JP4029609B2 - Biological component measurement method and reagent kit used therefor - Google Patents

Description

【０００７】
しかしながら、D. SchomburgおよびD. Stephan編, 「酵素ハンドブック９（Enzyme Handbook 9）」（Springer-Verlag）には、本酵素は、基質としてメタノールを酸化するのみならず、その生成物であるホルムアルデヒドをも酸化することが記載されている。ホルムアルデヒドは水溶液中では水和して存在し、アルコールの状態で存在するので、アルコールデヒドロデナーゼの被酸化基質となり、一部は酢酸まで酸化されて反応系の外に放出されてしまう。したがって、この酵素を用いてのホルムアルデヒドの高感度測定は成り立たない。
【０００８】
また、グルタチオン非依存性のホルムアルデヒド脱水素酵素等のアルデヒド脱水素酵素は非可逆的にホルムアルデヒドを酸化するので、同様にサイクリング反応による高感度測定には適用できない。
【０００９】
一方、分析科学の分野において、ホルムアルデヒドを中間生成物として経由して測定できる化合物があることが知られている。中でも有用なものとして、臨床検査におけるクレアチニン、クレアチンおよびホモシステイン等の測定が挙げられる。
【００１０】
クレアチニンは臨床検査において腎機能の主要な診断マーカーである。また、クレアチンの測定は、筋ジストロフィー症、甲状腺機能亢進症などの病態解析に用いられる。これらの測定法としてはＪａｆｆｅ法が主流であるが、特異性に関する問題点の指摘があった。最近は、基質特異性の高いクレアチニンアミドハイドロラ−ゼ、クレアチンアミジノハイドロラーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼを用いた酵素法も増加しているが、生体内に存在する還元物質の影響を受ける可能性の指摘があった。また、酵素法においてペルオキシダーゼの代わりにグルタチオン非依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素を用いて、サルコシンオキシダーゼ反応により生成するホルムアルデヒドを上記方法にて分析する方法も報告されているが（Clin. Clim. Acta, 122, 181 (1982), Ann. Clin. Biochem., 29, 523 (1992)）、上述のように、微量の測定には必ずしも十分ではなかった。
【００１１】
ホモシステインは、生体内では必須アミノ酸であるメチオニンが代謝を受けて生成されるＳＨ基を有するアミノ酸であるが、シスタチオニンβ−シンターゼによってさらに代謝されるため、通常は低濃度で生体内に存在する。血中ホモシステイン濃度の上昇をもたらすこれら代謝酵素の遺伝疾患であるホモシスチン尿症が動脈硬化症と関連のあることが知られており、近年では、正常値より若干高いレベルのホモシステイン濃度においても脳梗塞、心筋梗塞、深部静脈血栓症（いわゆるエコノミークラス症候群）と関連付けられることが明らかにされたことから、現在では、血中ホモシステイン濃度がこれら疾患の独立した危険因子として注目されている。
【００１２】
ホモシステインの測定法は、これまでＨＰＬＣを用いた方法が標準法として用いられており（Clin. Chem., 39, 1590 (1993)）、種々の改良法も報告されているが、ＨＰＬＣを用いる方法では、精巧な分析装置を必要とする上、多量の検体を扱うには不適であるという欠点がある。ＨＰＬＣによる分離を要しない方法としては、ホモシステインをアデノシン、フルオレセイン標識Ｓ−アデノシルホモシステイン存在下でＳ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素と反応させ、反応系に存在するＳ−アデノシルホモシステインを、抗Ｓ−アデノシルホモシステイン抗体を用いて蛍光偏向イムノアッセイにより計測することで、ホモシステインを測定する方法（特表平８−５０６４７８号公報）などが知られている。また最近、酵素法として、ホモシステインをホモシステインデスルフラーゼで反応させ、生成するアンモニア、α−ケト酸または硫化水素を測定する方法（特表２０００−５０２２６２号公報）、ホモシステインに対して分解作用を有するＬ−メチオニンγ−リアーゼやｏ−アセチルホモセリン−リアーゼを用いて、チオール化合物の存在下で生成する硫化水素またはチオール化合物置換ホモシステインを測定する方法（特開２０００−１６６５９７号公報）、ホモシステインのγ位メルカプト基と置換可能な求核試薬の存在下、γ−置換−α−アミノ酪酸合成酵素によりホモシステインから生成する、γ−置換−α−アミノ酪酸または硫化水素を定量する方法（特開２０００−２２８９９８号公報）なども報告されている。
【００１３】
しかし、イムノアッセイ法でも、一般の生化学検査に比べて時間、費用を要することが知られており、短時間に多数の検体を安価に分析するのには好適とはいえない。また、従来の酵素反応を用いた分析法では、一般に血中ホモシステイン量が正常値で１０μＭ程度若しくはそれ以下と微量であるため測定感度が不足していたり、あるいは使用する酵素の基質特異性により、検体中のホモシステイン以外の物質に作用するなどの点で、正確なホモシステイン量の測定には十分であるとは言えない。
【００１４】
服部と川村（特開２００１−１７１９８）は、ホモシステインと他の物質とを基質とする転移酵素を、当該他の基質とともにホモシステインを含む試料に作用させて、生成する化合物を測定することにより、ホモシステインをより高感度且つ高精度に測定できることを開示している。特に、転移酵素としてベタイン−ホモシステインメチル転移酵素、および他の基質としてベタインを使用し、生成するジメチルグリシンを、ジメチルグリシンオキシダーゼを用いて更にサルコシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素にまで分解し、これらの化合物のいずれかを測定することにより、ホモシステインを特に高感度且つ高精度に測定できることが記載されている。しかしながら、生体試料において、ホモシステインの多くは、ジスルフィド結合により蛋白質やチオール基を有する他のアミノ酸と結合した状態で存在するため、総ホモシステインの測定は還元条件下で行う必要があるが、還元条件下で十分に安定なジメチルグリシンオキシダーゼはこれまでに報告されておらず、したがって、かかる条件下では試薬性能の低下を引き起こす可能性があった。
【００１５】
一方、酵素サイクリング法を利用したホモシステイン測定法として、シスタチオニンβ−シンターゼとシスタチオニンβ−リアーゼにより生成するピルビン酸、アンモニアを測定する方法（ＵＳ６１７４６９６）、ホモシステインデスルフラーゼと２−ケト酪酸脱水素酵素を用いて、生成されるＮＡＤ類または消費されるチオＮＡＤ類を分析する方法（特開２００１−１６１３９９，特開２００１−１４９０９２）などが知られているが、生体内でのホモシステイン量を考慮すると更に高感度で測定できる方法が望ましい。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の第１の目的は、ホルムアルデヒド、または測定系における反応中間体としてホルムアルデヒドが生成する、ホモシステイン、クレアチニン、クレアチン等の化合物の、高感度且つ簡便な測定手段を提供することである。また、本発明の第２の目的は、ＨＰＬＣやイムノアッセイを用いずに、高感度且つ簡便にホモシステインを測定する手段を提供することである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の第１の課題を解決すべく、酵素サイクリング法を用いたホルムアルデヒドの高感度測定法の確立を目標とした。そこでまず、当該方法に使用し得る酵素として、ホルムアルデヒドに可逆的に作用するグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素（EC 1.2.1.1）に着目して、鋭意研究を重ねた結果、２種類の異なる酸化還元物質を補酵素として利用することができ、且つ両者に対する反応性のバランスがサイクリング反応の進行を可能ならしめるものである、新規なグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素をスクリーニングすることに成功した。さらに、この酵素を、グルタチオン、酸化型の補酵素および還元型の他の補酵素とともに試料に作用させ、該酵素反応によるいずれかの補酵素量の変化を測定することにより、ホルムアルデヒド、並びに反応中間体としてホルムアルデヒドを生成するホモシステインやクレアチニン、クレアチン等を、高感度且つ簡便に測定できることを確認した。
【００１８】
一方で、本発明者らは、上記の第２の課題を解決する手段として、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素とジメチルグリシンオキシダーゼを用いる測定系に着目し、当該測定系における使用に適した特性を有するジメチルグリシンオキシダーゼを鋭意探索した結果、チオール化合物に対して耐性であり、且つ従来の酵素に比べてジメチルグリシンに対するＫ_m値の小さい、新規なジメチルグリシンオキシダーゼを単離精製することに成功した。さらに、本酵素を上記測定系に適用したところ、ホモシステインをさらに高感度且つ高精度に測定できることを確認して、本発明を完成するに至った。
【００１９】
即ち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）ＮＡＤに対する反応性に対してのチオＮＡＤに対する反応性の比が３０％以上、好ましくは６０％以上であるグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素、グルタチオンおよび酸化型補酵素を試料に接触させ、該酵素反応より生成した化合物を分析することを特徴とするホルムアルデヒドの測定方法。
（２）グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素が、さらに以下の理化学的性質を有するものである、上記（１）のホルムアルデヒドの測定方法。
(a) 作用：ＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、チオＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる１つの酸化型補酵素および還元型グルタチオンの存在下にホルムアルデヒドに作用して、Ｓ−ホルミルグルタチオンおよび還元型補酵素を生成する。
(b) 至適ｐＨ：約７．５〜約８．５
(c) ｐＨ安定性：約６．０〜約９．０
(d) 熱安定性：約４０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間処理）
（３）グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素が、微生物、好ましくはメタノール資化性酵母、より好ましくはハンゼヌラ（Hansenula）属に属する酵母、就中ハンゼヌラ・ノンファーメンタンス（Hansenula nonfermentans）ＩＦＯ１４７３株由来である、上記（１）または（２）のホルムアルデヒドの測定方法。
（４）ＮＡＤに対する反応性に対してのチオＮＡＤに対する反応性の比が３０％以上であるグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素、グルタチオン、チオＮＡＤ類およびチオＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる１つの化合物、並びに還元型ＮＡＤ類および還元型ＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの化合物を試料に接触させて、サイクリング反応を行わせしめ、該反応により変化した化合物の量を分析することを特徴とする、ホルムアルデヒドの測定方法。
（５）ＮＡＤに対する反応性に対してのチオＮＡＤに対する反応性の比が３０％以上であるグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素、グルタチオン、還元型チオＮＡＤ類および還元型チオＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの化合物、並びにＮＡＤ類およびＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの化合物を試料に接触させて、サイクリング反応を行わせしめ、該反応により変化した化合物の量を分析することを特徴とする、ホルムアルデヒドの測定方法。
（６）生成した還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類化合物の量を分析することを特徴とする、上記（４）のホルムアルデヒドの測定方法。
（７）ホルムアルデヒドの最低検出感度が１μｍｏｌ／Ｌ以下である、上記（４）〜（６）のいずれかのホルムアルデヒドの測定方法。
（８）反応中間体としてホルムアルデヒドを生成する生体成分の測定方法において、生成したホルムアルデヒドを上記（１）〜（７）のいずれかの方法により分析することを特徴とする、該生体成分の測定方法。
（９）ベタイン、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素、ジメチルグリシンオキシダーゼおよび必要に応じてサルコシンオキシダーゼを試料に接触させ、該酵素反応により生成したホルムアルデヒドを、上記（１）〜（７）のいずれかの方法により測定することを特徴とする、ホモシステインの測定方法。
（１０）クレアチンアミジノハイドロラーゼ、サルコシンオキシダーゼ、および必要に応じてクレアチニンアミドハイドロラーゼを作用させ、該酵素反応により生成したホルムアルデヒドを上記（１）〜（７）のいずれか方法により測定することを特徴とする、クレアチンまたはクレアチニンの測定方法。
（１１）ベタイン、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素、チオール化合物に対し安定なジメチルグリシンオキシダーゼおよび必要に応じてサルコシンオキシダーゼを試料に接触させ、該酵素反応により生成した過酸化水素を、ペルオキシダーゼ存在下、酸化系発色試薬および必要に応じてカップラーと反応させ、生成する色素を測定することを特徴とする、ホモシステインの測定方法。
（１２）ベタイン、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素、チオール化合物に対し安定なジメチルグリシンオキシダーゼおよび必要に応じてサルコシンオキシダーゼを試料に接触させ、該酵素反応により生成したホルムアルデヒドを、ホルムアルデヒド脱水素酵素および酸化型補酵素と反応させ、生成する還元型補酵素を測定することを特徴とする、ホモシステインの測定方法。
（１３）ベタイン、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素、チオール化合物に対し安定なジメチルグリシンオキシダーゼおよび必要に応じてサルコシンオキシダーゼを試料に接触させ、該酵素反応により生成したホルムアルデヒドを、グルタチオン、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素および酸化型補酵素と反応させ、生成する還元型補酵素を測定することを特徴とする、ホモシステインの測定方法。
（１４）チオール化合物が、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエタンスルホン酸、２−メルカプトエチルアミン、システイン、ホモシステイン、Ｎ−アセチルシステイン、チオグリセロール、チオグリコール酸、還元型グルタチオンまたはこれらの塩から選択される少なくとも１種、好ましくはジチオスレイトールであり、より好ましくは、ジチオスレイトール非存在下に対し、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール存在下で、少なくとも５０％酵素活性が保持されるジメチルグリシンオキシダーゼを用いることを特徴とする、上記（１１）〜（１３）のいずれかのホモシステインの測定方法。
（１５）ジメチルグリシンオキシダーゼが、さらに以下の理化学的性質を有する酵素である、上記（１１）〜（１４）のいずれかのホモシステインの測定方法。
(a) 作用：酸素の存在下にジメチルグリシンに作用して，サルコシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を生成する。
(b) ジメチルグリシンに対するＫ_m値：１５ｍＭ以下
（１６）ジメチルグリシンオキシダーゼが、微生物、好ましくはアルスロバクター属（Arthrobacter）またはストレプトマイセス属（Streptomyces）に属する微生物、より好ましくはアルスロバクター・ニコチアナエ（Arthrobacter nicotianae）ＩＦＯ１４２３４株またはストレプトマイセス・ミュータビリス（Streptomyces mutabilis）ＩＦＯ１２８００株由来である、上記（１１）〜（１５）のいずれかのホモシステインの測定方法。
（１７）ホモシステインの最低検出感度が１μｍｏｌ／Ｌ以下である、上記（１３）〜（１６）のいずれかのホモシステインの測定方法。
（１８）以下の理化学的性質を有するグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素。
(a) 作用：ＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、チオＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる１つの補酵素、還元型グルタチオンの存在下にホルムアルデヒドに作用して、Ｓ−ホルミルグルタチオン、還元型補酵素を生成する。
(b) ＮＡＤに対する反応性に対してのチオＮＡＤに対する反応性の比が３０％以上である。
(c) 至適ｐＨ：約７．５〜約８．５
(d) ｐＨ安定性：約６．０〜約９．０
(e) 熱安定性：約４０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間処理）
（１９）微生物、好ましくはメタノール資化性酵母、より好ましくはハンゼヌラ属に属する酵母、就中ハンゼヌラ・ノンファーメンタンスＩＦＯ１４７３株由来である、上記（１８）のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素。
（２０）以下の理化学的性質を有するジメチルグリシンオキシダーゼ。
(a) 作用：酸素の存在下にジメチルグリシンに作用して，サルコシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を生成する。
(b) ジチオスレイトール非存在下に対し、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール存在下で、少なくとも５０％酵素活性が保持される。
(c) ジメチルグリシンに対するＫ_m値：１５ｍＭ以下
（２１）微生物、好ましくはアルスロバクター属またはストレプトマイセス属に属する微生物、より好ましくはアルスロバクター・ニコチアナエＩＦＯ１４２３４株またはストレプトマイセス・ミュータビリスＩＦＯ１２８００株由来である、上記（２０）のジメチルグリシンオキシダーゼ。
（２２）緩衝液、グルタチオン、ＮＡＤに対する反応性に対してのチオＮＡＤに対する反応性の比が３０％以上であるグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素、および該酵素反応により生成する化合物を分析するための試薬を少なくとも含有してなることを特徴とするホルムアルデヒド測定用試薬キット。
（２３）緩衝液、グルタチオン、ＮＡＤに対する反応性に対してのチオＮＡＤに対する反応性の比が３０％以上であるグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素、チオＮＡＤ類およびチオＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの化合物、並びに還元型ＮＡＤ類および還元型ＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの化合物を少なくとも含有してなることを特徴とするホルムアルデヒド測定用試薬キット。
（２４）緩衝液、グルタチオン、ＮＡＤに対する反応性に対してのチオＮＡＤに対する反応性の比が３０％以上であるグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素、還元型チオＮＡＤ類および還元型チオＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの化合物、並びにＮＡＤ類およびＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの化合物を少なくとも含有してなることを特徴とするホルムアルデヒド測定用試薬キット。
（２５）グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素が、上記（１８）または（１９）の酵素である、上記（２２）〜（２４）のいずれかのホルムアルデヒド測定用試薬キット。
（２６）上記（２２）〜（２５）のいずれかに記載の試薬に加えて、ベタイン、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素、ジメチルグリシンオキシダーゼおよび必要に応じてサルコシンオキシダーゼを更に含有してなることを特徴とする、ホモシステイン測定用試薬キット。
（２７）上記（２２）〜（２５）のいずれかに記載の試薬に加えて、クレアチンアミジノハイドロラーゼ、サルコシンオキシダーゼおよび必要に応じてクレアチニンアミドハイドロラーゼを更に含有してなることを特徴とする、クレアチニンまたはクレアチン測定用試薬キット。
（２８）緩衝液、ベタイン、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素、チオール化合物に対し安定なジメチルグリシンオキシダーゼおよび必要に応じてサルコシンオキシダーゼ、並びに該酵素反応により生成した過酸化水素を測定するための試薬を含有してなることを特徴とする、ホモシステイン測定用試薬キット。
（２９）過酸化水素を測定するための試薬として、ペルオキシダーゼ、酸化系発色試薬および必要に応じてカップラーを含有することを特徴とする、上記（２８）のホモシステイン測定用試薬キット。
（３０）緩衝液、ベタイン、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素、チオール化合物に対し安定なジメチルグリシンオキシダーゼおよび必要に応じてサルコシンオキシダーゼ、並びに該酵素反応により生成したホルムアルデヒドを測定するための試薬を含有してなることを特徴とする、ホモシステイン測定用試薬キット。
（３１）ホルムアルデヒドを測定するための試薬として、ホルムアルデヒド脱水素酵素および酸化型補酵素を含有することを特徴とする、上記（３０）のホモシステイン測定用試薬キット。
（３２）ホルムアルデヒドを測定するための試薬として、グルタチオン、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素および酸化型補酵素を含有することを特徴とする、上記（３０）のホモシステイン測定用試薬キット。
（３３）ジメチルグリシンオキシダーゼが、上記（２０）または（２１）のいずれかの酵素である、上記（２８）〜（３２）のいずれかのホモシステイン測定用試薬キット。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明のホルムアルデヒドの測定方法は、チオＮＡＤ類もしくはチオＮＡＤＰ類、およびＮＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類の２種類の補酵素を利用でき、且つＮＡＤに対する反応性に対するチオＮＡＤに対する反応性の比が従来公知のものに比べて高い新規グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素を、グルタチオンおよび上記いずれかの酸化型補酵素とともに試料に作用させ、生成もしくは消費されるいずれかの化合物の量を測定することを特徴とする。
【００２１】
本発明において使用されるグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素（EC 1.2.1.1）は、正確には、酸化型補酵素の存在下、グルタチオンとホルムアルデヒドより非酵素的に生成するＳ−ヒドロキシメチルグルタチオンを基質として、Ｓ−ホルミルグルタチオンと還元型補酵素の生成を可逆的に触媒する酵素である。
【００２２】
本発明におけるグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素は、補酵素として、チオＮＡＤ類もしくはチオＮＡＤＰ類、およびＮＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類を利用することができる。ＮＡＤ類としては、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド、アセチルピリジンアデニンヒポキサンチンジヌクレオチド、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドなどが、ＮＡＤＰ類としては、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドリン酸、アセチルピリジンアデニンヒポキサンチンジヌクレオチドリン酸、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドリン酸などが例示される。また、チオＮＡＤ類としては、例えば、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドなどが、チオＮＡＤＰ類としては、例えば、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドリン酸などが具体例として挙げられる。
【００２３】
好ましい実施態様においては、本発明のホルムアルデヒドの測定方法は、グルタチオン、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素、チオＮＡＤ類およびチオＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる１つの化合物、並びに還元型ＮＡＤ類および還元型ＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの化合物を試料に作用させて、サイクリング反応を行わせしめ、該反応より変化した化合物の量を分析することを特徴とする。
【００２４】
別の好ましい実施態様においては、本発明のホルムアルデヒドの測定方法は、グルタチオン、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素、還元型チオＮＡＤ類および還元型チオＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの化合物、並びにＮＡＤ類およびＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの化合物を試料に作用させて、サイクリング反応を行わせしめ、該反応より変化した化合物の量を分析することを特徴とする。
【００２５】
該サイクリング反応では、酸化型補酵素から還元型補酵素、若しくは還元型補酵素から酸化型補酵素の生成が反応時間に比例して、基質の量に対して増幅して生成されることから、補酵素がＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類の場合は３４０ｎｍ付近の吸光度を、チオＮＡＤ類、チオＮＡＤＰ類の場合は４００ｎｍ付近の吸光度を測定することで、ホルムアルデヒドを高感度に定量することができる。該サイクリング反応に用いるグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素としては、ホルムアルデヒドを分解してサイクリング反応系外に放出するような夾雑酵素（例えば、Ｓ−ホルミルグルタチオンハイドロラーゼ等）を含まないか、測定値に影響を与えない程度に含量が低いことが望ましい。またＮＡＤ（Ｐ）分解酵素についても全く含まないか、測定値に影響を与えない程度に含量が低いことが望ましい。
【００２６】
該サイクリング反応を効率的に行わせしめるためには、本発明で使用するグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素は、チオＮＡＤ類もしくはチオＮＡＤＰ類に対して十分な反応性を有する必要がある。具体的には、ＮＡＤに対する反応性に対してのチオＮＡＤに対する反応性の比が３０％以上であり、好ましくは６０％以上である。さらに、酸化型補酵素としてチオＮＡＤ（Ｐ）類を用いる場合、逆反応において、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素は、正反応により生成する還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類に対する反応性に対して、添加される還元型ＮＡＤ（Ｐ）類に対する反応性が十分に高いものである。一方、酸化型補酵素としてＮＡＤ（Ｐ）類を用いる場合、逆反応において、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素は、正反応により生成する還元型ＮＡＤ（Ｐ）類に対する反応性に対して、添加される還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類に対する反応性が十分に高いものである。グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素は高等動物から微生物まで広く存在することが知られており、チオＮＡＤに対して比較的高い作用性を有する該酵素としてはヒト肝臓由来のものが報告されているが（Biochem. J., 177, 869-878 (1979)）、高等動物のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素は、通常、微生物由来の酵素と比べて比活性が低く、また、該酵素を用いてサイクリング反応を行うことができたという報告は未だなされていない。
【００２７】
従って、本発明は、上記のいずれかの条件を具備し、サイクリング反応を触媒することができる、新規グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素を提供する。好ましくは、当該酵素は、さらに下記の理化学的性質を有する。
(a) 作用：ＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、チオＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる１つの補酵素、還元型グルタチオンの存在下にホルムアルデヒドに作用して、Ｓ−ホルミルグルタチオン、還元型補酵素を生成する。
(b) 至適ｐＨ：約７．５〜約８．５
(c) ｐＨ安定性：約６．０〜約９．０
(d) 熱安定性：約４０℃以下
ここで「ｐＨ安定性」とは、２５℃で２４時間処理した後の残存活性が８０％以上のｐＨ範囲をいい、「熱安定性」とは、ｐＨ７．５で３０分間処理した後の残存活性が９０％以上の温度範囲をいう。
【００２８】
本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素は、サイクリング反応を触媒するのに必要な上記の条件を具備する限り、その由来は特に制限されないが、好ましくは微生物由来であり、より好ましくはメタノール資化性酵母由来、いっそう好ましくはハンゼヌラ属に属する酵母由来、就中ハンゼヌラ・ノンファーメンタンスＩＦＯ１４７３株由来のものが挙げられる。ＩＦＯ１４７３株は、財団法人発酵研究所（〒５３２−８６８６ 大阪市淀川区十三本町２−１７−８５）より入手可能である。
【００２９】
また、本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素は、ランダムにもしくは部位特異的に変異を誘発することにより、サイクリング反応を触媒するのに必要な、２種類の補酵素に対する反応性のバランスを保持する範囲で、比活性や安定性を向上させるなどの酵素特性の改良をもたらすように遺伝的に改変されたものであってもよい。
【００３０】
本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素は、該酵素を産生する細胞または組織の培養物を原料として単離精製する方法、あるいは当該酵素蛋白質をコードする遺伝子を常法によって単離し、遺伝子組換え技術を用いて適当な宿主中で発現させる方法によって取得することができる。前者の好ましい一実施態様として、以下の方法が例示される。
【００３１】
まず、上記のいずれかのグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素生産菌（例えば、ハンゼヌラ・ノンファーメンタンスＩＦＯ１４７３株など）を栄養培地中で培養する。使用する栄養培地としては、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地、天然培地のいずれも使用できる。炭素源としては、例えばリンゴ酸、コハク酸等が使用される。窒素源としては、例えばペプトン類、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の無機窒素含有化合物が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等が使用される。
【００３２】
培養は通常、振盪培養あるいは通気撹拌培養により行う。培養温度は約２０〜約４０℃、好ましくは約２５〜約３７℃である。培養ｐＨは約５〜約９、好ましくは約６〜約８の範囲に制御するのがよい。しかしながら、使用する菌株が生育し得る限り、これら以外の条件下でも実施することができる。培養期間は、通常約１〜約７日であり、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素は通常、菌体内に生産蓄積される。
【００３３】
本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素の精製は、一般に使用される精製法を用いて行うことができる。例えば、菌体を回収後、超音波破砕、ガラスビーズを用いる機械的な破砕、フレンチプレス、界面活性化剤による溶解などにより、菌体内画分を抽出することができる。得られた抽出液を、硫安やぼう硝などによる塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどによる金属凝集法、プロタミンやポリエチレンイミンなどを用いた凝集法、さらにはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどによるイオン交換クロマト法などに付すことにより、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素を精製することができる。
【００３４】
本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素によるサイクリング反応を用いたホルムアルデヒドの測定方法について、酸化型補酵素としてチオＮＡＤ（Ｐ）類化合物を用いる場合を例にとってさらに詳述する。還元型グルタチオン、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素、酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）類化合物および還元型ＮＡＤ（Ｐ）類化合物を試料に接触させると、試料中に含まれるホルムアルデヒド、還元型グルタチオンおよび酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）類化合物から、Ｓ−ホルミルグルタチオンと還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類化合物が生成する。次いで、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素は、過剰に存在する還元型ＮＡＤ（Ｐ）類化合物を補酵素として利用し、生成されたＳ−ホルミルグルタチオンを再びホルムアルデヒドとグルタチオンに戻す。以下、酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）類化合物を補酵素とする正反応と、還元型ＮＡＤ（Ｐ）類を補酵素とする逆反応とが繰り返され、結果として１分子のホルムアルデヒドに対して多数分子の還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類化合物が生成される。一方で、還元型ＮＡＤ（Ｐ）類化合物は反応サイクルの進行に伴って消費される。したがって、還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類化合物量の増加または還元型ＮＡＤ（Ｐ）類化合物量の減少を、上記のように吸光度を指標にしてモニタリングすることにより、低濃度のホルムアルデヒドも感度よく検出することができる。
【００３５】
また、上記測定系において、ＮＡＤ（Ｐ）類を補酵素として利用し得るがチオＮＡＤ（Ｐ）類を補酵素として実質的に利用できない他の酵素と、当該酵素の基質をさらに添加することにより、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類化合物を還元型に再生することができる。この場合、ホルムアルデヒドの測定は、還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類化合物の増加を指標にして行われる。このような測定系に使用される他の酵素およびその基質の組み合わせとしては、ＮＡＤ類を利用し得るものとして、例えば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.37）（例えば、ブタやウシの心筋由来）とＬ−リンゴ酸、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.8）（例えば、ウサギ筋肉由来）とＬ−グリセロール−３−リン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.12）（例えば、ウサギ骨格筋もしくは肝、酵母または大腸菌由来）とＤ−グリセロアルデヒドリン酸およびリン酸、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.49）（例えば、リューコノストック（Leuconostoc）属細菌由来）とグルコース−６−リン酸、グルコースデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.47）（例えば、バチルス属細菌、シュードモナス属細菌由来）とβ−Ｄ−グルコース、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.4.1.3）（例えば、ウシ肝由来）とＬ−グルタミン酸等が、ＮＡＤＰ類を利用し得るものとして、例えば、グリオキシル酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.17）（例えば、シュードモナス・オキサラティカス（Pseudomonas oxalaticus）由来）とＣｏＡおよびグリオキシル酸、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.44）（例えば、ラット肝、ビール酵母または大腸菌由来）と６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.13）（例えば、植物葉緑体由来）とＤ−グリセロアルデヒド−３−リン酸およびリン酸、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.49）（例えば、酵母またはリューコノストック属細菌由来）とグルコース−６−リン酸、グルコースデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.47）（例えば、バチルス属細菌、シュードモナス属細菌由来）とβ−Ｄ−グルコース、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.4.1.3）（例えば、ウシ肝由来）とＬ−グルタミン酸等が挙げられる。
【００３６】
本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素を用いたサイクリング法によれば、試料中の濃度が１μｍｏｌ／Ｌ以下の微量のホルムアルデヒドの検出が可能となる。
【００３７】
しかしながら、本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素を用いたホルムアルデヒドの測定は、サイクリング反応を介さずに、以下のようにして行うこともできる。
即ち、グルタチオン、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素およびチオＮＡＤ類、チオＮＡＤＰ類、ＮＡＤ類およびＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる１つの酸化型補酵素を試料に接触させ、生成されるＳ−ホルミルグルタチオンを、紫外部における吸光度を指標として測定することにより、ホルムアルデヒドを測定することができる。あるいは、さらにＳ−ホルミルグルタチオンハイドロラーゼ（EC 3.1.1.12）を作用させて生成するギ酸を、さらにギ酸脱水素酵素（EC1.2.1.2；EC 1.2.1.43）を用いて二酸化炭素に分解し、生成する還元型補酵素を測定することによっても、ホルムアルデヒドの測定が可能である。
【００３８】
Ｓ−ホルミルグルタチオンハイドロラーゼは、動物臓器やメタノール資化性酵母、細菌などに存在することが知られており、これら給源より採取して使用することができる。また、ギ酸脱水素酵素は、植物種子、メタノール資化性酵母、細菌などに存在する酵素で、これら給源より採取して使用することができる。あるいは、市販の酵素（例えば、シグマ製FORMATE DEHYDROGENASE等）を使用してもよい。
【００３９】
上記の一連の酵素反応により生成される還元型補酵素（ＮＡＤＨ類またはＮＡＤＰＨ類）は、紫外部での吸光度、或いは蛍光を測定することにより分析することができる。また、ジアホラーゼやメチルフェナジウムメチルスルフェートのような電子伝達体の存在下でテトラゾリウム塩を還元する際に生成するホルマザン色素を測定することによっても、還元型補酵素を測定することができる。
【００４０】
本発明のホルムアルデヒドの測定方法は、多段階測定の反応中間体としてホルムアルデヒドを生成する種々の生体成分の測定方法において、その最終工程として好ましく使用され得る。
【００４１】
例えば、クレアチニンまたはクレアチンの測定は、クレアチンアミジノハイドロラーゼおよびサルコシンオキシダーゼ（クレアチニンの場合はさらにクレアチニンアミドハイドロラーゼ）を試料に作用させて、クレアチニンまたはクレアチンをグリシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素に分解し、生成する過酸化水素を発色基質等を用いて測定することにより行われている。そこで、過酸化水素の定量用試薬の代わりに、本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素を用いてホルムアルデヒドを測定することにより、クレアチニンまたはクレアチンを高感度で測定することができる。
【００４２】
従って、本発明は、クレアチンアミジノハイドロラーゼ、サルコシンオキシダーゼおよび必要に応じてクレアチニンアミドハイドロラーゼを試料に接触させてホルムアルデヒドを生成させ、さらに、本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素、グルタチオン、およびチオＮＡＤ類、チオＮＡＤＰ類、ＮＡＤ類およびＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる１つの酸化型補酵素、および必要に応じてさらに該酸化型補酵素とは異なる種類の還元型補酵素を接触させて、生成もしくは消費される化合物量を分析することによる、クレアチニンまたはクレアチンの測定方法を提供する。
【００４３】
使用するクレアチンアミジノハイドロラーゼ、サルコシンオキシダーゼおよびクレアチニンアミドハイドロラーゼは特に限定されるものではなく、これらの酵素を生産する微生物などから公知の手法を用いて採取できる他、各種市販の酵素を用いることもできる。例えば、クレアチンアミジノハイドロラーゼとしては、バチルス属、コリネバクテリウム属、ミクロコッカス属、アクチノバチルス属、アルカリゲネス属（Alcaligenes）に属する細菌等由来のものが、クレアチニンアミドハイドロラーゼとしては、シュードモナス属、アルカリゲネス属、フラボバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロコッカス属、ペニシリウム属に属する細菌等由来のものが、サルコシンオキシダーゼとしては、各種動物や、アルスロバクター属、ペニシリウム属、バチルス属に属する微生物等由来のものが挙げられる。
【００４４】
また、ホモシステインの測定は、ベタイン、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素およびジメチルグリシンオキシダーゼを試料に作用させて、ホモシステインをサルコシン、過酸化水素およびホルムアルデヒドに分解し、生成する過酸化水素を発色基質等を用いて測定することにより行うことができる。そこで、上記と同様に、過酸化水素の定量用試薬の代わりに、本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素を用いてホルムアルデヒドを測定することにより、ホモシステインを測定することができる。
【００４５】
本発明において使用されるベタイン−ホモシステインメチル転移酵素（EC 2.1.1.5）は、ベタインをもう一方の基質としてホモシステインに作用し、ジメチルグリシンとメチオニンを生成する酵素であり、例えば、哺乳動物やシュードモナス属、アスペルギルス属などの微生物から採取することが可能である。本酵素のもう一方の基質であるベタインは、塩酸塩の形で安価に市販されている。
【００４６】
ジメチルグリシンオキシダーゼ（EC 1.5.3.10）は、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素により生成したジメチルグリシンに作用して、サルコシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素に分解する酵素であり、例えばシリンドロカーポン（Cylindrocarpon）属、アクロモバクター（Achromobacter）属、アルスロバクター属などの微生物から採取することができる。
【００４７】
また、ジメチルグリシンオキシダーゼにより生成されるサルコシンにサルコシンオキシダーゼを作用させれば、２倍量のホルムアルデヒドが生成するので検出感度をさらに増加させることができる。サルコシンオキシダーゼとしては、クレアチニンまたはクレアチンの測定方法について上記した通りのものを、同様に使用することができる。
【００４８】
反応中間体としてホルムアルデヒドを生成する他の測定対象として、例えば、メタノール、尿酸などが例示される（Clin. Chem., 33/12, 2204-2208 (1987), Clin. Biochem., 27/2, 93-97 (1994)）。即ち、メタノールは、アルコールオキシダーゼ（EC 1.1.3.13）によりホルムアルデヒドと過酸化水素を生成する。また、尿酸は、ウリカーゼ（EC 1.7.3.3）の反応により生成される過酸化水素を、メタノールの存在下でカタラーゼ（EC 1.11.1.6）と作用させることでホルムアルデヒドを生成するので、これを上記測定方法により分析することができる。
【００４９】
本発明はまた、上記のホルムアルデヒドの測定方法に使用するための試薬キットを提供する。本発明におけるホルムアルデヒド測定用試薬キットは、緩衝液、グルタチオン、上述の本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素および該酵素反応により生成する化合物を分析するための試薬を少なくとも含有してなる。当該試薬キットは、ＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類およびチオＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる１つの酸化型補酵素をさらに含有することが好ましい。
【００５０】
グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素の反応により生成する化合物を分析するための試薬としては、Ｓ−ホルミルグルタチオンを分析するための試薬として、Ｓ−ホルミルグルタチオンハイドロラーゼ、ギ酸脱水素酵素および生成する還元型補酵素を分析するための試薬が挙げられる。Ｓ−ホルミルグルタチオンハイドロラーゼ、ギ酸脱水素酵素および生成する還元型補酵素を分析するための試薬は、それぞれ上述のものが好ましく使用され得る。なお、Ｓ−ホルミルグルタチオンは、反応液の紫外部での吸光度を分析することにより直接測定することができるので、この場合は上記の試薬に代えて、吸光度測定に必要な試薬もしくは器具類を含むこともできる。
【００５１】
本発明の試薬キットにおいて使用される緩衝液としては、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液は濃度、温度によりｐＨの変動を受けやすいが、安価という利点がある。一方、ＧＯＯＤ緩衝液は具体的にはＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳなどが例示され、臨床診断薬用として多用されている。これら緩衝液の種類、濃度およびｐＨは、各試薬成分の保存および酵素反応など目的に応じて一種もしくは複数が選択されるが、いずれの緩衝液を用いるに際しても、酵素反応時のｐＨとしては５．０〜１０．０の範囲で使用されることが好ましい。
【００５２】
また、本発明の試薬キットを構成する試薬には、金属塩、蛋白質、アミノ酸、糖、有機酸などを安定化剤として使用することができる。金属塩としてはナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、銅、亜鉛、マンガンなどの塩が挙げられる。蛋白質としては酵素反応に影響を与えないものが望ましいが、例えば牛血清アルブミン、卵アルブミン、ゼラチンなどが挙げられる。アミノ酸としては、グリシン、リジン、グルタミン酸、グリシルグリシン、ポリリジンなどを挙げることができる。糖としては、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖およびこれらの誘導体を用いることができる。具体的には、グルコース、フラクトース、ガラクトース、マンノース、キシロース、ラクトース、シュークロース、マルトース、トレハロース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトシルシクロデキストリン、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、デキストリン、アミロース、グリコーゲン、デンプン、イヌリン、グルコサミン、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、リビトール、デオキシグルコースなどが挙げられる。有機酸としては、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸、フマル酸、グルコン酸、コール酸、デオキシコール酸などが例示される。その他、ホウ酸、ホウ砂、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム、グリセロール、フィコールなども使用可能である。
【００５３】
更に、本発明の試薬キットを構成する試薬には、試薬性能に悪影響を及ぼさない範囲で防腐剤や界面活性剤を添加してもよい。防腐剤としてはアジ化ナトリウム、キレート剤、各種抗生物質、防菌剤、防黴剤などが挙げられる。具体的にはアジ化ナトリウムの他、ＥＤＴＡ及びその塩（金属キレートを含む）、ＣｙＤＴＡ、ＧＨＥＧ、ＤＰＴＡ−ＯＨ、ＤＴＰＡ、ＥＤＤＡ、ＥＤＤＰ、ＥＤＤＰＯ、ＥＤＴＡ−ＯＨ、ＥＤＴＰＯ、ＥＧＴＡ、ＨＢＥＤ、ＨＤＴＡ、ＨＩＤＡ、ＩＤＡ、Methyl-ＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＮＴＰ、ＮＴＰＯ、ＴＴＨＡ（これらは同仁より市販）等のキレート剤、ＢＮＤ、ＣＡＡ、ＨＰＯ、ＩＺＵ、ＭＩＴ（ロッシュより市販）、ProClin150、ProClin300（ローム＆ハースより市販）、ベンザルコニウムクロリド、KathonCG、ｐ−ヒドロキシメチルベンゾエート等の防菌（黴）剤、アンフォテリシンＢ、アンピシリン、ブラスティシジンＳ、クロラムフェニコール、ジヒドロストレプトマイシン、クリンダマイシン、シクロヘキシミド、フィリピン、Ｇ４１８、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、ネオマイシン、ロモフンジン、ポリオキシン、ペニシリン、スルファメチゾール、テトラサイクリン等の抗生物質が使用可能である。界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤が挙げられる。具体的には、アデカトール７２０Ｎ、Ｂ−７９５、Ｂ−７９７、ＬＯ−７、ＮＰ−６９０、ＮＰ−６９５、ＮＰ−７２０、ＰＣ−８、ＳＯ−１２０、ＳＯ−１４５、ブリジェ３５、９８、７００、エマルゲン１０９Ｐ、４３０、４６０、７０７、７０９、８１０、９１１、９３５、９５０、Ａ−６０，Ｂ６６、ｎ−ドデシルマルトシド、ゲナポールＸ−０８０，ＭＥＧＡ−７、８、９、１０、ニッコールＢＬ−９ＥＸ、ＢＬ−２０ＴＸ、ＨＣＤ−１００、ＭＧＯ、ＭＹＯ−６、ＭＹＬ−１０、ＮＰ−１８ＴＸ、ＯＰ−１０、ＴＬ−１０、ＴＭＧＯ５、ＳＬ−１０、オクチル α―グルコシド、オクチル β―グルコシド、オクチルチオグルコシド、オクチルチオガラクトシド、ペンタエチレングリコールドデシルエーテル、ポリエチレンエーテルＷ−１、プルロニックＦ−６８、Ｌ−７１、Ｐ−１０３、ノニデットＰ４０、レオドール４６０、ＴＷＬ−１０３、ＴＷＬ−１０６、サポニン、サルコシネートＰＮ、スパン２０、８５、ＳＭ１０８０、スクロースモノラウレート、テトロニック７０４、テシット、トリトンＸ−１００、Ｘ−１１４、Ｘ−３０５、ツイーン２０、４０、８０等の非イオン性界面活性剤、ビス（ヒドロキシエチル）−（ステアロイルアミノメチルカルボニルオキシ）エチルアミンクロリド、メチル硫酸ベンジルラウリルメチルスルフォニウム、２−[（４−ｔ−オクチルフェノキシ）エトキシ]エチルモルフォリンクロリド、ラウリルピリジニウムクロリド、ラウリル（トリ−ｐ−トリル）ホスホニウムクロリド、ラウリルフェニルシクロテトラメチレンホフホニウムブロミド、セチルピリジウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、（ポリオキシエチレン）ラウリルアミン、などの陽イオン性界面活性剤、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸、Ｎ−ラウロイルサルコシン、タウロコール酸などの陰イオン性界面活性剤、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、Ｎ，Ｎ−ビス（オクチルアミノエチル）グリシン、Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−（ステアリルオキシメチル）ピリジウムベタイン、Ｎ−パルミチルスルホタウリン、ラウリルジメチルアミンオキシド、Ｎ−（ラウリルチオエトキシ）メチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルベタインなどの両性界面活性剤が使用できる。
【００５４】
本発明の別のホルムアルデヒド測定用試薬キットは、グルタチオンおよび本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素に加えて、チオＮＡＤ類およびチオＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの化合物、並びに還元型ＮＡＤ類および還元型ＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの化合物をさらに含有してなるか、あるいは、還元型チオＮＡＤ類および還元型チオＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの化合物、並びにＮＡＤ類およびＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの化合物をさらに含有してなる。
【００５５】
これらの試薬キットによれば、上記のサイクリング反応によるホルムアルデヒドの高感度測定を簡便に実施することが可能である。ＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、チオＮＡＤＰ類としては、それぞれ上述のようなものを用いることができる。また、当該試薬キットには、サイクリング反応により生成する酸化型補酵素を還元型に再生する、上述のような酵素およびその基質をさらに含有させることもできる。
【００５６】
本発明のホルムアルデヒド測定用試薬キットは、上記の各試薬成分を、それぞれ単独で保存することもできるし、あるいは２以上の成分を同一の試薬中に保存することもできる。したがって、本発明の試薬キットは、上記の全ての試薬成分を含有してなる単一の試薬組成物であってもよい。しかしながら、互いに干渉を与える成分が存在するか、または単一の保存条件で安定性の確保が難しい成分が存在する場合には、構成成分を分割して保存することが好ましい。
【００５７】
本発明は、上記のホルムアルデヒド測定用の試薬成分に加えて、更にクレアチンアミジノハイドロラーゼ、サルコシンオキシダーゼおよび必要に応じてクレアチニンアミドハイドロラーゼを含有してなる、クレアチニンまたはクレアチン測定用試薬キットを提供する。これらの酵素としては、上述したようなものを適宜利用可能である。
【００５８】
また、別の本発明は、上記のホルムアルデヒド測定用の試薬成分に加えて、更にベタイン、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素、ジメチルグリシンオキシダーゼを少なくとも含有してなる、ホモシステイン測定用試薬キットを提供する。これらの酵素および基質としては、それぞれ上述したようなものを好ましく使用することができる。
【００５９】
しかしながら、測定に供される試料が生体試料、特に血漿や尿の場合、含有されるホモシステインは、大部分がアルブミンのような循環蛋白質と結合した状態、あるいはシステインや他のホモシステイン分子のような遊離アミノ酸とのジスルフィド結合体の状態で存在する。従って、総ホモシステインを測定する際には、予め試料を還元剤や酵素反応により処理し、遊離ホモシステインを生成させることが必要となる。
【００６０】
この場合に用いられる還元剤としては、例えばチオール類、水素化ホウ素類、アマルガム、ホスフィンやホスホチオエートなどを例示することができる。具体的には、チオール類としてはジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトメチルアミン、システイン、シスタミン、システインチオグリコレート、チオグリコール酸、還元型グルタチオンなど、水素化ホウ素類としては水素化ホウ素ナトリウムなど、アマルガムとしてはナトリウムアマルガムなどが挙げられる。
【００６１】
しかしながら、本発明において使用される酵素が該チオール化合物により活性阻害を受けた場合、試薬性能の低下を引き起こす可能性が考えられるが、チオール化合物に影響を受けないジメチルグリシンオキシダーゼはこれまでに報告されておらず、本発明によって初めて単離精製されたものである。
【００６２】
従って、本発明は、チオール化合物に対して安定な新規ジメチルグリシンオキシダーゼを提供する。このようなチオール化合物としては、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエタンスルホン酸、２−メルカプトエチルアミン、システイン、ホモシステイン、Ｎ−アセチルシステイン、チオグリセロール、チオグリコール酸、還元型グルタチオンまたはこれらの塩から選択される少なくとも一種が挙げられる。
【００６３】
ここで「チオール化合物に対して安定」とは、試料中の総ホモシステインをすべて遊離型に還元するのに必要な量のチオール化合物の存在下において、ホモシステインの正確な測定に影響を与えない程度に酵素活性が保持され得ることをいう。好ましくは、本発明のジメチルグリシンオキシダーゼは、ジチオスレイトール非存在下に対し、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール存在下で、少なくとも５０％酵素活性が保持されるものである。
【００６４】
より好ましくは、本発明のジメチルグリシンオキシダーゼは、さらに下記の理化学的性質を有する酵素である。
(a) 作用：酸素の存在下にジメチルグリシンに作用して，サルコシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を生成する。
(b) ジメチルグリシンに対するＫｍ値：１５ｍＭ以下
【００６５】
本発明のジメチルグリシンオキシダーゼは、上記のチオール化合物に対する安定性を有する限りその由来は特に制限されないが、好ましくはアルスロバクター属またはストレプトマイセス属等の微生物由来であり、特に好ましくは、アルスロバクター・ニコチアナエＩＦＯ１４２３４株またはストレプトマイセス・ミュータビリスＩＦＯ１２８００株由来のものが挙げられる。ＩＦＯ１４２３４株およびＩＦＯ１２８００株は、いずれも財団法人発酵研究所（〒５３２−８６８６日本国大阪市淀川区十三本町２−１７−８５）より入手可能である。
【００６６】
また、本発明のジメチルグリシンオキシダーゼは、ランダムにもしくは部位特異的に変異を誘発することにより、上記のチオール化合物に対する耐性を保持する範囲で、比活性や安定性を向上させるなどの酵素特性の改良をもたらすように遺伝的に改変されたものであってもよい。
【００６７】
本発明のジメチルグリシンオキシダーゼは、該酵素を産生する細胞または組織の培養物を原料として単離精製する方法、あるいは当該酵素蛋白質をコードする遺伝子を常法によって単離し、遺伝子組換え技術を用いて適当な宿主中で発現させる方法によって取得することができる。前者の好ましい一実施態様として、以下の方法が例示される。
【００６８】
まず、上記のいずれかのジメチルグリシンオキシダーゼ生産菌、例えば、アルスロバクター・ニコチアナエＩＦＯ１４２３４株またはストレプトマイセス・ミュータビリスＩＦＯ１２８００株などを栄養培地中で培養する。使用する栄養培地としては、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地、天然培地のいずれも使用できる。炭素源としては、例えばリンゴ酸、コハク酸等が使用される。窒素源としては、例えばペプトン類、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の無機窒素含有化合物が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等が使用される。
【００６９】
培養は通常、振盪培養あるいは通気撹拌培養により行う。培養温度は約２０〜約４０℃、好ましくは約２５〜約３７℃である。培養ｐＨは約５〜約９、好ましくは約６〜約８の範囲に制御するのが良い。しかしながら、使用する菌株が生育し得る限り、これら以外の条件下で実施することもできる。培養期間は通常、約１〜約７日であり、ジメチルグリシンオキシダーゼは通常、菌体内に生産蓄積される。
【００７０】
本発明のジメチルグリシンオキシダーゼの精製は、一般に使用される精製法を用いて行うことができる。例えば、菌体を回収後、超音波破砕、ガラスビーズを用いる機械的な破砕、フレンチプレス、界面活性化剤による溶解などにより、菌体内画分を抽出することができる。得られた抽出液を、硫安やぼう硝などによる塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどによる金属凝集法、プロタミンやポリエチレンイミンなどを用いた凝集法、さらにはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどによるイオン交換クロマト法などに付すことにより、ジメチルグリシンオキシダーゼを精製することができる。
【００７１】
本発明はまた、上記の本発明のジメチルグリシンオキシダーゼを用いたホモシステインの測定方法を提供する。当該方法は、ベタイン、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素および本発明のジメチルグリシンオキシダーゼを試料に作用させて、試料中に含まれるホモシステインをサルコシン、過酸化水素およびホルムアルデヒドに分解し、これらの生成物のいずれかを分析することを特徴とする。
【００７２】
ベタインおよびベタイン−ホモシステインメチル転移酵素は、それぞれ上述のものが好ましく使用され得る。
【００７３】
ジメチルグリシンオキシダーゼは、下式に示すように、酸素の存在下にジメチルグリシンをサルコシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素に分解する。
【００７４】
【数２】

【００７５】
したがって、反応中の酸素消費量を計測するか、あるいは過酸化水素センサーを用いて、または直接もしくはペルオキシダーゼ存在下に酸化還元指示薬を用いて、過酸化水素の生成量を計測することにより、ジメチルグリシンを測定することができる。あるいは、生成したホルムアルデヒドを、Ｈａｎｚ試薬、ホルムアルデヒド脱水素酵素、ホルムアルデヒドオキシダーゼ等を用いて、紫外部もしくは可視部の吸光度、あるいは蛍光を計測することにより間接的に測定することができる。例えば、ホルムアルデヒド脱水素酵素によりＮＡＤより生成する還元型ＮＡＤ（ＮＡＤＨ）は、ジアホラーゼやメチルフェナジウムメチルスルフェートのような電子伝達体の存在下で、テトラゾリウム塩を還元してホルマザン色素を生じるので、これを測定することによりホモシステインを定量することができる。
【００７６】
更に、サルコシンオキシダーゼ（EC 1.5.3.1）を追加して加えると、サルコシンはグリシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素に分解されるので、ホルムアルデヒドまたは過酸化水素を感度的に倍加して測定することができる。また、更にホルムアルデヒドオキシダーゼを作用させてホルムアルデヒドを過酸化水素に分解することにより、感度をさらに向上させることができる。
【００７７】
サルコシンオキシダーゼは、上述のように、各種動物や、アルスロバクター属、ペニシリウム属、バチルス属等の微生物などから採取することが可能である。また、市販の酵素を使用することもできる。
【００７８】
また、上記酵素は、それぞれの酵素蛋白質をコードする遺伝子を生産菌から単離し、遺伝子工学的技術により発現させた酵素であってもよい。更に、例えば酵素蛋白質の比活性や安定性を向上させるなど、酵素特性の改良をもたらすように遺伝子を改変したものも含まれる。
【００７９】
ジメチルグリシンオキシダーゼにより（場合によっては、さらにサルコシンオキシダーゼおよびホルムアルデヒドオキシダーゼにより）生成する過酸化水素は、紫外部の吸光度を直接測定するか、カタラーゼと酸化チタン試薬（Agric. Biol. Chem., 38, 1213 (1974)）により比色定量分析を行うか、あるいは過マンガン酸カリウムを用いて滴定定量するなどにより分析することが可能であるが、高感度測定のためには、ペルオキシダーゼ存在下、酸化系発色試薬及び、必要に応じて４−アミノアンチピリンや３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンなどのカップラーと反応させ、生成する色素を測定することにより定量することが好ましい。使用する発色試薬は特に制限されるものではなく、各種の市販されているものなどを使用することができるが、具体例としてＮ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−アニリン、Ｎ−メチル−Ｎ−スルホプロピル−アニリン、Ｎ−ブチル−Ｎ−スルホプロピル−アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３,５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３,５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３,５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｏ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｐ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３,５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３,５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３,５−ジメチルシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−スルホプロピルアニリン、ｐ−クロロフェノール、ｐ−ブロモフェノール、２,４−ジクロロフェノール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン、Ｎ−（３−スルホプロピル）３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’,Ｎ”,Ｎ”−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタンなどが挙げられる。また、過酸化水素は直接、またはカタラーゼ共存下で酸素の消費をセンサーを用いてモニタリングすることでも測定することができる。
【００８０】
ジメチルグリシンオキシダーゼにより生成するサルコシンは、サルコシンオキシダーゼを作用させることにより生成するホルムアルデヒドまたは過酸化水素を上述方法により分析できる他、電子伝達体、発色色素の存在下でサルコシン脱水素酵素を作用させ、生成する色素を測定することでも分析することが可能である。電子伝達体としては、ジアホラーゼやメチルフェナジウムメチルスルフェート、メチレンブルー、フェリシアン化カリウムなどが例示される。また、色素としてはテトラゾリウム塩、インドフェノールなどが挙げられる。また、サルコシン脱水素酵素は哺乳動物やシュードモナス属微生物などから直接、もしくは該酵素の遺伝子を遺伝子工学的手法で作製した組換え体より採取可能である。
【００８１】
ジメチルグリシンオキシダーゼにより（場合によっては、さらにサルコシンオキシダーゼにより）生成するホルムアルデヒドは、好ましくは、グルタチオン、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素および酸化型補酵素、および必要に応じて当該酸化型酵素とは異なる種類の還元型補酵素を試料に作用させて、生成もしくは消費され化合物を分析することにより測定することができる。
【００８２】
グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素としては、本発明において新たに取得された上述の酵素を用いることが最も好ましいが、哺乳動物、高等植物、メタノール資化性酵母、細菌などに由来する従来公知の酵素も同様に使用することができる。例えば、市販品である、キャンジダ（Candida）属酵母由来の酵素などを使用することができる。具体的には、シグマ製FORMALDEHYDE DEHYDROGENASE (Glutathione dependent)等が挙げられる。
【００８３】
該酵素は酵素蛋白質をコードする遺伝子を生産菌から単離し、遺伝子工学的技術により発現させたものであっても良く、更には、例えば酵素比活性や安定性を向上させるなど、酵素特性を改変した変異体や化学修飾酵素も含まれる。
【００８４】
補酵素としては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（ＮＡＤ類）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸類（ＮＡＤＰ類）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（チオＮＡＤ類）またはチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸類（チオＮＡＤＰ類）が挙げられ、ＮＡＤ類またはＮＡＤＰ類は、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素が補酵素として利用できるものを適宜使用すれば良いが、公知のものではＮＡＤ類として、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド、アセチルピリジンアデニンヒポキサンチンジヌクレオチド、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドなどが、ＮＡＤＰ類としてはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドリン酸、アセチルピリジンアデニンヒポキサンチンジヌクレオチドリン酸、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドリン酸などが例示される。また、チオＮＡＤ類またはチオＮＡＤＰ類においても、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素が補酵素として利用可能なものを適宜使用可能であるが、公知のものとして、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドリン酸などが具体例として挙げられる。
【００８５】
従来公知のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素を用いた場合のホルムアルデヒドの測定方法としては、本発明の新規グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素について上述したもののうち、サイクリング反応を介した測定法を除くいかなる手段も同様に用いることができる。
【００８６】
ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素、本発明のジメチルグリシンオキシダーゼおよびグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素を用いた本発明の測定方法によれば、試料中の濃度が１μｍｏｌ／Ｌ以下の微量のホモシステインの検出が可能となる。
【００８７】
本発明はまた、上記のホモシステインの測定方法に使用するための試薬キットを提供する。本発明のホモシステイン測定用試薬キットは、緩衝液、ベタイン、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素、チオール化合物に対して安定な本発明のジメチルグリシンオキシダーゼ、およびこれらの酵素反応により生成するホルムアルデヒド、サルコシンまたは過酸化水素の少なくとも１種を分析するための試薬を含有してなる。さらにサルコシンオキシダーゼを含んでいてもよい。ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素、サルコシンオキシダーゼに関しては、上述したようなものが好ましいが、特に限定はされない。ここで酵素反応により生成するホルムアルデヒド、サルコシン、または過酸化水素を分析するための試薬とは、具体的には上述したような原理に基づくものが挙げられる。即ち、ホルムアルデヒドを分析するための試薬としては、ホルムアルデヒド脱水素酵素、ホルムアルデヒドオキシダーゼ、Ｈａｎｚ試薬、ＣＴＡ試薬（J. Biol. Chem., 231, 813 (1958)）、Ｐｕｒｐａｌｄ試薬（Anal. Biochem., 234(1), 50 (1996)）やフェニルヒドラジン、フェリアン化カリウム、クロロホルム、メタノールを組み合わせた試薬などがある。過酸化水素を分析するための試薬としては、ペルオキシダーゼ、酸化系発色試薬及び、必要に応じて４−アミノアンチピリンや３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンなどのカップラー、カタラーゼ、酸化チタン試薬、過マンガン酸カリウムなどがある。また、サルコシンを分析するための試薬としては、サルコシンオキシダーゼおよび該酵素反応により生成するホルムアルデヒド、過酸化水素を分析するための上記試薬、サルコシン脱水素酵素、電子伝達体、発色色素などがある。
【００８８】
特に好ましい態様においては、本発明のホモシステイン測定用試薬キットは、緩衝液、ベタイン、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素、チオール化合物に対して安定な本発明のジメチルグリシンオキシダーゼ、グルタチオン、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素および該グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素が利用し得る酸化型補酵素を含有してなる。必要に応じてサルコシンオキシダーゼをさらに含むことができる。ベタイン、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素および酸化型補酵素としては、上述のものが好ましく使用できる。また、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素として、本発明において新たに得られた酵素を使用し、サイクリング反応を介してホルムアルデヒドを測定する場合には、該試薬キットは、上記酸化型補酵素とは異なる種類の還元型補酵素をさらに含むことが好ましい。
【００８９】
緩衝液としては、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液など、上記のホルムアルデヒド測定用試薬キット中に含まれる緩衝液として例示されたものが同様に使用可能である。緩衝液の種類、濃度およびｐＨは、各試薬成分の保存および酵素反応など目的に応じて一種もしくは複数が選択されるが、いずれの緩衝液を用いるに際しても、酵素反応時のｐＨとしては５．０〜１０．０の範囲で使用されることが好ましい。
【００９０】
また、本発明のホモシステイン測定用試薬キットを構成する試薬には、上記のホルムアルデヒド測定用試薬キットを構成する試薬の安定化剤として例示された、各種の金属塩、蛋白質、アミノ酸、糖、有機酸などを同様に含有させることができる。さらに、試薬性能に悪影響を及ぼさない範囲で上述のような防腐剤や界面活性剤を添加してもよい。
【００９１】
本発明のホモシステイン測定用試薬キットは、上記の各試薬成分を、それぞれ単独で保存することもできるし、あるいは２以上の成分を同一の試薬中に保存することもできる。したがって、本発明の試薬キットは、上記の全ての試薬成分を含有してなる単一の試薬組成物であってもよい。しかしながら、互いに干渉を与える成分が存在するか、または単一の保存条件で安定性の確保が難しい成分が存在する場合には、構成成分を分割して保存することが好ましい。
【００９２】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００９３】
実施例１ グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素の取得
本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素の活性測定は以下の試薬及び測定条件にて行った。
〈試薬〉
試薬Ａ １００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）
試薬Ｂ １０ｍＭ 酸化型ＮＡＤ水溶液
試薬Ｃ ２０ｍＭ ホルムアルデヒド水溶液
試薬Ｄ ２０ｍＭ グルタチオン水溶液
〈測定条件〉
試薬Ａ、試薬Ｂ、試薬Ｃおよび試薬Ｄを各２．１ｍｌ、０．３ｍｌ、０．３ｍｌ、０．３ｍｌの割合で混合し、試薬混液を作成する。この試薬混液３ｍｌを３７℃で約５分間予備加温した後、０．１ｍｌの酵素溶液を加えて混和し、３７℃で４分間反応させる。この時、３４０ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化を測定する。盲検は酵素溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に加えて、以下同様に吸光度変化を測定する。上記条件にて１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【００９４】
メタノール資化性酵母ハンゼヌラ・ノンファーメンタンスＩＦＯ１４７３株を６０ｍｌのＹＰＤ培地（１％ Ｄ−グルコース、１％ ポリペプトン、１％ 酵母エキス；ｐＨ５．０）に一白金耳植菌し、３０℃、２４時間振とう培養後、６Ｌのグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素生産培地（２％ メタノール、０．５％ Ｄ−グルコース、１％ ポリペプトン、１．６％ 酵母エキス、０．２％ リン酸水素二カリウム、０．７％ リン酸二水素一カリウム）に移し、３０℃、４８時間通気攪拌培養した。培養終了後、培養液を遠心分離し、２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。次いで、菌体をガラスビーズで破砕し、遠心分離を行って上清液を得た。得られた酵素液をポリエチレンイミンによる除核酸処理および硫安分画後、セファデックスＧ−２５による脱塩処理、ＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびスーパーデックス２００ゲル濾過クロマトグラフィーにより分離精製し、精製酵素標品約９０ｍｇを得た。該方法により得た標品は電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一なバンドを示し、この時の比活性は約２５０Ｕ／ｍｇ蛋白質であった。
【００９５】
また、上記方法で得たグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素の酵素活性を、試薬Ｂの酸化型ＮＡＤの代わりに酸化型チオＮＡＤを用いた以外は上記活性測定条件と同じ条件で測定した結果、この酵素の酸化型チオＮＡＤに対する反応性は、酸化型ＮＡＤに対するそれの６１％であった。
【００９６】
一方、比較例として、市販のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素（Candida boidinii由来；ＳＩＧＭＡ社製）の酵素活性を、同様に測定した結果、当該酵素の酸化型チオＮＡＤに対する反応性は、酸化型ＮＡＤに対するそれの２２％であった。
【００９７】
実施例２ ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素の取得
本発明のベタイン−ホモシステインメチル転移酵素の活性測定は以下の試薬及び測定条件で行った。
〈試薬〉
試薬Ａ ５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）
試薬Ｂ １００ｍＭ ＤＬ−ホモシステイン溶液（試薬Ａで溶解）
試薬Ｃ １００ｍＭ ベタイン（試薬Ａで溶解）
試薬Ｄ ０．２％ ペンタシアノアンミン鉄（III）ナトリウム水溶液
試薬Ｅ 酢酸
試薬Ｆ １０％ 亜硝酸ナトリウム水溶液
〈測定条件〉
酵素溶液２．３ｍｌに試薬Ｂ、試薬Ｃを各０．０７５ｍｌ、０．１２５ｍｌを加えて混和後、３７℃で１時間反応させる。反応終了後、直ちに試薬Ｄを５ｍｌ加えて攪拌し、一分間放置後、更に試薬Ｅ、試薬Ｆの順に各１ｍｌずつ加えて攪拌する。室温で３０分間放置後５２０ｎｍにおける吸光度を測定する。試薬Ａに溶解したＬ−メチオニンを酵素溶液の代わりに用いて同様の手順にて測定した吸光度より標準曲線を作成し、これから酵素反応により生成したメチオニンの量を測定する。上記条件にて１時間に１マイクロモルのメチオニンを生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【００９８】
遺伝子の塩基配列が公知であるヒト由来のベタイン−ホモシステインメチル転移酵素（J. Biol. Chem., 271(37), 22831 (1998)）をコードする遺伝子の全長を増幅可能な２種のプライマー（配列表の配列番号１および２に記載）を作成し、これを用いてヒト肝臓ｃＤＮＡ（クロンテック製）を鋳型として、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法によりヒト由来のベタイン−ホモシステインメチル転移酵素をコードするＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは以下に示す反応液組成及び反応条件にて実施した。
〈反応液組成〉
ＫＯＤPlus ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製） １Ｕ／５０μｌ
１０倍濃度添付バッファー ５μｌ／５０μｌ
鋳型ｃＤＮＡ １．５μｇ／５０μｌ
ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ 各０．２ｍＭ
プライマー 各２５pmol／５０μｌ
〈反応条件；下記（２）〜（４）を計３０サイクル実施した〉
（１）９５℃、２分間 （変性）
（２）９５℃、３０秒間（変性）
（３）６０℃、３０秒間（アニーリング）
（４）６８℃、１分間 （伸長反応）
【００９９】
ＰＣＲ反応後、反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供し、約１．２Ｋｂｐの単一の増幅バンドを確認した。この増幅断片をＤＮＡ断片精製キット（MagExtractor PCR&Gel Clean Up；東洋紡績製）を用いて回収した後、このＤＮＡ断片をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素にて処理した。次いで、ｐＥＴ１１ａプラスミド（ストラタジーン製）をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で処理し、これを上記ＤＮＡ断片とＴ４ ＤＮＡリガーゼ（東洋紡績製）を用いて連結した。これを用いてEpicurian Coli BL21 (DE3)-CodonPlus^TM-RIL コンピテントセル（ストラタジーン製）を形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ ポリペプトン、０．５％ 酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍｌ アンピシリン；ｐＨ７．２）に塗布し、３７℃で１６時間培養した。
【０１００】
得られたコロニーは、アンピシリンを含むＬＢ培地６０ｍｌで３０℃、１６時間振とう培養後、塩化亜鉛およびアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（１．６％ ポリペプトン、１％ 酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ、３４μｇ／ｍｌ 塩化亜鉛、１００ｍｇ／ｍｌ アンピシリン；ｐＨ７．２）６Ｌに接種し、３７℃で通気攪拌培養した。約２．５時間後、培養液の６００ｎｍの吸光度が約１．０に達した時点で、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを１ｍＭになるように添加し、更に４時間培養を行った。培養終了後、培養液を遠心分離し、菌体を５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。次いで、菌体をフレンチプレスで破砕し、遠心分離を行って上清液を得た。得られた酵素液をポリエチレンイミンによる除核酸処理後、セファデックスＧ−２５による脱塩処理、ＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、スーパーデックス２００ゲル濾過クロマトグラフィーにより分離精製し、精製酵素標品約５０ｍｇを得た。該方法により得た標品は電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一なバンドを示し、この時の比活性は約２．１Ｕ／ｍｇ−蛋白質であった。
【０１０１】
実施例３ ジメチルグリシンオキシダーゼの取得
本発明のジメチルグリシンオキシダーゼの活性測定は以下の試薬及び測定条件により行った。
〈試薬〉
試薬Ａ １００ｍＭ ジメチルグリシン溶液
（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で溶解）
試薬Ｂ ０．１％ ４−アミノアンチピリン水溶液
試薬Ｃ ０．１％ フェノール水溶液
試薬Ｄ ２５Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ（東洋紡績製；ＰＥＯ−３０１）水溶液
〈測定条件〉
試薬Ａ、試薬Ｂ、試薬Ｃおよび試薬Ｄを各１．５ｍｌ、０．３ｍｌ、０．６ｍｌ、０．６ｍｌの割合で混合し、試薬混液を作成する。この試薬混液３ｍｌを３７℃で約５分間予備加温した後、０．１ｍｌの酵素溶液を加えて混和し、３７℃で４分間反応させる。この時、５００ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化を測定する。盲検は酵素溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に加えて、以下同様に吸光度変化を測定する。上記条件にて１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【０１０２】
（１）アルスロバクター・ニコチアナエＩＦＯ１４２３４株からの単離
アルスロバクター・ニコチアナエＩＦＯ１４２３４株を６０ｍｌのＬＢ培地（１％ ポリペプトン、０．５％ 酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に一白金耳植菌し、３０℃、１６時間振とう培養後、６Ｌのジメチルグリシンオキシダーゼ生産培地（２％ ベタイン、１％ ポリペプトン、１．６％ 酵母エキス、１．４％ リン酸水素二カリウム、０．５５％ リン酸二水素一カリウム）に移し、３０℃、４０時間通気攪拌培養した。培養終了後、培養液を遠心分離し、２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。次いで、菌体をガラスビーズで破砕し、遠心分離を行って上清液を得た。得られた酵素液をポリエチレンイミンによる除核酸処理および硫安分画後、セファデックスＧ−２５による脱塩処理、ＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、スーパーデックス２００ゲル濾過クロマトグラフィーにより分離精製し、精製酵素標品約１１０ｍｇを得た。該方法により得た標品は電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一なバンドを示し、この時の比活性は約９．３Ｕ／ｍｇ蛋白質であった。
【０１０３】
また、上記方法で得たジメチルグリシンオキシダーゼの酵素活性を、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ ジチオスレイトール存在下で測定した以外は上記活性測定条件と同じ条件で測定した結果、その活性値はジチオスレイトール非存在下と比べて７１％であった。
【０１０４】
（２）ストレプトマイセス・ミュータビリスＩＦＯ１２８００株からの単離
ストレプトマイセス・ミュータビリスＩＦＯ１２８００株を、６０ｍｌのジメチルグリシン生産培地（２％ ベタイン、１％ ポリペプトン、１．６％ 酵母エキス、１．４％ リン酸ニ水素カリウム、０．５５％ リン酸水素ニカリウム）に一白金耳接種し、３０℃、７２時間振とう培養した。培養終了後、培養液を遠心分離し、回収した菌体を２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。次いで、菌体をガラスビーズで破砕し、遠心分離を行い、得られた抽出液をセファデックスＧ−２５により脱塩処理した。
【０１０５】
また、上記抽出液について、ジメチルグリシンオキシダーゼの酵素活性を、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ ジチオスレイトール存在下で測定した以外は上記活性測定条件と同じ条件で測定した結果、その活性値はジチオスレイトール非存在下と比べて９８％であった。
【０１０６】
さらに、上記２種のジメチルグリシンオキシダーゼのジメチルグリシンに対するＫ_ｍ値を測定した結果、アルスロバクター・ニコチアナエＩＦＯ１４２３４株由来の酵素は１３．６ｍＭ、ストレプトマイセス・ミュータビリスＩＦＯ１２８００株由来の酵素は１４．３ｍＭであった。
【０１０７】
実施例４ ホルムアルデヒド標準液の測定（１）
本実施例で使用するＳ−ホルミルグルタチオンハイドロラーゼの活性測定はBiochimica. et Biophysica Acta, 614 81-91 (1980)に記載の方法に、また、ギ酸脱水素酵素の酵素活性はEur. J. Biochem., Feb 2;62(1), 151-160 (1976)に記載の方法にそれぞれ従って実施した。
【０１０８】
本実施例で使用するＳ−ホルミルグルタチオンハイドロラーゼは以下にようにして取得した。
メタノール資化性酵母キャンジダ・ボイディニイ（Candida boidinii）ＩＦＯ１４７３株を６０ｍｌのＹＰＤ培地（１％ Ｄ−グルコース、１％ ポリペプトン、１％ 酵母エキス；ｐＨ５．０）に一白金耳植菌し、３０℃、２４時間振とう培養後、６ＬのＳ−ホルミルグルタチオンハイドロラーゼ生産培地（２％ メタノール、０．５％ Ｄ−グルコース、１％ ポリペプトン、１．６％ 酵母エキス、０．２％ リン酸水素二カリウム、０．７％ リン酸二水素一カリウム）に移し、３０℃、４８時間通気攪拌培養した。培養終了後、培養液を遠心分離し、２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。次いで、菌体をガラスビーズで破砕した後、遠心分離を行って上清液を得た。得られた酵素液をポリエチレンイミンによる除核酸処理および硫安分画後、セファデックスＧ−２５による脱塩処理、ＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびスーパーデックス２００ゲル濾過クロマトグラフィーにより分離精製し、精製酵素標品約１０ｍｇを得た。該方法により得た標品は電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的にほぼ単一なバンドを示し、この時の比活性は約９００Ｕ／ｍｇ蛋白質であった。
【０１０９】
種々の濃度のホルムアルデヒド水溶液１０μＬを試料とし、これを１００Ｕ／ｍｌ グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素（実施例１で調製）、１ｍＭ 酸化型ＮＡＤ、３ｍＭ グルタチオン、５Ｕ／ｍｌ Ｓ−ホルミルグルタチオンハイドロラーゼ（上記で調製したもの）、５Ｕ／ｍｌ ギ酸脱水素酵素（シグマ製）をそれぞれ含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）３００μｌと混合し、３７℃で１０分間反応させ、３４０ｎｍの吸光度を測定した。盲検はホルムアルデヒド水溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に加えて、以下同様に吸光度変化を測定した。反応終了時の吸光度と試料のホルムアルデヒド濃度の関係は表１および図１に示す通りであり、ホルムアルデヒド濃度が０〜５００μＭの範囲において直線性を示し、定量が可能であった。
なお、この測定系はサイクリング法ではない。
【０１１０】
【表１】

【０１１１】
実施例５ ホルムアルデヒド標準液の測定（２）
種々の濃度のホルムアルデヒド水溶液１０μＬを試料とし、これを１００Ｕ／ｍｌ グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素（実施例１で調製）、１ｍＭ 酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、０．５ｍＭ 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、３ｍＭ グルタチオン、０．１％ トリトンＸ−１００をそれぞれ含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）３００μｌと混合し、３７℃で５分間サイクリング反応を実施し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。盲検はホルムアルデヒド水溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に加えて、以下同様に吸光度変化を測定した。反応開始後１分後と５分後の吸光度の増加と、試料中のホルムアルデヒド濃度の関係は表２および図２に示す通りであり、ホルムアルデヒド濃度が０〜５０μＭの範囲において直線性を示し、定量が可能であった。
【０１１２】
【表２】

【０１１３】
さらに、表２および図２からは、サイクリング法において１μｍｏｌ／Ｌのホルムアルデヒドが測定できていることがわかる。
【０１１４】
実施例６ クレアチニン標準液の測定
種々の濃度のクレアチニン水溶液５μＬを試料とし、これを１００Ｕ／ｍｌ クレアチニンアミドハイドロラーゼ（東洋紡績製；ＣＮＨ−３１１）、５０Ｕ／ｍｌ クレアチンアミジノハイドロラーゼ（東洋紡績製；ＣＲＨ−２２１）、１０Ｕ／ｍｌ サルコシンオキシダーゼ（東洋紡績製；ＳＡＯ−３４１）、０．１％ トリトンＸ−１００をそれぞれ含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）２００μｌと混合し、３７℃で５分間反応させた後、３００Ｕ／ｍｌ グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素（実施例１で調製）、３ｍＭ 酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、１．５ｍＭ 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、９ｍＭ グルタチオン、０．１％ トリトンＸ−１００をそれぞれ含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）１００μｌを加え、３７℃で５分間サイクリング反応を実施し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。盲検はクレアチニン水溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に加えて、以下同様に吸光度変化を測定した。反応開始後１分後と５分後の吸光度の増加と、試料中のクレアチニン濃度の関係は表３および図３に示す通りであり、クレアチニン濃度が０〜１００μＭの範囲において直線性を示し、定量が可能であった。
【０１１５】
【表３】

【０１１６】
さらに、表３および図３からは、サイクリング法において１０μｍｏｌ／Ｌのクレアチニンが測定できていることがわかる。
【０１１７】
実施例７ ホモシステイン標準液の測定
ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素およびジメチルグリシンオキシダーゼは、それぞれ実施例２および実施例３（１）で取得したものを使用した。また、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素およびジメチルグリシンオキシダーゼの活性測定は、それぞれ実施例２および実施例３と同様にして行った。
【０１１８】
種々の濃度のＬ−ホモシスチン水溶液を、０．５ｍＭ ジチオスレイトール中で、３７℃、３０分間加温して生成したＬ−ホモシステイン１０μＬを試料とし、これを２０ｍＭ ベタイン、１Ｕ／ｍｌ ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素（上記で調製したもの）、７Ｕ／ｍｌ ジメチルグリシンオキシダーゼ（上記で調製したもの）、５Ｕ／ｍｌ サルコシンオキシダーゼ（東洋紡績製；ＳＡＯ−３４１）をそれぞれ含む２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）２００μｌと混合し、３７℃で５分間反応させた後、３００Ｕ／ｍｌ グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素（実施例１で調製）、３ｍＭ 酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、１．５ｍＭ 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、９ｍＭ グルタチオン、０．１％ トリトンＸ−１００をそれぞれ含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）１００μｌを加え、３７℃で５分間サイクリング反応を実施し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。盲検はＬ−ホモシステイン溶液の代わりに０．５ｍＭ ジチオスレイトールを試薬混液に加えて、以下同様に吸光度変化を測定した。反応開始後１分後と５分後の吸光度の増加と、試料中のホモシステイン濃度の関係は表４および図４に示す通りであり、ホモシステイン濃度が０〜１００μＭの範囲において直線性を示し、定量が可能であった。
【０１１９】
【表４】

【０１２０】
さらに、表４および図４からは、サイクリング法において１μｍｏｌ／Ｌのホモシステインが測定できていることがわかる。
【０１２１】
【発明の効果】
本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素はサイクリング反応が可能であるため、従来よりも高感度なホルムアルデヒドの測定が可能である。従って、当該酵素を用いたホルムアルデヒドの測定は、測定系における反応中間体としてホルムアルデヒドを生成させる、ホモシステイン、クレアチニン、クレアチン等の生体成分の臨床検査に好適に適用できる点で極めて有用である。一方、本発明のジメチルグリシンオキシダーゼはチオール化合物に対して安定であるため、ホモシステインの多くが蛋白質や他のアミノ酸とジスルフィド結合した状態で存在する、血液や尿などのような生体試料における総ホモシステインの測定に好適に使用することができ、より試薬性能に優れたホモシステイン定量試薬を提供できる点で有用である。
【０１２２】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１
ヒトベタイン−ホモシステインメチル転移酵素ｃＤＮＡを増幅するためのＰＣＲプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号２
ヒトベタイン−ホモシステインメチル転移酵素ｃＤＮＡを増幅するためのＰＣＲプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
【０１２３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】実施例４における、吸光度とホルムアルデヒド濃度との関係を示すグラフである。
【図２】実施例５における、吸光度とホルムアルデヒド濃度との関係を示すグラフである。
【図３】実施例６における、吸光度とクレアチニン濃度との関係を示すグラフである。
【図４】実施例７における、吸光度とホモシステイン濃度との関係を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a simple and highly sensitive method for measuring formaldehyde or a compound that forms formaldehyde as a reaction intermediate using glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase, and a reagent kit therefor. The present invention further relates to a method for measuring biological components such as creatinine, creatine and homocysteine via formaldehyde as an intermediate product, and a reagent kit therefor. The present invention also relates to a method for measuring homocysteine using betaine-homocysteine methyltransferase and dimethylglycine oxidase and a reagent kit therefor. Furthermore, this invention relates to the novel enzyme used suitably for said measuring method and reagent kit.
[0002]
[Prior art]
Formaldehyde is a cytotoxin that is highly reactive with proteins, membranes, DNA, and the like, and is known to cause various disorders when aspirated or taken. In recent years, formaldehyde contained in the atmosphere, industrial waste liquids, foods and the like has been regarded as a problem, and a method for measuring this simply and accurately is required.
[0003]
As a method for measuring formaldehyde, ratios using Hanz reagent, CTA reagent (J. Biol. Chem., 231, 813 (1958)), Purpald reagent (Anal. Biochem., 234 (1), 50 (1996)), etc. A color analysis method and an analysis method using a reagent combining phenylhydrazine, potassium ferricyanide, chloroform, and methanol are known. However, these methods have problems such as complicated operations and a long time for measurement, or the use of harmful reagents. As means for solving this problem, an enzyme method using glutathione-independent formaldehyde dehydrogenase (EC 2.1.1.46) has been disclosed (Japanese Patent Laid-Open Nos. 5-42000 and 2000-225000). These enzyme methods analyze reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) produced simultaneously with the production of formic acid from formaldehyde by an enzymatic reaction, or a coloring dye produced by further reaction of the coenzyme. However, since the measurement sensitivity depends on the molecular extinction coefficient of reduced NAD or a dye, it is not necessarily sufficient for measuring a trace amount of formaldehyde.
[0004]
On the other hand, as a high-sensitivity quantification method using a trace amount of enzyme, a method for amplifying and quantifying a substrate to be measured and a coenzyme acting on the substrate by a cycling reaction is known (testing and technology, vol. 27). , No8, July 1999). As one of the cycling methods, a dehydrogenase and two coenzymes (thio-NADs and NADHs, or NADs and thio-NADHs) and a measurement method using an enzyme cycling method using a reversible reaction have been reported. (Japanese Patent Publication No. 6-61278, Japanese Patent Publication No. 6-73477, Japanese Patent Publication No. 6-73478, Japanese Patent Publication No. 6-73479, Japanese Patent No. 3023700, Japanese Patent No. 3034969, Japanese Patent No. 3034979 No. 3, Patent No. 3034984, Japanese Patent No. 3034986, Japanese Patent No. 3034987, Japanese Patent No. 3034988, Japanese Patent Laid-Open No. 8-103298).
[0005]
Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-341198 discloses a highly sensitive determination method for alcohols or aldehydes using alcohol dehydrogenase and thio-NADs and NADHs, or NADs and thio-NADHs. As a representative enzyme of alcohol dehydrogenase used here, an enzyme (EC 1.1.1.1) that catalyzes the following reaction is mentioned.
[0006]
[Expression 1]

[0007]
However, in “Enzyme Handbook 9” (Springer-Verlag) edited by D. Schomburg and D. Stephan, this enzyme not only oxidizes methanol as a substrate but also forms the product formaldehyde. Is also described as oxidizing. Formaldehyde exists in a hydrated form in an aqueous solution and exists in an alcohol state, so that it becomes an oxidizable substrate for alcohol dehydrodenase, and a part thereof is oxidized to acetic acid and released outside the reaction system. Therefore, highly sensitive measurement of formaldehyde using this enzyme is not possible.
[0008]
In addition, aldehyde dehydrogenase such as glutathione-independent formaldehyde dehydrogenase irreversibly oxidizes formaldehyde, and thus cannot be applied to high-sensitivity measurement by cycling reaction.
[0009]
On the other hand, in the field of analytical science, it is known that there are compounds that can be measured via formaldehyde as an intermediate product. Among them, useful are measurement of creatinine, creatine, homocysteine and the like in clinical examination.
[0010]
Creatinine is a major diagnostic marker of renal function in clinical laboratory tests. The measurement of creatine is used for pathological analysis of muscular dystrophy, hyperthyroidism and the like. As the measurement method, the Jeff method is the mainstream, but there has been a problem with specificity. Recently, enzymatic methods using creatinine amide hydrolase, creatine amidinohydrolase, sarcosine oxidase, and peroxidase with high substrate specificity are increasing, but they may be affected by reducing substances present in the living body. There was an indication. In addition, a method of analyzing formaldehyde produced by the sarcosine oxidase reaction using glutathione-independent formaldehyde dehydrogenase instead of peroxidase in the enzymatic method has been reported (Clin. Clim. Acta, 122 , 181 (1982), Ann. Clin. Biochem., 29, 523 (1992)), as described above, was not always sufficient for the measurement of trace amounts.
[0011]
Homocysteine is an amino acid having an SH group that is produced by metabolism of methionine, which is an essential amino acid in vivo, but is further metabolized by cystathionine β-synthase and is therefore usually present in vivo at a low concentration. . It is known that homocystinuria, a genetic disorder of these metabolic enzymes that causes an increase in blood homocysteine levels, is associated with arteriosclerosis. In recent years, even at a level of homocysteine slightly higher than normal, Since it has been revealed that it is associated with cerebral infarction, myocardial infarction, deep vein thrombosis (so-called economy class syndrome), blood homocysteine concentration is now drawing attention as an independent risk factor for these diseases.
[0012]
As a method for measuring homocysteine, a method using HPLC has been used as a standard method (Clin. Chem., 39, 1590 (1993)), and various improved methods have been reported, but HPLC is used. This method requires a sophisticated analyzer and is not suitable for handling a large amount of specimens. As a method not requiring separation by HPLC, homocysteine is reacted with S-adenosylhomocysteine hydrolase in the presence of adenosine and fluorescein-labeled S-adenosylhomocysteine, and S-adenosylhomocysteine present in the reaction system. A method for measuring homocysteine by measuring anti-S-adenosylhomocysteine antibody by fluorescence polarization immunoassay (Japanese Patent Publication No. 8-506478) is known. Recently, as an enzymatic method, homocysteine is reacted with homocysteine desulfurase, and the produced ammonia, α-keto acid or hydrogen sulfide is measured (Japanese translations of PCT publication No. 2000-502262). A method for measuring hydrogen sulfide or thiol compound-substituted homocysteine produced in the presence of a thiol compound using L-methionine γ-lyase or o-acetylhomoserine lyase having an action (JP 2000-166597 A), Method for quantifying γ-substituted-α-aminobutyric acid or hydrogen sulfide produced from homocysteine by γ-substituted-α-aminobutyric acid synthase in the presence of a nucleophile capable of substituting the γ-position mercapto group of homocysteine (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-228998) has also been reported.
[0013]
However, it is known that the immunoassay method requires time and cost as compared with a general biochemical test, and is not suitable for analyzing a large number of specimens in a short time at low cost. Moreover, in the conventional analysis method using an enzyme reaction, the amount of homocysteine in the blood is generally about 10 μM or less as a normal value, so measurement sensitivity is insufficient, or due to the substrate specificity of the enzyme used. In terms of acting on substances other than homocysteine in the specimen, it cannot be said that it is sufficient for accurate measurement of the amount of homocysteine.
[0014]
Hattori and Kawamura (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-17198) measured the compounds produced by acting a transferase with homocysteine and another substance as a substrate on a sample containing homocysteine together with the other substrate. Discloses that homocysteine can be measured with higher sensitivity and higher accuracy. In particular, using betaine-homocysteine methyltransferase as a transferase and betaine as another substrate, the resulting dimethylglycine is further decomposed into sarcosine, formaldehyde and hydrogen peroxide using dimethylglycine oxidase. It is described that homocysteine can be measured with particularly high sensitivity and high accuracy by measuring any of the compounds. However, in biological samples, most of homocysteine exists in a state bound to other amino acids having proteins and thiol groups by disulfide bonds, so total homocysteine must be measured under reducing conditions. Dimethyl glycine oxidase, which is sufficiently stable under conditions, has not been reported so far and therefore could cause a reduction in reagent performance under such conditions.
[0015]
On the other hand, as a method for measuring homocysteine using the enzyme cycling method, a method for measuring pyruvic acid and ammonia produced by cystathionine β-synthase and cystathionine β-lyase (US Pat. No. 6,174,696), homocysteine desulfurase and 2-ketobutyrate dehydrogenation Methods for analyzing produced NADs or consumed thio-NADs using enzymes (Japanese Patent Laid-Open Nos. 2001-161399, 2001-149092) are known. In consideration of this, a method capable of measuring with higher sensitivity is desirable.
[0016]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, a first object of the present invention is to provide a highly sensitive and simple measuring means for formaldehyde or a compound such as homocysteine, creatinine, creatine, etc., which formaldehyde is generated as a reaction intermediate in a measurement system. . A second object of the present invention is to provide a means for measuring homocysteine with high sensitivity and ease without using HPLC or immunoassay.
[0017]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the first problem, the present inventors have aimed to establish a highly sensitive measurement method of formaldehyde using an enzyme cycling method. Therefore, as a result of extensive research, focusing on glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.1) that reversibly acts on formaldehyde as an enzyme that can be used in the method, two different types of redox We have successfully screened a novel glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase that can be used as a coenzyme, and the balance of reactivity with both enables the cycling reaction to proceed. Further, this enzyme is allowed to act on a sample together with glutathione, an oxidized coenzyme, and another coenzyme in a reduced form, and by measuring the change in the amount of any coenzyme due to the enzyme reaction, formaldehyde and the reaction intermediate It was confirmed that homocysteine, creatinine, creatine, and the like that generate formaldehyde as a body can be measured with high sensitivity and ease.
[0018]
On the other hand, the present inventors paid attention to a measurement system using betaine-homocysteine methyltransferase and dimethylglycine oxidase as a means for solving the above second problem, and exhibited characteristics suitable for use in the measurement system. As a result of diligent search for dimethylglycine oxidase, it is resistant to thiol compounds and is more resistant to dimethylglycine than conventional enzymes. _m We succeeded in isolating and purifying a novel dimethylglycine oxidase having a small value. Furthermore, when the present enzyme was applied to the above measurement system, it was confirmed that homocysteine could be measured with higher sensitivity and higher accuracy, and the present invention was completed.
[0019]
That is, the present invention has the following configuration.
(1) contacting a sample with glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase, glutathione, and oxidized coenzyme, wherein the ratio of reactivity to thio-NAD to reactivity to NAD is 30% or more, preferably 60% or more; A method for measuring formaldehyde, comprising analyzing a compound produced by the enzyme reaction.
(2) The method for measuring formaldehyde according to (1) above, wherein the glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase further has the following physicochemical properties:
(a) Action: acting on formaldehyde in the presence of one oxidized coenzyme and reduced glutathione selected from the group consisting of NADs, NADPs, thio-NADs, and thio-NADPs, and S-formylglutathione and reduction Produces type coenzyme.
(b) Optimum pH: about 7.5 to about 8.5
(c) pH stability: about 6.0 to about 9.0
(d) Thermal stability: about 40 ° C. or less (pH 7.5, treatment for 30 minutes)
(3) The glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase is derived from a microorganism, preferably a methanol-assimilating yeast, more preferably a yeast belonging to the genus Hansenula, especially Hansenula nonfermentans IFO 1473 strain A method for measuring formaldehyde according to (1) or (2) above.
(4) One compound selected from the group consisting of glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase, glutathione, thioNADs and thioNADPs, wherein the ratio of reactivity to thioNAD to reactivity to NAD is 30% or more And a compound selected from the group consisting of reduced NADs and reduced NADPs is brought into contact with a sample to cause a cycling reaction, and the amount of the compound changed by the reaction is analyzed. Method for measuring formaldehyde.
(5) selected from the group consisting of glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase, glutathione, reduced thioNADs, and reduced thioNADPs, wherein the ratio of reactivity to thioNAD to reactivity to NAD is 30% or more A compound selected from the group consisting of NADs and NADPs is brought into contact with a sample to cause a cycling reaction, and the amount of the compound changed by the reaction is analyzed. Method for measuring formaldehyde.
(6) The method for measuring formaldehyde according to (4) above, wherein the amount of the produced reduced thioNADPs or reduced thioNADs compound is analyzed.
(7) The method for measuring formaldehyde according to any one of (4) to (6) above, wherein the minimum detection sensitivity of formaldehyde is 1 μmol / L or less.
(8) In the measuring method of the biological component which produces | generates formaldehyde as a reaction intermediate, the produced | generated formaldehyde is analyzed by the method in any one of said (1)-(7), The measuring method of this biological component .
(9) Betaine, betaine-homocysteine methyltransferase, dimethylglycine oxidase and, if necessary, sarcosine oxidase are brought into contact with the sample, and formaldehyde produced by the enzyme reaction is converted to any of the above (1) to (7) A method for measuring homocysteine, characterized by measuring by a method.
(10) A method in which creatine amidinohydrolase, sarcosine oxidase and, if necessary, creatinine amide hydrolase are allowed to act, and formaldehyde produced by the enzyme reaction is measured by any one of the methods (1) to (7). And a method for measuring creatine or creatinine.
(11) Betaine, betaine-homocysteine methyltransferase, dimethylglycine oxidase which is stable against thiol compounds and, if necessary, sarcosine oxidase are brought into contact with the sample, and hydrogen peroxide produced by the enzymatic reaction is reacted in the presence of peroxidase. A method for measuring homocysteine, which comprises reacting with an oxidative coloring reagent and, if necessary, a coupler, and measuring a produced dye.
(12) Betaine, betaine-homocysteine methyltransferase, dimethylglycine oxidase which is stable against thiol compounds and, if necessary, sarcosine oxidase are brought into contact with the sample, and formaldehyde produced by the enzymatic reaction is converted into formaldehyde dehydrogenase and oxidation. A method for measuring homocysteine, characterized by measuring a reduced coenzyme produced by reacting with a type coenzyme.
(13) Betaine, betaine-homocysteine methyltransferase, dimethylglycine oxidase stable to thiol compounds and, if necessary, sarcosine oxidase are brought into contact with the sample, and formaldehyde generated by the enzyme reaction is converted into glutathione, glutathione-dependent formaldehyde A method for measuring homocysteine, which comprises reacting with a dehydrogenase and an oxidized coenzyme to measure a reduced coenzyme produced.
(14) The thiol compound is dithiothreitol, dithioerythritol, 2-mercaptoethanol, 2-mercaptoethanesulfonic acid, 2-mercaptoethylamine, cysteine, homocysteine, N-acetylcysteine, thioglycerol, thioglycolic acid, reduced type At least one selected from glutathione or a salt thereof, preferably dithiothreitol, more preferably at least 50% enzyme in the presence of 0.05 mmol / L dithiothreitol compared to the absence of dithiothreitol The method for measuring homocysteine according to any one of (11) to (13) above, wherein dimethylglycine oxidase retaining activity is used.
(15) The method for measuring homocysteine according to any one of (11) to (14) above, wherein dimethylglycine oxidase is an enzyme having the following physicochemical properties:
(a) Action: Acts on dimethylglycine in the presence of oxygen to produce sarcosine, formaldehyde and hydrogen peroxide.
(b) K for dimethylglycine _m Value: 15 mM or less
(16) The dimethylglycine oxidase is a microorganism, preferably a microorganism belonging to the genus Arthrobacter or Streptomyces, more preferably an Arthrobacter nicotianae IFO14234 strain or Streptomyces. The method for measuring homocysteine according to any one of (11) to (15) above, which is derived from a Streptomyces mutabilis IFO12800 strain.
(17) The method for measuring homocysteine according to any of (13) to (16) above, wherein the minimum detection sensitivity of homocysteine is 1 μmol / L or less.
(18) A glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase having the following physicochemical properties:
(a) Action: acts on formaldehyde in the presence of one coenzyme, reduced glutathione, selected from the group consisting of NADs, NADPs, thio-NADs, and thio-NADPs, to form S-formylglutathione, reduced complement Produce enzymes.
(b) The ratio of reactivity to thio-NAD to reactivity to NAD is 30% or more.
(c) Optimum pH: about 7.5 to about 8.5
(d) pH stability: about 6.0 to about 9.0
(e) Thermal stability: about 40 ° C. or less (pH 7.5, treatment for 30 minutes)
(19) The glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase of (18) above, which is derived from a microorganism, preferably a methanol-assimilating yeast, more preferably a yeast belonging to the genus Hansenula, especially Hansenula nonfermentans IFO1473 strain.
(20) Dimethylglycine oxidase having the following physicochemical properties.
(a) Action: Acts on dimethylglycine in the presence of oxygen to produce sarcosine, formaldehyde and hydrogen peroxide.
(b) At least 50% of the enzyme activity is retained in the presence of 0.05 mmol / L dithiothreitol compared to the absence of dithiothreitol.
(c) K for dimethylglycine _m Value: 15 mM or less
(21) The dimethylglycine oxidase according to (20) above, which is derived from a microorganism, preferably a microorganism belonging to the genus Arthrobacter or Streptomyces, more preferably a strain of Arthrobacter Nicotianae IFO14234 or Streptomyces mutabilis IFO12800 .
(22) For analyzing a glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase having a reactivity ratio to thio-NAD of 30% or more with respect to reactivity to buffer, glutathione and NAD, and a compound produced by the enzyme reaction A reagent kit for measuring formaldehyde, comprising at least a reagent.
(23) selected from the group consisting of glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase, thioNADs and thioNADPs, wherein the ratio of reactivity to thioNAD to reactivity to buffer, glutathione and NAD is 30% or more A reagent kit for measuring formaldehyde, comprising at least one compound and at least one compound selected from the group consisting of reduced NADs and reduced NADPs.
(24) It consists of glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase, reduced thioNADs and reduced thioNADPs whose reactivity ratio to thioNAD is 30% or more with respect to reactivity to buffer, glutathione and NAD A reagent kit for measuring formaldehyde, comprising at least one compound selected from the group and one compound selected from the group consisting of NADs and NADPs.
(25) The reagent kit for formaldehyde measurement according to any one of (22) to (24), wherein the glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase is the enzyme according to (18) or (19).
(26) In addition to the reagent according to any one of (22) to (25), betaine, betaine-homocysteine methyltransferase, dimethylglycine oxidase and, if necessary, sarcosine oxidase A reagent kit for measuring homocysteine.
(27) In addition to the reagent according to any one of (22) to (25) above, creatine amidinohydrolase, sarcosine oxidase, and optionally creatinine amide hydrolase, Reagent kit for measuring creatinine or creatine.
(28) Buffer, betaine, betaine-homocysteine methyltransferase, dimethylglycine oxidase stable to a thiol compound and, if necessary, sarcosine oxidase, and a reagent for measuring hydrogen peroxide produced by the enzyme reaction A reagent kit for measuring homocysteine, comprising:
(29) The reagent kit for measuring homocysteine according to (28) above, which contains a peroxidase, an oxidative coloring reagent and, if necessary, a coupler as a reagent for measuring hydrogen peroxide.
(30) Contains a buffer, betaine, betaine-homocysteine methyltransferase, dimethylglycine oxidase stable to thiol compounds and, if necessary, sarcosine oxidase, and a reagent for measuring formaldehyde generated by the enzyme reaction. A reagent kit for measuring homocysteine.
(31) The reagent kit for measuring homocysteine according to (30) above, which contains formaldehyde dehydrogenase and an oxidized coenzyme as reagents for measuring formaldehyde.
(32) The reagent kit for measuring homocysteine according to (30) above, which contains glutathione, glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase and oxidized coenzyme as reagents for measuring formaldehyde.
(33) The reagent kit for measuring homocysteine according to any one of (28) to (32), wherein dimethylglycine oxidase is the enzyme according to any one of (20) or (21).
[0020]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The method for measuring formaldehyde of the present invention can utilize two types of coenzymes, thioNADs or thioNADPs, and NADs or NADPs, and the ratio of reactivity to thioNAD to reactivity to NAD is conventionally known. A novel glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase, which is higher than the above, is allowed to act on a sample together with glutathione and one of the above oxidized coenzymes, and the amount of any compound produced or consumed is measured. .
[0021]
The glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.1) used in the present invention is a substrate for S-hydroxymethyl glutathione that is produced non-enzymatically from glutathione and formaldehyde in the presence of an oxidized coenzyme. As an enzyme that reversibly catalyzes the production of S-formylglutathione and reduced coenzyme.
[0022]
The glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase in the present invention can utilize thioNADs or thioNADPs, and NADs or NADPs as coenzymes. Examples of NADs include nicotinamide adenine dinucleotide, acetylpyridine adenine dinucleotide, acetylpyridine adenine hypoxanthine dinucleotide, and nicotinamide hypoxanthine dinucleotide. Examples of NADPs include nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. And acetylpyridine adenine dinucleotide phosphate, acetylpyridine adenine hypoxanthine dinucleotide phosphate, nicotinamide hypoxanthine dinucleotide phosphate and the like. Examples of thio NADs include thionicotinamide adenine dinucleotide and thionicotinamide hypoxanthine dinucleotide. Examples of thio NADPs include thionicotinamide adenine dinucleotide phosphate and thionicotinamide hypoxanthine dinucleotide. Specific examples include nucleotide phosphates.
[0023]
In a preferred embodiment, the method for measuring formaldehyde according to the present invention comprises glutathione, glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase, one compound selected from the group consisting of thioNADs and thioNADPs, and reduced NADs and reduced forms. One compound selected from the group consisting of NADPs is allowed to act on a sample to cause a cycling reaction, and the amount of the compound changed by the reaction is analyzed.
[0024]
In another preferred embodiment, the method for measuring formaldehyde according to the present invention comprises glutathione, glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase, one compound selected from the group consisting of reduced thioNADs and reduced thioNADPs, and NAD. And a compound selected from the group consisting of NADPs are allowed to act on a sample to cause a cycling reaction, and the amount of the compound changed by the reaction is analyzed.
[0025]
In the cycling reaction, the production of oxidized coenzyme from reduced coenzyme, or oxidized coenzyme from reduced coenzyme is generated in proportion to the reaction time, amplified with respect to the amount of substrate, Formaldehyde can be quantified with high sensitivity by measuring the absorbance around 340 nm when the coenzyme is NADs or NADPs, and measuring the absorbance around 400 nm when the coenzymes are thioNADs or thioNADPs. The glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase used in the cycling reaction does not contain a contaminating enzyme (such as S-formyl glutathione hydrolase) that decomposes formaldehyde and releases it outside the cycling reaction system. It is desirable that the content is low enough not to affect. Further, it is desirable that NAD (P) degrading enzyme is not contained at all or the content is low enough not to affect the measured value.
[0026]
In order to efficiently perform the cycling reaction, the glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase used in the present invention needs to have sufficient reactivity with thioNADs or thioNADPs. Specifically, the ratio of reactivity to thio-NAD to reactivity to NAD is 30% or more, preferably 60% or more. Further, when thioNAD (P) s are used as oxidized coenzymes, glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase in the reverse reaction is reactive against the reduced thioNAD (P) s produced by the forward reaction. The reactivity to the added reduced NAD (P) s is sufficiently high. On the other hand, when NAD (P) s are used as oxidized coenzymes, glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase is added to the reactivity against reduced NAD (P) s produced by the forward reaction in the reverse reaction. Reactivity with reduced thioNAD (P) s is sufficiently high. Glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase is known to exist widely from higher animals to microorganisms, and a human liver-derived enzyme has been reported as the enzyme having a relatively high activity against thio-NAD. (Biochem. J., 177, 869-878 (1979)), glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase in higher animals usually has a lower specific activity than that of microorganism-derived enzymes, and cycling using this enzyme is also possible. There has been no report that the reaction could be performed.
[0027]
Accordingly, the present invention provides a novel glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase that has any of the above conditions and can catalyze a cycling reaction. Preferably, the enzyme further has the following physicochemical properties:
(a) Action: acts on formaldehyde in the presence of one coenzyme, reduced glutathione, selected from the group consisting of NADs, NADPs, thio-NADs, and thio-NADPs, to form S-formylglutathione, reduced complement Produce enzymes.
(b) Optimum pH: about 7.5 to about 8.5
(c) pH stability: about 6.0 to about 9.0
(d) Thermal stability: about 40 ° C or less
Here, “pH stability” refers to a pH range in which the residual activity after treatment at 25 ° C. for 24 hours is 80% or more, and “thermal stability” refers to the residual after treatment at pH 7.5 for 30 minutes. A temperature range in which the activity is 90% or more.
[0028]
The glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase of the present invention is not particularly limited in its origin as long as it has the above-described conditions necessary for catalyzing the cycling reaction, but is preferably derived from microorganisms, more preferably methanol assimilation. Derived from yeast, more preferably derived from yeast belonging to the genus Hansenula, especially those derived from Hansenula non-fermentans IFO 1473 strain. The IFO 1473 strain is available from the Fermentation Research Institute (2-17-85 Jusohoncho, Yodogawa-ku, Osaka 532-8686).
[0029]
In addition, the glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase of the present invention maintains a balance of reactivity to the two coenzymes necessary to catalyze the cycling reaction by inducing mutations randomly or site-specifically. In such a range, it may be genetically modified so as to bring about improvement in enzyme properties such as improvement in specific activity and stability.
[0030]
The glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase of the present invention is obtained by isolating and purifying a culture of cells or tissues producing the enzyme as a raw material, or by isolating a gene encoding the enzyme protein by a conventional method, It can be obtained by a method of expressing in a suitable host using a technique. The following method is illustrated as one preferred embodiment of the former.
[0031]
First, any one of the glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase-producing bacteria (for example, Hansenula non-fermentans IFO 1473 strain) is cultured in a nutrient medium. As a nutrient medium to be used, any of a synthetic medium and a natural medium can be used as long as it contains an appropriate amount of a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance and other necessary nutrients that can be assimilated by the strain used. As the carbon source, for example, malic acid or succinic acid is used. As the nitrogen source, for example, nitrogen-containing natural products such as peptones, meat extracts and yeast extracts, and inorganic nitrogen-containing compounds such as ammonium chloride and ammonium citrate are used. As the inorganic substance, potassium phosphate, sodium phosphate, magnesium sulfate or the like is used.
[0032]
The culture is usually performed by shaking culture or aeration and agitation culture. The culture temperature is about 20 to about 40 ° C, preferably about 25 to about 37 ° C. The culture pH is controlled in the range of about 5 to about 9, preferably about 6 to about 8. However, as long as the strain used can grow, it can be carried out under other conditions. The culture period is usually about 1 to about 7 days, and glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase is usually produced and accumulated in the cells.
[0033]
Purification of the glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase of the present invention can be performed using a commonly used purification method. For example, the bacterial cell fraction can be extracted by recovering the bacterial cells by ultrasonic disruption, mechanical disruption using glass beads, French press, dissolution with a surfactant, or the like. The obtained extract is subjected to salting-out using ammonium sulfate or sodium nitrate, metal coagulation using magnesium chloride or calcium chloride, coagulation using protamine or polyethyleneimine, DEAE (diethylaminoethyl) -sepharose, CM The glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase can be purified by subjecting it to ion exchange chromatography using (carboxymethyl) -sepharose or the like.
[0034]
The method for measuring formaldehyde using a cycling reaction with glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase of the present invention will be described in more detail with reference to an example in which a thioNAD (P) compound is used as an oxidized coenzyme. When reduced glutathione, glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase, oxidized thio-NAD (P) compounds and reduced NAD (P) compounds are brought into contact with the sample, formaldehyde, reduced glutathione and oxidized form contained in the sample S-formylglutathione and reduced thioNAD (P) compounds are produced from thioNAD (P) compounds. Next, glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase uses an excessively reduced NAD (P) compound as a coenzyme, and returns the produced S-formyl glutathione to formaldehyde and glutathione again. Hereinafter, a forward reaction using an oxidized thio-NAD (P) compound as a coenzyme and a reverse reaction using a reduced NAD (P) compound as a coenzyme are repeated, resulting in a large number of molecules per molecule of formaldehyde. The reduced thio-NAD (P) compounds are produced. On the other hand, reduced NAD (P) compounds are consumed as the reaction cycle progresses. Therefore, by monitoring the increase in the amount of reduced thio-NAD (P) compounds or the decrease in the amount of reduced NAD (P) compounds using the absorbance as an indicator as described above, even low concentrations of formaldehyde can be detected with high sensitivity. can do.
[0035]
Further, in the above measurement system, NAD (P) s can be used as a coenzyme, but thioNAD (P) s can not be substantially used as a coenzyme, and a substrate for the enzyme is further added. The oxidized NAD (P) compounds can be regenerated into a reduced form. In this case, the measurement of formaldehyde is performed using the increase in reduced thioNAD (P) compounds as an index. As a combination of other enzymes and their substrates used in such a measurement system, NADs can be used, for example, malate dehydrogenase (EC 1.1.1.37) (for example, derived from porcine or bovine heart muscle) And L-malate, glycerol-3-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.8) (eg, from rabbit muscle) and L-glycerol-3-phosphate, glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.12) (eg, Rabbit skeletal muscle or liver, from yeast or E. coli) and D-glyceraldehyde phosphate and phosphate, glucose-6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.49) (eg from Leuconostoc bacteria) and glucose -6-phosphate, glucose dehydrogenase (EC 1.1.1.47) (for example, Bacillus bacteria, Pseudomonas bacteria) And β-D-glucose, glutamic acid dehydrogenase (EC 1.4.1.3) (for example, derived from bovine liver), L-glutamic acid and the like can utilize NADPs, for example, glyoxylate dehydrogenase (EC 1.2.1.17 ) (For example from Pseudomonas oxalaticus) and CoA and glyoxylic acid, phosphogluconate dehydrogenase (EC 1.1.1.44) (for example from rat liver, brewer's yeast or E. coli) and 6-phospho-D- Gluconic acid, glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.13) (for example, derived from plant chloroplasts) and D-glyceraldehyde-3-phosphate and phosphate, glucose-6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.49) (E.g., from yeast or Leuconostoc bacteria) and glucose-6-phosphate, Examples include lucose dehydrogenase (EC 1.1.1.47) (for example, derived from Bacillus bacteria and Pseudomonas bacteria), β-D-glucose, glutamate dehydrogenase (EC 1.4.1.3) (for example, derived from bovine liver), L-glutamic acid, and the like. It is done.
[0036]
According to the cycling method using the glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase of the present invention, a trace amount of formaldehyde having a concentration of 1 μmol / L or less in a sample can be detected.
[0037]
However, measurement of formaldehyde using the glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase of the present invention can also be performed as follows without involving a cycling reaction.
Specifically, glutathione, glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase and thio-NADs, thio-NADPs, NADs, and one oxidized coenzyme selected from the group consisting of NADPs are brought into contact with a sample, and S-formyl glutathione produced Can be measured by measuring the absorbance in the ultraviolet region as an index. Alternatively, formic acid produced by further reacting with S-formylglutathione hydrolase (EC 3.1.1.12) is further decomposed into carbon dioxide using formate dehydrogenase (EC1.2.1.2; EC 1.2.1.43), Formaldehyde can also be measured by measuring the produced reduced coenzyme.
[0038]
S-formylglutathione hydrolase is known to exist in animal organs, methanol-assimilating yeast, bacteria, and the like, and can be collected and used from these sources. In addition, formate dehydrogenase is an enzyme present in plant seeds, methanol-assimilating yeast, bacteria, and the like, and can be collected and used from these sources. Alternatively, a commercially available enzyme (for example, Sigma FORMATE DEHYDROGENASE) may be used.
[0039]
Reduced coenzymes (NADHs or NADPHs) produced by the above series of enzyme reactions can be analyzed by measuring absorbance or fluorescence in the ultraviolet region. The reduced coenzyme can also be measured by measuring a formazan dye produced when a tetrazolium salt is reduced in the presence of an electron carrier such as diaphorase or methylphenadium methyl sulfate.
[0040]
The formaldehyde measurement method of the present invention can be preferably used as the final step in various biological component measurement methods that produce formaldehyde as a reaction intermediate for multistage measurement.
[0041]
For example, measurement of creatinine or creatine is performed by causing creatine amidinohydrolase and sarcosine oxidase (or creatinine amide hydrolase in the case of creatinine) to act on a sample and decomposing creatinine or creatine into glycine, formaldehyde and hydrogen peroxide. This is done by measuring hydrogen peroxide to be measured using a chromogenic substrate or the like. Therefore, creatinine or creatine can be measured with high sensitivity by measuring formaldehyde using the glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase of the present invention instead of the reagent for quantifying hydrogen peroxide.
[0042]
Accordingly, the present invention provides creatine amidinohydrolase, sarcosine oxidase, and optionally creatinine amide hydrolase in contact with a sample to form formaldehyde, and further, the glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase, glutathione, and thiol of the present invention. Contacting one oxidized coenzyme selected from the group consisting of NADs, thio-NADPs, NADs and NADPs, and, if necessary, another type of reduced coenzyme different from the oxidized coenzyme, A method for measuring creatinine or creatine by analyzing the amount of a compound produced or consumed is provided.
[0043]
The creatine amidinohydrolase, sarcosine oxidase and creatinine amide hydrolase to be used are not particularly limited and can be collected using known techniques from microorganisms producing these enzymes, and various commercially available enzymes can also be used. it can. For example, creatine amidinohydrolase is derived from bacteria belonging to the genus Bacillus, Corynebacterium, Micrococcus, Actinobacillus, Alcaligenes, and the creatinine amide hydrolase is Pseudomonas genus, Alkaligenes. From genus, Flavobacterium, Corynebacterium, Micrococcus, Penicillium, etc., as sarcosine oxidase, various animals, microorganisms belonging to Arthrobacter, Penicillium, Bacillus, etc. The thing of origin is mentioned.
[0044]
For homocysteine measurement, betaine, betaine-homocysteine methyltransferase and dimethylglycine oxidase are allowed to act on the sample to decompose homocysteine into sarcosine, hydrogen peroxide and formaldehyde, and the generated hydrogen peroxide is a chromogenic substrate. It can carry out by measuring using etc. Thus, in the same manner as described above, homocysteine can be measured by measuring formaldehyde using the glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase of the present invention instead of the reagent for quantifying hydrogen peroxide.
[0045]
Betaine-homocysteine methyltransferase (EC 2.1.1.5) used in the present invention is an enzyme that acts on homocysteine using betaine as another substrate to produce dimethylglycine and methionine. It can be collected from microorganisms such as Pseudomonas and Aspergillus. Betaine, the other substrate of this enzyme, is commercially available in the form of hydrochloride at low cost.
[0046]
Dimethylglycine oxidase (EC 1.5.3.10) is an enzyme that acts on dimethylglycine produced by betaine-homocysteine methyltransferase and decomposes into sarcosine, formaldehyde, and hydrogen peroxide. For example, the genus Cylindrocarpon It can be collected from microorganisms such as the genus Achromobacter and Arthrobacter.
[0047]
In addition, when sarcosine oxidase is allowed to act on sarcosine produced by dimethylglycine oxidase, twice the amount of formaldehyde is produced, so that the detection sensitivity can be further increased. As sarcosine oxidase, those described above for the method for measuring creatinine or creatine can be used in the same manner.
[0048]
Examples of other measurement targets that generate formaldehyde as a reaction intermediate include methanol, uric acid and the like (Clin. Chem., 33/12, 2204-2208 (1987), Clin. Biochem., 27/2, 93-97 (1994)). That is, methanol produces formaldehyde and hydrogen peroxide by alcohol oxidase (EC 1.1.3.13). In addition, uric acid produces formaldehyde by reacting hydrogen peroxide produced by the reaction of uricase (EC 1.7.3.3) with catalase (EC 1.11.1.6) in the presence of methanol. It can be analyzed by the method.
[0049]
The present invention also provides a reagent kit for use in the above-described method for measuring formaldehyde. The reagent kit for measuring formaldehyde in the present invention comprises at least a buffer, glutathione, the aforementioned glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase of the present invention, and a reagent for analyzing the compound produced by the enzyme reaction. The reagent kit preferably further contains one oxidized coenzyme selected from the group consisting of NADs, NADPs, thio-NADs, and thio-NADPs.
[0050]
As a reagent for analyzing a compound produced by the reaction of glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase, as a reagent for analyzing S-formylglutathione, S-formylglutathione hydrolase, formate dehydrogenase, and reduced form produced Examples include reagents for analyzing coenzymes. As the reagents for analyzing S-formylglutathione hydrolase, formate dehydrogenase and the resulting reduced coenzyme, those described above can be preferably used. In addition, since S-formylglutathione can be directly measured by analyzing the absorbance in the ultraviolet part of the reaction solution, in this case, instead of the above-mentioned reagents, reagents or instruments necessary for absorbance measurement are included. You can also.
[0051]
Examples of the buffer used in the reagent kit of the present invention include Tris-HCl buffer, phosphate buffer, borate buffer, and GOOD buffer. Tris-HCl buffer and phosphate buffer are susceptible to pH fluctuations depending on the concentration and temperature, but have the advantage of being inexpensive. On the other hand, the GOOD buffer is specifically exemplified by MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, BES, MOPS, TES, HEPES, Tricine, Bicine, POPSO, TAPS, CHES, CAPS, etc. It is used a lot. The type, concentration and pH of these buffer solutions are selected from one or more depending on the purpose such as storage of each reagent component and enzyme reaction, but the pH at the time of enzyme reaction is 5 when any buffer solution is used. It is preferably used in the range of 0.0 to 10.0.
[0052]
In addition, metal salts, proteins, amino acids, sugars, organic acids, and the like can be used as stabilizers in the reagents constituting the reagent kit of the present invention. Examples of the metal salt include sodium, potassium, magnesium, calcium, iron, copper, zinc, manganese and the like. Proteins that do not affect the enzyme reaction are desirable, but examples include bovine serum albumin, egg albumin, and gelatin. Examples of amino acids include glycine, lysine, glutamic acid, glycylglycine, polylysine and the like. As the sugar, monosaccharide, disaccharide, oligosaccharide, polysaccharide and derivatives thereof can be used. Specifically, glucose, fructose, galactose, mannose, xylose, lactose, sucrose, maltose, trehalose, maltotriose, maltotetraose, maltosyl cyclodextrin, α-cyclodextrin, β-cyclodextrin, γ-cyclo Examples include dextrin, dextrin, amylose, glycogen, starch, inulin, glucosamine, inositol, mannitol, sorbitol, ribitol, deoxyglucose and the like. Examples of the organic acid include α-ketoglutaric acid, malic acid, fumaric acid, gluconic acid, cholic acid, deoxycholic acid, and the like. In addition, boric acid, borax, sodium chloride, potassium chloride, ammonium sulfate, glycerol, Ficoll and the like can also be used.
[0053]
Furthermore, a preservative and a surfactant may be added to the reagent constituting the reagent kit of the present invention as long as the reagent performance is not adversely affected. Examples of antiseptics include sodium azide, chelating agents, various antibiotics, antibacterial agents, and antifungal agents. Specifically, in addition to sodium azide, EDTA and its salts (including metal chelates), CyDTA, GHEG, DPTA-OH, DTPA, EDDA, EDDP, EDDPO, EDTA-OH, EDTPO, EGTA, HBED, HDTA, HIDA , IDA, Methyl-EDTA, NTA, NTP, NTPO, TTHA (commercially available from Dojin), BND, CAA, HPO, IZU, MIT (commercially available from Roche), ProClin150, ProClin300 (commercially available from Rohm & Haas) ), Bactericides such as benzalkonium chloride, Kathon CG, p-hydroxymethylbenzoate, amphotericin B, ampicillin, blasticidin S, chloramphenicol, dihydrostreptomycin, clindamycin, cycloheximide, Philippines, G418 Gentamycin, hygromycin, kanamycin, lincomycin, neomycin, Romofunjin, polyoxin, penicillin, sulfamethizole, antibiotics such as tetracycline is available. Examples of the surfactant include nonionic surfactants, cationic surfactants, anionic surfactants, and amphoteric surfactants. Specifically, Adecatol 720N, B-795, B-797, LO-7, NP-690, NP-695, NP-720, PC-8, SO-120, SO-145, Blige 35, 98, 700 , Emulgen 109P, 430, 460, 707, 709, 810, 911, 935, 950, A-60, B66, n-dodecyl maltoside, Genapol X-080, MEGA-7, 8, 9, 10, Nikkor BL- 9EX, BL-20TX, HCD-100, MGO, MYO-6, MYL-10, NP-18TX, OP-10, TL-10, TMGO5, SL-10, octyl α-glucoside, octyl β-glucoside, octylthio Glucoside, octylthiogalactoside, pentaethylene glycol dodecyl ether, polyethylene ether -1, Pluronic F-68, L-71, P-103, Nonidet P40, Rheodor 460, TWL-103, TWL-106, Saponin, Sarcosinate PN, Span 20, 85, SM 1080, Sucrose monolaurate, Tetronic 704 Nonionic surfactants such as Tesit, Triton X-100, X-114, X-305, Tween 20, 40, 80, bis (hydroxyethyl)-(stearoylaminomethylcarbonyloxy) ethylamine chloride, benzyl methyl sulfate Laurylmethylsulfonium, 2-[(4-t-octylphenoxy) ethoxy] ethylmorpholine chloride, laurylpyridinium chloride, lauryl (tri-p-tolyl) phosphonium chloride, laurylphenylcyclotetramethylene hofphoni Cationic surfactants such as umbromide, cetylpyridium chloride, cetyltrimethylammonium chloride, (polyoxyethylene) laurylamine, anionic interfaces such as sodium cholate, deoxycholic acid, N-lauroylsarcosine, taurocholic acid Activator, CHAPS, CHAPSO, N, N-bis (octylaminoethyl) glycine, N-carboxymethyl-N- (stearyloxymethyl) pyridium betaine, N-palmitylsulfotaurine, lauryldimethylamine oxide, N- ( Amphoteric surfactants such as laurylthioethoxy) methyl-N, N-dimethylbetaine can be used.
[0054]
Another reagent kit for measuring formaldehyde of the present invention includes one compound selected from the group consisting of thioNADs and thioNADPs, in addition to glutathione and the glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase of the present invention, and reduced NADs And one compound selected from the group consisting of reduced NADPs, or one compound selected from the group consisting of reduced thioNADs and reduced thioNADPs, and NADs and NADPs It further contains one compound selected from the group consisting of the above.
[0055]
According to these reagent kits, high-sensitivity measurement of formaldehyde by the above cycling reaction can be easily performed. As NADs, NADPs, thio-NADs, and thio-NADPs, those described above can be used. In addition, the reagent kit may further contain the above-described enzyme that regenerates the oxidized coenzyme produced by the cycling reaction into a reduced form and its substrate.
[0056]
In the reagent kit for measuring formaldehyde of the present invention, each of the above-described reagent components can be stored alone, or two or more components can be stored in the same reagent. Therefore, the reagent kit of the present invention may be a single reagent composition containing all the reagent components described above. However, when there are components that interfere with each other or there are components that are difficult to ensure stability under a single storage condition, it is preferable to store the components separately.
[0057]
The present invention provides a reagent kit for measuring creatinine or creatine, which further contains creatine amidinohydrolase, sarcosine oxidase and, if necessary, creatinine amide hydrolase, in addition to the reagent components for measuring formaldehyde described above. As these enzymes, those described above can be used as appropriate.
[0058]
Another invention provides a reagent kit for measuring homocysteine, further comprising at least betaine, betaine-homocysteine methyltransferase, and dimethylglycine oxidase in addition to the reagent components for measuring formaldehyde. . As these enzymes and substrates, those described above can be preferably used.
[0059]
However, if the sample to be measured is a biological sample, especially plasma or urine, the homocysteine contained is mostly bound to circulating proteins such as albumin, or like cysteine and other homocysteine molecules. Exists in the form of disulfide conjugates with free amino acids. Therefore, when measuring the total homocysteine, it is necessary to previously treat the sample with a reducing agent or an enzymatic reaction to generate free homocysteine.
[0060]
Examples of the reducing agent used in this case include thiols, borohydrides, amalgam, phosphine and phosphothioate. Specifically, as thiols, dithiothreitol, dithioerythritol, 2-mercaptoethanol, 2-mercaptomethylamine, cysteine, cystamine, cysteine thioglycolate, thioglycolic acid, reduced glutathione, and the like as borohydrides Includes sodium borohydride, and examples of the amalgam include sodium amalgam.
[0061]
However, when the activity of the enzyme used in the present invention is inhibited by the thiol compound, there is a possibility that the reagent performance may be lowered. However, dimethylglycine oxidase which is not affected by the thiol compound has been reported so far. However, it has been isolated and purified for the first time by the present invention.
[0062]
Accordingly, the present invention provides a novel dimethylglycine oxidase that is stable against thiol compounds. Such thiol compounds include dithiothreitol, dithioerythritol, 2-mercaptoethanol, 2-mercaptoethanesulfonic acid, 2-mercaptoethylamine, cysteine, homocysteine, N-acetylcysteine, thioglycerol, thioglycolic acid, reduction Type glutathione or at least one selected from these salts.
[0063]
Here, “stable to thiol compound” does not affect the accurate measurement of homocysteine in the presence of the amount of thiol compound necessary to reduce all the homocysteine in the sample to free form. It means that the enzyme activity can be retained to a certain extent. Preferably, the dimethylglycine oxidase of the present invention retains at least 50% enzyme activity in the presence of 0.05 mmol / L dithiothreitol compared to the absence of dithiothreitol.
[0064]
More preferably, the dimethylglycine oxidase of the present invention is an enzyme having the following physicochemical properties.
(a) Action: Acts on dimethylglycine in the presence of oxygen to produce sarcosine, formaldehyde and hydrogen peroxide.
(b) Km value for dimethylglycine: 15 mM or less
[0065]
The origin of the dimethylglycine oxidase of the present invention is not particularly limited as long as it has stability to the above thiol compound, but is preferably derived from microorganisms such as Arthrobacter or Streptomyces, and particularly preferably Arthro Examples include those derived from the Bacter nicotianae IFO 14234 strain or the Streptomyces mutabilis IFO 12800 strain. Both the IFO 14234 strain and the IFO 12800 strain are available from the Fermentation Research Institute (2-17-85 Jusohoncho, Yodogawa-ku, Osaka 532-8686, Japan).
[0066]
Further, the dimethylglycine oxidase of the present invention improves enzyme properties such as improving specific activity and stability within a range that retains resistance to the above-mentioned thiol compounds by inducing mutation randomly or site-specifically. It may be genetically modified to produce
[0067]
The dimethylglycine oxidase of the present invention can be obtained by isolating and purifying a culture of a cell or tissue producing the enzyme as a raw material, or by isolating a gene encoding the enzyme protein by a conventional method and using a gene recombination technique. It can be obtained by a method of expression in an appropriate host. The following method is illustrated as one preferred embodiment of the former.
[0068]
First, any of the above dimethylglycine oxidase producing bacteria, for example, Arthrobacter Nicotianae IFO14234 strain or Streptomyces mutabilis IFO12800 strain is cultured in a nutrient medium. As a nutrient medium to be used, any of a synthetic medium and a natural medium can be used as long as it contains an appropriate amount of a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance and other necessary nutrients that can be assimilated by the strain used. As the carbon source, for example, malic acid or succinic acid is used. As the nitrogen source, for example, nitrogen-containing natural products such as peptones, meat extracts and yeast extracts, and inorganic nitrogen-containing compounds such as ammonium chloride and ammonium citrate are used. As the inorganic substance, potassium phosphate, sodium phosphate, magnesium sulfate or the like is used.
[0069]
The culture is usually performed by shaking culture or aeration and agitation culture. The culture temperature is about 20 to about 40 ° C, preferably about 25 to about 37 ° C. The culture pH may be controlled in the range of about 5 to about 9, preferably about 6 to about 8. However, as long as the strain to be used can grow, it can also be carried out under other conditions. The culture period is usually about 1 to about 7 days, and dimethylglycine oxidase is usually produced and accumulated in the cells.
[0070]
The dimethylglycine oxidase of the present invention can be purified using a commonly used purification method. For example, the bacterial cell fraction can be extracted by recovering the bacterial cells by ultrasonic disruption, mechanical disruption using glass beads, French press, dissolution with a surfactant, or the like. The obtained extract is subjected to salting-out using ammonium sulfate or sodium nitrate, metal coagulation using magnesium chloride or calcium chloride, coagulation using protamine or polyethyleneimine, DEAE (diethylaminoethyl) -sepharose, CM Dimethylglycine oxidase can be purified by subjecting it to ion exchange chromatography using (carboxymethyl) -sepharose or the like.
[0071]
The present invention also provides a method for measuring homocysteine using the above dimethylglycine oxidase of the present invention. In this method, betaine, betaine-homocysteine methyltransferase and the dimethylglycine oxidase of the present invention are allowed to act on a sample to decompose homocysteine contained in the sample into sarcosine, hydrogen peroxide and formaldehyde, and the products thereof. Any one of the above is analyzed.
[0072]
As for betaine and betaine-homocysteine methyltransferase, those described above can be preferably used.
[0073]
Dimethylglycine oxidase decomposes dimethylglycine into sarcosine, formaldehyde and hydrogen peroxide in the presence of oxygen as shown in the following formula.
[0074]
[Expression 2]

[0075]
Therefore, by measuring the oxygen consumption during the reaction, or by measuring the amount of hydrogen peroxide produced using a hydrogen peroxide sensor, or directly or in the presence of peroxidase, the amount of hydrogen peroxide produced is measured. Can be measured. Alternatively, the produced formaldehyde can be indirectly measured by measuring the absorbance or fluorescence of the ultraviolet or visible part using Hanz reagent, formaldehyde dehydrogenase, formaldehyde oxidase, or the like. For example, reduced NAD (NADH) produced from NAD by formaldehyde dehydrogenase reduces a tetrazolium salt in the presence of an electron carrier such as diaphorase or methylphenadium methyl sulfate to produce a formazan dye. By measuring this, homocysteine can be quantified.
[0076]
Furthermore, when sarcosine oxidase (EC 1.5.3.1) is added in addition, sarcosine is decomposed into glycine, formaldehyde and hydrogen peroxide, so that it can be measured by sensitively doubling formaldehyde or hydrogen peroxide. Further, the sensitivity can be further improved by further degrading formaldehyde into hydrogen peroxide by acting formaldehyde oxidase.
[0077]
As described above, sarcosine oxidase can be collected from various animals, microorganisms such as Arthrobacter, Penicillium, and Bacillus. Commercially available enzymes can also be used.
[0078]
The enzyme may be an enzyme obtained by isolating a gene encoding each enzyme protein from the producing bacteria and expressing the gene by a genetic engineering technique. Furthermore, a gene modified so as to bring about an improvement in enzyme properties, for example, to improve the specific activity and stability of the enzyme protein is also included.
[0079]
Hydrogen peroxide produced by dimethylglycine oxidase (and possibly by sarcosine oxidase and formaldehyde oxidase) can be measured directly by measuring UV absorbance or by catalase and titanium oxide reagents (Agric. Biol. Chem., 38, 1213). (1974)) can be performed by colorimetric analysis or titration with potassium permanganate. For high-sensitivity measurement, oxidative coloration in the presence of peroxidase It is preferable to quantify by reacting with a reagent and, if necessary, a coupler such as 4-aminoantipyrine or 3-methyl-2-benzothiazolinone, and measuring the resulting dye. The coloring reagent to be used is not particularly limited, and various commercially available ones can be used. Specific examples include N-ethyl-N-sulfopropyl-m-anisidine, N-ethyl-N. -Sulfopropyl-aniline, N-methyl-N-sulfopropyl-aniline, N-butyl-N-sulfopropyl-aniline, N-ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethoxyaniline, N-sulfopropyl-3 , 5-dimethoxyaniline, N-ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethylaniline, N-ethyl-N-sulfopropyl-m-toluidine, N-ethyl-N-sulfopropyl-o-toluidine, N- Ethyl-N-sulfopropyl-p-toluidine, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-anisidine, N Ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) aniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline, N- (2-hydroxy-3-sulfo) Propyl) -3,5-dimethoxyaniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethylcyanylin, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) ) -M-Toluidine, N-sulfopropylaniline, p-chlorophenol, p-bromophenol, 2,4-dichlorophenol, p-hydroxybenzoic acid, 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine, N -(3-sulfopropyl) 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine, N, N, N', N ', N ", N" -hexa (3-sulfopropyl) -4,4', 4 "-Tria Bruno and triphenylmethane and the like. Further, hydrogen peroxide directly or oxygen consumption under catalase coexistence with sensors can also be determined by monitoring.
[0080]
Sarcosine produced by dimethylglycine oxidase can be generated by the above-mentioned method to analyze formaldehyde or hydrogen peroxide produced by the action of sarcosine oxidase, and by producing sarcosine dehydrogenase in the presence of an electron carrier or chromogenic dye. It is also possible to analyze by measuring the dye to be. Examples of the electron carrier include diaphorase, methylphenadium methyl sulfate, methylene blue, and potassium ferricyanide. Examples of the dye include tetrazolium salts and indophenol. In addition, sarcosine dehydrogenase can be collected directly from mammals, Pseudomonas microorganisms, or the like, or from a recombinant in which the gene of the enzyme is produced by genetic engineering techniques.
[0081]
Formaldehyde produced by dimethylglycine oxidase (and possibly by sarcosine oxidase) is preferably glutathione, glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase and oxidized coenzyme, and, if necessary, a type different from the oxidized enzyme. The reduced coenzyme is allowed to act on a sample and analyzed by analyzing the compound produced or consumed.
[0082]
As the glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase, it is most preferable to use the above-mentioned enzyme newly obtained in the present invention. However, conventionally known enzymes derived from mammals, higher plants, methanol-assimilating yeast, bacteria, etc. Can be used as well. For example, a commercially available enzyme derived from the genus Candida can be used. Specific examples include FORMALDEHYDE DEHYDROGENASE (Glutathione dependent) manufactured by Sigma.
[0083]
The enzyme may be a gene encoding an enzyme protein isolated from the producing bacteria and expressed by genetic engineering techniques. Furthermore, the enzyme properties are modified, for example, by improving the enzyme specific activity and stability. Mutants and chemically modified enzymes are also included.
[0084]
Coenzymes include nicotinamide adenine dinucleotides (NADs), nicotinamide adenine dinucleotide phosphates (NADPs), thionicotinamide adenine dinucleotides (thioNADs) or thionicotinamide adenine dinucleotide phosphates ( Thio NADPs) may be used, and NADs or NADPs may be appropriately used as long as glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase can be used as a coenzyme. However, known NADs include nicotinamide adenine dinucleotide. Acetylpyridine adenine dinucleotide, acetylpyridine adenine hypoxanthine dinucleotide, nicotinamide hypoxanthine dinucleotide, etc., and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate as NADPs Acetylpyridine adenine dinucleotide phosphate, acetylpyridine adenine hypoxanthine dinucleotide phosphate and nicotinamide hypoxanthine dinucleotide phosphate are exemplified. As thio-NADs or thio-NADPs, those in which glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase can be used as a coenzyme can be used as appropriate, and as known ones, thionicotinamide adenine dinucleotide, thionicotinamide Specific examples include hypoxanthine dinucleotide, thionicotinamide adenine dinucleotide phosphate, thionicotinamide hypoxanthine dinucleotide phosphate, and the like.
[0085]
As a method for measuring formaldehyde when a conventionally known glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase is used, any means other than the method described above for the novel glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase of the present invention except for the measurement method via cycling reaction is used. Can be used similarly.
[0086]
According to the measurement method of the present invention using betaine-homocysteine methyltransferase, the dimethylglycine oxidase of the present invention and the glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase, detection of a trace amount of homocysteine having a concentration of 1 μmol / L or less in the sample Is possible.
[0087]
The present invention also provides a reagent kit for use in the above method for measuring homocysteine. The reagent kit for measuring homocysteine of the present invention comprises a buffer solution, betaine, betaine-homocysteine methyltransferase, dimethylglycine oxidase of the present invention which is stable against thiol compounds, and formaldehyde, sarcosine or It contains a reagent for analyzing at least one of hydrogen peroxide. Furthermore, sarcosine oxidase may be included. As for betaine-homocysteine methyltransferase and sarcosine oxidase, those described above are preferable, but are not particularly limited. Here, the reagent for analyzing formaldehyde, sarcosine, or hydrogen peroxide produced by the enzyme reaction specifically includes those based on the principle as described above. That is, as a reagent for analyzing formaldehyde, formaldehyde dehydrogenase, formaldehyde oxidase, Hanz reagent, CTA reagent (J. Biol. Chem., 231, 813 (1958)), Purpald reagent (Anal. Biochem., 234) (1), 50 (1996)) and a reagent combining phenylhydrazine, potassium ferrianide, chloroform, and methanol. Reagents for analyzing hydrogen peroxide include peroxidase, oxidative coloring reagent, and couplers such as 4-aminoantipyrine and 3-methyl-2-benzothiazolinone, catalase, titanium oxide reagent, peroxidase as necessary. Examples include potassium manganate. Examples of the reagent for analyzing sarcosine include sarcosine oxidase, formaldehyde generated by the enzyme reaction, the above-described reagent for analyzing hydrogen peroxide, sarcosine dehydrogenase, an electron carrier, and a coloring dye.
[0088]
In a particularly preferred embodiment, the homocysteine measurement reagent kit of the present invention comprises a buffer, betaine, betaine-homocysteine methyltransferase, dimethylglycine oxidase, glutathione, glutathione-dependent formaldehyde of the present invention that is stable against thiol compounds. It contains a dehydrogenase and an oxidized coenzyme that can be used by the glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase. If necessary, sarcosine oxidase can be further included. As betaine, betaine-homocysteine methyltransferase, glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase and oxidized coenzyme, those described above can be preferably used. In addition, when using the enzyme newly obtained in the present invention as a glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase and measuring formaldehyde through a cycling reaction, the reagent kit is different from the above oxidized coenzyme. It is preferable to further include a type of reduced coenzyme.
[0089]
As the buffer solution, those exemplified as the buffer solution contained in the reagent kit for measuring formaldehyde, such as Tris-HCl buffer solution, phosphate buffer solution, borate buffer solution, and GOOD buffer solution, can be used similarly. . One or a plurality of types, concentrations, and pH of the buffer solution are selected depending on purposes such as storage of each reagent component and enzyme reaction, but the pH at the time of enzyme reaction is 5. It is preferably used in the range of 0 to 10.0.
[0090]
The reagent constituting the homocysteine measurement reagent kit of the present invention includes various metal salts, proteins, amino acids, sugars, organic compounds exemplified as the stabilizer for the reagent constituting the formaldehyde measurement reagent kit. An acid etc. can be contained similarly. Furthermore, you may add the above preservatives and surfactants in the range which does not have a bad influence on reagent performance.
[0091]
In the reagent kit for measuring homocysteine of the present invention, each of the above-mentioned reagent components can be stored alone, or two or more components can be stored in the same reagent. Therefore, the reagent kit of the present invention may be a single reagent composition containing all the reagent components described above. However, when there are components that interfere with each other or there are components that are difficult to ensure stability under a single storage condition, it is preferable to store the components separately.
[0092]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but the present invention is not limited thereto.
[0093]
Example 1 Acquisition of glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase
The activity of the glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase of the present invention was measured using the following reagents and measurement conditions.
<reagent>
Reagent A 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5)
Reagent B 10 mM oxidized NAD aqueous solution
Reagent C 20 mM formaldehyde aqueous solution
Reagent D 20 mM glutathione aqueous solution
<Measurement condition>
Reagent A, reagent B, reagent C, and reagent D are mixed at a ratio of 2.1 ml, 0.3 ml, 0.3 ml, and 0.3 ml, respectively, to prepare a reagent mixture. After pre-warming 3 ml of this reagent mixture at 37 ° C. for about 5 minutes, 0.1 ml of enzyme solution is added and mixed, and the mixture is reacted at 37 ° C. for 4 minutes. At this time, the change in absorbance per minute at 340 nm is measured. In the blind test, distilled water is added to the reagent mixture instead of the enzyme solution, and the change in absorbance is measured in the same manner. The amount of enzyme that produces 1 micromole of hydrogen peroxide per minute under the above conditions is defined as 1 unit (U).
[0094]
The methanol-utilizing yeast Hansenula nonfermentans IFO 1473 strain was inoculated into 60 ml of YPD medium (1% D-glucose, 1% polypeptone, 1% yeast extract; pH 5.0) at 30 ° C., 24 ° C. After time-shaking culture, 6 L of glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase production medium (2% methanol, 0.5% D-glucose, 1% polypeptone, 1.6% yeast extract, 0.2% dipotassium hydrogen phosphate , 0.7% monopotassium dihydrogen phosphate) and cultured with aeration and stirring at 30 ° C. for 48 hours. After completion of the culture, the culture solution was centrifuged and suspended in 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5). Next, the cells were crushed with glass beads and centrifuged to obtain a supernatant. The resulting enzyme solution was denucleated with polyethyleneimine and fractionated with ammonium sulfate, then desalted with Sephadex G-25, DEAE Sepharose chromatography, phenyl Sepharose chromatography, hydroxyapatite chromatography, and Superdex 200 gel filtration chromatography. The purified enzyme preparation was about 90 mg. The sample obtained by this method showed a single band on electrophoresis (SDS-PAGE), and the specific activity at this time was about 250 U / mg protein.
[0095]
Further, the enzyme activity of the glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase obtained by the above method was measured under the same conditions as the above activity measurement conditions except that oxidized thio-NAD was used instead of oxidized NAD of reagent B. The reactivity of the enzyme to oxidized thio-NAD was 61% of that to oxidized NAD.
[0096]
On the other hand, as a comparative example, the enzyme activity of a commercially available glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase (derived from Candida boidinii; manufactured by SIGMA) was measured in the same manner. As a result, the reactivity of the enzyme with oxidized thioNAD was determined to be oxidized NAD. 22% of that.
[0097]
Example 2 Obtaining Betaine-Homocysteine Methyltransferase
The activity of betaine-homocysteine methyltransferase of the present invention was measured using the following reagents and measurement conditions.
<reagent>
Reagent A 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5)
Reagent B 100 mM DL-homocysteine solution (dissolved in Reagent A)
Reagent C 100 mM Betaine (dissolved in Reagent A)
Reagent D 0.2% Sodium pentacyanoammine iron (III) aqueous solution
Reagent E Acetic acid
Reagent F 10% sodium nitrite aqueous solution
<Measurement condition>
Add 0.075 ml and 0.125 ml of Reagent B and Reagent C to 2.3 ml of the enzyme solution and mix them, followed by reaction at 37 ° C. for 1 hour. Immediately after completion of the reaction, 5 ml of Reagent D is added and stirred, and after standing for 1 minute, 1 ml each of Reagent E and Reagent F is further added and stirred. After standing at room temperature for 30 minutes, the absorbance at 520 nm is measured. A standard curve is prepared from the absorbance measured in the same procedure using L-methionine dissolved in Reagent A instead of the enzyme solution, and the amount of methionine produced by the enzyme reaction is measured therefrom. The amount of enzyme that produces 1 micromole of methionine per hour under the above conditions is defined as 1 unit (U).
[0098]
Two primers capable of amplifying the full-length gene encoding human betaine-homocysteine methyltransferase (J. Biol. Chem., 271 (37), 22831 (1998)) with known base sequence of the gene (Described in SEQ ID NOs: 1 and 2 in the Sequence Listing), and using this as a template for human liver cDNA (manufactured by Clontech) using a polymerase chain reaction (PCR) method for human-derived betaine-homocysteine methyltransferase The encoding DNA fragment was amplified. PCR was performed with the following reaction solution composition and reaction conditions.
<Reaction solution composition>
KODPlus DNA polymerase (Toyobo) 1U / 50μl
10x concentration buffer 5μl / 50μl
Template cDNA 1.5 μg / 50 μl
dATP, dTTP, dGTP and dCTP 0.2 mM each
Each primer 25 pmol/50μl
<Reaction conditions; the following (2) to (4) were carried out for a total of 30 cycles>
(1) 95 ° C, 2 minutes (denaturation)
(2) 95 ° C., 30 seconds (denaturation)
(3) 60 ° C., 30 seconds (annealing)
(4) 68 ° C, 1 minute (extension reaction)
[0099]
After the PCR reaction, a part of the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a single amplification band of about 1.2 Kbp was confirmed. This amplified fragment was recovered using a DNA fragment purification kit (MagExtractor PCR & Gel Clean Up; manufactured by Toyobo), and then treated with NdeI and BamHI restriction enzymes. Next, the pET11a plasmid (Stratagene) was treated with NdeI and BamHI restriction enzymes, and ligated with the above DNA fragment using T4 DNA ligase (Toyobo). Using this, Epicurian Coli BL21 (DE3) -CodonPlus ^TM -RIL competent cells (Stratagene) were transformed and applied to LB agar medium containing ampicillin (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, 100 μg / ml ampicillin; pH 7.2) And cultured at 37 ° C. for 16 hours.
[0100]
The obtained colony was cultured in 60 ml of LB medium containing ampicillin with shaking at 30 ° C. for 16 hours, and then 2 × YT medium (1.6% polypeptone, 1% yeast extract, 0.5% NaCl) containing zinc chloride and ampicillin. , 34 μg / ml zinc chloride, 100 mg / ml ampicillin; pH 7.2) 6 L, and aerated and stirred at 37 ° C. After about 2.5 hours, when the absorbance at 600 nm of the culture solution reached about 1.0, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside was added to 1 mM, and further cultured for 4 hours. It was. After completion of the culture, the culture solution was centrifuged, and the cells were suspended in 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 5 mM 2-mercaptoethanol and 1 mM EDTA. Subsequently, the bacterial cells were crushed with a French press and centrifuged to obtain a supernatant. The obtained enzyme solution is denucleated with polyethyleneimine, then separated and purified by Sephadex G-25 desalting, DEAE Sepharose chromatography, hydroxyapatite chromatography, Superdex 200 gel filtration chromatography, and purified enzyme preparation About 50 mg was obtained. The sample obtained by this method showed a single band on electrophoresis (SDS-PAGE), and the specific activity at this time was about 2.1 U / mg protein.
[0101]
Example 3 Acquisition of dimethylglycine oxidase
The activity of dimethylglycine oxidase of the present invention was measured using the following reagents and measurement conditions.
<reagent>
Reagent A 100 mM dimethylglycine solution
(Dissolved in 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5))
Reagent B 0.1% 4-aminoantipyrine aqueous solution
Reagent C 0.1% phenol aqueous solution
Reagent D 25 U / ml peroxidase (manufactured by Toyobo; PEO-301) aqueous solution
<Measurement condition>
Reagent A, reagent B, reagent C, and reagent D are mixed at a ratio of 1.5 ml, 0.3 ml, 0.6 ml, and 0.6 ml, respectively, to prepare a reagent mixture. After pre-warming 3 ml of this reagent mixture at 37 ° C. for about 5 minutes, 0.1 ml of enzyme solution is added and mixed, and the mixture is reacted at 37 ° C. for 4 minutes. At this time, the change in absorbance per minute at 500 nm is measured. In the blind test, distilled water is added to the reagent mixture instead of the enzyme solution, and the change in absorbance is measured in the same manner. The amount of enzyme that produces 1 micromole of hydrogen peroxide per minute under the above conditions is defined as 1 unit (U).
[0102]
(1) Isolation from Arthrobacter nicotianae IFO 14234 strain
Arthrobacter Nicotianae IFO 14234 strain was inoculated into 60 ml of LB medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl; pH 7.2), and cultured with shaking at 30 ° C. for 16 hours. Then, it was transferred to 6 L of dimethylglycine oxidase production medium (2% betaine, 1% polypeptone, 1.6% yeast extract, 1.4% dipotassium hydrogen phosphate, 0.55% monopotassium dihydrogen phosphate), 30 The culture was aerated and stirred at 40 ° C. for 40 hours. After completion of the culture, the culture solution was centrifuged and suspended in 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5). Next, the cells were crushed with glass beads and centrifuged to obtain a supernatant. The resulting enzyme solution was subjected to nucleic acid removal treatment with polyethyleneimine and ammonium sulfate fractionation, followed by separation and purification by Sephadex G-25 desalting treatment, DEAE Sepharose chromatography, phenyl Sepharose chromatography, Superdex 200 gel filtration chromatography, About 110 mg of purified enzyme preparation was obtained. The sample obtained by this method showed a single band on electrophoresis (SDS-PAGE), and the specific activity at this time was about 9.3 U / mg protein.
[0103]
Further, the enzyme activity of dimethylglycine oxidase obtained by the above method was measured under the same conditions as the above activity measurement conditions except that it was measured in the presence of 0.05 mmol / L dithiothreitol. It was 71% compared to the presence.
[0104]
(2) Isolation from Streptomyces mutabilis IFO12800
Streptomyces mutabilis IFO12800 strain in 60 ml of dimethylglycine production medium (2% betaine, 1% polypeptone, 1.6% yeast extract, 1.4% potassium dihydrogen phosphate, 0.55% dipotassium hydrogen phosphate) One platinum loop was inoculated and cultured with shaking at 30 ° C. for 72 hours. After completion of the culture, the culture solution was centrifuged, and the collected cells were suspended in 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5). Next, the cells were crushed with glass beads, centrifuged, and the resulting extract was desalted with Sephadex G-25.
[0105]
Further, as a result of measuring the enzyme activity of dimethylglycine oxidase in the presence of 0.05 mmol / L dithiothreitol in the above extract, under the same conditions as the above activity measurement conditions, the activity value is not dithiothreitol. It was 98% compared with the presence.
[0106]
Furthermore, K of dimethylglycine of the above two dimethylglycine oxidases _m As a result of measuring the value, the enzyme derived from Arthrobacter nicotianae IFO 14234 strain was 13.6 mM, and the enzyme derived from Streptomyces mutabilis IFO 12800 strain was 14.3 mM.
[0107]
Example 4 Measurement of formaldehyde standard solution (1)
The activity of S-formylglutathione hydrolase used in this example was measured by the method described in Biochimica. Et Biophysica Acta, 614 81-91 (1980), and the enzyme activity of formate dehydrogenase was measured by Eur. J. Biochem. , Feb 2; 62 (1), 151-160 (1976), respectively.
[0108]
S-formylglutathione hydrolase used in this example was obtained as follows.
Methanol-assimilating yeast Candida boidinii IFO 1473 strain was inoculated into 60 ml of YPD medium (1% D-glucose, 1% polypeptone, 1% yeast extract; pH 5.0) at 30 ° C. After 24 hours of shaking culture, 6 L of S-formylglutathione hydrolase production medium (2% methanol, 0.5% D-glucose, 1% polypeptone, 1.6% yeast extract, 0.2% dipotassium hydrogen phosphate , 0.7% monopotassium dihydrogen phosphate) and cultured with aeration and stirring at 30 ° C. for 48 hours. After completion of the culture, the culture solution was centrifuged and suspended in 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5). Next, the cells were crushed with glass beads and then centrifuged to obtain a supernatant. The resulting enzyme solution was denucleated with polyethyleneimine and fractionated with ammonium sulfate, then desalted with Sephadex G-25, DEAE Sepharose chromatography, phenyl Sepharose chromatography, hydroxyapatite chromatography, and Superdex 200 gel filtration chromatography. To obtain about 10 mg of purified enzyme preparation. The sample obtained by this method showed an almost single band on electrophoresis (SDS-PAGE), and the specific activity at this time was about 900 U / mg protein.
[0109]
Samples of 10 μL of various concentrations of formaldehyde aqueous solution were used as 100 U / ml glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase (prepared in Example 1), 1 mM oxidized NAD, 3 mM glutathione, 5 U / ml S-formyl glutathione hydrolase (described above) Prepared in step 2), mixed with 300 μl of 50 mM potassium phosphate buffer solution (pH 7.5) each containing 5 U / ml formate dehydrogenase (Sigma), reacted at 37 ° C. for 10 minutes, and the absorbance at 340 nm was measured. . In the blind test, distilled water was added to the reagent mixture instead of the formaldehyde aqueous solution, and the change in absorbance was measured in the same manner. The relationship between the absorbance at the end of the reaction and the formaldehyde concentration of the sample is as shown in Table 1 and FIG. 1. It showed linearity in the range of formaldehyde concentration of 0 to 500 μM and could be quantified.
This measurement system is not a cycling method.
[0110]
[Table 1]

[0111]
Example 5 Measurement of formaldehyde standard solution (2)
10 μL of formaldehyde aqueous solution of various concentrations was used as a sample, which was 100 U / ml glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase (prepared in Example 1), 1 mM oxidized thionicotinamide adenine dinucleotide, 0.5 mM reduced nicotinamide adenine dinucleotide. The mixture was mixed with 300 μl of 50 mM HEPES buffer (pH 8.0) each containing nucleotide, 3 mM glutathione, and 0.1% Triton X-100, subjected to cycling reaction at 37 ° C. for 5 minutes, and the absorbance at 405 nm was measured. In the blind test, distilled water was added to the reagent mixture instead of the formaldehyde aqueous solution, and the change in absorbance was measured in the same manner. The relationship between the increase in absorbance at 1 minute and 5 minutes after the start of the reaction and the formaldehyde concentration in the sample is as shown in Table 2 and FIG. 2, and shows linearity when the formaldehyde concentration is in the range of 0 to 50 μM. Was possible.
[0112]
[Table 2]

[0113]
Furthermore, it can be seen from Table 2 and FIG. 2 that 1 μmol / L formaldehyde can be measured by the cycling method.
[0114]
Example 6 Measurement of creatinine standard solution
5 μL of creatinine aqueous solution of various concentrations was used as a sample, and 100 U / ml creatinine amide hydrolase (Toyobo; CNH-311), 50 U / ml creatine amidinohydrolase (Toyobo; CRH-221), 10 U / ml After mixing with 200 μl of 50 mM HEPES buffer (pH 8.0) each containing sarcosine oxidase (Toyobo; SAO-341) and 0.1% Triton X-100, reacted at 37 ° C. for 5 minutes, then 300 U / ml Glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase (prepared in Example 1), 3 mM oxidized thionicotinamide adenine dinucleotide, 1.5 mM reduced nicotinamide adenine dinucleotide, 9 mM glutathione, 0.1% Triton X-100 50 mM HEP S buffer (pH 8.0) 100 [mu] l was added, was performed for 5 minutes cycling reaction at 37 ° C., it was measured absorbance at 405nm. In the blind test, distilled water was added to the reagent mixture instead of the creatinine aqueous solution, and the change in absorbance was measured in the same manner. The relationship between the increase in absorbance at 1 minute and 5 minutes after the start of the reaction and the creatinine concentration in the sample is as shown in Table 3 and FIG. 3, and shows linearity in the range of creatinine concentration of 0 to 100 μM. Was possible.
[0115]
[Table 3]

[0116]
Furthermore, it can be seen from Table 3 and FIG. 3 that 10 μmol / L creatinine can be measured by the cycling method.
[0117]
Example 7 Measurement of homocysteine standard solution
As betaine-homocysteine methyltransferase and dimethylglycine oxidase, those obtained in Example 2 and Example 3 (1) were used, respectively. The activities of betaine-homocysteine methyltransferase and dimethylglycine oxidase were measured in the same manner as in Example 2 and Example 3, respectively.
[0118]
10 μL of L-homocysteine produced by heating L-homocystine aqueous solutions of various concentrations in 0.5 mM dithiothreitol at 37 ° C. for 30 minutes was used as a sample, and this was used as 20 mM betaine, 1 U / ml betaine-homo. 20 mM PIPES buffer (pH 7.) containing cysteine methyltransferase (prepared above), 7 U / ml dimethylglycine oxidase (prepared above), 5 U / ml sarcosine oxidase (Toyobo; SAO-341). 3) After mixing with 200 μl and reacting at 37 ° C. for 5 minutes, 300 U / ml glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase (prepared in Example 1), 3 mM oxidized thionicotinamide adenine dinucleotide, 1.5 mM reduced form Nicotinamide adenine dinucleotide, 9 mM gluta On, 50 mM HEPES buffer (pH 8.2) 100 [mu] l was added containing respectively 0.1% Triton X-100, carried out for 5 minutes cycling reaction at 37 ° C., was measured absorbance at 405nm. In the blind test, 0.5 mM dithiothreitol was added to the reagent mixture instead of the L-homocysteine solution, and the change in absorbance was measured in the same manner. The relationship between the increase in absorbance at 1 minute and 5 minutes after the start of the reaction and the homocysteine concentration in the sample is as shown in Table 4 and FIG. 4, and shows linearity in the range of 0 to 100 μM. Quantification was possible.
[0119]
[Table 4]

[0120]
Furthermore, it can be seen from Table 4 and FIG. 4 that 1 μmol / L homocysteine can be measured by the cycling method.
[0121]
【The invention's effect】
Since the glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase of the present invention can perform a cycling reaction, it can measure formaldehyde with higher sensitivity than before. Therefore, measurement of formaldehyde using the enzyme is extremely useful in that it can be suitably applied to clinical tests of biological components such as homocysteine, creatinine, creatine, etc., which generate formaldehyde as a reaction intermediate in the measurement system. On the other hand, since the dimethylglycine oxidase of the present invention is stable against thiol compounds, most homocysteine exists in a disulfide bond state with proteins and other amino acids, and thus is homogenous in biological samples such as blood and urine. This is useful in that it can be suitably used for the measurement of cysteine and can provide a homocysteine quantitative reagent with better reagent performance.
[0122]
[Sequence Listing Free Text]
SEQ ID NO: 1
An oligonucleotide designed to function as a PCR primer for amplifying human betaine-homocysteine methyltransferase cDNA.
SEQ ID NO: 2
An oligonucleotide designed to function as a PCR primer for amplifying human betaine-homocysteine methyltransferase cDNA.
[0123]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
1 is a graph showing the relationship between absorbance and formaldehyde concentration in Example 4. FIG.
2 is a graph showing the relationship between absorbance and formaldehyde concentration in Example 5. FIG.
3 is a graph showing the relationship between absorbance and creatinine concentration in Example 6. FIG.
4 is a graph showing the relationship between absorbance and homocysteine concentration in Example 7. FIG.

Claims (11)

A dimethylglycine oxidase stable to thiol compounds derived from Arthrobacter nicotianae IFO 14234 strain having the following physicochemical properties:
(a) Action: acts on dimethylglycine in the presence of oxygen to produce sarcosine, formaldehyde and hydrogen peroxide.
(b) 71 % enzyme activity is retained in the presence of 0.05 mmol / L dithiothreitol compared to the absence of dithiothreitol.
(c) _{K m} values for dimethylglycine: 13.6 m M A dimethylglycine oxidase stable to thiol compounds derived from Streptomyces mutabilis IFO12800 strain having the following physicochemical properties:
(a) Action: Acts on dimethylglycine in the presence of oxygen to produce sarcosine, formaldehyde and hydrogen peroxide.
(b) The enzyme activity is retained 98% in the presence of 0.05 mmol / L dithiothreitol compared to the absence of dithiothreitol.
(c) K against dimethylglycine _m Value: 14.3 mM Betaine, betaine-homocysteine methyltransferase, dimethylglycine oxidase according to claim 1 or 2 and, if necessary, sarcosine oxidase are brought into contact with a sample, and hydrogen peroxide produced by the enzyme reaction is oxidized in the presence of peroxidase. A method for measuring homocysteine, which comprises reacting with a coloring reagent and, if necessary, a coupler, and measuring a produced dye. Betaine, betaine-homocysteine methyltransferase, dimethylglycine oxidase according to claim 1 or 2 and, if necessary, sarcosine oxidase are brought into contact with a sample, and formaldehyde produced by the enzymatic reaction is converted into formaldehyde dehydrogenase and oxidized complement. A method for measuring homocysteine, which comprises measuring a reduced coenzyme produced by reacting with an enzyme. Betaine, betaine-homocysteine methyltransferase, the dimethylglycine oxidase according to claim 1 or 2 and, if necessary, sarcosine oxidase are brought into contact with a sample, and formaldehyde generated by the enzymatic reaction is converted into glutathione and glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenation. A method for measuring homocysteine, which comprises reacting an enzyme and an oxidized coenzyme to measure a reduced coenzyme produced. The method for measuring homocysteine according to claim 3 , wherein the minimum detection sensitivity of homocysteine is 1 μmol / L or less. A buffer, betaine, betaine-homocysteine methyltransferase, dimethylglycine oxidase according to claim 1 or 2 and, if necessary, sarcosine oxidase, and a reagent for measuring hydrogen peroxide produced by the enzyme reaction; A reagent kit for measuring homocysteine. The reagent kit for measuring homocysteine according to claim 7 , comprising a peroxidase, an oxidative coloring reagent and, if necessary, a coupler as a reagent for measuring hydrogen peroxide. A buffer, betaine, betaine-homocysteine methyltransferase, dimethylglycine oxidase according to claim 1 or 2 and, if necessary, sarcosine oxidase, and a reagent for measuring formaldehyde produced by the enzyme reaction A reagent kit for measuring homocysteine. The reagent kit for measuring homocysteine according to claim 9 , wherein the reagent for measuring formaldehyde contains formaldehyde dehydrogenase and oxidized coenzyme. The reagent kit for measuring homocysteine according to claim 9 , comprising glutathione, glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase and oxidized coenzyme as reagents for measuring formaldehyde.

Images