JP4065249B2

JP4065249B2 - 蛍光寿命測定装置

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Publication number: JP4065249B2
Application number: JP2004115682A
Authority: JP
Inventors: 理小谷
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2004-04-09
Filing date: 2004-04-09
Publication date: 2008-03-19
Anticipated expiration: 2024-04-09
Also published as: JP2005300311A

Description

本発明は、試料にパルス励起光を照射して励起された試料から放出される蛍光光子をカウントし、カウントした蛍光光子数をもとに蛍光寿命を測定する蛍光寿命測定装置に関するものである。

従来、励起光を試料に照射して試料を励起状態にして、試料が基底状態に遷移する過程で発する蛍光光子を測定して蛍光寿命を算出し、試料の励起状態を調べる方法が知られている。蛍光寿命を算出する方法として、試料にパルス励起光を照射し、試料から放出される蛍光光子数を複数の時間帯において測定し、測定された蛍光光子数から蛍光寿命を算出する時間ゲート法が知られている（非特許文献１参照）。

"Multiple Time-Gate Module for Fluorescence Lifetime Imaging"C.J.DE GRAUW and H.C.GERRITSEN,APPLIED SPECTROSCOPY, Volume 55, Number 6, 2001.

ところで、蛍光寿命の分布画像を取得する場合、走査型蛍光顕微鏡装置を用いる場合が多く、励起光が試料を走査する速さは一定になっている。また、誤差の小さい蛍光寿命を測定するためには、所定の蛍光光子数をカウントする必要がある。蛍光光子の放出確率は、励起光の照射強度に対応して増減するため、蛍光光子の放出確率が少ない部位を基準に励起光の照射強度を合わせるのが一般的であった。つまり、蛍光光子の放出確率が少ない部位に対しては、励起光の照射時間を増加させ、あるいは、励起光の照射回数を増大させていた。しかしながら、蛍光光子の放出確率が少ない部位を基準にすると、照射時間を増加させ、あるいは、照射回数を増加させて励起光を走査することになり、結果的に蛍光寿命の分布画像を取得するために多大な時間を要するという問題点があった。

また、蛍光光子の放出確率が少ない部位を基準にして励起光を照射すると、蛍光光子の放出確率が多い部位に対しては、励起光の照射強度が強すぎて褪色が進行し、試料が損傷するという問題点があった。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、簡易な構成で短時間に誤差の均一な蛍光寿命の分布画像が取得できる蛍光寿命測定装置を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、請求項１にかかる蛍光寿命測定装置は、試料にパルス励起光を照射しつつ走査し、前記パルス励起光によって励起された前記試料から放出される蛍光光子をカウントし、該カウントした蛍光光子数をもとに蛍光寿命を測定する蛍光寿命測定装置において、カウントされた前記蛍光光子数が所定数に達するごとに、前記パルス励起光の照射位置を次の照射位置に走査させる走査制御手段を備えたことを特徴とする。

また、請求項２にかかる蛍光寿命測定装置は、上記の発明において、前記照射位置は、１画素内の所定領域に対応することを特徴とする。

また、請求項３にかかる蛍光寿命測定装置は、上記の発明において、試料にパルス励起光を照射しつつ走査し、前記パルス励起光によって励起された前記試料から放出される蛍光光子をカウントし、該カウントした蛍光光子数をもとに蛍光寿命を測定する蛍光寿命測定装置において、前記試料の蛍光寿命測定領域を予め所定の光強度の励起光によって走査し、前記蛍光寿命測定領域の蛍光強度分布を測定する蛍光強度測定手段と、前記蛍光強度分布をもとに前記蛍光寿命測定領域内の各所定領域から放出される蛍光光子数が所定数を超えるように前記励起光の強度に対応した前記励起光の走査速度を演算する走査速度演算手段と、前記走査速度演算手段によって演算された走査速度にしたがって各所定領域を前記パルス励起光が走査するように制御する走査制御手段と、を備えたことを特徴とする。

また、請求項４にかかる蛍光寿命測定装置は、上記の発明において、前記パルス励起光が照射されてから前記蛍光光子が放出されるまでの時間をもとに前記蛍光寿命を演算する時間相関単一計数法を用いて前記蛍光寿命を演算する演算手段を備えることを特徴とする。

また、請求項５にかかる蛍光寿命測定装置は、上記の発明において、前記パルス励起光が照射されてから複数の時間帯においてカウントされた前記蛍光光子数をもとに前記蛍光寿命を演算する時間ゲート法を用いて前記蛍光寿命を演算する演算手段を備えることを特徴とする。

本発明にかかる蛍光寿命測定装置は、蛍光光子の放出確率に対応して励起光の照射強度を変化させ、短時間に均一な誤差の蛍光寿命の分布画像が取得できるという効果を奏する。

以下に添付図面を参照して、この発明にかかる蛍光寿命測定装置の好適な実施の形態を詳細に説明する。

（実施の形態１）
図１は、この発明の実施の形態１である蛍光寿命測定装置１００の概要構成を示すブロック図である。図１において、この蛍光寿命測定装置１００は、パルスレーザ光源１と、レンズ系２，５，７と、ビームスプリッタ３と、スキャナ４と、検出器８と、制御部９と、表示部１０とを有している。さらに、制御部９は、信号処理部９１と、カウンタ９２と、スキャナ制御部９３と、演算部９４とを有している。

まず、制御部９の制御のもと、パルスレーザ光源１からパルス励起光が所定の光強度で、かつ所定の時間間隔で出射される。パルス励起光は、レンズ系２、ビームスプリッタ３、スキャナ４、レンズ系５を順次介して試料６に集光する。集光したパルス励起光は、試料６を励起し、試料６から蛍光光子が放出される。試料６から放出された蛍光光子は、レンズ系５、スキャナ４を順次介してビームスプリッタ３で反射され、レンズ系７を介して検出器８に入射する。検出器８は、入射した蛍光光子の光強度に対応した電気信号Ｓ１を制御部９に出力する。

制御部９内の信号処理部９１は、電気信号Ｓ１を入力して所定の閾値で２値化し、２値化した信号をカウンタ９２に出力する。カウンタ９２は、２値化した信号を入力して蛍光光子をカウントし、カウントした蛍光光子数が予め設定した光子数に達した場合、カウントした蛍光光子数が予め設定した蛍光光子数に達した旨をスキャナ制御部９３と演算部９４とに出力する。スキャナ制御部９３は、カウントした蛍光光子数が予め設定した光子数に達した旨を入力すると、スキャナ４を可変に制御してパルス励起光の照射位置を次の照射位置に走査させる。演算部９４は、積算した蛍光光子数が予め設定した光子数に達した旨を入力すると、測定した蛍光光子数をもとに蛍光寿命を演算し、表示部１０に出力する。制御部９は、１画面分の蛍光寿命が演算された時点で、表示部１０を介して蛍光寿命の分布画像を出力表示させる。演算部９４は、パルス励起光が照射されてから蛍光光子数が放出されるめでの時間をもとに蛍光寿命を演算する単一相関時間計数法、あるいはパルス励起光の照射によって放出される蛍光光子を複数の時間帯で測定し、この複数の時間帯の時間幅と測定時間の時間差とから蛍光寿命を演算する時間ゲート法のいずれかの方法を用いて蛍光寿命を演算する。

つぎに、図２に示すフローチャートを参照して、制御部９および制御部９内の各部位の動作を説明する。まず、スキャナ制御部９３は、パルス励起光の走査位置を初期走査位置に設定し（ステップＳ１０１）、制御部９は、カウンタ９２のリセットを行い（ステップＳ１０２）、パルス励起光を発振させる（ステップＳ１０３）。カウンタ９２は、蛍光光子のカウントを開始し（ステップＳ１０４）、カウントした蛍光光子数が予め設定した蛍光光子数に達したか否かを判断する（ステップＳ１０５）。カウントした蛍光光子数が予め設定した蛍光光子数に達した場合（ステップＳ１０５，Ｙｅｓ）、カウンタ９２は、カウントした蛍光光子数が予め設定した蛍光光子数に達した旨を演算部９４に出力する。カウントした蛍光光子数が予め設定した蛍光光子数に達していない場合（ステップＳ１０５，Ｎｏ）、制御部９は、再びパルス励起光を発振させる（ステップＳ１０３）。演算部９４は、カウントした蛍光光子数が予め設定した蛍光光子数に達した旨を入力すると、測定した蛍光光子数をもとに蛍光寿命を演算する（ステップＳ１０６）。つぎに、制御部９は、演算部９４が演算した蛍光寿命が１画面分終了したか否かを判断し（ステップＳ１０７）、１画面分終了した場合（ステップＳ１０７，Ｙｅｓ）、表示部１０を介して蛍光寿命の分布画像を出力表示させ（ステップＳ１０８）、１画面分終了していない場合（ステップＳ１０７，Ｎｏ）、スキャナ制御部９３を介して、パルス励起光の照射位置を次の照射位置に走査させ（ステップＳ１０９）、カウンタ９２のリセットを行う（ステップＳ１０２）。

図３は、スキャナ制御部９３によってスキャナ４が可変に制御され、パルス励起光の照射位置が時間とともに走査する様子を示す模式図である。図３に示すように、パルス励起光の照射位置は、１画素単位で走査しているが、１画素に対応する照射位置に留まる時間は、一定ではない。たとえば、照射位置Ｐ０〜Ｐ１に対応する画素の蛍光光子の放出確率が大きく、照射位置Ｐ１〜Ｐ２に対応する画素の蛍光光子の放出確率が小さい場合、時間Δｔ１を時間Δｔ２に比して長くする。このようにして、蛍光光子の放出確率が小さい照射位置Ｐ０〜Ｐ１に対応する画素に対しては、励起光の留まる時間を長くして光強度を増加させ、蛍光光子の放出確率が大きい照射位置Ｐ１〜Ｐ２に対応する画素に対しては、励起光の留まる時間を短くする。このように、蛍光光子の放出確率に対応して励起光の留まる時間を可変させると、全ての照射位置に対応する画素から放出される蛍光光子数は同じになる。

一般的に、蛍光寿命の誤差は、カウントされる蛍光光子数が多いと小さく、カウントされる蛍光光子数が少ないと大きくなる。したがって、１画素単位でカウントされる蛍光光子数を予め設定し、各画素でカウントされる蛍光光子数が予め設定した蛍光光子数に一致するようにすると、均一な誤差の蛍光寿命の分布画像が取得できる。

この実施の形態１では、１画素に対応する励起光の照射位置からカウントされる蛍光光子数を予め設定し、カウントされた蛍光光子数がこの設定した蛍光光子数に達した時点で次の画素に対応する位置に照射位置を走査するようにしていた。したがって、誤差が均一の蛍光寿命の分布画面が取得できる。

なお、この実施の形態１では、パルス励起光の照射位置を１箇所に固定して１画素と対応させるようにしていたが、１画素に対応する領域内であれば、パルス励起光の照射位置を移動させてもよい。

また、この実施の形態１では、１画素に対応する領域の蛍光寿命の演算を行った後にパルス励起光の照射位置を走査するようにしていたが、パルス励起光の走査を先に行い、１画面分の蛍光光子数の測定を行った後に、まとめて蛍光寿命の演算を行うようにしてもよい。

（実施の形態２）
つぎに、この実施の形態２について説明する。実施の形態１では、１画素に対応する照射位置からカウントされる蛍光光子数を予め設定し、各画素の蛍光寿命の誤差を均一にするようにしていたが、この実施の形態２では、一度目は、所定の速度でパルス励起光を走査させて、蛍光強度の分布画像を取得するとともに蛍光強度をもとにカウントされる蛍光光子数が設定した蛍光光子数になる走査速度を演算し、２度目は、演算した走査速度にしたがってパルス励起光を走査し、均一な誤差の蛍光寿命の分布画像を取得するようにしている。

図４は、この発明の実施の形態２である蛍光寿命測定装置２００の概要構成を示すブロック図である。図４において、この蛍光寿命測定装置２００は、制御部９に代えて制御部９Ａを配置し、制御部９Ａは、信号処理部９１と、カウンタ９２と、スキャナ制御部９３ａと、演算部９４と、走査速度演算部９５と、記憶部９６とを有している。なお、図１と同一の構成部分には、同一の符号を付している。

まず、制御部９Ａの制御のもと、パルスレーザ光源１からパルス励起光が出射され、パルス励起光はスキャナ制御部９３ａの制御のもと走査される。スキャナ制御部９３ａは、所定の走査速度でパルス励起光を走査させる。このパルス励起光の走査によって、検出器８は、試料６から発した蛍光の蛍光強度に対応した電気信号Ｓ２を制御部９Ａに出力する。制御部９Ａは、入力した電気信号Ｓ２を走査速度演算部９５と表示部１０とに出力する。表示部１０は、入力した電気信号Ｓ２を表示信号に変換し、蛍光強度の分布画像を出力表示する。

走査速度演算部９５は、入力した電気信号Ｓ２をもとにカウントされる蛍光光子数が予め設定された蛍光光子数になるようにパルス励起光の走査速度を演算し、記憶部９６に出力する。記憶部９６は、入力した走査速度を格納する。

つぎに、制御部９Ａの制御のもと、パルスレーザ光源１からパルス励起光が出射され、パルス励起光はスキャナ制御部９３ａの制御のもと走査される。スキャナ制御部９３ａは、記憶部９６に格納された走査速度にしたがってパルス励起光を走査させる。このパルス励起光の走査によって、信号処理部９１と、カウンタ９２とを順次介して蛍光光子数がカウントされ、カウントされた蛍光光子数が演算部９４に出力される。演算部９４は、入力した蛍光光子数をもとに蛍光寿命を演算し、演算結果を表示部１０に出力する。表示部１０は、演算部９４から入力した蛍光寿命を蓄積し、１画面分の蛍光寿命を蓄積した時点で、蛍光寿命の分布画像を出力表示する。

図５に示すフローチャートを参照して、制御部９Ａおよび制御部９Ａ内の各部位の動作を説明する。まず、制御部９Ａは、パルス励起光を発振させ（ステップＳ２０１）、スキャナ制御部９３ａは、所定の走査速度でパルス励起光を走査させ（ステップＳ２０２）、制御部９Ａは、検出器８を介して蛍光強度に対応した電気信号Ｓ２を入力し（ステップＳ２０３）、電気信号Ｓ２を走査速度演算部９５と表示部１０とに出力する。走査速度演算部９５は、蛍光強度に対応した電気信号Ｓ２をもとに画素ごとに走査する走査速度を演算し（ステップＳ２０４）、演算結果を記憶部９６に出力する。表示部１０は、蛍光強度に対応した電気信号Ｓ２をもとに蛍光強度の分布画像を出力表示する（ステップＳ２０５）。制御部９Ａは、１画面分の走査が終了した場合、蛍光寿命の測定に進む。

つぎに、蛍光寿命の測定について説明する。まず、スキャナ制御部９５は、パルス励起光の走査位置を初期走査位置に設定し（ステップＳ２０６）、制御部９Ａは、カウンタ９２のリセットを行い（ステップＳ２０７）、パルス励起光を発振させる（ステップＳ２０８）。カウンタ９２は、信号処理部９１を介して蛍光光子のカウントを開始し（ステップＳ２０９）、カウントした蛍光光子数を演算部９４に出力する。スキャナ制御部９５は、記憶部９６に格納された走査速度にしたがってパルス励起光を走査させ（ステップＳ２１０）、１画素分を走査したか否かを判断し（ステップＳ２１１）、１画素分の走査が終了した場合（ステップＳ２１１，Ｙｅｓ）、演算部９４は、入力した蛍光光子数をもとに蛍光寿命を演算する（ステップＳ２１２）。１画素分の走査が終了していない場合（ステップＳ２１１，Ｎｏ）、制御部９Ａは、パルス励起光の発振（ステップＳ２０８）を行う。つぎに、制御部９Ａは、蛍光寿命の演算が１画面分終了したか否かを判断し（ステップＳ２１３）、１画面分終了した場合（ステップＳ２１３，Ｙｅｓ）、表示部１０を介して蛍光寿命の分布画像を出力表示させ（ステップＳ２１４）、蛍光寿命の演算が１画面分終了していない場合（ステップＳ２１３，Ｎｏ）、スキャナ制御部９５を介してパルス励起光を次の画素の照射位置に走査させて（ステップＳ２１５）、カウンタ９２のリセットを行う（ステップＳ２０７）。

図６−１〜図６−４は、励起光強度と蛍光強度と励起光の走査速度との関係を示す模式図である。図６−１に示すように、スキャナ制御部９３ａは、１度目は、励起光の走査速度を一定にして走査させる。つまり、走査速度が一定であるため、励起光強度Ｌ１は一定になる。図６−２に示すように、この走査によって検出器８を介して蛍光強度Ｌａが取得される。一方、蛍光寿命の測定に必要な所定の蛍光強度Ｌｔは、一定である。図６−３に示すように、各画素において蛍光寿命の測定に必要な励起光強度Ｌ２は、蛍光強度Ｌｔを蛍光強度Ｌａで除した値に比例する（Ｌ２∝Ｌｔ／Ｌａ）。各画素で蛍光寿命の測定に必要な走査時間Ｔは、Ｌ２に比例しており、励起光の走査速度ＳＰは、Ｔに反比例している。走査速度演算部９５は、蛍光強度Ｌａから走査時間Ｔあるいは走査速度ＳＰを演算する（Ｔ∝Ｌａ／Ｌｔ，ＳＰ∝Ｌｔ／Ｌａ）。図６−４に示すように、蛍光光強度Ｌａの大きいところでは、走査速度ＳＰは速く、蛍光強度Ｌａが小さいところでは、走査速度ＳＰは遅くなる。また、走査速度演算部９５は、走査速度ＳＰと蛍光強度Ｌａとの関係式（ＳＰ＝Ｃ（Ｌｔ／Ｌａ））の比例係数Ｃを変更することで、測定される蛍光寿命の誤差を任意に設定することができる。

図７は、パルス励起光が画素ごとに走査速度を変えて走査しているところを示す模式図である。図７において、パルス励起光の走査速度は、直線の傾きによって表されるが、この走査速度は、走査速度演算部９５によって演算された速度にしたがっている。したがって、蛍光光子の放出確率が高い画素領域では、パルス励起光の走査速度は速く、蛍光光子の放出確率が小さい画素領域では、パルス励起光の走査速度は遅くなっている。

この実施の形態２では、１度目は、パルス励起光を一定の走査速度で走査させて、蛍光強度を表示するとともに各画素を走査する走査速度を演算し、２度目は、演算した走査速度にしたがってパルス励起光を走査させて蛍光寿命の演算を行うようにしている。このようにして、１度目の走査によって、蛍光強度の分布画像を取得し、２度目の走査によって、均一な誤差の蛍光寿命の分布画像を取得するようにしている。

なお、この実施の形態２では、１度目のパルス励起光の走査によって得られた蛍光強度の分布画像を表示するようにしていたが、表示を選択できるようにしてもよい。また、パルス励起光が照射位置に留まる時間は、パルス励起光の照射回数を変えて決めるようにしてもよいし、パルス励起光の照射時間を変えて決めるようにしてもよい。いずれも照射強度を変えることになるからである。

また、この実施の形態２では、蛍光強度の分布画像を取得する場合と蛍光寿命の分布画像を取得する場合との双方においてパルス励起光を用いるようにしていたが、蛍光強度の分布画像を取得する場合は、パルス発振光源ではなく連続発振光源を用いるようにしてもよい。

この発明の実施の形態１にかかる蛍光寿命測定装置を示す機能ブロック図である。この発明の実施の形態１にかかる制御部の動作を示すフローチャートである。この発明の実施の形態１にかかるパルス励起光の照射位置と時間との関係を示す模式図である。この発明の実施の形態２にかかる蛍光寿命測定装置を示す機能ブロック図である。この発明の実施の形態２にかかる制御部の動作を示すフローチャートである。この発明の実施の形態２にかかる励起光の光強度と走査位置との関係を示す模式図である。この発明の実施の形態２にかかる蛍光強度と所定の蛍光強度との関係を示す模式図である。この発明の実施の形態２にかかる励起光の光強度と走査位置との関係を示す模式図である。この発明の実施の形態２にかかる励起光の走査速度と走査位置との関係を示す模式図である。この発明の実施の形態２にかかるパルス励起光の照射位置と時間との関係を示す模式図である。

符号の説明

１パルスレーザ光源
２，５，７レンズ系
３ビームスプリッタ
４スキャナ
６試料
８検出器
９，９Ａ制御部
９１信号処理部
９２カウンタ
９３，９３ａスキャナ制御部
９４演算部
９５走査速度演算部
９６記憶部
１００，２００蛍光寿命測定装置

Claims

試料にパルス励起光を照射しつつ走査し、前記パルス励起光によって励起された前記試料から放出される蛍光光子をカウントし、該カウントした蛍光光子数をもとに蛍光寿命を測定する蛍光寿命測定装置において、
カウントされた前記蛍光光子数が所定数に達するごとに、前記パルス励起光の照射位置を次の照射位置に走査させる走査制御手段を備えたことを特徴とする蛍光寿命測定装置。
前記照射位置は、１画素内の所定領域に対応することを特徴とする請求項１に記載の蛍光寿命測定装置。
試料にパルス励起光を照射しつつ走査し、前記パルス励起光によって励起された前記試料から放出される蛍光光子をカウントし、該カウントした蛍光光子数をもとに蛍光寿命を測定する蛍光寿命測定装置において、
前記試料の蛍光寿命測定領域を予め所定の光強度の励起光によって走査し、前記蛍光寿命測定領域の蛍光強度分布を測定する蛍光強度測定手段と、
前記蛍光強度分布をもとに前記蛍光寿命測定領域内の各所定領域から放出される蛍光光子数が所定数を超えるように前記励起光の強度に対応した前記励起光の走査速度を演算する走査速度演算手段と、
前記走査速度演算手段によって演算された走査速度にしたがって各所定領域を前記パルス励起光が走査するように制御する走査制御手段と、
を備えたことを特徴とする蛍光寿命測定装置。
前記パルス励起光が照射されてから前記蛍光光子が放出されるまでの時間をもとに前記蛍光寿命を測定する時間相関単一計数法を用いて前記蛍光寿命を演算する演算手段を備えることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一つに記載の蛍光寿命測定装置。
前記パルス励起光が照射されてから複数の時間帯においてカウントされた前記蛍光光子数をもとに前記蛍光寿命を測定する時間ゲート法を用いて前記蛍光寿命を演算する演算手段を備えることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一つに記載の蛍光寿命測定装置。