JP4018401B2 - Reagent composition - Google Patents

Description

＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
（ただし、Ｒ ^１ 及びＲ ^２ は、互いに独立に水素原子又は炭素数１〜２のアルキル基、Ｒ ^３ は炭素数２〜４のスルホアルキル基又は炭素数２〜４のヒドロキシスルホアルキル基、Ｒ ^４ は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を示す。）
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の試薬組成物中に含まれる、発色系の水素供与体は、３位及び５位のいずれにもアルコキシル基が結合していないアニリン誘導体であり、水素受容体との反応（カップリング反応）により色素を形成するものである。本発明の組成物中に用いられるアニリン誘導体は、上記一般式(I)で示される構造を有するものである。
【００１３】
一般式(I)中、Ｒ^３のスルホアルキル基又はヒドロキシスルホアルキル基におけるアルキル部分は、直鎖状でも分枝状でもよく、また、炭素数は、２〜４である。さらに、Ｒ^４のアルキル基も、直鎖状でも分枝状でもよく、また、炭素数は、１〜３である。一般式(I)で表されるアニリン誘導体のうち、特に好ましいものとして、下記一般式(II)で示される構造を有するN-スルホプロピルアニリン誘導体及び下記一般式(III)で示される構造を有するN-ヒドロキシスルホプロピルアニリン誘導体を挙げることができる。
【００１４】
【化３】

【００１５】
【化４】

（ただし、一般式(II)及び(III)中、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^４は、前記一般式(I)中のＲ^１、Ｒ^２及びＲ^４とそれぞれ同義）
【００１６】
試薬組成物中のアニリン誘導体の濃度は、特に限定されないが、通常、試薬組成物全体の重量を基準にして、０．５〜４．０ｍｍｏｌ／Ｌ程度が好ましく、さらに好ましくは１．０〜３．０ｍｍｏｌ／Ｌ程度である。
【００１７】
本発明の試薬組成物に含まれるアルブミンは、アルブミンであれば何ら限定されるものではなく、血清アルブミン等の市販のアルブミンを用いることができる。アルブミンの起源は何ら限定されるものではなく、特に、広く用いられているウシ血清アルブミンを好適に用いることができる。
【００１８】
試薬組成物中のアルブミンの濃度は、特に限定されないが、通常、試薬組成物全体の重量を基準にして、０．３〜３．０％程度が好ましく、さらに好ましくは０．５〜１．５％程度である。
【００１９】
被検試料中に含まれる測定すべき化合物に酸化酵素を作用させ、それによって生じる過酸化水素と、水素供与体と、水素受容体との反応により色素を形成し、形成された色素を比色定量する１試薬系又は２試薬系の試薬組成物自体は周知であり、また、ＬＤＬコレステロールの選択的定量方法に用いられる試薬組成物であって、被検試料中にＴＧが高濃度に含まれる場合に生じる測定誤差を回避するためにアブルミンをさらに配合した試薬組成物も公知である（特開２００１−２２４３９７）。本発明の試薬組成物は、アルブミンと発色系の水素供与体とを含む試薬組成物において、水素供与体として上記した特定のアニリン誘導体を用いることに特徴があり、他の成分は、公知の試薬組成物と同様でよい。
【００２０】
本発明の試薬組成物は、アルブミンと上記アニリン誘導体とを含有するものであれば、いずれの用途に適用されるものであってもよいが、特開２００１−２２４３９７に記載されている、ＬＤＬコレステロールの定量方法の第１工程に用いられる試薬組成物にとりわけ適している。以下、このＬＤＬコレステロールの定量方法についてさらに説明する。
【００２１】
リポ蛋白に含まれるコレステロールとしては，エステル型コレステロール（コレステロールエステル）及び遊離型コレステロールがある。本明細書において、単に「コレステロール」という場合には、これらの両者を包含する。
【００２２】
本方法に供される被検試料としては、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ等のリポ蛋白を含むかもしれない試料であればいずれのものでもよく、例えば、血液、血清、血漿等の体液やその希釈物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００２３】
本方法は、第１工程及び第２工程から成り、第１工程では被検試料中のＨＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中のコレステロールを消去し、続く第２工程では、被検試料中の残存コレステロールを定量する。第１工程でＨＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中のコレステロールが消去されているので、第２工程で定量されるコレステロールは、主として被検試料中のＬＤＬ中のコレステロールである。
【００２４】
第１工程における「消去」とは、コレステロールを分解し、かつ、その分解産物が次の第２工程で検出されないようにすることを意味する。ＬＤＬ以外のリポ蛋白、すなわち、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ等に含まれるコレステロールを選択的に消去する方法としては以下の方法を挙げることができる。
【００２５】
すなわち、低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下において、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去する。
【００２６】
過酸化水素を消去する方法としては、カタラーゼを作用させて水と酸素に分解する方法、及びペルオキシダーゼを用いて水素供与体と過酸化水素を反応させて無色キノンに転化する方法を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
第１工程の反応液中のコレステロールエステラーゼ濃度は０．２〜１．０Ｕ／ｍＬ程度が好ましく、コレステロールオキシダーゼの濃度は０．１〜 ０．７Ｕ／ｍＬ程度が好ましい。さらに、カタラーゼの濃度は４００〜２０００Ｕ／ｍＬ程度が好ましい。また、過酸化水素を無色キノンへ転化する場合のペルオキシダーゼの濃度は１．０〜６．０Ｕ／ｍＬが好ましく、水素供与体の濃度としては０．５〜４．０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。
【００２８】
第１工程で用いられる、ＬＤＬ以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の好ましい例として、ＨＬＢ値が１３以上１５以下、好ましくは１３以上１４以下であるポリアルキレンオキサイド誘導体を挙げることができる。
【００２９】
ＨＬＢ値が１３以上１５以下のポリアルキレンオキサイド誘導体の好ましい具体例としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等でＨＬＢ値が１３以上１５以下の化合物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００３０】
第１工程で用いられる上記界面活性剤の濃度は、０．１〜１０ｇ／Ｌ程度が好ましく、さらに好ましくは０．５〜５．０ｇ／Ｌ程度である。
【００３１】
第１工程は、ｐＨ５〜９の緩衝液中で行うことが好ましく、緩衝液としてはトリス、トリエタノールアミン、グットの緩衝液等のアミンを含む緩衝液が好ましい。特にグット緩衝液であるＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ及びＰＯＰＳＯが好ましく、緩衝液の濃度は１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ程度が好ましい。
【００３２】
第１工程で、ＬＤＬとの反応を抑え、他のリポ蛋白の消去をさらに高めるために、反応液中に２価の金属イオンを含ませてもよい。２価の金属イオンとしては銅イオン、鉄イオン及びマグネシウムイオンを使用することができるが、特にマグネシウムイオンが好ましい。２価の金属イオンの濃度は５〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ程度が好ましい。
【００３３】
なお、第１工程の反応液中には、任意的に、リポ蛋白分解酵素を加えることもできる。この酵素を加えることにより、特にＶＬＤＬ中のコレステロールが反応しやすくなるので好ましい。この酵素の反応液中濃度は、５．０〜１０．０Ｕ／ｍＬ程度が好ましい。
【００３４】
第１工程の反応温度は３０〜４０℃程度が適当であり、３７℃が最も好ましい。また，反応時間は２〜１０分間程度でよい。
【００３５】
続く第２工程では，被検試料中の残存コレステロールを定量する。これは、例えば、少なくともＬＤＬに作用する界面活性剤を加え、第１工程で加えたコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの作用により生じた過酸化水素を定量することにより行うことができる。
【００３６】
ここで、少なくともＬＤＬに作用する界面活性剤は、ＬＤＬのみに選択的に作用する界面活性剤でもよいし、全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤であってもよい。全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤の好ましい例として、ＨＬＢ値が１１以上１３未満、好ましくは１２以上１３未満であるポリアルキレンオキサイド誘導体を挙げることができる。
【００３７】
また、ＬＤＬのみに選択的に作用する界面活性剤として、陰イオン界面活性剤を挙げることができる。ここで用いられる陰イオン界面活性剤としては、特に限定されないが、芳香環に炭素数４〜１８の直鎖状又は分枝状アルキル基が結合したものを有するものが好ましい。
【００３８】
第２工程で用いられる界面活性剤の濃度は、０．１〜１００ｇ／Ｌ程度が好ましく、さらに好ましくは１〜５０ｇ／Ｌ程度である。
【００３９】
また、第２工程における過酸化水素の定量は、水素供与体と、水素受容体とのカップリング反応により形成される色素を定量することにより行うことができる。水素供与体としては、上記したアニリン誘導体（第１工程に用いる試薬中に含まれる）が用いられ、水素受容体としては、従来と同様、4-アミノアンチピリンやメチルベンゾチアゾロンヒドラゾン等を用いることができる。
【００４０】
第２工程のその他の好ましい条件は、第１工程における好ましい条件と同様である。
【００４１】
従って、本発明の試薬組成物を、上記したＬＤＬコレステロールの定量方法の第１工程を行うための試薬組成物として用いる場合には、上記したアルブミン及びアニリン誘導体の他に、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、ＬＤＬ以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤が少なくとも含まれ、さらに、カタラーゼ、マグネシウム塩や緩衝剤が含まれていてもよい。組成物中のこれらの成分の濃度は、第１工程の反応液中の各成分の濃度が上記の範囲になるように設定することが好ましい。
【００４２】
なお、上記ＬＤＬの定量方法では、上記アニリン誘導体とカップリング反応して色素を形成する上記水素受容体は、第２工程において添加され、第１工程に用いられる試薬組成物中には含まれない。
【００４３】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４４】
実施例１、比較例１
上記したＬＤＬコレステロールの定量方法の第１試薬として用いられる、下記の組成を有する試薬組成物を調製した。
【００４５】
試薬組成
ＰＩＰＥＳ緩衝液，pH７.０ ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ ０．６Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ ０．５Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ ６００U／ｍＬ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤 エマルゲンB-６６（花王社製） ０．２％
ウシ血清アルブミン １．０％
水素供与体＊１ ＊２
（＊１、＊２：実施例１ではN-エチル-N-(2-ヒドロキシ-３-スルホプロピル)-3-メチルアニリン(TOOS)を2.00 mM、比較例１ではN-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン(HDAOS)を0.56 mM）
【００４６】
各組成物の７００ｎｍにおける吸光度を測定した後、各組成物を８℃で１年間保存し、４００〜８００ｎｍにおける吸収スペクトル及び７００ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図１及び表１に示す。
【００４７】
図１に示されるように、比較例１の試薬組成物では発色を示す吸収ピーク（725nmを最大吸収とするピーク）が大きく上昇しているのに対し、実施例１の試薬組成物では、この吸収ピークの上昇が全く認められず、安定であることがわかる。なお、比較例１で水素供与体として用いたHDAOSは、この種の試薬組成物において、発色系の水素供与体として従来から広く用いられている化合物である。また、表１に示されるように、比較例１の試薬組成物では、自動分析装置で使用する副波長７００ｎｍ吸光度が大幅に上昇しているのに対し、実施例１の試薬組成物では、波長７００ｎｍ吸光度の上昇が全く見られなかった。これらより、本発明の試薬組成物では、保存中の自然発色が従来の試薬組成物に比較して大幅に抑制されることが明らかになった。
【００４８】
【表１】
表１ 試薬組成物保存後の測定波長吸光度（７００ｎｍ）への影響

【００４９】
実施例２、比較例２
ＬＤＬコレステロールの定量試薬として用いられる、下記の組成を有する試薬組成物を調製した。
【００５０】
第１試薬
ＰＩＰＥＳ緩衝液，pH７.０ ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ ０．６Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ ０．５Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ ６００U／ｍＬ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤 エマルゲンB-６６ ０．２％
ウシ血清アルブミン １．０％
水素供与体＊１ ＊２
（＊１、＊２：実施例２ではN-エチル-N-(2-ヒドロキシ-３-スルホプロピル)-3-メチルアニリン(TOOS)を2.00 mM、比較例２ではN-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン(HDAOS)を0.56 mM）
【００５１】
第２試薬
４-アミノアンチピリン ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ４．０単位／ｍＬ
アジ化ナトリウム ０．０５％
非イオン界面活性剤 １．０％
（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）
【００５２】
血清試料４μＬに，あらかじめ３７℃に加温した第１試薬３００μＬを混和し，３７℃で５分間反応させた後に，第２試薬１００μＬを加え５分間反応させ，６００ｎｍにおける吸光度を測定した。測定された吸光度から事前に測定していた既知濃度試料の吸光度と比較を行い，ＬＤＬコレステロールを算出した。
【００５３】
各組成物を８℃，１年間保存した後，血清試料中のＬＤＬコレステロールを算出した。対照法として超遠心法による試料中のＬＤＬコレステロールを求めた。超遠心法は「新生化学実験講座第４巻 脂質I 中性脂質とリポ蛋白質」、１８１（１９９３）に記載された方法を用いた。
【００５４】
その結果を表２に示す。表に示されるように比較例２では超遠心法と５％以上乖離するものが数例見られる。これに対し，実施例２ではこのような乖離例は見られず，本発明の試薬組成物を用いたＬＤＬコレステロール測定試薬は正確にＬＤＬコレステロールを定量していることがわかる。
【００５５】
【表２】
表２ 試薬生成物保存後のＬＤＬコレステロール測定値への影響

【００５６】
【発明の効果】
本発明によれば，前記のアニリン誘導体を水素供与体として用いることにより、保存中の自然発色が抑えられ、自動分析装置での吸光度変化への影響が回避され、長期にわたり正確な測定が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の組成物(TOOS)及び比較例１の組成物(HDAOS)を８℃で１年間保存後の吸収スペクトルを示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a reagent composition for forming a dye by the reaction of hydrogen peroxide, a hydrogen donor, and a hydrogen acceptor, and quantifying the formed dye. The reagent composition of the present invention is useful as a reagent for quantifying cholesterol, particularly cholesterol in low-density lipoprotein.
[0002]
[Prior art]
Low density lipoprotein (LDL) plays a major role in cholesterol transport in the blood, and an increase in LDL is known to be one of the risk factors for arteriosclerotic diseases. It is clinically very useful to simply and quantitatively quantify cholesterol in LDL (hereinafter sometimes referred to as “LDL cholesterol”).
[0003]
Conventional methods for quantifying LDL cholesterol include a method for obtaining from two steps of fractionation and cholesterol quantification, and a calculation method based on the Friedewald equation obtained from total cholesterol, HDL cholesterol, and triglyceride values.
[0004]
The fractionation operation includes an ultracentrifugation method, a precipitation method, an immunization method, and the like, but an operation of centrifuging or filtering a sample is necessary, and there are problems in convenience and economy. In addition, the calculation method using the Friedewald equation is limited in its use, and there is a problem in accuracy because it does not take individual differences into account.
[0005]
The present applicant has previously developed an LDL cholesterol quantification method (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-224397) that does not require a fractionation operation, and this method is currently applied in the field of clinical examination. In this method, cholesterol in lipoproteins other than LDL in the sample is selectively eliminated in the presence of abulmin in the first step, and LDL cholesterol is quantified in the second step. According to this quantification method, even when triglyceride (TG) is contained in a high concentration in the test sample by performing the first step in the presence of albumin, the quantification can be performed accurately while avoiding the influence. It can be carried out. Cholesterol is quantified by forming a dye by the reaction of hydrogen peroxide produced by the action of cholesterol oxidase, a hydrogen donor, and a hydrogen acceptor, and quantifying the formed dye. Is called. The reagent composition used in the first step includes a hydrogen donor and albumin at the same time.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
However, there has been a problem that the reagent composition used in the first step of this quantification method, which simultaneously contains a chromogenic hydrogen donor and albumin, gradually develops its color during long-term storage. This color development affects the reaction absorbance depending on the measurement wavelength used. It was also found that this color development consumed a part of the components in the first step, and a sufficient reaction with the test sample could not be obtained. Therefore, avoiding this problem increases the usefulness as a measurement reagent, and the method has been desired. This problem can also be solved by including a hydrogen donor and albumin in separate reagent compositions. However, this increases the number of reagent compositions to be mixed at the time of use, which complicates the operation. This is not preferable because human error is likely to occur. Therefore, it is desired to solve the above problems in a reagent composition containing a hydrogen donor and albumin simultaneously.
[0007]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a reagent composition containing a chromogenic hydrogen donor and albumin at the same time, which can significantly suppress natural color development during long-term storage. .
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of investigating the cause of color development of the reagent composition, the present inventors have found that the coexistence of albumin and an aniline derivative as a hydrogen donor causes color development due to dissolved oxygen in the reaction solution. Specifically, the aniline derivative is gradually oxidized by dissolved oxygen present in the reaction solution, and changes to an oxide in which oxygen is added to the 4-position. This reaction is likely to occur in aniline derivatives having an alkoxyl group at the 3-position and / or 5-position, and this oxidation increases the reactivity at the 2- or 6-position. A substance derived from abulmin binds to this part and causes color development.
[0009]
Therefore, as a result of examining methods for suppressing color development, by using a combination of albumin and a specific aniline derivative in which no alkoxyl group is bonded to any of the 3-position and 5-position, color development during reaction solution storage can be suppressed, As a result, it was confirmed experimentally that the influence on the LDL cholesterol measurement value was avoided and the reagent composition could be stabilized for a long period of time, and the present invention was completed.
[0010]
That is, the present invention provides a reagent composition for forming a dye by reaction of hydrogen peroxide, a hydrogen donor, and a hydrogen acceptor, and quantifying the formed dye, comprising at least the hydrogen donor and And a reagent composition containing albumin at the same time, wherein the hydrogen donor is an aniline derivative having a structure represented by the following general formula (I) .
[Chemical 2]

_______________
(However, R ¹ and R ² are each independently a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 2 carbon atoms, R ³ is a sulfoalkyl group having 2 to 4 carbon atoms or a hydroxysulfoalkyl group having 2 to 4 carbon atoms, R ⁴ represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.)
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The chromogenic hydrogen donor contained in the reagent composition of the present invention is an aniline derivative having no alkoxyl group bonded to any of the 3-position and 5-position, and reacts with a hydrogen acceptor (coupling reaction). ) To form a pigment. Aniline derivatives used in the compositions of the present invention, Ru der those having a structure represented by the above following general formula (I).
[0013]
In the formula (I), the alkyl moiety in sulfoalkyl group or a hydroxyalkyl sulfoalkyl group R ³ may be a branched be linear, The number of carbon atoms is 2-4. Furthermore, the alkyl group of R ⁴ may be linear or branched, and has 1 to 3 carbon atoms. Among the aniline derivatives represented by the general formula (I), particularly preferred are N-sulfopropylaniline derivatives having a structure represented by the following general formula (II) and a structure represented by the following general formula (III). Mention may be made of N-hydroxysulfopropylaniline derivatives.
[0014]
[Chemical 3]

[0015]
[Formula 4]

(However, the general formula (II) and ^(III), R 1, ^{R 2,} and ^{R 4, R} 1, same meanings as ^{R 2} and ^{R 4} in the general formula (I))
[0016]
The concentration of the aniline derivative in the reagent composition is not particularly limited, but is usually preferably about 0.5 to 4.0 mmol / L, more preferably 1.0 to 3 based on the weight of the whole reagent composition. About 0.0 mmol / L.
[0017]
The albumin contained in the reagent composition of the present invention is not limited as long as it is albumin, and commercially available albumin such as serum albumin can be used. The origin of albumin is not limited at all, and bovine serum albumin that is widely used can be particularly preferably used.
[0018]
The concentration of albumin in the reagent composition is not particularly limited, but is usually preferably about 0.3 to 3.0%, more preferably 0.5 to 1.5, based on the weight of the whole reagent composition. %.
[0019]
An oxidase is allowed to act on a compound to be measured contained in a test sample, and a dye is formed by the reaction of hydrogen peroxide, a hydrogen donor, and a hydrogen acceptor generated thereby, and the formed dye is colorimetrically. The reagent composition itself for quantification is well known, and is a reagent composition used for the selective quantification method of LDL cholesterol, and TG is contained in the test sample at a high concentration. In order to avoid measurement errors occurring in some cases, a reagent composition further blended with abulmin is also known (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-22497). The reagent composition of the present invention is characterized in that the above-mentioned specific aniline derivative is used as a hydrogen donor in a reagent composition containing albumin and a chromogenic hydrogen donor, and other components are known reagents. It may be the same as the composition.
[0020]
The reagent composition of the present invention may be applied to any use as long as it contains albumin and the above aniline derivative. However, LDL cholesterol described in JP-A-2001-22497 It is particularly suitable for the reagent composition used in the first step of the quantitative method. Hereinafter, this LDL cholesterol determination method will be further described.
[0021]
As cholesterol contained in lipoprotein, there are ester-type cholesterol (cholesterol ester) and free-type cholesterol. In the present specification, the term “cholesterol” includes both of them.
[0022]
The test sample used in this method may be any sample that may contain lipoproteins such as HDL, LDL, VLDL and CM, for example, body fluids such as blood, serum, plasma, and the like Although a dilution can be mentioned, it is not limited to these.
[0023]
This method comprises a first step and a second step. In the first step, cholesterol in HDL, VLDL and CM in the test sample is eliminated, and in the subsequent second step, the residual cholesterol in the test sample is quantified. To do. Since cholesterol in HDL, VLDL and CM is erased in the first step, cholesterol quantified in the second step is mainly cholesterol in LDL in the test sample.
[0024]
“Elimination” in the first step means degrading cholesterol and preventing the degradation product from being detected in the next second step. Examples of a method for selectively eliminating cholesterol contained in lipoproteins other than LDL, that is, HDL, VLDL, CM, and the like include the following methods.
[0025]
That is, cholesterol esterase and cholesterol oxidase are allowed to act in the presence of a surfactant that acts on lipoproteins other than low-density lipoprotein, thereby eliminating the generated hydrogen peroxide.
[0026]
Examples of the method for eliminating hydrogen peroxide include a method in which catalase is allowed to act to decompose into water and oxygen, and a method in which a hydrogen donor is reacted with hydrogen peroxide using peroxidase to convert it into colorless quinone. However, it is not limited to these.
[0027]
The cholesterol esterase concentration in the reaction solution in the first step is preferably about 0.2 to 1.0 U / mL, and the concentration of cholesterol oxidase is preferably about 0.1 to 0.7 U / mL. Furthermore, the concentration of catalase is preferably about 400 to 2000 U / mL. In addition, the concentration of peroxidase when converting hydrogen peroxide to colorless quinone is preferably 1.0 to 6.0 U / mL, and the concentration of hydrogen donor is preferably 0.5 to 4.0 mmol / L.
[0028]
Preferable examples of the surfactant that acts on lipoproteins other than LDL used in the first step include polyalkylene oxide derivatives having an HLB value of 13 to 15, preferably 13 to 14.
[0029]
Preferable specific examples of polyalkylene oxide derivatives having an HLB value of 13 to 15 include polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene cetyl ether, polyoxyethylene oleyl ether, polyoxyethylene higher alcohol ether, polyoxyethylene octyl phenyl ether. Examples thereof include compounds having an HLB value of 13 or more and 15 or less, such as polyoxyethylene nonylphenyl ether, but are not limited thereto.
[0030]
The concentration of the surfactant used in the first step is preferably about 0.1 to 10 g / L, more preferably about 0.5 to 5.0 g / L.
[0031]
The first step is preferably performed in a buffer solution having a pH of 5 to 9, and the buffer solution is preferably a buffer solution containing an amine such as Tris, triethanolamine or Gut's buffer solution. In particular, Bis-Tris, PIPES, MOPSO, BES, HEPES and POPSO which are good buffer solutions are preferable, and the concentration of the buffer solution is preferably about 10 to 500 mmol / L.
[0032]
In the first step, a divalent metal ion may be included in the reaction solution in order to suppress the reaction with LDL and further enhance elimination of other lipoproteins. Copper ions, iron ions, and magnesium ions can be used as the divalent metal ions, but magnesium ions are particularly preferable. The concentration of the divalent metal ion is preferably about 5 to 200 mmol / L.
[0033]
In addition, lipoproteinase can be optionally added to the reaction solution in the first step. It is preferable to add this enzyme because cholesterol in VLDL is particularly easily reacted. The concentration of the enzyme in the reaction solution is preferably about 5.0 to 10.0 U / mL.
[0034]
The reaction temperature in the first step is suitably about 30-40 ° C, most preferably 37 ° C. The reaction time may be about 2 to 10 minutes.
[0035]
In the subsequent second step, the residual cholesterol in the test sample is quantified. This can be performed, for example, by adding at least a surfactant that acts on LDL and quantifying hydrogen peroxide generated by the action of cholesterol esterase and cholesterol oxidase added in the first step.
[0036]
Here, the surfactant that acts at least on LDL may be a surfactant that acts selectively only on LDL, or a surfactant that acts on all lipoproteins. Preferable examples of surfactants that act on all lipoproteins include polyalkylene oxide derivatives having an HLB value of 11 or more and less than 13, preferably 12 or more and less than 13.
[0037]
Moreover, an anionic surfactant can be mentioned as surfactant which acts selectively only on LDL. Although it does not specifically limit as an anionic surfactant used here, The thing which has a C4-C18 linear or branched alkyl group couple | bonded with the aromatic ring is preferable.
[0038]
The concentration of the surfactant used in the second step is preferably about 0.1 to 100 g / L, more preferably about 1 to 50 g / L.
[0039]
The hydrogen peroxide in the second step can be quantified by quantifying the dye formed by the coupling reaction between the hydrogen donor and the hydrogen acceptor. As the hydrogen donor, the above-mentioned aniline derivative (included in the reagent used in the first step) is used, and as the hydrogen acceptor, 4-aminoantipyrine, methylbenzothiazolone hydrazone, etc. are used as in the conventional case. Can do.
[0040]
Other preferable conditions in the second step are the same as the preferable conditions in the first step.
[0041]
Therefore, when the reagent composition of the present invention is used as a reagent composition for performing the first step of the LDL cholesterol quantification method described above, in addition to the above-mentioned albumin and aniline derivative, cholesterol oxidase, cholesterol esterase, A surfactant that acts on lipoproteins other than LDL is included, and a catalase, a magnesium salt, and a buffer may be further included. The concentration of these components in the composition is preferably set so that the concentration of each component in the reaction solution in the first step falls within the above range.
[0042]
In the LDL quantification method, the hydrogen acceptor that forms a dye by coupling reaction with the aniline derivative is added in the second step and is not included in the reagent composition used in the first step. .
[0043]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
[0044]
Example 1 and Comparative Example 1
A reagent composition having the following composition to be used as the first reagent in the LDL cholesterol quantification method described above was prepared.
[0045]
Reagent composition PIPES buffer, pH 7.0 50 mmol / L
Cholesterol esterase 0.6 U / mL
Cholesterol oxidase 0.5 U / mL
Catalase 600U / mL
Magnesium chloride 10mmol / L
Surfactant Emulgen B-66 (Kao Corporation) 0.2%
Bovine serum albumin 1.0%
Hydrogen donor * 1 * 2
(* 1, * 2: In Example 1, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methylaniline (TOOS) was 2.00 mM, and in Comparative Example 1, N- (2-hydroxy- 3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (HDAOS) 0.56 mM)
[0046]
After measuring the absorbance at 700 nm of each composition, each composition was stored at 8 ° C. for 1 year, and the absorption spectrum at 400 to 800 nm and the absorbance at 700 nm were measured. The results are shown in FIG.
[0047]
As shown in FIG. 1, in the reagent composition of Comparative Example 1, the absorption peak showing color development (peak with the maximum absorption at 725 nm) is greatly increased, whereas in the reagent composition of Example 1, this is not the case. It can be seen that the absorption peak is not increased at all and is stable. HDAOS used as a hydrogen donor in Comparative Example 1 is a compound that has been widely used as a color-forming hydrogen donor in this type of reagent composition. Further, as shown in Table 1, in the reagent composition of Comparative Example 1, the absorbance at the sub-wavelength of 700 nm used in the automatic analyzer is significantly increased, whereas in the reagent composition of Example 1, the wavelength is increased. No increase in absorbance at 700 nm was observed. From these results, it has been clarified that the natural color development during storage is significantly suppressed in the reagent composition of the present invention as compared with the conventional reagent composition.
[0048]
[Table 1]
Table 1 Effect on measured wavelength absorbance (700 nm) after storage of reagent composition

[0049]
Example 2 and Comparative Example 2
A reagent composition having the following composition to be used as a quantitative reagent for LDL cholesterol was prepared.
[0050]
First reagent PIPES buffer, pH 7.0 50 mmol / L
Cholesterol esterase 0.6 U / mL
Cholesterol oxidase 0.5 U / mL
Catalase 600U / mL
Magnesium chloride 10mmol / L
Surfactant Emulgen B-66 0.2%
Bovine serum albumin 1.0%
Hydrogen donor * 1 * 2
(* 1, * 2: In Example 2, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methylaniline (TOOS) was 2.00 mM, and in Comparative Example 2, N- (2-hydroxy- 3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (HDAOS) 0.56 mM)
[0051]
Second reagent 4-aminoantipyrine 4.0 mmol / L
Peroxidase 4.0 units / mL
Sodium azide 0.05%
Nonionic surfactant 1.0%
(Polyoxyethylene alkyl phenyl ether)
[0052]
300 μL of the first reagent preliminarily heated to 37 ° C. was mixed with 4 μL of the serum sample, reacted at 37 ° C. for 5 minutes, then added with 100 μL of the second reagent, reacted for 5 minutes, and the absorbance at 600 nm was measured. The LDL cholesterol was calculated by comparing the measured absorbance with the absorbance of a sample of a known concentration that had been measured in advance.
[0053]
After each composition was stored at 8 ° C. for 1 year, LDL cholesterol in the serum sample was calculated. As a control method, LDL cholesterol in the sample was obtained by ultracentrifugation. The ultracentrifugation method used was the method described in “Seminar of Experimental Chemistry Vol. 4, Lipid I, Neutral Lipids and Lipoproteins”, 181 (1993).
[0054]
The results are shown in Table 2. As shown in the table, in Comparative Example 2, there are several examples that deviate 5% or more from the ultracentrifugation method. On the other hand, in Example 2, such a divergence example is not seen, and it turns out that the LDL cholesterol measuring reagent using the reagent composition of the present invention accurately quantifies LDL cholesterol.
[0055]
[Table 2]
Table 2 Effect on LDL cholesterol measurement after storage of reagent product

[0056]
【The invention's effect】
According to the present invention, by using the aniline derivative as a hydrogen donor, natural color development during storage can be suppressed, the influence on the absorbance change in the automatic analyzer can be avoided, and accurate measurement can be performed over a long period of time. Become.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows absorption spectra of the composition of Example 1 (TOOS) and the composition of Comparative Example 1 (HDAOS) after storage at 8 ° C. for 1 year.

Claims (2)

A reagent composition for forming a dye by reaction of hydrogen peroxide, a hydrogen donor and a hydrogen acceptor, and quantifying the formed dye, comprising at least the hydrogen donor and albumin simultaneously In the reagent composition, the hydrogen donor is an aniline derivative having a structure represented by the following general formula (I):

_______________
(However, R ¹ and R ² are each independently a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 2 carbon atoms, R ³ is a sulfoalkyl group having 2 to 4 carbon atoms or a hydroxysulfoalkyl group having 2 to 4 carbon atoms, R ⁴ represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.)   The composition according to claim 1, which is used for a method for quantifying cholesterol in low-density lipoprotein.

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