JP4035754B2 - Bisphenol A hapten compound, hybridoma, anti-bisphenol A antibody having resistance to organic solvents, and method for measuring bisphenol A using them - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビスフェノールＡのハプテン化合物、ハイブリドーマ、ビスフェノールＡを特異的に認識するモノクローナル抗体及びそれらを用いたビスフェノールＡの免疫学的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビスフェノールＡは耐熱性食器やほ乳ビンに使われているポリカーボネート樹脂の原料や安定化剤、酸化防止剤として使用され、また缶詰の内側のコーティングに使用されるエポキシ樹脂や歯科治療に使用されているコンポジットレジンやシーラントの原料としても使用されている。ビスフェノールＡは年間約３０万トン程度生産されているが、発ガン性等の毒性が低いことからこれまではあまり問題とされていなかった。しかしながら、近年ある種の化合物が人や野生動物の内分泌機能を撹乱する作用を持つという、いわゆる「内分泌撹乱物質」がグローバルな環境問題としてクローズアップされ、ビスフェノールＡもエストロジェン活性を有する内分泌撹乱物質の一つである疑いがあることが判明したことから、大きな注目を集めるようになった。特に、乳がん細胞を用いた実験では数ｐｐｂ程度のごく微量な量でエストロジェンと同様な作用を発揮することが確認されており、マウスに対するビスフェノールＡ投与実験でも、精子運動性低下等といった生殖機能異常が報告されている。また、環境庁が実施した化学物質の環境中の安全性調査においても、ビスフェノールＡが大都市周辺の河川や港湾の水質や底質等から検出されたことから、ビスフェノールＡによる汚染が広範囲に広がっていることが明らかとなり、環境中の暴露量を把握することが急務となっている。
【０００３】
ビスフェノールＡ等の内分泌撹乱物質の測定は高い精度の分析値が求められ、抽出、濃縮、精製といった各種のクロマトグラフィーや高価な質量分析装置等の機器を用いる公定分析法に従って行われている。これらの分析法は高感度で、構造の類似する複数の化合物を一度に同定、定量できる多成分分析が可能であるが、環境試料からの目的物質の抽出、分離、精製が煩雑で、化合物によっては誘導体化が必要といった問題があり、従って高価な機器に対する多大な設備投資や、分析技術者の習熟、その他分析に時間がかかるといった問題を抱えているのが現状である。このため精度が高くかつ簡便な測定方法の開発が望まれており、このような問題を解決すべく、抗体を用いた免疫測定法による環境汚染物質の検出技術が注目されつつある。
【０００４】
この免疫測定法は１９８０年代に米国において地下水や河川水の除草剤の分析に適用され、近年、カナダ、ヨーロッパ並びに我が国においても免疫測定法を用いた環境汚染物質の開発が行われている。免疫測定法とは、抗体が抗原を特異的に認識する能力を用いて微量の抗原を検出する方法であり、抗体の抗原に対する高い親和性と高い特異性により抗原を高感度に測定することができる。また測定方法が簡易で迅速に結果が得られる、多検体、多成分の同時測定が可能である、測定目的に適した検出感度、測定レンジを有する、測定試料の精製が不要である、測定に要するコストが低いといった種々のメリットを持ち、医学、生化学、薬学、農学など広い分野で利用されている。免疫測定法において測定対象物質を検出するには、抗体または抗原を標識する必要があるが、その標識方法としては酵素を用いる方法、放射性物質を用いる方法、蛍光物質を用いる方法、金属原子を用いる方法などが挙げられる。中でも、酵素を用いた酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は臨床検査や生化学分野での生体試料中の目的成分の定量に応用されている。ＥＩＡ法は、抗原抗体反応の形式により、競合法と非競合法に大別できる。非競合法は複数の抗原結合部位を持つ多価抗原に適用でき、蛋白質など高分子の抗原や抗体の測定が可能であるが、ビスフェノールＡのような低分子化合物は競合法によって測定する。
【０００５】
ＥＩＡ法においては、抗原に対していかに特異性が高く、かつ親和性の高い抗体が得られるか重要であるが、ビスフェノールＡは低分子化合物であるため、通常それ自体では抗体産生を誘導する能力を持たない。そこで、抗体産生誘導能のある高分子化合物と結合させることにより、ビスフェノールＡと特異的に反応する抗体産生を誘導することが可能となる。このような低分子化合物の物質をハプテンと呼び、ハプテン分子に対し特異的な抗体を産生させるためには、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、ＯＶＡ（卵製アルブミン）、ＫＬＨ（スガシガイヘモシアニン）といった免疫原性を有する高分子化合物にビスフェノールＡ分子を導入することが必要となる。
【０００６】
抗ハプテン抗体の性能はハプテン抗原の作製方法に大きく影響され、ハプテン分子の設計が抗体の特異性と親和性を決定する。ビスフェノールＡに対する抗体を得るためにも、このようなハプテン設計は重要な要因であるが、これまでに作製されたハプテン抗原によって得られた抗体とビスフェノールＡ以外の関連物質との交差反応性が高いという問題点があった。また環境試料を測定する際には、測定感度を上げるために有機溶媒を用いた固相抽出を行う場合があるが、固相抽出を行った場合、抽出後の試料には有機溶媒が混入してしまうため、有機溶媒に耐性を有する抗体が望まれていた。しかしながら、これまでに得られたモノクローナル抗体は有機溶媒に対する耐性が低く、試料中に有機溶媒が混入すると著しく抗原結合活性が低下する場合が多かった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ビスフェノールＡを高感度に測定するために、交差反応性が低くかつ有機溶媒に対して耐性を有する抗体とその抗体を産生するハイブリドーマ、及びその製造法を提供することを目的とする。さらに本発明は、ビスフェノールＡと高感度かつ特異的に反応する抗体を得るためのビスフェノールＡ誘導体とその製造法を提供することを目的し、当該化合物はビスフェノールＡと特異的に反応するための抗体を産生するハイブリドーマを作製する際の免疫原及びビスフェノールＡを競合的に測定する際の標識抗原となる。
【０００８】
【発明を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情に鑑み、ビスフェノールＡを高感度で測定でき、かつ有機溶媒に耐性を有する抗体を開発すべく鋭意検討した結果、ビスフェノールＡに特定の長さを有するスペーサー化合物を導入したハプテン抗原で免疫を行うことにより、前記化合物に高感度かつ特異的に反応する抗体が得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）４０％濃度以下の有機溶媒を含む水溶液中において５０％以上の抗原結合能を保持することが可能なビスフェノールＡに特異的に反応するモノクローナル抗体。
（２）受託番号が、ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４６、ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４７、及びＦＥＲＭ ＢＰ−７１４８よりなる群から選ばれたいずれかであるハイブリドーマにより産生される（１）記載のモノクローナル抗体。
（３）受託番号が、ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４６、ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４７、及びＦＥＲＭ ＢＰ−７１４８よりなる群から選ばれたいずれかであるハイブリドーマであり、（１）記載のモノクローナル抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマ。
（４）以下の式(Ｉ) で表される構造（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）で表される構造を有することを特徴とするハプテン化合物。
【化２】
（６）高分子化合物が蛋白質である（５）記載の免疫抗原。
（７）（４）記載のハプテン化合物に標識物質を結合させることにより得られることを特徴とする標識抗原。
（８）標識物質が酵素である（７）記載の標識抗原。
（９）（４）記載のハプテン化合物のカルボキシル基末端を活性化し、高分子化合物と結合させることを特徴とする免疫抗原及び標識抗原の製造方法。
（１０）（５）または（６）に記載の免疫抗原を動物に免疫することにより得られる（１）記載のモノクローナル抗体の製造方法。
（１１）（１）記載のモノクローナル抗体と請求項７記載の標識抗原を用いることを特徴とするビスフェノールＡの測定方法。
（１２）測定対象物をメタノールを溶媒に用いた固相抽出法にて予め濃縮を行う（１１）記載のビスフェノールＡの測定方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のモノクローナル抗体は、ビスフェノールＡの末端に特定の長さを有するスペーサー化合物を導入したハプテン化合物に高分子化合物を結合せしめ、本複合体を免疫原としてマウス等に免疫した後、免疫したマウスの脾臓細胞とミエローマ細胞を融合させハイブリドーマ細胞を調製し、該ハイブリドーマ細胞から免疫原と結合する抗体を産生する細胞を単離し、さらに該ハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体を精製することにより得ることができるものである。
【００１１】
本発明のハプテン化合物は、以下の式(Ｉ)により表される化合物であり、ビスフェノールＡの末端の水酸基にカルボキシル基を有するスぺーサーを結合させることにより得られる。式(Ｉ)中、ｎは１〜１０の整数を示す。更に該ハプテン化合物のカルボキシル基をイミドエステル化等で活性化し、高分子化合物と結合させることにより、免疫用抗原及びビスフェノールＡを競合的に測定する際の標識抗原とすることができる。
【００１２】
【化３】
以下に、本発明のハプテン化合物、ハイブリドーマ、モノクローナル抗体の作製、及びビスフェノールＡの免疫化学的測定法について説明する。
【００１４】
ビスフェノールＡハプテン化合物の作製
本発明の式（Ｉ）で示されるハプテン化合物は公知の方法により作製することができる。例えば、ビスフェノールＡの片側の水酸基とスぺーサーとなるハロゲン化アルキルエステルとを有機溶媒中にて反応させ、エステル部分をアルカリ等の塩基によって加水分解することにより得ることができる。該スぺーサーの長さは特に限定されるものではないが、該ハプテン化合物にキャリアーとなる高分子化合物を結合させ免疫原とする場合、抗体はキャリアーとの結合部位より離れた部分を認識する場合が多く、ある程度の長さを有することが望ましい。しかし、長すぎる場合スぺーサー部分を認識する抗体が得られる場合もあることから、スぺーサー長としては炭素数で１〜１０、好ましくは３〜６、さらに好ましい炭素数は５である。例えば、スぺーサーとしては３−ブロモプロピオン酸メチル、３−ブロモプロピオン酸エチル、γ−ブロモ酪酸エチル、５−ブロモ吉草酸エチル、６−ブロモヘキサン酸エチルなどのハロゲン化アルキルエステルが挙げられるが、特に好ましいスぺーサー化合物は、炭素数５の６−ブロモヘキサン酸エチルである。
【００１５】
反応時のビスフェノールＡとハロゲン化アルキルのモル比は１：１〜１：０．５が好ましく、特に等モルで反応させるのが好ましい。反応に使用する溶媒としては、ＤＭＳＯ、ＤＭＥ、ＤＭＦ、ＴＨＦ、ヘキサン、酢酸エチル、ジクロロメタン等の有機溶媒が挙げられるが、特に限定されるものではない。また、塩基としてはナトリウムアミド、炭酸カリウム、トリエチルアミン、水酸化ナトリウム、酸化バリウム、酸化銀、水素化ナトリウム等を用いることができる。反応温度は０〜９０℃、好ましくは室温ないしは９０℃、更に好ましくは８０〜８５℃で、反応時間は０．５〜６時間、好ましくは１〜３時間の間で攪拌しながら行うことが望ましい。得られた化合物は、必要に応じてシリカゲルカラムクロマトグラフィーや再結晶等の精製操作によって高純度化し、ハプテン化合物とすることができる。
【００１６】
免疫用抗原の作製
上述のハプテン化合物はそれ自身免疫原性を持たないため、単独で免疫しても目的とする抗体が得られない場合が多い。そこで免疫原性を有する高分子化合物をキャリアー化合物として結合させ複合体とすることにより免疫原とすることができる。
【００１７】
該キャリアー化合物として用いられる高分子化合物は、１万以上の分子量であることが望ましく、例えばヘモシアニン、卵白アルブミン、牛血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン等の蛋白質、ＭＡＰレジン、ポリアミド、ポリアクロレイン等の合成高分子、デキストラン、アガロース等の多糖、不活化した細菌等が挙げられる。なかでも、スガシガイヘモシアニン及び牛血清アルブミンが、操作性、免疫原性の点で好ましい。
【００１８】
ハプテン化合物とキャリアー化合物との結合は、ハプテン化合物のカルボキシル基と高分子担体上の反応性官能基とを反応させればよく、方法は特に限定されないが、公知の方法として混合酸無水物法や活性エステル法等が挙げられる。混合酸無水物法は、ハプテン化合物のカルボキシル基をクロル炭酸ブチル、クロロ炭酸エチル等のクロロアルキルホルメートと反応させ、活性のある混合酸無水物に誘導した後、高分子担体上のアミノ基中に反応させアミド結合を生成する方法である。これに対し活性エステル法は、ハプテン化合物のカルボキシル基をカルボジイミド型縮合剤を使用して、活性エステル型に変換してから高分子担体のアミノ基に反応させる方法である。いずれの方法でもハプテン化合物を結合させることができるが、混合酸無水物法の場合、ビスフェノールＡの水酸基とも反応する場合があり、水酸基を保護しておく必要があるのに対し、活性エステル法は水酸基と反応せず、また得られたイミドエステルの安定性も高く、乾燥した状態で長期間、冷凍庫中で保存することができることから特に好ましい。
【００１９】
活性エステル法はハプテン化合物と活性エステル類で最も水溶性の高いＮ−ヒドロキシスクシンイミドとを有機溶媒中でジシクロヘキシルカルボジイミドや水溶性カルボジイミド等のカップリング剤の存在下にて反応させ、カルボキシル基をイミドエステル化することにより行う。反応時のハプテン化合物とＮ−ヒドロキシスクシンイミドのモル比は１：１〜１：５の範囲が好ましく、特に好ましくは１：１である。反応温度は０〜４０℃、好ましくは１０〜２０℃である。反応時間は２〜１０時間、好ましくは５時間である。また反応時の有機溶媒としてはＤＭＳＯ、ＤＭＥ、ＤＭＦ、ＴＨＦ、ヘキサン、酢酸エチル等の有機溶媒が挙げられるが、特に限定されるものではない。得られたイミドエステル化ハプテン化合物は、必要に応じてシリカゲルカラムクロマトグラフィーや再結晶等の精製操作によって高純度化する。
【００２０】
得られたイミドエステル化ハプテン化合物とキャリアーとの結合は、通常含水有機溶媒中で行う。まずイミドエステル化ハプテンをメタノール、ＤＭＳＯ有機溶媒に溶解する。同様に牛血清アルブミン、スガシガイヘモシアニン等の担体をリン酸緩衝液、生理食塩水等のアミノ基を含有しない緩衝液に溶解し、イミドエステル化ハプテン溶液中に緩衝液に溶解した担体溶液を徐々に添加し、反応を行う。反応溶液中の有機溶媒濃度は５〜８０％、好ましくは２０〜５０％である。緩衝液はアミノ基を含まないものであれば特に限定されず、緩衝液濃度は、１０〜５００mmol、好ましくは５０〜１００mmol、また緩衝液のｐＨは５〜１０の間であればよく、好ましくは６〜８の間である。イミドエステル化ハプテンとキャリアーのモル比は２００：１〜１０：１の範囲が好ましく、特に好ましくは１００：１〜５０：１の間である。反応温度は０〜５０℃の間で行うことが好ましく、特に好ましくは２０〜３０℃である。反応時間は１〜２４時間の間で行えばよく、好ましくは５〜１５時間の間である。このようにして得られた免疫用抗原は、必要に応じてゲルろ過、透析等により緩衝液に置換し精製する。
【００２１】
ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の作製
上記の方法により得られた免疫原を用い、公知の方法によりモノクローナル抗体を作製することができる。以下に例を示すが、方法は特に限定されるものではない。
【００２２】
本発明で使用されるような可溶性物質を抗原として免疫する際は、通常アジュバンドとともにエマルジョン状態にする。アジュバンドとしてはフロインド・アジュバンド、ミョウバン及び百日咳死菌体が用いられる。
【００２３】
免疫する動物としては、通常BALB/cマウスを用いるが、Ｆ１マウスやハムスター等を用いても良い。１匹のマウスに免疫する抗原量としては、３０〜５０μｇ／回でよく、生理食塩水で１００〜５００μｇ／ｍｌになるように調製した免疫用抗原と完全フロインドアジュバンドを２本の注射器等を用いて等量ずつ混合してエマルジョンを作製し、０．１〜０．２ｍｌ／匹ずつ注射する。エマルジョンの投与は注射する部位によって、(1)腹腔内注射(ｉｐ)、(2)皮下注射(ｓｃ)、静脈内注射(ｉｖ)、筋肉内注射(ｉｍ)などがあるが、腹腔内注射及び皮下注射が望ましい。１〜２週間おきに数回免疫する。免疫したマウスは数日後採血し、十分に抗体価が上昇した３〜４日前には、同量の抗原を静脈内または腹腔内に注射する。
【００２４】
細胞融合に用いられるミエローマ細胞には、マウス、ラット由来のものがあるが、多くの場合Balb/cマウス由来のＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２、Ｘ６３．６．５．３の骨髄腫細胞が用いられる。
【００２５】
細胞の融合法としてはＨＶＪウイルスや電気パルスを利用する方法があるが、現在では細胞毒性も比較的少なく、融合操作の簡便なポリエチレングリコール(ＰＥＧ)法が用いられている。一般によく用いられるＰＥＧの平均分子量は１０００〜６０００で、３０〜５０％（ｖ／ｖ）濃度で使用する。
【００２６】
摘出した脾臓より回収した脾細胞は、無血清培地でよく洗浄した後、対数増殖期にあるミエローマ細胞と混合し、細胞融合を行う。ミエローマ細胞と脾細胞の混合比は１：１０〜１：１の範囲であればよく、混合した脾細胞とミエローマ細胞を遠心してペレットにし、ＰＥＧ溶液を加え、攪拌と振とうによって融合させる。融合後、遠心洗浄してＨＡＴ添加増殖培地に移し、９６穴培養プレートにて培養する。ＨＡＴ培地はサルベージ回路をもたないミエローマ細胞は生存できず、脾細胞と融合したハイブリドーマのみが生育する。融合して数日後よりコロニーが形成し始めるため、コロニーの増殖が認められたウエルの培養上清を採取し、抗原であるビスフェノールＡとの反応性をＥＬＩＳＡ法により確認し、目的の抗体産生の有無でスクリーニングを行う。スクリーニングは、５０％有機溶媒（例えば、メタノール）中で抗原抗体反応を行い、抗原結合活性を有するクローンを取得し、さらに該有機溶媒中での反応性評価を行いクローンの選抜を行う。この際、キャリアー担体由来の抗体を排除するため、スクリーニング用抗原は免疫用抗原として使用したハプテン複合体とは別の担体で複合体を作製し、スクリーニング用抗原とする。例えば免疫用抗原を牛血清アルブミンで作製した場合、スクリーニング用抗原は卵白アルブミンやスガシガイヘモシアニンで作製する。スクリーニング後、抗体産生が確認されたウエルを選び、限界希釈法にてクローニングを行い、単一の抗体産生ハイブリドーマを得る。
【００２７】
本発明のハイブリドーマは、有機溶媒耐性を有しかつビスフェノールＡを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであれば特に限定されないが、例えば、工業技術院生命工学研究所に寄託された、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７１４６(識別表示 ＢＰＡ３Ｂ９)、ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４７(識別表示 ＢＰＡ１７Ｂ４)、ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４８(識別表示 ＢＰＡ１０Ｅ５)などのハイブリドーマが挙げられる。
【００２８】
樹立したクローンからモノクローナル抗体を調製するには、ハイブリドーマ細胞をプレートやフラスコで培養し、その培養上清を取得することにより得られるが、炭酸ガス培養器に収納できる簡易フォローファイバー型培養装置でも培養することができる。更にハイブリドーマ細胞をプリスタン前投与マウスの腹腔内に移植し増殖させ、移植後１０〜１４日で腹腔に溜まった腹水を回収することによっても得ることができる。
【００２９】
このようにして得られた培養液及び腹水は、イオン交換クロマトグラフィーや疎水クロマトグラフィー、またプロテインＡもしくはプロテインＧを固定化したアフィニティークロマトグラフィーにより必要に応じて精製し、モノクローナル標品とすることができる。こうして得られたモノクローナル抗体は、４０％濃度の有機溶媒を含む水溶液中において８０％以上の抗原結合能を保持するものであり、実施例に記載された方法により性能評価を実施した。ここで、有機溶媒とは、メタノール、エタノール、アセトン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、アセトニトリルなどを指すものであるが、特に限定はされない。
【００３０】
抗ビスフェノールＡモノクローナル抗体を用いたビスフェノールＡ測定法
本発明によって得られた抗ビスフェノールＡ抗体を用いて、ビスフェノールＡの測定を行うことができる。免疫測定法には競合型測定法、非競合型測定法、均質法等があるが、ビスフェノールＡは低分子化合物であるため、競合法により行う。競合法には主にマイクロプレートのウエル、チューブ、磁性粒子等に抗原を固定化する間接競合法と、ウエルやチューブに抗体を固定化する直接競合法がある。
【００３１】
間接競合法では、ウエルに固定化する抗原として免疫原に用いた抗原もしくは他の担体とハプテン化合物の複合体を用いる。まずハプテン複合体をマイクロプレート等のウエルに固相化する。次いでウエルに抗原が結合していない部分を牛血清アルブミン、カゼイン等の市販のブロッキング剤でブロックする。このウエルに検体と一次抗体である抗ビスフェノールＡ抗体を加えて、検体と固相化抗原を抗体に対して競合反応させる。固相化抗原と結合しなかった抗体を洗浄除去後、同ウエルに二次抗体としてヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体をペルオキシダーゼ（ＰＥＯ）やアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）等の酵素で標識した酵素標識抗体を加えて、固相化抗原と結合した一次抗体と結合させる。緩衝液で数回洗浄した後、酵素基質を加えて発色した酵素反応生成物の吸光度を測定する。
【００３２】
酵素にペルオキシダーゼを用いる場合は、基質に過酸化水素、発色剤にｏ−フェニレンジアミンやテトラメチルベンジジンを使用する。アルカリフォスファターゼでは基質にｐ−ニトロフェニルリン酸が一般的に用いられる。また基質の反応生成物が蛍光であったり、酵素標識抗原に酵素の代わりに、蛍光物質を標識して用いる場合には蛍光測定器で測定する。これに化学発光物質を用いると化学発光測定器での測定が可能となり、より感度のよい測定法となる。
【００３３】
直接競合法は、ウエルに抗体を固相化してブロッキングした後、別途調製したハプテン化合物と酵素を結合した酵素標識抗原と検体を加え、固相抗体と検体及び酵素標識抗体とを競合反応させる。抗体と結合しなかった標識抗原を洗浄除去し、酵素基質を加えて反応生成物の吸光度を測定する。この方法でも標識物質を変えることにより、より感度の高い測定法を構築することができる。
【００３４】
競合測定法に使用する酵素標識抗原は、免疫抗原と同様の方法で作製することができる。すなわち免疫抗原作製時に用いた牛血清アルブミン等のキャリアー担体の代わりに、ペルオキダーゼやアルカリフォスファターゼ等の酵素を使用することにより標識抗原を得ることができる。また上述のように、ローダミン等の蛍光物質や化学発光物質で標識体を作製することもできる。
【００３５】
競合測定法の場合、得られた標識抗原が検体よりも抗体と強い親和性を有する場合、検体と標識抗原との競合反応が起こりにくくなる。その結果測定感度が低くなる場合があり、標識抗原の作製方法によって測定感度は左右される。一般に標識抗原の親和力が小さいほど感度としては高くなる傾向があり、標識酵素に導入されるハプテン化合物数の量に応じて親和性は変化する。このため、標識抗原作製時の標識用酵素とハプテン化合物の反応モル比は１：１〜１：５０で行うことが好ましく、更に好ましくは１：１０〜１：２０である。
【００３６】
上述の測定方法において、検体を添加しない反応溶液の吸光度に対し、検体を添加した反応溶液の吸光度の減少を阻害率として測定する。その際、既知濃度のビスフェノールＡ標準溶液より検量線を作成し、得られた検量線からビスフェノールＡ濃度を算出することができる。なお、この測定を行う前に、測定対象物を予めメタノールを溶媒として用いた固相抽出法により濃縮を行っておくことも好ましい。
【００３７】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３８】
実施例１ ビスフェノールＡハプテン化合物の合成
ビスフェノールＡ (1) ５１ｇ（２２４mmol）と、５−ブロモヘキサン酸エチルエステル ５０ｇ(２２４mmol)をジメチルホルムアミド５００ｍｌに溶解し、炭酸カリウム４６ｇ(３３６mmol)を加えて８０〜８５℃で２時間反応させた。反応液は水にクエンチ後、酢酸エチルで抽出し、水で洗浄を行った後、シリカゲルカラム（酢酸エチル：ヘキサン＝１：６）で精製し、ビスフェノールモノヘキサン酸エチルエステル (2)を ３７ｇ(収率４４．７％)得た。次いで、得られたビスフェノールモノヘキサン酸エチルエステル(2) ３７ｇを７０％エタノール水溶液２２０ｍｌに溶解し、８５％水酸化カリウム溶液を１３．２ｇ(２００mmol)加えた後、７５〜８０℃で1時間攪拌した。反応混合物を水にクエンチした後、６規定の塩酸でｐＨを１に調整し、酢酸エチルで抽出し、温水で洗浄後、クロロホルムで再結晶を行い、ビスフェノールＡハプテン(3)を２６．１ｇ(収率７６．３％)得た。以下に反応スキームを示す。
【００３９】
【化４】
実施例２ 免疫用抗原の作製
実施例１により作製したビスフェノールＡハプテン化合物を用い、活性エステル法により免疫用抗原を作製した。以下に反応スキームを示す。まず、実施例１で得られたハプテン化合物(3)３０．８ｇ(９０mmol)をジメチルホルムアミド３００ｍｌに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１０．４ｇ(９０mmol)とジシクロヘキシルカルボジイミド１８．６ｇ(９０mmol)を加えて、室温で５時間攪拌した。反応混合物を氷水にクエンチ後、酢酸エチルで抽出を行い、温水で洗浄後、シリカゲルカラム(酢酸エチル：ヘキサン＝１：５)で精製し、イミドエステル化ビスフェノールＡハプテン(4)を１０．０ｇ(収率２４．７％)得た。
【００４１】
【化５】
得られたイミドエステル化ハプテンとキャリアー担体である牛血清アルブミンとの結合は以下の方法により実施した。まず牛血清アルブミン０．２ｇ(３．０２μmol)を１００mmolのホウ酸緩衝液(ｐＨ８．０) １０ｍｌに溶解した後、５ｍｌの無水ＤＭＦを添加しキャリアー蛋白質溶液とした。次いで本溶液中に５ｍｌのＤＭＦに溶解したイミドエステル化ビスフェノールＡ ６８ｍｇ(０．１５４mmol)を徐々に添加し、２５℃で１８時間攪拌し反応を行った。反応終了後、モノエタノールアミン２．５ｍｌを添加し、２５℃で２時間攪拌を行い残存する活性エステルをブロックした後、ＰＢＳに対して透析を行い、ビスフェノールＡ−ＢＳＡ複合体を得た。ビスフェノールＡ−ＢＳＡ複合体に導入されたハプテン数は、ＴＮＢＳ法によりアミノ基の定量を行うことにより算出したところ４０個であった。
【００４３】
実施例３ 動物への免疫
実施例２で作製した免疫用抗原２ｍｇを１ｍｌのＰＢＳに溶解し、等量の完全アジュバントと混和し１ｍｇ／ｍｌ濃度のエマルジョン溶液を作製した。このエマルジョン溶液を６匹のBalb/cマウスに一匹に対し総量０．１ｍｌになるよう各々２箇所に腹腔内投与した。同様の操作で２週間おきに３回追加免疫を行った。各回の免疫一週間後に採血を行い、血液を室温１時間放置後、血餅を分離し抗血清を得た。
【００４４】
実施例４ 抗体価の測定
実施例２に記載した免疫用抗原の作製法と同様に牛血清アルブミンの代わりに、卵白アルブミンを用いて抗体価測定用の抗原を作製した。この抗原を０．１ｍｇ／ｍｌになるようにＰＢＳに溶解し９６ウエルマイクロプレートに１００μｌ／ウエルになるよう分注し、３７℃、２時間インキュベートし固相化を行った。抗原溶液を除去後、０．０５％ Tween20を含むＰＢＳにて３回洗浄し、５倍希釈のブロッキング溶液(ナカライテスク製)を３００μｌずつ分注し、４℃で一晩静置してブロッキングを行い、抗体価測定用プレートを作製した。
【００４５】
このプレートにＰＢＳで４倍希釈系列で希釈した抗血清を５０μｌ／ウエル添加し、３７℃、２時間反応させた。同プレートを、Tween20を０．０５％含むＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳで４０００倍希釈したＰＥＯ標識抗マウスＩｇＧウサギ抗体(ZYMED社製)を５０μｌ／ウエル添加し、３７℃、１時間反応させた。更にTween20を０．０５％含むＰＢＳで３回洗浄後、TMB Microwell Peroxidase Substrate（KPL社製）を５０μｌ／ウエル添加し、遮光下、３７℃で反応させた。２０分後、０．５mol／Ｌの硫酸を１００μｌ／ウエル添加して発色を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定し抗体価を求めた。
【００４６】
実施例５ ハイブリドーマ及び抗ビスフェノールＡモノクローナル抗体の作製
抗体価が最も高かったマウスについて最終免疫として１ｍｇ／ｍｌ濃度の免疫用抗原１００μｌを腹腔内投与した。最終免疫の３日後、常法に従って無菌的に脾臓を摘出し、脾細胞を分散させて、ＲＰＭＩ１６４０培地にて３回洗浄し、脾細胞浮遊液を調製した。細胞数をカウントし、予め培養していたＳｐ／２ミエローマ細胞と脾細胞が１：１０の割合になるよう混合し、遠心後、上清を除去した。上清除去後、ＰＥＧ溶液を０．５ｍｌ加え、細胞を攪拌し、更に２〜３分かけて徐々に２５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を加え細胞融合を行った。次に遠心により上清を除去し、ＨＡＴ培地を加えた後、細胞を浮遊させ、９６穴培養プレートに撒種し３７℃の炭酸ガス培養器内で培養を行った。
【００４７】
培養開始後１週間目より、細胞の増殖の見られたウエルの培養上清を用いてスクリーニングを行った。スクリーニングは、卵白アルブミンを用いて作製した抗体価測定用の抗原を、０．１mg/mlになるようにＰＢＳに溶解し９６ウエルマイクロプレートに１００μｌ／ウエルになるよう分注し、３７℃、２時間インキュベートし固相化を行った。抗原溶液を除去後、０．０５％ Tweenを含むＰＢＳにて３回洗浄し、５倍希釈のブロッキング溶液(ナカライテスク製)を３００μｌずつ分注し、４℃で一晩静置してブロッキングを行い、抗体価測定用プレートを作製した。得られたハイブリドーマの培養上清は等量のメタノールを添加しメタノール濃度５０％になるよう調製した。このサンプルを、採取した培養上清を５０μl／ウエルになるように上記抗体価測定用プレートに添加し、３７℃、２時間反応させ、抗ビスフェノールＡ抗体を産生しているかどうか調べた。同プレートをTween20を０．０５％含むＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳで４０００倍希釈したＰＥＯ標識抗マウスＩｇＧウサギ抗体(ZYMED社製)を５０μｌ／ウエル添加し、３７℃、１時間反応させた。更にTween20を０．０５％含むＰＢＳで３回洗浄後、TMB Microwell Peroxidase Substrate（KPL社製）を５０μｌ／ウエル添加し、遮光下３７℃で反応させた。２０分後、０．５mol/Lの硫酸を１００μｌ／ウエル添加して発色を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定し抗体結合活性を有するクローンを選抜した。高い抗体価が確認されたハイブリドーマについて、限界希釈法によるクローニングを３回行い、モノクローン化ハイブリドーマを得た。
【００４８】
これらのハイブリドーマは０．５％ ウルトラ-Low IgGウシ胎児血清含有Hybridoma-SFM(GIBCO BRL社製)中で炭酸ガス培養器内で３７℃、１週間培養し培養上清を取得した。培養上清はプロテインＡカラムでアフィニティー精製後、ＰＢＳに対して透析を行いモノクローナル抗体とした。得られたモノクローナル抗体を用いて以下の実施例に示す各種試験を行った。
【００４９】
実施例６ 各モノクローナル抗体の交差反応評価
各モノクローナル抗体のビスフェノールＡ関連化合物に対する交差反応性を間接競合法により検討した。検討に用いた化合物はビスフェノールＡ及びビスフェノールＡの構造類似物質であるフェノール、p-tert-butyl phenolの３種類を選定した。まず各抗体を１０〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲になるようにＰＢＳで希釈し、この抗体溶液と０〜１０μｇ／ｍｌの間で希釈系列を作製した抗原溶液を等量混合し、ビスフェノールＡハプテンを固相した抗体価測定用プレートに５０μｌ／ウエルずつ分注して、３７℃で２時間反応させた。検討に用いた抗原はビスフェノールＡとその構造類似物質であるTween20を０．０５％含むＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳで４０００倍希釈したＰＥＯ標識抗マウスＩｇＧウサギ抗体(ZYMED社製)を５０μｌ／ウエル添加し、３７℃、１時間反応させた。更にTween20を０．０５％含むＰＢＳで３回洗浄後、TMB Microwell Peroxidase Substrate（KPL社製）を５０μｌ／ウエル添加し、遮光下３７℃で反応させた。２０分後、０．５mol／Ｌの硫酸を１００μｌ／ウエル添加して発色を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。抗原を添加していないサンプルの吸光度を１００％として、各抗原の阻害率を算出し交差反応性の評価を行った。その結果、ビスフェノールＡと選択的反応し、他の構造類似物との反応性が低いクローンとして３Ｂ９、５Ｇ９、１０Ｅ５、１７Ｂ４、の４クローンを選定した。
【００５０】
実施例７ 各モノクローナル抗体の有機溶媒耐性評価及びハイブリドーマの選定有機溶媒を含有した条件で各モノクローナル抗体を反応させ、どの程度の有機溶媒中での反応性評価を行った。まず各抗体を１０〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲になるようにＰＢＳで希釈し、この抗体溶液と０〜１００μｇ／ｍｌの間で希釈系列を作製したメタノール水溶液を等量混合し、ビスフェノールＡハプテンを固相した抗体価測定用プレートに５０μｌ／ウエルずつ分注して、３７℃で２時間反応させた。Tween20を０．０５％含むＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳで４０００倍希釈したＰＥＯ標識抗マウスＩｇＧウサギ抗体(ZYMED社製)を５０μｌ／ウエル添加し、３７℃、1時間反応させた。更にTween20を０．０５％含むＰＢＳで３回洗浄後、TMB Microwell Peroxidase Substrate（KPL社製）を５０μｌ／ウエル添加し、遮光下３７℃で反応させた。２０分後０．５mol／Ｌの硫酸を１００μｌ／ウエル添加して発色を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。メタノールを含有していないサンプルの吸光度を１００％として、各メタノール濃度での抗原結合活性を算出した。図１にその結果を示した。３Ｂ９、１０Ｅ５、１７Ｂ４の抗原結合活性は、４０％メタノール濃度においても、それぞれ５３％、８２％、８８％であり、いずれも５０％以上の抗原結合活性を有していた。５Ｇ９については、４０％メタノール共存下での抗原結合活性は１％であった。
【００５１】
実施例８ 各モノクローナル抗体のサブクラスの決定
各モノクローナル抗体のサブクラスはMouse MonoAB ID KIT（Zymed社製）を用いて決定した。タイピングした結果、５Ｇ９抗体のサブクラスはＩｇＧ2bであり、３Ｂ９抗体、１０Ｅ４抗体、１７Ｂ４抗体のサブクラスはいずれもＩｇＧ1であった。
【００５２】
実施例９ メタノール存在下での直接競合法によるビスフェノールＡ量の測定
各モノクローナル抗体を用いて直接競合法によるビスフェノールＡ量測定を検討した。またこの測定系でのメタノールの影響も同時に検討した。結果をそれぞれ図２、図３、図４、図５に示した。
【００５３】
直接競合法で使用したペルオキシダーゼ標識ビスフェノールＡは以下の方法により作製した。まず西洋ワサビペルオキシダーゼ１００ｍｇ(２．５μmol)を１００mmolのリン酸緩衝液(ｐＨ８．０) ４ｍｌに溶解した後、３ｍｌの無水ＤＭＦを添加しペルオキシダーゼ溶液とした。次いで本溶液中に１ｍｌのＤＭＦに溶解したイミドエステル化ビスフェノールＡ １１ｍｇ(０．０２５mmol)を徐々に添加し、２５℃で１８時間攪拌し反応を行った。反応終了後、モノエタノールアミン２．５ｍｌを添加し、２５℃で２時間攪拌を行い残存する活性エステルをブロックした後、ＰＢＳに対して透析を行い、ペルオキシダーゼ標識ビスフェノールＡを得た。
【００５４】
直接競合法は以下の方法により行った。まず各抗ビスフェノールＡモノクローナル抗体２５０μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳに溶解し９６ウエルマイクロプレートに１００μｌ／ウエルになるよう分注し、３７℃、２時間インキュベートし抗体の固相化を行った。抗体溶液を除去後、０．０５％ Tween20を含むＰＢＳにて３回洗浄し、５倍希釈のブロッキング溶液(ナカライテスク製)を３００μｌずつ分注し、４℃で一晩静置してブロッキングを行い、抗体固相化プレートを作製した。
【００５５】
次に上記のペルオキシダーゼ標識ビスフェノールＡを５ｎｇ／ｍｌになるようにＰＢＳで希釈し、０．５ｍｌずつ試験管に分注した。この標識抗原溶液に０〜６０％濃度のメタノールを含むＰＢＳで０〜１０μｇ／ｍｌの間で希釈系列を作製したビスフェノールＡ溶液を０．５ｍｌ添加し、この混合溶液を上記の抗体固相化プレートに５０μｌ／ウエルずつ分注して、２５℃で１時間反応させた。反応後、Tween20を０．０５％含むＰＢＳで３回洗浄し、TMB Microwell Peroxidase Substrate（KPL社製）を５０μｌ／ウエル添加し、遮光下３７℃で反応させた。２０分後、０．５mol／Ｌの硫酸を１００μｌ／ウエル添加して発色を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果からもわかるように、実施例７で有機溶媒耐性の高かった３クローンについては、０〜４０％濃度のメタノールを含有した状態で２〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲でビスフェノールＡの量を測定することができたが、３Ｂ９については、メタノール濃度が高くなるにつれ測定感度が大きく低下することがわかった。環境試料を測定する場合、固相抽出等の前処理工程により試料を濃縮するが、濃縮後はメタノール等の有機溶媒に置換されているため、有機溶媒に耐性を有することは大きなメリットであると言える。
【００５６】
実施例１０ メタノール存在下での直接競合法による交差反応性評価
有機溶媒耐性の高かった３クローンについて、５０％メタノール存在下で直接競合法によるビスフェノールＡ及びビスフェノールＡ構造類似物の反応性を検討した。抗原はビスフェノールＡ及びビスフェノールＡの構造類似物質であるフェノール、p-tert-butyl phenolの計３種類を用いた。抗原液はサンプル０〜５０％濃度のメタノールを含むＰＢＳで０〜１０μｇ／ｍｌの間で希釈系列を作製し、他は実施例９に記載の方法に従い、反応性の検討を行った。結果をそれぞれ図６、図７、図８に示した。３Ｂ９抗体、１０Ｅ５抗体、１７Ｂ４抗体のいずれも、ビスフェノールＡの測定が可能な範囲では構造類似物であるフェノール、 p-tert-butyl phenolとはほとんど反応しなかった。
【００５７】
【発明の効果】
上述したように、本発明のモノクローナル抗体は有機溶媒に対する耐性を有することから、有機溶媒存在下でも高感度でビスフェノールＡを測定することができ、環境分析等に広く応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】各モノクローナル抗体のメタノール耐性を示す図である。
【図２】３Ｂ９抗体を用いたメタノール存在下でのビスフェノールＡ測定を示す図である。
【図３】１０Ｅ５抗体を用いたメタノール存在下でのビスフェノールＡ測定を示す図である。
【図４】１７Ｂ４抗体を用いたメタノール存在下でのビスフェノールＡ測定を示す図である。
【図５】５Ｇ９抗体を用いたメタノール存在下でのビスフェノールＡ測定を示す図である。
【図６】３Ｂ９抗体のメタノール存在下での交差反応性を示す図である。
【図７】１０Ｅ５抗体のメタノール存在下での交差反応性を示す図である。
【図８】１７Ｂ４抗体のメタノール存在下での交差反応性を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a bisphenol A hapten compound, a hybridoma, a monoclonal antibody that specifically recognizes bisphenol A, and a method for immunoassay of bisphenol A using them.
[0002]
[Prior art]
Bisphenol A is used as a raw material, stabilizer, and antioxidant for polycarbonate resin used in heat-resistant dishes and milk bottles, and is used for epoxy resin and dental treatment used for coating the inside of cans. It is also used as a raw material for composite resins and sealants. Bisphenol A is produced about 300,000 tons per year, but it has not been a problem so far because of its low toxicity such as carcinogenicity. However, in recent years, so-called “endocrine disrupting substances” in which certain compounds have the action of disrupting the endocrine function of humans and wild animals have been highlighted as a global environmental problem, and bisphenol A is also an endocrine disrupting substance having estrogenic activity. As it turned out that there was one suspicion, it attracted a lot of attention. In particular, in experiments using breast cancer cells, it has been confirmed that it exhibits the same action as estrogen in a very small amount of several ppb, and even in bisphenol A administration experiments on mice, abnormal reproductive functions such as decreased sperm motility Has been reported. In addition, in the environmental safety survey of chemical substances conducted by the Environment Agency, bisphenol A was detected from the water quality and bottom quality of rivers and harbors around large cities, resulting in widespread contamination by bisphenol A. Therefore, it is urgent to know the amount of exposure in the environment.
[0003]
Measurement of endocrine disrupting substances such as bisphenol A requires highly accurate analytical values, and is carried out in accordance with official analytical methods using various types of chromatography such as extraction, concentration, and purification, and expensive mass spectrometers. These analytical methods are highly sensitive and allow multi-component analysis that can identify and quantify a plurality of compounds with similar structures at the same time, but the extraction, separation, and purification of target substances from environmental samples are complicated, and depending on the compound However, there is a problem that derivatization is necessary, and therefore, there is a problem that it takes a lot of capital investment for expensive equipment, proficiency of analysis engineers, and other analysis. For this reason, development of a highly accurate and simple measurement method is desired, and in order to solve such a problem, attention is being paid to a technology for detecting an environmental pollutant by an immunoassay method using an antibody.
[0004]
This immunoassay was applied to the analysis of groundwater and river water herbicides in the United States in the 1980s, and in recent years, environmental pollutants using immunoassays have also been developed in Canada, Europe and Japan. An immunoassay is a method for detecting a small amount of antigen using the ability of the antibody to specifically recognize the antigen, and it is possible to measure the antigen with high sensitivity by high affinity and high specificity of the antibody. it can. In addition, the measurement method is simple and quick results can be obtained, simultaneous measurement of multiple samples and multiple components is possible, detection sensitivity and measurement range suitable for the measurement purpose, and measurement sample purification is not required. It has various advantages such as low cost and is used in a wide range of fields such as medicine, biochemistry, pharmacy, and agriculture. In order to detect a substance to be measured in an immunoassay, it is necessary to label an antibody or an antigen. As the labeling method, a method using an enzyme, a method using a radioactive material, a method using a fluorescent material, or a metal atom is used. The method etc. are mentioned. Among these, enzyme-linked immunosorbent assay (EIA) using enzymes has been applied to the determination of target components in biological samples in the field of clinical examination and biochemistry. The EIA method can be roughly classified into a competitive method and a non-competitive method depending on the format of the antigen-antibody reaction. The non-competitive method can be applied to a multivalent antigen having a plurality of antigen-binding sites and can measure a high molecular antigen such as a protein or an antibody, but a low molecular weight compound such as bisphenol A is measured by a competitive method.
[0005]
In the EIA method, it is important how an antibody having high specificity and high affinity for an antigen can be obtained. However, since bisphenol A is a low molecular weight compound, it normally has the ability to induce antibody production by itself. Does not have. Therefore, it is possible to induce production of an antibody that specifically reacts with bisphenol A by binding to a polymer compound capable of inducing antibody production. Such a low molecular weight compound is called a hapten, and in order to produce an antibody specific to the hapten molecule, immunity such as BSA (bovine serum albumin), OVA (egg albumin), KLH (Sugamus hemocyanin) is used. It is necessary to introduce bisphenol A molecules into the polymer compound having the originality.
[0006]
The performance of an anti-hapten antibody is greatly influenced by the method of producing the hapten antigen, and the design of the hapten molecule determines the specificity and affinity of the antibody. Such a hapten design is also an important factor for obtaining an antibody against bisphenol A, but the cross-reactivity between an antibody obtained by a hapten antigen prepared so far and related substances other than bisphenol A is high. There was a problem. When measuring environmental samples, solid-phase extraction using an organic solvent may be performed to increase measurement sensitivity. However, when solid-phase extraction is performed, the organic solvent is mixed into the sample after extraction. Therefore, an antibody having resistance to an organic solvent has been desired. However, the monoclonal antibodies obtained so far have low resistance to organic solvents, and when the organic solvent is mixed in the sample, the antigen binding activity often decreases significantly.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide an antibody having low cross-reactivity and resistance to an organic solvent, a hybridoma producing the antibody, and a method for producing the same in order to measure bisphenol A with high sensitivity. And A further object of the present invention is to provide a bisphenol A derivative for obtaining an antibody that reacts with bisphenol A with high sensitivity and specificity, and a method for producing the same, and the compound is an antibody for specifically reacting with bisphenol A. And a labeled antigen for competitive measurement of bisphenol A.
[0008]
[Means for Solving the Invention]
In view of the above circumstances, the present inventors have intensively studied to develop an antibody that can measure bisphenol A with high sensitivity and is resistant to organic solvents. As a result, a spacer compound having a specific length is introduced into bisphenol A. By immunizing with the hapten antigen thus obtained, it was found that an antibody that reacts with the compound with high sensitivity and specificity was obtained, and the present invention was completed.
[0009]
That is, the present invention has the following configuration.
(1) A monoclonal antibody that specifically reacts with bisphenol A capable of retaining an antigen-binding ability of 50% or more in an aqueous solution containing an organic solvent having a concentration of 40% or less.
(2) The monoclonal antibody according to (1), produced by a hybridoma whose accession number is selected from the group consisting of FERM BP-7146, FERM BP-7147, and FERM BP-7148.
(3) A hybridoma whose accession number is any one selected from the group consisting of FERM BP-7146, FERM BP-7147, and FERM BP-7148, and producing the monoclonal antibody according to (1) A hybridoma.
(4) A hapten compound having a structure represented by the structure represented by the following formula (I) (wherein n represents an integer of 1 to 10).
[Chemical formula 2]
(6) The immune antigen according to (5), wherein the polymer compound is a protein.
(7) A labeled antigen obtained by binding a labeling substance to the hapten compound according to (4).
(8) The labeled antigen according to (7), wherein the labeling substance is an enzyme.
(9) A method for producing an immune antigen and a labeled antigen, wherein the carboxyl group terminal of the hapten compound according to (4) is activated and bound to a polymer compound.
(10) The method for producing a monoclonal antibody according to (1), which is obtained by immunizing an animal with the immune antigen according to (5) or (6).
(11) A method for measuring bisphenol A, wherein the monoclonal antibody according to (1) and the labeled antigen according to claim 7 are used.
(12) The method for measuring bisphenol A according to (11), wherein the measurement object is concentrated in advance by a solid phase extraction method using methanol as a solvent.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The monoclonal antibody of the present invention is obtained by binding a polymer compound to a hapten compound into which a spacer compound having a specific length is introduced at the end of bisphenol A, and immunizing a mouse or the like using this complex as an immunogen, and then immunizing the mouse. The hybridoma cells are prepared by fusing the spleen cells and myeloma cells, isolating cells that produce antibodies that bind to the immunogen from the hybridoma cells, and purifying the monoclonal antibodies produced by the hybridomas. Is.
[0011]
The hapten compound of the present invention is a compound represented by the following formula (I), and can be obtained by binding a spacer having a carboxyl group to the terminal hydroxyl group of bisphenol A. In the formula (I), n represents an integer of 1 to 10. Furthermore, by activating the carboxyl group of the hapten compound by imidoesterification or the like and binding it to a polymer compound, the antigen for immunization and bisphenol A can be used as a labeled antigen for competitive measurement.
[0012]
[Chemical Formula 3]
Hereinafter, preparation of the hapten compound, hybridoma, monoclonal antibody of the present invention, and immunochemical measurement method of bisphenol A will be described.
[0014]
Preparation of bisphenol A hapten compound
The hapten compound represented by the formula (I) of the present invention can be prepared by a known method. For example, it can be obtained by reacting a hydroxyl group on one side of bisphenol A with a halogenated alkyl ester serving as a spacer in an organic solvent and hydrolyzing the ester portion with a base such as an alkali. The length of the spacer is not particularly limited, but when a high molecular compound serving as a carrier is bound to the hapten compound as an immunogen, the antibody recognizes a portion away from the binding site with the carrier. In many cases, it is desirable to have a certain length. However, if the length is too long, an antibody that recognizes the spacer portion may be obtained. Therefore, the spacer length is 1 to 10 carbon atoms, preferably 3 to 6 carbon atoms, and more preferably 5 carbon atoms. For example, examples of the spacer include halogenated alkyl esters such as methyl 3-bromopropionate, ethyl 3-bromopropionate, ethyl γ-bromobutyrate, ethyl 5-bromovalerate, and ethyl 6-bromohexanoate. A particularly preferred spacer compound is ethyl 6-bromohexanoate having 5 carbon atoms.
[0015]
The molar ratio of bisphenol A and alkyl halide during the reaction is preferably 1: 1 to 1: 0.5, and the reaction is particularly preferably carried out in an equimolar amount. Examples of the solvent used in the reaction include organic solvents such as DMSO, DME, DMF, THF, hexane, ethyl acetate, and dichloromethane, but are not particularly limited. As the base, sodium amide, potassium carbonate, triethylamine, sodium hydroxide, barium oxide, silver oxide, sodium hydride and the like can be used. The reaction temperature is 0 to 90 ° C, preferably room temperature to 90 ° C, more preferably 80 to 85 ° C, and the reaction time is 0.5 to 6 hours, preferably 1 to 3 hours with stirring. . The obtained compound can be purified to a hapten compound by purification operations such as silica gel column chromatography and recrystallization as necessary.
[0016]
Production of antigen for immunization
Since the hapten compounds described above do not themselves have immunogenicity, the desired antibody is often not obtained even when immunized alone. Thus, an immunogen can be obtained by binding a polymer compound having immunogenicity as a carrier compound to form a complex.
[0017]
The polymer compound used as the carrier compound preferably has a molecular weight of 10,000 or more. For example, proteins such as hemocyanin, ovalbumin, bovine serum albumin, rabbit serum albumin, MAP resin, polyamide, polyacrolein, etc. Examples include molecules, polysaccharides such as dextran and agarose, inactivated bacteria, and the like. Among these, stag beetle hemocyanin and bovine serum albumin are preferable in terms of operability and immunogenicity.
[0018]
The bond between the hapten compound and the carrier compound may be performed by reacting the carboxyl group of the hapten compound with the reactive functional group on the polymer carrier, and the method is not particularly limited, but as a known method, a mixed acid anhydride method or Examples include the active ester method. In the mixed acid anhydride method, a carboxyl group of a hapten compound is reacted with a chloroalkyl formate such as butyl chlorocarbonate or ethyl chlorocarbonate to obtain an active mixed acid anhydride, and then the amino group in the amino group on the polymer carrier is reacted. To produce an amide bond. In contrast, the active ester method is a method in which a carboxyl group of a hapten compound is converted into an active ester type using a carbodiimide type condensing agent and then reacted with an amino group of a polymer carrier. The hapten compound can be bound by either method, but in the case of the mixed acid anhydride method, it may react with the hydroxyl group of bisphenol A and the hydroxyl group needs to be protected, whereas the active ester method is It is particularly preferable because it does not react with a hydroxyl group, and the obtained imide ester has high stability and can be stored in a freezer for a long time in a dry state.
[0019]
In the active ester method, the hapten compound and the most water-soluble N-hydroxysuccinimide are reacted in an organic solvent in the presence of a coupling agent such as dicyclohexylcarbodiimide or water-soluble carbodiimide, and the carboxyl group is converted to an imide ester. To do. The molar ratio of the hapten compound and N-hydroxysuccinimide during the reaction is preferably in the range of 1: 1 to 1: 5, particularly preferably 1: 1. The reaction temperature is 0 to 40 ° C, preferably 10 to 20 ° C. The reaction time is 2 to 10 hours, preferably 5 hours. Examples of the organic solvent at the time of reaction include, but are not particularly limited to, organic solvents such as DMSO, DME, DMF, THF, hexane, and ethyl acetate. The obtained imidoesterified hapten compound is highly purified by purification operations such as silica gel column chromatography and recrystallization as necessary.
[0020]
The obtained imidoesterified hapten compound and carrier are usually bonded in a water-containing organic solvent. First, imidoesterified hapten is dissolved in methanol and DMSO organic solvent. Similarly, a carrier such as bovine serum albumin or staghorn hemocyanin is dissolved in a buffer solution containing no amino group such as a phosphate buffer or physiological saline, and the carrier solution dissolved in the buffer in the imidoesterified hapten solution is gradually added. To react. The organic solvent concentration in the reaction solution is 5 to 80%, preferably 20 to 50%. The buffer solution is not particularly limited as long as it does not contain an amino group, the buffer solution concentration is 10 to 500 mmol, preferably 50 to 100 mmol, and the pH of the buffer solution may be between 5 and 10, preferably Between 6-8. The molar ratio of imidoesterified hapten to carrier is preferably in the range of 200: 1 to 10: 1, particularly preferably between 100: 1 to 50: 1. It is preferable to perform reaction temperature between 0-50 degreeC, Most preferably, it is 20-30 degreeC. The reaction time may be 1 to 24 hours, preferably 5 to 15 hours. The immunizing antigen thus obtained is purified by substituting it with a buffer solution by gel filtration, dialysis or the like, if necessary.
[0021]
Production of hybridomas and monoclonal antibodies
Using the immunogen obtained by the above method, a monoclonal antibody can be produced by a known method. Examples are shown below, but the method is not particularly limited.
[0022]
When immunizing a soluble substance as used in the present invention as an antigen, it is usually made into an emulsion together with adjuvant. As adjuvants, Freund adjuvant, alum and pertussis cells are used.
[0023]
As the animal to be immunized, BALB / c mice are usually used, but F1 mice, hamsters and the like may be used. The amount of antigen to be immunized to one mouse may be 30 to 50 μg / dose, and the immunizing antigen prepared with physiological saline to be 100 to 500 μg / ml and complete Freundage band with two syringes etc. Emulsions are made by mixing in equal amounts using 0.1 to 0.2 ml / animal. Depending on the site of injection, emulsion administration includes (1) intraperitoneal injection (ip), (2) subcutaneous injection (sc), intravenous injection (iv), intramuscular injection (im), etc. Subcutaneous injection is desirable. Immunize several times every 1-2 weeks. The immunized mouse is bled several days later, and the same amount of antigen is injected intravenously or intraperitoneally 3 to 4 days before the antibody titer rises sufficiently.
[0024]
Myeloma cells used for cell fusion include those derived from mice and rats. In many cases, NS-1, P3U1, SP2 and X63.3.6.5.3 myeloma cells derived from Balb / c mice are used. It is done.
[0025]
As a cell fusion method, there is a method using an HVJ virus or an electric pulse. At present, a polyethylene glycol (PEG) method is used which has a relatively low cytotoxicity and is easy for a fusion operation. Generally used PEG has an average molecular weight of 1000 to 6000 and is used at a concentration of 30 to 50% (v / v).
[0026]
Spleen cells collected from the removed spleen are thoroughly washed with a serum-free medium and then mixed with myeloma cells in the logarithmic growth phase to perform cell fusion. The mixing ratio of myeloma cells and spleen cells may be in the range of 1:10 to 1: 1. The mixed spleen cells and myeloma cells are pelleted by centrifugation, added with a PEG solution, and fused by stirring and shaking. After the fusion, it is washed by centrifugation, transferred to a growth medium supplemented with HAT, and cultured in a 96-well culture plate. In the HAT medium, myeloma cells having no salvage circuit cannot survive, and only hybridomas fused with splenocytes grow. Since colonies start to form several days after the fusion, the culture supernatant of the well in which colony growth was observed was collected, and the reactivity with the antigen bisphenol A was confirmed by the ELISA method to produce the desired antibody. Screen for presence or absence. In the screening, an antigen-antibody reaction is performed in a 50% organic solvent (for example, methanol) to obtain a clone having antigen-binding activity, and further, the reactivity is evaluated in the organic solvent to select a clone. At this time, in order to eliminate the carrier-derived antibody, the screening antigen is prepared as a screening antigen by preparing a complex with a carrier different from the hapten complex used as the immunization antigen. For example, when the antigen for immunization is produced with bovine serum albumin, the antigen for screening is produced with ovalbumin or stag beetle hemocyanin. After screening, a well in which antibody production has been confirmed is selected and cloned by limiting dilution to obtain a single antibody-producing hybridoma.
[0027]
The hybridoma of the present invention is not particularly limited as long as it is resistant to organic solvents and produces a monoclonal antibody that specifically recognizes bisphenol A. For example, the hybridoma deposited at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Examples include hybridomas such as numbers FERMBP-7146 (identification display BPA3B9), FERM BP-7147 (identification display BPA17B4), and FERM BP-7148 (identification display BPA10E5).
[0028]
Monoclonal antibodies can be prepared from established clones by culturing hybridoma cells in plates or flasks and obtaining the culture supernatant, but also in a simple follow-fiber culture device that can be stored in a carbon dioxide incubator. can do. Furthermore, it can be obtained by transplanting hybridoma cells into the abdominal cavity of mice pre-administered with pristane, allowing them to proliferate, and collecting ascites collected in the
[0029]
The culture solution and ascites thus obtained may be purified as necessary by ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, or affinity chromatography with protein A or protein G immobilized thereon to obtain a monoclonal preparation. it can. The monoclonal antibody thus obtained retains an antigen binding ability of 80% or more in an aqueous solution containing a 40% concentration organic solvent, and its performance was evaluated by the method described in the Examples. Here, the organic solvent refers to methanol, ethanol, acetone, DMF, DMSO, acetonitrile and the like, but is not particularly limited.
[0030]
Bisphenol A assay using anti-bisphenol A monoclonal antibody
Bisphenol A can be measured using the anti-bisphenol A antibody obtained by the present invention. Immunoassays include competitive measurement methods, non-competitive measurement methods, homogeneous methods, and the like, but since bisphenol A is a low molecular compound, it is performed by the competitive method. The competition method mainly includes an indirect competition method in which an antigen is immobilized on a well, tube, magnetic particle, etc. of a microplate, and a direct competition method in which an antibody is immobilized on a well or tube.
[0031]
In the indirect competition method, an antigen used as an immunogen or a complex of a hapten compound and another carrier is used as an antigen to be immobilized in a well. First, the hapten complex is immobilized on a well such as a microplate. Next, the portion where the antigen is not bound to the well is blocked with a commercially available blocking agent such as bovine serum albumin or casein. A specimen and an anti-bisphenol A antibody, which is a primary antibody, are added to the well, and the specimen and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with the antibody. After washing away the antibody that did not bind to the immobilized antigen, an enzyme-labeled antibody in which goat anti-mouse immunoglobulin antibody was labeled with an enzyme such as peroxidase (PEO) or alkaline phosphatase (ALP) as a secondary antibody was added to the well. Then, it is bound to the primary antibody bound to the immobilized antigen. After washing several times with a buffer solution, the absorbance of the enzyme reaction product colored by adding an enzyme substrate is measured.
[0032]
When peroxidase is used as an enzyme, hydrogen peroxide is used as a substrate, and o-phenylenediamine or tetramethylbenzidine is used as a color former. In alkaline phosphatase, p-nitrophenyl phosphate is generally used as a substrate. When the reaction product of the substrate is fluorescent or when a fluorescent substance is labeled instead of the enzyme for the enzyme-labeled antigen, the measurement is performed with a fluorometer. If a chemiluminescent substance is used for this, it becomes possible to measure with a chemiluminescence measuring instrument, and it becomes a more sensitive measuring method.
[0033]
In the direct competition method, an antibody is immobilized on a well for blocking, and then a separately prepared hapten compound and an enzyme-labeled antigen bound with an enzyme and a specimen are added to cause a competitive reaction between the solid-phase antibody, the specimen, and the enzyme-labeled antibody. The labeled antigen that did not bind to the antibody is washed away, an enzyme substrate is added, and the absorbance of the reaction product is measured. Even in this method, a more sensitive measurement method can be constructed by changing the labeling substance.
[0034]
The enzyme-labeled antigen used for the competitive measurement method can be prepared by the same method as that for the immunizing antigen. That is, a labeled antigen can be obtained by using an enzyme such as peroxidase or alkaline phosphatase instead of a carrier carrier such as bovine serum albumin used in the preparation of an immunizing antigen. In addition, as described above, a labeling body can be produced with a fluorescent substance such as rhodamine or a chemiluminescent substance.
[0035]
In the case of the competitive measurement method, when the obtained labeled antigen has a stronger affinity for the antibody than the sample, a competitive reaction between the sample and the labeled antigen is less likely to occur. As a result, the measurement sensitivity may be lowered, and the measurement sensitivity depends on the method for producing the labeled antigen. In general, the smaller the affinity of the labeled antigen, the higher the sensitivity, and the affinity changes depending on the amount of hapten compound introduced into the labeled enzyme. Therefore, the reaction molar ratio of the labeling enzyme to the hapten compound at the time of preparing the labeled antigen is preferably 1: 1 to 1:50, more preferably 1:10 to 1:20.
[0036]
In the measurement method described above, a decrease in absorbance of the reaction solution to which the sample is added is measured as an inhibition rate relative to the absorbance of the reaction solution to which the sample is not added. At that time, a calibration curve can be prepared from a bisphenol A standard solution having a known concentration, and the bisphenol A concentration can be calculated from the obtained calibration curve. In addition, before performing this measurement, it is also preferable to concentrate the measurement object in advance by a solid phase extraction method using methanol as a solvent.
[0037]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
[0038]
Example 1 Synthesis of bisphenol A hapten compound
51 g (224 mmol) of bisphenol A (1) and 50 g (224 mmol) of 5-bromohexanoic acid ethyl ester were dissolved in 500 ml of dimethylformamide, 46 g (336 mmol) of potassium carbonate was added and reacted at 80 to 85 ° C. for 2 hours. The reaction solution was quenched with water, extracted with ethyl acetate, washed with water, and purified with a silica gel column (ethyl acetate: hexane = 1: 6) to obtain 37 g of bisphenol monohexanoic acid ethyl ester (2) ( Yield 44.7%). Next, 37 g of the obtained ethyl bisphenolmonohexanoate (2) was dissolved in 220 ml of 70% ethanol aqueous solution, 13.2 g (200 mmol) of 85% potassium hydroxide solution was added, and the mixture was stirred at 75-80 ° C. for 1 hour. did. The reaction mixture was quenched with water, adjusted to
[0039]
[Formula 4]
Example 2 Production of antigen for immunization
Using the bisphenol A hapten compound prepared in Example 1, an antigen for immunization was prepared by the active ester method. The reaction scheme is shown below. First, 30.8 g (90 mmol) of the hapten compound (3) obtained in Example 1 was dissolved in 300 ml of dimethylformamide, and 10.4 g (90 mmol) of N-hydroxysuccinimide and 18.6 g (90 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide were added. And stirred at room temperature for 5 hours. The reaction mixture was quenched into ice water, extracted with ethyl acetate, washed with warm water, purified with a silica gel column (ethyl acetate: hexane = 1: 5), and 10.0 g of imidoesterified bisphenol A hapten (4) ( Yield 24.7%).
[0041]
[Chemical formula 5]
Binding of the obtained imidoesterified hapten and bovine serum albumin as a carrier carrier was carried out by the following method. First, 0.2 g (3.02 μmol) of bovine serum albumin was dissolved in 10 ml of 100 mmol borate buffer (pH 8.0), and then 5 ml of anhydrous DMF was added to obtain a carrier protein solution. Next, 68 mg (0.154 mmol) of imidoesterified bisphenol A dissolved in 5 ml of DMF was gradually added to this solution, and the mixture was stirred at 25 ° C. for 18 hours to carry out the reaction. After completion of the reaction, 2.5 ml of monoethanolamine was added and stirred at 25 ° C. for 2 hours to block the remaining active ester, followed by dialysis against PBS to obtain a bisphenol A-BSA complex. The number of haptens introduced into the bisphenol A-BSA complex was 40 when calculated by quantifying amino groups by the TNBS method.
[0043]
Example 3 Immunization to animals
2 mg of the antigen for immunization prepared in Example 2 was dissolved in 1 ml of PBS and mixed with an equal amount of complete adjuvant to prepare a 1 mg / ml emulsion solution. This emulsion solution was administered intraperitoneally to each of 6 Balb / c mice at a total of 0.1 ml per mouse. The same operation was repeated 3 times every 2 weeks. One week after each immunization, blood was collected, and the blood was allowed to stand at room temperature for 1 hour, and then clots were separated to obtain antiserum.
[0044]
Example 4 Measurement of antibody titer
Similar to the method for preparing an antigen for immunization described in Example 2, an antigen for antibody titer measurement was prepared using ovalbumin instead of bovine serum albumin. This antigen was dissolved in PBS to a concentration of 0.1 mg / ml, dispensed to a 96-well microplate at a concentration of 100 μl / well, and incubated at 37 ° C. for 2 hours for immobilization. After removing the antigen solution, it was washed 3 times with PBS containing 0.05
[0045]
50 μl / well of antiserum diluted in a 4-fold dilution series with PBS was added to the plate, and reacted at 37 ° C. for 2 hours. The plate was washed 3 times with PBS containing 0.05
[0046]
Example 5 Production of hybridoma and anti-bisphenol A monoclonal antibody
Mice with the highest antibody titer were intraperitoneally administered with 100 μl of immunizing antigen at a concentration of 1 mg / ml as the final immunization. Three days after the final immunization, the spleen was aseptically removed according to a conventional method, and the spleen cells were dispersed and washed three times with RPMI 1640 medium to prepare a spleen cell suspension. The number of cells was counted, and the pre-cultured Sp / 2 myeloma cells and spleen cells were mixed at a ratio of 1:10. After centrifugation, the supernatant was removed. After removing the supernatant, 0.5 ml of PEG solution was added, the cells were stirred, and 25 ml of RPMI 1640 medium was gradually added over 2 to 3 minutes to perform cell fusion. Next, after removing the supernatant by centrifugation and adding HAT medium, the cells were suspended, seeded in a 96-well culture plate, and cultured in a 37 ° C. carbon dioxide incubator.
[0047]
From one week after the start of the culture, screening was performed using the culture supernatant of the well in which cell proliferation was observed. In screening, an antigen for antibody titer measurement prepared using ovalbumin was dissolved in PBS so as to be 0.1 mg / ml, and dispensed to 100 μl / well in a 96-well microplate. Incubated for a period of time for immobilization. After removing the antigen solution, wash 3 times with PBS containing 0.05% Tween, dispense 300 μl of 5-fold diluted blocking solution (manufactured by Nacalai Tesque), and let stand at 4 ° C. overnight to block. The plate for antibody titer measurement was prepared. The culture supernatant of the obtained hybridoma was prepared by adding an equal amount of methanol to a methanol concentration of 50%. This sample was added to the above antibody titration plate so that the collected culture supernatant was 50 μl / well and reacted at 37 ° C. for 2 hours to examine whether or not anti-bisphenol A antibody was produced. The plate was washed 3 times with PBS containing 0.05
[0048]
These hybridomas were cultured in Hybridoma-SFM (GIBCO BRL) containing 0.5% Ultra-Low IgG fetal bovine serum in a carbon dioxide incubator for 1 week at 37 ° C. to obtain a culture supernatant. The culture supernatant was affinity purified with a protein A column and dialyzed against PBS to obtain a monoclonal antibody. Various tests shown in the following examples were performed using the obtained monoclonal antibodies.
[0049]
Example 6 Cross reaction evaluation of each monoclonal antibody
The cross-reactivity of each monoclonal antibody to bisphenol A related compounds was examined by the indirect competition method. The compounds used in the study were selected from three types: bisphenol A and phenol, which is a structurally similar substance of bisphenol A, and p-tert-butyl phenol. First, each antibody is diluted with PBS so as to be in a concentration range of 10 to 100 ng / ml, and an equal amount of this antibody solution and an antigen solution in which a dilution series is prepared between 0 to 10 μg / ml are mixed to obtain a bisphenol A hapten. 50 μl / well was dispensed onto a solid phase antibody titer measurement plate and reacted at 37 ° C. for 2 hours. The antigen used in the study was washed 3 times with PBS containing 0.05% of bisphenol A and its structurally similar substance Tween20, and then diluted 50 times with PEO-labeled anti-mouse IgG rabbit antibody (manufactured by ZYMED) diluted 4000 times with PBS. / Well was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. Further, after washing 3 times with PBS containing 0.05% of
[0050]
Example 7 Evaluation of Organic Solvent Resistance of Each Monoclonal Antibody and Selection of Hybridoma Each monoclonal antibody was reacted under conditions containing an organic solvent, and the reactivity in what organic solvent was evaluated. First, each antibody was diluted with PBS so as to be in a concentration range of 10 to 100 ng / ml, and an equal amount of this aqueous solution and a methanol aqueous solution that produced a dilution series between 0 to 100 μg / ml were mixed to prepare a bisphenol A hapten. 50 μl / well was dispensed onto a solid phase antibody titer measurement plate and reacted at 37 ° C. for 2 hours. After washing 3 times with PBS containing 0.05
[0051]
Example 8 Determination of the subclass of each monoclonal antibody
The subclass of each monoclonal antibody was determined using Mouse MonoAB ID KIT (Zymed). As a result of typing, the subclass of 5G9 antibody is IgG2bThe subclasses of 3B9 antibody, 10E4 antibody, and 17B4 antibody are all IgG1Met.
[0052]
Example 9 Measurement of bisphenol A content by direct competition method in the presence of methanol
Using each monoclonal antibody, the measurement of the amount of bisphenol A by the direct competition method was examined. The influence of methanol in this measurement system was also investigated. The results are shown in FIGS. 2, 3, 4, and 5, respectively.
[0053]
Peroxidase-labeled bisphenol A used in the direct competition method was prepared by the following method. First, 100 mg (2.5 μmol) of horseradish peroxidase was dissolved in 4 ml of 100 mmol phosphate buffer (pH 8.0), and then 3 ml of anhydrous DMF was added to form a peroxidase solution. Next, 11 mg (0.025 mmol) of imidoesterified bisphenol A dissolved in 1 ml of DMF was gradually added to this solution, and the reaction was carried out by stirring at 25 ° C. for 18 hours. After completion of the reaction, 2.5 ml of monoethanolamine was added and stirred at 25 ° C. for 2 hours to block the remaining active ester, followed by dialysis against PBS to obtain peroxidase-labeled bisphenol A.
[0054]
The direct competition method was performed by the following method. First, each anti-bisphenol A monoclonal antibody was dissolved in PBS to a concentration of 250 μg / ml, dispensed to a 96-well microplate at a concentration of 100 μl / well, and incubated at 37 ° C. for 2 hours to immobilize the antibody. After removing the antibody solution, wash 3 times with PBS containing 0.05% Tween20, dispense 300 μl of 5-fold diluted blocking solution (manufactured by Nacalai Tesque) and let stand at 4 ° C. overnight to block. Then, an antibody-immobilized plate was prepared.
[0055]
Next, the peroxidase-labeled bisphenol A was diluted with PBS to 5 ng / ml, and 0.5 ml was dispensed into a test tube. To this labeled antigen solution, 0.5 ml of a bisphenol A solution prepared with a dilution series of 0 to 10 μg / ml in PBS containing 0 to 60% concentration of methanol was added, and this mixed solution was added to the above antibody-immobilized plate. 50 μl / well, and then allowed to react at 25 ° C. for 1 hour. After the reaction, the plate was washed three times with PBS containing 0.05% of
[0056]
Example 10 Cross-reactivity evaluation by direct competition method in the presence of methanol
The reactivity of bisphenol A and bisphenol A structural analogs was examined by direct competition in the presence of 50% methanol for 3 clones with high organic solvent resistance. Three types of antigens, bisphenol A and phenol, which is a structurally similar substance of bisphenol A, and p-tert-butyl phenol were used. The antigen solution was prepared in a dilution series between 0 and 10 μg / ml with PBS containing 0 to 50% concentration of methanol, and the reactivity was examined according to the method described in Example 9 except for that. The results are shown in FIGS. 6, 7, and 8, respectively. None of the 3B9 antibody, the 10E5 antibody, and the 17B4 antibody reacted with phenol, p-tert-butyl phenol, which is a structural analog, to the extent that bisphenol A can be measured.
[0057]
【The invention's effect】
As described above, since the monoclonal antibody of the present invention has resistance to an organic solvent, bisphenol A can be measured with high sensitivity even in the presence of the organic solvent, and can be widely applied to environmental analysis and the like.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing methanol resistance of each monoclonal antibody.
FIG. 2 is a diagram showing measurement of bisphenol A in the presence of methanol using the 3B9 antibody.
FIG. 3 shows bisphenol A measurement in the presence of methanol using 10E5 antibody.
FIG. 4 is a diagram showing measurement of bisphenol A in the presence of methanol using the 17B4 antibody.
FIG. 5 shows bisphenol A measurement in the presence of methanol using 5G9 antibody.
FIG. 6 shows cross-reactivity of 3B9 antibody in the presence of methanol.
FIG. 7 is a diagram showing the cross-reactivity of 10E5 antibody in the presence of methanol.
FIG. 8 is a diagram showing the cross-reactivity of 17B4 antibody in the presence of methanol.
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