
（６３） プロモーター配列が（１４）、（１５）、（２３）、（２４）、（３２）、（３３）いずれか一項に記載のプロモーター配列であり、ターミネーター配列が（１６）、（１７）、（２５）、（２６）、（３４）、（３５）いずれか一項に記載のターミネーター配列である、（６２）記載のベクター。
【０３７６】
（６４） （４４）〜（６３）いずれか一項に記載のベクターでキャンディダ・ユティリスを形質転換し、薬剤耐性となった形質転換体を選択することを含んでなる、キャンディダ・ユティリスの形質転換法。
【０３７７】
（６５） （４４）〜（６３）いずれか一項記載のベクターのＤＮＡ配列がキャンディダ・ユティリスの染色体に保持される、（６４）記載の形質転換法。
【０３７８】
（６６） ベクターＤＮＡ配列がキャンディダ・ユティリスの染色体に多コピーで導入される、（６５）記載の形質転換法。
【０３７９】
（６７） マーカー遺伝子としてのシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子を含んでなるベクターを用いる、（６６）記載の形質転換法。
【０３８０】
（６８） ｒＲＮＡ遺伝子配列を含んでなるベクターを用い、その結果高頻度で形質転換体が得られる、（６７）記載の形質転換法。
【０３８１】
（６９） ベクターのマーカー遺伝子がシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子であるベクターを用いる（６８）記載の形質転換法。
【０３８２】
（７０） ベクターＤＮＡ配列が相同組換えによって染色体に導入される、（６４）〜（６９）いずれか一項記載の形質転換法。
【０３８３】
（７１） ベクターＤＮＡ配列がＵＲＡ３遺伝子座、Ｌ４１遺伝子座、ＰＧＫ遺伝子座、ＧＡＰ遺伝子座、またはＰＭＡ遺伝子座に保持される（７０）記載の形質転換法。
【０３８４】
（７２） キャンディダ・ユティリスがＡＴＣＣ９２５６、ＡＴＣＣ９２２６、およびＡＴＣＣ９９５０からなる群から選択されるものである、（６４）〜（７１）いずれか一項記載の形質転換法。
【０３８５】
（７３） 電気パルス法による、（６４）〜（７２）いずれか一項に記載の形質転換法。
【０３８６】
（７４） 電気パルス条件が、菌生存率が１０〜４０％であり、タイムコンスタントが１０〜２０ミリ秒である、（７３）記載の形質転換法。
【０３８７】
（７５） 自律複製機能を有するＤＮＡ断片であって、キャンディダ・ユティリス内で、当該ＤＮＡ断片を含むベクターを、染色体外要素であるプラスミドとして保持させ、宿主の形質転換頻度を増加させることができる、ＤＮＡ断片。
【０３８８】
（７６） 前記自律複製ＤＮＡ断片が酵母由来である、（７５）記載のＤＮＡ断片。
【０３８９】
（７７） 前記酵母がキャンディダ・ユティリスである、（７６）記載のＤＮＡ断片。
【０３９０】
（７８） 前記自律複製ＤＮＡ断片が図４１および４２に記載の塩基配列（配列番号：１１）、または自律複製機能を有するその部分配列を含んでなる、ＤＮＡ断片。
【０３９１】
（７９） 前記自律複製ＤＮＡ断片が図４３および４４に記載の塩基配列（配列番号：１２）、または自律複製機能を有するその部分配列を含んでなる、ＤＮＡ断片。
【０３９２】
（８０） キャンディダ・ユティリスを形質転換でき、さらに（７５）〜（７９）いずれか一項に記載のＤＮＡ断片を含んでなり、キャンディダ・ユティリス内でプラスミドとして存在し得る、ベクター。
【０３９３】
（８１） 選択マーカー遺伝子として（５６）〜（６０）いずれか一項に記載の薬剤耐性遺伝子を含んでなる、（８０）記載のベクター。
【０３９４】
（８２） キャンディダ・ユティリス酵母の形質転換法であって、（７５）〜（７９）いずれか一項に記載の自律複製能を有するＤＮＡ断片および選択マーカー遺伝子を含んでなるプラスミドと、キャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡと相同なＤＮＡ配列（「相同ＤＮＡ配列」）を両末端に有するＤＮＡ断片とでキャンディダ・ユティリス酵母を同時に形質転換し、該酵母のうち前記プラスミドによって形質転換された形質転換体を選択し、さらに相同なＤＮＡ配列を有する断片が染色体上に組み込まれた形質転換体を選択することからなる、形質転換法。
【０３９５】
（８３） （８２）で得られる形質転換体を、さらに非選択条件下で培養して前記プラスミドを脱落させることにより、外来ＤＮＡ断片を含むが、選択マーカー遺伝子を含まない株を選択する方法。
【０３９６】
（８４） 前記プラスミドが（８１）記載のベクターである、（８２）記載の形質転換法。
【０３９７】
（８５） 相同ＤＮＡ配列を両末端に有するＤＮＡ断片が異種遺伝子を含むものである、（８２）の形質転換法。
【０３９８】
（８６） 異種遺伝子を含むＤＮＡ配列と、キャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡと相同な配列（「相同ＤＮＡ配列」）とを含んでなり、かつマーカー遺伝子を含まないベクターであって、前記異種遺伝子を含むＤＮＡ配列がその両端において前記相同ＤＮＡ配列に挟まれてなり、前記相同ＤＮＡ配列において制限酵素切断され直鎖状とされて、相同組換えによって前記異種遺伝子を含むＤＮＡ配列をキャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡに組み込むことができる、ベクター。
【０３９９】
（８７） 相同ＤＮＡ配列が、（１）〜（５）いずれか一項に記載のｒＲＮＡ遺伝子配列、（７）〜（８）いずれか一項に記載のＰＭＡ遺伝子配列のＵＲＡ３遺伝子配列、（１０）〜（１２）いずれか一項に記載のＬ４１遺伝子配列、ＰＧＫ遺伝子配列、ＧＡＰ遺伝子配列、またはＰＭＡ遺伝子配列のうちいずれか、またはそれらの部分ＤＮＡ配列から選択される、（８６）記載のベクター。
【０４００】
（８８） 異種遺伝子を含むＤＮＡ配列で形質転換された、キャンディダ・ユティリス形質転換体。
【０４０１】
（８９） 異種遺伝子を含むＤＮＡ配列が（４４）〜（６３）いずれか一項に記載のベクターである、（８８）記載のキャンディダ・ユティリス形質転換体。
【０４０２】
（９０） 異種遺伝子を含むＤＮＡ配列が（８６）または（８７）記載のベクターである、（８８）記載のキャンディダ・ユティリス形質転換体。
【０４０３】
（９１） 選択マーカー遺伝子を含まない、（９０）記載のキャンディダ・ユティリス形質転換体。
【０４０４】
（９２） キャンディダ・ユティリスがＡＴＣＣ９２５６、ＡＴＣＣ９２２６、およびＡＴＣＣ９９５０からなる群から選択されるものである、（８８）〜（９１）いずれか一項に記載のキャンディダ・ユティリス形質転換体。
【０４０５】
（９３） 異種遺伝子によりコードされるペプチドの製造法であって、（８８）〜（９２）いずれか一項に記載のキャンディダ・ユティリス形質転換体を培養し、該培養物から異種遺伝子の発現産物を単離、精製することを含んでなる、方法。
【０４０６】
（９４） 選択マーカー遺伝子として、転写のためのプロモーター配列を持たない薬剤耐性遺伝子を含んでなり、キャンディダ・ユティリス酵母内で、プラスミドとして存在しうる、（８１）記載のプラスミド。
【０４０７】
（９５） 薬剤耐性遺伝子がＧ４１８耐性を与えるバクテリアトランスポゾンＴｎ９０３由来のＡＰＴ遺伝子である、（９４）記載のプラスミド。
【０４０８】
（９６） プラスミドｐＰＣＶ２である、（９５）記載のプラスミド。
【０４０９】
（９７） （９４）〜（９６）いずれか一項に記載のプラスミドの薬剤耐性遺伝子の５’側にＤＮＡの制限酵素部分分解断片をクローン化したＤＮＡライブラリーによって、キャンディダ・ユティリスを形質転換し、当該薬剤耐性となる形質転換体を選択し、その形質転換体から回収されるプラスミドＤＮＡからキャンディダ・ユティリス酵母内で機能する転写プロモーター活性を有するＤＮＡ断片を単離する、転写プロモーター活性を有するＤＮＡの単離方法。
【０４１０】
（９８） 制限酵素で部分分解されたＤＮＡがキャンディダ・ユティリス酵母染色体ＤＮＡである、（９７）記載の方法。
【０４１１】
（９９） （９７）または（９８）記載の方法により単離され得る、キャンディダ・ユティリス酵母内で転写プロモーター活性を有するＤＮＡ断片。
【０４１２】
（１００） ＤＮＡ断片が制限酵素ＡｌｕＩ、ＨａｅIII 、またはＲｓａＩ、もしくはその組み合わせの制限酵素分解により染色体から切り出され、かつ０．８〜１．８ｋｂの長さを有する、（９９）記載のＤＮＡ断片。
【０４１３】
（１０１） 図４８に記載の塩基配列（配列番号：１３）、またはキャンディダ・ユティリス酵母内で転写プロモーター活性を有するその部分配列を含んでなる、ＤＮＡ断片。
【０４１４】
（１０２） （９９）〜（１０１）いずれか１つに記載のプロモーター配列と、その下流に連結されてなる異種遺伝子とを含んでなる、ＤＮＡ配列。
【０４１５】
（１０３） （１０２）記載のＤＮＡ配列で宿主細胞を形質転換し、当該形質転換細胞を培養して異種遺伝子を発現させることを含んでなる、異種遺伝子の発現法。
【０４１６】
（１０４） 宿主細胞がキャンディダ・ユティリスである、（１０３）記載の異種遺伝子の発現法。
【０４１７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子を含むプラスミドの制限酵素地図とＤＮＡ塩基配列決定のストラテジー、およびＰＣＲによるプロモーター、ターミネーター各断片の取得法を示す図である。
【図２】ＰＧＫ遺伝子ターミネーターを含むＤＮＡ断片の塩基配列を表す図である。
【図３】ＰＧＫ遺伝子プロモーターを含むＤＮＡ断片の塩基配列を表す図である。
【図４】ＰＧＫ遺伝子プロモーター、およびターミネーターを利用した発現ベクタープラスミドの構築の説明図である。
【図５】リボソームＤＮＡを含むプラスミドの制限酵素地図である。
【図６】リボソームＤＮＡの構造と、ＤＮＡ塩基配列決定のストラテジーおよびサブクローニングされたプラスミドの構造を表す図であって、図６（ａ）はプラスミドｐＣＲＥ１、ｐＣＲＥ２、ｐＣＲＥ３、ｐＣＲＸ１、ｐＣＲＸ２、ｐＣＲＸ３、およびｐＣＲＸ４プラスミドの構造を表し、図６（ｂ）はキャンディダ・ユティリスのリボソームＤＮＡを含んだ約１３．５ｋｂのＤＮＡフラグメントの制限酵素地図である。
【図７】ＵＲＡ３遺伝子を含むプラスミドの制限酵素地図と、それらプラスミドのサッカロマイセス・セレビシエｕｒａ３−変異の相補能を表す図である。
【図８】ＵＲＡ３遺伝子のＤＮＡ塩基配列決定のストラテジーと、制限酵素地図である。
【図９】ＵＲＡ３遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を表す図である。
【図１０】ＵＲＡ３遺伝子の塩基配列から推定されるアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡの塩基配列を表す図である。
【図１１】ＵＲＡ３遺伝子の塩基配列から推定されるアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡの塩基配列であって、図１０の続きの配列を表す図である。
【図１２】Ｌ４１遺伝子を含むプラスミドの制限酵素地図と、ＤＮＡ塩基配列決定のストラテジーを示す図である。
【図１３】Ｌ４１遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を表す図である。
【図１４】Ｌ４１遺伝子の塩基配列から推定されるアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡの塩基配列を表す図である。
【図１５】プラスミドｐＣＬＢＳ１０、およびｐＣＬＢＳ１２の構築の説明図である。
【図１６】プラスミドｐＣＬＲＥ２、ｐＣＬＲＥ３、ｐＣＬＲＸ１、およびｐＣＬＲＸ２の構築を表す図である。
【図１７】さまざまな電気パルス条件でのＡＴＣＣ９９５０生菌率、および形質転換体数を調べた結果を表す図である。
【図１８】プラスミドｐＣＬＲＥ２によって形質転換されたＡＴＣＣ９９５０株のＤＮＡのサザンブロッティング解析の結果を表す電気泳動図である。
【図１９】プラスミドｐＣＬＲＥ２によって形質転換されたＡＴＣＣ９２２６株、ＡＴＣＣ９２５６株、およびＡＴＣＣ９９５０株のＤＮＡのサザンブロッティング解析の結果を表す電気泳動図である。
【図２０】プラスミドｐＣＬＲＥ４、ｐＣＬＲＥ５、ｐＣＬＲＥ６、およびｐＣＬＲＥ７の構築を表す図である。
【図２１】プラスミドｐＣＬＲＥ４、ｐＣＬＲＥ５、ｐＣＬＲＥ６、およびｐＣＬＲＥ７によって形質転換されたＡＴＣＣ９９５０株のＤＮＡのサザンブロッティング解析の結果を表す電気泳動図である。
【図２２】プラスミドｐＣＬＵＲＡ１によって形質転換されたＡＴＣＣ９９５０株のＤＮＡのサザンブロッティング解析の結果を表す電気泳動図である。
【図２３】プラスミドｐＣＬＳＴＡ１、およびｐＣＬＲＳＴＡ１の構築の説明図である。
【図２４】プラスミドｐＣＬＲＳＴＡ１により形質転換されたＡＴＣＣ９９５０株の培養上清をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果を表わす電気泳動図である。
【図２５】プラスミドｐＣＬＬＡＣ１、およびｐＣＬＲＬＡＣ１の構築の説明図である。
【図２６】プラスミドｐＣＬＡＰＨ１、およびｐＣＬＲＡＰＨ１の構築の説明図である。
【図２７】異なる薬剤耐性マーカー（ＣＹＨｒ：シクロヘキシミド耐性、Ｇ４１８ｒ：Ｇ４１８耐性）により選択されたプラスミドｐＣＬＲＡＰＨ１によるＡＴＣＣ９９５０株形質転換体のＤＮＡのサザンブロッティング解析の結果を表す電気泳動図である。
【図２８】プラスミドｐＣＲＥ８、ｐＣＲＡＰＨ２、ｐＣＲＡＰＨ３、ｐＣＲＡＰＨ４、ｐＣＲＡＰＨ５、およびｐＣＲＡＰＨ６の構造を示した図である。
【図２９】グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子を含むプラスミドの制限酵素地図とＤＮＡ塩基配列決定のストラテジー、およびＰＣＲによるプロモーター、ターミネーター各断片の取得法を示す図である。
【図３０】ＧＡＰ遺伝子プロモーターを含むＤＮＡ断片の塩基配列を表す図である。
【図３１】ＧＡＰ遺伝子ターミネーターを含むＤＮＡ断片の塩基配列を表す図である。
【図３２】ＧＡＰ遺伝子プロモーター、およびターミネーターを利用した発現ベクタープラスミドの構築の説明図である。
【図３３】原形質膜プロトンＡＴＰａｓｅ（ＰＭＡ）遺伝子を含むプラスミドの制限酵素地図とＤＮＡ塩基配列決定のストラテジー、およびＰＣＲによるプロモーター、ターミネーター各断片の取得法を示す図である。
【図３４】ＰＭＡ遺伝子プロモーターを含むＤＮＡ断片の塩基配列を表す図である。
【図３５】ＰＭＡ遺伝子ターミネーターを含むＤＮＡ断片の塩基配列を表す図である。
【図３６】ＰＭＡ遺伝子プロモーター、およびターミネーターを利用した発現ベクタープラスミドの構築の説明図である。
【図３７】ＡＲＳを含むＤＮＡ断片のクローニングベクターｐＧＫＡＰＨ２の構造を示す図である。
【図３８】ＡＲＳを含むプラスミド６種類の挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を示した図である。
【図３９】プラスミドｐＣＡＲＳ６とその挿入ＤＮＡ断片がサブクローン化された４種類のプラスミドの挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を示した図である。
【図４０】プラスミドｐＣＡＲＳ７とその挿入ＤＮＡ断片がサブクローン化された５種類のプラスミドの挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を示した図である。
【図４１】プラスミドｐＣＡＲＳ６−２の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を表す図である。
【図４２】プラスミドｐＣＡＲＳ６−２の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を表す図であって、図４１の続きの配列を表す図である。
【図４３】プラスミドｐＣＡＲＳ７−６の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を表す図である。
【図４４】プラスミドｐＣＡＲＳ７−６の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を表す図であって、図４３の続きの配列を表す図である。
【図４５】プラスミドｐＣＡＲＳ６あるいはｐＣＡＲＳ７によって形質転換されたＡＴＣＣ９９５０株のＤＮＡ（１）あるいはプラスミドｐＣＬＡＣ１によって形質転換されたＡＴＣＣ９９５０株のＤＮＡ（２）のサザンブロッティング解析の結果を表す電気泳動図である。
【図４６】ＡＴＣＣ９９５０株、ＡＴＣＣ９２２６株、ＡＴＣＣ９２５６株、ＫＰ−２０５９Ｐ株、そしてＳ２８８Ｃ株のＤＮＡについてＣＵＡＲＳ１（１）、ＣＵＡＲＳ２｛（２）および（３）｝をプローブとしたサザンブロッティング解析の結果を表す電気泳動図である。
【図４７】プロモータークローニングベクターｐＰＣＶ２の構築の説明図である。
【図４８】プラスミドｐＰＣＲＶ１９のプロモーター活性を示すＤＮＡ断片の塩基配列を表す図である。
【図４９】プラスミドｐＧＫＨＰＴ１の構築の説明図である。
【図５０】共形質転換法により形質転換されたＡＴＣＣ９９５０株ＤＮＡのＰＣＲ解析の結果を表す電気泳動図である。
Claims (6)
- 配列番号：７の塩基配列を含んでなる、キャンディダ・ユティリスのグリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子プロモーター。
- 請求項１記載のＧＡＰ遺伝子プロモーターと、配列番号：８の塩基配列を含んでなるキャンディダ・ユティリスのＧＡＰ遺伝子ターミネーターとを含んでなる、遺伝子発現ユニット。
- 請求項２記載の遺伝子発現ユニットを含んでなる、プラスミド。
- プラスミドｐＧＡＰＰＴ１またはｐＧＡＰＰＴ２である、請求項３記載のプラスミド。
- 請求項１記載のＧＡＰ遺伝子プロモーターと、その下流に連結されてなる異種遺伝子とを含んでなる、ＤＮＡ。
- 請求項１記載のＧＡＰ遺伝子プロモーターと、その下流に連結されてなる異種遺伝子と、その異種遺伝子の下流に連結されてなる配列番号：８の塩基配列とを含んでなる、ＤＮＡ。
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