JP4018082B2

JP4018082B2 - 電気化学バイオセンサ

Info

Publication number: JP4018082B2
Application number: JP2004158600A
Authority: JP
Inventors: ツイ、ガン; ヨー、ジェ−ヒュン; キム、モオン−ファン; キム、ジュ−ヨン; ウーム、ジョン−ヘェ; ナム、ハクヒュン; チャ、グン−シグ
Original assignee: i Sens Inc
Current assignee: i Sens Inc
Priority date: 2003-06-09
Filing date: 2004-05-28
Publication date: 2007-12-05
Anticipated expiration: 2024-05-28
Also published as: CN1323293C; CN1573324A; DE602004003288T2; KR100554649B1; JP2005003679A; ATE346161T1; US7288174B2; EP1486778A2; DE602004003288D1; KR20040105429A; EP1486778A3; EP1486778B1; US20050000808A1

Description

本発明は、電気化学バイオセンサに関する。より詳細には、ヘマトクリット値による測定誤差を大幅に減少させ得る感応膜組成物を備えた電気化学バイオセンサに関する。この感応膜組成物は、酵素、電子受容体、水溶性高分子、脂肪酸(C₄〜C₂₀)、及び第4 級アンモニウム塩からなる。本発明の感応膜組成物は、数マイクロリッター以下の微量試料を用いる多様な形態の電気化学バイオセンサに使用可能である。

糖尿病の診断及び予防のために、周期的な血糖値測定を行う需要が増大している。このような血糖値測定は、手に把持することが可能な携帯用計測器を利用して手軽に行うことができる。例えば、ストリップ形状のバイオセンサを使用して手軽に測定できる。このような血糖値測定のためのバイオセンサの動作原理は、比色分析法又は電気化学的方法に基づいている。

この中で、電気化学的方法は、下記の反応式1 により説明され、最大の特徴は電子受容体を使用することにある。電子受容体としては、フェロセン、フェロセン誘導体、キノン、キノン誘導体、遷移金属を有する有機物及び無機物( ヘキサアンミンルテニウム、オスミウム含有高分子、フェリシアン化カリウム等) 、有機導体の塩、及びビオロゲンなどの電子を伝達する有機物等を使用する。

反応式1
(1) ブドウ糖 + GOx-FAD →グルコン酸 + GOx-FADH₂
(2) GOx-FADH₂ + 電子受容体（酸化状態）→GOx-FAD + 電子受容体（還元状態）
（式中、GOx はグルコースオキシダーゼを示し、GO_X-FAD 及びGO_X-FADH₂はそれぞれグルコースオキシダーゼの活性部位であるフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD ）の酸化状態及び還元状態を示す。）
反応式１を参照すると、（１）血液内のブドウ糖はグルコースオキシダーゼの触媒作用によりグルコン酸に酸化される。この時、グルコースオキシダーゼの活性部位のFAD が還元されFADH₂になる。(2) その後、還元されたFADH₂は電子受容体との酸化還元反応によってFAD に酸化され、電子受容体は還元される。このように形成された還元状態の電子受容体は電極表面まで到達する。電子受容体の電極表面での酸化還元反応によって電気化学的に作用電極と参照電極を接続する外部回路に電流が流れる。このとき流れる電流を測定して血糖値を測定する。

上記のような電気化学的方法を動作原理とするバイオセンサを電気化学バイオセンサという。電気化学バイオセンサは、従来の比色分析法によるバイオセンサとは異なり酸素による影響を抑制することが可能である。従って試料が混濁した場合であっても試料を別途の前処理なしに使用できるとの長所を有する。

このような電気化学バイオセンサは血糖値の監視及び制御に一般的に使用されるが、センサの正確性は血液試料に存在する多様な妨害種によって影響を受ける。妨害種としては、酸化を受け易いアスコルビン酸及びアセトアミノフェン、並びに尿酸などがある。その他の深刻な誤差はヘマトクリット値によって誘発される。バイオセンサストリップを使用して規則的に血糖値を測定する場合に、ヘマトクリット値から多大な影響を受ける一回毎の使い捨て型バイオセンサは、誤った測定結果が生じることがある。誤差が甚だしい場合には、使用する患者に生命の危険が及ぶことさえある。

従来、バイオセンサにおいてこのようなヘマトクリット値の影響を低減するために多様な方法が提案されている。赤血球除去のための追加の処理を行う方法、試薬層上に赤血球除去層を塗布する方法（特許文献１〜３）、スクリーン印刷され得るシリカ充填剤含有試薬と赤血球除去手段とを備えた感応膜を使用する方法（特許文献４）、及び二段階で電位を印加して得た測定結果をケモメトリックスによって数理処理する方法（特許文献５）などである。しかし、従来の方法はその製造過程で追加の工程が必要であったり、或いはその試薬層を印刷する際に試薬の損失を生じていたため、作用電極上に試薬混合物を簡単に塗布することが困難であった。
特開平１１−３４４６１号公報特開２０００−３３８０７６号公報米国特許第５６５８４４４号明細書米国特許第６２４１８６２号明細書国際公開第０１/ ５７５１０号パンフレット

本発明は上記問題点を解決するためのものであり、ヘマトクリット値の変化による測定誤差の低減に関する。
本発明はさらに、ヘマトクリット値の変化から受ける影響を大幅に減少させ得る感応膜組成物、及び、血液試料を前処理過程なしに迅速に安定して導入できる試料導入部を具備した電気化学バイオセンサに関する。

上記問題点を解決するために、請求項１に記載の発明は、下部基板と、上部基板と、前記下部基板又は上部基板に形成された作用電極及び参照電極と、前記作用電極に形成された感応膜と、前記感応膜は酵素、電子受容体、水溶性高分子、及びC4〜C20 アルキル鎖を有し成分全体に対して０. １〜２０重量％で含有される脂肪酸又はその塩を含有することと、前記下部と上部基板の間に形成された試料導入部と、前記試料導入部は試料導入通路部、通気部及び補助空間部を有することと、該補助空間部は試料導入通路部と通気部が連通する箇所にされていることとからなることを要旨とする。

請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の電気化学バイオセンサにおいて、前記作用電極及び参照電極が同一基板上に形成されていることを要旨とする。
請求項３に記載の発明は、請求項１に記載の電気化学バイオセンサにおいて、前記作用電極及び参照電極が異なる基板上に形成されていることを要旨とする。

請求項４に記載の発明は、請求項１に記載の電気化学バイオセンサにおいて、前記下部基板上に粘性率感知電極をさらに設けることを要旨とする。
請求項５に記載の発明は、請求項1 に記載の電気化学バイオセンサにおいて、前記脂肪酸が、飽和脂肪酸、カプロン酸、ヘプタン酸、カプリル酸、ノナン酸、カプリン酸、ウンデカ酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、ヘプタデカン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、及びアラキジン酸からなる群から選択されることを要旨とする。

請求項６に記載の発明は、請求項1 に記載の電気化学バイオセンサにおいて、前記感応膜が全体成分に対して0.1 〜30重量％の第４級アンモニウム塩をさらに含むことを要旨とする。

請求項７に記載の発明は、請求項1 に記載の電気化学バイオセンサにおいて、前記感応膜が全体成分に対して0.1 〜30重量％の第４級アンモニウム塩をさらに含むことを要旨と
する。

請求項８に記載の発明は、請求項7 に記載の電気化学バイオセンサにおいて、前記第4 級アンモニウム塩が、ドデシルトリメチルアンモニウム、ミリスチルトリメチルアンモニウム、セチルトリメチルアンモニウム、オクタデシルトリメチルアンモニウム及びテトラヘキシルアンモニウム等のハロゲン化合物からなる群から選択されることを要旨とする。

請求項９に記載の発明は、請求項１に記載の電気化学バイオセンサにおいて、前記酵素が、血糖酸化酵素、グルコース脱水素酵素、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステル化酵素、乳酸酸化酵素、アスコルビン酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコール脱水素酵素、ビリルビンオキシダーゼからなる群から選択されることを要旨とする。

請求項１０に記載の発明は、請求項１に記載の電気化学バイオセンサにおいて、前記電子受容体が、ヘキサアンミンルテニウム(III) 塩化物、フェリシアン化カリウム、フェロシアン化カリウム、ジメチルフェロセン、フェリシニウム、フェロセンモノカルボン酸、7,7,8,8,- テトラシアノキノジメタン(TCNQ)、テトラチアフルバレン(TTF) 、ニッケロセン(Nc)、N-メチルアシジニウム(N-methyl acidinium(NMA+))、テトラチオテトラセン（ＴＴＴ）、N-メチルフェナジニウム( NMP+)、ヒドロキノン、3-ジメチルアミノ安息香酸(MBTHDMAB)、3-メチル-2- ベンゾチアゾリノンヒドラゾン、2-メトキシ-4- アリルフェノー
ル、4-アミノアンチピリン(AAP) 、ジメチルアニリン、4-アミノアンチピレン、4-メトキシナフトール、3,3',5,5'-テトラメチルベンチジン(TMB) 、2,2-アジノ- ジ-[3-エチル- ベンゾチアゾリン- スルホン酸] 、o-ジアニシジン、o-トルイジン、2,4-ジクロロフェノール、4-アミノフェナゾン、ベンチジン、プルシアンブルーからなる群から選択されることを要旨とする。

請求項１１に記載の発明は、請求項10に記載の電気化学バイオセンサにおいて、前記電子受容体が、ヘキサアンミンルテニウム(III) 塩化物であることを要旨とする。
請求項１２に記載の発明は、請求項１に記載の電気化学バイオセンサにおいて、前記水溶性高分子が、前記酵素を分散させて固定化させるために使用され、ポリビニルピロリドン、ポロビニルアルコール、ポリフルオロスルホナート、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、酢酸セルロース、デキストラン又はポリアミドで構成された群から選択されることを要旨とする。

請求項１３に記載の発明は、請求項１に記載の電気化学バイオセンサにおいて、前記試料導入通路部と通気部の幅の比が２：１以下であることを要旨とする。
請求項１４に記載の発明は、請求項１に記載の電気化学バイオセンサにおいて、前記試料導入通路部が、0.1 μｌ〜3.0 μｌの容積の試料を充填させることを要旨とする。

請求項１５に記載の発明は、請求項１に記載の電気化学バイオセンサにおいて、前記試料導入通路部と通気部がなす角度が、75〜105 °であり、前記補助空間部が前記試料導
入通路部端部に設けられることを要旨とする。

請求項１６に記載の発明は、請求項４に記載の電気化学バイオセンサにおいて、前記粘性率感知電極が、ヘマトクリット値による影響を減少させることを要旨とする。
前記の目的を達成するために本発明は、
a)下部基板及び上部基板と、b)下部基板又は上部基板に各々形成された作用電極及び参照電極( 又は補助電極) と、c)作用電極に形成される感応膜と、この感応膜は酵素、電子受容体、水溶性高分子、及び成分全体に対して0.1 〜20重量％にて含有されるC4〜C20 のアルキル鎖脂肪酸もしくはその塩を含有することと、d)下部基板と上部基板の間に設けら
れた試料導入部と、この試料導入部は試料導入通路部、通気部、及び、試料導入通路部と通気部の連通箇所に形成された補助空間部からなることとを備えた電気化学バイオセンサを提供する。

本発明の一実施形態はさらに、酵素、電子受容体、水溶性高分子、脂肪酸及び第４級アンモニウム塩を含有する感応膜組成物を提供する。
また、本発明のさらなる実施形態は感応膜組成物を備えたバイオセンサを提供する。これにより本発明の感応膜組成物はヘマトクリット値による測定誤差を画期的に減少させ得る。

また、本発明のバイオセンサは、一定量の微量試料を迅速に充填可能な試料導入部を具備し、極微量試料も前処理過程なしに導入することができる。よって測定値の再現性及び信頼性が向上する。さらに本発明のバイオセンサは、構造が単純であり簡単に大量生産が可能であるとの長所を有する。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の電気化学バイオセンサは、a) 導電体( 炭素もしくは金属のペースト、金属蒸着膜、又は伝導性高分子) のスクリーン印刷又は蒸着によって形成された層を備えた下部基板と、b) この下部基板の上方に設けられて下部基板と上部基板を分離するとともに、上下両面にて接着可能な中間層と、この中間層に区画形成されたＬ字形試料導入部と、c)
感応膜層とを備える。本発明の感応膜層はヘマトクリット値から測定値が受ける影響を低減させる。

電気化学バイオセンサのセンサ電極は、同一の基板（例えば下部基板のみ）に形成しても、異なる基板、即ち下部基板と上部基板にそれぞれ形成してもよい。即ち、作用電極と補助電極（又は参照電極）は、(1) 同一下部基板上に形成しても、(2) それぞれ下部基板及び上部基板上に対向させて形成してもよい（対向電極、参考文献：イー．ケイ．バウマン等、アナリティカルケミストリ(Analytical Chemistry)、1965年、第37巻、第1378ページ、及び、ケイ．ビー．オールダム、「微小電極：理論と用途(Microelectrodes: Theory and Applications)」、クルワーアカデミックパブリッシャー、1991年）。

本発明では上記のセンサ電極の他に、さらに追加の電極を設けてもよい。これを粘性率感知電極という。粘性率感知電極は、血液試料の粘性率を測定するために、作用電極の後方に配置される。ヘマトクリット値は、血液試料の粘性率及び導電率を変化させる。従って血液がバイオセンサの毛細管通路を通って試料導入部に充填されるときに要する時間は、血液内のヘマトクリット値に比例して変化する。従って、試料の粘性率とヘマトクリット値との相関関係を利用すると、粘性率感知電極によって粘性率変化を感知することにより、ヘマトクリット値による誤差を補正することができる。

Ｌ字形をなす試料導入部は、バイオセンサのストリップ端から迅速、正確、かつ簡便な血液試料の充填を可能にする。試料導入部は、試料導入通路部及びこの試料導入通路部に角度をもって連通されている通気部を有する。試料導入通路部と通気部が連通する箇所に補助空間部が形成されている。補助空間部は、一定量の試料を正確に通路内に充填することを可能にし、又は過剰試料の通気部を通じた放出を促進する。補助空間部は、粘性率感知電極を配置する場所として利用することもできる。

本発明による感応膜は、感応膜組成物を作用電極上に塗布することによって簡単に形成できる。使用した感応膜組成物は、酵素( グルコースオキシダーゼ、ラクタートオキシダーゼ等) 、電子受容体、水溶性高分子( 酢酸セルロース、ポリビニルアルコール、ポリピ
ロール等) 、ヘマトクリット値緩衝還元剤(C₄〜C₂₀のアルキル鎖からなる脂肪酸) 及び、親油性第４級アンモニウム塩を含有する。

さらに、本発明のバイオセンサは、上部基板の一部を通して下部基板の粘性率感知電極を視認するための試料確認窓を備える。試料確認窓は、試料充填の状態を確認するために設けられる。

以下、図面を参照して本発明の実施形態をさらに詳細に記載する。
図１は、試料導入部の好適な実施形態を図示したものである。中間基板200 内部に形成した試料導入部100 には、試料導入通路部101 と通気部102 がＬ字形に連通するように形成されており、連通箇所には補助空間部103 が設けられている。試料導入部は、下部基板400 と上部基板300 とによって外部から水密に遮断されている。

ここで、「試料導入通路部101 」とは、試料と接触したときにセンサ内部へ試料を導入するための通路をいう。「通気部102 」とは、空気を通過させ得る通路をいう。試料が試料導入通路部へ流入した時、試料導入部内に存在する空気は通気部を通じて排気される。このような通気部102 は、毛細管現象による試料導入を可能にする。

一方、補助空間部103 は、試料導入通路部101 と通気部102 が連通する箇所の近傍に若干の空間を提供することによって、試料導入通路部101 と通気部102 が連通する部位での気泡の発生を抑制する役割を果たす。上記の連通部位は電極と接触する部分であり、ここに気泡が発生すると血糖値の正確な測定が困難となる。

試料導入通路部101 と通気部102 の幅の比は、試料の迅速な充填を可能にするために好適には２：１以下、最適には５：１〜２：１の範囲にある。２：１以下に調整することにより確実に正確な試料の量を充填できるだけではなく、試料が迅速に通気部へ移動することによって試料の迅速な充填が可能となる。

試料導入通路部101 と通気部102 がなす角度（φ）は、図１に図示したように好適には90°であるが、必ずしもこれに限定されるものではなく、45〜135 °、好適には60〜120 °、最適には75〜105 °の範囲内で適切に調節できる。

図1 を参照すると、補助空間部103 は、試料導入通路部101 と通気部102 の連通箇所を越えて延伸している。そして、気泡を生じずに正確な分量の試料を充填するために、補助空間部103 と試料導入通路部101 とには親水性処理が施される。

試料導入部100 の全体積は、0.1 〜3.0 μl 、好適には0.1 〜1.0 μl 、最適には0.3 〜0.7 μl の範囲内に設定する。0.1 μl 未満の場合にはセンサの誤差範囲のよる影響によって正確な測定が保証されなくなり、3.0 μl を超過する場合には過剰に血液を採取することとなる。一実施形態によれば、好適な試料量は0.5 μl であった。

上記した構造の試料導入部100 が形成されている中間基板200 は、ポリエステル、ポリ塩化ビニル及びポリカーボネート等の有機高分子材料をプレス成形することによって形成できる。好適には、有機高分子材料からなる両面テープのプレス加工によって形成することができる。或いは、図１に示されている形状に従って接着層をスクリーン印刷することによって形成してもよい。

補助空間部103 は、図１に示されているように試料導入通路部を延長するように形成してもよいが、この形状に限定されるものではない。例えば、試料導入通路部101 又は通気部102 のいずれかと水平の角度で形成することもできる。

次に試料導入部100 の動作を説明する。まず、試料導入通路部101 の端部を試料と接触させると、毛細管現象により試料が試料導入通路部101 へ導入される。試料導入通路部101 を全て充填した試料は補助空間部103 に流入し、さらに通気部102 に流入する。ここで、試料導入通路部101 の幅に比べて通気部102 の幅を1/2 以下に調整することにより迅速な試料導入が可能になる。また、補助空間部を設けることにより試料導入通路部101 と通気部102 が連通する部位での気泡を防止することが可能になる。ヘマトクリット値、試料保管状態、及び使用した血液凝固防止剤によって差があるものの、本発明の実施例によると、体積が約 0.5μl の試料導入部への試料の充填に要する時間は約200 〜2000ms以内であった。一般に採取直後の血液試料を使用した場合であっても、約0.5 μl の試料導入部への充填に要する時間は、ヘマトクリット値によって異なるが約200 〜800ms の範囲内にある。

上記構造の試料導入部100 は、多様な形状のバイオセンサに使用可能である。その例として、作用電極、補助電極又は参照電極を同一基板上に形成した平面型バイオセンサ、又は補助電極を上部基板に形成し、作用電極と対向させて下部基板に製作した対向型バイオセンサ、又は平面型及び対向型のいずれであっても各電極にかかる電位差に関する信号を処理するように製作された電位差式バイオセンサが挙げられる。

図２は、上記の組成の感応膜と試料導入部とを備えた対向型バイオセンサの好適な実施形態を示す分解斜視図である。この実施形態の対向型バイオセンサは、下部基板400 、中間基板200 、及び上部基板300 を重ねた構造を有する。下部基板400 には、電子受容体及び酸化酵素がコーティングされた作用電極104 と、電極コンタクト106 とが形成されている。中間基板200 には試料導入部100 が区画されており、試料導入部100 はＬ字形の形状をなし連通する試料導入通路部101 及び通気部102 と、これら試料導入通路部101 と通気部102 が連通する箇所に設けられた補助空間部103 とからなる。上部基板300 の中間基板200 と対向する面には、参照電極（補助電極）105 及び電極コンタクト106 が形成されている。既に記載したように、試料導入部100 の形状はＬ字形に限定されるものではなく、試料導入通路部101 と通気部102 が水平以外の角度をもって結合されるように形成されればよい。また、補助空間部103 の構造の形状も、多様な形状にすることができる。

次に対向型バイオセンサの製造方法を説明する。まず、下部基板400 の上面にストリップの長さ方向の作用電極104 、及び電極コンタクト106 を、炭素又は金属からなる導電
材料の印刷又は蒸着によって形成する。

上部基板300 の裏面には、ストリップの長さ方向の参照電極（補助電極）105 及び電極コンタクト106 を炭素又は金属からなる導電材料の印刷又は蒸着によって形成する。このように形成された下部基板400 上に、上記のように試料導入部100 が区画形成され、数百μｍ程度の厚みを有する中間基板200 を接着させる。

中間基板200 は、作用電極104 上で、参照電極105 との間の電気接続を行う電気コンタクト、及び試料導入部を除く全面に設けられる。中間基板200 の材質は、絶縁性の物質であれば特別な制限はないが、加工性及び成形性の面から好適には絶縁性高分子材料が使用される。下部基板400 と上部基板300 は、接着剤又は両面テープを利用して容易に接着することもできる。その後、中間基板200 の切り欠き部から露出している作用電極上に電子受容体及び酸化酵素を分散させて固定化する。接着剤又は両面テープ等を利用して中間基板200 上面に上部基板300 を接着することによって対向型バイオセンサを製作する。

平面型バイオセンサのセンサ電極は、上記の試料導入部100 を備えた対向型バイオセンサ電極と同様の方式で製作することができる。
図３は、本発明の感応膜及び試料導入部を備えた対向型バイオセンサの好適な実施形態を示す分解斜視図である。本実施形態による対向型バイオセンサは、下部基板400 、中間基板200 、及び上部基板300 を順次積層した構造を有する。下部基板400 には粘性率感知電極107 、作用電極104 、バイオセンサ確認電極108 及び電極コンタクト106 が形成されている。作用電極104 上には電子受容体及び酸化酵素がコーティングされている。中間基板200 には試料導入部100 が区画形成されている。試料導入部100 は、Ｌ字形をなすように連通している試料導入通路部101 と通気部102 と、これら試料導入通路部101 及び通気部102 の連通箇所に形成された補助空間部103 とを備える。上部基板300 には、参照電極（補助電極）105 及び電極コンタクト106 が裏面に形成されている。

ここで、試料導入部100 の構造は既に説明したように、Ｌ字形に限定されるものではなく、試料導入通路部101 と通気部102 が角度をもって連通していればよい。補助空間部103 の構造もまた、上記のように多様な形状をとり得る。

本実施形態による対向型バイオセンサの製造方法を次に説明する。まず、下部基板400 の上面のストリップの長さ方向に炭素又は金属からなる導電材料を印刷又は蒸着し、作用電極104 、粘性率感知電極107 、電極コンタクト106 及びバイオセンサ確認電極108 を形成する。

上部基板300 の裏面には炭素又は金属からなる導電材料を印刷又は蒸着して参照電極（補助電極）105 及び電極コンタクト106 を形成する。参照電極105 を形成する導電材料は、試料の充填状態を確認するために下部基板の粘性率感知電極を視認可能とするための試料確認窓301 と、図３において「バイオセンサ」の文字で示されている商標部分とを切り欠いた形状に印刷又は蒸着されている。電極コンタクト106 は参照電極105 上に印刷又は蒸着されている。

次に、下部基板400 上に、数百μｍ程度の厚さの中間基板200 を、上記の試料導入部100 及び作用電極の電気接続を行う箇所を除く全面を覆って接着させる。中間基板200 の材質は、絶縁材料であれば特別な制限はないが、加工性及び成形性の面から絶縁性高分子材料が好ましい。下部基板400 と上部基板300 の接着は、接着剤又は両面テープを利用してもよい。その後、中間基板200 の切り欠き部から露出した作用電極上に電子受容体及び酸化酵素を分散させた状態で固定化する。中間基板200 上に上部基板300 を接着剤又は両面テープ等を利用して接着することにより対向型バイオセンサを製作する。

本発明の試料導入部100 は図１に示されているように形成することができるが、この形状に限定されるものではない。ここで、試料導入通路部101 、通気部102 、補助空間部103 は同一面上に形成されていれば十分である。例えば、試料導入通路部101 又は通気部102 のいずれかと水平の角度をもって形成することもできる。

試料の粘性率は、試料入口近傍において試料が最初に電極と接触する箇所から、補助空間部103 又は通気部102 のいずれか一方に設ける粘性率感知電極107 まで試料が充填される速度の関数として決定される。

バイオセンサの下部基板400 及び上部基板300 の材質は、セラミック、ガラス、又は高分子材料を使用できる。好適にはポリエステル、ポリビニルクロライド及びポリカーボネート等の有機高分子材料を使用できる。

作用電極104 及び参照電極105 の材料は、導電材料であれば特に制限はない。導電材料の例には、銀エポキシ、パラジウム、銅、金、白金、イリジウム、銀/ 塩化銀、炭素及び、特定な酸化- 還元対などの添加剤によって変性された炭素等がある。作用電極104 及び
参照電極105 は、導電材料を基板上にスクリーン印刷するか、物理蒸着した後エッチングするか、又は導体テープを付着することによって形成することができる。

試料導入部100 を具備したバイオセンサは、以下のような長所を有する。
（１）血液試料を毛細管現象で迅速に吸入する際、連通部位に補助空間部103 を形成し追加の空間を設けることによって試料導入部100 が屈曲する角の部位で発生し得る気泡を抑制することができる。

（２）試料導入部100 が細い入口及び通気部102 以外の箇所では水密に遮断され、試料通路全体が上部基板で覆われている為、センサの測定器具への脱着の際に、充填された試料が漏出することがなく衛生的である。また、測定時間中の試料蒸発による濃度の変化を最小化して分析上必要な再現性を向上させることができる。

（３）試料導入通路部101 と通気部102 が互いにほぼ直交する形状に形成された試料導入部100 を有するバイオセンサは、規定量の血液試料の迅速な充填が可能であり、バイオセンサの正確性及び信頼性、及び測定データの再現性を向上させることができる。

（４）本発明の実施形態による試料導入部100 は、センサの端部で試料を導入可能であるため、採血部位で測定試料である血液に容易に接触させることができ、試料導入がより簡便である。

感応膜は、感応膜組成物を作用電極104 上に塗布することによって簡単に形成可能である。この時、感応膜組成物の量は好適には、300 〜500nl である。使用した感応膜組成物は、分析用酵素（酸化剤、エステル化剤、又は脱水素化剤）、電子受容体、水溶性高分子、及びヘマトクリット値に干渉する還元剤を含有する。

酵素は、上記反応式1 に示したように、測定対象となる多様な代謝物質と反応して還元され、還元された酵素と電子受容体との酸化還元反応から代謝物質を定量する。本発明は、血糖値測定用バイオセンサを実施例で説明するが、血糖値測定の用途と同様に、特定酵素にとって適切な電子受容体を使用することにより、多様な代謝物質を同様な方法で定量することが可能である。他の測定対象としては例えば、コレステロール、乳酸、クレアチニン、蛋白質、過酸化水素、アルコール、アミノ酸、GPT(グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ) 、GOT(グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ) など酵素等の生体試料、環境試料、農工業試料又は食品試料中の多様な有機物又は無機物濃度がある。従って本発明は、感応膜組成物に含まれる酵素の種類を変えることによって多様な代謝物質の定量に利用できるものである。例えば、血糖酸化酵素、乳酸酸化酵素、コレステロールオキシダーゼ、グルタミン酸オキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ等を使用してコレステロール、乳酸、グルタミン酸、過酸化水素、及びアルコールの定量を行うことができる。好適には、血糖酸化酵素、グルコース脱水素酵素、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステル化酵素、乳酸酸化酵素、アスコルビン酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコール脱水素酵素、ビリルビンオキシダーゼ及び糖脱水素酵素からなる群から選択された酸化酵素を使用する。

本発明の実施例によると、血糖値測定バイオセンサで使用される酵素は、グルコースオキシダーゼ又は糖脱水素酵素を使用する。
電子受容体は、代謝物質と反応して還元された酵素との酸化還元反応によって還元される。このように形成された還元状態の電子受容体は、電極表面まで拡散することによって電極表面に酸化電位を印加させ、電流を発生させる役割を果たす。従来に使用されたフェロセン、フェロセン誘導体、キノン、キノン誘導体、有機導体の塩、又はビオロゲンを排除するものではないが、好適には、ヘキサアンミンルテニウム(III) 塩化物、フェリシ
アン化カリウム、フェロシアン化カリウム、ジメチルフェロセン、フェリシニウム、フェロセンモノカルボン酸、7,7,8,8,- テトラシアノキノジメタン(TCNQ)、テトラチアフルバレン(TTF) 、ニッケロセン(Nc)、N-メチルアシジニウム(N-methyl acidinium(NMA⁺))、テトラチオテトラセン（ＴＴＴ）、N-メチルフェナジニウム(NMP⁺)、ヒドロキノン、3-ジメチルアミノ安息香酸(MBTHDMAB)、3-メチル-2- ベンゾチアゾリノンヒドラゾン、2-メトキシ-4- アリルフェノール、4-アミノアンチピリン(AAP) 、ジメチルアニリン、4-アミノアンチピレン、4-メトキシナフトール、3,3',5,5'-テトラメチルベンチジン(TMB) 、2,2-アジノ- ジ-[3-エチル- ベンゾチアゾリン- スルホン酸] 、o-ジアニシジン、o-トルイジン、2,4-ジクロロフェノール、4-アミノフェナゾン、ベンチジン、プルシアンブルーからなる混合電子価化合物中から選択されたものを使用する。

本発明の実施形態において最適な電子受容体は、ヘキサアンミンルテニウム(III) 塩化物である。この電子受容体を使用すると以下の特性を有する。
（１）水溶液中で酸化- 還元状態が安定して反応が可逆的である。

（２）還元された電子受容体が酸素と反応しない。
（３）電子受容体の式量電位が充分に低く、血液内のアスコルビン酸、アセトアミノフェン及び尿酸などの多様な妨害種による影響を最小化できる。

（４）還元された電子受容体の酸化が酸性度の影響を受けない。
（５）電気化学妨害物質のアスコルビン酸、アセトアミノフェン及び尿酸と反応しない。

水溶性高分子は、感応膜組成物の高分子担体として酵素の固定化及び分散を助ける役割を果たす。本発明でPBS 緩衝溶液に溶解する前の固体状態の感応膜組成物に対して、0.1 〜10重量％含有させる。ポリビニルピロリドン(PVP) 、ポロビニルアルコール(PVA) 、過フッ化スルホン酸、ヒドロキシエチルセルロース(HEC) 、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC) 、カルボキシメチルセルロース(CMC) 、酢酸セルロース、デキストラン、又はポリアミドを使用することが好適であり、最適にはPVP 及びHPC を使用する。

本発明の感応膜組成物は、ヘマトクリット値による測定誤差を大幅に減少させられる物質を含有する。
脂肪酸は、感応膜組成物に添加されることにより、ヘマトクリット値による測定値への影響を減少させる役割を果たし、高濃度領域ではバイオセンサの動的線形領域を減らす傾向を示す。脂肪酸は水又は水溶液に溶解した後組成物に添加する。添加量は、固体状態の組成物に対して0.1 〜20重量％である。この場合、脂肪酸を0.1 重量％未満の分量で添加すると、脂肪酸添加による効果がなく、20重量％以上添加した時は脂肪酸が溶解しない問題がある。本発明で脂肪酸は、C₄〜C₂₀の炭素鎖を有した脂肪酸又はその脂肪酸塩を使
用し、好適にはは、C₆〜C₁₂からなるアルキル炭素鎖を持った脂肪酸又はその脂肪酸塩を使用する。このような脂肪酸としては、飽和脂肪酸、カプロン酸、ヘプタン酸、カプリル酸、ノナン酸、カプリン酸、ウンデカ酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、ヘプタデカン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、及びアラキジン酸があげられる。

また、脂肪酸と共に第4 級アンモニウム塩を感応膜組成物に添加することによって、ヘマトクリット値から受ける影響を低減させることができる。好適には、ドデシルトリメチルアンモニウム、ミリスチルトリメチルアンモニウム、セチルトリメチルアンモニウム、オクタデシルトリメチルアンモニウム及びテトラヘキシルアンモニウム等のハロゲン化物などの第４級アンモニウム塩を使用する。本発明では、その効果を考慮して固体状態の感応膜組成物に対して0.1 〜30重量％添加する。

以下、実施例によって本発明を詳細に説明する。但し、下記の実施例は、発明を例示するものであり、本発明が実施例によって限定されるものではない。

（脂肪酸を使用しない感応膜試薬の調製）
ヘキサアンミンルテニウム(III) 塩化物30mg(41.6 重量％) と分散剤のカルボキシメチルセルロース1mg(1.4 重量％) 、界面活性剤( 商品名: Triton X-100)1mg(1.4重量％) 、及びグルコースオキシダーゼ40mg(55.6 重量％) を含有する混合物をpH6.4 の1ml PBS 緩衝溶液に溶解した。溶液内に残留した微粒子は濾過することによって除去した。このような試薬溶液は、空気圧縮分配器(EFD XL100) の注射器内に保管した。

（脂肪酸を使用する感応膜試薬の調製）
ヘキサアンミンルテニウム(III) 塩化物30mg(32.6 重量％) 、分散剤のカルボキシメチルセルロース1mg(0.8 重量％) 、ポリビニルピロリドン(PVP)5mg(4重量％) 、界面活性剤( 商品名: Triton X-100) 1mg(0.8 重量％) 、脂肪酸としてラウリン酸20mg(15.7 重量％) 、臭化ミリスチルトリメチルアンモニウム30mg(23.6 重量％) 及び、グルコースオキシダーゼ40mg(31.5 重量％) を含有する混合物をpH6.4 の1ml PBS 緩衝溶液に溶解した。
溶液内に残留している微粒子はろ過することによって除去した。試薬溶液は空気圧縮分配器(EFD XL100) の注射器内に保管した。

（２電極系対向型バイオセンサの製作）
図２に図示した形態の作用電極と電極コンタクトを炭素ペーストでスクリーン印刷した後、140 ℃で5 分間加熱処理した。その後、電気コンタクトの端部に中間基板電極の厚さの銀ペーストをスクリーン印刷し、回路コンタクト部を完成した。上部基板電極に参照電極を形成するために炭素ペーストをスクリーン印刷し、下部基板電極製作時と同一条件で加熱処理した。参照電極の端部にペーストで回路コンタクトを形成して、対向型バイオセンサの上部基板電極を製作した。

ポリエステル材質の両面テープに図２に図示した形状の試料導入通路部、通気部及び補助空間部を区画形成してある中間基板をプレス加工によって製作した。試料導入通路部と通気部の幅の比は、2 ：1 になるように調節した。このように形成した試料導入部の全容積は、0.5 μｌになるように製作した。

図２に示されるように、バイオセンサを完成するために電極が印刷された下部基板上に中間基板を接着した。次に、中間基板の切り欠き部から露出している試料導入通路部位の作用電極上に実施例１又は２で調製した試薬溶液を塗布した後、45℃で30分間乾燥させた。酵素混合物が乾燥した後、回路コンタクトが良好に接続されるように、中間基板の上面を上部基板電極に圧着して対向型バイオセンサを製作した。

（粘性率感知電極を有するバイオセンサの製作）
図３に示されているように上部基板の大部分を覆うように参照電極を形成した他は、実施例３に関して記載した方法と同一の方法によって粘性率感知電極を有する対向型血糖値センサを製作した。粘性率感知電極の端部分は、試料導入部分の補助空間部に位置する。

図３に示されているバイオセンサを完成するために、作用電極が印刷された下部基板上に中間基板を接着した。次に、露出した試料導入通路部位の作用電極上に実施例１又は２
の方法によって調製した試薬溶液を塗布した後、45℃で30分間乾燥させた。酵素混合物が乾燥した後、回路コンタクトが良好に接続されるように中間基板の上面を上部基板電極に圧着して対向型バイオセンサを製作した。

（実験例１：対向型グルコースセンサでの妨害物質による影響検証）
実施例３に従って製作した平均値0.5 μｌ試料導入部を有する対向型グルコースセンサでのグルコース、アスコルビン酸、アセトアミノフェン及び尿酸のような妨害物質及び緩衝溶液に対する影響を測定した。

グルコースを含有する溶液、及びグルコースとそれぞれ異なる妨害物質を含む各種溶液に対する感応電流を測定した。その結果を図４に示した。図４において、(a) から(d) は、(a) グルコース177mg/dLをPBS 緩衝溶液(pH7.4) に溶解した溶液、(b) グルコース177mg/dL+ アセトアミノフェン660 μM 、(c) グルコース177mg/dL+ アスコルビン酸570 μM 、(d) グルコース177mg/dL+ 尿酸916 μM の測定結果を示す。この時、センサ電流は、参照電極に相対して+0.2V の電位を作用電極に印加し、５秒後に電流値を測定した。

図４に示されているように、グルコース177mg/dLをPBS 緩衝溶液(pH 7.4)に溶解した溶液に対する測定結果( 直線a)と、妨害物質を各々含有する、グルコース177mg/dLにアセトアミノフェン660 μM(直線b)、アスコルビン酸570 μM(直線c)、尿酸916 μM(直線d)を含む溶液の測定結果とでは、大きな差が観測されなかった。このような結果から、参照電極(Ag/AgCl) 対して印加電位+0.2V では電気化学バイオセンサに対する妨害物質の作用が微小であることが分かった。

（実験例２：対向型グルコースセンサのグルコース標準溶液に対する検定）
実施例３により製作した対向型グルコースセンサを利用してグルコース標準溶液に対する検定テストを行った。

検定の方法をより詳細に説明する。各々のグルコース濃度が、0 、50、150 、300 、450 及び600mg/dLの標準溶液で各濃度当り10回ずつ参照電極に対して印加電位+0.2V で電流値を測定した。この時、センサ導入部には0.5 μｌの試料が充填され、試料が導入部を満たすのにかかった時間は、約200ms 以内であった。測定は、試料が試料導入部を充填した後、２秒の反応時間を与え、次に+0.2V の電圧を3 秒間加えて5 秒後の電流値を測定した。その結果が図5 に示されている。

図６は、クロノアンペロメトリー法測定の動的曲線であり、各々の曲線は、グルコース0 mg/dL(曲線a)、50mg/dL(曲線b)、150mg/dL( 曲線c)、300mg/dL( 曲線d)、450mg/dL( 曲線e)及び600mg/dL( 曲線f)を示したものである。図６に見られるように、本発明のバイオセンサは短時間で一定電流に到達して測定に対する結果が迅速でかつ正確であることを示している。

また、本発明のバイオセンサから得られる傾きは、0.093[μA/(mg/dL)]で、相関係数は0.997 であり、本発明のバイオセンサが卓越した線形的な応答を示した（図５参照）。
（実験例３：血液粘性率測定とヘマトクリット値の影響補正）
実施例４により製作した粘性率感知電極を具備した対向型グルコースセンサを利用して、血液粘性率測定とヘマトクリット値の影響の補正テストを行なった。具体的に、200 mVの電位を作用電極と粘性率感知電極に印加した。試料導入部を通じて血液試料が導入されると瞬間電流が検知され流動時間測定が始まる。試料が補助空間部に接触すると同時に、２番目の瞬間電流が検知され、最初と2 番目の瞬間電流間の時間間隔が記録される。このような試料導入時間とヘマトクリット値の間の相関関係を図7 に示した。実験は、180mg/dL血糖と多様な量のヘマトクリット値の水準を含むフッ化ナトリウムで処理された全血を
使用して実施した。

実験の結果、下記数式１の関係式が得られた。

下記の表１は、試料充満時間の速度から推定されるヘマトクリット値を示す。

補正曲線はそれぞれの実験において多様なヘマトクリット値の血液試料を使用して得られ、ヘマトクリット値と傾きの相関関係は、表２に公式化された。

このような方式で誘導された補正常数は、40％ヘマトクリット値を有する血液試料に対して測定された血糖値を再補正するために利用され、結果的にこのような補正を経たバイオセンサは、ヘマトクリット値に影響を受けないで血糖濃度を測定することができる。即ち、測定器は、最初に試料導入速度を読み、血液試料内のヘマトクリット値を決定する。
そして、表から一致する補正曲線を捜して測定された電流値から補正された血糖値を決定する。

表３は、このような方式で実行した実験の結果を示している。ここで、試料導入速度は、粘性率感知電極で測定し、血液試料の血糖値を計算するために表２の補正曲線を使用した。

粘性率感知電極は、血液試料の非正常的な粘性率を区別することができる。このような現象は、非常に低い、或いは高いヘマトクリット値を有した試料でも空気泡形成による血液試料の正常でない充填等から発生し得る。測定時のこのような場合は、測定装置からプログラムにより警告メッセージや誤謬コードが出るようにする。

（実験例４：試薬層に含まれた脂肪酸により減少したヘマトクリット値の妨害作用）
実施例４によりバイオセンサストリップを製作した。ヘパリン（血液凝固防止剤）で処理した血液試料は、遠心分離機を利用して血漿とヘマトクリットに分離して20、40、60％の三種の異なったヘマトクリット値の血液試料を得るために再び混合した。血糖値測定におけるヘマトクリット値の影響は、実施例１，２に従って調製した試薬層を使用したバイオセンサを使用して、３種の異なった血糖値で評価した。その結果を表4 及び表5 に示した。

実験の結果、実施例２により準備した試薬を使用したバイオセンサは、実質的にヘマトクリットによる影響が明瞭に減少し、臨床学的に許容範囲内にあるヘマトクリット値40％に対する相対誤差を示すことが明確に判定した。

以上詳細に説明したように本発明は、バイオセンサストリップでヘマトクリット値( 血液内赤血球容積率) による測定誤差を大幅に減少させた感応膜組成物に関するものである。上記に示した試薬組成を使用して血液内妨害物質と血液内の電極活性物質、及びヘマトクリット値による信号大きさ変化の影響を大幅に減少させたバイオセンサを製作した。

また、本発明は、電気化学バイオセンサにおいて、感応膜組成物からなる感応膜層及び前処理過程なしに、迅速に所定量の試料を充填することができる試料導入部、及び、血液試料の粘性率を測定できる粘性率感知電極を具備した電気化学バイオセンサを提供した。これによって本発明のバイオセンサは、構造が単純かつ製造が容易であり、0.3 μｌ〜 0.7μｌの少量試料を前処理過程の必要なしに一定に導入でき、電極間の再現性が優れた。また、センサは測定時間が５秒以内と非常に速く、手軽に大量生産できる長所があるだけではなく、家庭や病院で患者自身が血液中のグルコース量を血液内の妨害物質とヘマトクリット値に影響を受けずに正確な測定が可能で、非常に有用である。

本発明の一実施形態による試料導入部を示す分解斜視図。本発明の一実施形態による対向型バイオセンサを示す分解斜視図。本発明の試料導入部、及び試料の粘性率感知電極を設けた対向型バイオセンサを示す分解斜視図。対向型バイオセンサの妨害物質による影響を測定したグラフ。対向型バイオセンサのブドウ糖標準溶液に対する検定曲線。対向型バイオセンサのブドウ糖標準溶液に対する定圧電流法動的曲線。本発明による対向型バイオセンサにおける試料粘性率とヘマトクリット値の相関関係を図示したグラフ。

符号の説明

１００…試料導入部、１０１…試料導入通路部、１０２…通気部、１０３…補助空間部、１０４…作用電極、１０５…参照電極（補助電極）、１０７…粘性率感知電極、３００…上部基板、４００…下部基板。

Claims

下部基板と、上部基板と、前記下部基板又は上部基板に形成された作用電極及び参照電極と、前記作用電極に形成された感応膜と、前記感応膜は酵素、電子受容体、水溶性高分子、及びC₄〜C₂₀アルキル鎖を有し成分全体に対して０. １〜２０重量％で含有される脂肪酸又はその塩、及び全体成分に対して0.1 〜30重量％の第４級アンモニウム塩を含有することと、前記下部と上部基板の間に形成された試料導入部と、前記試料導入部は試料導入通路部、通気部及び補助空間部を有することと、該補助空間部は試料導入通路部と通気部が連通する箇所に設けられているととからなる電気化学バイオセンサ。
前記作用電極及び参照電極が同一基板上に形成されていることを特徴とする、請求項１に記載の電気化学バイオセンサ。
前記作用電極及び参照電極が異なる基板上に形成されていることを特徴とする、請求項１に記載の電気化学バイオセンサ。
前記下部基板上に粘性率感知電極をさらに設けることを特徴とする、請求項１に記載の電気化学バイオセンサ。
前記脂肪酸が、飽和脂肪酸、カプロン酸、ヘプタン酸、カプリル酸、ノナン酸、カプリン酸、ウンデカ酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、ヘプタデカン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、及びアラキジン酸からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の電気化学バイオセンサ。
前記第４級アンモニウム塩が、ドデシルトリメチルアンモニウム、ミリスチルトリメチルアンモニウム、セチルトリメチルアンモニウム、オクタデシルトリメチルアンモニウム及びテトラヘキシルアンモニウム等のハロゲン化合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の電気化学バイオセンサ。
前記酵素が、血糖酸化酵素、グルコース脱水素酵素、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステル化酵素、乳酸酸化酵素、アスコルビン酸オキシダーゼ、アルコー
ルオキシダーゼ、アルコール脱水素酵素、ビリルビンオキシダーゼからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の電気化学バイオセンサ。
前記電子受容体が、ヘキサアンミンルテニウム(III) 塩化物、フェリシアン化カリウム、フェロシアン化カリウム、ジメチルフェロセン、フェリシニウム、フェロセンモノカルボン酸、7,7,8,8,- テトラシアノキノジメタン(TCNQ)、テトラチアフルバレン(TTF) 、ニッケロセン(Nc)、N-メチルアシジニウム(N-methyl acidinium(NMA ⁺ ))、テトラチオテトラセン（ＴＴＴ）、N-メチルフェナジニウム(NMP ⁺ )、ヒドロキノン、3-ジメチルアミノ安息香酸(MBTHDMAB)、3-メチル-2- ベンゾチアゾリノンヒドラゾン、2-メトキシ-4- アリルフェノール、4-アミノアンチピリン(AAP) 、ジメチルアニリン、4-アミノアンチピレン、4-メトキシナフトール、3,3',5,5'-テトラメチルベンチジン(TMB) 、2,2-アジノ- ジ-[3-エチル- ベンゾチアゾリン- スルホン酸] 、o-ジアニシジン、o-トルイジン、2,4-ジクロロフェノール、4-アミノフェナゾン、ベンチジン、プルシアンブルーからなる群から選択されることを特徴とする、請求項1 に記載の電気化学バイオセンサ。
前記電子受容体が、ヘキサアンミンルテニウム(III) 塩化物であることを特徴とする、請求項８に記載の電気化学バイオセンサ。
前記水溶性高分子が、前記酵素を分散させて固定化させるために使用され、ポリビニルピロリドン、ポロビニルアルコール、ポリフルオロスルホナート、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、酢酸セルロース、デキストラン又はポリアミドで構成された群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の電気化学バイオセンサ。
前記試料導入通路部と通気部の幅の比が２：１以下であることを特徴とする、請求項１に記載の電気化学バイオセンサ。
前記試料導入部が、0.1 μｌ〜3.0 μｌの容積の試料を充填させることを特徴とする、請求項1 に記載の電気化学バイオセンサ。
前記試料導入通路部と通気部がなす角度が、75〜105 °であり、前記補助空間部が前記試料導入通路部端部に設けられることを特徴とする、請求項1 に記載の電気化学バイオセンサ。
前記粘性率感知電極が、ヘマトクリット値による影響をもとに補正することを特徴とする、請求項４に記載の電気化学バイオセンサ。