JP4047958B2 - 4 (R) -Hydroxy-2-ketoglutarate aldolase and DNA encoding the enzyme - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はグリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する反応を触媒する酵素４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼ、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体、該形質転換体を用いた４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸〔以下、４（Ｒ）ＫＨＧと略す〕、４（Ｒ）−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸〔以下、４（Ｒ）ＨＧと略す〕または４（Ｒ）−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン〔以下、４（Ｒ）ＨＹＰと略す〕の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ピルビン酸とグリオキシル酸とから４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼ（以下、ＫＡＬと略称す）活性はいくつかの生物に存在することが報告されているが、いずれも４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のみならず４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸をも同時に生成し、４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のみを特異的に生成する４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼ〔以下、４（Ｒ）ＫＡＬと略す〕は知られていない〔Methods in Enzymology 41 partB, 115, E.E.Dekker & U. Maitra、J. Biol. Chem., 257, 5079 (1972)〕。
【０００３】
４（Ｒ）ＫＨＧの製造法として、エリスロ−４−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を化学的に脱アミノする方法（Methods in Enzymology, 17 partB, 275）、オキサロ酢酸とグリオキシル酸から合成したラセミ-4-ヒドロキシ-2-ケトグルタル酸から４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を分解除去する方法〔J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1, 1085(1992)〕、ピルビン酸とグリオキシル酸から４（Ｒ）ＫＨＧを生成する活性を有する生体触媒を、ピルビン酸もしくは該生体触媒によってピルビン酸に転換されうる化合物とグリオキシル酸に作用させる方法（特開平７−２８９２８４）などが知られている。
【０００４】
前２者の製法は原料が高価であったり、収量が低いため実用的ではない。後者の製法は実用可能ではあるものの、更なる経済的製法が望まれている。
４（Ｒ）ＨＧの製造法としては、化学合成したＤＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸にアンモニアとＮＡＤＰＨ存在下でグルタミン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４（Ｒ）４（Ｓ）ラセミ体の４−ヒドロキシグルタミン酸をイオン交換クロマトで分割する方法（Methods in Enzymology,17 partB,277）やアミノ基供与体存在下ピルビン酸とグリオキシル酸から４（Ｒ）ＨＧを生成する活性を有する生体触媒をピルビン酸もしくは該生体触媒によってピルビン酸に転換されうる化合物とグリオキシル酸に作用させる方法(特開平８−８０１９８)などが知られている。
【０００５】
前者の製法は高価な原料と光学分割操作を必要とするために実用に供しがたい。後者の製法は実用可能ではあるものの、更なる経済的製法が望まれている。
４（Ｒ）ＨＹＰの製造法としては、コラーゲン加水分解物より分離精製する方法の他、クロノスタキス属、グリオクラディウム属またはネクトリア属に属する微生物を培養しその培養物中より抽出する方法(特開平５−２３６９８０)、4-ヒドロキシ-2-ケトグルタル酸を4-ヒドロキシ-L-プロリンに転換する活性を有する微生物を4-ヒドロキシ-2-ケトグルタル酸に作用させる方法(特開平３−２６６９９５)などが知られている。しかしいずれの方法も原料あるいは分離精製に費やすコストが高く、優れた製法とは言い難い。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、医薬品などの合成原料として有用である４（Ｒ）ＫＨＧ、４（Ｒ）ＨＧおよび４（Ｒ）ＨＹＰを、工業的に有利に製造する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、グリオキシル酸とピルビン酸とから、４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は生成せず、４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のみを生成する反応を触媒する酵素４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼ〔４（Ｒ）ＫＡＬ〕、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体、該形質転換体を用いた４（Ｒ）ＫＨＧ、４（Ｒ）ＨＧまたは４（Ｒ）ＨＹＰの製造法に関する。
【０００８】
また、アミノ基供与体および４（Ｒ）ＫＨＧから４（Ｒ）ＨＹＰを生成する活性を有する生体触媒を用いた４（Ｒ）ＨＹＰの製造法に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の４（Ｒ）ＫＡＬとして、グリオキシル酸とピルビン酸とから、４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は生成せず、４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のみを生成する反応を触媒する酵素であればいずれも用いることができ、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号１で表されるアミノ酸配列とは一個以上のアミノ酸が置換、欠失または付加したアミノ酸配列を有し、かつグリオキシル酸とピルビン酸とから、４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は生成せず、４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のみを生成する反応を触媒する活性を有するポリペプチドをあげることができる。
【００１０】
配列番号１で表されるアミノ酸配列とは一個以上のアミノ酸が置換、欠失または付加したアミノ酸配列を有し、かつグリオキシル酸とピルビン酸とから、４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は生成せず、４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のみを生成する反応を触媒する活性を有するポリペプチドは、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982) 、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409(1982) 、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81,5662 (1984) 、Science, 224, 1431 (1984)、PCT WO85／00817(1985) 、Nature, 316, 601 (1985) 、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985) 、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）, ８章 Mutagenesis of Cloned ＤＮＡ，John Wiley & Sons,Inc.(1989)等に記載の方法に準じて調製することができる。
【００１１】
本発明のＤＮＡとして、上記本発明の４（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤＮＡをあげることができ、例えば、配列番号２または３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、および、該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡをあげることができる。
【００１２】
本発明のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、配列番号２または３で表される塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１倍〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
【００１３】
ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning, A laboratory manual)、第２版〔サンブルック(Sambrook)、フリッチ(Fritsch) 、マニアチス(Maniatis)編集、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス (Cold Spring Harbor Laboratory Press)、１９８９年刊、以下、モレキュラー・クローニング 第２版と略す〕等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号２および３で表される塩基配列から選ばれる塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、更に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
【００１４】
本発明のＤＮＡは、グリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活性を有する微生物より取得することができる。 該微生物として、例えばバチルス属に属する微生物をあげることができ、具体的にはバチルス エスピーＯＣ１８７株をあげることができる。バチルス エスピーＯＣ１８７株は本発明者らにより土壌より分離された菌株であって、ブダペスト条約に基づいて平成６年４月１９日付で工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４６４６として寄託されている。
【００１５】
以下に、グリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活性を有する微生物より４（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤＮＡを取得する方法を記す。
グリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活性を有する微生物から、通常のＤＮＡ単離法、例えばフェノール法〔Biochim. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)〕により、該微生物の染色体ＤＮＡを調製する。得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素により切断し該制限酵素切断断片をベクターＤＮＡに組込むことにより、該微生物染色体のＤＮＡライブラリーを構築する。このＤＮＡライブラリーを用いて宿主微生物を形質転換する。得られた形質転換体について、グリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活性を測定する。親株よりも該活性の増強された形質転換体より目的とする遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。
【００１６】
この一連の操作は、公知のin vitro組換え技法（モレキュラー・クローニング第２版）に準じて行うことができる。
グリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活性を有する微生物の染色体ＤＮＡライブラリーを構築するベクターＤＮＡとしては、大腸菌Ｋ１２株において自律複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミッドベクターなどいずれでも使用できる。具体的には、ZAP Express〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 58 (1992)〕、pBluescript II SK(+)〔ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Research）, 17, 9494 (1989)〕、λｚａｐ II（ストラタジーン社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１〔ＤＮＡ クローニン グ、ア・プラクティカル・アプローチ（DNA Cloning, A Practical Approach ）, 1, 49 (1985)〕、Lambda BlueMid（クローンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ（ファルマシア社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ （ファルマシア社製）、ｐｃＤ２〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol. Cell. Biol.）, 3, 280 (1983)〕、ｐＵＣ１８ 〔ジーン（Gene）, 33, 103 (1985)〕、ｐＳＴＶ２９（宝酒造社製）等をあげることができる。
【００１７】
宿主微生物としては、大腸菌に属する微生物であればいずれでも用いることができる。具体的には、Escherichia coli XL1-Blue MRF'〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 81 (1992)〕、Escherichia coli C600〔ジェネティックス（Genetics）、39, 440 (1954)〕、Escherichia coli Y1088〔Science, 222, 778 (1983)〕 、Escherichia coli Y1090〔Science, 222, 778 (1983)〕、Escherichia coli NM522 〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）、166, 1 (1983)〕、Escherichia coli K802〔J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)〕、Escherichia coli JM105、Escherichia coli ATCC33625等が用いられる。
【００１８】
４（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤＮＡ断片をそのままあるいは適当な制限酵素などで切断後、常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー(Sanger)らのジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)〕あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー〔パーキン・エルマー（Perkin Elmer）社製〕等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
【００１９】
このようにして決定された４（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤＮＡの塩基配列として、例えば配列番号２に示された塩基配列をあげることができる。
決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、ＤＮＡ合成機で化学合成することにより、本発明のＤＮＡを調製することもできる。ＤＮＡ合成機としては、チオホスファイト法を利用した島津製作所社製のＤＮＡ合成機、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２等をあげることができる。
【００２０】
本発明の４（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤＮＡより４（Ｒ）ＫＡＬを宿主細胞中で発現させるために、モレキュラー・クローニング 第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント１〜３４等に記載された方法等を用いることができる。
即ち、本発明のＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造成し、それを宿主細胞に導入することにより、本発明の４（Ｒ）ＫＡＬを発現する形質転換体を得ることができる。
【００２１】
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００２２】
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のＤＮＡの発現ベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、pKK233-2（ファルマシア社）、pSE280（インビトロジェン社）、pGEMEX-1〔プロメガ(Promega)社〕、pQE-8（キアゲン(QIAGEN)社）、ｐＫＹＰ１０( 特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)〕、ｐＬＳＡ１〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、ｐＧＥＬ１〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescript （STRATAGENE社）、ｐＴｒｓ３０〔Escherichia coli JM109/pTrS30 （ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔Escherichia coli JM109/pTrS32（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔Escherichia coli IGHA2（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００）より調製〕、ｐＧＫＡ２〔Escherichia coli IGKA2（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７９８）より調製〕、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＧＥＸ（Pharmacia社）、ｐＥＴシステム（Novagen社）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＳＴＶ２９（宝酒造社製）、ｐＣＧ１、ｐＣＳ１１６（特開平６−２７７０８２）等を例示することができる 。
【００２３】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、PLプロモーター、PRプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrp ｘ２）、tacプロモーター、T7プロモーター、PletIプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００２４】
リボソーム結合配列としては、シャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミッドを用いることが好ましい。
４（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤＮＡは４（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤＮＡであればいずれも用いることができるが、該ＤＮＡの塩基配列を宿主微生物での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換して用いることにより高発現化が達成できる。大腸菌を宿主として、発現に最適なコドンとなるように塩基を置換した４（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤＮＡの具体例として、配列番号３で示される塩基配列等をあげることができる。
【００２５】
本発明の組換えベクターにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
本発明の４（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤＮＡを含むプラスミッドとしては、例えばｐＫＳＲ２２２、ｐＫＳＲ３０３、ｐＫＳＲ３２１、ｐＫＳＲ８０３等があげられる。ｐＫＳＲ３０３を含む大腸菌であるEscherichia coli NHK46/pKSR303は、平成９年８月１２日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）にＦＥＲＭ ＢＰ−６０５１として寄託されている。
【００２６】
宿主細胞としては、エシェリヒア属、クレブシエラ属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-Blue 、Escherichia coli XL2-Blue 、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485 、Escherichia coli JM109 、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49 、Escherichia coli W3110 、Escherichia coli NY49、Escherichia coli ATCC33625、Escherichia coli ATCC11303、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefacines、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacterium flavum ATCC14067、Brevibacterium lactofermentum ATCC13869、Corynebacterium glutamicum ATCC13032 、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Klebsiela oxytoca ATCC8724、Serratia marsecens ATCC13880等をあげることができる。
【００２７】
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭63-2483942）等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ATCC37115）、ＹＥｐ２４（ATCC37051）、ＹＣｐ５０（ATCC37419）等を用いることができる。
【００２８】
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター 、MFα1 プロモーター、CUP 1プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
【００２９】
宿主細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、シュワニオミセス・アルビウス（Schwanniomyces alluvius）等をあげることができる。
【００３０】
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods. Enzymol., 194, 182 (1990)〕、スフェロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929 (1978)〕、酢酸リチウム法〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol.）、153, 163 (1983)〕等をあげることができる。
【００３１】
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐＡＧＥ１０７〔特開平3-22979 ；サイトテクノロジー（Cytotechnology）、3, 133, (1990)〕、ｐＡＳ３−３（特開平2-227075）、ｐＣＤＭ８〔ネイチャー（Nature）、329, 840, (1987)〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェ ン社製）ｐＡＧＥ１０３〔J. Biochem., 101, 1307(1987)〕、ｐＡＧＥ２１０等が用いられる。
【００３２】
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【００３３】
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、リン 酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕等をあげることができる。
【００３４】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばバキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル（Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント1-３４、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、４（Ｒ）ＫＡＬを発現することができる。
【００３５】
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、４（Ｒ）ＫＡＬを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３ 、ｐＢｌｕｅＢａｃIII （ともにインビトロジェン社製）等をあげることができる。
【００３６】
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) などを用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・ エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（W.H.Freeman and Company）、ニューヨーク（New York）、(1992)〕、Trichoplusia ni の卵巣細胞であるＨｉｇｈ ５（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
【００３７】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング 第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等をおこなうことができる。
【００３８】
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の４（Ｒ）ＫＡＬを生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明の４（Ｒ）ＫＡＬを製造することができる。本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００３９】
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
【００４０】
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１０〜９６時間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
【００４１】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００４２】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、EagleのＭＥＭ培地またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常５％ＣＯ2存在下等の条件下で行う。培養温度は３５〜３７℃がよく、培養時間は、通常３〜７日間である。
【００４３】
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地〔ファーミンジェン（Pharmingen）社製〕、Sf-900 II SFM培地（ギブコＢＲＬ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００ 、ＥｘＣｅｌｌ４０５ 〔いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ（JRH Biosciences）社製〕等を用いることができる。
【００４４】
培養温度は２５〜３０℃がよく、培養時間は、通常１〜４日間である。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記形質転換体の培養液から、上記方法により発現させた４（Ｒ）ＫＡＬを単離精製するためには、通常の酵素の単離、精製法を用いればよい。
【００４５】
例えば、本発明の４（Ｒ）ＫＡＬが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、DIAION HPA-75（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００４６】
また、該４（Ｒ）ＫＡＬが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該４（Ｒ）ＫＡＬを回収後、該４（Ｒ）ＫＡＬの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。該可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリペプチド変性剤の濃度が４（Ｒ）ＫＡＬが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該４（Ｒ）ＫＡＬを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
【００４７】
本発明の４（Ｒ）ＫＡＬが細胞外に分泌された場合には、培養上清に該４（Ｒ）ＫＡＬを回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【００４８】
また、上記方法により発現させた４（Ｒ）ＫＡＬを、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、桑和貿易（米国Advanced ChemTech社製）、パーキンエルマー ジャパン（米国Perkin-Elmer社製）、ファルマシア バイオテク（スウェーデンPharmaciaBiotech社製）、アロカ（米国Protein TechnologyInstrument社製）、クラボウ（米国Synthecell-Vega社製）、日本パーセプティブ・リミテッド（米国PerSeptive社製），島津製作所等のペプチド合成機を利用し合成することもできる。
【００４９】
上記で取得した形質転換体由来であり、かつグリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｒ）ＫＨＧを生成する活性を有する生体触媒Ｉ、ピルビン酸およびグリオキシル酸を水性媒体中に存在させることにより、水性媒体中に４（Ｒ）ＫＨＧを生成させ、生成した４（Ｒ）ＫＨＧを該水性媒体中より採取することにより４（Ｒ）ＫＨＧを製造することができる。
【００５０】
生体触媒Ｉとしては、上記で取得した形質転換体の培養物、細胞、細胞処理物のいずれも用いることができる。
細胞処理物としては、細胞の乾燥物、凍結乾燥物、界面活性剤または有機溶剤処理物、酵素処理物、超音波処理物、機械的摩砕処理物、細胞の蛋白質分画〔４（Ｒ）ＫＡＬの粗酵素または精製酵素〕、細胞および細胞処理物の固定化物等をあげることができる。
【００５１】
生体触媒Ｉ濃度は、湿菌体重量換算で０．１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは５〜１００ｇ／ｌである。
【００５２】
水性媒体としては、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、ならびに、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミド等のアミド類などの有機溶媒を含有した水性溶液があげられる。また必要に応じてトリトンＸ−１００（ナカライテスク社製）やノニオンＨＳ２０４（日本油脂社製）などの界面活性剤あるいはトルエンやキシレンのような有機溶媒を０．１〜２０ｇ／ｌ程度添加してもよい。
【００５３】
ピルビン酸およびグリオキシル酸の濃度は、１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは２０〜２００ｇ／ｌである。生体触媒Ｉによりピルビン酸に転換され得る化合物をピルビン酸の代替として用いることもできる。該化合物として、グルコース、フラクトース、シュークロース、マルトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などの糖類や、酢酸、乳酸、グルコン酸などの有機酸等をあげることができる。
【００５４】
水性媒体に、生体触媒Ｉ、ピルビン酸およびグリオキシル酸を上記濃度添加し、温度１５〜８０℃、好ましくは２５〜６０℃、ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜９の条件下で、０．５〜９６時間反応させ、４（Ｒ）ＫＨＧを製造することができる。
生体触媒Ｉとして用いられる細胞の培養初発または途中に、ピルビン酸およびグリオキシル酸を上記濃度添加し、４（Ｒ）ＫＨＧを製造することもできる。その際、ピルビン酸または該組換え株によってピルビン酸に転換される化合物は、予め培養基質として添加しておいてもよいし、グリオキシル酸とともに添加してもよい。
【００５５】
また、生体触媒Ｉが、上記記載の形質転換体であって、更に、１）グリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有しない、２）リポ酸に対する栄養要求性を有する、および３）リンゴ酸シンターゼ活性の低いあるいは有しないという性質の中から選ばれる１つ以上の性質を有する形質転換体由来のものが、４（Ｒ）ＫＨＧの製造には好ましい。このような形質転換体の微生物としては、例えば、エシェリヒア コリＫ−１２系統の亜株ＮＨＫ４０〔リポ酸要求性（ｌｉｐ）、４ＫＡＬ欠損（ｅｄａ）〕、コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２株等をあげることができる。エシェリヒア コリＮＨＫ４０株は、ブダペスト条約に基づいて平成９年４月１６日付で工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５９１９として寄託されている。
【００５６】
上記製造法により製造された４（Ｒ）ＫＨＧは、通常用いられる有機酸の精製法を用いて単離することができる。該精製法として、例えば、遠心分離により固形物を除いた反応上清から、イオン交換樹脂や膜処理法などの操作を組み合わせて、４（Ｒ）ＫＨＧを単離することができる。
上記記載の形質転換体、アミノ基供与体、糖質およびグリオキシル酸を水性媒体中に存在させることにより、水性媒体中に４（Ｒ）ＨＧを生成させ、生成した４（Ｒ）ＨＧを該水性媒体中より採取することにより４（Ｒ）ＨＧを製造することができる。
【００５７】
形質転換体の濃度は、湿菌体重量換算で０．１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは５〜１００ｇ／ｌである。
水性媒体としては、上記４（Ｒ）ＫＨＧの製造法において記載の水性媒体を用いることができる。
アミノ基供与体としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素などの無機アンモニウム塩またはグルタミン酸をはじめとする各種アミノ酸などをあげることができる。アミノ基供与体の濃度は０．１〜１００ｇ／ｌ、好ましくは１〜５０ｇ／ｌである。
【００５８】
糖質としては、上記形質転換体が資化しうるものであればよく、グルコース、フラクトース、シュークロース、マルトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などを用いることができる。
糖質およびグリオキシル酸の濃度は、１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは１０〜２００ｇ／ｌである。
【００５９】
水性媒体に、上記形質転換体、糖質およびグリオキシル酸を上記濃度添加し、温度１５〜８０℃、好ましくは２５〜６０℃、ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜９の条件下で、０．５〜９６時間反応させ、４（Ｒ）ＨＧを製造することができる。
【００６０】
上記形質転換体の培養初発または途中に、グリオキシル酸を上記濃度添加し、４（Ｒ）ＨＧを製造することもできる。
また、上記記載の形質転換体が、更に、１）グリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有しない、２）リポ酸に対する栄養要求性を有する、３）リンゴ酸シンターゼ活性の低いあるいは有しない、および４）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有しないという性質の中から選ばれる１つ以上の性質を有する形質転換体由来のものが、４（Ｒ）ＨＧの製造には好ましい。このような形質転換体の微生物としては、例えば、エシェリヒア コリＫ−１２系統の亜株ＮＨＫ４０〔リポ酸要求性（ｌｉｐ）、４ＫＡＬ欠損（ｅｄａ）〕、コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２株、エシェリヒア コリＫ−１２系統の亜株ＮＨＫ４６株〔ｌｉｐ，ｅｄａ，リンゴ酸シンターゼ欠損（ｇｌｃ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ欠損（ｐｐｃ）〕等をあげることができる。エシェリヒア コリＮＨＫ４６株は、ブダペスト条約に基づいて平成９年４月１６日付で工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５９２０として寄託されている。
【００６１】
上記記載の形質転換体、アミノ基供与体、糖質およびグリオキシル酸を水性媒体中に存在させることにより、水性媒体中に４（Ｒ）ＨＹＰを生成させ、生成した４（Ｒ）ＨＹＰを該水性媒体中より採取することにより４（Ｒ）ＨＹＰを製造することができる。
形質転換体の濃度は、湿菌体重量換算で０．１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは５〜１００ｇ／ｌである。
【００６２】
水性媒体としては、上記４（Ｒ）ＫＨＧの製造法において記載の水性媒体を用いることができる。
アミノ基供与体としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素などの無機アンモニウム塩またはグルタミン酸をはじめとする各種アミノ酸などをあげることができる。アミノ基供与体の濃度は０．１〜１００ｇ／ｌ、好ましくは１〜５０ｇ／ｌである。
【００６３】
糖質としては、上記形質転換体が資化しうるものであればよく、グルコース、フラクトース、シュークロース、マルトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などを用いることができる。
糖質およびグリオキシル酸の濃度は、１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは１０〜２００ｇ／ｌである。
【００６４】
水性媒体に、上記形質転換体、糖質およびグリオキシル酸を上記濃度添加し、温度１５〜８０℃、好ましくは２５〜６０℃、ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜９の条件下で、０．５〜９６時間反応させ、４（Ｒ）ＨＹＰを製造することができる。
また、上記形質転換体の培養初発または途中に、グリオキシル酸を上記濃度添加し、４（Ｒ）ＨＹＰを製造することもできる。
【００６５】
４（Ｒ）ＨＹＰの製造において、上記記載の形質転換体が、更に、１）グリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有しない、２）リポ酸に対する栄養要求性を有する、３）リンゴ酸シンターゼ活性の低いあるいは有しない、および４）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有しない５）アゼチジン−２−カルボン酸や３，４−デヒドロプロリン、チオプロリン等のプロリンアナログに耐性を有するという性質の中から選ばれる１つ以上の性質を有する形質転換体であることが好ましい。このような形質転換体の微生物として、例えば、エシェリヒア コリＫ−１２系統の亜株ＮＨＫ４０〔リポ酸要求性（ｌｉｐ）、４ＫＡＬ欠損（ｅｄａ）〕、コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２株、エシェリヒア コリＫ−１２系統の亜株ＮＨＫ４６株〔ｌｉｐ，ｅｄａ，リンゴ酸シンターゼ欠損（ｇｌｃ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ欠損（ｐｐｃ）〕、ＮＨＫ４７株〔ｌｉｐ，ｅｄａ，ｇｌｃ，ｐｐｃ，アゼチジン−２−カルボン酸耐性〕等をあげることができる。エシェリヒア コリＮＨＫ４７株は、ブダペスト条約に基づいて平成９年４月１６日付で工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５９２１として寄託されている。
【００６６】
上記のような各種欠損株や耐性株は、親株に通常の変異操作、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異剤処理、ＵＶ照射、γ線照射等を施した後、適当な寒天平板培地に塗布し、生育した変異株を取得し、目的とする酵素活性が親株に比べて欠損あるいは低下した菌株や親株よりアナログに耐性な菌株を選択することによって得ることができる。またエシェリヒア コリＫ−１２系統の菌株においては、目的とする欠損または耐性変異を有する別の菌株から所望の菌株にＰ１ファージなどを用いて欠損変異を移すこと（形質導入）によっても各種欠損変異株や耐性変異株を得ることができる。
【００６７】
４（Ｒ）ＨＹＰの製造法としては更に、アミノ基供与体および４（Ｒ）ＫＨＧから４（Ｒ）ＨＹＰに変換する活性を有する生体触媒II、アミノ基供与体および４（Ｒ）ＫＨＧを水性媒体中に存在させることにより、水性媒体中に４（Ｒ）ＨＹＰを生成させ、生成した４（Ｒ）ＨＹＰを該水性媒体中より採取することにより４（Ｒ）ＨＹＰを製造する方法をあげることができる。
【００６８】
生体触媒IIとしては、アミノ基供与体および４（Ｒ）ＫＨＧから４（Ｒ）ＨＹＰに変換する活性を有する微生物の培養物、菌体、菌体処理物のいずれも用いることができる。
【００６９】
アミノ基供与体および４（Ｒ）ＫＨＧから４（Ｒ）ＨＹＰに変換する活性を有する微生物として、例えばエシェリヒア(Escherichia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属等に属する微生物があげられる。具体的には、大腸菌由来でプロリンによるフィードバック阻害が緩和された変異型ＰｒｏＢＡ遺伝子を含むプラスミドｐＫＳＲ１９を導入したエシェリヒア コリ(Escherichia coli)Ｋ−１２株系統のＡＴＣＣ３３６２５株（ＡＴＣＣ３３６２５／ｐＫＳＲ１９）、コリネバクテリウム アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum)ＦＥＲＭ Ｐ−４９６２株等をあげることができる。より好ましくは、グルタミン酸の要求性を有する変異株をあげることができる。そのような変異株は、親株に通常の変異操作、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異剤処理、ＵＶ照射、γ線照射等を施した後、適当な寒天平板培地に塗布し、生育した変異株を取得し、生育にグルタミン酸を要求する菌株を選択することによって得ることができる。またエシェリヒア コリＫ−１２系統の菌株においては、形質導入によっても欠損変異株を得ることができる。このような微生物としてエシェリヒア コリ(Escherichia coli)Ｋ−１２株系統のＡＴＣＣ３３６２５にイソクエン酸デヒドロゲナーゼの欠損変異（ｉｃｄ）を付与したＮＨＫ３株にｐＫＳＲ１９を導入したＮＨＫ３／ｐＫＳＲ１９株やｐＫＳＲ１９に大腸菌由来のＰｒｏＣ遺伝子を連結したｐＫＳＲ２１を導入したＮＨＫ３／ｐＫＳＲ２１株、さらにグルタミン酸デヒドロゲナーゼとグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含むプラスミドｐＫＳＲ５０をも導入したＮＨＫ３／ｐＫＳＲ２１＋ｐＫＳＲ５０株があげられる。またグルタミン酸の要求性に加え、アゼチジン−２−カルボン酸、３，４−デヒドロプロリンやチオプロリンなどプロリンアナログに耐性となった宿主微生物を用いると一層有利である。
【００７０】
そのような微生物は、上記のように親株に変異操作や形質導入を施すことによって得られるほか、プロリンアナログ耐性遺伝子を含むプラスミドを導入することによっても得ることができる。具体的にはエシェリヒア コリＮＨＫ２３／ｐＫＳＲ２１＋ｐＫＳＲ５０株があげられる。なおエシェリヒア コリＮＨＫ３／ｐＫＳＲ２１＋ｐＫＳＲ５０株およびＮＨＫ２３／ｐＫＳＲ２１＋ｐＫＳＲ５０株は、平成９年８月１２日付で、エシェリヒア コリＮＨＫ３／ｐＫＳＲ１９株は平成９年８月２６日付で、各々ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５２、ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５３、ＦＥＲＭ ＢＰ−６０７６として、ブダペスト条約に基づいき工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００７１】
菌体処理物としては、菌体の乾燥物、凍結乾燥物、界面活性剤または有機溶剤処理物、酵素処理物、超音波処理物、機械的摩砕処理物、菌体の蛋白質分画〔アミノ基供与体および４（Ｒ）ＫＨＧから４（Ｒ）ＨＹＰに変換する活性を有する粗酵素または精製酵素〕、菌体および菌体処理物の固定化物等をあげることができる。
【００７２】
生体触媒IIの濃度は、微生物菌体換算で０．１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは５〜１００ｇ／ｌである。
４（Ｒ）ＫＨＧは、単離精製された４（Ｒ）ＫＨＧのほか、４（Ｓ）ＫＨＧおよび４（Ｓ）ＨＧを含まない粗精製標品、あるいは上記に記載した微生物に由来する生体触媒反応を利用して生成された４（Ｒ）ＫＨＧを含有する反応液等を利用することができる。４（Ｒ）ＫＨＧの濃度は１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは２０〜２００ｇ／ｌである。
【００７３】
水性媒体としては、上記４（Ｒ）ＫＨＧの製造法において記載の水性媒体を用いることができる。
水性媒体に、生体触媒II、アミノ基供与体および４（Ｒ）ＫＨＧを上記濃度添加し、温度１５〜８０℃、好ましくは２５〜６０℃、ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜９の条件下で、０．５〜９６時間反応させ、４（Ｒ）ＨＹＰを製造することができる。
【００７４】
生体触媒IIとして用いられる微生物の培養初発または途中に４（Ｒ）ＫＨＧを上記濃度添加し４（Ｒ）ＨＹＰを製造することもできる。
上記の如くして生成した４（Ｒ）ＨＧあるいは４（Ｒ）ＨＹＰは、通常用いられるアミノ酸の精製法を用いて単離することができる。例えば遠心分離により固形物を除いた反応上清から、イオン交換樹脂や膜処理法などの操作を組み合わせて、４（Ｒ）ＨＧあるいは４（Ｒ）ＨＹＰを単離することができる。
以下に本発明の実施例を示す。
【００７５】
【実施例】
実施例１ ４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子の取得
バチルス エスピー(Bacillus sp.)ＯＣ１８７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４６４６）を１白金耳、１０ｍｌのＬＢ液体培地〔バクトトリプトン（ディフコ社製） １０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製） ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを水１リットルに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕に植菌し、３０℃で２０時間培養した。得られた培養菌体から公知の方法〔Biochim. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)〕に従い染色体ＤＮＡを単離した。精製したバチルス エスピーＯＣ１８７株の染色体ＤＮＡ ５μｇとｐＳＴＶ２９プラスミドＤＮＡ（宝酒造社製）１μｇをＳａｌ Ｉ用緩衝液（宝酒造社製Ｋバッファー）１００μｌに溶かし、２０単位の制限酵素Ｓａｌ Ｉ（宝酒造社製）を加え、３７℃で３時間消化反応を行った後、６５℃で１５分間加熱することによって反応を停止させた。該反応停止液に３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）１０μｌを添加後、−２０℃に冷却したエタノール３００μｌを加え、−８０℃で３０分間静置した。静置後、該エタノール混合物中に形成された沈殿を遠心分離によって取得した（以下、該操作をエタノール沈殿法と略す）。該沈殿を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション バッファーＡ液（宝酒造社製）４０μｌ、ライゲーション バッファーＢ液（宝酒造社製）５μｌを加え、混合した後、１６℃で１６時間ＤＮＡ連結反応を行い組換え体ＤＮＡを得た（以下、該操作をライゲーション反応と略す)。該組換え体ＤＮＡを用い、エシェリヒア コリ(Escherichia coli)Ｋ−１２株系統のＡＴＣＣ３３６２５株をマニアチスらの方法〔モレキュラー・クローニング 第２版〕に従って形質転換し、クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地（ＬＢ培地に寒天２％を加えて固めたもの）に塗布し、３７℃で２４時間インキュベートした。生じたクロラムフェニコールに耐性の形質転換コロニー約２０００個についてピルビン酸とグリオキシル酸から４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を合成する活性を測定した。
【００７６】
即ち、各形質転換株をクロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地３ｍｌ中で３０℃にて２０時間培養し、該培養液に３０μｌのキシレンと２Ｍピルビン酸ナトリウム溶液１５０μｌ、２Ｍグリオキシル酸溶液（ＮａＯＨにてｐＨ６．４に調製）１５０μｌを添加し、３７℃で３０分間振盪した。
該振盪液の遠心上清を住友化学社製のSUMICHIRAL OA-5000（内径４．６ｍｍ、長さ５ｃｍ)を用い、１ｍＭ 酢酸銅（II）、０．１ｍＭ 酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ４．５）８５：イソプロパノール１５の混合液を移動層とし、ＵＶ２１０ｎｍの吸光度を測定するＨＰＬＣ法で分析し、４（Ｒ）および４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタルの生成量を測定した。
【００７７】
該測定により、４（Ｒ）ＫＨＧ合成活性を有する形質転換株を選択し、該形質転換株より、４（Ｒ）ＫＨＧ合成活性を担う約３．５ｋｂのＳａｌ Ｉ処理ＤＮＡ断片を有するプラスミドｐＫＳＲ２０１を取得した。
該Ｓａｌ Ｉ処理ＤＮＡ断片の制限酵素地図を図１に示す。さらに各種制限酵素を用いて、このＤＮＡ断片上の４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子領域を含むＰｓｔ Ｉ−Ｓａｌ Ｉ約１．８ｋｂをｐＳＴＶ２９のＰｓｔ Ｉ−Ｓａｌ Ｉサイト間に挿入したｐＫＳＲ２２２を作製した。
【００７８】
ｐＫＳＲ２２２に含まれる４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子のＤＮＡ配列をジデオキシ法〔Proc. Natl. Sci. USA, 74, 5463(1977)〕により決定した。４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子の構造遺伝子領域を配列番号２に、ＤＮＡ配列より推定される４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子のアミノ酸配列を配列番号１に示した。
【００７９】
実施例２ 発現プラスミドの作製
４（Ｒ）ＫＡＬ活性を高発現させるために、エシェリヒア コリのトリプトファン生合成酵素遺伝子由来のプロモーター（Ｔｒｐプロモーター）を４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子上流に連結したプラスミドの造成を行った。また同時に、４（Ｒ）ＫＡＬのＮ末端５アミノ酸に対応するＤＮＡ塩基配列はバチルス エスピーＯＣ１８７株由来の配列から、エシェリヒア コリの至適コドンに相応する配列へと改変した。
【００８０】
４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子のＮ末端に対応し、２残基目のヒスチジン残基、４残基目のロイシン残基および５残基目のセリン残基に相応するコドンをエシェリヒアコリの至適コドンに相応する文字に改変した配列番号４に示した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子のＣ末端に対応する配列番号５に示した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを常法に従って合成した。これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＰＣＲ法〔R.F.Saiki etal., Science, 230, 1350 (1985)〕によって４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子を増幅させた。
【００８１】
即ち、ｐＫＳＲ２２２を鋳型とし、Ｇｅｎｅ ＡｍｐＴＭ Ｋｉｔ (パーキンエルマージャパン社製)および、同社のＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用い、９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる反応工程を１サイクルとして３０サイクル行った後、７２℃で５分間反応させた。
該反応により増幅された約６３０ｂｐｓのＤＮＡ断片をクロロホルム抽出した後、エタノール沈殿法により該ＤＮＡ断片を精製した。
【００８２】
該ＤＮＡ断片２μｇとＴｒｐプロモーターを有する参考例１記載のベクタープラスミドｐＴｒＳ３３１μｇを各々Ｃｌａ ＩおよびＢａｍ ＨＩで２重消化後、各々のＣｌａ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ消化ＤＮＡ断片をアガロース電気泳動によって精製した。
これら精製された両断片を混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
【００８３】
該組換え体ＤＮＡを用い、エシェリヒア コリＡＴＣＣ３３６２５株をマニアチスらの方法〔モレキュラー・クローニング 第２版〕に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で２４時間培養した。
【００８４】
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について実施例１と同様の方法により（ただし培養時にはクロラムフェニコールに替わりにアンピシリン１００μｇ／ｍｌを添加した）４（Ｒ）ＫＡＬ合成活性を測定した。
いずれの形質転換体も高い４（Ｒ）ＫＡＬ合成活性を有していた。
これらの形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地３ｍｌ中で３７℃で１６時間振盪培養し、得られた培養液を遠心分離することにより取得した菌体より公知の方法〔モレキュラー・クローニング 第２版〕でプラスミドを単離した。
【００８５】
これら単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べた結果、いずれも同じ構造のプラスミドを有していることが確認された。このようにして作製されたプラスミドをｐＫＳＲ３０３と命名した。
ｐＫＳＲ３０３の制限酵素切断地図を図２に示した。
次に、コリネバクテリウム属細菌中に４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子を導入するために、コリネバクテリウム属細菌中で自律増殖できるベクタープラスミドｐＣＳ１１６〔該プラスミドを含有するEscherichia coli KY9002/pCS116（ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５５）より取得〕とｐＫＳＲ３０３との連結を行った。
【００８６】
ｐＣＳ１１６およびｐＫＳＲ３０３各々１μｇを４５μｌのＨバッファー（宝酒造社製）に溶解し、１０単位のＢｇｌ IIを加え３７℃で３時間消化反応を行った。
該反応により得られたＤＮＡをフェノール抽出した後、エタノール沈殿法により該ＤＮＡ断片を取得した。
【００８７】
該ＤＮＡを５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行い、組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、エシェリヒア コリＡＴＣＣ３３６２５株をマニアチスらの方法〔モレキュラー・クローニング 第２版〕に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌとスペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で２４時間培養した。
【００８８】
生育してきたアンピシリンおよびスペクチノマイシンに耐性なコロニーから上記同様にプラスミドを単離し、該プラスミドを用い公知の方法（特開平６−２７７０８２）にしたがってコリネバクテリウム グルタミクム(Corynebacterium glutamicum) ＡＴＣＣ１３０３２株を形質転換した。
【００８９】
該形質転換体をスペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＢＹ寒天培地〔ブイヨン（極東社製）２０ｇ、酵母エキス（極東社製）５ｇを水１リットルに含みｐＨ７．２に調整し、寒天２％を加えて固めた培地〕に塗布し、３０℃で４８時間培養した。
生育してきたスペクチノマイシンに耐性なコロニー数個から公知の方法（特開昭５７−１８３７９９）にしたがってプラスミドを単離した。
【００９０】
これら単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べた結果、いずれも同じ構造のプラスミドを有していることが確認された。このようにして作製されたプラスミドをｐＫＳＲ８０３と命名した。
ｐＫＳＲ８０３の制限酵素切断地図を図３に示した。
【００９１】
実施例３ 各種菌株による４（Ｒ）ＫＨＧの生産
エシェリヒア コリＢ株系統のＡＴＣＣ１１３０３株、クレブシエラ オキシトカ(Klebsiela oxytoca) ＡＴＣＣ８７２４株、セラチア マルセセンス(Serratia marsecens) ＡＴＣＣ１３８８０株を各々ＬＢ培地３ｍｌに１白金耳づつ植菌し、２８℃で１２時間培養した。
【００９２】
培養後、得られた培養液を遠心分離することによりにより各々の菌体を取得した。
これら菌体を各々、氷冷した５０ｍＭ ＣａＣｌ2溶液１ｍｌに懸濁し、これら懸濁液を遠心分離することによりにより各々の菌体を再度取得した。
これら菌体を各々、０．２ｍｌの氷冷した５０ｍＭ ＣａＣｌ2、５０％グリセロール溶液に懸濁後、氷中に１０分間放置した。
【００９３】
これら菌懸濁液に実施例２で作製したｐＫＳＲ３０３を０．２μｇ添加し氷中に２０分間放置した後、４２℃で３０秒間加熱し、各々に０．８ｍｌのＬＢ培地を加え、３０℃で１時間振盪培養した。
これら培養液を４００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で２４時間培養した。
【００９４】
生育したきたコロニーを選択することにより、ｐＫＳＲ３０３の導入されたエシェリヒア コリＢ株系統のＡＴＣＣ１１３０３株、クレブシエラ オキシトカＡＴＣＣ８７２４株およびセラチア マルセセンスＡＴＣＣ１３８８０株を取得した。
エシェリヒア コリＡＴＣＣ３３６２５株、ＡＴＣＣ１１３０３株、クレブシエラ オキシトカＡＴＣＣ８７２４株、セラチア マルセセンスＡＴＣＣ１３８８０株の各株、これらの株にｐＫＳＲ３０３を導入した株、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２株およびｐＫＳＲ８０３を導入したＡＴＣＣ１３０３２株の各株を３ｍｌのＬＢ培地で１６時間振盪培養した。
【００９５】
これら培養液にキシレン３０μｌ、２Ｍピルビン酸ナトリウム溶液１５０μｌ、２Ｍグリオキシル酸溶液（ＮａＯＨにてｐＨ６．４に調製）１５０μｌを添加し、３７℃で３０分間振盪した。
これら反応液の遠心上清を、実施例１と同様の方法により４（Ｒ）および４（Ｓ）−ヒドロキシ-2-ケトグルタル生成量を測定した。
【００９６】
結果を第１表に示した。
【００９７】
【表１】
【００９８】
実施例４ 大腸菌変異株による４（Ｒ）ＫＨＧの生産
エシェリヒア コリＫ−１２系統の菌株でｐｐｃ、ｌｉｐ、ｅｄａの３重欠損変異を持つＮＨＫ４３株からリンゴ酸シンターゼ活性低下株を誘導した。
即ち、グルタミン酸２ｇ／ｌ、リポ酸１００μｇ／ｌを添加したＬＢ培地中で対数増殖期まで培養したＮＨＫ４３株の菌体を遠心分離によって集め、０．０５Ｍトリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄後、菌体濃度が１０9細胞／ｍｌになるように同緩衝液に懸濁した。
【００９９】
該懸濁液にＮＴＧを終濃度が６００ｍｇ／ｌになるように加え、室温で２０分間保持して変異処理を行った。
該変異処理菌体をグルコース０．５％、グルタミン酸０．０５ｇ／ｌ、リポ酸１００μｇ／ｌ、グリオキシル酸３０ｍＭを添加したＭ９最少寒天培地〔モレキュラー・クローニング 第２版〕に塗布した後、３７℃で２日間培養した。
【０１００】
生育してきた菌株のうち、小さいコロニーを形成する菌株をグルタミン酸２ｇ／ｌ、リポ酸１００μｇ／ｌを添加したＬＢ寒天培地上に接種し、培養した。
【０１０１】
該培養プレートに生育した菌株をグルコース０．５％、グルタミン酸０．５ｇ／ｌ、リポ酸１００μｇ／ｌを添加したＭ９最少寒天培地とグルコース０．５％、リポ酸１００μｇ／ｌ、グリオキシル酸３０ｍＭを添加したＭ９最少寒天培地とにレプリカし、前者培地上では生育するが後者培地上では生育できない株を選択した。
【０１０２】
該選択された菌株をＭＳ培地〔グルコース ３ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 １０ｇ、ＭｇＳＯ4 １ｇ、チアミン塩酸塩 １００μｇ、酵母エキス １ｇ、ペプトン １ｇ、リポ酸 ５０μｇ、ＣａＣＯ3 ２０ｇ、グルタミン酸 ２ｇを水１リットル中に含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕中、３７℃で振盪培養した。
【０１０３】
対数増殖期後期まで培養した段階で、遠心分離により集菌し、５０ｍＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．０）で該菌体を洗浄後、超音波破砕機で破砕した。該菌体破砕液を遠心分離（１５、０００ｒｐｍ、４５分間）し、得られた上清を細胞抽出液とした。
該細胞抽出液のリンゴ酸シンターゼ活性を、既報〔Methods in Enzymology 5, 633(1962)〕にしたがって測定し、活性の検出されなかったＮＨＫ４６株を目的の変異株として選択した。
【０１０４】
該ＮＨＫ４６株に、Ｐ１ファージによる形質導入法〔J.H.Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.(1972)〕を用いて、エシェリヒア コリＷ３１１０株由来のｌｉｐ+遺伝子を導入し、リポ酸非要求性のＮＨＫ４８株を得た。
ＮＨＫ４３株、ＮＨＫ４６株およびＮＨＫ４８株にマニアチスらの方法〔モレキュラー・クローニング 第２版〕に従ってｐＫＳＲ２２２を導入し（ただし培養はリポ酸 １００μｇ／ｌ、グルタミン酸 ２ｇ／ｌを添加して行った）、クロラムフェニコール耐性を指標に形質転換体を得た。
【０１０５】
また同様にしてアンピシリン耐性を指標にＮＨＫ４６株にｐＫＳＲ３０３を導入し、エシェリヒア コリＮＨＫ４６／ｐＫＳＲ３０３株を取得した。
各形質転換株をグルコース １％、炭酸カルシウム ２％、リポ酸 １００μｇ／ｌ、グルタミン酸 ２ｇ／ｌを添加したＬＢ培地に植菌し、２８℃で１６時間振盪培養した。
【０１０６】
これら培養液各々０．５ｍｌずつを滅菌した５ｍｌのＴ培地〔グルコース ５０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 １０ｇ、ＭｇＳＯ4 １ｇ、チアミン塩酸塩 １０μｇ、酵母エキス ０．２ｇ、ＫＣｌ ３ｇ、リポ酸 ５０μｇ、トリプトファン ２５０ｍｇ、ＣａＣＯ3 ２０ｇ、グルタミン酸 ２ｇを水１リットル中に含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕に添加し、３０℃で２４時間振盪培養した後、２Ｍグリオキシル酸溶液（ＮａＯＨでｐＨ６．４に調整）０．２５ｍｌを添加し３７℃でさらに２４時間振盪培養した。
【０１０７】
これら培養液を遠心分離して得た培養上清を実施例１と同様の方法により４（Ｒ）ＫＨＧおよび４（Ｓ）ＫＨＧの生成量を測定した。
結果を第２表に示す。
４（Ｒ）ＫＨＧ生成量の比較から、リポ酸要求性変異とリンゴ酸シンターゼ活性低下変異は４（Ｒ）ＫＨＧ生産に寄与することが明白となった。
【０１０８】
【表２】
【０１０９】
実施例５ ジャーファーメンターでの４（Ｒ）ＫＨＧ生産
エシェリヒア コリＫ−１２系統の菌株でｌｉｐ、ｅｄａの２重欠損変異を持つＮＨＫ４０株に実施例４と同様にしてｐＫＳＲ２２２を導入し、形質転換体を取得した。
【０１１０】
該形質転換体をグルコース １％、炭酸カルシウム ２％、リポ酸 １００μｇ／ｌを添加したＬＢ培地に植菌し、２８℃で１３時間振盪培養した。
該培養液１０ｍｌを、同じ組成の培地を２００ｍｌ入れ滅菌した１Ｌ容三角フラスコに添加し、２８℃で１３時間振盪培養した。
該培養液全量を、Ｊ１培地〔１リットルあたり、ラクトース ３０ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 １０ｇ、ＫＣｌ ３ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ２ｇ、ＭｇＳＯ4 １ｇ、酵母エキス ０．５ｇ、トリプトファン ２５０ｍｇ、ＣａＣｌ2 １５ｍｇ、ＦｅＳＯ4・７ａｑ １０ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４-６ａｑ １０ｍｇ、ＮｉＣｌ2 １．５ｍｇ、モリブデン酸アンモン １．５ｍｇ、ＣｏＣｌ2 １．５ｍｇ、チアミン塩酸塩 １００μｇ、リポ酸 ７５μｇ、を含有し、ｐＨ６．８に調整した培地〕を１８００ ｍｌ入れ滅菌した５ｌ容ジャーファーメンターに添加し、アンモニア水でｐＨを６．８に保ちつつ、通気２Ｌ／ｍｉｎ、撹拌５００ｒｐｍ、３３℃の条件で培養した。
【０１１１】
培養２０時間後に、該培養液にキシレン ２０ｍｌおよび２Ｍ グリオキシル酸溶液（ＮａＯＨでｐＨ６．４に調製）３７０ｍｌを添加し、３７℃でさらに１２時間培養した。
該培養上清中の４（Ｒ）ＫＨＧ含量を実施例１と同様の方法により測定した。
該培養上清には、２９９．５ｍＭの４（Ｒ）ＫＨＧが生成されていた。
【０１１２】
実施例６ ４（Ｒ）ＨＧ生産
Ｐ１ファージによる形質導入法〔J.H.Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.(1972)〕を用いて、エシェリヒア コリＷ３１１０株由来のｐｐｃ+遺伝子をＮＨＫ４３株に導入し、グルタミン酸非要求性のＮＨＫ４５株を取得した。
【０１１３】
該株に実施例４と同様の方法でｐＫＳＲ２２２を導入した。
ｐＫＳＲ２２２を保有するＮＨＫ４３株、ＮＨＫ４６株、ＮＨＫ４８株、ＮＨＫ４５株およびｐＫＳＲ３０３を保有するＮＨＫ４６株を実施例４と同様に培養し、これら培養上清中の４（Ｒ）ＨＧ、４（Ｓ）ＨＧの生成量をメルク社製Lichrospher(C18)カラムを用い、１０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１０ｍＭ 無水硫酸ナトリウム（ｐＨ２．２）、０．４％ ｎ−プロパノール、０．０３％ ＳＤＳを含む溶液を移動層とし、溶出液をo-フタルアルデヒドでポストカラムラベルした後、励起光３５０nm、蛍光448nmの蛍光を測定するＨＰＬＣによって分析し４（Ｒ）ＨＧ、４（Ｓ）ＨＧの生成量を測定した。
【０１１４】
結果を第３表に示した。
４（Ｒ）ＨＧ生成量の比較から、リポ酸要求性変異、リンゴ酸シンターゼ活性低下変異およびホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ欠損変異は４（Ｒ）ＨＧ生産に寄与することが明白となった。
またｐＫＳＲ８０３を保有するコリネバクテリウムグル タミクムＡＴＣＣ１３０３２株をＬＢ培地に植菌し、１６時間振盪培養した。
【０１１５】
該培養液０．５ｍｌを滅菌した５ｍｌのＴＣ培地〔グルコース １００ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２０ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．２５ｇ、尿素 ３ｇ、ビオチン １００μｇ、コーンスチープリカー ５ｇ、ＦｅＳＯ4 ・７ａｑ １０ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４-６ａｑ ５ｍｇ、ＣａＣＯ3 ２０ｇを水１リットル中に含有し、ｐＨ７．２に調整した培地〕に添加し、３０℃で２４時間振盪培養した後、該培養液に２Ｍグリオキシル酸溶液（ＮａＯＨにてｐＨ６．４に調製）０．２５ｍｌを添加し、３７℃でさらに２４時間振盪培養した。
【０１１６】
該培養上清中の４（Ｒ）ＨＧ、４（Ｓ）ＨＧの生成量を同様にＯＤＳカラムを用い測定した。
結果を第３表に示した。
【０１１７】
【表３】
【０１１８】
実施例７ ジャーファーメンターでの４（Ｒ）ＨＧ生産
ｐＫＳＲ３０３を保有するエシェリヒア コリＮＨＫ４６株をグルコース １％、炭酸カルシウム ２％、リポ酸 １００μｇ／ｌ、グルタミン酸 ２ｇ／ｌを添加したＬＢ培地に植菌し、２８℃で１３時間振盪培養した。
該培養液１０ｍｌを、同じ組成の培地２００ｍｌを入れ滅菌した１Ｌ容三角フラスコに添加し、２８℃で１３時間振盪培養した。
【０１１９】
該培養液全量を、Ｊ２培地〔１リットルあたり、グルコース ３０ｇ、グルタミン酸 １２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 １０ｇ、ＫＣｌ ３ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ２ｇ、ＭｇＳＯ4 １ｇ、酵母エキス ０．５ｇ、トリプトファン ２５０ｍｇ、イソロイシン ２０ｍｇ、メチオニン １０ｍｇ、ＣａＣｌ2 １５ｍｇ、ＦｅＳＯ4・７ａｑ １０ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４-６ａｑ １０ｍｇ、ＮｉＣｌ2 １．５ｍｇ、モリブデン酸アンモン １．５ｍｇ、ＣｏＣｌ2 １．５ｍｇ、チアミン塩酸塩 １００μｇ、リポ酸 ７５μｇを含有し、ｐＨ６．８に調整した培地〕１８００ｍｌを入れ滅菌した５Ｌ容ジャーファーメンターに添加し、アンモニア水でｐＨを６．８に保ちつつ、通気２Ｌ／ｍｉｎ、撹拌５００ｒｐｍ、３３℃の条件で培養した。 培養１４時間後、該培養液に２Ｍ グリオキシル酸溶液（ＮａＯＨでｐＨ６．４に調製）１９０ｍｌを添加し、３７℃でさらに適宜グルコースを添加しながら６０時間培養を継続した。
【０１２０】
該培養上清中の４（Ｒ）ＨＧ量を実施例６と同様にＨＰＬＣで分析した。
該培養上清中には、１１７．８ｍＭの４（Ｒ）ＨＧが生成していた。
【０１２１】
実施例８ プロリン合成酵素遺伝子と４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子の連結
大腸菌由来の脱感作されたＰｒｏＢＡ遺伝子を有するプラスミドｐＰＲＯ−１１〔該プラスミドを含有するEscherichia coli ATCC33625/pPRO11（ＦＥＲＭ ＢＰ−６０７７）より取得〕をＰｓｔＩで消化し、該消化物をアガロースゲル電気泳動後Prep-A-Gene DNA Purification System （ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてＰｒｏＢＡ遺伝子を含む約３ｋｂのＤＮＡ断片を単離精製した。
【０１２２】
該断片およびマルチプルクローニングサイトを持つプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア バイオテク社製）のＰｓｔＩ消化物を用い、ライゲーション反応を行い、得られた生成物を用いて大腸菌ＡＴＣＣ３３６２５株を形質転換した。
該形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で２４時間培養し、アンピシリン耐性の形質転換体を取得した。
【０１２３】
これら形質転換体を、グルコース ０．５％、チアミン塩酸塩 １００μｇ／ｌ、３，４−デヒドロプロリン １００ｍｇ／ｌを添加したＭ９最少寒天培地にレプリカした。
脱感作型ＰｒｏＢＡ遺伝子を有する株は１００ｍｇ／ｌの３，４−デヒドロプロリンに耐性を示すため（特開平３−２６６９９５）、上記培地で生育した株を脱感作型ＰｒｏＢＡ遺伝子を有する株として選択した。
【０１２４】
選択された株から常法にしたがってプラスミドを抽出し、制限酵素解析を行い、ｐＴｒｃ９９ＡのＰｓｔＩサイトにＰｒｏＢＡ遺伝子を含む約３ｋｂのＤＮＡ断片が、ｐＴｒｃ９９Ａのｔａｃプロモーターに対してＰｒｏＢＡの転写方向が順方向となるように挿入された構造を持つｐＫＳＲ１７を取得した。
ｔａｃプロモーターとＰｒｏＢＡの転写開始点を近づけるため、ｐＫＳＲ１７をＥｃｏＲＶで部分消化し、さらにＳｍａＩで消化した後、該消化物をライゲーション反応に供し、自己環化させた。
【０１２５】
該環化物を用いて大腸菌ＡＴＣＣ３３６２５株を形質転換した。
数個の形質転換体からプラスミドを抽出し、制限酵素解析を行った結果、いずれのプラスミドも同じ構造を有することが確認された。
該プラスミドをｐＫＳＲ１８と命名した。
【０１２６】
該ｐＫＳＲ１８をＥｃｏＲＩとＢｇｌIIで消化し、DNA blunting kit（宝酒造社製）を使って平滑末端化後、アガロースゲル電気泳動とPrep-A-Gene DNA Purification System（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてＰｒｏＢＡ遺伝子を含む約２．９ｋｂのＤＮＡ断片を単離精製した。
該ＤＮＡ断片と、高温誘導型プロモーターを有する発現ベクターｐＰＡＣ１〔該プラスミドを含有するEscherichia coli KY8415/pPAC1（ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５４）より取得〕をＣｌａＩで消化し、DNA blunting kitを使って平滑末端化したＤＮＡ断片をライゲーション反応によって連結した。
【０１２７】
該連結反応物を用いて、大腸菌ＡＴＣＣ３３６２５株を形質転換し、形質転換体からプラスミドを抽出し、ｐＰＡＣ１の高温誘導型プロモーター下流にＰｒｏＢＡの転写方向が順方向となるように挿入された構造を持つｐＫＳＲ１９を取得した。
一方、大腸菌のＰｒｏＣ遺伝子を含むＨｉｎｃII−ＸｈｏＩ処理ＤＮＡ断片をｐＴｒｓ３３のＳｍａＩ−ＳａｌＩ間に挿入したｐＥｐｒｏＣをＥｃｏＲＩとＢｇｌIIで消化しDNA blunting kitを使って平滑末端化後、アガロースゲル電気泳動とPrep-A-Gene DNA Purification System（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてＴｒｐプロモーターからＰｒｏＣ遺伝子を含む約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を単離精製した。
【０１２８】
該ＤＮＡ断片とＳｐｈＩで消化後平滑末端化したｐＫＳＲ１９をライゲーション反応によって連結した。
該連結反応物を用いて、大腸菌ＡＴＣＣ３３６２５株を形質転換した。
該形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で２４時間培養し、アンピシリン耐性の形質転換体を取得した。
【０１２９】
該アンピシリン耐性の形質転換体からプラスミドを抽出し、制限酵素解析を行い、脱感作型ＰｒｏＢＡ遺伝子とＰｒｏＣ遺伝子を有するプラスミドを見出し、ｐＫＳＲ２１と命名した。
該ｐＫＳＲ２１をＢａｍＨＩ消化、平滑末端化後さらにＰｓｔＩ消化し、アガロースゲル電気泳動とPrep-A-Gene DNA Purification System（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて約７ｋｂのＤＮＡ断片を単離精製した。
【０１３０】
該ＤＮＡ断片と、実施例２で作成したｐＫＳＲ３０３をＥｃｏＲＩ消化、平滑末端化後さらにＰｓｔＩ消化し、アガロースゲル電気泳動とPrep-A-Gene DNAPurification System（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて単離精製した約２．９ｋｂのＤＮＡ断片とをライゲーション反応によって連結した。
該連結反応物を用いて、大腸菌ＡＴＣＣ３３６２５株を形質転換した。
【０１３１】
該形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で２４時間培養し、アンピシリン耐性の形質転換体を取得した。
該アンピシリン耐性の形質転換体からプラスミドを抽出し、制限酵素解析を行い、脱感作型ＰｒｏＢＡ、ＰｒｏＣ遺伝子および４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子を有するプラスミドｐＫＳＲ３２１を得た。
【０１３２】
本実施例のプラスミドの構築手順を図４に示した。
【０１３３】
実施例９ グリオキシル酸添加培養による４（Ｒ）ＨＹＰ生産
実施例４で作成したＮＨＫ４６株からプロリンアナログのアゼチジン−２−カルボン酸に耐性となった変異株を誘導した。
即ち、実施例４と同様に培養したＮＨＫ４６株に実施例４と同様に変異処理を施し、グルコース ０．５％、グルタミン酸 ０．５ｇ／ｌ、リポ酸 １００μｇ／ｌ、アゼチジン−２−カルボン酸 １００ｍｇ／ｌを添加したＭ９最少寒天培地に塗布し、３７℃で２日間培養した。
【０１３４】
該培養において、大きなコロニーを形成して生育した、アゼチジン−２−カルボン酸耐性変異株ＮＨＫ４７株を取得した。
ＮＨＫ４６株およびＮＨＫ４７株に実施例８で作成したｐＫＳＲ３２１を導入し、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を得た。各形質転換株およびｐＫＳＲ３０３を保有するＮＨＫ４６株（実施例４で作成）を実施例４と同様に培養し、これら培養上清中の４（Ｒ）ＨＹＰ量をＨＰＬＣを用いて定量した。
【０１３５】
ＨＰＬＣによる定量は以下のように行なった。培養上清液８０μｌに１Ｍ 硼酸緩衝液（ｐＨ９．６）２０μｌ、６ｍｇ／ｍｌ ＮＢＤ−Ｃｌ（7-chloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole chloride)を含むメタノール溶液１００μｌを加え、遮光下６０℃、２０分間反応させる。この反応液に１Ｎ ＨＣｌを５０μｌ添加して反応を停止させた後、ミリポアフィルターで濾過し、その濾液を以下の条件で分析した。
【０１３６】
カラム：資生堂CAPCELLPAK-C18 (4.6 x 150mm)
移動相：Ａ；１０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ４）、
Ｂ；Ａとメタノールの等量混合液
流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ
温度：５０℃
移動相のグラジエントタイムプログラム
時間（min） B(Vol%)
０−１０ ０−８
１０−２０ ８−８０
２０−２１ ８０−１００
２１−２３ １００
２３−２４ ０
検出：Ｅｘ＝４７０ｎｍ， Ｅｍ＝５３０ｎｍの蛍光検出
結果を第４表に示した。
【０１３７】
【表４】
【０１３８】
実施例１０ ２段反応による４（Ｒ）ＨＹＰ生産
イソクエン酸デヒドロゲナーゼを欠損した大腸菌の変異株ＥＢ１０６株〔E.coli Genetic Stock Center(Yale University, New Haven, CT, USA)より分与〕からＰ１ファージによる形質導入法を用いて、大腸菌ＡＴＣＣ３３６２５株にイソクエン酸デヒドロゲナーゼ欠損変異（ｉｃｄ）を導入し、ＮＨＫ３株を作成した。本変異株はｉｃｄ変異のためグルタミン酸要求性を示す。
【０１３９】
実施例８で作成したｐＫＳＲ１９を用いて大腸菌ＡＴＣＣ３３６２５株を、実施例８で作成したｐＫＳＲ１９およびｐＫＳＲ２１を用いて大腸菌ＮＨＫ３株を、それぞれ形質転換し、アンピシリン耐性を指標に各形質転換体を取得した。
さらに大腸菌のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｄｈ）を含むＰｓｔＩとＣｌａＩサイトで挟まれた４．２ｋｂのＤＮＡ断片と大腸菌のグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｚｗｆ）を含むＢａｍＨＩとＳｐｈＩサイトで挟まれた約３ｋｂのＤＮＡ断片を持ち、クロラムフェニコール耐性遺伝子を有するｐＡＣＹＣ１７７由来のプラスミドｐＫＳＲ５０（図５に制限酵素地図を示した）を用いてｐＫＳＲ２１を保有する大腸菌ＮＨＫ３株（ＮＨＫ３／ｐＫＳＲ２１株）を形質転換し、アンピシリンとクロラムフェニコール両薬剤に耐性であることを指標に、ｐＫＳＲ５０とｐＫＳＲ２１を保有するＮＨＫ３株（ＮＨＫ３／ｐＫＳＲ５０＋ｐＫＳＲ２１）を取得した。
【０１４０】
また大腸菌Ｋ−１２株系統で、変異型（ｉｃｄ，ｓｕｃＡ，ｐｕｔＡ，ｅｄａ）を有する変異株ＮＨＫ２３株にも同様にしてｐＫＳＲ５０とｐＫＳＲ２１を導入し、ＮＨＫ２３／ｐＫＳＲ５０＋ｐＫＳＲ２１株を取得した。
大腸菌ＡＴＣＣ３３６２５株、上記の様にして造成したＮＨＫ３、ＡＴＣＣ３３６２５／ｐＫＳＲ１９株、ＮＨＫ３／ｐＫＳＲ１９株、ＮＨＫ３／ｐＫＳＲ５０＋ｐＫＳＲ２１株およびＮＨＫ２３／ｐＫＳＲ５０＋ｐＫＳＲ２１株を実施例４と同様にＴ培地中で３０℃にて２４時間培養した後、実施例５で作成した４（Ｒ）ＫＨＧを含有する培養上清をミリポア濾過滅菌したものを４（Ｒ）ＫＨＧの終濃度が４０ｍＭになるように添加し、３７℃でさらに２４時間振盪培養した。
【０１４１】
該培養上清中の４（Ｒ）ＨＹＰ量をＨＰＬＣで定量した。
結果を第５表に示した。
コリネバクテリウム グルタミクムＫＹ１０９１２株をＬＢ培地中で１６時間振盪培養した。
該培養液０．５ｍｌを滅菌した５ｍｌのＴＣ培地に添加し、３０℃で２４時間振盪培養した後、ミリポア濾過滅菌した実施例５で作成したＲ−ＫＨＧを含有する培養上清を４（Ｒ）ＫＨＧの終濃度が４０ｍＭになるように添加し、３７℃でさらに２４時間振盪培養した。
【０１４２】
該培養培養上清中の４（Ｒ）ＨＹＰ量をＨＰＬＣで定量した。
結果を第５表に示した。
【０１４３】
【表５】
【０１４４】
実施例１１ マイクロジャーファーメンターでの４（Ｒ）ＨＹＰ生産
実施例１０で造成したエシェリヒア コリＮＨＫ２３／ｐＫＳＲ５０＋ｐＫＳＲ２１株をグルコース １％、炭酸カルシウム ２％、グルタミン酸 ２ｇ／ｌを添加したＬＢ培地に植菌し、２８℃で１３時間振盪培養した。
該培養液０．５ｍｌを、同じ組成の培地１０ｍｌを入れ滅菌した３００ｍｌ容三角フラスコに添加し、２８℃で１３時間振盪培養した。
【０１４５】
該培養液全量を、リポ酸を除いたＪ２培地９０ｍｌを入れ滅菌した２００ｍｌ容ジャーファーメンターに添加し、アンモニア水でｐＨを６．８に保ちつつ、通気２００ｍｌ／ｍｉｎ、撹拌８００ｒｐｍ、３３℃の条件で培養した。
【０１４６】
培養１４時間後に、培養温度を４０℃にあげ、さらに８時間培養後、培養温度を３７℃に下げた。
培養２２時間目に、ジャーファーメンターから培養液を２７ｍｌ抜き取り、該ジャーファーメンターに実施例５で作成した４（Ｒ）ＫＨＧを含有する培養上清２７ｍｌをミリポア濾過滅菌後添加した〔４（Ｒ）ＫＨＧ終濃度８０ｍＭ〕。
【０１４７】
３７℃の条件で、該ジャーファーメンターに適宜グルコースを添加しながら４０時間培養を継続した。
該培養上清中の４（Ｒ）ＨＹＰをＨＰＬＣで分析した。
該培養により４９．９ｍＭ（６．５ｇ／ｌ）の４（Ｒ）ＨＹＰが生成した。
【０１４８】
参考例１ ｐＴｒＳ３３の構築
ＰＴｒＳ３３は特開昭５８−１１０６００および特開平２−２２７０７５に記載された手順に従って容易に構築することができる。以下に該プラスミドの構築方法を示す。
【０１４９】
大腸菌ＩＫＹＰ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−６９６２）より単離したプラスミドｐＫＹＰ−１をＴａｑ１で部分消化後、ＥｃｏＲＩで消化し、得られた、トリプトファンプロモーターとＳＤ配列を含む約２．６ｋｂのＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動法により精製、取得した。
ｐＢＲ３２２（宝酒造社製）をＴａｑ１で部分消化した後、ＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動法により約４．３３ｋｂのＤＮＡ断片を精製、取得した。
【０１５０】
得られた約２．６ｋｂのＤＮＡ断片および約４．３３ｋｂのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。
該連結ＤＮＡを用い、マニアチスらの方法〔モレキュラー・クローニング 第２版〕に従って大腸菌Ｃ６００ＳＦＳ株を形質転換し、アンピシリンおよびテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で２４時間インキュベートした。
【０１５１】
生育してきたアンピシリンおよびテトラサイクリンに耐性を示す形質転換体よりプラスミドｐＫＹＰ−５を抽出、取得した。
該ｐＫＹＰ−５をＨａｐIIとＨｉｎｄIIIで消化し約３４０ｂｐのＤＮＡ断片を取得した。
該約３４０ｂｐのＤＮＡ断片を、ＣｌａＩとＨｉｎｄIIIで消化したｐＢＲ３２２に挿入してｐＫＹＰ−１０を取得した。
【０１５２】
該ｐＫＹＰ−１０をＢａｎIIIとＮｒｕＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動法により、トリプトファンプロモーターを含む約３．８ｋｂのＤＮＡ断片を精製、取得した（ＢａｎIII−ＮｒｕＩ断片）。
トリプトファンプロモーターの下流にＡＴＧ開始コドンを付与するために、配列番号６および７に示されるＤＮＡ配列を有する２種類のＤＮＡリンカーをトリエステル法によって合成した。
【０１５３】
これら合成ＤＮＡリンカーをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、上記で取得したｐＫＹＰ−１０由来のＢａｎIII−ＮｒｕＩ断片と連結した。
該連結ＤＮＡを用い、マニアチスらの方法〔モレキュラー・クローニング 第２版〕に従って大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で２４時間インキュベートした。
【０１５４】
生育してきたアンピシリンに耐性を示す形質転換体よりプラスミドｐＴｒＳ２０を抽出、取得した。
該ｐＴｒＳ２０をＳａｃＩとＰｓｔＩで消化後、アガロースゲル電気泳動法により約１．１５ｋｂのＤＮＡ断片を精製、取得した（ＳａｃＩ−ＰｓｔＩ断片）。
【０１５５】
大腸菌ＩＫＹＰ−２６（ＦＥＲＭ ＢＰ−８６３）より単離したｐＫＹＰ２６をＢａｍＨＩで消化後、アガロースゲル電気泳動法により約１．７ｋｂのＤＮＡ断片を精製、取得した（ＢａｍＨＩ断片）。
またM13mp18RF ＤＮＡ（宝酒造社製）をＳａｃＩとＣｌａＩで消化後、アガロースゲル電気泳動法により約０．６５ｋｂのＤＮＡ断片を精製した（ＳａｃＩ−ＣｌａＩ断片）。
【０１５６】
更に、配列番号８および９に示されるＤＮＡ配列を有する２種類のＤＮＡリンカーをアプライド・バイオシステムズ社３８０Ａ ＤＮＡ合成機を用いて合成し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いリン酸化した。
上記で得られたｐＴｒＳ２０由来のＳａｃＩ−ＰｓｔＩ断片、ｐＫＹＰ２６由来のＢａｍＨＩ断片、M13mp18RF ＤＮＡ由来のＳａｃＩ−ＣｌａＩ断片および５’りん酸化された上記２つの合成ＤＮＡをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。
【０１５７】
該連結ＤＮＡを用い、マニアチスらの方法〔モレキュラー・クローニング 第２版〕に従って大腸菌ATCC33625株を形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で２４時間インキュベートした。
生育してきたアンピシリンに耐性を示す形質転換体よりプラスミドｐＴｒＳ３３を抽出、取得した。
【０１５８】
【発明の効果】
本発明により、グリオキシル酸とピルビン酸とから、４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は生成せず、４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のみを生成する反応を触媒する酵素４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼ、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体、該形質転換体を用いた４（Ｒ）ＫＨＧ、４（Ｒ）ＨＧまたは４（Ｒ）ＨＹＰの製造法を提供することができる。
【０１５９】
また、アミノ基供与体および４（Ｒ）ＫＨＧから４（Ｒ）ＨＹＰを生成する活性を有する生体触媒を用いた４（Ｒ）ＨＹＰの製造法を提供することができる。
【０１６０】
【配列表】
【０１６１】
【０１６２】
【０１６３】
【０１６４】
【０１６５】
【０１６６】
【０１６７】
【０１６８】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はｐＫＳＲ２０１上にクローニングされたBacillus sp.OC187株由来のＤ片の制限酵素地図を示した図である。
【図２】図２はｐＫＳＲ３０３の制限酵素地図を示した図である。
【図３】図３はｐＫＳＲ８０３の制限酵素地図を示した図である。
【図４】図４はｐＫＳＲ１９、ｐＫＳＲ２１、ｐＫＳＲ３２１の作成手順と構造を示した図である。
【図５】図５はｐＫＳＲ５０の制限酵素地図を示した図である。
【符号の説明】
Ａｍｐ：ｐＢＲ３２２由来アンピシリン耐性遺伝子
Ｐｔｒｐ：トリプトファンプロモーター
４（Ｒ）ＫＡＬ：４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼをコードする遺伝子
Ｓｐｃ：スペクチノマイシン耐性遺伝子
ｌａｃｌｑ：過剰生産型lacリプレッサー遺伝子
Ｐｔａｃ：tacプロモーター
ＰｒｏＢＡＲ：フィードバック阻害緩和型変異プロリン生合成遺伝子ProBA
ＰｐＬ：ラムダファージ由来pLプロモーター
ＰｒｏＣ：プロリン生合成遺伝子ProC
ＺＷＦ：グルコース-6リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子
ＧＤＨ：グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子
Ｃｍ：クロラムフェニコール耐性遺伝子
ｏｒｉ１７７：pACYC177複製起点[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an enzyme 4 (R) -hydroxy-2-ketoglutarate aldolase that catalyzes a reaction for producing 4 (R) -hydroxy-2-ketoglutarate from glyoxylic acid and pyruvic acid, DNA encoding the enzyme, Recombinant DNA obtained by incorporating the DNA into a vector, a transformant obtained by introducing the recombinant DNA into a host cell, 4 (R) -hydroxy-2-ketoglutaric acid [ Hereinafter abbreviated as 4 (R) KHG], 4 (R) -hydroxy-L-glutamic acid [hereinafter abbreviated as 4 (R) HG] or 4 (R) -hydroxy-L-proline [hereinafter 4 (R) (Hereinafter abbreviated as HYP).
[0002]
[Prior art]
It has been reported that 4-hydroxy-2-ketoglutarate aldolase (hereinafter abbreviated as KAL) activity that produces 4-hydroxy-2-ketoglutarate from pyruvate and glyoxylate exists in several organisms. However, both of them produce not only 4 (R) -hydroxy-2-ketoglutaric acid but also 4 (S) -hydroxy-2-ketoglutaric acid at the same time, and only 4 (R) -hydroxy-2-ketoglutaric acid is specific. 4-hydroxy-2-ketoglutarate aldolase [hereinafter abbreviated as 4 (R) KAL] is not known [Methods in Enzymology 41 part B, 115, EEDekker & U. Maitra, J. Biol. Chem. ,257, 5079 (1972)].
[0003]
As a method for producing 4 (R) KHG, a method in which erythro-4-hydroxy-L-glutamic acid is chemically deaminated (Methods in Enzymology, 17 part B, 275), racemic-4-synthesized from oxaloacetic acid and glyoxylic acid Method of decomposing and removing 4 (S) -hydroxy-2-ketoglutaric acid from hydroxy-2-ketoglutaric acid [J. Chem. Soc. Perkin Trans.,1, 1085 (1992)], a method of reacting glyoxylic acid with a biocatalyst having an activity of producing 4 (R) KHG from pyruvic acid and glyoxylic acid and a compound that can be converted to pyruvic acid by the biocatalyst ( JP-A-7-289284) is known.
[0004]
The former two methods are not practical because the raw materials are expensive or the yield is low. Although the latter production method is practical, a further economical production method is desired.
As a method for producing 4 (R) HG, glutamate dehydrogenase was allowed to act on chemically synthesized DL-4-hydroxy-2-ketoglutaric acid in the presence of ammonia and NADPH, and the resulting 4 (R) 4 (S) racemate was produced. A method for separating 4-hydroxyglutamic acid by ion exchange chromatography (Methods in Enzymology, 17 part B, 277) and a biocatalyst having an activity of generating 4 (R) HG from pyruvic acid and glyoxylic acid in the presence of an amino group donor. Known is an acid or a compound that can be converted to pyruvic acid by the biocatalyst and a method of acting on glyoxylic acid (JP-A-8-80198).
[0005]
The former method is difficult to put to practical use because it requires expensive raw materials and optical resolution operation. Although the latter production method is practical, a further economical production method is desired.
As a method for producing 4 (R) HYP, in addition to a method of separating and purifying from a collagen hydrolyzate, a method of culturing a microorganism belonging to the genus Chronostachys, Gliocladium or Nectria and extracting it from the culture ( JP-A-5-236980), a method in which a microorganism having an activity of converting 4-hydroxy-2-ketoglutarate to 4-hydroxy-L-proline is allowed to act on 4-hydroxy-2-ketoglutarate (JP-A-3-26695) Etc. are known. However, each method is expensive as a raw material or separation and purification, and is not an excellent production method.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for industrially advantageously producing 4 (R) KHG, 4 (R) HG and 4 (R) HYP which are useful as raw materials for synthesis of pharmaceuticals and the like.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present invention does not produce 4 (S) -hydroxy-2-ketoglutaric acid from glyoxylic acid and pyruvic acid, and enzyme 4 (catalyzing a reaction producing only 4 (R) -hydroxy-2-ketoglutaric acid. R) -hydroxy-2-ketoglutarate aldolase [4 (R) KAL], DNA encoding the enzyme, recombinant DNA obtained by incorporating the DNA into a vector, and introducing the recombinant DNA into a host cell And a method for producing 4 (R) KHG, 4 (R) HG or 4 (R) HYP using the transformant.
[0008]
The present invention also relates to a method for producing 4 (R) HYP using an amino group donor and a biocatalyst having an activity of producing 4 (R) HYP from 4 (R) KHG.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
As 4 (R) KAL of the present invention, 4 (S) -hydroxy-2-ketoglutaric acid is not produced from glyoxylic acid and pyruvic acid, and only 4 (R) -hydroxy-2-ketoglutaric acid is produced. Any enzyme that catalyzes can be used, for example, a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or one or more amino acids substituted or missing from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. 4 (S) -hydroxy-2-ketoglutaric acid is not produced from glyoxylic acid and pyruvic acid, and only 4 (R) -hydroxy-2-ketoglutaric acid is produced from the lost or added amino acid sequence. A polypeptide having an activity of catalyzing the reaction can be mentioned.
[0010]
The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted or added, and glyoxylic acid and pyruvic acid are used to express 4 (S) -hydroxy-2-ketoglutaric acid Polypeptides that have the activity of catalyzing the reaction of producing only 4 (R) -hydroxy-2-ketoglutaric acid without being produced areTen, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA,79, 6409 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA,81, 5662 (1984), Science,224, 1431 (1984), PCT WO85 / 00817 (1985), Nature,316, 601 (1985), Gene,34, 315 (1985), Nucleic Acids Research,134431 (1985), Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 8, Mutagenesis of Cloned DNA, John Wiley & Sons, Inc. (1989), etc. Can be prepared.
[0011]
Examples of the DNA of the present invention include the DNA encoding the 4 (R) KAL of the present invention. For example, the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 3, and the stringent DNA Examples thereof include DNA that hybridizes under conditions.
[0012]
The DNA capable of hybridizing with the DNA of the present invention under stringent conditions is a colony hybridization method, a plaque hybridization method or a Southern method using the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 3 as a probe. It means DNA obtained by using blot hybridization or the like. Specifically, using a filter on which colony or plaque-derived DNA is immobilized, in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl, 65 ° C. After hybridization, the SSC solution with a concentration of 0.1 to 2 times (the composition of the SSC solution with a concentration of 1 is composed of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate) is used and the filter is filtered at 65 ° C. DNA that can be identified by washing Kill.
[0013]
Hybridization: Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd edition (edited by Sambrook, Fritsch, Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory) -The method described in Press (Cold Spring Harbor Laboratory Press), 1989, hereinafter abbreviated as "Molecular Cloning 2nd Edition". Specifically, DNA capable of hybridizing is DNA having at least 60% homology with a base sequence selected from the base sequences represented by SEQ ID NOs: 2 and 3, preferably DNA having 80% or more homology. More preferred is DNA having a homology of 95% or more.
[0014]
The DNA of the present invention can be obtained from a microorganism having an activity of producing 4 (R) -hydroxy-2-ketoglutaric acid from glyoxylic acid and pyruvic acid. Examples of the microorganism include microorganisms belonging to the genus Bacillus, and specifically include Bacillus sp. OC187 strain. The Bacillus sp. OC187 strain is a strain isolated from the soil by the present inventors, and was deposited as FERM BP-4646 at the National Institute of Biotechnology, April 19, 1994 based on the Budapest Treaty. ing.
[0015]
Hereinafter, a method for obtaining DNA encoding 4 (R) KAL from a microorganism having an activity of producing 4 (R) -hydroxy-2-ketoglutaric acid from glyoxylic acid and pyruvic acid will be described.
From a microorganism having an activity of producing 4 (R) -hydroxy-2-ketoglutaric acid from glyoxylic acid and pyruvic acid, a conventional DNA isolation method such as phenol method [Biochim. Biophys. Acta.,72619 (1963)], the chromosomal DNA of the microorganism is prepared. The chromosomal DNA library is constructed by cleaving the obtained chromosomal DNA with an appropriate restriction enzyme and incorporating the restriction enzyme-cleaved fragment into vector DNA. This DNA library is used to transform host microorganisms. About the obtained transformant, the activity which produces | generates 4 (R) -hydroxy-2-ketoglutaric acid from glyoxylic acid and pyruvic acid is measured. A DNA containing the target gene can be obtained from a transformant having enhanced activity compared to the parent strain.
[0016]
This series of operations is knownin in vitroRecombination techniques (Molecular Cloning 2nd Edition) can be used.
As a vector DNA for constructing a chromosomal DNA library of a microorganism having an activity of producing 4 (R) -hydroxy-2-ketoglutaric acid from glyoxylic acid and pyruvic acid, as long as it can autonomously replicate in Escherichia coli K12 strain, Any of phage vectors and plasmid vectors can be used. Specifically, ZAP Express (Stratagies, made by Stratagene,Five, 58 (1992)], pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research,17, 9494 (1989)], λzap II (manufactured by Stratagene), λgt10, λgt11 [DNA Cloning, A Practical Approach],1, 49 (1985)], Lambda BlueMid (manufactured by Clontech), λExCell (manufactured by Pharmacia), pT7T318U (manufactured by Pharmacia), pcD2 [Molecular and Cellular Biology (Mol. Cell. Biol.),Three, 280 (1983)], pUC18 [Gene,33, 103 (1985)], pSTV29 (Takara Shuzo) and the like.
[0017]
As the host microorganism, any microorganism belonging to E. coli can be used. In particular,Escherichia coli XL1-Blue MRF '(Stratagies, made by Stratagene,Five, 81 (1992)),Escherichia coli C600 (Genetics,39, 440 (1954)),Escherichia coli Y1088 (Science,222, 778 (1983)],Escherichia coli Y1090 (Science,222, 778 (1983)),Escherichia coli NM522 [J. Mol. Biol.,166, 1 (1983)],Escherichia coli K802 [J. Mol. Biol.,16, 118 (1966)),Escherichia coli JM105,Escherichia coli ATCC33625 or the like is used.
[0018]
The DNA fragment encoding 4 (R) KAL is digested as it is or with an appropriate restriction enzyme or the like, and then incorporated into a vector by a conventional method, and a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, the dideoxy method [Sc. Acad. Sci. USA,74, 5463 (1977)] or 373A DNA sequencer (manufactured by Perkin Elmer), etc., to determine the base sequence of the DNA.
[0019]
Examples of the base sequence of the DNA encoding 4 (R) KAL determined in this way include the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
The DNA of the present invention can also be prepared by chemically synthesizing with a DNA synthesizer based on the determined DNA base sequence. Examples of the DNA synthesizer include a DNA synthesizer manufactured by Shimadzu Corporation using the thiophosphite method, a DNA synthesizer model 392 manufactured by Perkin Elmer using the phosphoramidite method, and the like.
[0020]
In order to express 4 (R) KAL in the host cell from the DNA encoding 4 (R) KAL of the present invention, Molecular Cloning 2nd Edition or Current Protocols in Molecular Biology Supplements 1-34 Etc. can be used.
That is, by constructing a recombinant vector in which the DNA of the present invention is inserted downstream of a promoter of an appropriate expression vector and introducing it into a host cell, a transformant expressing 4 (R) KAL of the present invention is obtained. Obtainable.
[0021]
Any host cell can be used as long as it can express the target gene, such as bacteria, yeast, animal cells, and insect cells.
As the expression vector, a vector that can replicate autonomously in the host cell or can be integrated into a chromosome and contains a promoter at a position where the DNA of the present invention can be transcribed is used.
[0022]
When a prokaryotic organism such as a bacterium is used as a host cell, the DNA expression vector of the present invention is capable of autonomous replication in prokaryotes, and at the same time comprises a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA of the present invention, and a transcription termination sequence. It is preferable that A gene that controls the promoter may also be included.
Examples of the expression vector include pKK233-2 (Pharmacia), pSE280 (Invitrogen), pGEMEX-1 (Promega), pQE-8 (QIAGEN), pKYP10 (Japanese Patent Laid-Open No. 58-86). 110600), pKYP200 [Agric. Biol. Chem.,48, 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem.,53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA,82, 4306 (1985)], pBluescript (STRATAGENE), pTrs30 [Escherichia coli JM109 / pTrS30 (prepared from FERM BP-5407)], pTrs32 [Escherichia coli Prepared from JM109 / pTrS32 (FERM BP-5408)], pGHA2 [Escherichia coli Prepared from IGHA2 (FERM BP-400)], pGKA2 [Escherichia coli Prepared from IGKA2 (FERM BP-6798)], pTerm2 (Japanese Patent Laid-Open No. 3-22979, US4686191, US4939094, US5160735), pGEX (Pharmacia), pET system (Novagen), pSupex, pACYC184, pSTV29 (Takara Shuzo) Examples thereof include pCG1 and pCS116 (Japanese Patent Laid-Open No. Hei 6-277082).
[0023]
Any promoter can be used as long as it can be expressed in a host cell such as Escherichia coli. For example,trpPromoter (Ptrp),lacPromoter (Plac), PLPromoter, PRExamples of the promoter include promoters derived from E. coli and phages. PtrpTwo promoters in series (Ptrp x2),tacArtificially designed and modified promoters such as a promoter, T7 promoter, and PletI promoter can also be used.
[0024]
As the ribosome binding sequence, it is preferable to use a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
Any DNA that encodes 4 (R) KAL can be used as long as it encodes 4 (R) KAL, so that the base sequence of the DNA becomes an optimal codon for expression in a host microorganism. High expression can be achieved by replacing the base. As a specific example of DNA encoding 4 (R) KAL in which E. coli is used as a host and the base is substituted so as to be an optimal codon for expression, the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 can be exemplified.
[0025]
In the recombinant vector of the present invention, a transcription termination sequence is not necessarily required for the expression of the DNA of the present invention, but it is preferable to place the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
Examples of the plasmid containing DNA encoding 4 (R) KAL of the present invention include pKSR222, pKSR303, pKSR321, pKSR803, and the like. E. coli containing pKSR303Escherichia coli NHK46 / pKSR303 was deposited as FERM BP-6051 on August 12, 1997 at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, 1-3 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan (postal code 305). Yes.
[0026]
Host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Klebsiella, Serratia, Corynebacterium, Brevibacterium, Pseudomonas, Bacillus, etc.Escherichia coli XL1-Blue,Escherichia coli XL2-Blue,Escherichia coli DH1,Escherichia coli MC1000,Escherichia coli KY3276,Escherichia coli W1485,Escherichia coli JM109,Escherichia coli HB101,Escherichia coli No. 49,Escherichia coli W3110,Escherichia coli NY49,Escherichia coli ATCC33625,Escherichia coli ATCC11303,Bacillus subtilis,Bacillus amyloliquefacines,Brevibacterium immariophilum ATCC14068,Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066,Brevibacterium flavum ATCC14067,Brevibacterium lactofermentum ATCC13869,Corynebacterium glutamicum ATCC13032,Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870,Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354,Klebsiela oxytoca ATCC8724,Serratia marsecens ATCC13880 etc. can be mentioned.
[0027]
As a method for introducing the recombinant vector, any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the host cell. For example, a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69, 2110 (1972)], protoplast method (Japanese Patent Laid-Open No. 63-2483942), and the like.
When using a yeast strain as a host cell, YEP13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419) etc. can be used as an expression vector, for example.
[0028]
Any promoter can be used as long as it can be expressed in yeast strains. For example, promoters of glycolytic genes such as hexose kinase, gal 1 promoter, gal 10 promoter, heat shock polypeptide promoter And promoters such as MFα1 promoter and CUP 1 promoter.
[0029]
Host cells include Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisae), Schizosaccharomyces pombe (Schizosaccharomyces pombe), Kluyveromyces lactis (Kluyveromyces lactis), Trichosporon Pulllance (Trichosporon pullulans), Schwaniomyces Albius (Schwanniomyces alluvius) Etc.
[0030]
As a method for introducing a recombinant vector, any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into yeast. For example, an electroporation method [Methods. Enzymol.,194, 182 (1990)], spheroplast method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84, 1929 (1978)], lithium acetate method [J. Bacteriol.153, 163 (1983)].
[0031]
When animal cells are used as hosts, examples of expression vectors include pAGE107 [JP-A-3-22979; Cytotechnology,Three, 133, (1990)], pAS3-3 (JP-A-2-27075), pCDM8 [Nature,329, 840, (1987)], pcDNAI / Amp (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen) pAGE103 [J. Biochem.,1011307 (1987)], pAGE210 and the like are used.
[0032]
Any promoter can be used as long as it can be expressed in animal cells. For example, IE (immediate early) gene promoter of cytomegalovirus (human CMV), SV40 early promoter or metallothionein promoter, etc. I can give you. In addition, an enhancer of human CMV IE gene may be used together with a promoter.
[0033]
Examples of host cells include human cells such as Namalwa cells, COS cells that are monkey cells, CHO cells that are Chinese hamster cells, and HBT5637 (Japanese Patent Laid-Open No. 63-299).
As a method for introducing a recombinant vector, any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells. For example, an electroporation method [Cytotechnology,Three, 133 (1990)], calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84, 7413 (1987)].
[0034]
When insect cells are used as hosts, for example, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, Current Protocols in Molecular Biology Supplement 1-34, Bio / Technology,6, 47 (1988) and the like, 4 (R) KAL can be expressed.
[0035]
That is, a recombinant gene transfer vector and a baculovirus are co-introduced into insect cells to obtain a recombinant virus in the insect cell culture supernatant, then further infected with the insect cells and 4 (R) KAL Can be expressed.
Examples of the gene transfer vector used in the method include pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII (both manufactured by Invitrogen) and the like.
[0036]
As the baculovirus, for example, an autographa californica nuclear polyhedrosis virus, which is a virus that infects the night stealing insects, can be used.
As an insect cell,Spodoptera frugiperdaSf9, Sf21 [Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York, (1992)],Trichoplusia ni High 5 (manufactured by Invitrogen) and the like, which are ovarian cells of the above, can be used.
[0037]
Examples of a method for co-introducing the above recombinant gene introduction vector and the above baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include, for example, the calcium phosphate method (JP-A-2-27075), the lipofection method [Proc. Natl. Acad Sci. USA,84, 7413 (1987)].
As a gene expression method, in addition to direct expression, secretory production, fusion protein expression, and the like can be performed according to the method described in Molecular Cloning, Second Edition.
[0038]
The transformant obtained as described above is cultured in a medium, the 4 (R) KAL of the present invention is produced and accumulated in the culture, and the 4 (R) KAL of the present invention is collected from the culture. Can be manufactured. The method of culturing the transformant of the present invention in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
As a medium for culturing a transformant obtained by using a prokaryote such as E. coli or a eukaryote such as yeast as a host, the medium contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the organism. Any natural or synthetic medium may be used as long as the medium can efficiently be cultured.
[0039]
The carbon source may be anything that can be assimilated by the organism, such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid and propionic acid, ethanol, Alcohols such as propanol can be used.
Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of organic acids such as ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein A hydrolyzate, soybean meal, soybean meal hydrolyzate, various fermented cells, digests thereof, and the like can be used.
[0040]
Examples of inorganic substances that can be used include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate.
The culture is usually carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture. The culture temperature is preferably 15 to 40 ° C., and the culture time is usually 10 to 96 hours. During the culture, the pH is maintained at 3.0 to 9.0. The pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
[0041]
Moreover, you may add antibiotics, such as an ampicillin and a tetracycline, to a culture medium as needed during culture | cultivation.
When culturing a microorganism transformed with an expression vector using an inducible promoter as a promoter, an inducer may be added to the medium as necessary. For example,lacWhen culturing a microorganism transformed with an expression vector using a promoter, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, etc.trpWhen culturing a microorganism transformed with an expression vector using a promoter, indoleacrylic acid or the like may be added to the medium.
[0042]
As a medium for cultivating a transformant obtained using animal cells as a host, a generally used RPMI 1640 medium, Eagle's MEM medium, a medium obtained by adding fetal calf serum or the like to these mediums, or the like can be used.
Culture is usually 5% CO2Perform under conditions such as presence. The culture temperature is preferably 35 to 37 ° C., and the culture time is usually 3 to 7 days.
[0043]
Moreover, you may add antibiotics, such as kanamycin and penicillin, to a culture medium as needed during culture | cultivation.
As a medium for cultivating a transformant obtained using insect cells as a host, a commonly used TNM-FH medium (Pharmingen), Sf-900 II SFM medium (Gibco BRL) ExCell400, ExCell405 [both manufactured by JRH Biosciences] and the like can be used.
[0044]
The culture temperature is preferably 25 to 30 ° C., and the culture time is usually 1 to 4 days.
Moreover, you may add antibiotics, such as a gentamicin, to a culture medium as needed during culture | cultivation.
In order to isolate and purify 4 (R) KAL expressed by the above method from the culture medium of the transformant, a normal enzyme isolation and purification method may be used.
[0045]
For example, when 4 (R) KAL of the present invention is expressed in a dissolved state in a cell, after completion of the culture, the cell is recovered by centrifugation, suspended in an aqueous buffer solution, an ultrasonic crusher, a French press. Then, the cells are disrupted with a Manton Gaurin homogenizer, Dynomill or the like to obtain a cell-free extract. From the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract, an ordinary enzyme isolation and purification method, that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Anion exchange chromatography using resin such as diethylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Kasei), cation exchange chromatography using resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia) Methods such as electrophoresis, hydrophobic chromatography using resin such as butyl sepharose, phenyl sepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, isoelectric focusing etc. A purified preparation can be obtained by using alone or in combination.
[0046]
In addition, when the 4 (R) KAL is expressed in an insoluble form in the cells, the cells are similarly collected and then disrupted and centrifuged from the precipitate fraction obtained by a conventional method. After recovering the 4 (R) KAL, the insoluble form of the 4 (R) KAL is solubilized with a polypeptide denaturant. The solubilized solution is diluted or dialyzed into a dilute solution that does not contain a polypeptide denaturant or does not denature the 4 (R) KAL. After making it into a three-dimensional structure, a purified sample can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
[0047]
When 4 (R) KAL of the present invention is secreted extracellularly, the 4 (R) KAL can be recovered in the culture supernatant. That is, a soluble fraction is obtained by treating the culture by a technique such as centrifugation as described above, and a purified preparation is obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. be able to.
[0048]
4 (R) KAL expressed by the above method can also be produced by chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). Also, Kuwawa Trading (manufactured by Advanced ChemTech, USA), Perkin Elmer Japan (manufactured by Perkin-Elmer, USA), Pharmacia Biotech (manufactured by PharmaciaBiotech, Sweden), Aloka (manufactured by Protein Technology Instrument, USA), Kurabo (USA, Synthecell-Vega) ), Nippon Perceptive Limited (PerSeptive, USA), Shimadzu Corporation and other peptide synthesizers can be used for synthesis.
[0049]
By making biocatalyst I, pyruvic acid and glyoxylic acid derived from the transformant obtained above and having an activity of producing 4 (R) KHG from glyoxylic acid and pyruvic acid in an aqueous medium, 4 (R) KHG can be produced by producing 4 (R) KHG in the medium and collecting the produced 4 (R) KHG from the aqueous medium.
[0050]
As the biocatalyst I, any of the culture, cell, and cell-treated product of the transformant obtained above can be used.
Cell processed products include cell dried products, lyophilized products, surfactant or organic solvent treated products, enzyme treated products, ultrasonic treated products, mechanically milled products, cell protein fraction [4 (R) KAL crude enzyme or purified enzyme], immobilized cells and cell-treated products, and the like.
[0051]
The biocatalyst I concentration is 0.1 to 200 g / l, preferably 5 to 100 g / l in terms of wet cell weight.
[0052]
Examples of the aqueous medium include buffers such as water, phosphate, carbonate, acetate, borate, citrate, and tris, alcohols such as methanol and ethanol, esters such as ethyl acetate, and acetone. Examples thereof include aqueous solutions containing organic solvents such as ketones and amides such as acetamide. If necessary, a surfactant such as Triton X-100 (manufactured by Nacalai Tesque) or Nonion HS204 (manufactured by NOF Corporation) or an organic solvent such as toluene or xylene is added in an amount of about 0.1 to 20 g / l. Also good.
[0053]
The concentration of pyruvic acid and glyoxylic acid is 1 to 200 g / l, preferably 20 to 200 g / l. Compounds that can be converted to pyruvate by biocatalyst I can also be used as an alternative to pyruvate. Examples of the compound include saccharides such as glucose, fructose, sucrose, maltose, starch, starch hydrolyzate, and molasses, and organic acids such as acetic acid, lactic acid, and gluconic acid.
[0054]
Biocatalyst I, pyruvic acid and glyoxylic acid are added to the aqueous medium at the above concentrations, and the temperature is 15-80 ° C., preferably 25-60 ° C., pH 3-11, preferably pH 5-9, By reacting for 96 hours, 4 (R) KHG can be produced.
It is also possible to produce 4 (R) KHG by adding pyruvic acid and glyoxylic acid at the above-mentioned concentrations during the initial culture or in the middle of the cell used as biocatalyst I. At that time, pyruvic acid or a compound to be converted to pyruvic acid by the recombinant strain may be added in advance as a culture substrate, or may be added together with glyoxylic acid.
[0055]
Biocatalyst I is the transformant described above, and further 1) does not have the ability to produce 4 (S) -hydroxy-2-ketoglutaric acid from glyoxylic acid and pyruvic acid. The production of 4 (R) KHG is derived from a transformant having one or more properties selected from the properties of having an auxotrophy for acid and 3) low or no malate synthase activity. Is preferred. Examples of microorganisms of such transformants include Escherichia coli K-12 substrain NHK40 [lipoic acid requirement (lip), 4KAL deficient (eda)], Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain, and the like. it can. Escherichia coli NHK40 strain was deposited as FERM BP-5919 to the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on April 16, 1997, based on the Budapest Treaty.
[0056]
4 (R) KHG produced by the above production method can be isolated using a commonly used purification method of organic acid. As the purification method, for example, 4 (R) KHG can be isolated from a reaction supernatant from which solids have been removed by centrifugation, by combining operations such as an ion exchange resin and a membrane treatment method.
The transformant, amino group donor, carbohydrate and glyoxylic acid described above are present in an aqueous medium to produce 4 (R) HG in the aqueous medium, and the produced 4 (R) HG is added to the aqueous medium. By collecting from the medium, 4 (R) HG can be produced.
[0057]
The concentration of the transformant is 0.1 to 200 g / l, preferably 5 to 100 g / l in terms of wet cell weight.
As the aqueous medium, the aqueous medium described in the above 4 (R) KHG production method can be used.
Examples of the amino group donor include inorganic ammonium salts such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride and urea, and various amino acids including glutamic acid. The concentration of the amino group donor is 0.1 to 100 g / l, preferably 1 to 50 g / l.
[0058]
Any sugar can be used as long as the transformant can assimilate, and glucose, fructose, sucrose, maltose, starch, starch hydrolyzate, molasses, and the like can be used.
The concentration of carbohydrate and glyoxylic acid is 1 to 200 g / l, preferably 10 to 200 g / l.
[0059]
To the aqueous medium, the above transformant, sugar and glyoxylic acid are added at the above concentrations, and the temperature is 15 to 80 ° C., preferably 25 to 60 ° C., pH 3 to 11, preferably pH 5 to 9 and 0.5. By reacting for ˜96 hours, 4 (R) HG can be produced.
[0060]
It is also possible to produce 4 (R) HG by adding glyoxylic acid at the above concentration during the initial culture or in the middle of the transformant.
Moreover, the transformant described above further has 1) an ability to produce 4 (S) -hydroxy-2-ketoglutaric acid from glyoxylic acid and pyruvic acid, and 2) an auxotrophy for lipoic acid. 4 (R) is derived from a transformant having one or more properties selected from 3) having low or no malate synthase activity, and 4) having no phosphoenolpyruvate carboxylase activity. ) Preferred for the production of HG. Examples of microorganisms of such transformants include, for example, Escherichia coli K-12 strain substrain NHK40 [lipoic acid requirement (lip), 4KAL deficient (eda)], Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain, Escherichia coli K- Examples include 12 strains of substrain NHK46 [lip, eda, malate synthase deficiency (glc), phosphoenolpyruvate carboxylase deficiency (ppc)] and the like. Escherichia coli NHK46 strain was deposited as FERM BP-5920 at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on April 16, 1997, based on the Budapest Treaty.
[0061]
The transformant, amino group donor, sugar and glyoxylic acid described above are present in an aqueous medium to produce 4 (R) HYP in the aqueous medium, and the produced 4 (R) HYP is converted into the aqueous medium. By extracting from the medium, 4 (R) HYP can be produced.
The concentration of the transformant is 0.1 to 200 g / l, preferably 5 to 100 g / l in terms of wet cell weight.
[0062]
As the aqueous medium, the aqueous medium described in the above 4 (R) KHG production method can be used.
Examples of the amino group donor include inorganic ammonium salts such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride and urea, and various amino acids including glutamic acid. The concentration of the amino group donor is 0.1 to 100 g / l, preferably 1 to 50 g / l.
[0063]
Any sugar can be used as long as the transformant can assimilate, and glucose, fructose, sucrose, maltose, starch, starch hydrolyzate, molasses, and the like can be used.
The concentration of carbohydrate and glyoxylic acid is 1 to 200 g / l, preferably 10 to 200 g / l.
[0064]
To the aqueous medium, the above transformant, sugar and glyoxylic acid are added at the above concentrations, and the temperature is 15 to 80 ° C., preferably 25 to 60 ° C., pH 3 to 11, preferably pH 5 to 9 and 0.5. By reacting for ˜96 hours, 4 (R) HYP can be produced.
In addition, 4 (R) HYP can be produced by adding glyoxylic acid at the above concentration or during the initial culture of the transformant.
[0065]
In the production of 4 (R) HYP, the transformant described above does not further have 1) the ability to produce 4 (S) -hydroxy-2-ketoglutaric acid from glyoxylic acid and pyruvic acid. Has auxotrophy for acid, 3) low or no malate synthase activity, and 4) no phosphoenolpyruvate carboxylase activity 5) azetidine-2-carboxylic acid, 3,4-dehydroproline, thioproline, etc. It is preferable that the transformant has one or more properties selected from the property of having resistance to a proline analog. Examples of microorganisms of such transformants include, for example, Escherichia coli K-12 strain substrain NHK40 [lipoic acid requirement (lip), 4KAL deficient (eda)], Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain, Escherichia coli K-12. Substrains of strains NHK46 [lip, eda, malate synthase deficient (glc), phosphoenolpyruvate carboxylase deficient (ppc)], NHK47 strain [lip, eda, glc, ppc, azetidine-2-carboxylic acid resistant], etc. Can give. Escherichia coli NHK47 strain has been deposited as FERM BP-592 at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on April 16, 1997, based on the Budapest Treaty.
[0066]
The above-mentioned various deficient strains and resistant strains are subjected to normal mutation operations such as N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) treatment, UV irradiation, γ-ray irradiation, etc. After applying, apply to an appropriate agar plate medium, obtain the grown mutant strain, and obtain by selecting the strain whose target enzyme activity is deficient or reduced compared to the parent strain or a strain resistant to analog from the parent strain be able to. In addition, in the case of Escherichia coli K-12 strains, various deletion mutants can also be obtained by transferring the deletion mutation (transduction) from another strain having the target deletion or resistance mutation to the desired strain using P1 phage or the like. And resistant mutants can be obtained.
[0067]
As a method for producing 4 (R) HYP, an amino group donor and biocatalyst II having an activity of converting 4 (R) KHG to 4 (R) HYP, an amino group donor and 4 (R) KHG are aqueous. A method for producing 4 (R) HYP by producing 4 (R) HYP in an aqueous medium by being present in the medium and collecting the produced 4 (R) HYP from the aqueous medium. Can do.
[0068]
As the biocatalyst II, any of an amino group donor and a culture of microorganisms having activity to convert 4 (R) KHG to 4 (R) HYP, microbial cells, or processed microbial cells can be used.
[0069]
Examples of microorganisms having an amino group donor and an activity of converting 4 (R) KHG to 4 (R) HYP include, for example, Escherichia (Escherichia), Corynebacterium (Corynebacterium) Microbes belonging to the genus and the like. Specifically, Escherichia coli introduced with plasmid pKSR19 containing a mutated ProBA gene derived from Escherichia coli and with which feedback inhibition by proline is alleviated (Escherichia coli) K-12 strain ATCC 33625 strain (ATCC 33625 / pKSR19), Corynebacterium acetoacidophilum (Corynebacterium acetoacidophilum) FERM P-4962 strain and the like. More preferable examples include mutants having glutamic acid requirement. Such a mutant strain is appropriately treated after subjecting the parent strain to usual mutation procedures, for example, treatment with a mutation agent such as N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), UV irradiation, γ-ray irradiation, etc. It can be obtained by applying to a fresh agar plate medium, obtaining a grown mutant strain, and selecting a strain that requires glutamic acid for growth. In addition, in Escherichia coli K-12 strains, defective mutants can also be obtained by transduction. As such a microorganism, Escherichia coli (Escherichia coli) NHK3 / pKSR19 strain in which pKSR19 was introduced into the NHK3 strain in which ATCC 33625 of the K-12 strain line was added with a deletion mutation (icd) of isocitrate dehydrogenase, and NHK3 / pKSR21 in which pKSR21 in which E. coli-derived ProC gene was linked to pKSR19 was introduced And NHK3 / pKSR21 + pKSR50 strain into which a plasmid pKSR50 containing glutamate dehydrogenase and glucose-6-phosphate dehydrogenase has also been introduced. In addition to the requirement for glutamic acid, it is more advantageous to use a host microorganism that has become resistant to proline analogs such as azetidine-2-carboxylic acid, 3,4-dehydroproline, and thioproline.
[0070]
Such a microorganism can be obtained by introducing a plasmid containing a proline analog resistance gene in addition to being obtained by subjecting the parent strain to mutation or transduction as described above. Specific examples include Escherichia coli NHK23 / pKSR21 + pKSR50 strains. The Escherichia coli NHK3 / pKSR21 + pKSR50 and NHK23 / pKSR21 + pKSR50 strains were dated August 12, 1997, and the Escherichia coli NHK3 / pKSR19 strain was dated August 26, 1997, respectively, FERM BP-6052, FERM BP-6053, FERM BP-6076 has been deposited with the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science, based on the Budapest Treaty.
[0071]
The treated cells include dried cells, freeze-dried products, surfactants or organic solvent-treated products, enzyme-treated products, sonicated products, mechanically-ground products, and cell protein fractions [amino Group donor, and a crude enzyme or purified enzyme having an activity of converting 4 (R) KHG to 4 (R) HYP], immobilized cells and treated cells, and the like.
[0072]
The concentration of the biocatalyst II is 0.1 to 200 g / l, preferably 5 to 100 g / l in terms of microbial cells.
4 (R) KHG is not only 4 (R) KHG isolated and purified, but also a crude product containing no 4 (S) KHG and 4 (S) HG, or a biocatalyst derived from the microorganism described above A reaction solution containing 4 (R) KHG produced using the reaction can be used. The concentration of 4 (R) KHG is 1 to 200 g / l, preferably 20 to 200 g / l.
[0073]
As the aqueous medium, the aqueous medium described in the above 4 (R) KHG production method can be used.
Biocatalyst II, amino group donor and 4 (R) KHG are added to the aqueous medium at the above concentrations, and the temperature is 15 to 80 ° C., preferably 25 to 60 ° C., pH 3 to 11, preferably pH 5 to 9 , And reacting for 0.5 to 96 hours, 4 (R) HYP can be produced.
[0074]
It is also possible to produce 4 (R) HYP by adding the above concentration of 4 (R) KHG at the beginning or during the cultivation of the microorganism used as biocatalyst II.
4 (R) HG or 4 (R) HYP produced as described above can be isolated using a commonly used amino acid purification method. For example, 4 (R) HG or 4 (R) HYP can be isolated from the reaction supernatant from which solids have been removed by centrifugation, by combining operations such as ion exchange resin and membrane treatment.
Examples of the present invention are shown below.
[0075]
【Example】
Example 1 Acquisition of 4 (R) KAL gene
Bacillus SPBacillus sp.) OC187 strain (FERM BP-4646) 1 platinum ear, 10 ml LB liquid medium [Bactotrypton (Difco) 10 g, yeast extract (Difco) 5 g, NaCl 5 g in 1 liter of water, medium adjusted to pH 7.2] and cultured at 30 ° C. for 20 hours. From the obtained cultured cells, a known method [Biochim. Biophys. Acta.,72, 619 (1963)], chromosomal DNA was isolated. 5 μg of purified chromosomal DNA of Bacillus sp. OC187 strain and 1 μg of pSTV29 plasmid DNA (Takara Shuzo)Sal Dissolve in 100 μl of I buffer solution (K buffer manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.).Sal I (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was added, digestion reaction was performed at 37 ° C for 3 hours, and then the reaction was stopped by heating at 65 ° C for 15 minutes. After adding 10 μl of 3M sodium acetate (pH 5.6) to the reaction stop solution, 300 μl of ethanol cooled to −20 ° C. was added and allowed to stand at −80 ° C. for 30 minutes. After standing, the precipitate formed in the ethanol mixture was obtained by centrifugation (hereinafter, this operation is abbreviated as ethanol precipitation method). The precipitate was dissolved in 5 μl of distilled water, 40 μl of ligation buffer A solution (Takara Shuzo) and 5 μl of ligation buffer B solution (Takara Shuzo) were added and mixed, and then DNA ligation reaction was performed at 16 ° C. for 16 hours. Recombinant DNA was obtained (hereinafter, this operation is abbreviated as ligation reaction). Using the recombinant DNA, Escherichia coli (Escherichia coli) The ATCC 33625 strain of the K-12 strain was transformed according to the method of Maniatis et al. [Molecular Cloning, Second Edition], and LB agar medium containing 25 μg / ml of chloramphenicol (LB medium was added with 2% agar and solidified. And incubated at 37 ° C. for 24 hours. The activity of synthesizing 4-hydroxy-2-ketoglutaric acid from pyruvic acid and glyoxylic acid was measured on about 2000 transformed colonies resistant to chloramphenicol.
[0076]
Specifically, each transformed strain was cultured in 3 ml of LB liquid medium containing 25 μg / ml of chloramphenicol for 20 hours at 30 ° C., and 30 μl of xylene and 150 μl of 2M sodium pyruvate solution and 2M glyoxylic acid solution were added to the culture solution. (Adjusted to pH 6.4 with NaOH) 150 μl was added and shaken at 37 ° C. for 30 minutes.
Using the SUMICHIRAL OA-5000 manufactured by Sumitomo Chemical Co., Ltd. (inner diameter: 4.6 mm, length: 5 cm), 1 mM copper acetate (II), 0.1 mM aqueous ammonium acetate solution (pH 4.5) 85: A mixed liquid of isopropanol 15 was used as a moving layer, and analysis was performed by an HPLC method for measuring absorbance at UV 210 nm, and production amounts of 4 (R) and 4 (S) -hydroxy-2-ketoglutar were measured.
[0077]
From the measurement, a transformant having 4 (R) KHG synthesis activity was selected, and from the transformant, about 3.5 kb carrying 4 (R) KHG synthesis activity.Sal Plasmid pKSR201 having an I-treated DNA fragment was obtained.
TheSal A restriction enzyme map of the I-treated DNA fragment is shown in FIG. In addition, using various restriction enzymes, the 4 (R) KAL gene region on this DNA fragment is included.Pst I-Sal I about 1.8 kb of pSTV29Pst I-Sal PKSR222 inserted between I sites was prepared.
[0078]
The DNA sequence of 4 (R) KAL gene contained in pKSR222 was analyzed by the dideoxy method [Proc. Natl. Sci. USA,74, 5463 (1977)]. The structural gene region of 4 (R) KAL gene is shown in SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence of 4 (R) KAL gene deduced from the DNA sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
[0079]
Example 2 Preparation of expression plasmid
In order to highly express 4 (R) KAL activity, a plasmid was constructed in which a promoter derived from the tryptophan biosynthetic enzyme gene of Escherichia coli (Trp promoter) was linked upstream of the 4 (R) KAL gene. At the same time, the DNA base sequence corresponding to the N-terminal 5 amino acids of 4 (R) KAL was changed from the sequence derived from Bacillus sp. OC187 strain to a sequence corresponding to the optimal codon of Escherichia coli.
[0080]
Corresponding to the N-terminal of the 4 (R) KAL gene, the codons corresponding to the second histidine residue, the fourth leucine residue and the fifth serine residue are the optimal codons for Escherichia coli. The oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and the oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 corresponding to the C-terminus of the 4 (R) KAL gene were synthesized according to a conventional method. . Using these oligonucleotides as primers, PCR method [R.F.Saiki etal., Science,230, 1350 (1985)], the 4 (R) KAL gene was amplified.
[0081]
That is, using pKSR222 as a template, Gene AmpTM Kit (manufactured by PerkinElmer Japan) and its DNA Thermal Cycler, a reaction process consisting of 94 ° C. for 30 seconds, 52 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute is 1 step. After 30 cycles, the reaction was carried out at 72 ° C. for 5 minutes.
After extracting the DNA fragment of about 630 bps amplified by the reaction with chloroform, the DNA fragment was purified by ethanol precipitation.
[0082]
2 μg of the DNA fragment and 331 μg of the vector plasmid pTrS described in Reference Example 1 having the Trp promoterCla I andBam After double digestion with HI, eachCla I-Bam The HI digested DNA fragment was purified by agarose electrophoresis.
After mixing both these purified fragments, ethanol precipitation was performed, and the obtained DNA precipitate was dissolved in 5 μl of distilled water, and a ligation reaction was performed to obtain recombinant DNA.
[0083]
Using the recombinant DNA, Escherichia coli ATCC 33625 strain was transformed according to the method of Maniatis et al. (Molecular Cloning, Second Edition), and then the transformant was applied to an LB agar medium containing 100 μg / ml of ampicillin, and 37 ° C. For 24 hours.
[0084]
Measurement of 4 (R) KAL synthetic activity for several grown ampicillin-resistant transformants by the same method as in Example 1 (but 100 μg / ml of ampicillin was added instead of chloramphenicol at the time of culture) did.
All the transformants had high 4 (R) KAL synthesis activity.
These transformants were shake-cultured at 37 ° C. for 16 hours in 3 ml of LB liquid medium containing 100 μg / ml of ampicillin, and the obtained culture solution was centrifuged to obtain a known method [molecular cloning. The second edition] isolated the plasmid.
[0085]
The isolated plasmids were cleaved with various restriction enzymes and the structures were examined. As a result, it was confirmed that all the plasmids had the same structure. The plasmid thus prepared was named pKSR303.
A restriction enzyme cleavage map of pKSR303 is shown in FIG.
Next, in order to introduce the 4 (R) KAL gene into a bacterium belonging to the genus Corynebacterium, the vector plasmid pCS116 [containing the plasmid can be autonomously propagated in the genus Corynebacterium.Escherichia coli KY9002 / pCS116 (FERM BP-6055)] and pKSR303 were linked.
[0086]
1 μg each of pCS116 and pKSR303 was dissolved in 45 μl of H buffer (Takara Shuzo).Bgl II was added and digestion was performed at 37 ° C. for 3 hours.
The DNA obtained by the reaction was extracted with phenol, and then the DNA fragment was obtained by ethanol precipitation.
[0087]
The DNA was dissolved in 5 μl of distilled water and subjected to ligation reaction to obtain recombinant DNA.
Using the recombinant DNA, Escherichia coli ATCC 33625 strain was transformed according to the method of Maniatis et al. (Molecular Cloning Second Edition), and the transformant was LB agar containing ampicillin 100 μg / ml and spectinomycin 100 μg / ml It was applied to the medium and cultured at 37 ° C. for 24 hours.
[0088]
In the same manner as described above, a plasmid was isolated from the grown colonies resistant to ampicillin and spectinomycin, and Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum) ATCC13032 strain was transformed.
[0089]
The transformant was adjusted to pH 7.2 by adding 20 g of a bouillon (manufactured by Kyokuto Co., Ltd.) and 5 g of yeast extract (manufactured by Kyokuto Co., Ltd.) in 1 liter of water containing 100 μg / ml of spectinomycin. The medium was added to a hardened medium] and cultured at 30 ° C. for 48 hours.
A plasmid was isolated from several colonies resistant to spectinomycin grown according to a known method (Japanese Patent Laid-Open No. 57-183799).
[0090]
The isolated plasmids were cleaved with various restriction enzymes and the structures were examined. As a result, it was confirmed that all the plasmids had the same structure. The plasmid thus prepared was named pKSR803.
A restriction enzyme cleavage map of pKSR803 is shown in FIG.
[0091]
Example 3 Production of 4 (R) KHG by various strains
ATCC11303 strain of Escherichia coli B strain, Klebsiella oxytoka (Klebsiela oxytoca) ATCC8724 strain, Serratia marcescens (Serratia marsecens) Each ATCC 13880 strain was inoculated into 3 ml of LB medium with 1 platinum loop and cultured at 28 ° C. for 12 hours.
[0092]
After culturing, each bacterial cell was obtained by centrifuging the obtained culture solution.
Each of these cells was ice-cooled 50 mM CaCl.2Each bacterial cell was obtained again by suspending in 1 ml of the solution and centrifuging these suspensions.
Each of these cells was 0.2 ml of ice-cold 50 mM. CaCl2The suspension was suspended in a 50% glycerol solution and then left on ice for 10 minutes.
[0093]
0.2 μg of pKSR303 prepared in Example 2 was added to these bacterial suspensions and allowed to stand in ice for 20 minutes, then heated at 42 ° C. for 30 seconds, 0.8 ml of LB medium was added to each, and 30 ° C. Cultured with shaking for 1 hour.
These culture solutions were applied to an LB agar medium containing 400 μg / ml ampicillin and cultured at 30 ° C. for 24 hours.
[0094]
By selecting the grown colonies, ATCC11303 strain, Klebsiella oxytoca ATCC8724 strain and Serratia marcescens ATCC13880 strain of Escherichia coli B strain strain into which pKSR303 was introduced were obtained.
Each strain of Escherichia coli ATCC 33625 strain, ATCC 11303 strain, Klebsiella oxytoca ATCC 8724 strain, Serratia marcescens ATCC 13880 strain, strains in which pKSR303 was introduced into these strains, Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain, and 3 ml of ATCC13032 strain in which pKSR803 was introduced The LB medium was shaken for 16 hours.
[0095]
To these cultures were added 30 μl of xylene, 150 μl of 2M sodium pyruvate solution, 150 μl of 2M glyoxylic acid solution (adjusted to pH 6.4 with NaOH) and shaken at 37 ° C. for 30 minutes.
The amounts of 4 (R) and 4 (S) -hydroxy-2-ketoglutar produced from the centrifugal supernatants of these reaction solutions were measured in the same manner as in Example 1.
[0096]
The results are shown in Table 1.
[0097]
[Table 1]
[0098]
Example 4 Production of 4 (R) KHG by E. coli mutants
A malate synthase activity-reduced strain was derived from the NHK43 strain having a triple deletion mutation of ppc, lip and eda in the Escherichia coli K-12 strain.
That is, the cells of the NHK43 strain cultured in an LB medium supplemented with 2 g / l glutamic acid and 100 μg / l lipoic acid were collected by centrifugation, and 0.05 M Tris-maleic acid buffer (pH 6.0) was collected. After washing with, the cell concentration is 109It was suspended in the same buffer so that it might become a cell / ml.
[0099]
To this suspension, NTG was added so as to have a final concentration of 600 mg / l, and mutation treatment was carried out by maintaining at room temperature for 20 minutes.
The mutated bacterial cells were applied to M9 minimal agar medium (Molecular Cloning Second Edition) supplemented with 0.5% glucose, 0.05 g / l glutamic acid, 100 μg / l lipoic acid, and 30 mM glyoxylic acid. For 2 days.
[0100]
Among the grown strains, the strains forming small colonies were inoculated on an LB agar medium supplemented with 2 g / l glutamic acid and 100 μg / l lipoic acid and cultured.
[0101]
M9 minimal agar medium supplemented with 0.5% glucose, 0.5 g / l glutamic acid, 100 μg / l lipoic acid and 0.5% glucose, 100 μg / l lipoic acid, 30 mM glyoxylic acid were added to the strain grown on the culture plate. A strain was selected that replicated on the added M9 minimal agar medium and grew on the former medium but could not grow on the latter medium.
[0102]
The selected strain is MS medium [glucose 3g, KH2POFour4g, (NHFour)2SOFour10g MgSOFour1g thiamine hydrochloride 100 μg, yeast extract 1g peptone 1 g lipoic acid 50 μg, CaCOThree20 g, glutamic acid 2 g in 1 liter of water and adjusted to pH 7.2] was cultured with shaking at 37 ° C.
[0103]
At the stage of culturing until the late logarithmic growth phase, the cells were collected by centrifugation, washed with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0), and crushed with an ultrasonic crusher. The cell disruption solution was centrifuged (15,000 rpm, 45 minutes), and the resulting supernatant was used as a cell extract.
The malate synthase activity of the cell extract was previously reported [Methods in Enzymology.Five, 633 (1962)], and the NHK46 strain in which the activity was not detected was selected as a target mutant.
[0104]
The NHK46 strain was transformed into a lip derived from Escherichia coli W3110 using the P1 phage transduction method [J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)].+The gene was introduced to obtain NHK48 strain that does not require lipoic acid.
PKSR222 was introduced into NHK43 strain, NHK46 strain and NHK48 strain according to the method of Maniatis et al. (Molecular Cloning 2nd Edition) (culture was performed by adding 100 μg / l lipoic acid and 2 g / l glutamic acid), and chloram Transformants were obtained using phenicol resistance as an index.
[0105]
Similarly, pKSR303 was introduced into the NHK46 strain using ampicillin resistance as an index to obtain the Escherichia coli NHK46 / pKSR303 strain.
Glucose from each transformed strain 1% calcium carbonate 2% lipoic acid 100 μg / l, glutamic acid The LB medium supplemented with 2 g / l was inoculated and cultured with shaking at 28 ° C. for 16 hours.
[0106]
Sterilize 5 ml of each of these cultures in 5 ml of T medium [glucose 50g, KH2POFour4g, (NHFour)2SOFour10g MgSOFour1g thiamine hydrochloride 10 μg yeast extract 0.2g, KCl 3g, lipoic acid 50 μg, tryptophan 250mg, CaCOThree20 g, glutamic acid 2 g in 1 liter of water and adjusted to pH 7.2], and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours, and then added with 0.25 ml of 2M glyoxylic acid solution (adjusted to pH 6.4 with NaOH). The culture was further shaken at 37 ° C. for 24 hours.
[0107]
The amount of 4 (R) KHG and 4 (S) KHG produced from the culture supernatant obtained by centrifuging these cultures was measured in the same manner as in Example 1.
The results are shown in Table 2.
Comparison of 4 (R) KHG production revealed that lipoic acid-requiring mutations and malate synthase activity-reducing mutations contribute to 4 (R) KHG production.
[0108]
[Table 2]
[0109]
Example 5 4 (R) KHG production on a jar fermenter
In the same manner as in Example 4, pKSR222 was introduced into the NHK40 strain having a double deletion mutation of lip and eda in the Escherichia coli K-12 strain, and a transformant was obtained.
[0110]
The transformant was converted to glucose 1% calcium carbonate 2% lipoic acid The LB medium supplemented with 100 μg / l was inoculated and cultured with shaking at 28 ° C. for 13 hours.
10 ml of the culture solution was added to a sterilized 1 L Erlenmeyer flask containing 200 ml of the medium having the same composition, and cultured with shaking at 28 ° C. for 13 hours.
The total amount of the culture solution was mixed with J1 medium [lactose per liter. 30g, (NHFour)2SOFour10 g, KCl 3g, KH2POFour2g, K2HPOFour2g MgSOFour1g yeast extract 0.5g tryptophan 250mg, CaCl215mg, FeSOFour・ 7aq 10 mg, MnSOFour・ 4-6aq 10 mg, NiCl21.5mg, ammonium molybdate 1.5mg, CoCl21.5mg, thiamine hydrochloride 100 μg, lipoic acid 1800 ml of a medium containing 75 μg and adjusted to pH 6.8] was added to a sterilized 5 liter jar fermenter, and the pH was kept at 6.8 with aqueous ammonia, while aeration was 2 L / min, stirring was 500 rpm, 33 Culturing was performed at a temperature of ° C.
[0111]
After 20 hours of culturing, 20 ml of xylene and 370 ml of 2M glyoxylic acid solution (adjusted to pH 6.4 with NaOH) were added to the medium, followed by further culturing at 37 ° C. for 12 hours.
The 4 (R) KHG content in the culture supernatant was measured by the same method as in Example 1.
In the culture supernatant, 299.5 mM of 4 (R) KHG was produced.
[0112]
Example 6 4 (R) HG Production
Using the P1 phage transduction method [J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)], ppc derived from Escherichia coli W3110 strain+The gene was introduced into the NHK43 strain to obtain a glutamic acid non-requiring NHK45 strain.
[0113]
PKSR222 was introduced into the strain in the same manner as in Example 4.
The NHK43 strain, the NHK46 strain, the NHK48 strain, the NHK45 strain, and the NHK46 strain carrying the pKSR303 having pKSR222 were cultured in the same manner as in Example 4, and 4 (R) HG, 4 (S) HG in these culture supernatants were cultured. Using a Lichrospher (C18) column made by Merck as a production amount, a solution containing 10 mM sodium citrate, 10 mM anhydrous sodium sulfate (pH 2.2), 0.4% n-propanol, 0.03% SDS is used as the moving bed, The eluate was post-column labeled with o-phthalaldehyde, and then analyzed by HPLC measuring fluorescence with excitation light of 350 nm and fluorescence of 448 nm, and the amount of 4 (R) HG and 4 (S) HG produced was measured.
[0114]
The results are shown in Table 3.
Comparison of 4 (R) HG production revealed that lipoic acid-requiring mutations, malate synthase activity-reducing mutations, and phosphoenolpyruvate carboxylase-deficient mutations contribute to 4 (R) HG production.
In addition, Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain carrying pKSR803 was inoculated into LB medium and cultured with shaking for 16 hours.
[0115]
5 ml of TC medium sterilized with 0.5 ml of the culture solution [glucose 100g, KH2POFour0.5g, K2HPOFour0.5g, (NHFour)2SOFour20g, MgSOFour0.25g urea 3g, biotin 100μg, corn steep liquor 5g, FeSOFour・ 7aq 10 mg, MnSOFour・ 4-6aq 5mg, CaCOThreeMedium containing 20 g in 1 liter of water and adjusted to pH 7.2], and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours. Then, 2M glyoxylic acid solution (adjusted to pH 6.4 with NaOH) was added to the culture solution. 0.25 ml was added, and the mixture was further cultured with shaking at 37 ° C. for 24 hours.
[0116]
The production amount of 4 (R) HG and 4 (S) HG in the culture supernatant was similarly measured using an ODS column.
The results are shown in Table 3.
[0117]
[Table 3]
[0118]
Example 7 Production of 4 (R) HG on a jar fermenter
Escherichia coli NHK46 strain carrying pKSR303 is glucose 1% calcium carbonate 2% lipoic acid 100 μg / l, glutamic acid The LB medium supplemented with 2 g / l was inoculated and cultured with shaking at 28 ° C. for 13 hours.
10 ml of the culture solution was added to a 1 L Erlenmeyer flask containing 200 ml of the medium having the same composition and sterilized, followed by shaking culture at 28 ° C. for 13 hours.
[0119]
The total amount of the culture solution was mixed with J2 medium [glucose per liter. 30 g, glutamic acid 12g, (NHFour)2SOFour10 g, KCl 3g, KH2POFour2g, K2HPOFour2g MgSOFour1g yeast extract 0.5g tryptophan 250 mg, isoleucine 20 mg, methionine 10 mg, CaCl215mg, FeSOFour・ 7aq 10 mg, MnSOFour・ 4-6aq 10 mg, NiCl21.5mg, ammonium molybdate 1.5mg, CoCl21.5mg, thiamine hydrochloride 100 μg, lipoic acid Medium containing 75 μg and adjusted to pH 6.8] was added to a sterilized 5 L jar fermenter containing 1800 ml and kept at pH 6.8 with aqueous ammonia, with aeration of 2 L / min, stirring at 500 rpm, 33 ° C. Cultured under conditions. After 14 hours of culture, add 2M 190 ml of a glyoxylic acid solution (adjusted to pH 6.4 with NaOH) was added, and the culture was continued for 60 hours at 37 ° C. while adding glucose as appropriate.
[0120]
The amount of 4 (R) HG in the culture supernatant was analyzed by HPLC as in Example 6.
In the culture supernatant, 117.8 mM 4 (R) HG was produced.
[0121]
Example 8 Ligation of proline synthase gene and 4 (R) KAL gene
Plasmid pPRO-11 containing the desensitized ProBA gene from E. coli [containing the plasmidEscherichia coli Acquired from ATCC33625 / pPRO11 (FERM BP-6077)]PstAfter digestion with I, the digest was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 3 kb containing the ProBA gene was isolated and purified using Prep-A-Gene DNA Purification System (manufactured by BIO-RAD).
[0122]
Plasmid pTrc99A (manufactured by Pharmacia Biotech) having this fragment and multiple cloning sitesPstA ligation reaction was performed using the digested product I, and the resulting product was used to transform E. coli ATCC 33625 strain.
The transformant was applied to an LB agar medium containing 100 μg / ml of ampicillin and cultured at 37 ° C. for 24 hours to obtain an ampicillin resistant transformant.
[0123]
These transformants were converted to glucose 0.5% thiamine hydrochloride 100 μg / l, 3,4-dehydroproline Replicated to M9 minimal agar medium supplemented with 100 mg / l.
Since a strain having a desensitized ProBA gene exhibits resistance to 100 mg / l 3,4-dehydroproline (Japanese Patent Laid-Open No. 3-26695), a strain grown in the above medium is used as a strain having a desensitized ProBA gene. Selected.
[0124]
A plasmid was extracted from the selected strain according to a conventional method, restriction enzyme analysis was performed, and pTrc99APstPKSR17 having a structure in which a DNA fragment of about 3 kb containing the ProBA gene at the I site was inserted so that the transcription direction of ProBA was forward with respect to the tac promoter of pTrc99A was obtained.
To bring the tac promoter close to the transcription start point of ProBA,EcoPartially digested with RV, andSmaAfter digestion with I, the digest was subjected to a ligation reaction and self-cyclized.
[0125]
Escherichia coli ATCC 33625 was transformed with the cyclized product.
As a result of extracting plasmids from several transformants and conducting restriction enzyme analysis, it was confirmed that all plasmids have the same structure.
The plasmid was named pKSR18.
[0126]
PKSR18EcoRI andBglDigested with II, blunt-ended using a DNA blunting kit (Takara Shuzo), and about 2 containing the ProBA gene using agarose gel electrophoresis and Prep-A-Gene DNA Purification System (BIO-RAD) A .9 kb DNA fragment was isolated and purified.
The DNA fragment and an expression vector pPAC1 having a high temperature inducible promoter [containing the plasmidEscherichia coli Acquired from KY8415 / pPAC1 (FERM BP-6054)]ClaDNA fragments digested with I and blunt-ended using a DNA blunting kit were ligated by ligation reaction.
[0127]
The ligation product is used to transform E. coli ATCC 33625 strain, a plasmid is extracted from the transformant, and inserted downstream of the high-temperature inducible promoter of pPAC1 so that the transcription direction of ProBA is the forward direction. pKSR19 was obtained.
On the other hand, it contains ProC gene of E. coliHincII-XhoI treated DNA fragment of pTrs33SmaI-SalPEproC inserted between IEcoRI andBglAfter digestion with II and blunting using a DNA blunting kit, approximately 2.1 kb containing the ProC gene from the Trp promoter using agarose gel electrophoresis and Prep-A-Gene DNA Purification System (BIO-RAD). The DNA fragment was isolated and purified.
[0128]
The DNA fragment andSphPKSR19 digested with I and blunt-ended was ligated by a ligation reaction.
The ligation product was used to transform E. coli ATCC 33625 strain.
The transformant was applied to an LB agar medium containing 100 μg / ml of ampicillin and cultured at 37 ° C. for 24 hours to obtain an ampicillin resistant transformant.
[0129]
A plasmid was extracted from the ampicillin resistant transformant, subjected to restriction enzyme analysis, a plasmid having a desensitized ProBA gene and a ProC gene was found, and named pKSR21.
The pKSR21BamAfter HI digestion and blunt endPstAfter digestion with I, a DNA fragment of about 7 kb was isolated and purified using agarose gel electrophoresis and Prep-A-Gene DNA Purification System (manufactured by BIO-RAD).
[0130]
The DNA fragment and pKSR303 prepared in Example 2EcoAfter RI digestion and blunt endPstThe DNA fragment of about 2.9 kb which had been digested with I and isolated and purified using agarose gel electrophoresis and Prep-A-Gene DNA Purification System (manufactured by BIO-RAD) was ligated by ligation reaction.
The ligation product was used to transform E. coli ATCC 33625 strain.
[0131]
The transformant was applied to an LB agar medium containing 100 μg / ml of ampicillin and cultured at 37 ° C. for 24 hours to obtain an ampicillin resistant transformant.
A plasmid was extracted from the ampicillin resistant transformant and subjected to restriction enzyme analysis to obtain a plasmid pKSR321 having desensitized ProBA, ProC gene and 4 (R) KAL gene.
[0132]
The procedure for constructing the plasmid of this example is shown in FIG.
[0133]
Example 9 4 (R) HYP Production by Glyoxylic Acid Added Culture
A mutant strain that became resistant to the proline analog azetidine-2-carboxylic acid was derived from the NHK46 strain prepared in Example 4.
That is, the NHK46 strain cultured in the same manner as in Example 4 was subjected to a mutation treatment in the same manner as in Example 4, and 0.5% glucose, 0.5 g / l glutamic acid, 100 μg lipoic acid, 100 mg azetidine-2-carboxylic acid. / L was added to M9 minimal agar medium and cultured at 37 ° C. for 2 days.
[0134]
In the culture, an azetidine-2-carboxylic acid resistant mutant NHK47 strain that grew in a large colony was obtained.
PKSR321 prepared in Example 8 was introduced into the NHK46 and NHK47 strains, and transformants were obtained using ampicillin resistance as an index. Each transformant and the NHK46 strain carrying pKSR303 (created in Example 4) were cultured in the same manner as in Example 4, and the amount of 4 (R) HYP in these culture supernatants was quantified using HPLC.
[0135]
Quantification by HPLC was performed as follows. Add 100 μl of methanol solution containing 20 μl of 1M borate buffer (pH 9.6) and 6 mg / ml NBD-Cl (7-chloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole chloride) to 80 μl of culture supernatant. The reaction is carried out at 60 ° C. for 20 minutes in the dark. The reaction was stopped by adding 50 μl of 1N HCl to the reaction solution, followed by filtration with a Millipore filter, and the filtrate was analyzed under the following conditions.
[0136]
Column: Shiseido CAPCELLPAK-C18 (4.6 x 150mm)
Mobile phase: A; 10 mM sodium citrate (pH 4),
B: Equal volume mixture of A and methanol
Flow rate: 1.5 ml / min
Temperature: 50 ° C
Mobile phase gradient time program
Time (min) B (Vol%)
0-10 0-8
10-20 8-80
20-21 80-100
21-23 100
23-24 0
Detection: Ex = 470 nm, Em = 530 nm fluorescence detection
The results are shown in Table 4.
[0137]
[Table 4]
[0138]
Example 10 4 (R) HYP Production by Two-Step Reaction
E. coli mutant EB106 deficient in isocitrate dehydrogenase [E.coli An isocitrate dehydrogenase-deficient mutation (icd) was introduced into Escherichia coli ATCC 33625 using the P1 phage transduction method from the Genetic Stock Center (distributed from Yale University, New Haven, CT, USA) to prepare the NHK3 strain. . This mutant strain shows glutamic acid requirement because of the icd mutation.
[0139]
Escherichia coli ATCC 33625 strain was transformed using pKSR19 prepared in Example 8, and Escherichia coli NHK3 strain was transformed using pKSR19 and pKSR21 prepared in Example 8, and each transformant was obtained using ampicillin resistance as an index.
In addition, it contains the glutamate dehydrogenase gene (gdh) of Escherichia coliPstI andClaContains a 4.2 kb DNA fragment flanked by I sites and the glucose-6-phosphate dehydrogenase gene (zwf) of Escherichia coliBamHI andSphA pKCYC177-derived plasmid pKSR50 (restriction enzyme map shown in FIG. 5) having a DNA fragment of about 3 kb sandwiched between I sites and having a chloramphenicol resistance gene is used. E. coli NHK3 strain (NHK3 / PKSR21 strain) was transformed, and an NHK3 strain carrying pKSR50 and pKSR21 (NHK3 / pKSR50 + pKSR21) was obtained using the resistance to both ampicillin and chloramphenicol as an index.
[0140]
In addition, pKSR50 and pKSR21 were similarly introduced into the mutant NHK23 strain having a mutant type (icd, sucA, putA, eda) in the E. coli K-12 strain, and the NHK23 / pKSR50 + pKSR21 strain was obtained.
E. coli ATCC 33625 strain, NHK3, ATCC 33625 / pKSR19 strain, NHK3 / pKSR19 strain, NHK3 / pKSR50 + pKSR21 strain and NHK23 / pKSR50 + pKSR21 strain constructed as described above were cultured in T medium at 30 ° C. for 24 hours. After that, the culture supernatant containing 4 (R) KHG prepared in Example 5 and sterilized by Millipore filtration was added so that the final concentration of 4 (R) KHG was 40 mM, and further at 37 ° C. for 24 hours. Cultured with shaking.
[0141]
The amount of 4 (R) HYP in the culture supernatant was quantified by HPLC.
The results are shown in Table 5.
Corynebacterium glutamicum KY10912 strain was cultured with shaking in LB medium for 16 hours.
0.5 ml of the culture solution was added to 5 ml of sterilized TC medium, shake-cultured at 30 ° C. for 24 hours, and then the culture supernatant containing R-KHG prepared in Example 5 was sterilized by Millipore filtration. ) The final concentration of KHG was added to 40 mM, and the mixture was further cultured with shaking at 37 ° C. for 24 hours.
[0142]
The amount of 4 (R) HYP in the culture culture supernatant was quantified by HPLC.
The results are shown in Table 5.
[0143]
[Table 5]
[0144]
Example 11 4 (R) HYP Production with Microjar Fermenter
The Escherichia coli NHK23 / pKSR50 + pKSR21 strain constructed in Example 10 was inoculated into an LB medium supplemented with 1% glucose, 2% calcium carbonate, and 2 g / l glutamic acid, and cultured with shaking at 28 ° C. for 13 hours.
0.5 ml of the culture solution was added to a sterilized 300 ml Erlenmeyer flask containing 10 ml of the medium having the same composition, and cultured with shaking at 28 ° C. for 13 hours.
[0145]
The total amount of the culture broth was added to a 200 ml jar fermenter sterilized by adding 90 ml of J2 medium excluding lipoic acid, and the pH was maintained at 6.8 with aqueous ammonia, while aeration was 200 ml / min, stirring was 800 rpm, and 33 ° C. Cultured under conditions.
[0146]
After 14 hours of culturing, the culturing temperature was raised to 40 ° C., and after further culturing for 8 hours, the culturing temperature was lowered to 37 ° C.
At 22 hours of culturing, 27 ml of the culture solution was extracted from the jar fermenter, and 27 ml of the culture supernatant containing 4 (R) KHG prepared in Example 5 was added to the jar fermenter after sterilization by Millipore [4 (R ) KHG final concentration 80 mM].
[0147]
Under the condition of 37 ° C., the culture was continued for 40 hours while appropriately adding glucose to the jar fermenter.
4 (R) HYP in the culture supernatant was analyzed by HPLC.
The culture produced 49.9 mM (6.5 g / l) of 4 (R) HYP.
[0148]
Reference Example 1 Construction of pTrS33
PTrS33 can be easily constructed according to the procedures described in JP-A-58-110600 and JP-A-2-227075. The construction method of this plasmid is shown below.
[0149]
Plasmid pKYP-1 isolated from E. coli IKYP-1 (FERM P-6926)TaqAfter partial digestion with 1,EcoA DNA fragment of about 2.6 kb containing the tryptophan promoter and the SD sequence obtained by digestion with RI was purified and obtained by agarose gel electrophoresis.
pBR322 (Takara Shuzo)TaqAfter partial digestion with 1,EcoAfter digestion with RI, a DNA fragment of about 4.33 kb was purified and obtained by agarose gel electrophoresis.
[0150]
The obtained about 2.6 kb DNA fragment and about 4.33 kb DNA fragment were ligated using T4 DNA ligase.
Using the ligated DNA, Escherichia coli C600SFS strain was transformed according to the method of Maniatis et al. [Molecular Cloning, Second Edition], spread on LB agar medium containing ampicillin and tetracycline, and incubated at 37 ° C. for 24 hours.
[0151]
Plasmid pKYP-5 was extracted and obtained from a transformant exhibiting resistance to the grown ampicillin and tetracycline.
PKYP-5HapII andHinA DNA fragment of about 340 bp was obtained by digestion with dIII.
The about 340 bp DNA fragment wasClaI andHinpKYP-10 was obtained by insertion into pBR322 digested with dIII.
[0152]
PKYP-10BanIII andNruAfter digestion with I, a DNA fragment of about 3.8 kb containing a tryptophan promoter was purified and obtained by agarose gel electrophoresis (BanIII−NruI fragment).
In order to add an ATG start codon downstream of the tryptophan promoter, two types of DNA linkers having the DNA sequences shown in SEQ ID NOs: 6 and 7 were synthesized by the triester method.
[0153]
After phosphorylating these synthetic DNA linkers using T4 polynucleotide kinase, using T4 DNA ligase, the pKYP-10-derived pKYP-10 derived above was obtained.BanIII−NruLigated with the I fragment.
The ligated DNA was used to transform E. coli strain HB101 according to the method of Maniatis et al. [Molecular Cloning, Second Edition], applied to an LB agar medium containing ampicillin, and incubated at 37 ° C. for 24 hours.
[0154]
Plasmid pTrS20 was extracted and obtained from the transformant showing resistance to the grown ampicillin.
The pTrS20SacI andPstAfter digestion with I, a DNA fragment of about 1.15 kb was purified and obtained by agarose gel electrophoresis (SacI-PstI fragment).
[0155]
PKYP26 isolated from E. coli IKYP-26 (FERM BP-863)BamAfter digestion with HI, a DNA fragment of about 1.7 kb was purified and obtained by agarose gel electrophoresis (BamHI fragment).
M13mp18RF DNA (Takara Shuzo)SacI andClaAfter digestion with I, a DNA fragment of about 0.65 kb was purified by agarose gel electrophoresis (SacI-ClaI fragment).
[0156]
Furthermore, two types of DNA linkers having the DNA sequences shown in SEQ ID NOs: 8 and 9 were synthesized using an Applied Biosystems 380A DNA synthesizer and phosphorylated using T4 polynucleotide kinase.
Derived from pTrS20 obtained aboveSacI-PstI fragment, derived from pKYP26BamHI fragment, derived from M13mp18RF DNASacI-ClaThe above two synthetic DNAs, which were I fragment and 5 'phosphorylated, were ligated using T4 DNA ligase.
[0157]
Using the ligated DNA, E. coli ATCC33625 strain was transformed according to the method of Maniatis et al. [Molecular Cloning 2nd Edition], applied to LB agar medium containing ampicillin, and incubated at 37 ° C. for 24 hours.
Plasmid pTrS33 was extracted and obtained from a transformant exhibiting resistance to the grown ampicillin.
[0158]
【The invention's effect】
According to the present invention, 4 (S) -hydroxy-2-ketoglutaric acid is not produced from glyoxylic acid and pyruvic acid, and enzyme 4 (catalyzing a reaction producing only 4 (R) -hydroxy-2-ketoglutaric acid ( R) -hydroxy-2-ketoglutarate aldolase, DNA encoding the enzyme, recombinant DNA obtained by incorporating the DNA into a vector, transformant obtained by introducing the recombinant DNA into a host cell, A method for producing 4 (R) KHG, 4 (R) HG or 4 (R) HYP using the transformant can be provided.
[0159]
Moreover, the manufacturing method of 4 (R) HYP using the biocatalyst which has the activity which produces | generates 4 (R) HYP from an amino group donor and 4 (R) KHG can be provided.
[0160]
[Sequence Listing]
[0161]
[0162]
[0163]
[0164]
[0165]
[0166]
[0167]
[0168]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is cloned on pKSR201Bacillus It is the figure which showed the restriction enzyme map of D piece derived from sp.OC187 strain.
FIG. 2 is a diagram showing a restriction enzyme map of pKSR303.
FIG. 3 is a diagram showing a restriction enzyme map of pKSR803.
FIG. 4 is a diagram showing the creation procedure and structure of pKSR19, pKSR21, and pKSR321.
FIG. 5 is a diagram showing a restriction enzyme map of pKSR50.
[Explanation of symbols]
Amp: Ampicillin resistance gene derived from pBR322
Ptrp: Tryptophan promoter
4 (R) KAL: gene encoding 4-hydroxy-2-ketoglutarate aldolase
Spc: spectinomycin resistance gene
laclq: Overproduced lac repressor gene
Ptac: tac promoter
ProBAR: Mutation of Proline Biosynthesis Gene ProBA
PpL: lambda phage derived pL promoter
ProC: Proline biosynthesis gene ProC
ZWF: Glucose-6 phosphate dehydrogenase gene
GDH: Glutamate dehydrogenase gene
Cm: Chloramphenicol resistance gene
ori177: pACYC177 replication origin
Claims (20)
（１）受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４６４６から得られる下記の制限酵素地図で表されるＤＮＡ断片中の配列番号２で表される塩基配列を含むＰｓｔＩ−ＳａｌＩ断片をｐＳＴＶ２９のＰｓｔＩ−ＳａｌＩサイト間に挿入して得られるｐＫＳＲ２２２
（３）下記の構造を有するｐＫＳＲ３２１
(1) Insert a PstI-SalI fragment containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the DNA fragment represented by the following restriction enzyme map obtained from the accession number FERM BP-4646 between the PstI-SalI sites of pSTV29 PKSR222 obtained
(3) pKSR321 having the following structure
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