JP4067147B2

JP4067147B2 - Method and reagent for measuring creatine phosphokinase activity

Info

Publication number: JP4067147B2
Application number: JP04302597A
Authority: JP
Inventors: 泰史白波瀬; 正光高橋; 吉史渡津
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1997-02-11
Filing date: 1997-02-11
Publication date: 2008-03-26
Anticipated expiration: 2017-02-11
Also published as: JPH10215895A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はクレアチンホスホキナーゼ（以下、ＣＰＫという）活性の測定方法及び試薬に関する。より詳細には、酵素法によるＣＰＫ活性の測定法において、溶血による干渉を回避することができる方法及びその試薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＣＰＫは分子量約８万のＳＨ酵素であり、後記反応式−１で示される酵素反応を可逆的に触媒し、筋収縮に伴うエネルギー代謝に重要な働きをしている。ＣＰＫは、急性心筋梗塞、多発性筋炎、進行性筋ジストロフィーにおいて異常増加が認められることから、臨床検査においてＣＰＫ活性の測定（定量）が行われている。また、筋萎縮症の判別にもＣＰＫ活性の測定が利用される。
ＣＰＫ活性測定は、下記反応式−１，２，３で示されるように、クレアチンリン酸、ＡＤＰを基質としてヘキソキナーゼ（ＨＫ）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）を共役させ、β−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの吸光度上昇として測定する酵素反応法により行われている。
【０００３】

【０００４】
しかしながら、上記の方法において、溶血した検体中のＣＰＫ活性を測定しようとすると血球中の成分により正の干渉を受ける。この原因は、ＭＫ（ミオキナーゼ）がＡＤＰを基質としてＡＴＰとＡＭＰを生成するため（反応式−４参照）、その分ＣＰＫ活性により生成したＡＴＰに上乗せされて測り込まれてしまうことによる。
この溶血の影響（一般に溶血干渉といわれる）を回避するためには、大きく分けて２つの方法がある。１つはＭＫの活性を阻害するものであり、ＡＭＰ、Ｐ¹，Ｐ⁵−ジ（アデノシン−５’−）ペンタホスフェート（以下、Ａｐ５Ａという）の添加が行われている（臨床化学・補冊231-255; 1987)。他にＮａＦ(Clin. Chem., 23, 1569-1575; 1977)、抗ミオキナーゼ抗体（特開平５−２６０９９７号公報）などを添加する報告がある。もう１つは、検体盲検（クレアチンリン酸を除く試料を用いた測定値）をとって、その値を差し引くことにより溶血干渉を回避する方法であり、現在、自動分析措置においてはダブルレートが行えるようになってきているので、広く用いられている。この方法の原理は、試薬を２つに分け、第１試薬にはクレアチンリン酸を除くすべてを加えておき、第２試薬をクレアチンリン酸にする。検体と第１試薬だけを反応させ吸光度変化料を測定する（ＭＫ活性の測定）。次に第２試薬を加えて反応させ吸光度変化量を測定する（ＭＫ＋ＣＰＫ活性の測定）。前後の吸光度変化量を差し引くことにより真のＣＰＫ活性を求める方法である。
【０００５】
しかし、上述の方法は、ダブルレートすることのできない自動分析装置に対しては応用できないし、２回測定して差し引くために再現性の低下が起こるだけでなく、第２試薬添加前後のｐＨ変動、希釈による反応条件の変化が起こるため、正確には盲検をとれないという問題がある。また、第１試薬中にクレアチンリン酸を除くすべてを添加するため試薬の安定性が低下する問題が起こる。例えば、グルコース、ＮＡＤ（Ｐ）とＧ６ＰＤＨを共存させると、Ｇ６ＰＤＨはグルコースデヒドロゲナーゼ活性を持っているために経時的にＮＡＤ（Ｐ）がＮＡＤ（Ｐ）Ｈとなり試薬ブランクの上昇が起こってしまう。また、ＡＤＰのｐＨ安定性はアルカリ側（ｐＨ８以上）で安定であり、酸性側では経時的に加水分解されてリン酸基が遊離してＡＭＰになる。特に最近では液状安定化試薬が要望されており、こうした不安定要因は極力排除する必要性がある。従って、グルコース、ＡＤＰをアルカリ性の第２試薬（クレアチンリン酸もＡＤＰと同様のｐＨ安定性を示す）に添加する方が安定な液状試薬になる。ところが、逆にこうした安定化液状試薬にするとダブルレートができなくなってしまう欠点を有していた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このような問題から、本発明者等は、溶血干渉を回避できると共に液状安定性に優れた試薬を目的として鋭意検討を行った。まず、従来からＭＫ活性の阻害剤として使用されているＡｐ５Ａを大量に添加する実験を行った（後記参考例２及び図３参照）。その結果、Ａｐ５Ａは約１００μＭ以上加えても溶血干渉を完全に回避することはできず、一定の溶血干渉を受けることが分かった。この事実は、溶血干渉がＭＫ以外の血球成分による干渉と考えられた（図３の結果より９５％はＭＫ活性による干渉であると推察される）。そこで、本発明者等は、血球成分が解糖系の酵素、基質成分（糖のリン酸エステル）を多く含むことから、各種糖リン酸エステルを加えることにより解糖系酵素を阻害できるのではと考え、Ａｐ５Ａと糖リン酸エステルを併用したところ、溶血干渉を著しく低減できることが判明した。また、測定用試薬各成分の配合組合せの最適化を図ることにより、安定性の高い液状製剤を得られることが判明した。本発明はかかる知見に基づいてなされたもので、本発明の目的は、溶血干渉を回避できるＣＰＫ活性測定法及び液状安定性の良好なＣＰＫ活性測定試薬を提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するためになされた本発明の要旨は、
(a)下記反応式（１）、（２）及び（３）で示される酵素反応を利用してクレアチンホスホキナーゼの活性を測定する方法であって、Ａｐ５Ａと、グルコース−６−リン酸を除く糖リン酸エステルとを使用して溶血干渉を回避することを特徴とするクレアチンホスホキナーゼ活性の測定方法；
【化２】

(b)糖リン酸エステルとして、グルコース−１，６−ジリン酸、フルクトース−１，６−ジリン酸、フルクトース−２，６−ジリン酸、アラビノース−５−リン酸、エリスロース−４−リン酸、グリセリン酸−２−リン酸、グリセリン酸−３−リン酸、グリセリン酸−２，３−ジリン酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸、グリセロール−３−リン酸及びマルトース−６−リン酸から選ばれた１種又は２種以上を使用する上記(a)記載の方法；
(c)上記 (a) 又は (b) に記載のクレアチンホスホキナーゼ活性の測定方法に用いられるクレアチンホスホキナーゼ活性測定用試薬であって、第１試薬と第２試薬よりなり、第１試薬はβ−ＮＡＤ（Ｐ）を少なくとも含有し、第２試薬はＡＤＰ及びクレアチンリン酸を少なくとも含有し、Ａｐ５Ａ及び糖リン酸エステルがそれぞれ第１試薬及び第２試薬の少なくとも一方に添加されていることを特徴とするクレアチンホスホキナーゼ活性測定用試薬；
である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は上記の構成よりなり、本発明の測定方法は、上記反応式（１）、（２）及び（３）で示される酵素反応を利用したＣＰＫ活性の測定法において、Ａｐ５Ａと、グルコース−６−リン酸を除く糖リン酸エステルとを使用して溶血干渉を回避することからなる。即ち、前述のように、Ａｐ５Ａのみでは溶血干渉を完全に回避するには困難であり、本発明ではＡｐ５Ａと、グルコース−６−リン酸を除く糖リン酸エステルとを併用して溶血干渉を低減するものである。
本発明において、糖リン酸エステルとしては、Ａｐ５Ａと併用することにより溶血干渉を低減できるものであれば各種の糖リン酸エステル類を使用することができるが、好ましい例としては、例えば、グルコース−１，６−ジリン酸、フルクトース−１，６−ジリン酸、フルクトース−２，６−ジリン酸、アラビノース−５−リン酸、エリスロース−４−リン酸、グリセリン酸−２−リン酸、グリセリン酸−３−リン酸、グリセリン酸−２，３−ジリン酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸、グリセロール−３−リン酸、マルトース−６−リン酸などが挙げられる。なお、糖リン酸エステルは２種以上を併用してもよい。
Ａｐ５Ａと糖リン酸エステルの使用量は、Ａｐ５Ａと糖リン酸エステルの相互の使用量、検体中の溶血成分含量などに依存するが、前述のようにＡｐ５ＡはＣＰＫ活性測定反応液中、約１００μＭの濃度で使用するのが好ましく、この場合、糖リン酸エステルはＣＰＫ活性測定反応液中で０．２〜５ｍＭ程度、好ましくは０．３〜３ｍＭ程度に調整される。０．２ｍＭ未満では効果が不十分であり、また５ｍＭを超えるとＣＰＫ活性を阻害するおそれがある。
【０００９】
本発明の方法はＣＰＫ活性測定反応液中にＡｐ５Ａと糖リン酸エステルを共存させることにより行うことができ、本発明の方法によれば、溶血干渉を回避できるので、シングルレートで測定を行うことができる。更に、従来のダブルレートする場合においても、検体盲検の吸光度変化量は小さい方が正確に測定されるため、ダブルレートに本発明の方法を適用しても効果を奏する。
また、本発明の方法は、前述の反応式−１，２，３に基づくＣＰＫ活性の測定法に限らず、酵素反応を利用したＣＰＫ活性の測定法であって、溶血干渉を受ける方法であれば、何れの方法にも効果的に利用することができる。
【００１０】
次に、本発明のＣＰＫ活性測定試薬は、前記反応式−１，２，３に基づくＣＰＫ活性測定用試薬であり、
(a)第１試薬と第２試薬よりなり、
(b)第１試薬はβ−ＮＡＤ（Ｐ）を少なくとも含有し、第２試薬はＡＤＰ及びクレアチンリン酸を少なくとも含有し、
(c)Ａｐ５Ａ及び糖リン酸エステルのそれぞれが第１試薬及び第２試薬の少なくとも一方に添加されていること、
からなる。
前述のように、現在、ＣＰＫ活性測定用試薬においては液状製剤が好まれているが、前記反応式−１，２，３に基づくＣＰＫ活性測定試薬の構成成分において、グルコース、β−ＮＡＤ（Ｐ）及びＧ６ＰＤＨを共存させると、経時的にβ−ＮＡＤ（Ｐ）が還元されてβ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが生成して試薬ブランクの上昇が起こり、またクレアチンリン酸やＡＤＰはアルカリ性側で安定であることが判明した。
【００１１】
このような事実から、本発明者等は、液状で且つ安定性の高いＣＰＫ活性測定用試薬を得るため、試薬各成分の組合せを種々検討した結果、測定用試薬を第１試薬と第２試薬に分け、第１試薬にはβ−ＮＡＤ（Ｐ）を少なくとも含有させ、第２試薬はＡＤＰ及びクレアチンリン酸を少なくとも含有させることにより、測定用試薬の安定性を著しく高められることが判明した。更に、Ａｐ５Ａ及び糖リン酸エステルをそれぞれ第１試薬及び第２試薬の少なくとも一方に添加（好ましくは第１試薬にＡｐ５Ａを、第２試薬に糖リン酸エステルを添加）することにより、溶血干渉の回避を図った。なお、他の試薬成分であるＧ６ＰＤＨ、ＨＫ、グルコースなどは、保存安定性や酵素反応性を考慮して、第１試薬及び／又は第２試薬に添加される。
即ち、本発明のＣＰＫ活性測定用試薬は、安定性の高い液状製剤であり、且つ溶血干渉を回避できる試薬を提供するものである。
【００１２】
上記の第１試薬は適当な緩衝液（例えば、イミダゾール緩衝液、トリス緩衝液等）溶液とされ、液性は弱酸性（ｐＨ６．０〜６．８程度）とするのが好ましく、また第２試薬は適当な緩衝液（例えば、ジエタノールアミン緩衝液、モノエタノールアミン緩衝液等）溶液とされ、液性はアルカリ性（ｐＨ８．５〜９．５程度）とするのが好ましい。
また、ＣＰＫは、チオール化合物、Ｍｇ²⁺などにより活性化されるので、第１試薬及び／又は第２試薬には、これらの活性化成分を添加するのが好ましい。
なお、Ａｐ５Ａ及び糖リン酸エステルの使用量は前述の条件を引用することができる。
より具体的に一例を示すと、第１試薬としては、２〜３ｍＭのβ−ＮＡＤ（Ｐ）、２〜３Ｕ／ｌのＧ６ＰＤＨ、４〜６Ｕ／ｌのＨＫ、１０ｍＭ程度の酢酸マグネシウム、２ｍＭ程度のＥＤＴＡ、４０〜５０ｍＭのチオグリセロールを含有するイミダゾール緩衝液（ｐＨ６．５程度）；第２試薬としては、６．５〜７．５ｍＭのＡＤＰ、６５〜８０ｍＭのグルコース、９０〜１２０ｍＭのクレアチンリン酸、１０ｍＭ程度の酢酸マグネシウム、２ｍＭ程度のＥＤＴＡ、５〜２０ｍＭ程度のＡＭＰを含有するジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．０程度）が例示される。
【００１３】
本発明の試薬の使用法としては、例えば、検体と第１試薬とを混合し、３７℃程度で５分間程度インキュベートした後、第２試薬を添加して２分間程度インキュベートし、次いで波長３４０ｎｍの吸光度変化量を測定することによりＣＰＫ活性を測定することができる。
本発明の方法及び試薬は、臨床検査における血清検体中のＣＰＫ活性測定などに利用される。
【００１４】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、溶血干渉を回避することができるので、検体の性状にかかわらずＣＰＫ活性を正確に測定することができるという効果を奏する。
また、本発明の試薬によれば、溶血干渉を回避できると共に、長期間安定な液状製剤を得ることができるという効果を奏する。
【００１５】
【実施例】
以下、参考例及び実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
参考例１
１００ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ５．８，ｐＨ６．６，ｐＨ７．３）、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．１）、１００ｍＭジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．１）、１００ｍＭモノエタノールアミン緩衝液（ｐＨ１０．１）に１０ｍＭのクレアチンリン酸及びＡＤＰを別々に溶解し、３０℃で１４日間放置後、クレアチンリン酸濃度とリン酸濃度及びＡＤＰ濃度とリン酸濃度の測定を行った。
その結果を図１（クレアチンリン酸の安定性）及び図２（ＡＤＰの安定性）に示す。ＡＤＰ、クレアチンリン酸ともｐＨ９以上では安定性は良好であるが、酸性側ではリン酸の生成に比例して残存量が低下している。従ってＡＤＰ、クレアチンリン酸はアルカリ側の試薬に添加した方が試薬の安定化が図れる。
【００１６】
参考例２
以下の組成のＣＰＫ試薬を調製し、第２試薬にＡｐ５Ａの濃度を変えて添加した。溶血液は、ヒト血球を生理食塩水で洗浄したものに精製水を加え、−２０℃で凍結融解させて調製した。検体は、ヒト血清９容に溶血液１容を加えて、ヘモグロビン濃度が５００ｍｇ／ｄｌになるよう調製した。溶血液の代わりに精製水１容添加したものをコントロールとした。検体８μｌに第１試薬２５０μｌを加え３７℃で５分間インキュベートした。これに第２試薬１００μｌを加え２分間インキュベート後、波長３４０ｎｍの吸光度変化量からＣＰＫ活性を測定した。結果を図３に示した。
図３から分かるように、Ａｐ５Ａは１００μＭまではＭＫ活性に相当すると思われる溶血干渉の低下が見られるが、１００μＭ以上では濃度を上げても溶血干渉は低くならない。従って、この溶血干渉分はＭＫ以外の成分による干渉と考えられた。
【００１７】
（第１試薬）
１４３ｍＭイミダゾール、２ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、４３ｍＭチオグリセロール、２．８６ｍＭ β−ＮＡＤ（Ｐ）、２．５Ｕ／ｌＧ６ＰＤＨ、５Ｕ／ｌＨＫ（ｐＨ８．６）
（第２試薬）
２ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、７．１６ｍＭＡＤＰ、１７．９ｍＭＡＭＰ、７２ｍＭグルコース、１０４ｍＭクレアチンリン酸（ｐＨ９．０）
【００１８】
実施例１
参考例２の試薬組成の第２試薬に０．３６ｍＭＡｐ５Ａを添加し（ＣＰＫ活性測定反応液中、１００μＭ）、第１試薬に１ｍＭ（ＣＰＫ活性測定反応液中、０．７ｍＭ）の各種リン酸エステルを添加した。検体及び操作方法は、参考例２に準じて調製、操作した。結果を表１に示した。
表１に示されるように、糖リン酸エステルを添加することにより、溶血干渉を回避できるとことが判明した。
【００１９】
【表１】

【００２０】
実施例２
実施例１で特に効果の高かった糖リン酸エステルの濃度を変えて実施例１と同様に操作し、糖リン酸エステル濃度の影響を調べた。その結果を表２に示す。表２に示される結果より、ＣＰＫ活性測定反応液中に０．２ｍＭ以上の濃度で効果が現われる。添加量が多い程影響を回避できるが、ＣＰＫ活性も低下することから０．２〜３ｍＭ以下の添加が好ましい。
【００２１】
【表２】

【００２２】
実施例３
溶血液の添加量を変えてヘモグロビン量として０，１００，２００，３００，４００，５００ｍｇ／ｄｌになるよう検体を調製した。実施例１の第２試薬に３ｍＭ（ＣＰＫ活性測定反応液中、０．８４ｍＭ）のグリセリン酸−２，３−ジリン酸を添加し、各検体のＣＰＫ活性を測定した。その結果を表３に示す。
またダブルレートのできる試薬として以下の試薬を調製し、第２試薬反応分から第１試薬反応分（検体盲検）を差し引く方法と比較した。その結果も表３に示した。
表３に示されるように、ダブルレートの主反応では最大２２Ｕ／ｌの溶血干渉を受けているが、盲検を差し引くと最大５Ｕ／ｌの溶血干渉になる。それに対して、グリセリン酸−２，３−ジリン酸を添加した本発明は、シングルレートでも最大５Ｕ／ｌの溶血干渉であることが明らかになった。
【００２３】
（第１試薬）
１４３ｍＭイミダゾール、２ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭＡＤＰ、５ｍＭＡＭＰ、２０ｍＭグルコース、４３ｍＭチオグリセロール、２．８６ｍＭ β−ＮＡＤ（Ｐ）、２．５Ｕ／ｌＧ６ＰＤＨ、５Ｕ／ｌＨＫ（ｐＨ８．６）
（第２試薬）
２ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．３６ｍＭＡｐ５Ａ、３ｍＭグリセリン酸−２，３−ジリン酸、２ｍＭＡＤＰ、５ｍＭＡＭＰ、２０ｍＭグルコース、１０４ｍＭクレアチンリン酸（ｐＨ９．０）
【００２４】
【表３】

【図面の簡単な説明】
【図１】クレアチンリン酸のｐＨ安定性を示す図である。
【図２】ＡＤＰのｐＨ安定性を示す図である。
【図３】溶血干渉に与えるＡｐ５Ａの効果を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method and a reagent for measuring creatine phosphokinase (hereinafter referred to as CPK) activity. More specifically, the present invention relates to a method capable of avoiding interference due to hemolysis in a method for measuring CPK activity by an enzymatic method and a reagent therefor.
[0002]
[Prior art]
CPK is an SH enzyme having a molecular weight of about 80,000, and reversibly catalyzes an enzyme reaction represented by the following reaction formula-1 and plays an important role in energy metabolism accompanying muscle contraction. Since CPK has an abnormal increase in acute myocardial infarction, polymyositis, and progressive muscular dystrophy, CPK activity is measured (quantified) in clinical tests. In addition, measurement of CPK activity is also used for discrimination of muscular atrophy.
As shown in the following reaction formulas-1, 2, and 3, CPK activity is measured by conjugating hexokinase (HK) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) using creatine phosphate and ADP as substrates. -It is carried out by an enzyme reaction method that measures the increase in absorbance of NAD (P) H.
[0003]

[0004]
However, in the above method, when the CPK activity in the hemolyzed specimen is measured, positive interference is caused by the components in the blood cells. This is because MK (myokinase) generates ATP and AMP using ADP as a substrate (see Reaction Formula-4), and thus is added to ATP generated by CPK activity and measured.
In order to avoid the influence of hemolysis (generally referred to as hemolysis interference), there are roughly two methods. One is to inhibit the activity of MK, and AMP, P ¹ , P ⁵ -di (adenosine- ^{5 ′} -) pentaphosphate (hereinafter referred to as Ap5A) is added (clinical chemistry / supplement) 231-255; 1987). In addition, there are reports of adding NaF (Clin. Chem., 23 , 1569-1575; 1977), anti-myokinase antibody (JP-A-5-260997) and the like. The other is a method of avoiding hemolytic interference by taking a sample blind test (measured value using a sample excluding creatine phosphate) and subtracting that value. Since it has become possible to do so, it is widely used. The principle of this method is to divide the reagent into two, add everything except creatine phosphate to the first reagent, and make the second reagent creatine phosphate. Only the specimen and the first reagent are reacted to measure the absorbance change material (measurement of MK activity). Next, the second reagent is added and reacted to measure the amount of change in absorbance (measurement of MK + CPK activity). In this method, the true CPK activity is obtained by subtracting the amount of change in absorbance before and after.
[0005]
However, the above-described method cannot be applied to an automatic analyzer that cannot perform double rate, and not only a decrease in reproducibility occurs due to the measurement and subtraction twice, but also a change in pH before and after the addition of the second reagent. However, since the reaction conditions change due to dilution, there is a problem that blinding cannot be accurately performed. In addition, since everything except creatine phosphate is added to the first reagent, there arises a problem that the stability of the reagent is lowered. For example, when glucose, NAD (P) and G6PDH coexist, G6PDH has glucose dehydrogenase activity, so that NAD (P) becomes NAD (P) H and the reagent blank rises over time. Moreover, the pH stability of ADP is stable on the alkali side (pH 8 or higher), and on the acidic side, it is hydrolyzed with time to release the phosphate group to AMP. In particular, recently, a liquid stabilizing reagent has been demanded, and it is necessary to eliminate such an unstable factor as much as possible. Therefore, it is more stable to add glucose and ADP to an alkaline second reagent (creatine phosphate also exhibits the same pH stability as ADP). However, conversely, when such a stabilized liquid reagent is used, there is a drawback that double rate cannot be obtained.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
Due to such problems, the present inventors have conducted intensive studies for the purpose of a reagent that can avoid hemolysis interference and has excellent liquid stability. First, an experiment was conducted in which a large amount of Ap5A that has been conventionally used as an inhibitor of MK activity was added (see Reference Example 2 and FIG. 3 below). As a result, it was found that even when Ap5A was added in an amount of about 100 μM or more, hemolysis interference could not be completely avoided, and constant hemolysis interference was received. This fact was considered that hemolysis interference was caused by blood cell components other than MK (95% is presumed to be interference due to MK activity from the results in FIG. 3). Therefore, the present inventors have been able to inhibit glycolytic enzymes by adding various sugar phosphates, since blood cell components contain a large amount of glycolytic enzymes and substrate components (sugar phosphate esters). As a result, when Ap5A and sugar phosphate ester were used in combination, it was found that hemolysis interference can be significantly reduced. It has also been found that a highly stable liquid preparation can be obtained by optimizing the combination of each component of the measuring reagent. The present invention has been made based on such findings, and an object of the present invention is to provide a CPK activity measurement method capable of avoiding hemolysis interference and a CPK activity measurement reagent having good liquid stability.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The gist of the present invention made to solve the above problems is as follows.
(a) A method for measuring the activity of creatine phosphokinase using the enzyme reaction represented by the following reaction formulas (1), (2) and (3), excluding Ap5A and glucose-6-phosphate method for measuring creatine phosphokinase activity, characterized in that by using the sugar phosphate ester to avoid hemolysis interference;
[Chemical 2]

(b) Glucose-1,6-diphosphate, fructose-1,6-diphosphate, fructose-2,6-diphosphate, arabinose-5-phosphate, erythrose-4-phosphate as a sugar phosphate ester , Glyceric acid-2-phosphoric acid, glyceric acid-3-phosphoric acid, glyceric acid-2,3-diphosphoric acid, glyceraldehyde-3-phosphoric acid, glycerol-3-phosphoric acid and maltose-6-phosphoric acid The method according to the above (a), using one or more selected ones;
(c) A reagent for measuring creatine phosphokinase activity used in the method for measuring creatine phosphokinase activity described in (a) or (b ) above, comprising a first reagent and a second reagent, wherein the first reagent is β -NAD (P) at least, the second reagent contains at least ADP and creatine phosphate, and Ap5A and sugar phosphate are added to at least one of the first reagent and the second reagent, respectively. A reagent for measuring creatine phosphokinase activity;
It is.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention consists of the above structure, the measuring method of the present invention, the above reaction formula (1), (2) and measurement of CPK activity using an enzyme reaction represented by (3), and Ap5A, glucose - It consists avoiding hemolysis interference using a sugar phosphate ester except 6-phosphate. That is, as described above, Ap5A alone is difficult to completely avoid hemolysis interference reduction and Ap5A the present invention, the combination with hemolysis interfere with sugar phosphate ester except glucose-6-phosphate To do.
In the present invention, as the sugar phosphate ester, various sugar phosphate esters can be used as long as they can reduce hemolytic interference by using together with Ap5A. Preferred examples include glucose- 1,6-diphosphate, fructose-1,6-diphosphate, fructose-2,6-diphosphate, arabinose-5-phosphate, erythrose-4-phosphate, glyceric acid-2-phosphate, glyceric acid -3-phosphoric acid, glyceric acid-2,3-diphosphoric acid, glyceraldehyde-3-phosphoric acid, glycerol-3-phosphoric acid, maltose-6-phosphoric acid and the like. Two or more sugar phosphates may be used in combination.
The use amount of Ap5A and sugar phosphate ester depends on the mutual use amount of Ap5A and sugar phosphate ester, the hemolytic component content in the sample, etc. As described above, Ap5A is about 100 μM in the CPK activity measurement reaction solution. In this case, the sugar phosphate is adjusted to about 0.2 to 5 mM, preferably about 0.3 to 3 mM in the CPK activity measurement reaction solution. If it is less than 0.2 mM, the effect is insufficient, and if it exceeds 5 mM, CPK activity may be inhibited.
[0009]
The method of the present invention can be carried out by coexisting Ap5A and a sugar phosphate ester in the reaction solution for measuring the CPK activity. According to the method of the present invention, hemolysis interference can be avoided, so measurement is performed at a single rate. Can do. Further, even in the case of the conventional double rate, the smaller the amount of change in absorbance in the sample blind, the more accurately the measurement is performed.
In addition, the method of the present invention is not limited to the method for measuring CPK activity based on the above-described reaction formulas-1, 2, and 3. Any method can be used effectively.
[0010]
Next, the CPK activity measurement reagent of the present invention is a CPK activity measurement reagent based on the above reaction formulas-1, 2, 3;
(a) a first reagent and a second reagent,
(b) the first reagent contains at least β-NAD (P), the second reagent contains at least ADP and creatine phosphate,
(c) Ap5A and sugar phosphate ester are added to at least one of the first reagent and the second reagent,
Consists of.
As described above, at present, liquid preparations are preferred for the reagent for measuring CPK activity. However, in the components of the reagent for measuring CPK activity based on the reaction formulas-1, 2, 3, glucose, β-NAD (P ) And G6PDH, β-NAD (P) is reduced over time and β-NAD (P) H is generated to raise the reagent blank, and creatine phosphate and ADP are stable on the alkaline side. It turned out to be.
[0011]
Based on these facts, the present inventors have studied various combinations of each component of the reagent in order to obtain a liquid and highly stable reagent for measuring CPK activity. As a result, the measuring reagent is designated as the first reagent and the second reagent. It was found that the stability of the measuring reagent can be remarkably enhanced by containing at least β-NAD (P) in the first reagent and at least containing ADP and creatine phosphate in the second reagent. Furthermore, Ap5A and sugar phosphate ester are added to at least one of the first reagent and the second reagent, respectively (preferably Ap5A is added to the first reagent and sugar phosphate ester is added to the second reagent), thereby preventing hemolysis interference. I tried to avoid it. Other reagent components such as G6PDH, HK, and glucose are added to the first reagent and / or the second reagent in consideration of storage stability and enzyme reactivity.
That is, the reagent for measuring CPK activity of the present invention is a highly stable liquid preparation and provides a reagent that can avoid hemolysis interference.
[0012]
The first reagent is an appropriate buffer solution (for example, imidazole buffer solution, Tris buffer solution, etc.), and the liquid property is preferably weakly acidic (pH 6.0 to 6.8). The reagent is an appropriate buffer solution (for example, diethanolamine buffer solution, monoethanolamine buffer solution, etc.), and the liquid property is preferably alkaline (pH of about 8.5 to 9.5).
Further, since CPK is activated by a thiol compound, Mg ²⁺ or the like, it is preferable to add these activating components to the first reagent and / or the second reagent.
In addition, the above-mentioned conditions can be cited for the usage amount of Ap5A and sugar phosphate ester.
More specifically, as the first reagent, as the first reagent, 2-3 mM β-NAD (P), 2-3 U / l G6PDH, 4-6 U / l HK, 10 mM magnesium acetate, about 2 mM EDTA, imidazole buffer solution (about pH 6.5) containing 40-50 mM thioglycerol; 6.5-7.5 mM ADP, 65-80 mM glucose, 90-120 mM creatine phosphorus as the second reagent Examples include diethanolamine buffer solution (about pH 9.0) containing acid, about 10 mM magnesium acetate, about 2 mM EDTA, and about 5 to 20 mM AMP.
[0013]
As a method of using the reagent of the present invention, for example, a sample and a first reagent are mixed, incubated at about 37 ° C. for about 5 minutes, then added with the second reagent, incubated for about 2 minutes, and then with a wavelength of 340 nm. CPK activity can be measured by measuring the amount of change in absorbance.
The method and reagent of the present invention are used for measuring CPK activity in serum samples in clinical examinations.
[0014]
【The invention's effect】
According to the method of the present invention, since hemolysis interference can be avoided, there is an effect that CPK activity can be accurately measured regardless of the properties of the specimen.
Moreover, according to the reagent of the present invention, it is possible to avoid hemolysis interference and to obtain a liquid preparation that is stable for a long period of time.
[0015]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail based on a reference example and an Example, this invention is not limited to these examples.
Reference example 1
100 mM imidazole buffer (pH 5.8, pH 6.6, pH 7.3), 100 mM Tris buffer (pH 8.1), 100 mM diethanolamine buffer (pH 9.1), 100 mM monoethanolamine buffer (pH 10.1) 10 mM creatine phosphate and ADP were dissolved separately and allowed to stand at 30 ° C. for 14 days, and then measured for creatine phosphate concentration, phosphate concentration, ADP concentration, and phosphate concentration.
The results are shown in FIG. 1 (stability of creatine phosphate) and FIG. 2 (stability of ADP). Both ADP and creatine phosphate have good stability at pH 9 or higher, but on the acidic side, the residual amount decreases in proportion to the production of phosphoric acid. Therefore, the reagent can be stabilized by adding ADP and creatine phosphate to the alkali side reagent.
[0016]
Reference example 2
A CPK reagent having the following composition was prepared and added to the second reagent at different concentrations of Ap5A. Lysed blood was prepared by adding purified water to human blood cells washed with physiological saline, and freeze-thawing at −20 ° C. The specimen was prepared by adding 1 volume of hemolyzed blood to 9 volumes of human serum so that the hemoglobin concentration was 500 mg / dl. As a control, 1 volume of purified water was added instead of hemolyzed blood. 250 μl of the first reagent was added to 8 μl of the sample and incubated at 37 ° C. for 5 minutes. 100 μl of the second reagent was added thereto and incubated for 2 minutes, and then the CPK activity was measured from the change in absorbance at a wavelength of 340 nm. The results are shown in FIG.
As can be seen from FIG. 3, Ap5A shows a decrease in hemolysis interference that seems to correspond to MK activity up to 100 μM, but hemolysis interference does not decrease at higher concentrations than 100 μM. Therefore, this hemolytic interference was considered to be interference due to components other than MK.
[0017]
(First reagent)
143 mM imidazole, 2 mM EDTA, 10 mM magnesium acetate, 43 mM thioglycerol, 2.86 mM β-NAD (P), 2.5 U / l G6PDH, 5 U / l HK (pH 8.6)
(Second reagent)
2 mM EDTA, 10 mM magnesium acetate, 7.16 mM ADP, 17.9 mM AMP, 72 mM glucose, 104 mM creatine phosphate (pH 9.0)
[0018]
Example 1
0.36 mM Ap5A was added to the second reagent having the reagent composition of Reference Example 2 (in the CPK activity measurement reaction solution, 100 μM), and 1 mM (in the CPK activity measurement reaction solution, 0.7 mM) various phosphoric acids. The ester was added. The specimen and the operating method were prepared and operated according to Reference Example 2. The results are shown in Table 1.
As shown in Table 1, it was found that hemolysis interference can be avoided by adding sugar phosphate ester.
[0019]
[Table 1]

[0020]
Example 2
The effect of the sugar phosphate ester concentration was examined by changing the concentration of the sugar phosphate ester, which was particularly effective in Example 1, in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 2. From the results shown in Table 2, the effect appears at a concentration of 0.2 mM or more in the CPK activity measurement reaction solution. The effect can be avoided as the addition amount increases, but the addition of 0.2 to 3 mM or less is preferable because CPK activity also decreases.
[0021]
[Table 2]

[0022]
Example 3
Samples were prepared so that the amount of hemoglobin was changed to 0, 100, 200, 300, 400, 500 mg / dl by changing the amount of hemolyzed blood. 3 mM (0.84 mM in CPK activity measurement reaction solution) of glyceric acid-2,3-diphosphate was added to the second reagent of Example 1, and the CPK activity of each specimen was measured. The results are shown in Table 3.
In addition, the following reagents were prepared as reagents capable of double rate, and compared with the method of subtracting the first reagent reaction (sample blind) from the second reagent reaction. The results are also shown in Table 3.
As shown in Table 3, the double-rate main reaction receives a maximum of 22 U / l of hemolytic interference, but subtracting the blind results in a maximum of 5 U / l of hemolytic interference. In contrast, the present invention to which glyceric acid-2,3-diphosphoric acid was added was found to have hemolysis interference of up to 5 U / l even at a single rate.
[0023]
(First reagent)
143 mM imidazole, 2 mM EDTA, 10 mM magnesium acetate, 2 mM ADP, 5 mM AMP, 20 mM glucose, 43 mM thioglycerol, 2.86 mM β-NAD (P), 2.5 U / l G6PDH, 5 U / l HK (pH 8.6)
(Second reagent)
2 mM EDTA, 10 mM magnesium acetate, 0.36 mM Ap5A, 3 mM glyceric acid-2,3-diphosphate, 2 mM ADP, 5 mM AMP, 20 mM glucose, 104 mM creatine phosphate (pH 9.0)
[0024]
[Table 3]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the pH stability of creatine phosphate.
FIG. 2 is a graph showing the pH stability of ADP.
FIG. 3 shows the effect of Ap5A on hemolytic interference.

Claims

A method for measuring the activity of creatine phosphokinase using an enzyme reaction represented by the following reaction formulas (1), (2) and (3), wherein P ¹ , P ⁵ -di (adenosine-5′-) and penta phosphate, method for measuring creatine phosphokinase activity, characterized in that to avoid hemolysis interference using a sugar phosphate ester except glucose-6-phosphate.

As sugar phosphates, glucose-1,6-diphosphate, fructose-1,6-diphosphate, fructose-2,6-diphosphate, arabinose-5-phosphate, erythrose-4-phosphate, glyceric acid -2-phosphoric acid, glyceric acid-3-phosphoric acid, glyceric acid-2,3-diphosphoric acid, glyceraldehyde-3-phosphoric acid, glycerol-3-phosphoric acid and maltose-6-phosphoric acid The method of Claim 1 which uses 1 type (s) or 2 or more types.

A reagent for measuring creatine phosphokinase activity used in the method for measuring creatine phosphokinase activity according to claim 1 or 2, comprising a first reagent and a second reagent, wherein the first reagent comprises β-NAD (P). At least, the second reagent contains at least ADP and creatine phosphate, and P ¹ , P ⁵ -di (adenosine- ^{5 ′} -) pentaphosphate and sugar phosphate ester are at least one of the first reagent and the second reagent, respectively. A reagent for measuring creatine phosphokinase activity, which is added to one side.