JP4060123B2

JP4060123B2 - Method for suppressing protein deactivation

Info

Publication number: JP4060123B2
Application number: JP2002147371A
Authority: JP
Inventors: 幸生原; 仁田中
Original assignee: Nihon Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Nihon Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2002-05-22
Filing date: 2002-05-22
Publication date: 2008-03-12
Anticipated expiration: 2022-05-22
Also published as: JP2003342294A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エンドトキシンを含むタンパク質溶液をエンドトキシン活性の低減を目的として界面活性剤で処理する際、目的タンパク質の失活を抑制する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞膜構成成分であるリポ多糖とタンパク質の複合体であり、哺乳動物の体内に入ると動物を発熱させたり毒性を示す物質である。
タンパク質を医薬品として用いる場合や、タンパク質を動物試験に用いる場合、使用に先立ちそのタンパク質溶液がエンドトキシンを含まないようにするか、または含まれているエンドトキシンを除去または不活化することが重要である。しかし、タンパク質溶液中にエンドトキシンが含まれないようにするとか、含まれている場合にそれを除去または不活化することは容易なことではない。
【０００３】
従来エンドトキシンを除去する方法としては、分画法、陰イオン交換体などを用いたクロマトグラフィー法など、エンドトキシンと目的タンパク質にそれぞれ異なった挙動をとらせることによりエンドトキシンをタンパク質から分画する方法が知られている。また、エンドトキシンに特異的親和性を持つ、例えばポリミキシンＢをリガンドとしたクロマトグラフィーを用いることも効果的である。しかしこれらの方法ではエンドトキシン画分と目的タンパク質画分を完全に分離することは難しい。
一方、エンドトキシンを失活化する方法としては、タンパク質溶液を熱、酸、アルカリ、ある種の界面活性剤で処理する等の方法があげられる。しかし、これらの処理は多くの場合、目的とするタンパク質が致命的かつ不可逆的なダメージを受けてしまう。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、タンパク質溶液中に含まれるエンドトキシンの活性を界面活性剤を用いて低減する工程において、エンドトキシンの活性を減弱化し、目的とするタンパク質の活性をなるべく高く保持できる方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するため、界面活性剤処理による目的タンパク質の変性を抑制する物質について種々研究を重ねた結果、処理時にアミノ酸、糖類またはポリオールを存在させることによってタンパク質が安定化させられることを知見し、さらに検討を重ねて本発明を完成した。
【０００６】
すなわち本発明は、
（１）エンドトキシンを含むタンパク質溶液をエンドトキシン活性の低減を目的として界面活性剤で処理する際、アミノ酸、糖類およびポリオールから選ばれた少なくとも一種を存在させることを特徴とするタンパク質の失活を抑制する方法、
（２）界面活性剤が陰イオン界面活性剤、両性界面活性剤または非イオン界面活性剤である（１）記載の方法、
（３）界面活性剤がステロイド骨格を持つ化合物を主成分とする界面活性剤である（１）記載の方法、
（４）界面活性剤が、コール酸ナトリウム、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）またはポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルである（１）記載の方法、
（５）界面活性剤の濃度が０．５〜５ｗ／ｖ％である（１）記載の方法、
（６）アミノ酸の濃度が５〜２０ｗ／ｖ％である（１）記載の方法、
（７）アミノ酸がグルタミン酸、リジンまたはグリシンである（１）または（６）記載の方法、
（８）糖類の濃度が５〜５０ｗ／ｖ％である（１）記載の方法、
（９）糖類がショ糖またはマンニトールである（１）または（８）記載の方法、
（１０）ポリオールの濃度が５〜５０ｗ／ｖ％である（１）記載の方法、
（１１）ポリオールがエチレングリコール、ポリエチレングリコールまたはグリセロールである（１）または（１０）記載の方法、および
（１２）（１）記載の界面活性剤による処理の後に、タンパク質溶液を限外ろ過膜を用いて界面活性剤を除去することを特徴とするタンパク質含有水溶液の調製方法、
である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
界面活性剤処理の対象となるエンドトキシン含有タンパク質としては、たとえば血漿タンパク質、遺伝子組換え生産タンパク質等があり、特に自体生理活性を有するタンパク質としては、たとえばトロンビン、アンチトロンビン、血液凝固第IX因子、プロテインＣ、プロテインＳなど、原料またはいずれかの精製工程においてエンドトキシンが混入してくる可能性のあるタンパク質が挙げられる。
安定化剤として使用するアミノ酸の種類は特に限定されないが、グルタミン酸、リジン、グリシン等が好ましい。その濃度は５〜２０ｗ／ｖ％が適当である。
糖類としてはたとえば単糖、二糖、寡糖、糖アルコールなどが用いられ、その代表的な例として、たとえばショ糖、マンニトールなどが挙げられる。その濃度は５〜５０ｗ／ｖ％が適当である。
【０００８】
ポリオールとしてはたとえばエチレングリコール、分子量１，０００〜２０，０００のポリエチレングリコール、グリセロール等が例示され、それらの濃度は、５〜５０ｗ／ｖ％が適当である。
界面活性剤の種類は特に限定されないが、陰イオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤が好ましく、特に好ましいものとしてコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）などの分子中にステロイド骨格を持つ界面活性剤や、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルなどの非イオン界面活性剤などが挙げられる。タンパク質溶液中の界面活性剤の使用濃度は０．５〜５ｗ／ｖ％程度が適当である。
【０００９】
界面活性剤によるエンドトキシンの失活化反応の反応温度、反応時間、ｐＨ等の条件は、目的とするタンパク質の安定性に従い決定すればよいが、通常反応温度は、４〜２５℃、反応時間は１分〜２４時間程度、ｐＨ範囲は５〜９程度である。反応液は必要により撹拌することができる。
添加した界面活性剤を除去する場合は、沈澱法、透析法、限外ろ過法等が好ましい。
限外ろ過膜の分画分子量は、界面活性剤の大きさ、ミセルの状態、限界ミセル濃度、目的タンパク質の大きさなどの情報から総合的に判断すればよい。
本発明は、タンパク質が高濃度の界面活性剤に曝露された場合のタンパク質の失活化を極力防ぐための方法を提供することにある。そのため、高濃度の界面活性剤にタンパク質が曝露される環境ならば、エンドトキシンの失活化を目的とすることに限らず使用することができる。その一例として、ウイルス不活化を目的とした溶媒・洗浄剤処理（Ｓ／Ｄ処理）が挙げられる。この場合は、タンパク質の失活化の程度とウイルス不活化の程度を総合的に評価し、条件を設定すればよい。
【００１０】
【実施例】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
実施例１
ヒト・アンチトロンビン-IIIの安定化剤の効果実験
（１）アンチトロンビン−IIIの調製
コーン低温エタノール分画の上清I約１７．５リットルを４００ｍＬのＤＥＡＥ陰イオン交換体により処理した後、未吸着画分をプールとして集めた。０．０２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で前もって平衡化したヘパリン−セファロースゲル約３７０ｍＬを充填したカラムに前述のプール画分を負荷した。引き続き、０．０２Ｍのリン酸緩衝液、０．３Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．３）３．０リットルで洗浄した後、０．０２Ｍリン酸緩衝液、２．０Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．３）３．０リットルでアンチトロンビン−IIIを溶出した。
【００１１】
ついで、ヘパリン−セファーロースゲルから溶出したアンチトロンビン−III画分を限外ろ過装置（ポール社製分画分子量１０ｋＤａ）を用い、０．１Ｍ以下の塩濃度になるよう脱塩し、約２００ｍＬになるまで濃縮した。
前記画分を０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で約１．０リットルに希釈した。前もって０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＱ−セファロースＦＦゲル（トリメチルアミノメチル／アガロース、アマシャムバイオサイエンス社製）約３４０ｍＬに前述の希釈液を負荷した。次いで、０．０１Ｍのリン酸緩衝液、０．１２Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）を６．０リットル送液して洗浄した後、０．０１Ｍのリン酸緩衝液、０．１７Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）を３．０リットル送液しアンチトロンビン−IIIを溶出した。
【００１２】
この溶出画分をさらに精製するため、再度ヘパリン−セファロースゲル処理を行った。０．０２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で前もって平衡化したヘパリン−セファロースゲル約３７０ｍＬを充填したカラムに前述のＱ−セファロースＦＦゲルの溶出液を負荷した。引き続き、０．０２Ｍのリン酸緩衝液、０．３Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．３）３．０リットルで洗浄した後、０．０２Ｍのリン酸緩衝液、２．０Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．３）３．０リットルでアンチトロンビン−IIIを溶出した。
得られたアンチトロンビン−III溶液のうち３００ｍＬを限外ろ過膜（セントリプレップ−１０ミリポア社製）を用いて、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）によりバッファーを交換した。得られた溶液中のアンチトロンビン−IIIの活性は１２０ＩＵ／ｍＬであった。
【００１３】
（２）エンドトキシンを含むアンチトロンビン−III溶液の調製
得られたアンチトロンビン−III溶液１ｍＬに、終濃度約１００ＩＵ／ｍＬ程度となるよう、エンドトキシン溶液を添加した。さらに、アンチトロンビン活性が約５ＩＵ／ｍＬとなるよう前記バッファーで希釈し、４℃に冷却した。
一方、表１の終濃度となるよう、ｐＨ調整を行ったグルタミン酸ナトリウム、ショ糖、グリセロールの前述バッファー溶解液に、終濃度１ｗ／ｖ％となるよう５ｗ／ｖ％コール酸ナトリウム溶液を添加し、４℃に冷却した。これを界面活性剤を含む安定化剤溶液とした。
次に、前述のエンドトキシン含有アンチトロンビン−III溶液０．１ｍＬと、前述の界面活性剤含有安定化剤溶液０．９ｍＬを混合し、すばやく且つ充分に撹拌した。次に、４℃において２時間反応させ、エンドトキシンの失活化を行った。その後速やかに、アンチトロンビン活性（テストチームＡＴIII・２キット第一化学薬品製）およびエンドトキシン活性（エンドスペシー生化学工業社製）の測定を行った。被検溶液を、測定系への影響がないよう、それぞれの希釈緩衝液を用いて２５０または５００倍に希釈し、各活性の測定を行った。この測定結果を表１に示した。界面活性剤によりエンドトキシンが全ての条件において十分に失活化していることが確認され、さらに安定化剤を含まないものに比べ、安定化剤を含有するものはアンチトロンビン活性が高率で保持され、安定化効果が奏されていることが確認された。
【００１４】
【表１】

【００１５】
実施例２
ヒト・プロテインＳを用いた安定化剤の効果実験
（１）ヒト・プロテインＳ溶液の調製
ヒト血漿またはコーン分画で得たＳＩ画分を、あらかじめ２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ６Ｂに負荷した。試料を負荷した後、２５ｍＭ塩化ナトリウムを含む平衡化緩衝液で洗浄し、ついで３００ｍＭ塩化ナトリウムを含む平衡化緩衝液で溶出し、ヒト・プロテインＳを含む画分を得た。
【００１６】
（２）免疫吸着クロマトグラフィーによる精製
ヒト・プロテインＳを含む画分に塩酸ベンズアミジンを終濃度が１〜１０ｍＭとなるように加え、さらに塩化カルシウムを終濃度が２ｍＭとなるように加えたのち、あらかじめ２ｍＭ塩化カルシウムおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む平衡化緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した。カルシウム存在下でのみヒト・プロテインＳと結合する単クローン抗体を不溶化したカラムに負荷した。カラムを２ｍＭ塩化カルシウムおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む平衡化緩衝液で洗浄したのち、５ｍＭＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．３）で溶出した。
得られたヒト・プロテインＳ溶液３０ｍＬを限外ろ過膜（セントリプレップー１０：ミリポア社製）を用いて、２０ｍＭクエン酸ナトリウム１５０ｍＭ、塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）にてバッファー交換した。このプロテインＳ溶液１５ｍＬに、終濃度８０ＥＵ／ｍＬ程度となるよう、エンドトキシン溶液を添加した。さらに、前記バッファーで希釈し、４℃に冷却した。
【００１７】
一方、表２の終濃度となるようｐＨ調整を行った各安定化剤の前述バッファー溶解液に、終濃度１ｗ／ｖ％となるよう５ｗ／ｖ％ＣＨＡＰＳ溶液を添加し、４℃に冷却した。これを界面活性剤を含む安定化剤溶液とした。
次に、前述のエンドトキシン含有プロテインＳ溶液１ｍＬと、前述の界面活性剤含有安定化剤溶液１ｍＬを混合し、素早く、且つ十分に撹拌した。４℃において１７時間反応させ、エンドトキシンの失活化を行った。その後速やかに、プロテインＳ活性（スタクロットプロテインＳ：ロッシュ・ダイアグノスティックス社製）およびエンドトキシン活性（エンドスペシー；生化学工業社製）の測定を行った。被検溶液は、測定系への影響が無いようそれぞれの希釈緩衝液で１０倍以上希釈した。この測定結果を表２に示した。界面活性剤によりエンドトキシンが全ての条件において十分に失活化していることが確認され、さらに安定化剤を含まないものに比べ、安定化剤を有するものにはプロテインＳ活性が高率で保持され、安定化効果を示していることが確認された。
【００１８】
【表２】

【００１９】
実施例３
実施例１と同様にして、エンドトキシン含有アンチトロンビン−III溶液を調製した。
次に安定化剤として最終濃度１０ｗ／ｖ％のグリセロールを含み、さらに表３に示す界面活性剤を含むように調製し、これを界面活性剤含有安定化剤溶液とした。これらの液を１０℃で保存した。
次に前記エンドトキシン含有アンチトロンビン−III溶液１ｍＬと界面活性剤含有安定化剤溶液１ｍＬを混合し、１０℃、２４時間反応させた後エンドトキシンの失活化を行った。その後速やかに、アンチトロンビン−III活性およびエンドトキシン活性の測定を行い、その結果を表３に示した。同じ界面活性剤を用いても、安定化剤の存否により残存アンチトロンビンIII活性に差のあることが確認された。
【００２０】
【表３】

＋：安定剤添加
−：安定剤無添加
【００２１】
実施例４
実施例１と同様の方法で、エンドトキシン含有アンチトロンビン−III溶液を調製した。また、安定化剤として最終濃度５、１０または２０ｗ／ｖ％のグルタミン酸ナトリウム、最終濃度５、２０または５０ｗ／ｖ％ショ糖、最終濃度５、２０または５０ｗ／ｖ％のグリセロールに界面活性剤として、最終濃度１ｗ／ｖ％コール酸ナトリウムを加えたものを界面活性剤含有安定化剤溶液とした。これらの液を２５℃で保存した。
実施例１と同様にして、前記エンドトキシン含有アンチトロンビン−III溶液０．１ｍＬと界面活性剤含有安定化剤溶液０．９ｍＬを混合し、エンドトキシンの失活化を行った。つづいてアンチトロンビン−IIIおよびエンドトキシン活性の測定を行い、その結果を表４に示した。この結果から、同じ安定化剤を用いても、アンチトロンビンIIIの安定効果は安定化剤の濃度に依存することが確認された。
【００２２】
【表４】

【００２３】
実施例５
実施例４と同様にしてエンドトキシン含有アンチトロンビン−III溶液を調製した。また、安定化剤として最終濃度２０ｗ／ｖ％グリセロールを、界面活性剤として、最終濃度１ｗ／ｖ％コール酸ナトリウムを含む界面活性剤含有安定化剤液を調製した。
次いで、実施例１と同様にして、エンドトキシン含有アンチトロンビン−III溶液０．１ｍＬと界面活性剤含有安定化剤溶液０．９ｍＬを混合し、エンドトキシンの失活化を行った。つづいて、緩衝液で４０倍に希釈した後、分画分子量１０ｋＤａの限外ろ過膜を用いて緩衝液を交換し、界面活性剤を除去した。その後、エンドトキシンおよびアンチトロンビン−IIIの活性を測定し、表５に示す結果を得た。この結果から限外ろ過膜により界面活性剤が高度に除去され、且つ界面活性剤除去後も、低エンドトキシン活性を維持していることが確認された。
【００２４】
【表５】

【００２５】
【発明の効果】
本発明によれば、エンドトキシンを含有するタンパク質を、界面活性剤で処理してエンドトキシンを不活化または活性を低減するに際して、エンドトキシンの不活化、活性低下は抑制せず、タンパク質、特にアンチトロンビン−IIIなどのように自体生理活性を有するタンパク質の失活、活性低下を極力抑制し、タンパク質の収率を高いレベルに維持することができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for suppressing inactivation of a target protein when a protein solution containing endotoxin is treated with a surfactant for the purpose of reducing endotoxin activity.
[0002]
[Prior art]
Endotoxin is a complex of lipopolysaccharide, which is a cell membrane component of Gram-negative bacteria, and a protein, and is a substance that causes fever and toxicity when entering the body of a mammal.
When using a protein as a pharmaceutical or when using a protein for animal testing, it is important that the protein solution does not contain endotoxin or that the endotoxin contained is removed or inactivated prior to use. However, it is not easy to prevent endotoxin from being contained in the protein solution, or to remove or inactivate it if it is contained.
[0003]
Conventional methods for removing endotoxins include methods for fractionating endotoxins from proteins by causing the endotoxin and target protein to behave differently, such as fractionation and chromatography using anion exchangers. It has been. It is also effective to use chromatography having specific affinity for endotoxin, for example, polymyxin B as a ligand. However, it is difficult to completely separate the endotoxin fraction and the target protein fraction by these methods.
On the other hand, methods for inactivating endotoxin include methods such as treating a protein solution with heat, acid, alkali, and a certain surfactant. However, these treatments often cause fatal and irreversible damage to the target protein.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for reducing the endotoxin activity in a step of reducing the endotoxin activity contained in the protein solution by using a surfactant and maintaining the target protein activity as high as possible. It is in.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present inventors have conducted various studies on substances that suppress the denaturation of the target protein by the surfactant treatment, and as a result, the protein is stabilized by the presence of amino acids, sugars or polyols during the treatment. The present invention was completed through further investigations.
[0006]
That is, the present invention
(1) When a protein solution containing endotoxin is treated with a surfactant for the purpose of reducing endotoxin activity, at least one selected from amino acids, saccharides and polyols is present to inhibit protein deactivation. Method,
(2) The method according to (1), wherein the surfactant is an anionic surfactant, an amphoteric surfactant or a nonionic surfactant,
(3) The method according to (1), wherein the surfactant is a surfactant mainly composed of a compound having a steroid skeleton.
(4) The method according to (1), wherein the surfactant is sodium cholate, 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonic acid (CHAPS) or polyoxyethylene octylphenyl ether. ,
(5) The method according to (1), wherein the concentration of the surfactant is 0.5 to 5 w / v%,
(6) The method according to (1), wherein the amino acid concentration is 5 to 20 w / v%,
(7) The method according to (1) or (6), wherein the amino acid is glutamic acid, lysine or glycine,
(8) The method according to (1), wherein the saccharide concentration is 5 to 50 w / v%,
(9) The method according to (1) or (8), wherein the saccharide is sucrose or mannitol,
(10) The method according to (1), wherein the polyol concentration is 5 to 50 w / v%,
(11) After the method according to (1) or (10), wherein the polyol is ethylene glycol, polyethylene glycol or glycerol, and (12) the treatment with the surfactant according to (1), the protein solution is subjected to an ultrafiltration membrane. A method for preparing a protein-containing aqueous solution, wherein the surfactant is removed using
It is.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Examples of endotoxin-containing proteins to be treated with a surfactant include plasma proteins, recombinantly produced proteins, and the like. Particularly, proteins having physiological activity themselves include, for example, thrombin, antithrombin, blood coagulation factor IX, protein C, protein S, and the like, which may be contaminated with raw materials or endotoxin in any purification step.
The type of amino acid used as the stabilizer is not particularly limited, but glutamic acid, lysine, glycine and the like are preferable. The concentration is suitably 5 to 20 w / v%.
Examples of the saccharide include monosaccharides, disaccharides, sucrose, sugar alcohols and the like, and typical examples thereof include sucrose and mannitol. The concentration is suitably 5 to 50 w / v%.
[0008]
Examples of the polyol include ethylene glycol, polyethylene glycol having a molecular weight of 1,000 to 20,000, glycerol and the like, and their concentration is suitably 5 to 50 w / v%.
The type of the surfactant is not particularly limited, but anionic surfactants, amphoteric surfactants, and nonionic surfactants are preferable, and sodium cholate, sodium deoxycholate, 3-[(3-coral are particularly preferable. Examples include surfactants having a steroid skeleton in the molecule such as amidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonic acid (CHAPS), and nonionic surfactants such as polyoxyethylene octylphenyl ether. The use concentration of the surfactant in the protein solution is suitably about 0.5 to 5 w / v%.
[0009]
Conditions such as the reaction temperature, reaction time, pH, etc. of the endotoxin inactivation reaction by the surfactant may be determined according to the stability of the target protein. Usually, the reaction temperature is 4-25 ° C., and the reaction time is About 1 minute to 24 hours, pH range is about 5-9. The reaction solution can be stirred if necessary.
When removing the added surfactant, a precipitation method, a dialysis method, an ultrafiltration method and the like are preferable.
The fractional molecular weight of the ultrafiltration membrane may be comprehensively determined from information such as the surfactant size, micelle state, limit micelle concentration, and target protein size.
An object of the present invention is to provide a method for preventing protein inactivation as much as possible when the protein is exposed to a high concentration of a surfactant. Therefore, if it is the environment where protein is exposed to a high concentration surfactant, it can use not only for the purpose of inactivation of endotoxin. One example is solvent / cleaning agent treatment (S / D treatment) for virus inactivation. In this case, it is only necessary to comprehensively evaluate the degree of protein inactivation and the degree of virus inactivation and set the conditions.
[0010]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples.
Example 1
Experiments on the effect of human antithrombin-III stabilizer (1) Preparation of antithrombin-III About 17.5 liters of supernatant I of corn cryogenic ethanol fraction was treated with 400 mL of DEAE anion exchanger, The adsorbed fraction was collected as a pool. The aforementioned pool fraction was loaded onto a column packed with about 370 mL of a heparin-sepharose gel previously equilibrated with 0.02 M phosphate buffer (pH 7.3). Subsequently, after washing with 3.0 liters of 0.02M phosphate buffer and 0.3M sodium chloride solution (pH 7.3), 0.02M phosphate buffer and 2.0M sodium chloride solution (pH 7.3) Antithrombin-III was eluted with 3.0 liters.
[0011]
Next, the antithrombin-III fraction eluted from the heparin-Sepharose gel was desalted to a salt concentration of 0.1 M or less using an ultrafiltration device (Pole molecular weight cut off 10 kDa) to about 200 mL. Concentrated to
The fraction was diluted to about 1.0 liter with 0.01 M phosphate buffer (pH 7.0). About 340 mL of Q-Sepharose FF gel (trimethylaminomethyl / agarose, manufactured by Amersham Biosciences) equilibrated with 0.01 M phosphate buffer (pH 7.0) in advance was loaded with the above-described diluent. Next, after 6.0 L of 0.01 M phosphate buffer and 0.12 M sodium chloride solution (pH 7.0) was fed and washed, 0.01 M phosphate buffer and 0.17 M sodium chloride solution 3.0 liter of (pH 7.0) was fed to elute antithrombin-III.
[0012]
In order to further purify the eluted fraction, heparin-Sepharose gel treatment was performed again. A column packed with about 370 mL of heparin-sepharose gel previously equilibrated with 0.02 M phosphate buffer (pH 7.3) was loaded with the eluate of the above-mentioned Q-sepharose FF gel. Subsequently, after washing with 3.0 liters of 0.02 M phosphate buffer and 0.3 M sodium chloride solution (pH 7.3), 0.02 M phosphate buffer and 2.0 M sodium chloride solution (pH 7.3). ) Antithrombin-III was eluted with 3.0 liters.
Of the obtained antithrombin-III solution, 300 mL of the buffer was exchanged with 20 mM sodium citrate and 150 mM sodium chloride solution (pH 7.0) using an ultrafiltration membrane (manufactured by Centriprep-10 Millipore). The activity of antithrombin-III in the obtained solution was 120 IU / mL.
[0013]
(2) Preparation of antithrombin-III solution containing endotoxin The endotoxin solution was added to 1 mL of the obtained antithrombin-III solution so that the final concentration was about 100 IU / mL. Furthermore, it diluted with the said buffer so that antithrombin activity might be set to about 5 IU / mL, and it cooled at 4 degreeC.
On the other hand, a 5 w / v% sodium cholate solution was added to the aforementioned buffer solution of sodium glutamate, sucrose, and glycerol, which had been adjusted to have the final concentration shown in Table 1, to a final concentration of 1 w / v%. Cooled to 4 ° C. This was used as a stabilizer solution containing a surfactant.
Next, 0.1 mL of the above-mentioned endotoxin-containing antithrombin-III solution and 0.9 mL of the above-mentioned surfactant-containing stabilizer solution were mixed and rapidly and sufficiently stirred. Next, reaction was performed at 4 ° C. for 2 hours to inactivate endotoxin. Immediately thereafter, the antithrombin activity (Test Team ATIII-2 Kit, manufactured by Daiichi Chemical) and endotoxin activity (Endspecy Seikagaku Co., Ltd.) were measured. The test solution was diluted 250 or 500 times with each dilution buffer so as not to affect the measurement system, and each activity was measured. The measurement results are shown in Table 1. It was confirmed that the endotoxin was sufficiently inactivated under all conditions by the surfactant, and the antithrombin activity was retained at a higher rate for those containing the stabilizer compared to those containing no stabilizer. It was confirmed that a stabilizing effect was achieved.
[0014]
[Table 1]

[0015]
Example 2
Experiments on the effect of stabilizers using human protein S (1) Preparation of human protein S solution The SI fraction obtained from human plasma or corn fraction was previously equilibrated with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4). DEAE-Sepharose CL6B was loaded. After loading the sample, it was washed with an equilibration buffer containing 25 mM sodium chloride, and then eluted with an equilibration buffer containing 300 mM sodium chloride to obtain a fraction containing human protein S.
[0016]
(2) Purification by immunoadsorption chromatography Benzamidine hydrochloride is added to the fraction containing human protein S to a final concentration of 1 to 10 mM, and calcium chloride is added to a final concentration of 2 mM. Equilibration was performed with an equilibration buffer (pH 7.4) containing 2 mM calcium chloride and 150 mM sodium chloride. A monoclonal antibody that binds to human protein S only in the presence of calcium was loaded onto an insolubilized column. The column was washed with equilibration buffer containing 2 mM calcium chloride and 150 mM sodium chloride, and then eluted with 5 mM EDTA buffer (pH 7.3).
The obtained human protein S solution (30 mL) was subjected to buffer exchange with 20 mM sodium citrate (150 mM) and sodium chloride solution (pH 7.0) using an ultrafiltration membrane (Centreprep 10: manufactured by Millipore). The endotoxin solution was added to 15 mL of this protein S solution so that the final concentration was about 80 EU / mL. Furthermore, it diluted with the said buffer and cooled to 4 degreeC.
[0017]
On the other hand, a 5 w / v% CHAPS solution was added to the aforementioned buffer solution of each stabilizer whose pH was adjusted to the final concentration shown in Table 2 so that the final concentration was 1 w / v%, and the solution was cooled to 4 ° C. . This was used as a stabilizer solution containing a surfactant.
Next, 1 mL of the above-mentioned endotoxin-containing protein S solution and 1 mL of the above-mentioned surfactant-containing stabilizer solution were mixed and rapidly and sufficiently stirred. The reaction was carried out at 4 ° C. for 17 hours to inactivate endotoxin. Immediately thereafter, protein S activity (Stacrot protein S: manufactured by Roche Diagnostics) and endotoxin activity (Endspecy; manufactured by Seikagaku Corporation) were measured. The test solution was diluted 10 times or more with each dilution buffer so as not to affect the measurement system. The measurement results are shown in Table 2. It was confirmed that the endotoxin was sufficiently inactivated under all conditions by the surfactant, and the protein S activity was retained at a higher rate for those having the stabilizer than those not containing the stabilizer. It was confirmed that it shows a stabilizing effect.
[0018]
[Table 2]

[0019]
Example 3
In the same manner as in Example 1, an endotoxin-containing antithrombin-III solution was prepared.
Next, glycerol having a final concentration of 10 w / v% was added as a stabilizer, and the surfactants shown in Table 3 were further prepared to obtain a surfactant-containing stabilizer solution. These solutions were stored at 10 ° C.
Next, 1 mL of the endotoxin-containing antithrombin-III solution and 1 mL of a surfactant-containing stabilizer solution were mixed and reacted at 10 ° C. for 24 hours, and then the endotoxin was inactivated. Immediately thereafter, antithrombin-III activity and endotoxin activity were measured, and the results are shown in Table 3. Even when the same surfactant was used, it was confirmed that there was a difference in the remaining antithrombin III activity depending on the presence or absence of the stabilizer.
[0020]
[Table 3]

+: Addition of stabilizer-: No addition of stabilizer
Example 4
In the same manner as in Example 1, an endotoxin-containing antithrombin-III solution was prepared. In addition, a final concentration of 5, 10 or 20 w / v% sodium glutamate as a stabilizer, a final concentration of 5, 20 or 50 w / v% sucrose, a final concentration of 5, 20 or 50 w / v% glycerol as a surfactant. A surfactant solution containing a final concentration of 1 w / v% sodium cholate was used. These solutions were stored at 25 ° C.
In the same manner as in Example 1, 0.1 mL of the endotoxin-containing antithrombin-III solution and 0.9 mL of a surfactant-containing stabilizer solution were mixed to inactivate endotoxin. Subsequently, antithrombin-III and endotoxin activity were measured, and the results are shown in Table 4. From this result, it was confirmed that even when the same stabilizer was used, the stabilizing effect of antithrombin III was dependent on the concentration of the stabilizer.
[0022]
[Table 4]

[0023]
Example 5
An endotoxin-containing antithrombin-III solution was prepared in the same manner as in Example 4. Further, a surfactant-containing stabilizer solution containing 20 w / v% glycerol as a final stabilizer and 1 w / v% sodium cholate as a final surfactant was prepared.
Next, in the same manner as in Example 1, 0.1 mL of the endotoxin-containing antithrombin-III solution and 0.9 mL of the surfactant-containing stabilizer solution were mixed to inactivate endotoxin. Then, after diluting 40 times with a buffer solution, the buffer solution was exchanged using an ultrafiltration membrane having a fractional molecular weight of 10 kDa, and the surfactant was removed. Thereafter, the activities of endotoxin and antithrombin-III were measured, and the results shown in Table 5 were obtained. From this result, it was confirmed that the surfactant was highly removed by the ultrafiltration membrane and that the low endotoxin activity was maintained even after the surfactant was removed.
[0024]
[Table 5]

[0025]
【The invention's effect】
According to the present invention, when a protein containing endotoxin is treated with a surfactant to inactivate endotoxin or reduce its activity, inactivation of the endotoxin and reduction in activity are not suppressed, and proteins, particularly antithrombin-III Thus, it is possible to suppress the inactivation and decrease in activity of the protein having its own physiological activity as much as possible, and maintain the protein yield at a high level.

Claims

A method for suppressing deactivation of a protein, characterized in that when a protein solution containing endotoxin is treated with a surfactant for the purpose of reducing endotoxin activity, at least one selected from amino acids, sugars and polyols is present.

The method according to claim 1, wherein the surfactant is an anionic surfactant, an amphoteric surfactant or a nonionic surfactant.

The method according to claim 1, wherein the surfactant is a surfactant mainly composed of a compound having a steroid skeleton.

The method according to claim 1, wherein the surfactant is sodium cholate, 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonic acid (CHAPS) or polyoxyethylene octylphenyl ether.

The method according to claim 1, wherein the concentration of the surfactant is 0.5 to 5 w / v%.

The method according to claim 1, wherein the concentration of the amino acid is 5 to 20 w / v%.

The method according to claim 1 or 6, wherein the amino acid is glutamic acid, lysine or glycine.

The method according to claim 1, wherein the concentration of the saccharide is 5 to 50 w / v%.

The method according to claim 1 or 8, wherein the saccharide is sucrose or mannitol.

The process according to claim 1, wherein the concentration of the polyol is 5 to 50 w / v%.

The method according to claim 1 or 10, wherein the polyol is ethylene glycol, polyethylene glycol or glycerol.

A method for preparing a protein-containing aqueous solution, wherein the surfactant is removed from the protein solution using an ultrafiltration membrane after the treatment with the surfactant according to claim 1.