JP4053616B2 - Search method of antisense homology box in protein molecule - Google Patents

Description

上記表および本明細書においては、アミノ酸は一文字標記にて表す。また、各数値はアミノ酸のハイドロパシーを示す。
【０００８】
本発明はタンパク質分子内において、アミノ酸配列がセンス−アンチセンスの関係にある部分を上記表に記載した対応関係に基づき、アミノ酸レベルで検索する、タンパク質分子内アンチセンスホモロジーボックスの検索方法を提供する。
【０００９】
便宜上移動フレームを設定するタンパク質をタンパク質１と、移動フレームと比較するタンパク質をタンパク質２として説明すれば、本発明はより詳細には以下の工程：
【００１０】
１）タンパク質１のアミノ酸配列上、予め定めた個数のアミノ酸からなる移動フレームを該配列のＮ末端に設定する；
２）移動フレームのアミノ酸配列を、タンパク質分子２のアミノ酸配列とＮ末端から順に比較し、タンパク質分子２のアミノ酸配列上で設定個数以上のアミノ酸が該移動フレームと上記表に記載の関係にある部分を抽出してアンチセンスフレームとする；
３）タンパク質分子２のアミノ酸配列のＮ末端まで比較した後、移動フレームをタンパク質分子２のＣ末端から逆向きの配列と順に比較し、２）と同様にしてアンチセンスフレームを抽出する；
４）移動フレームをタンパク質分子１上アミノ酸一つ移動させて２）および３）を繰り返す；
５）移動フレームがタンパク質分子１のアミノ酸配列のＣ末端に達するまで４）を繰り返す；
６）相対するアンチセンスフレームの複数集積して持つ部分をアンチセンスホモロジーボックスとする
を含む方法である。工程の概念図を図２に示した。本発明のごとくタンパク質内のアンチセンスホモロジーボックスを検索する場合にはタンパク質２はタンパク質１の同一コピーである。
【００１１】
得られるアンチセンスフレームを持つペプチドフレームは単独で存在するものも、アミノ酸数個分フレームが移動して重複しているものもある（図３参照）。本明細書において、これらのフレーム単独あるいは重複部分を「アンチセンスホモロジーボックス」という。アンチセンスホモロジーボックスは原型タンパク質分子内でペプチドの読み取り方向にかかわりなくお互いにアンチセンスの関係にある部分であるが、１個だけでなく複数のアンチセンスホモロジーボックスとアンチセンスであっても、当該アンチセンスホモロジーボックス自身とアンチセンスであってもよい（図４参照）。
【００１２】
本発明の方法によって得られるアンチセンスホモロジーボックスは相互に親和性を有し、タンパク質分子の三次元構造に深くかかわっていることが予測される。従って、本発明の方法により得られるアンチセンスホモロジーボックスのアミノ酸配列を有するペプチドを原型としたタンパク質と同一系内に存在させれば、該タンパク質の三次元構造に影響を及ぼし、その結果として該タンパク質本来の生理活性が変化すると考えられる。従って、本発明はさらに分子内アンチセンスホモロジーボックスを検索することを含むに基づいた生理活性ペプチドの設計方法も提供する。
【００１３】
すなわち本発明はタンパク質分子内において、アミノ酸配列がセンス−アンチセンスの関係にある部分を上記表に基づきアミノ酸レベルで検索することを含む、生理活性ペプチドの設計方法も提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の方法においては表１の関係に基づき、タンパク質分子内におけるアンチセンスアミノ酸の検索を行う。検索のためには、目的とするタンパク質のアミノ酸配列をあらかじめ決定しておくことが必要である。アミノ酸配列は、データーベースとして当業者の利用に供されているアミノ酸配列や、ｃＤＮＡから得られるアミノ酸配列を用いる他、従来から当業者に知られているいずれの方法を用いて決定したものであってもよい。
【００１５】
検索時に設定する移動フレームのアミノ酸の個数としては、６個から１５個程度の範囲で定める。６〜１５個としたのは、例えば抗原ペプチドとしてＴ細胞レセプター等に提示されるペプチドが１０個程度のアミノ酸であり、アミノ酸１０個程度のペプチドが構造情報を十分保持しているという知見に基づく。移動フレームのアミノ酸数を１０個とするのが最も好ましい。移動フレームのアミノ酸数を１０アミノ酸とするとき、これに対しアンチセンスの関係にあるアミノ酸の数が８個以上の場合にアンチセンスフレームと規定すれば、８０％以上の相補性を有するアンチセンスフレームが得られる。複数のアンチセンスフレームを持つ部分は特に分子内での相互作用にかかわっている可能性が高いと考えられ、かかる部分をアンチセンスホモロジーボックスとする。
【００１６】
実際の検索は、上記手順に基づいたコンピュータープログラムを作成し、必要なデータを読み込んで行えばよい。本発明者らは、ＩＢＭ社のパーソナルコンピューター上で稼働するプログラムであるＡＮＴＩＳを作成し、さまざまな解析を行った。本発明者らが移動フレームのアミノ酸を１０、移動フレームとアンチセンスの関係にあるアミノ酸が８個以上の場合をアンチセンスフレームであるととして、様々なタンパク質を用いて行った予備試験によれば、タンパク質の長さに関係なく、平均１４アミノ酸からなるアンチセンスホモロジーボックスが分子内に平均５０アミノ酸からなる非アンチセンス部分を挟んで存在していることがわかった。
【００１７】
本発明のタンパク質分子内のアンチセンスホモロジーボックスを検索することを含む、生理活性ペプチドの設計方法において、目的とする生理活性は原型タンパク質の活性に対して何らかの変化を及ぼす活性である。本発明において、原型として用いるタンパク質としては何らかの生理活性を示すタンパク質例えば、酵素、受容体、抗体、リンホカイン、サイトカイン、増殖因子、細胞内情報伝達物質、遺伝子発現制御タンパク質等が挙げられるが、これらに限定されない。期待される生理活性としては、かかる原型として用いるタンパク質の三次元構造を変化させることによる活性の阻害、あるいは活性部位の露出による活性の増強や改変等が挙げられる。
【００１８】
本発明の生理活性ペプチドの設計方法においては、ペプチドの設計はアンチセンスホモロジーボックスのアミノ酸配列そのものからなるペプチドを用いる場合のみならず、該ペプチドを改変させる場合も含む。
【００１９】
本発明の設計方法において用いるペプチドの改変方法としては、アンチセンスホモロジーボックスが繰り返される配列のペプチドを作成するような方法の他に、上記表に示したごときアンチセンスアミノ酸の関係にあるアミノ酸はハイドロパシーについても相補的であるという関係から、ハイドロパシーの平均値を維持して実際の分子内の環境に近づけるため、アンチセンスホモロジーボックスに隣接する部分のアミノ酸配列を付け加えた配列としてもよい。さらに、アンチセンスホモロジーボックス内のアミノ酸を同様のハイドロパシーを示すアミノ酸で置換してもよい。
【００２０】
更に同様の目的を達するためにアミノ酸等を化学修飾してもよい。また、タンパク質分解酵素の作用によりペプチドが分解されるのを防ぐために、Ｄ体のアミノ酸を用いてペプチドを合成したり、アミノ酸の化学修飾をすることも有用な手段となる。
【００２１】
本発明の設計方法によってなされた設計に基づいて、ペプチドを合成する。ペプチドの合成は、化学合成、遺伝子組換法で遺伝子導入した微生物による合成、遺伝子導入した培養細胞により産生させる等々の従来知られているかあるいは将来的に開発されるいかなる方法を用いてもよい。得られたペプチドについては、各タンパク質の活性に及ぼす効果を検出する。本願発明の方法によって、原型としたタンパク質に親和性が高く、タンパク質の生理活性に対して何らかの作用を及ぼすペプチドが得られることが予想される。この作用を検出するためには、原型タンパク質への親和性を評価する他に、原型タンパク質の活性に応じて試験すればよい。例えばエンドセリンレセプター分子内アンチセンスホモロジーボックスから誘導されたペプチドについては、エンドセリンとの結合、エンドセリンにより収縮させた血管平滑筋細胞に対する弛緩作用等を調べればよい。また、Ｃ５ａレセプター由来のペプチドには、Ｃ５ａへの親和性やＣ５ａの活性である細胞内カルシウム濃度の増大、細胞の脱顆粒化等を制御する効力について調べるればよい。もちろん、本願発明の生理活性を有するペプチドはこれらの活性の変化に限定されるべきではなく、現在知られており、または将来明らかにされるすべてのタンパク質に及ぶ。
以下実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【００２２】
【実施例１】
１）Ａ型ヒトエンドセリンレセプター内のアンチセンスホモロジーボックスの検索
ヒトＡ型エンドセリンレセプターのアミノ酸配列に対し、本発明の方法により移動フレームのアミノ酸数を１０とし、アミノ酸レベルで８０％以上の相補性を示すアンチセンスホモロジーボックスを検索した。検索にはＡ型ヒトエンドセリンレセプターをコードするｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列（Biochem. Biophys. Res. Commun., 180, 1265-1272(1991)参照)を用いて行った。
【００２３】
７つのアンチセンスホモロジーボックスが得られたが、アミノ末端領域（アミノ酸１２から２４）にある第１のアンチセンスホモロジーボックスはタンパク質の合成の後に除かれるため、天然のレセプター内に存在するのは６つのボックスである。第２及び第３のボックスはアミノ酸５５から６４および７４から８０であり、細胞外に位置していた。第４のアンチセンスホモロジーボックスはアミノ酸１１７〜１９１を含む。第４のアンチセンスホモロジーボックスは自分自身を含むほとんどすべてのアンチセンスホモロジーボックスに対して相補的であった。第５番目及び６番目のボックスは細胞膜透過領域に存在すると考えられる。カルボキシ末端側のボックスは３８６位のアミノ酸から始まり、最後の２つを除く残りの配列を含んでいた。
【００２４】
上記のうち、最も活性が強いと考えられる第４のアンチセンスホモロジーボックスから誘導されたペプチド、すなわちＮＨ₂−ＣＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷ−ＣＯＯＨを選んだ。
【００２５】
２）ペプチドの改変
得られたＮＨ₂−ＣＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷ−ＣＯＯＨペプチド（ＥＴＲ−Ｐ１と名付ける）に基づき２つのペプチドをデザインした。第１はＥＴＲ−Ｐ１の両端に、エンドセリンレセプターＡのアミノ酸配列においてＥＴＲ−Ｐ１に隣接するアミノ酸を４個ずつ付加したペプチド（ただし、アミノ酸の性質を考慮してＣ末端のＱをＩに置換した）（ＥＴＲ−Ｐ１／ｆ１）および第２はＥＴＲ−Ｐ１／ｆ１のアミノ酸配列を逆向きとした配列（ＥＴＲ−Ｐ１／ｒｅ）である。以下に改変ペプチドのアミノ酸配列を示す：
ＥＴＲ−Ｐ１／ｆ１：ＮＨ₂−ＶＬＮＬＣＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷＳＲＶＩ−ＣＯＯＨ
ＥＴＲ−Ｐ１／ｒｅ：ＮＨ₂−ＩＶＲＳＷＳＡＶＡＲＹＲＤＶＳＬＡＣＬＮＬＶ−ＣＯＯＨ
【００２６】
上記３つのアミノ酸配列に基づいてペプチドを合成した。ペプチドの合成はぺプチドシンセサイザー（ＰＥＰＴＩＣＯＵＰＬＥＲ ２２００：ベガ社製）を用いて固相法により行った。得られたペプチド樹脂を無水弗化水素により処理して樹脂よりペプチドの切り出しおよび脱保護を行った後、酢酸−アセトニトリル−水（１：２：２）で抽出、高速液体クロマトグラフィーによる精製を行い、アミノ酸分析によって確認した。
【００２７】
３）エンドセリンによるラット血管平滑筋収縮に対するペプチドの効果
オスWistarラット(２２０〜３５０ｇ，７〜９週令)の大腿動脈を採取し、螺旋状に切り取って長さ２０ｍｍ幅１.４ｍｍの標本を作成した。得られた標本を張力測定器にセットし、Krebs-Henseleit Bicarbonate緩衝液２０ｍｌ中に浸漬し、静止張力として５００ｍｇを負荷した。
【００２８】
エンドセリン−１を最終濃度が１０^-9Ｍとなるように緩衝液へ添加し、標本の収縮が一定となったところで各ペプチドを累積的に添加して血管の弛緩を調べた。最終的に平滑筋弛緩剤であるパパベリンを最終濃度１０^-4Ｍとなるよう添加して標本を完全に弛緩させ、これを弛緩率１００％としてペプチドによる弛緩率を求めた。結果を図５に示した。この結果から、ＥＴＲ−Ｐ１がエンドセリンの平滑筋収縮作用を阻害すること、およびＥＴＲ−Ｐ１／ｆ１およびＥＴＲ−Ｐ１／ｒｅがそれぞれＥＴＲ−Ｐ１より強い活性を示すことがわかる。
【００２９】
４）細胞内Ａ型エンドセリンレセプターへのエンドセリン結合促進作用
Ａ型エンドセリンレセプター（ＥＴＲ−Ａ）を発現している細胞である３Ｔ３細胞に、¹²⁵Ｉを標識したエンドセリンー１（ＥＴ−１）を作用させれば、ＥＴ−１の結合を¹²⁵Ｉの放射性活性で測定し得る。この系に非標識のＥＴ−１を添加すればその量に応じて競合阻害が起こり、¹²⁵Ｉ−ＥＴ−１が細胞に吸着しなくなる。ＥＴ−１の競合阻害物質として知られるＢＱ１２３を系に添加しても同様の効果が認められる。
【００３０】
この系に上記で得たＥＴＲ−Ｐ１／ｆ１を添加したところ、測定された¹²⁵Ｉの活性は上昇し、¹²⁵Ｉ−ＥＴ−１の細胞への結合の促進が認められた。
この結果より、ＥＴＲ−Ｐ１／ｆ１はＡ型エンドセリンレセプターに作用させると立体構造を変化させ、ＥＴＲ−Ａのシグナル伝達機能を失わせる一方、ＥＴ−１の結合性を高めるものであると考えられる。
【００３１】
５）インビボにおける効果
ＥＴＲ−Ｐ１／ｆ１の生体内における作用を調べた。
ラットに細菌の菌体内毒素であるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を投与すると、エンドトキシンショックとして致死的血圧低下が誘導される。これに対してＬＰＳ投与の前に予めＥＴＲ−Ｐ１／ｆ１を５０μｇ／ｋｇ血管内投与した群においては血圧低下を顕著に防止した。
同様の実験をイヌを用いて行った。ＬＰＳの持続投与を開始した１５分後にＥＴＲ−Ｐ１／ｆ１を投与した場合にも血圧低下に対する抑制効果が認められた。
【００３２】
【実施例２】
１）Ｃ５ａレセプターのアンチセンスホモロジーボックスの検索
補体の活性フラグメントであるＣ５ａはアナフィラトキシンとも呼ばれる。このＣ５ａに対する細胞膜上のレセプターであるＣ５ａレセプター（Ｃ５ａＲ）の分子内アンチセンスホモロジーボックスを、実施例１と同様にして検索した。得られたアンチセンスホモロジーボックスから分子内の複数部分と相互にアンチセンスの関係にあることから分子内で中心的役割を果たしていると考えられるアンチセンスホモロジーボックスとしてＮＨ₂−ＬＲＴＷＳＲＲＡＴＲＳＴＫＬＫＶＶ−ＣＯＯＨ（ＰＲ２２７と名付ける）を選択し、実施例１と同様にして合成した。
【００３３】
２）細胞のカルシウムインフラックスに及ぼす影響
培養細胞株であるＵ９３７細胞にジブチルｃＡＭＰを添加して培養すると貪食細胞へと分化し、Ｃ５ａＲを細胞膜上に発現するようになる。この細胞にＣ５ａを作用させると細胞が活性化され、カルシウムインフラックスを生じることが知られている。
【００３４】
Ｃ５ａＲを発現させた細胞へ、１０^-11Ｍ以下の濃度のＣ５ａを単独で添加してもカルシウムインフラックスはほとんど生じなかった。この系に対してＰＲ２２７を添加するとＣ５ａに対する感受性が増強され、顕著なカルシウムインフラックスが認められた（図６参照）。一方、Ｃ５ａを添加せずＰＲ２２７のみを添加した場合にはカルシウムインフラックスの変化は全く認められなかった。
この結果より、ＰＲ２２７はＣ５ａＲに作用してその分子立体構造に変化を及ぼし、Ｃ５ａとの反応性を高めるような分子変換を生じさせたものと考えられる。
【００３５】
【発明の効果】
本発明の方法により、アミノ酸レベルにおける検索によりタンパク質分子内でセンス−アンチセンスの関係を有する領域を検索することが可能となった。本発明の方法で検索されたタンパク質の分子内センスーアンチセンスの関係を有する領域であるアンチセンスホモロジーボックスは、当該タンパク質に対して特異的に作用する、生理活性ペプチドの設計に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 センスペプチドとアンチセンスペプチドの関係を示す図である。
【図２】 本発明の検索方法の概念図である。
【図３】 本発明のアンチセンスホモロジーボックスの概念図である。
【図４】 本発明のタンパク質分子内アンチセンスホモロジーボックスの相互関係を示す図である。
【図５】 実施例１（４）の結果を示す図である。
【図６】 実施例２（２）の結果を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for searching regions that are in an antisense relationship with each other in a protein molecule and a method for designing a bioactive peptide based on the method.
[0002]
[Prior art]
Not only the primary sequence of amino acids but also the three-dimensional structure depending on the noncovalent interaction greatly contributes to the activity of the protein. It is known that hydrogen bonds, hydrophobic interactions, ionic bonds, van der Waals attractive forces and the like are involved in this three-dimensional structure. In addition to these, it has been reported that the peptides that have a sense-antisense relationship in the protein molecule recognize and bind to each other and contribute to the three-dimensional structure of the protein. Here, the peptide in the sense-antisense relationship means the relationship of peptides (antisense peptides) consisting of amino acids encoded by the paired strands of DNA encoding a certain peptide (sense peptide) (see FIG. 1). ).
[0003]
The details of the recognition mechanism of the peptide in the sense-antisense relationship have not been clarified yet. It has been reported that the amino acid encoded by the antisense codon (antisense amino acid) of the codon encoding the hydrophilic amino acid is a hydrophobic amino acid and vice versa (Bralock et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 121, 203-207 (1984) and the same, Trends. Biotech. 6,140-144 (1991)), and the same complementarity is recognized also in the case of a codon which shows an amino acid with low hydrophilicity. Thus, it has been reported that there is a significant correlation (r = 0.74) in the hydropathy between the amino acids encoded by the paired DNA, and the complementarity of such hydropathy is between the sense and antisense peptides. It is thought to be related to the affinity of. Further, there is a report that the higher the complementarity of the average value of hydropathy between peptides, the higher the affinity between the peptides. A method for designing a peptide having affinity for a protein based on the hydropathic theory has been proposed (Japanese Patent Publication No. 62-502513).
[0004]
In recent years, in order to analyze protein activity, etc., DNA sequences having such a sense-antisense relationship have been searched for in protein molecules or between corresponding proteins such as a ligand and its receptor. .
However, as is well known, a DNA codon encoding an amino acid is composed of three nucleic acids, but since there are a plurality of codons encoding one amino acid, there are a plurality of amino acids as antisense amino acids. Therefore, in the search, when comparing at the amino acid level, even if it corresponds to an antisense amino acid, it is often not determined to be an antisense portion when compared at the nucleic acid level.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for searching a region having a sense-antisense relationship in a protein molecule by searching at an amino acid level. Furthermore, an object of the present invention is to provide a method for designing a bioactive peptide that specifically acts on a certain protein.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present invention is characterized in that complementary amino acids are searched not at the nucleic acid level but at the amino acid level. This is based on mutations in the genetic code, for example, GUU, GUC, GUG and GUA are codons encoding valine, and complementary codons thereto are AAC, GAC, CAC and UAC, respectively, Asn, Encodes Asp, His, and Tyr. In other words, these four amino acids are the amino acids that are in the antisense relationship with Val at the amino acid level. The correspondence of amino acids that become sense-antisense relationships due to such nucleic acid code mutations is shown below:
[0007]
[Table 4]

In the above table and this specification, amino acids are represented by single letter symbols. Moreover, each numerical value shows the hydropathy of an amino acid.
[0008]
The present invention provides a method for searching an intramolecular protein homology box, wherein a part of an amino acid sequence in a protein molecule is searched at the amino acid level based on the correspondence described in the above table. .
[0009]
For convenience, if the protein that sets the movement frame is described as protein 1 and the protein that is compared with the movement frame is protein 2, the present invention will be described in more detail in the following steps:
[0010]
1) A movement frame consisting of a predetermined number of amino acids on the amino acid sequence of protein 1 is set at the N-terminus of the sequence;
2) The amino acid sequence of the moving frame is compared with the amino acid sequence of protein molecule 2 in order from the N-terminus, and the amino acid sequence of protein molecule 2 has a number of amino acids greater than the set number in the relationship described in the above table with the moving frame. Is extracted as an antisense frame;
3) After comparing the amino acid sequence of protein molecule 2 up to the N-terminus, the migration frame is compared with the reverse sequence from the C-terminus of protein molecule 2 and the antisense frame is extracted in the same manner as in 2);
4) Move the movement frame one amino acid on protein molecule 1 and repeat 2) and 3);
5) Repeat 4) until the movement frame reaches the C-terminus of the amino acid sequence of protein molecule 1;
6) A method including an antisense homology box in which a plurality of opposing antisense frames are accumulated. A conceptual diagram of the process is shown in FIG. When searching for an antisense homology box within a protein as in the present invention, protein 2 is the same copy of protein 1.
[0011]
Some of the resulting peptide frames having an antisense frame are present alone, while others are shifted by several amino acid frames (see FIG. 3). In this specification, these single frames or overlapping portions are referred to as “antisense homology boxes”. An antisense homology box is a portion in the original protein molecule that is in an antisense relationship with each other regardless of the reading direction of the peptide, but not only one but also a plurality of antisense homology boxes and antisense The antisense homology box itself and antisense may be used (see FIG. 4).
[0012]
It is expected that the antisense homology box obtained by the method of the present invention has affinity for each other and is deeply related to the three-dimensional structure of the protein molecule. Therefore, if the peptide having the amino acid sequence of the antisense homology box obtained by the method of the present invention is present in the same system as the original protein, it affects the three-dimensional structure of the protein, and as a result, the protein It is thought that the original physiological activity changes. Therefore, the present invention further provides a method for designing a bioactive peptide based on including searching for an intramolecular antisense homology box.
[0013]
That is, the present invention also provides a method for designing a physiologically active peptide, which comprises searching a part of a protein molecule where the amino acid sequence has a sense-antisense relationship based on the above table at the amino acid level.
[0014]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the method of the present invention, the search for antisense amino acids in protein molecules is performed based on the relationship shown in Table 1. For the search, it is necessary to determine the amino acid sequence of the target protein in advance. The amino acid sequence was determined using any method known to those skilled in the art, in addition to the amino acid sequence used for those skilled in the art as a database or the amino acid sequence obtained from cDNA. May be.
[0015]
The number of amino acids in the moving frame set at the time of search is determined in the range of about 6 to 15. The reason why the number is 6 to 15 is based on the knowledge that, for example, the peptide presented to the T cell receptor or the like as an antigen peptide is about 10 amino acids, and the peptide of about 10 amino acids has sufficient structural information. . Most preferably, the moving frame has 10 amino acids. When the number of amino acids in the moving frame is 10 amino acids, if the number of amino acids in the antisense relationship is 8 or more, and defined as an antisense frame, an antisense frame having 80% or more complementarity Is obtained. It is considered that a portion having a plurality of antisense frames is particularly likely to be involved in the interaction within the molecule, and such a portion is referred to as an antisense homology box.
[0016]
The actual search may be performed by creating a computer program based on the above procedure and reading the necessary data. The present inventors created ANTIS, which is a program that runs on an IBM personal computer, and performed various analyses. According to preliminary tests conducted using various proteins, the present inventors considered that the amino acid in the moving frame is 10 and the case where there are 8 or more amino acids in the antisense relationship with the moving frame is the antisense frame. Regardless of the length of the protein, it was found that an antisense homology box consisting of an average of 14 amino acids was present in the molecule with a non-antisense portion consisting of an average of 50 amino acids in between.
[0017]
In the method for designing a bioactive peptide including searching for an antisense homology box in the protein molecule of the present invention, the target bioactivity is an activity that causes some change to the activity of the prototype protein. In the present invention, the protein used as a prototype includes proteins exhibiting some physiological activity, such as enzymes, receptors, antibodies, lymphokines, cytokines, growth factors, intracellular signaling substances, gene expression control proteins, and the like. It is not limited. Expected physiological activities include inhibition of activity by changing the three-dimensional structure of the protein used as the prototype, or enhancement or modification of activity by exposure of the active site.
[0018]
In the method for designing a physiologically active peptide of the present invention, the peptide design includes not only the case of using a peptide consisting of the amino acid sequence of the antisense homology box itself but also the case of modifying the peptide.
[0019]
As a method for modifying peptides used in the designing method of the present invention, in addition to a method of creating a peptide having a sequence in which an antisense homology box is repeated, amino acids having a relationship with antisense amino acids as shown in the above table are hydrolyzed. In order to maintain the average value of hydropathy and bring it closer to the environment in the molecule, the sequence may be a sequence in which the amino acid sequence adjacent to the antisense homology box is added. Furthermore, amino acids in the antisense homology box may be substituted with amino acids that exhibit similar hydropathy.
[0020]
Furthermore, amino acids and the like may be chemically modified to achieve the same purpose. In addition, in order to prevent the peptide from being degraded by the action of proteolytic enzymes, it is also useful means to synthesize a peptide using a D-form amino acid or chemically modify the amino acid.
[0021]
Peptides are synthesized based on the design made by the design method of the present invention. For peptide synthesis, any conventionally known method such as chemical synthesis, synthesis by a microorganism introduced with a gene recombination method, or production by a cultured cell into which a gene has been introduced may be used. About the obtained peptide, the effect on the activity of each protein is detected. By the method of the present invention, it is expected that a peptide having high affinity for the original protein and having some effect on the physiological activity of the protein can be obtained. In order to detect this effect, in addition to evaluating the affinity for the prototype protein, it may be tested according to the activity of the prototype protein. For example, for a peptide derived from an endothelin receptor intramolecular antisense homology box, binding to endothelin, relaxation of vascular smooth muscle cells contracted by endothelin, etc. may be examined. In addition, the C5a receptor-derived peptide may be examined for its affinity for C5a, the increase in intracellular calcium concentration, which is the activity of C5a, and the ability to control degranulation of cells. Of course, the peptides with physiological activity of the present invention should not be limited to these changes in activity, but extend to all proteins now known or revealed in the future.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
[0022]
[Example 1]
1) Search for antisense homology box in type A human endothelin receptor For the amino acid sequence of human type A endothelin receptor, the number of amino acids in the moving frame is set to 10 by the method of the present invention, and complementation of 80% or more at the amino acid level is achieved. The antisense homology box shown was searched. The search was carried out using an amino acid sequence deduced from cDNA encoding type A human endothelin receptor (see Biochem. Biophys. Res. Commun., 180, 1265-1272 (1991)).
[0023]
Seven antisense homology boxes were obtained, but the first antisense homology box in the amino-terminal region (amino acids 12 to 24) is removed after protein synthesis, so that there are 6 in the natural receptor. Is one box. The second and third boxes were amino acids 55 to 64 and 74 to 80 and were located extracellularly. The fourth antisense homology box contains amino acids 117-191. The fourth antisense homology box was complementary to almost all antisense homology boxes including itself. The fifth and sixth boxes are thought to exist in the cell membrane permeation region. The carboxy terminal box started at amino acid 386 and contained the remaining sequence except the last two.
[0024]
Among the above, a peptide derived from the fourth antisense homology box considered to be the most active, namely NH ₂ -CALSVDRYRAVASW-COOH, was selected.
[0025]
2) were designed two peptides based on the modified resulting NH ₂ -CALSVDRYRAVASW-COOH peptide of the peptide (designated ETR-P1). The first is a peptide in which 4 amino acids adjacent to ETR-P1 in the amino acid sequence of endothelin receptor A are added to both ends of ETR-P1 (however, the C-terminal Q is replaced with I in consideration of the amino acid properties). ) (ETR-P1 / f1) and the second is a sequence (ETR-P1 / re) in which the amino acid sequence of ETR-P1 / f1 is reversed. The amino acid sequence of the modified peptide is shown below:
_{ETR-P1 / f1: NH 2} -VLNLCALSVDRYRAVASWSRVI-COOH
_{ETR-P1 / re: NH 2} -IVRSWSAVARYRDVSLACLNLV-COOH
[0026]
Peptides were synthesized based on the above three amino acid sequences. Peptide synthesis was performed by a solid phase method using a peptide synthesizer (PEPTICOPLER 2200: manufactured by Vega). The obtained peptide resin was treated with anhydrous hydrogen fluoride to cleave and deprotect the peptide from the resin, followed by extraction with acetic acid-acetonitrile-water (1: 2: 2) and purification by high performance liquid chromatography. Confirmed by amino acid analysis.
[0027]
3) Effect of peptide on rat vascular smooth muscle contraction induced by endothelin The femoral artery of male Wistar rats (220-350g, 7-9 weeks old) was collected and cut into a spiral shape to prepare a specimen 20mm long and 1.4mm wide. did. The obtained specimen was set in a tension measuring instrument, immersed in 20 ml of Krebs-Henseleit Bicarbonate buffer, and 500 mg was applied as a static tension.
[0028]
Endothelin-1 was added to the buffer so that the final concentration was 10 ^-9 M, and when the sample contraction was constant, each peptide was added cumulatively to examine the relaxation of blood vessels. Finally, papaverine, which is a smooth muscle relaxant, was added to a final concentration of 10 ⁻⁴ M to completely relax the specimen, and the relaxation rate by the peptide was determined with this relaxation rate of 100%. The results are shown in FIG. From this result, it can be seen that ETR-P1 inhibits the smooth muscle contraction action of endothelin, and that ETR-P1 / f1 and ETR-P1 / re each show stronger activity than ETR-P1.
[0029]
4) Promoting endothelin binding to intracellular A-type endothelin receptor By causing ¹²⁵ I-labeled endothelin-1 (ET-1) to act on 3T3 cells, which are expressing the A-type endothelin receptor (ETR-A) The binding of ET-1 can be measured with a radioactivity of ¹²⁵ I. If unlabeled ET-1 is added to this system, competitive inhibition occurs depending on the amount, and ¹²⁵ I-ET-1 does not adsorb to the cells. The same effect is observed when BQ123, known as a competitive inhibitor of ET-1, is added to the system.
[0030]
When ETR-P1 / f1 obtained above was added to this system, the measured ¹²⁵ I activity was increased, and ¹²⁵ I-ET-1 binding to the cells was promoted.
From this result, it is considered that when ETR-P1 / f1 acts on the A-type endothelin receptor, the steric structure is changed and the signaling function of ETR-A is lost, while the binding of ET-1 is enhanced. .
[0031]
5) Effect in vivo The action of ETR-P1 / f1 in vivo was examined.
Administration of lipopolysaccharide (LPS), a bacterial endotoxin, to rats induces a lethal hypotension as an endotoxin shock. On the other hand, in the group in which 50 μg / kg ETR-P1 / f1 was administered intravascularly before LPS administration, blood pressure decrease was remarkably prevented.
A similar experiment was performed using dogs. An inhibitory effect on blood pressure reduction was also observed when ETR-P1 / f1 was administered 15 minutes after the start of continuous administration of LPS.
[0032]
[Example 2]
1) Searching for antisense homology box of C5a receptor C5a, an active fragment of complement, is also called anaphylatoxin. The intramolecular antisense homology box of C5a receptor (C5aR), which is a receptor on the cell membrane for C5a, was searched in the same manner as in Example 1. From the obtained antisense homology box, NH ₂ -LRTWSRRATRSKLKVV-COOH (PR227 and Named) was selected and synthesized in the same manner as in Example 1.
[0033]
2) Effect on cell calcium influx When Ubutyl cells, which are cultured cell lines, are cultured with dibutyl cAMP added thereto, they differentiate into phagocytic cells and C5aR is expressed on the cell membrane. It is known that when C5a is allowed to act on these cells, the cells are activated and calcium influx is generated.
[0034]
Even when C5a having a concentration of 10 ⁻¹¹ M or less was added alone to cells expressing C5aR, calcium influx was hardly generated. When PR227 was added to this system, the sensitivity to C5a was enhanced and a remarkable calcium influx was observed (see FIG. 6). On the other hand, when only PR227 was added without adding C5a, no change in calcium influx was observed.
From this result, it is considered that PR227 acts on C5aR to change its molecular three-dimensional structure, thereby causing molecular conversion that enhances the reactivity with C5a.
[0035]
【The invention's effect】
According to the method of the present invention, it has become possible to search a region having a sense-antisense relationship in a protein molecule by searching at the amino acid level. An antisense homology box, which is a region having an intramolecular sense-antisense relationship of a protein searched by the method of the present invention, is useful for designing a physiologically active peptide that specifically acts on the protein.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the relationship between a sense peptide and an antisense peptide.
FIG. 2 is a conceptual diagram of a search method according to the present invention.
FIG. 3 is a conceptual diagram of an antisense homology box of the present invention.
FIG. 4 is a diagram showing the interrelationship of antisense homology boxes within a protein molecule of the present invention.
FIG. 5 is a diagram showing the results of Example 1 (4).
FIG. 6 is a diagram showing the results of Example 2 (2).

Claims (2)

The following steps:
1) A moving frame consisting of a predetermined number of amino acids in the amino acid sequence of a protein molecule is set at the N-terminus of the sequence;
2) The amino acid sequence of the movement frame is compared with the amino acid sequence of the protein molecule in order from the N-terminus, and a specified number or more of amino acids on the amino acid sequence of the protein molecule are represented as the movement frame in the table:

Extracting the part having the relationship described in the above as an antisense frame;
3) After comparison with the entire amino acid sequence, the moving frame is compared with the sequence in the reverse direction from the C-terminus, and the antisense frame is extracted in the same manner as in 2);
4) Move the moving frame one amino acid and repeat 2) and 3);
5) Repeat 4) until the moving frame reaches the C-terminus;
6) A method for searching a protein intramolecular antisense homology box, comprising using an antisense homology box as a portion having a plurality of opposing antisense frames. The following steps:
1) A moving frame consisting of a predetermined number of amino acids in the amino acid sequence of a protein molecule is set at the N-terminus of the sequence;
2) The amino acid sequence of the movement frame is compared with the amino acid sequence of the protein molecule in order from the N-terminus, and a specified number or more of amino acids on the amino acid sequence of the protein molecule are represented as the movement frame in the table:

Extracting the part having the relationship described in the above as an antisense frame;
3) After comparison with the entire amino acid sequence, the moving frame is compared with the sequence in the reverse direction from the C-terminus, and the antisense frame is extracted in the same manner as in 2);
4) Move the moving frame one amino acid and repeat 2) and 3);
5) Repeat 4) until the moving frame reaches the C-terminus;
6) An antisense homology box is a portion having a plurality of opposing antisense frames accumulated.
7) Based on the amino acid sequence of the antisense homology box, a bioactive peptide that exerts some change on the activity of the protein is designed.
A method for designing a physiologically active peptide, comprising a step.

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