JP4067441B2 - Capillary electrophoresis method, capillary electrophoresis program, recording medium storing the program, and capillary electrophoresis apparatus - Google Patents

Description

【００１９】
ここで、ｍは移動度（ｃｍ^２・Ｖ^−１・ｓ^−１）、Ｖは泳動するときの速度（ｃｍ・ｓ^−１）、Ｅは電位勾配（Ｖ・ｃｍ^−１）である。
【００２０】
移動度には、絶対移動度ｍ_０と実効移動度ｍがある。絶対移動度(Absolute mobility）は無限希釈（イオン強度は０）の溶液における完全解離状態の移動度のことであり、実効移動度（Effective mobility）はイオン間の相互作用がある実溶液中の移動度のことである。この絶対移動度は、イオンのサイズ、拡散係数などそのイオン特有の性質および溶媒の粘度や温度等によって決まる物理定数である。すなわち、その値はイオン種によって固有の値を示す。なお、ｍ_０の値は２５℃で通常１０^−４（ｃｍ^２・Ｖ^−１・ｓ^−１）のオーダーである。また、ｍ_０には１℃あたり約２％の温度依存性がある。
【００２１】
水和しているイオンの半径をＳｔｏｋｅｓ半径とみなすと、Ｓｔｏｋｅｓの法則に従って絶対移動度は次式で与えられる。
【００２２】
【数２】

【００２３】
ここで、Ｚは電荷、ｅは電子素量１．６０２２×１０^−１９（Ｃ）、ｒは球状粒子の水和半径、ηは媒体の粘度である。いくつかの有機イオン種の移動度は数式１によって計算することができる。また、逆に水和半径が正確にわかっている場合にはその絶対移動度は非常に精度よく求めることができる。
【００２４】
しかし、複雑な多原子分子イオンにおいてこの概念は当てはまらない。そこでＪｏｋｌは、有機イオンや錯イオンの絶対移動度は√Mに反比例するとした次式の経験式を導いた。
【００２５】
【数３】

【００２６】
ここで、Ｚは電荷、Ｍは錯体の式量、ｋは比例定数である。この経験式によって多くの複雑な錯イオンの絶対移動度が計算された。
【００２７】
Ａ−２ 実効移動度
移動度を考える上で重要なことは、実際の溶液中で影響するファクターを考慮しなければならないことである。ここで、実際の溶液中での移動度を実効移動度ｍという。ｍは一定でなく、例えば、溶媒の誘電率、イオン強度、ｐＨなどによって大きく変化する。ここで、実際の溶液中での移動度を実効移動度、いま溶液中でイオン化しうる物質をＡとする。この物質Ａは、中性分子および各イオン種Ａ_０、Ａ_１、Ａ_２、……Ａ_ｋ全体を表しており、これらが速くて動的な化学平衡状態にあり、巨視的な視野では実在しているものとしてふるまう。例えば、リン酸塩は、水溶液中で中性分子Ｈ_３ＰＯ_４および各イオン種Ｈ_２ＰＯ^４−、ＨＰＯ_４ ^２−、ＰＯ_４ ^３−の形で存在している。
電気泳動的な視野においては、全粒子をＡ_０、Ａ_１、Ａ_２、……Ａ_ｋ、各種の移動度をｍ_０、ｍ_１、ｍ_２、……ｍ_ｋ、そして各濃度をｃ_０、ｃ_１、ｃ_２、……ｃ_ｋとすると、それらは電場中で同一の物質として実効移動度ｍ_Ａで泳動し、次式で表される。
【００２８】
【数４】

【００２９】
ここで、ｘ_ｉはイオンｉのモル分率であり、ｃ_Ａは物質Ａの全濃度である。
【００３０】
【数５】

【００３１】
これにより、リン酸塩の実効移動度は次のように表される。
【００３２】
【数６】

【００３３】
化学平衡がｐＨの影響を受けることから、実効移動度も当然ｐＨの影響を受ける。ｐＨと１価の弱酸および弱塩基の実効移動度ｍとの依存関係は、それぞれ弱酸の解離曲線、弱塩基のプロトン化曲線に対応しているような特徴的な関係をもつ。弱酸ＨＡについて、実効移動度は次式で表される。
【００３４】
【数７】

【００３５】
ここで、Ｋ_ＨＡは、酸ＨＡの解離定数であり、次式で表される。
Ｋ_ＨＡ＝［Ｈ^＋］［Ａ⁻］／［ＨＡ］
【００３６】
図３４は、酢酸におけるｐＨと実効移動度との関係を示す図である。図３４に示す曲線は、イオン移動度ｍ_Ａｃ＝４０×１０^−９（ｍ^２・Ｖ^−１・ｓ^−１）であり、ｐＫ_ａ（酸解離定数）＝４．７６の酢酸塩の移動度曲線を表している。すなわち、ｐＨ＞８においては、４０×１０^−９（ｍ^２・Ｖ^−１・ｓ^−１）、ｐＨ＝４．７６において２０×１０^−９（ｍ^２・Ｖ^−１・ｓ^−１）、ｐＨ＜２では０になっている。
【００３７】
もう１つの例として、アミノ酸やタンパク質のような両性電解質について説明する。これらの化合物は、周囲のｐＨによってカチオンやアニオンとして存在する。例えば、β‐アラニンの両性イオンの形は次のようである。
ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＯＯ^―
｜
ＮＨ_３ ^＋
アミノ酸の両性電解質としての特徴は、酸性領域から塩基性領域にうつるときの解離定数によって表される。第１の解離定数ｐＫ_１の値は、酸性領域におけるカルボキシル基のプロトン化、すなわち両性イオンがカチオンを構成する過程を示す。
【００３８】
【数８】

【００３９】
一方、第２の解離定数ｐＫ_２は、アミノ基のプロトンが解離し、両性イオンがアニオンを構成する過程を示している。
【００４０】
【数９】

【００４１】
β−アラニンは、ｐＫ_１＝３．８のときカチオン（＋）として存在し、その移動度は３６×１０^−９（ｍ^２・Ｖ^−１・ｓ^−１）、ｐＫ_２＝９．６のときはアニオン（−）として存在して、その移動度は−３１×１Ｏ^−９（ｍ^２・Ｖ^−１・ｓ^−１）となる。
【００４２】
図３５は、β−アラニンでの実効移動度とｐＨとの関係を示している。すなわち、ｐＨ＞１１において−３１×１Ｏ^−９（ｍ^２・Ｖ^−１・ｓ^−１）、７．５＞ｐＨ＞５において０、ｐＨ＜２において３６×１０^−９（ｍ^２・Ｖ^−１・ｓ^−１）、となっているので、β−アラニンをｐＨ＞７．５の電解液中で電気泳動させるとマイナス側にβアラニンイオンが移動し、５＞ｐＨの電解液中で電気泳動させるとプラス側に移動する。したがって、ｐＨ＞７．５の電解液と５＞ｐＨの電解液を隣接させた状態で、この電解液中にβ−アラニンを存在させ電気泳動させるとβ−アラニンは両電解液の境界面に濃縮されるか、境界面から反対側に離散していく。
【００４３】
図中のｐＫ１、ｐＫ２は、それぞれ酸解離定数で、アミノ酸のアミノ基部分が半分解離（移動度が絶対移動度約＋４０の半分約＋２０）した時のｐＨ値、カルボン酸部分が半分解離した時のｐＨ値をあらわしている。また、ｐＩは等電点で、ｐＨがこの値のときイオンの電荷は０（したがってイオンの移動度０）となる。ｐＩは次のようにあらわすことができる。
ｐＩ＝（ｐＫ１＋ｐＫ２）／２
【００４４】
Ａ−３ 相対移動度
相対移動度は次式で定義される。
【００４５】
【数１０】

【００４６】
ナトリウムイオンは参照イオンで、２５℃における移動度は次の式で与えられる。
【００４７】
【数１１】

【００４８】
上式は参照濃度ｃ_０を基準としたイオン強度として表され、ｍ_０は１０^−５（ｃｍ^２・Ｖ^−１・ｓ^−１）のオーダーで与えられる。また、ｚ_ｉは電荷である。
【００４９】
Ａ−４ 移動度と伝導度
図３６は、イオンの電気泳動と電流のモデルを示す図である。微視的視点から見ると、溶液中でのイオンの電気泳動は電解質溶液による電流の伝導と見なされる。電流Ｉ、イオン移動の平面幅の面積Ｓ、電流密度ｉには次の関係がある。
【００５０】
【数１２】

【００５１】
個々のイオン種がそれらの濃度、電荷、泳動速度に比例するかたちで電流密度に寄与する。その式は次式で表される。
【００５２】
【数１３】

【００５３】
ここで、ｃ_ｊはイオン種ｊの濃度で単位は（ｍｏｌ・ｍ^−３）、Ｆはファラデー定数（９６４８７（Ｃ・ｍｏｌ^−１））である。電流密度ｉはオームの法則により、電場強度Ｅと次の関係がある。
【００５４】
【数１４】

【００５５】
これにより、物性値である伝導度κと移動度には次の関係がある。
【００５６】
【数１５】

【００５７】
図中のｖは、ある電位勾配（Ｅ）下でのイオンの電気泳動速度である。ＦｃのＦはファラデー定数、ｃはイオンのモル濃度である。Ｆｃでイオン種ｊの運ぶ電気量を表す。なお、イオン種ｊがＺの価数を持つときは、Ｚを乗じてＺＦｃがイオン種ｊの電気量を表す。
【００５８】
Ａ−５ ｐＨ効果
混合試料の相互分離を可能にするには、各成分の実効移動度に適当な差が生じる必要がある。このためには適切な電解液条件を選択することが重要であり、特に、弱電解質を含む試料に対してはｐＨの選択が重要である。
【００５９】
電気泳動法による弱酸、弱塩基物質および両性物質の分離には、これらの物質の絶対移動度はあまり差がないので、解離度定数の差を利用して分離することがより効果的である。電解液のｐＨを調整して、イオン種の解離度を変えることにより実効移動度を変えることができる。解離度αとｐＨおよび酸解離定数ｐＫａの関係は次式で与えられる。
【００６０】
【数１６】

【００６１】
与えられた試料イオンを相互分離するには、リーディング電解液のｐＨをどのような値にするかがまず必要であり、絶対移動度やｐＫａが分かれば、コンピュータによるシミュレーションの手法により分離最適条件を見つけることが可能となる。逆に、各試料の実効移動度を測定し、シミュレーションによってその実効移動度にベストフィットするよう安定度定数や絶対移動度を計算することが可能である。図３４は、コンピューターシミュレーションを用いて有機酸の実効移動度のｐＨ依存性曲線を示したものである。このようなグラフを作成し、分離を対象とするイオン種の実効移動度差が大きくなるようにｐＨ領域を設定して実験を行えば容易に分離が達成される。
【００６２】
Ｂ キャピラリー電気泳動
Ｂ−１ 概要
キャピラリー電気泳動ＣＥとは、溶液中で電荷を持つ物質が電場の影響を受けて、電荷の種類により正負いずれかの電極方向へ一定速度で移動する電気泳動をキャピラリー中で行う分析法である。ＣＥは、１９７０年代終わりから８０年代初めにかけて開発された手法で、内径１００μｍ以下程度のキャピラリーを用いる電気泳動である。キャピラリーを利用することで多くの利点が得られる。特に、ジュール熱がおよぼす悪影響を減少させることができるのが大きな特徴である。キャピラリーは電気抵抗が高いので、非常に強い電場（１００〜５００（Ｖ／ｃｍ））を印加しても、流れる電流は小さく、熱の発生を最小限に抑えられる。また、キャピラリーは内容積に対して表面積の比率が大きく、発生する熱を効率良く放散できる。これにより、高電圧をかけることができるので、分析時間は短くなり高い分離効率と分離能が得られる。高電圧を印加したときに、キャピラリー内で溶液の流れ、すなわち電気浸透流が発生するが、この流れは、層流ではなく平面的な流れをもつので、しばしば１０^５（段／ｍ）を越える理論段数が得られる。この電気浸透流により、電荷の種類に関係なく全ての溶質を同時に分析することができる。その他、ＣＥは、様々な分離メカニズムや選択性をもつ多くの分離モードを有する、必要試料量が微小で済む、オンキャピラリーでの検出および定量分析が可能である、さらに分離系が単純であるので理論的取り扱いが容易であるなどの優れた特徴をもつ。その半面、試料注入量が少ないため、注入方法・再現性に課題がある。一般に、ＣＥは、分析目的に限られ、分取には利用できないことが多い。また、タンパク質のようなキャピラリー内壁に吸着する物質の取り扱いが困難であるなどの点が指摘されている。
【００６３】
Ｂ−２ 電気浸透流
電気浸透流ＥＯＦは、ＣＥにとって非常に重要な要素である。ＥＯＦはキャピラリー中の液全体の流れであり、キャピラリー内壁の表面電荷がその基になっている。電解質溶液中では、通常固体の表面は固体表面のイオン化（すなわち酸一塩基平衡）または固体表面へのイオン種の吸着、またはその両方によって生じる過剰の負電荷を帯びている。フューズドシリカキャピラリーについてもこの両方の現象が起きているものと予想され、内壁の多数のシラノール基（ＳｉＯＨ）のイオン化（ＳｉＯ⁻）が内壁において電気二重層を形成し、これに対して電圧をかけるとＥＯＦが生じる。この電気二重層によって壁面に近いところでは電位差が生じる。この電位差をゼータ電位（zeta potential；ζ）という。ＥＯＦが発生する過程としては電圧をキャピラリーの両端に加えると、電気二重層を形成している陽イオンは陰極の方へ引かれるが、陰イオンであるシラノール基は管壁に固定されているので移動できない。しかし、陽イオンは溶液に溶解しているので、陽イオンの移動によってキャピラリー中の全溶液は陰極の方へ引っ張られる。これがＥＯＦである。
【００６４】
電気浸透流速度ｖ_ＥＯＦは、支持電解液の誘電率εと粘性率η、ゼータ電位ζ_１およびキャピラリーに沿ってかけられている電場の強さＥの関数として以下の式（Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉの式）で与えられる。
【００６５】
【数１７】

【００６６】
ゼータ電位ζ_１は、キャピラリー内壁の荷電状態に応じて正負いずれの符号もとりうるが、通常の状態（フューズドシリカ素管に中性からアルカリ性の支持電解液を充填して用いる場合など）では負になるため、電気浸透流速度ｖ_ＥＯＦは正となり、従って電気浸透流は陽極から陰極へ向かう。εやηは、支持電解液の電解質濃度、ｐＨ、温度などに支配される。設定された条件下では、誘電率ε、粘性率ηおよびゼータ電位ζ_１は一定となるので、ｖ_ＥＯＦは電位勾配Ｅに依存し両者は比例関係にある。Ｅはキャピラリーの長さＬに対する印加電圧Ｖの比であり、従ってＶに比例する。結局、電気浸透流速度ｖ_ＥＯＦもＶとともに増加し、高電圧をかけるほど電気浸透流速度は速くなる。
【００６７】
キャピラリー中で起きるＥＯＦの独特の特徴として以下に示す２つが挙げられる。
（１）流れが平面的であるので試料ゾーンの拡散を起こさない
（２）電荷に関係なくほとんど全ての種を同じ方向に移動させる
それぞれの特徴について説明すると、１つめについては流れの駆動力はキャピラリーに沿って（すなわち内壁面で）一様に分布しているため、キャピラリー内での圧力降下がおきないので流れが均一になる。２つめについては通常の条件下（すなわち負に帯電したキャピラリー表面）では流れは陽極から陰極に向かう。ＥＯＦの速度は陰イオンの電気泳動速度よりも１桁以上大きいため、陰イオンも陰極へ向かって押し流される。従って陽イオン、中性物質、および陰イオンは全て同じ方向に移動することになり、１回の測定で、電気泳動分析を行うことができる。移動速度を考えると陽イオンは泳動方向と同じため最も早く、中性物質は互いに分離されないがすべてＥＯＦと同じであり、陰イオンは電気泳動の方向がＥＯＦと逆であるがＥＯＦによって陰極側へ最も遅く泳動する。
【００６８】
様々な理由から、キャピラリーの材質はフューズドシリカが頻繁に用いられている。フューズドシリカキャピラリーを用いる場合、支持電解液のｐＨが低いと内壁のシラノール基の電離が抑えられるために帯電が弱く、ζ_１が小さくなりｖ_ＥＯＦが減少する。逆にｐＨが高くなるとζ_１の絶対値は増加し、ｖ_ＥＯＦが上昇する。
【００６９】
Ｂ−３ ゾーン電気泳動
図３７は、キャピラリーゾーン電気泳動法（ＣＺＥ）の原理図である。図３７に示す図は、実効移動度の異なる試料をゾーン電気泳動分離した場合について、キャピラリー中における各ゾーン状態の模式図と電位勾配（Ｅ）の関係を示す。
【００７０】
ゾーン電気泳動法は、使用する電解液に１つの支持電解液（ＳＥ）を用いる。よって、電位勾配（Ｅ）はキャピラリーを通して一定になる。緩衝能を持つカウンターイオン（Ｑ）を含む電解液（支持電解液：ＳＥ）をキャピラリーに充填し、その間に試料を注入する。通電を開始すると試料中のアニオン、カチオン成分はそれぞれ対極に向かって固有の速度（実効移動度）で泳動するが、電気浸透流により全ての成分は陰極方向に向かって泳動する。ゾーン電気泳動法では試料ゾーンの界面自己保持作用がないため、試料ゾーンは不連続である。
【００７１】
各ゾーンの泳動速度（ｖ_ｍｉｇ）は、以下の式のように電気泳動速度（ｖ_ｅｐ）と電気浸透流速度（ｖ_ＥＯＦ）の和として表される。
【００７２】
【数１８】

【００７３】
ここでｍは、ある試料成分イオンの実効移動度、Ｅは電位勾配、ε、ζ、ηはそれぞれ溶媒の誘電率、キャピラリー内壁のゼータ電位、溶媒の粘度である。なお、キャピラリー全体で電気浸透流速度は一定である。イオンＳＥ、Ａ、Ｂ、Ｃの実効移動度は
【００７４】
【数１９】

【００７５】
なので、電位勾配が一定であれば、泳動速度ｖは次の関係が成立する。
【００７６】
【数２０】

【００７７】
試料はキャピラリー末端に固定された検出器まで移動した後検出される。
【００７８】
Ｂ−４ 等速電気泳動法
（原理）
等速電気泳動では、分析試料のいずれのイオンよりも移動度の大きいイオンを含む電解液（リーディング電解液）と、移動度の小さいイオンを含む電解液（ターミナル電解液）の２種類の電解液を用い、この両者の境界面に試料を注入し、通電することにより泳動を行うことが特徴である。定常状態になると分離された各イオンは等速で泳動するためこのような名がついている。
【００７９】
図３８は、等速電気泳動分離の原理図を表している。カチオン分析では陰極側にはリーディング電解液、陽極側にはターミナル電解液とし、両電解液の界面付近に分離を目的とする実効移動度の異なる陽イオン混合試料Ｓ（例えば、イオンＡ、Ｂを含む）を注入する（ａ）。この系に通電すると各陽イオンは泳動を開始し、実効移動度に差があるＡとＢのイオンは分離し始めるが、この状態ではＡとＢの混合ゾーンＭが存在し分離は不完全である（ｂ）。さらに、通電することにより混合ゾーンはなくなり、分離が完了すると各試料ゾーンは鋭い界面（界面の自己保持効果）で隔てられ、原則的に実効移動度の順に配列して泳動する（ｃ）。分離されたＡとＢのゾーンは、このままの状態（定常状態）を保ち陰極側へと移動していく。図のｃｌのグラフはｃの各ゾーンの実効移動度、ｃ２のグラフはｃの各ゾーンの電位勾配、ｃ３のグラフはｃの各ゾーンの温度を表している。
【００８０】
極希であるが、泳動順が逆転することがある。試料イオンがＡ、Ｂの順に泳動するとき、その泳動順を決定する必要十分条件はｍ_Ａ＞ｍ_Ｂではなく次式で表される２条件である。
【数２１】

【００８１】
ここで、ｍ_Ｂ，ＡはゾーンＡ中のＢの移動度であり、他も同様である。すなわち、試料イオンＢは、Ａゾーン内においてはＡイオンよりも遅く、試料イオンＡはＢゾーン内においてはＢイオンよりも速いことが必要十分条件である。
【００８２】
イオンＬ、Ａ、Ｂ、Ｔの実効移動度をそれぞれｍ_Ｌ、ｍ_Ａ、ｍ_Ｂ、ｍ_Ｔ、各ゾーンの電位勾配をそれぞれＥ_Ｌ、Ｅ_Ａ、Ｅ_Ｂ、Ｅ_Ｔ、各ゾーンの電導度をκ_Ｌ、κ_Ａ、κ_Ｂ、κ_Ｔ、とすると、定常状態においては等速で泳動しているので、次の関係式が成り立つ。
【００８３】
【数２２】

【００８４】
また、各イオンの実効移動度には次の関係がある。
【００８５】
【数２３】

【００８６】
よって、各ゾーンの電位勾配は次の関係となる。
【００８７】
【数２４】

【００８８】
等速電気泳動法においては泳動電流が一定であるので、修正オームの法則によると各ゾーンの電導度（κ）は次の関係となる。
【００８９】
【数２５】

【００９０】
このように、電位勾配（Ｅ）が測定できる電位勾配検出器、電導度（κ）が測定できる電導度検出器が等速電気泳動では用いられる。
【００９１】
等速電気泳動は、リーディングイオンの濃度によって薄い試料成分が分離過程で濃縮され、逆に濃い試料成分が薄められるという特徴がある。このことはマトリックス中の微量成分の分析には利点である。また試料イオンは、リーディングとターミナルの間を泳動する成分においては１００％の回収率であり、また多量の試料を注入することができ無駄なフラクションはないので、等速電気泳動は分離分取に優れている。
【００９２】
（濃縮効果）
通常、あるリーディング電解質のある濃度で行われる等速電気泳動分析の定常状態において、ある試料の濃度は一定に調整され泳動前の濃度には依存しない。このことからある試料ゾーンの体積を定量パラメータとして用いることができる。もし、調整された濃度よりも濃い試料を泳動させれば試料は希釈され、逆に調整された濃度より薄い試料を泳動させれば試料は濃縮される。この効果を利用すれば、試料中の微量構成要素であっても分析可能となるので実際の分析には重要である。
【００９３】
１．キャピラリーゾーン電気泳動装置
図１は、キャピラリーゾーン電気泳動装置の構成図である。この装置は、電源ユニット２０１、各種電解液を充填するリザーバー２０２および２０２’、被検物質を含む試料（以下単に試料ということがある）を充填するバイアル２０３、電気泳動を発生させるためのキャピラリー２０４、リザーバー等を載置するターンテーブル２０６および２０６’、前記ターンテーブルを上下・左右・回転駆動させる駆動部２０７および２０７’、吸光度検出部２１０、前記各部、手段等を制御するコントローラ２２０、データ処理部２３０を備える。キャピラリーゾーン電気泳動装置は、吸引ポンプ２０５、プリアンプ２２１、Ａ／Ｄコンバータ２２２をさらに備えてもよい。
【００９４】
また、吸光度検出部２１０は、例えば、ランプ（例えば、ＵＶランプ）、アパーチャ（絞り）、シャッター、分光器スリット、グリーティング（回折格子）、検出器２１５（例えば、５１２ｃｈのフォトダイオードアレイ）を有する。データ処理部２３０は、演算部２３１、インタフェース２３２、記憶部２３３、表示部２３４、出力部２３５を有する。なお、コントローラ２２０と演算部２３１は、例えばマイクロコンピューター等により兼用することができる。
【００９５】
電源ユニット２０１は、例えば、出力０〜３０ｋＶの高電圧電源を含み、配線を介して支持電解液を充填したリザーバー２０２、２０２’および試料を充填したバイアル２０３にそれぞれ接続されている。
【００９６】
リザーバー２０２、２０２’は、ターンテーブル２０６、２０６’に複数載置されている。リザーバー２０２、２０２’には、ＵＶ吸収のある適宜の支持電解液、分析試料のいずれのイオンよりも移動度の大きいイオンを含むリーディング電解液、移動度の小さいイオンを含むターミナル電解液がそれぞれ充填される。バイアル２０３は、分析対象となる試料（例えばＵＶ吸収のない試料）が充填され、ターンテーブル２０６または２０６’に載置することができる。また、例えば、濃度やｐＨの異なる試料を充填するための複数のバイアル２０３を備えてもよい。
【００９７】
なお、リザーバーとは、キャピラリー２０４の体積に対して十分大きく、電圧の印加やキャピラリー２０４内の液が少々流れ込んできても元々あった状態が変化しない液溜めと、場合によってはリザーバー中に充填されている電解液のことを言う。一方、バイアルとは、単に液体を充填する液溜めを言い、上述の例では、バイアル２０３には試料が充填されている。しかしながら、液体を充填するための液溜め容器そのものとしてはリザーバーとバイアルを区別する必要はない。
【００９８】
キャピラリー２０４は、適宜の内径および長さ（例えば、内径７５μｍ、長さ１００ｃｍ）を有する管であり、例えば、キャピラリー２０４の一端はリザーバー２０２に挿入され、他端はリザーバー２０２’に挿入されている。
【００９９】
本実施の形態おける電気泳動装置は、キャピラリー２０４を使用するために、例えば、ナノリットルオーダーのサンプルで分析が可能であり、高電圧を印加できるため短時間分析が可能である。一方、高電圧を印加する場合ジュール熱が発生するため、その影響を考慮する必要がある。例えば、異種の導体または半導体に流す電流を制御することで熱の発生、吸収のコントロールすることができるペルチェ素子を用いることにより、キャピラリー温度を調整することができる。なお、ペルチェ素子による制御以外にもキャピラリー２０４のオープンになっている部分が温度に与える影響も大きい。
【０１００】
ターンテーブル２０６および２０６’は、上下、左右および回転動し、キャピラリー２０４に充填する電解液等を切り替えるための切り替え手段である。ターンテーブル２０６および２０６’には、測定に必要な電解液および試料等を充填するリザーバ２０２、２０２’およびバイアル２０３が載置される。なお、図１に示すターンテーブル２０６および２０６’は、回転動することによりキャピラリー２０４に充填する電解液に切り替えるものであるが、例えば、左右または縦横方向に移動するものであってもよい。
【０１０１】
駆動部２０７および２０７’は、ターンテーブル２０６および２０６’を上下、左右および回転動させるための駆動手段であり、コントローラ２２０により制御される。
【０１０２】
吸光度検出部２１０のランプはＵＶ光（または白色光）を発行し、発光した光は、アパーチャ、シャッターを介してキャピラリー２０４に入射する。分光器スリットは、ランプから照射される紫外線の幅を制限するための隙間を有し、キャピラリー２０４近傍に配置され、又は、取り付けられている。キャピラリー２０４を透過した光は、分光器スリットを介してグリーティングに達し、例えば１９０〜６００ｎｍの光に分光され、検出器２１５上に結像される。
【０１０３】
検出器２１５は、例えば、紫外から近赤外までの広範囲にわたってダイナミックレンジを有するフォトダイオードアレイを５１２個配列したもので、５１２ｃｈの各波長ごとの光量に比例したビデオ信号として分光された光を検出する。フォトダイオードアレイは、ＰＮ接合または整流性を示す金属と半導体との接触の逆方向電流が光の照射による高起電力効果で増加する事を利用した光電変換装置である。これを５１２個用いる事によって高精度な多波長同時検出が可能である。
【０１０４】
プリアンプ２２１は、検出器２１５からの出力を増幅する。Ａ／Ｄコンバータ２２２は、増幅された信号をデジタル信号に変換し、コントローラ２２０およびデータ処理部２３０に出力する。
【０１０５】
コントローラ２２０は、電源ユニット２０１、駆動部２０７および２０７’等を制御して試料分析の動作を制御する。例えば、コントローラ２２０は、各電解液および試料の充填、電気泳動させるための電圧付与、吸光度感度の調整、電気的試料注入による電圧印加の時間を示す試料注入時間の調整等を行う。コントローラ２２０による検出感度や試料注入時間の調整によって、より高精度な試料分析が可能となり、低濃度試料の分析が可能となる。また、コントローラ２２０およびターンテーブル２０６、２０６’を備えることにより、分析による個人差がなくなり再現性の高いデータが得られる。また、多検体をセットするだけで容易な操作により自動測定が可能である。
【０１０６】
データ処理部２３０の演算部２３１は、検出器２１５によって信号化された吸光度をインタフェース２３２を介して入力する。また、演算部２３１は、入力した吸光度に基づき、電気泳動を開始してから検出器２１５が出力を発信するまでに要した時間を、被検物質の泳動時間として把握し記録する。演算部２３１は、泳動時間に基づき、後述するＴＣＤＴ方法によって実効移動度計算等の適宜のデータ処理を行い、処理結果を表示部２３４または出力部２３５に出力する。演算部２３１は、実効移動度に基づき、例えば、実効移動度と物質名が予め対応して記憶されたファイルを参照し、試料に含まれる成分を同定してもよい。
【０１０７】
２．電気泳動法及び動作
図２は、試料分析のメインフローチャートである。
まず、初期設定を行う（Ｓ１００）。例えば、試料の入ったバイアル２０３、支持電解液、リーディング電解液、ターミナル電解液がそれぞれ入ったリザーバー２０２をターンテーブル２０６にセットし、また、支持電解液の入ったリザーバー２０２’をターンテーブル２０６’にセットする。なお、ターンテーブル２０６には、濃度またはｐＨの異なる試料の入った複数のバイアル２０３がセットされてもよい。コントローラ２２０は、試料注入時間を設定する。試料注入時間は、例えば、予め上限と下限の時間が設定されており、コントローラ２２０は上限又は下限の時間を試料注入時間として設定することができる。
【０１０８】
次に、コントローラ２２０は、駆動部２０７、２０７’および電源ユニット２０１等を制御し、電解液および試料をキャピラリー２０４に充填する（Ｓ１０１）。コントローラ２２０は、電圧をキャピラリー２０４の両端に印加して電気泳動を開始させ、リーディング電解液と試料とターミナル電解液が電気泳動し分離された状態において、試料のウィンドウである分離ウィンドウ部分の吸光度（分離ウィンドウデータ）および泳動時間を測定する（Ｓ１０３）。コントローラ２２０は、検出器２１５からの出力に基づき試料内の成分が分離される分離ウィンドウを検出し、分離ウィンドウデータを採取する。
【０１０９】
また、コントローラ２２０は、採取した分離ウィンドウデータおよび泳動時間をデータ処理部２３０の演算部２３１に出力する。なお、コントローラ２２０は、電気泳動開始を示す信号および分離ウィンドウの検出を示す適宜の信号を演算部２３１に出力し、演算部２３１が泳動時間を測定し、検出器２１５から分離ウィンドウデータを入力するようにしてもよい。なお、充填動作、吸光度の測定の詳細については後述する。
【０１１０】
演算部２３１は、インタフェース２３２を介して分離ウィンドウデータおよび泳動時間を入力し、記憶部２３３に記憶する（Ｓ１０５）。なお、演算部２３１は、ステップＳ１０３での測定中分離ウィンドウデータを採取するたびにデータを入力および記憶するようにしてもよい。
【０１１１】
次に、コントローラ２２０は、条件を変えてもう一度測定するか判断する（Ｓ１０７）。例えば、コントローラは、分離ウィンドウデータ及び泳動時間に基づき、充填した試料量が、さらに試料を注入しても測定感度が向上しない試料注入限界かによりもう一度測定するか判断することができる。または、コントローラ２２０は、予め記憶部２３３に記憶された複数の測定条件について全て測定するまで、もう一度測定すると判断することもできる。
【０１１２】
一例として、まず、コントローラ２２０は、分離ウィンドウデータおよび泳動時間に基づき所定成分の吸光度ピーク面積（ピーク部分の吸光度変化と時間軸で囲まれる面積）を算出し、試料注入時間または試料の濃度に対応して内部に備えられたメモリ等に蓄積する。コントローラ２２０は、蓄積された吸光度ピーク面積に基づきピーク面積の増加の直線性を判断する。例えば、コントローラ２２０は、蓄積された適宜の数のデータから傾き（変化量）を求め、傾きの変化がしきい値以下であることにより直線性を判断することができる。また、コントローラ２２０は直線近似や多項式近似を行い、直線性を判断してもよい。
【０１１３】
コントローラ２２０は、ピーク面積増加の直線性が保たれている場合には「もう一度測定する」と判断し、一方、直線性が保たれていない場合には「もう一度測定しない」と判断することができる。また、例えば、コントローラ２２０は、所定回数測定したか、試料注入時間が予め定められたしきい値を超えたか等の条件により、もう一度測定するか判断してもよい。
【０１１４】
コントローラ２２０は、「もう一度測定する」と判断した場合（Ｓ１０７）、測定条件を変更し（Ｓ１０８）、ステップＳ１０１の処理へ戻る。測定条件の変更として、コントローラ２２０は、例えば、試料注入時間を所定時間大きく設定する、異なる濃度またはｐＨの試料が入ったバイアル２０３を指定する、試料のｐＨを調整する、リーディング電解液相当の物質を試料に混入させる等の処理を行う。また、各電解液にｐＨを調整する又は浸透流速度を抑える物質を混入してもよい。
【０１１５】
試料注入時間を大きくすると、後述する実験結果にも示すように低濃度試料を分析することが可能となる。しかし、試料注入時間をあまりに大きくすると分離の場がせまくなり、また、感度向上も期待できないため、試料注入時間を適切に調整することが重要となる。
【０１１６】
また、異なるバイアル２０３を指定する例として、ターンテーブル２０６に予め異なる濃度またはｐＨに調整した試料または電解液を複数準備しておき、測定ごとにこれらを切り替え、以前の操作で用いた試料または電解液とは異なる濃度またはｐＨの試料または電解液をキャピラリー２０４に導入して、同様の操作を繰り返す測定が例示できる。この場合、ステップＳ１０８では、コントローラ２２０は、次の測定でキャピラリー２０４に充填する試料および電解液の入ったリザーバー２０２およびバイアル２０３を指定する。
【０１１７】
また、ｐＨの調整の例として、例えば、ターンテーブル２０６および２０６’上にリザーバーに充填した電解液２０２またはバイアル２０３に充填した試料のｐＨを調整するための酸および／またはアルカリ溶液を充填したバイアルを載置しておき、一回の測定操作を終えた後に、図示しない液体吸引吐出手段を用いてこの酸またはアルカリ溶液をリザーバー２０２またはバイアル２０３に添加し、電解液または試料のｐＨを変化させてから再度上述と同様の操作を行うことも例示できる。
【０１１８】
一方、コントローラ２２０は、測定しないと判断した場合（Ｓ１０７）、例えば、演算部２３１に測定終了の信号を送信し、ステップＳ１０９の処理へ移る。演算部２３１は、コントローラ２２０から測定終了の信号を受け取ると、記憶部２３３に記憶した分離ウィンドウデータおよび泳動時間を参照し、最適のデータ又は適当な値を示すひとつ又は複数のデータを求め、その分離ウィンドウデータ及び／又は泳動時間に基づき実効移動度等の各種データを計算する（Ｓ１０９）。例えば、演算部２３１は、直近に記憶した分離ウィンドウデータおよび泳動時間を記憶部２３３から読み出し、実効移動度に換算する。なお、実効移動度の計算については後述する。
【０１１９】
本実施の形態の装置では、後述するように、濃度又はｐHの値に従い吸光度のピークの絶対値は大きくなり、またピーク幅は広くなり、ある濃度又はｐHに達するとピーク及びピーク幅が飽和する。したがって、演算部２３１は、記憶部２３３の複数のデータに基づきピーク、ピーク幅又はピーク面積を計算することにより、最適又は適当なデータを求めることができる。また、本実施の形態の装置では、試料注入時間が長くなるに従い試料の注入量が増大し、吸光度のピークの絶対値が大きくなるが、一方、感度は低くなる。したがって、演算部２３１は、記憶部２３３の複数のデータから所定の上限及び／又は下限のしきい値が示す範囲内にピークの絶対値及び／又は感度が含まれるか否かを判断することで最適又は適当なデータを求めることができる。さらに、演算部２３３は、これら濃度、ｐH、試料注入時間のいずれか複数の組み合わせにより、最適又は適当なデータを求めてもよい。
【０１２０】
さらに、実効移動度が既知の物質について、その実効移動度と物質名をデータ処理部２３０の記憶部２３３に記憶しておき、演算部２３１が算出した被検物質の実効移動度ついて前記記憶情報を検索するようなプログラムを実行すれば、被検物質を迅速に同定することも可能になる。むろん、かかる方法による同定以外にも、測定を実施する過程で電気泳動によって各被検物質は分画されるため、キャピラリーに例えば質量分析装置を接続しておけば、質量分析によって各被検物質を同定することも可能である。
【０１２１】
また、分離ウィンドウデータはベースラインにうねりを生じるので、演算部２３１は、実効移動度に換算する前に、次のような方法でベースライン補正してもよい。まず、演算部２３１は、記憶部２３３に記憶されている泳動時間について、適度な時間間隔をおいてベースライン補正用の分離ウィンドウデータのサンプリングを行う。なお、ベースライン補正用データは、分離ウィンドウデータ採取時に適宜の間隔で演算部２３１により記憶部２３３に記憶されるようにしてもよい。次に、演算部２３１は、ベースライン補正用データをもとに最小自乗法などによってベースラインの多項式近似を行う。演算部２３１は、求めたベースラインの多項式に基づきベースラインの吸光度を算出し、算出した吸光度と実測値との差を求めることにより、ベースライン補正されたデータとする。
【０１２２】
演算部２３１は、換算した実効移動度および／または物質名を表示部２３４または出力部２３５に出力する（Ｓ１１１）。また、演算部２３１は、測定した分離ウィンドウデータを表示部２３４または出力部２３５に出力してもよい。
【０１２３】
図３は、キャピラリーへの試料等の充填のフローチャートである。図３に示すフローチャートは、上述のステップＳ１０１のサブフローチャートである。
【０１２４】
まず、支持電解液をキャピラリー２０４に充填する（Ｓ２０１）。具体的には、コントローラ２２０は、駆動部２０７を制御して、キャピラリー２０４の左側端の直下に任意のｐＨに調整した支持電解液を充填したリザーバー２０２が位置するように、ターンテーブル２０６を回転させた後上昇させ、キャピラリー２０４の左端をリザーバー２０２中に挿入し、支持電解液中に浸らせる。また、コントローラ２２０は、駆動部２０７’を制御し、上述と同様にキャピラリー２０４の右側端の直下に空のリザーバー２０２’中に挿入する。次に、右側のリザーバー２０２’を密閉し、コントローラ２２０は、吸引ポンプ２０５を所定時間作動させ、キャピラリー２０４内に支持電解液を充填する。
【０１２５】
次に、リーディング電解液をキャピラリー２０４に充填する（Ｓ２０３）。まず、コントローラ２２０は、駆動部２０７を制御して左側のターンテーブル２０６を下降させ、キャピラリー２０４の左側端をリザーバー２０２の外に出し、再度駆動部２０７を制御して、左側のターンテーブル２０６を回転させ、リーディング電解液を充填したリザーバ２０２をキャピラリー２０４の左側端の直下に移動する。この後、コントローラ２２０は、駆動部２０７を制御して左側のターンテーブル２０６を上昇させ、キャピラリー２０４の左側端をリザーバー２２０内に挿入し、左側端をリーディング電解液に浸らせる。コントローラ２２０は、再度吸引ポンプ２０５を所定時間作動させ、キャピラリー２０４にリーディング電解液を充填する。
【０１２６】
次に、ＥＫＩにより試料をキャピラリー２０４に充填する（Ｓ２０５）。コントローラ２２０は、上述と同様に駆動部２０７を制御して左側のターンテーブル２０６を動かし、キャピラリー２０４の左側端をバイアル２０３内に挿入し、試料に浸らせる。また、コントローラ２２０は、駆動部２０７’を制御してキャピラリー２０４の右側端を電解液（例えば、キャピラリー２０４内に充填したのと組成およびｐＨが同一の支持電解液）を充填したリザーバー２０２’に挿入し、右側端を電解液に浸らせる。コントローラ２２０は、電源ユニット２０１によりキャピラリー２０４の両端に電圧を印加して、バイアル２０３の被検試料をキャピラリー２０４に注入する。なお、コントローラ２２０は、予め設定されたまたは上述のステップＳ１０８で設定した試料注入時間の間、電圧を印加する。
【０１２７】
次に、ターミナル電解液をキャピラリー２０４に充填する（Ｓ２０７）。上述のようにしてキャピラリー２０４にバイアル２０３の試料を注入した後に、コントローラ２２０は、駆動部２０７により左側のターンテーブル２０６を適宜下降、回転、上昇させ、ターミナル電解液を充填したリザーバー２０２にキャピラリー２０４の左側端を挿入する。また、キャピラリー２０４の右側端には、空のリザーバー２０２’が挿入されるようにターンテーブル２０６’を適宜下降、回転、上昇させ、上述の支持電解液の充填と同様にしてターミナル電解液をキャピラリー２０４に導入する。ターミナル電解液の導入後、図１のステップＳ１０３の処理へ移る。
【０１２８】
以上の操作により、キャピラリー２０４内は、順に支持電解液、リーディング電解液、試料、ターミナル電解液が並んでいる。なお、ステップＳ２０３は、ステップＳ２０５の後に行うこともできる。この場合、キャピラリー２０４内は、順に支持電解液、試料、リーディング電解液、ターミナル電解液が並ぶ。また、ステップＳ２０３を省略し、ステップＳ２０７においてリーディング液とターミナル液を混合した電解液をキャピラリー２０４に充填することもできる。
【０１２９】
なお、試料には、実効移動度を算出するための、泳動時間のよくわかっている標準物質を含むことができる。または、各電解液のいずれかに標準物質が含まれていてもよい。さらに、試料又は電解液に標準物質を含めず、リーディング電解液又はターミナル電解液を基準にして実効移動度を求めるようにしてもよい。
【０１３０】
図４は、吸光度測定のフローチャートである。図４に示すフローチャートは、上述のステップＳ１０３のサブフローチャートである。
【０１３１】
コントローラ２２０は、電源ユニット２０１により泳動電圧付与を開始する（Ｓ３０１）。この時、コントローラ２２０は、まず左右両側のターンテーブル２０６および２０６’を適宜下降、回転、上昇させ、キャピラリー２０４の左側端および右側端を支持電解液（例えば、ステップＳ２００でキャピラリー内に充填したのと組成およびｐＨが同一の支持電解液）を充填したリザーバー２０２および２０２’に挿入する。キャピラリー２０４の左右の端がリザーバー２０２および２０２’に充填された電解液に挿入された後に電源ユニット２０１によってキャピラリー２０４の両端に電圧を印加し、電気泳動を開始させる。また、コントローラ２２０は、電気泳動開始後に吸光度の検出および泳動時間の測定を開始する。例えば、コントローラ２２０は、シャッターを開かせるための信号を出力し、ランプから発せられる光をキャピラリーに照射させる。
【０１３２】
試料は、キャピラリー２０４内を有効長（試料が導入されたキャピラリー２０４の一端付近からキャピラリー２０４に沿ったスリットまでの距離）だけ泳動する。この試料中のイオンの泳動方向は、例えば、リザーバー２０２からリザーバー２０２’に向かっている。この間に、試料中の各イオンは、各イオンの泳動速度（実効移動度）の差により分離される。この泳動速度（実効移動度）の差により分離された試料は、上述したグリーティングによって、一定時間ごとのスペクトルデータとして検出される。このスペクトルデータは、検出器２１５によって、吸光度として信号化される。検出器２１５は、プリアンプ２２１、Ａ／Ｄコンバータ２２２を介して吸光度をコントローラ２２０およびデータ処理部２３０に出力する。
【０１３３】
コントローラ２２０は、検出された吸光度（ここでは、支持電解液、リーディング電解液の吸光度が検出されている）を監視し、吸光度が予め定められたしきい値以上増加したか判断する（Ｓ３０３）。吸光度の増加は、リーディング電解液がスリット部分を通過し、試料が分離される分離ウィンドウ部分の吸光度が測定可能となったことを示す。コントローラ２２０は、吸光度が当該しきい値以上増加していない場合（Ｓ３０３）、検出感度を維持し（Ｓ３０５）監視を続ける。一方、コントローラ２２０は、吸光度が当該しきい値以上増加した場合（Ｓ３０３）、検出感度を増加させる（Ｓ３０７）。分離ウィンドウ部分の吸光度は、リーディング液やターミナル液に比べて大きいため、本実施の形態ではリーディング液の通過を判断して検出感度を増加する。コントローラ２２０は、感度増加の後に、分離ウィンドウデータの採取を開始する（Ｓ３０９）。
【０１３４】
コントローラ２２０は、分離ウィンドウデータの採取中（Ｓ３１１）、採取した吸光度が予め定めれたしきい値以上減少したか判断する（Ｓ３１３）。吸光度の大幅な減少は、分離ウィンドウ部分がスリット部分を通過し、ターミナル電解液の吸光が始まったことを示す。コントローラ２２０は、吸光度が当該しきい値以上減少していない場合（Ｓ３１３）、ステップＳ３１１に戻り分離ウィンドウデータの採取を継続する。一方、コントローラ２２０は、吸光度が当該しきい値以上減少している場合（Ｓ３１３）、分離ウィンドウデータの採取を終了し（Ｓ３１５）、図２のステップＳ１０５の処理へ移る。
【０１３５】
なお、上述の吸光度の増加、減少の判断に用いるしきい値は、同じ値としてもよいし異なる値とすることもできる。
【０１３６】
（実効移動度計算）
ＴＣＤＴ法による実効移動度の測定について、概要を以下に説明する（特開２００２−５８８６号公報参照）。
【０１３７】
泳動時間から実効移動度を求める通常の方法では、実効移動度（ｍ）は下記式（１）のようにして求められる。
ｍ＝ν_ｉｏｎ／Ｅ＝（ｌ／ｔ−ν_ｅｏｆ）／（Ｖ／Ｌ） （１）
ここで、Ｖは印加電圧、Ｅは電位勾配、ｌは有効長、Ｌはキャピラリー全長、ν_ｉｏｎは被検物質の泳動速度、ｔは被検物質が検出器２１５によって検出されるまでの時間（泳動時間）である。また、ν_ｅｏｆ（電気浸透流速度、ｅｌｅｃｔｒｏｏｓｍｏｔｉｃ ｆｌｏｗ ｖｅｌｏｃｉｔｙ）は、移動度０の物質の泳動時間またはシステムピークの泳動時間（ｔ_ｅｏｆ）を用いて下記式（２）から得られる。
ν_ｅｏｆ＝ｌ／ｔ_ｅｏｆ （２）
従って、式（１）は下記式（１）’のようになる。
ｍ＝（ｌ／ｔ−ｌ／ｔ_ｅｏｆ）／（Ｖ／Ｌ） （１）’
【０１３８】
なお、システムピークとは、間接吸収法を用いたとき、電気浸透流によってキャピラリー２０４内の液体が流され、試料を導入した部分が検出器２１５に到達した場合に出現する、あたかも何か物質が検出されたかのようなピークをいう。従ってシステムピークの泳動時間（ｔ_ｅｏｆ）は、システムピークが出現するまでの時間を意味する。ここで間接吸収法とは、例えば、被検物質にＵＶ（紫外線）の吸収がない場合、電解液にＵＶ吸収のある物質を用いると、被検物質の部分だけ電解液が減少し、ＵＶの吸光度が上昇することを利用した検出方法である。電気浸透流とは、例えば、シリカキャピラリーを用いたとき、キャピラリー内壁にあるシラノール基が解離することにより内壁が負に帯電し、キャピラリー内部にある溶液が見かけ上正に帯電することにより、電場を印加すると液体全体が負電極側に流れる現象をいう。なおこの電気浸透流は、キャピラリー２０４に他の物質を用いても、ほとんどの場合、発生する（ただし、物質や電解液の組成により流れる向きが変わることもある）。
【０１３９】
前記移動度０の物質の泳動時間（ｔ_ｅｏｆ）とは、電場の印加により、上述のように、電気浸透流のためにキャピラリー２０４内の液体全体が押し流されるため、移動度を持たないような（即ち、移動度０）物質（例えば、中性物質）でも検出器２１５によって検出されるので、このような電場を印加してから検出されるまでの時間を意味する。なお移動度０の物質としては、例えばベンジルアルコールを例示することができる。
【０１４０】
上記において、温度による移動度の変化を詳しく検討すると、被検物質の実効移動度（ｍ）の温度依存性は、下記式（３）のように、被検物質イオン自身の項（ｆ（Ｔ））と支持電解液への温度依存性の項（ｇ（Ｔ）＝ε／η（ε：誘電率、η：粘性係数））とに分けて考えられる。
ｍ＝ｆ（Ｔ）・ｇ（Ｔ） （３）
【０１４１】
前記式（３）を基準温度Ｔ_０の周りでテイラー展開すると、下記式（４）のようになる（ただし、ΔＴ＝Ｔ−Ｔ_０、ｆ_０＝ｆ（Ｔ_０）、ｇ_０＝ｇ（Ｔ_０）である）。なお本発明において基準温度Ｔ_０は任意であるが、一例として、物理化学定数の標準に用いられる25℃が多く用いられる。
ｍ＝（ｆ_０＋ｆ_１ΔＴ＋ｆ_２ΔＴ^２＋・・・）（ｇ_０＋ｇ_１ΔＴ＋ｇ_２ΔＴ^２＋・・・） （４）
【０１４２】
前記式（４）において、温度変化によるイオンサイズの変化は、溶媒の粘度や誘電率の温度依存性と比較して非常に小さいため、イオン自身への影響の温度依存性を無視すると、実効移動度（ｍ）は下記式（５）で表される。
ｍ＝ｆ_０（ｇ_０＋ｇ_１ΔＴ＋ｇ_２ΔＴ^２＋・・・）
＝ｆ_０ｇ_０（１＋ｇ_１／ｇ_０・ΔＴ＋ｇ_２／ｇ_０・ΔＴ^２＋・・・） （５）
【０１４３】
前記式（５）において、ΔＴが小さいところでは二次以降の項を無視することができ、さらに、ｆ_０ｇ_０＝ｍ_Ｔ０、ｇ_１／ｇ_０＝αと置き換えると、物質に依らず移動度は下記式（６）で表されることになる。
ｍ＝（１＋αΔＴ）・ｍ_Ｔ０ （６）
【０１４４】
ここで、ｍ_Ｔ０は基準温度における被検物質の実効移動度を表し、αは被検物質イオンに依存しない温度係数を表す。一般に、２５℃における温度係数αの値は約０．０２（例：Ｋ ０．０１９１、Ｌｉ ０．０２２８）である。
【０１４５】
ＴＣＤＴ法における、温度係数を考慮した泳動時間からの実効移動度の測定法を以下に説明する。
標準物質の基準温度（Ｔ_０）での実効移動度（ｍ_０、ｓ）は、電気泳動における既知の実効移動度（ｍ_ｓ）から前記式（１）’を用いて次のように求められる。
ｍ_０、ｓ＝（ｌ／ｔ_ｓ−ｌ／ｔ_ｅｏｆ）／｛（１＋αΔＴ）Ｅ｝
【０１４６】
さらに、前記式（６）よりｍ_ｓとｍ_０、ｓの関係は下記式（７）のようになる。
１＋αΔＴ＝ｍ_ｓ／ｍ_０、ｓ （７）
また、被検物質の基準温度Ｔ_０における実効移動度（ｍ_Ｔ０）は、前記式（１）’を用いてその実効移動度（ｍ）から次のように求められる。
ｍ_Ｔ０＝（ｌ／ｔ−ｌ／ｔ_ｅｏｆ）／｛（１＋αΔＴ）Ｅ｝
【０１４７】
ここで、前記ｍとｍ_Ｔ０の間には、前記式（６）から次のような関係が成立する。
１＋αΔＴ＝ｍ／ｍ_Ｔ０
以上の式から、基準温度Ｔ_０における被検物質（イオン）の実効移動度（ｍ_Ｔ０）は下記式（８）のようにして得られる。
ｍ_Ｔ０＝ｍ／（１＋αΔＴ）＝（ｌ／ｔ−ｌ／ｔ_ｅｏｆ）／｛（１＋αΔＴ）Ｅ｝＝｛（ｔ_ｅｏｆ／ｔ−１）／（ｔ_ｅｏｆ／ｔ_ｓ−１）｝・ｍ_０、ｓ （８）
【０１４８】
前記式（８）によれば、前記したような、Ｅ、Ｖ、Ｉ、Ｌといった、キャピラリーゾーン電気泳動装置に依存するパラメータが消去されることになり、装置の条件に依存しない電気泳動データの標準化が可能となる。ここで、前記式（８）は、上述した式１である。
【０１４９】
キャピラリーゾーン電気泳動の結果から被検物質の実効移動度を求めるために採用し得るＴＣＤＴ法の第一の態様は、上述した理論を用いて、被検物質および少なくとも標準物質を含む試料について、任意の異なるｐＨでキャピラリーゾーン電気泳動を実施し、実効移動度が温度のみに影響されるとして補正を行うものであり、電気泳動における移動度を持たない移動度０の物質の泳動時間またはシステムピークの泳動時間（ｔ_ｅｏｆ）、被検物質の泳動時間（ｔ）、標準物質の泳動時間（ｔ_ｓ）および標準物質の基準温度Ｔ_０における実効移動度（ｍ_０、ｓ）から前記式１（式（８））を用いて被検物質の実効移動度（ｍ_Ｔ０）を求めるものである。
【０１５０】
上述した式１（前記式（８））に含まれるパラメータであるｍ_０、ｓは、論文や既存データ、更には実施者にける予備実験の結果（フェログラム）等から決定することができる。またｔ_ｅｏｆは、例えば、キャピラリー２０４内の電解液の濃度のむら等により測定される。さらに、ｔ_ｅｏｆ、ｔおよびｔ_ｓは、既存データや実験値、更にはだいたいの見積もり等から、どの検出ピークがどの物質に対応するのか当たりを付けることができるので、実験より得られたフェログラムからそれぞれの泳動時間を決定できる。なお、時間補正をさらに考慮して実効移動度を測定することもできる。
【０１５１】
３．実験結果
３−１ スタッキング効果を利用したオンライン前濃縮
ＣＥにおける低濃度試料の濃縮現象としてスタッキング効果が知られている。本比較例においては、スタッキングのみを使用したときの希土類試料の分離・検出濃度下限についての実験結果を示す。
【０１５２】
（スタッキングの原理）
図５は、スタッキングの模式図である。図５の模式図は、スタッキング時のキャピラリー長さに沿った電位勾配および濃度勾配を示す。まず泳動バッファー液（Ｂ）をキャピラリー２０４に注入し、その後低濃度試料液（Ｓ）をキャピラリー２０４内に供給し、電気泳動を開始する。スタッキング効果を発揮させるには試料プラグの電位勾配が支持電解液部分（泳動バッファー液）に比べて相対的に高いことが必要である。この電位勾配の差によって試料プラグと支持電解液の界面で試料が濃縮される。
【０１５３】
電気泳動開始ともに、試料液中の低濃度試料が泳動し、泳動バッファー液との境界に到達する。試料プラグ中で高い速度で泳動した試料中の各成分が界面に到達するとそこから先は電位勾配が低いので泳動速度が激減し、その結果として試料が界面に停滞し濃縮される。したがって、共存イオンを多量に含み試料プラグの電位勾配が上がらない場合、通常、濃縮は期待できない（非常に実効移動度の高いイオンが共存するときはある程度の濃縮を期待することができる。これについては後述の例を参照）。このような場合には電位勾配差を作るためにきわめて高濃度（高イオン強度）の支持電解液を使う必要がある。試料プラグ中の各成分が界面にすべて到達すると濃縮完了である。
【０１５４】
（実験条件）
図２５にスタッキングにおける実験条件を示す。支持電解液としては発明者らで最適化を行った希土類イオン１５種（Ｌａ〜Ｌｕ＋Ｙ）の全分離を達成させる組成の電解液を使用した。クレアチニンはＵＶ可視剤でありα−ヒドロキシイソ酪酸（ＨＩＢＡ）とマロン酸は希土類イオンとの錯形成剤として使用している。試料の充填には落差法（２５ｍｍ）を用いた。代表的な試料充填時間は１００ｓ、５００ｓ、９００ｓ、１３００ｓである。ハーゲンポアジューレの式から試料充填体積は２１、１０７、１９３、２７８ｎｌ、試料プラグ長は４．８、２４、４４、６３ｍｍ、各試料成分の絶対量は０．２ｐｐｍの試料に対して０．０３、０．１３、０．２３、０．３３ｐｍｏｌとそれぞれ見積もられた。キャピラリー有効長（８７．７ｃｍ）に対する試料プラグ長の割合は、ハーゲンポアズイユの式からそれぞれ０．６％、３％、５％、７％である。
【０１５５】
（結果と考察）
図６および図７は、スタッキング効果を用いたランタニドイオンのＣＺＥ分離におけるエレクトロフェログラムである。図６および図７のエレクトロフェログラムは、横軸に泳動時間（秒）、縦軸に２２０ｎｍの波長の吸光度（absorbance）を示している。なお、一般に、光が吸収される現象は、試料が存在する部分の分離用電解液中のＵＶ吸収性試薬の濃度が試料濃度分だけ減少するため、吸光度が減少することによる。よって、本実施の形態は、例えばＵＶ間接吸収法を前提とした方法であって、実測される吸光度の増減の方向が、本実施の形態で図示したものでは実際とは逆になっている。すなわち、実際は、吸光度の目盛はマイナスの絶対値を示すものであり、また、各図で示したエレクトロフェログラムとは上下逆のエレクトロフェログラムが得られる。よって、図中、吸光度が上方向に変化する場合「吸光度が減少する」と表現され、一方、吸光度が下方向に変化する場合「吸光度が増加する」と表現される。以下、本実施の形態において示す吸光度についての図においても同様である。
【０１５６】
図６は、２ｐｐｍ希土類試料の試料注入時間を増加させた時に得られたエレクトロフェログラムである。図６−ｃ（試料５００ｓ充填：キャピラリー有効長の３％）および図６−ｄ（１００ｓ充填：キャピラリー有効長の０．６％）ではピーク分離が確認できるが、より大量の試料を導入すると全分離ができなくなっている（図６−ａ、ｂ）。これは、希薄試料部の電気浸透流移動度が大きく、結果として試料プラグ長の増大と共に浸透流速度が増大し逆に電気泳動速度は減少した結果、分離ウィンドウが狭くなったためである。また、大量注入するとピーク幅が広がっているが、これは試料プラグの電気浸透流速度とバッファー部分の電気浸透流速度のミスマッチにより、スタッキングによって試料プラグと泳動バッファーの界面で濃縮された試料の撹乱が起こるためである。この実験から、スタッキングのみを通常の方法で用いたのでは、大量の試料を充填できないことが明らかである。
【０１５７】
図７は、０．２ｐｐｍ希土類試料について得られたエレクトロフェログラムである。全イオンの分離が確認できた図７−ｃ（５００ｓ充填）のＥｒのピークより、Ｓ／Ｎ＝３に対応する検出濃度限界ＬＬＤＣは１２０ｐｐｂと評価された。ただしＳ／Ｎの算出において図７−ｃ中に観測されている周期の大きなべースラインの乱れは考慮しなかった。
【０１５８】
この結果は、泳動バッファーと試料との境界における吸光度を経時的に追跡することによって、試料の濃縮が飽和に達する時点を知ることができることを示唆している。すなわち、フォトダイオードアレイの信号をある時間間隔でサンプリングしていくと、キャピラリー長さ方向に吸光度がピークを生じながら成長するのを追跡することができる。そのピーク値は、時間とともに成長を続けるがある時間からは成長が停止する。この時間をもってスタッキングによる濃縮が完了したことを知ることができる。
【０１５９】
３−２ 過渡的等速電気泳動前濃縮−ＣＺＥ
上述の３−１のようにスタッキングのみを用いた場合、ピークの全分離を保てる試料プラグ長はキャピラリー有効長の３％に過ぎなかった（図６−ｃ）。これがピーク全分離の限界であり、５％試料を充填するだけで試料ピークの全分離を達成することができなくなった（図６−ｂ）。濃度感度を向上させるためには、より多くの試料を充填した場合でも試料の全分離を達成することが必要である。過渡的等速電気泳動前濃縮（ｔｒ−ＩＴＰ）の使用がＣＺＥによる高感度分析に有用である。本例では過渡的等速電気泳動前濃縮を行った場合の結果を示す。
【０１６０】
（過渡的等速電気泳動前濃縮の原理）
図８は、過渡的等速電気泳動前濃縮の模式図である。図８の模式図は、過渡的等速電気泳動前濃縮時のキャピラリー長さに沿った電位勾配および濃度勾配を示す。
【０１６１】
まず、キャピラリー２０４にリーディング電解液（Ｌ）、希薄試料（Ｓ）、ターミナル電解液（Ｔ）の順に充填する（図８−上段）。スタッキング過渡的等速電気泳動過程では、電圧を印加すると資料濃度はリーディング電解液の濃度に応じ等速電気泳動の原理で試料プラグとリーディング電解液の界面で試料が濃縮される。ターミナル電解液もこの界面で濃度調整され過渡的な等速電気泳動状態となる（図８−中段）。続いてＣＺＥモードに移行し、キャピラリー２０４中で分離した各ピークが検出器２１５で検出される（図８−下段）。
【０１６２】
過渡的等速電気泳動を用いる利点としては、第一にＬとＴの存在により濃縮した状態が長続きすることがあげられる。通常のスタッキングのみを用いた場合には、濃縮したピークは検出器に達するまでに拡散してピークが低くなると考えられるが、濃縮状態（過渡的等速電気泳動状態）が長続きしＣＺＥに移行するのが遅ければピークが高い状態で検出できることになる。ピーク分離の問題もあるが、これは濃度感度向上に有効であると考えられる。第二に、ＥＯＦのミスマッチによる濃縮したピークの撹乱を抑制する効果があげられる。比較的大量の試料をキャピラリー２０４内に導入する場合にスタッキングのみを使用すると試料プラグと泳動バッファー界面で濃縮したピークがＥＯＦのミスマッチにより撹乱される（図６−ｂ）が、ターミナル電解液の存在がこの撹乱を抑制すると考えられる。これは濃度感度とピークの全分離という点で重要である。
【０１６３】
（過渡的等速電気泳動前濃縮の効果）
図２６に、過渡的等速電気泳動前濃縮を適用した実験条件を示す。過渡的等速電気泳動前濃縮の効果を確かめるために、スタッキングのみを用いたのでは全分離を達成できなかった場合（図６−ｂ）に対応する実験条件である。
【０１６４】
図９は、過渡的等速電気泳動前濃縮の実験結果を示すフェログラムである。図９には、過渡的等速電気泳動前濃縮（Ａ）と、比較対象としてスタッキングによるフェログラム（Ｂ）も併せて示す。Ａにおける各液の注入時間は、Ｌ＝８００ｓ、Ｓ＝９００ｓ、Ｔ＝８０ｓであり、Ｂは、Ｌ＝０ｓ、Ｓ＝９００ｓ、Ｔ＝０ｓとして実験した結果である。すなわち、注入時間は図６−ｂと同じ９００ｓである。
【０１６５】
図９からわかるように、スタッキングのみでは全分離を達成できなかった場合（図９−Ｂ）に対して、過渡的等速電気泳動を適用することで全分離を達成することができた（図９−Ａ）。ピーク出現時間が大きく変わらないにもかかわらず図９−Ａのほうが濃縮および分離がよいのは、過渡的等速電気泳動前濃縮の原理のところでも述べたように過渡的等速電気状態の実現によりＥＯＦのミスマッチが抑制されているためと考えられる。
【０１６６】
また、このことはキャピラリー２０４に充填してピークを全分離できる試料のプラグ長の限界を、キャピラリー有効長の３％（スタッキングのみ使用時）から５％まで増大させられたことを意味する。さらに試料を充填すると分離の場が狭くなった。これは、希薄な試料をキャピラリー２０４内に充填する以上試料プラグ部分のＥＯＦの増大が避けられないためと考えられる。Ｓ／Ｎ＝３に対応するＥｒのＬＬＤＣは、４０ｐｐｂと見積もられた。
【０１６７】
この例の場合にも、スタッキングの場合と同様に、リーディング液と試料との境界で試料の濃縮が起こるので、キャピラリー長さ方向の吸光度の経時変化を追跡することにより試料濃縮が飽和に達した時点を知ることができる。
【０１６８】
３−３ 過渡的等速電気泳動を用いるときの試料溶液（Ｓ）、リーディング（Ｌ）およびターミナル（Ｔ）電解液の充填順序変更
従来、等速電気泳動において電解液系は、図８のように試料の前方にリーディング電解液を充填し、試料の後方にターミナル電解液を充填するという電解液配置で行われてきた。図８で説明した過渡的等速電気泳動の原理を考えると、電圧を印加するとまずスタッキングが起こるのであるから希薄な試料を用いる場合は必ずしもリーディング電解液を試料の前方に充填する必要はない。
【０１６９】
図１０は、電解液充填順序を変えた場合の効果を示す模式図である。図１０に示すように試料の後方にリーディング電解液を充填し、電圧印加時にこの液もスタッキングさせれば試料プラグと泳動バッファーの界面で図８と同様の過渡的等速電気泳動状態が実現できる。
【０１７０】
（実験条件）
図２７に、電解液充填順序を変えた場合の実験条件を示す。試料注入には落差法を用い、試料、リーディング電解液、ターミナル電解液の順にキャピラリー２０４に充填し、その後電圧を印加した。
【０１７１】
（結果と考察）
図１１は、電解液充填順序を変えた場合の効果を示すフェログラムである。
図１１−Ｂは、電解液充填順序を変えた場合のエレクトロフェログラムである。図１１−Ｂに示すように、試料の後方にリーディングおよびターミナル電解液を充填する方法により、スタッキングのみでは全分離が達成されない場合（９００ｓ充填：試料プラグ長はキャピラリー有効長の５％、図１１−Ｃ）でも、Ｌａのピークは消えているが他のピークの全分離を達成できていることがわかる。なお、Ｌａのピークは、リーディング電解液の充填量を減らせば確認できる。したがって、本手法は、従来知られている過渡的等速電気泳動前濃縮における電解液系の充填モードと同様な効果があると言える。また、試料の後方に電解液系を充填することの応用として、リーディング電解液とターミナル電解液を混合しても同様の効果がある。実際に実験を行ったところ、図１１−Ａに示すように図１１−Ｂと同様の結果が得られた。試料の後方にリーディング電解液を充填する方法の利点として、リーディング電解液のｐＨ調整が必要ないということがあげられる。従来の充填方法では、リーディング電解液のｐＨやカウンターイオンの選択が重要であったが、本手法では例えば、ＫＣｌなどをリーディング電解液としてそのまま使用でき、その選択がより簡便である。また、リーディング電解液とターミナル電解液を試料後方に充填する方法は、電解液充填のステップが一つ減らせるのでより簡便であるといえる。キャピラリー２０４内に充填できる試料のプラグ長は、従来法と同じく５％程度である。過渡的等速電気泳動前濃縮がスタッキングより濃度感度の点で優ることはわかったが、最適な濃縮と分離を得るためのリーディング電解液やターミナル電解液の種類、濃度、キャピラリー２０４内への導入量の最適化が必要である。
【０１７２】
３−４ 試料組成に基づく過渡的等速電気泳動前濃縮
以上の考察から結局、試料プラグ部分の浸透流速度を抑えなければ多量の試料を導入できないと考えられたので、試料にリーディング電解液相当の役割をはたす物質（１５ｍＭ酢酸アンモニウム）を混合し試料組成に基づく過渡的等速電気泳動を行った。
【０１７３】
（実験条件）
図２８に、試料組成に基づく過渡的等速電気泳動における実験条件を示す。試料充填時間は、１３００ｓ、３６００ｓ、５４００ｓである。ハーゲンポアシューレの式から試料充填体積は、２７８、７７０、１１６０ｎｌ、試料プラグ長は６３、１７６、６２４ｍｍ、キャピラリー有効長（８７．７ｃｍ）に対する試料プラグ長の割合はそれぞれ７％、２０％、３０％であった。
【０１７４】
（結果と考察）
図１２は、リーディング電解液相当の物質を試料組成に混入させた場合の過渡的等速電気泳動を示すフェログラムである。図１２−Ｄ、Ｅは、それぞれ試料をキャピラリー有効長の７％充填した場合に、従来の過渡的等速電気泳動とスタッキングを適用したときに得られたフェログラムである。過渡的等速電気泳動を利用したときの充填できる試料のプラグ長の限界が５％であったことを考えると当然であるが、浸透流速度の増大により分離ウィンドウが狭くなっている。図１２−Ｃに示すように、同じプラグ長でも１５ｍＭの酢酸を添加することで全分離を達成することができた。さらにプラグ長を２０％まで長くしても全分離が達成できた（図１２−Ｂ）。このとき、Ｓ／Ｎ＝３に対応するＥｒのＬＬＤＣは１７ｐｐｂと見積もられた。これ以上試料を導入すると、ＥＯＦが増大し全分離不可能となった（図１２−Ａ）が、更なる最適化により感度向上の可能性がある。
【０１７５】
３−５ 電気的試料注入（ＥＫＩ）−ＥＫＩ時の試料濃度と試料導入量の関係
電気的試料注入（ＥＫＩ）は、試料バイアルと泳動バッファーバイアルの間に電圧を印加することによって行われる。ＥＫＩによる注入では、試料は各試料固有の移動度とＥＯＦのポンプ作用の両方によってキャピラリー２０４内に導入される。ＥＫＩの特徴として一般に導入される試料の量が個々の試料の移動度に依存することがあげられる。すなわち、移動度の高いイオンは、移動度の低いイオンよりも多量に導入されるのでイオン種による注入量の違いが生じる。また、試料マトリックスの伝導度が高いときなどは、マトリックス成分がＥＫＩ時に流れる電気量のほとんどを担うので、目的とする試料成分の導入量が減少するという課題がある。
【０１７６】
しかしながら、河川水のようなマトリックス成分の少ない希薄な試料を取り扱うときには、次の二点によりキャピラリー２０４内への大量試料導入が期待できる。
▲１▼泳動バッファーと試料界面での連続的なスタッキング。
▲２▼大量試料導入と同様の効果（圧力差による試料導入では導入される試料体積の限界は１μＬ程度であるが、試料バイアルには１００μＬ程度の試料を入れられる）。
本例では、ＥＫＩによる検出濃度感度向上とＥＫＩの適用できる試料の条件について確認する。
【０１７７】
図２９に、試料濃度に対する試料導入量の変化を調べるための実験条件を示す。使用する支持電解液と印加電圧を固定すれば、あるＥＫＩ時間に流れる電気量は一定であると考えられる。したがって、試料濃度が高くなると、ＥＫＩによりキャピラリー２０４内に導入される試料量はある一定値に収束すると考えられる。このことを確認するためにイットリウム塩化物を試料とし、図２９に示す実験条件とし、濃度を２ｐｐｂから３０００ｐｐｍまで変化させて試料濃度に対して試料導入量がどのように変化するか調べた。
【０１７８】
図１３および図１４に、イットリウム（Ｙ）濃度変化に対するエレクトロフェログラムを示す。図１３は、濃度変化２ｐｐｂ〜２ｐｐｍに対するエレクトロフェログラムであり、図１４は、濃度変化２ｐｐｍ〜２０００ｐｐｍに対するエレクトロフェログラムである。なお、試料注入時間（ＥＫＩ時間）は２００ｓである。また、図１５および図１６に、イットリウム（Ｙ）濃度(単位ｐｐｂ、ｐｐｍ)とイットリウムピーク面積の関係を示す。なお、図１５および図１６には、ＥＫＩ時間が２００ｓ（図中の▲）の他に、３００ｓ、１００ｓの場合（図中の●、■）についても示している。
【０１７９】
図１５および１６より、２ｐｐｂから２ｐｐｍ程度までは濃度とイットリウムピークの面積の間に直線性があるが、１０ｐｐｍ、２０ｐｐｍと試料濃度が高くなると直線性が失われ、１００ｐｐｍから３００ｐｐｍまでは面積の増加が見られなかった。１００ｐｐｍの試料と１０００ｐｐｍの試料では、試料バイアルに入っている試料の絶対量は１０倍違うにもかかわらず、１０００ｐｐｍの試料は１００ｐｐｍの試料の１０倍入っていない。これは、ＥＫＩ時に流れる電流量が一定であることを考えれば予想通りの結果である。図１６には落差法で試料注入を行った結果も１０００、２０００、３０００ｐｐｍの試料に対して同時に示しているが（図中の×印）、３０００ｐｐｍの試料に対しては２００秒間ＥＫＩを行ったときよりも落差法で試料を注入した方が多く入っている。なお、本実施の形態におけるキャピラリー電気泳動方法では、所定成分の吸光度ピーク面積の直線性を判断することで試料注入量が飽和していないかを判断し、ＥＫＩによる試料注入の効果が得られるように制御されている。
【０１８０】
図１６に示した落差法（２５ｍｍ×６５０ｓ）で１０００ｐｐｍのイットリウム試料を充填したときのピーク面積を基準にして、２ｐｐｂから３０００ｐｐｍまでの各濃度の試料に対し、落差法で試料を充填したときのピーク面積を比例関係から算出することができる。
【０１８１】
図１７は、落差法によるピーク面積に対するＥＫＩによるピーク面積の比（Ａ）と濃度の関係を示す図である。図１７に示す結果は、上述の比例関係から算出した値に対し、ＥＫＩを２００秒間行ったときの各濃度のピーク面積値が何倍になるか計算した結果である。なお、落差法によるイットリウムのピーク面積に対するＥＫＩによるイットリウムピーク面積の倍率をＡとした。図１７より、２ｐｐｍの時のＡ＝２００倍からＡ値は小さくなり始め、１０ｐｐｍでＡ＝１００倍、２０ｐｐｍでＡ＝７０倍、１０００ｐｐｍでＡ＝２倍となりＥＫＩの効果が小さくなっていくことがわかる。
【０１８２】
以上のことから、ＥＫＩは低濃度試料をキャピラリー２０４内に大量に充填するのに有効な方法であることがわかる。この場合には、キャピラリー長さ方向の吸光度測定から、試料濃縮の飽和時点を検出することは難しい。すなわち、試料はＥＫＩによって次々と導入されてくるので、吸光度ピークが飽和することなくいつまでも成長するからである。従って、この場合の試料注入限界を知るには、あらかじめ試料導入時間を設定しておき吸光度ピーク面積の成長の直線性を参考にしながら判定するのが望ましい。すなわち、あらかじめ設定した試料導入時間内に直線性が保たれている場合にはその時間まで導入を続け、時間内に直線性がなくなった場合には、その時点で導入をうち切る等の工夫が必要である。なお、以上の方法以外にも、試料注入限界を知るための適宜の方法をとることができる。
【０１８３】
３−６ 電気的試料注入（ＥＫＩ）−希薄希土類試料へのＥＫＩの適用
図３０に、希薄希土類試料へのＥＫＩの適用についての実験条件を示す。図１８は、希土類試料へのＥＫＩ適用時のフェログラムである。図１８は、希薄希土類試料へのＥＫＩの適用について、２００ｐｐｂの試料について図３０に示す条件で実験した結果である。比較対象として、加圧法による試料注入を使用した場合に、現段階で濃度感度がよい試料組成に基づく過渡的等速電気泳動によるエレクトロフェログラムを併せて示した（図１８−Ｄ）。
【０１８４】
図１８−Ｃに示すように、加圧法による試料導入を用いた場合（図１８−Ｄ）と比べてＥＫＩにより大量に試料が導入されることが確認された。さらに試料注入時間を長くすると、さらに大量に試料が導入されることが確認された（図１８−Ａ、Ｂ）。このことより、濃度感度向上にＥＫＩが有効であることがわかる。
【０１８５】
３−７ ＥＫＩの適用範囲−試料のｐＨが試料導入量に与える影響
上述のスタッキングについての説明でも書いたように、試料マトリックスの伝導度が高い場合、目的成分のキャピラリー２０４への大量導入は期待できないと考えられる。そこで、目的成分以外のものが試料に入っている場合として、ｐＨが異なる試料に対してＥＫＩを適用したときに、導入される試料量がどのように変化するか調べた。
【０１８６】
図３１に、試料のｐＨが試料導入量に与える影響についての実験条件を示す。実験として、試料のｐＨを２〜７まで変化させてＥＫＩを行った。ＥＫＩ時間は２０秒に固定した。ｐＨ２の試料は、１００ｍＭＨＣｌを１００μＬ（ｐＨ７）試料に１０μＬ添加する方法で調整した。他の試料も同様な操作で調整した。
【０１８７】
図１９は、ＥＫＩ時にサンプルｐＨが目的試料の導入量に与える影響を示すフェログラムである。図１９に示す結果は、図３１（ａ）および（ｂ）の条件に対する実験結果である。ｐＨが低くなるにつれて試料導入量が少なくなり、ｐＨ２（図１９−Ｄ）では試料ピークを確認することができなかった。これは試料へのＨＣｌの添加により試料成分の伝導度が高くなり、泳動バッファーと試料界面での連続的なスタッキングが起こりにくくなったこと、および、より多く存在するＨＣｌがＥＫＩ時に流れる電気量のほとんどを担ったためと考えられる。
【０１８８】
図２０は、サンプルｐＨとＥＫＩ時間の影響を示すフェログラムである。図１９に示す結果は、図３１（ａ）および（ｃ）の条件に対する実験結果である。図２０−Ａに、ｐＨ２の試料のＥＫＩ時間を図１９−Ｄでの時間（２０ｓｅｃ）より１０倍長くしたとき（２００ｓｅｃ）のフェログラムを示す。図２０−Ｃに、比較のために落差法で試料を５００秒間充填し、スタッキングを用いたときに得られたフェログラムもあわせて示した。
【０１８９】
図２０より明らかなように、ＥＫＩ時間を２０ｓ（図２０−Ｂ）から２００ｓ（図２０−Ａ）に長くすることによりピークの出現が確認された。しかしながら、ピーク強度は加圧法で試料をキャピラリー２０４に充填したときと同程度であり、試料注入法としてＥＫＩがよりよいといえるものではない。また、図２０−Ａでは軽希土類（Ｌａ〜Ｎａ）のピークが消えているが、これについては後述する。以上のことから、ＥＫＩは、マトリックス成分の少ない希薄な試料の濃度感度向上に有効であることが確認された。
【０１９０】
３−８ ＥＫＩによる希土類イオン１５種の濃度感度向上
上述のように、ＥＫＩは試料中にイオン性マトリックスがほとんどない希薄な試料を、大量にキャピラリー２０４内に導入するのに有効であることが明らかとなった。また、希土類試料については、２００ｐｐｂの試料に関して大きい強度のピークが確認された（図１９−Ａ〜Ｃ）。すなわち、ＥＫＩにより濃度感度を向上させるためには、ＥＫＩ時間を長くすることが有効である。ここでは、さらに低濃度の２０ｐｐｂの希土類試料に対して、ＥＫＩを適用しＥＫＩ時間を長くするとピーク強度および分離挙動がどのように変化するか調べた。
【０１９１】
図３２に、ＥＫＩ時間に対する試料ピークの分離挙動の実験条件を示す。また、図２１に、ＥＫＩ時間に対する試料ピークの分離挙動（エレクトロフェログラム）を示す。図２１より、ＥＫＩ時間を長くするにつれてピーク強度が強くなっていくことがわかる。しかしながら、図２１−Ａ、Ｂよりわかるように、ＥＫＩ時間１５０ｓ（図２１−ｃ）以上では、システムピークが出現し分離の場が狭くなっている。このシステムピークの出現は、ＥＫＩ中にキャピラリー２０４内で発生する電気浸透流（ＥＯＦ）により、薄い試料がキャピラリー２０４内に導入されたためと考えられる。したがって、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）などを電解液に添加し、キャピラリー２０４内で発生するＥＯＦを抑えることは試料のキャピラリー２０４内への大量導入に有効であると思われる。この場合、ピークの出現時間が遅くなると考えられるので、キャピラリー２０４を短くすることが必要であろう。
【０１９２】
また、ＥＫＩ時間が長くなるにつれて、軽希土類（Ｌａ〜Ｎａ）のピークがブロードとなるが、Ｓｍ以降の重希土類のピークはシャープさを保っている。ＥＫＩ時間１５０ｓ（図２１−ｃ）では、全希土類のピークを確認できるが、さらに低濃度の希土類試料をすべて検出するためには軽希土類の拡散を抑える必要がある。図２１−ｃで最もピークの低いＬａのピークに関してＳ／Ｎ＝３として全希土類を検出できるＬＬＤＣは２．６ｐｐｂと見積もられた。
【０１９３】
３−９ 本実施の形態に係るキャピラリー電気泳動方法による試料分析
以上、種々の条件について試験を実施し、試料のＥＫＩ注入および過渡的等速電気泳動が試料成分の濃縮に対して有効であり、濃縮された成分分離にはキャピラリー２０４内における過渡的等速電気泳動が有効であることがわかった。しかし、ＥＫＩ注入時間をいたずらに長くすると試料注入量は飽和するとともに、分離過程においてもウィンドウが狭くなり、成分ピークの分離に対して不利になるだけでなく、感度向上もさほど期待できなくなることも判明した。
【０１９４】
図３３に、本実施の形態に係るキャピラリー電気泳動方法による試料分析の実験条件を示す。ＥＫＩを２００ｐｐｂの試料に適用し、現段階で濃度感度が最もよい試料組成で過渡的等速電気泳動を行い、得られたエレクトロフェログラムからウィンドウ部分のみを抽出し、実効移動度に変換してわかりやすく表示したフェログラムの例を示す。
【０１９５】
図２２および図２３は、本実施の形態の方法により試料を導入して検出したエレクトロフェログラムである。試料注入時間を増加させるにつれて吸光度感度は高くなっているが、等速電気泳動の分離ウィンドウは狭くなっている。本実施の形態では、リーディング液の吸光度が上昇する箇所から、感度を上げてフェログラムを抽出する。分離ウィンドウの部分のみを拡大して示すと、図２３のようなフェログラムが得られる。この分離ウィンドウが終了すると、ターミナル液の吸光が始まるので、データのサンプリングを終える。試料注入時間が長いほど、分離ウィンドウの幅が狭くなっている。
【０１９６】
ここで、分離ウィンドウ内では、ベースラインが、例えば図１９や図２１に示しているようにうねりを生じるので、これを補正する。また、ピークの重なりによって各成分の分離が判定しにくくなるから、これらのデータの泳動時間を実効移動度に換算する。
【０１９７】
図２４に、泳動時間を実効移動度に換算して得られた出力フェログラムを示す。このような処理を行うことにより、希薄な試料の成分を濃縮させ、高感度で検出でき、しかも未知物質の同定も直ちに行うことができるようになる。
【０１９８】
４．付記
本発明の過渡的等速電気泳動前濃縮付きキャピラリー電気泳動方法は、その各手順をコンピュータに実行させるためのキャピラリー電気泳動プログラム、キャピラリー電気泳動プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、キャピラリー電気泳動プログラムを含みコンピュータの内部メモリーにロード可能なプログラム製品、そのプログラムを含むサーバ等のコンピュータ、等により提供されることができる。
【０１９９】
【発明の効果】
本発明によると、簡便で高感度な分析が可能なキャピラリー電気泳動方法を提供することができる。また、本発明によると、低濃度試料のキャピラリー内への大量導入とオンライン前濃縮が可能なキャピラリー電気泳動方法を提供することができる。さらに、本発明は、注入する試料の濃縮限界を自動的に判断し、電気泳動分離および分析を自動で行うためのキャピラリー電気泳動方法を提供することができる。
【０２００】
また、本発明によると次のような効果を提供することができる。
（１）ＥＫＩを使用した試料注入によって、従来法の数十倍の試料導入が可能である。すなわち、検出感度を数十倍に上げることが可能である。なお、この試料注入量はさらに上げることが可能で、１０００倍程度まで上げることもできると見られている。
（２）キャピラリーゾーン出口での分取が可能である
（３）分取のみを目的とする泳動分離適用であれば、ＥＫＩによる試料注入量は更に増加させることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】キャピラリーゾーン電気泳動装置。
【図２】試料分析のフローチャート。
【図３】試料充填のフローチャート。
【図４】分離ウィンドウデータ測定のフローチャート。
【図５】スタッキングの模式図。
【図６】スタッキング効果を用いたランタニドイオンのＣＺＥ分離におけるエレクトロフェログラム（１）。
【図７】スタッキング効果を用いたランタニドイオンのＣＺＥ分離におけるエレクトロフェログラム（２）。
【図８】過渡的等速電気泳動前濃縮の模式図。
【図９】過渡的等速電気泳動前濃縮の効果を示すフェログラム。
【図１０】電解液充填順序を変えた場合の効果を示す模式図。
【図１１】電解液充填順序を変えた場合の効果を示すフェログラム。
【図１２】リーディング電解液相当の物質を試料組成に混入させた場合の過渡的等速電気泳動を示すフェログラム。
【図１３】イットリウム（Ｙ）濃度変化（２ｐｐｂ〜２ｐｐｍ）に対するエレクトロフェログラム。
【図１４】イットリウム（Ｙ）濃度変化（２ｐｐｍ〜２０００ｐｐｍ）に対するエレクトロフェログラム。
【図１５】イットリウム濃度（Ｙ）とピーク面積の関係。
【図１６】イットリウム濃度とピーク面積の関係。
【図１７】落差法によるピーク面積に対するＥＫＩによるピーク面積の比（Ａ）と濃度の関係。
【図１８】希土類試料へのＥＫＩ適用（２００ｐｐｂの試料に適用した結果）時のフェログラム。
【図１９】ＥＫＩ時にサンプルｐＨが目的試料の導入量に与える影響を示すフェログラム。
【図２０】サンプルｐＨとＥＫＩ時間の影響を示すフェログラム。
【図２１】ＥＫＩ時間に対する試料ピークの分離挙動。
【図２２】本発明の方法により試料を導入して検出したエレクトロフェログラム。
【図２３】ウィンドウ部分を拡大したフェログラム。
【図２４】泳動時間を実効移動度に換算して得られた出力フェログラム。
【図２５】スタッキングにおける実験条件。
【図２６】過渡的等速電気泳動前濃縮を適用した実験条件。
【図２７】電解液充填順序を変えた場合の実験条件。
【図２８】試料組成に基づく過渡的等速電気泳動における実験条件。
【図２９】試料濃度に対する試料導入量の変化を調べるための実験条件。
【図３０】希薄希土類試料へのＥＫＩの適用についての実験条件。
【図３１】試料のｐＨが試料導入量に与える影響についての実験条件。
【図３２】ＥＫＩ時間に対する試料ピークの分離挙動の実験条件。
【図３３】キャピラリー電気泳動方法による試料分析の実験条件。
【図３４】酢酸におけるｐＨと実効移動度との関係。
【図３５】β−アラニンでの実効移動度とｐＨとの関係。
【図３６】イオンの電気泳動と電流のモデルを示す図。
【図３７】キャピラリーゾーン電気泳動法（ＣＺＥ）の原理図。
【図３８】等速電気泳動分離の原理図。
【符号の説明】
２０１ 電源ユニット
２０２、２０２’ リザーバー
２０３ バイアル
２０４ キャピラリー
２０５ 吸引ポンプ
２０６、２０６’ ターンテーブル
２０７、２０７’ 駆動部
２１０ 吸光度検出部
２１５ 検出器
２２０ コントローラ
２２１ プリアンプ
２２２ Ａ／Ｄコンバータ
２３０ データ処理部
２３１ 演算部
２３２ インタフェース
２３３ 記憶部
２３４ 表示部
２３５ 出力部[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a capillary electrophoresis method, a capillary electrophoresis program, a recording medium storing the program, and a capillary electrophoresis apparatus, and in particular, with transient isotachophoresis preconcentration for measuring a low concentration sample with high sensitivity. The present invention relates to a capillary electrophoresis method, a capillary electrophoresis program, a recording medium storing the program, and a capillary electrophoresis apparatus.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, it has been said that capillary zone electrophoresis (CZE) is inferior in terms of concentration sensitivity compared to ion chromatography. This is because in CZE, the amount of sample that can be filled in the capillary at the time of analysis is very small. Therefore, in order to obtain high concentration sensitivity, a highly sensitive detector such as laser fluorescence detection or mass spectrometry is used, or a preconcentration technique such as isotachophoresis (ITP) is used in combination. CZE-LIF (Capillary zone electrophoresis-laser-induced fluorescence detection), CZE-MS (Capillary zone electrophoresis-mass spectrometry), ITP device and CZE An ITP-CZE apparatus in which the apparatus is simply connected in series and the sample is subjected to isotachophoresis separation and subjected to capillary zone electrophoresis to increase separation sensitivity is also commercially available. However, since these apparatuses are very expensive, conventional CE (Capillary Electrophoresis) equipped with a UV / VIS (Ultraviolet and Visible light spectrometry) detector used in a simple apparatus. There is a strong demand for a method that enables simple and highly sensitive analysis using an apparatus.
[0003]
As an analysis method using capillary electrophoresis, for example, an electrophoretic analysis method that quickly measures an unknown sample with high accuracy by adding a standard substance to the unknown sample and converting each migration time to obtain an effective mobility is proposed. (For example, refer to Patent Document 1).
[Patent Document 1]
Japanese Patent Laid-Open No. 2002-5886
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
For simple and highly sensitive analysis using a conventional CE (Capillary Electrophoresis) apparatus, introduction of a large amount of a low concentration sample into the capillary and on-line preconcentration are indispensable. In CZE, stacking and transient isotachophoresis (tr-ITP) have been proposed as pre-concentration methods and have been used for many samples. However, even when stacking is used, the detection concentration limit (LLDC) is not so low. This is because the sample load is essentially limited because the resolution decreases as the sample plug length increases. Moreover, not only due to the mismatch of electroosmotic flow (EOF) between the sample plug and the supporting electrolyte (SE), but also because the potential gradient at SE is lowered and the EOF velocity is increased, the separation window is increased. This is because it becomes narrower.
[0005]
Therefore, the other pre-concentration method, ie, the use of transient isokinetic electrophoresis pre-concentration, is useful for high-sensitivity analysis by CZE. Important features of isotachophoresis include that a dilute sample is concentrated according to the leading ion concentration, and that the zone interface is self-retained.
[0006]
In addition, as described above, in the conventional capillary zone electrophoresis (CZE), since the amount of the filled sample is very small, a normal detector (for example, UV, VIS) has a difficulty in high-sensitivity detection. Furthermore, it is not suitable for fractionating fractions separated after electrophoresis. In isotachophoresis (ITP), it is possible to inject a larger amount of sample compared to CZE, but low concentration components are concentrated before the leading solution, but high concentration components are diluted. It is not suitable for fractionating high concentration fractions.
[0007]
In addition, the method combining ITP and CZE injects an amount of sample that can be separated at the ITP portion, so that a larger amount of sample can be injected than at the time of CZE analysis, and each component separated at the ITP portion is concentrated at the CZE portion. Therefore, although the above two drawbacks are improved to some extent and fraction fractionation is possible, there is a limit to the amount of injected sample, and it is not applicable to, for example, analytical fractionation of trace components in river water.
[0008]
In view of the above points, an object of the present invention is to provide a capillary electrophoresis method capable of simple and highly sensitive analysis. Another object of the present invention is to provide a capillary electrophoresis method capable of introducing a large amount of a low-concentration sample into a capillary and performing on-line preconcentration. Another object of the present invention is to provide a capillary electrophoresis method for automatically determining the concentration limit of a sample to be injected and automatically performing electrophoretic separation and analysis.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
Such a problem is that, in a capillary electrophoresis apparatus, the electrophoresis part is configured to perform isotachophoresis (ITP) and capillary zone electrophoresis (CZE), and ITP is operated as transient electrophoresis (tr-ITP). This can be solved by using the capillary electrophoresis method according to the present invention in which sample injection is performed by electrical sample injection (EKI).
[0010]
In order to realize this method, an electrical sample injection device for injecting a sample and an electrolyte, a portion for separating the sample by isotachophoresis (ITP), and the isokinetic electrophoresis are used for separation. In a capillary electrophoresis apparatus having a capillary electrophoresis (CZE) portion for concentrating and separating a sample, for example, an electrolyte solution by EKI and a signal detected by a VIS or UV detection device at the boundary between ITP and CZE at the time of sample injection Based on this, the apparatus is configured so that the injection can be stopped and electrophoretic separation can be performed when it is determined that the concentration limit of the sample injected from the EKI is approaching. Here, as to the determination method of the concentration limit of the sample, as will be described later, the determination condition is set in accordance with the actual situation.
[0011]
In order to easily realize such an operation, an apparatus further including a computer capable of automatically performing the following operation is provided. That is, in the above apparatus, which further includes an apparatus control and a data recording computer, the reading liquid filling operation, the sample filling by EKI, the terminal liquid filling, and the start of application of the electrophoresis voltage are started under the control of the computer. After that, the separation window data is collected by judging the start of reading liquid absorbance increase, and after the start of terminal liquid absorbance decrease is judged, the electrophoresis measurement device is configured to end the separation window data collection. To do.
[0012]
As will be described later as an effect of the solving means of the present invention, 18 kinds of cations (mobility is 70 × 10 6) composed of 15 rare earth ions and 3 alkali metals having a small mobility difference and a wide mobility difference.^-5~ 8x10^-5(Cm²V^-1s^-1)) As sample, limit of stacking, effect of transient isotachophoresis pre-concentration (tr-ITP), sample solution (S), reading (L) and terminal (T) electrolyte when using tr-ITP The behavior when the order of filling is changed is shown in comparison. Moreover, as a sample injection method, in addition to the conventionally used pressurization method (drop method, suction method), electrical sample injection (EKI) as a sample introduction method into the capillary, and EKI and transient constant velocity It also shows the effect of improving the concentration sensitivity of the method (Electrokinetic supercharging) combined with pre-electrophoresis concentration.
[0013]
According to the first solution of the present invention,
Setting a sample injection time for injecting the sample into the capillary by electrical sample injection;
Filling the capillary with the leading electrolyte, filling the sample by electrical sample injection according to the set sample injection time, and filling the terminal electrolyte in a predetermined order;
Applying an electrophoresis voltage so that electrophoresis is performed by separating the leading electrolyte, the sample, and the terminal electrolyte in this order;
Measuring the absorbance and migration time of each electrolyzed electrolyte and sample;
A step of increasing the absorbance sensitivity by determining that the absorbance measured at a predetermined absorbance sensitivity has increased by a predetermined threshold value or more and starting acquisition of separation window data indicating the absorbance of the sample separation window When,
Ending the acquisition of separation window data by determining that the absorbance has decreased by more than a predetermined threshold; and
Storing the acquired separation window data in association with the migration time;
Based on the separation window data and the running time, the sample injection time and / or sample concentration and / or pH of the packed sample was measured under conditions where the measurement sensitivity is saturated, or the sample injection time and / or sample concentration And / or determining whether the measurement was performed under a plurality of predetermined conditions for pH;
A step for repeating the acquisition of separation window data and the corresponding migration time again by changing the measurement conditions according to the judgment result
, A capillary electrophoresis program for causing a computer to execute these processes, and a computer-readable recording medium on which the program is recorded.
[0014]
According to the second solution of the present invention,
A vial containing a sample having a test substance;
A plurality of reservoirs each containing a leading electrolyte and a terminal electrolyte, or a mixture thereof;
A capillary for performing electrophoresis;
A power supply unit for electrical sample injection and electrophoresis;
A detector for detecting the absorbance and migration time of substances contained in each electrolyte and sample;
A control unit for controlling the vial, the reservoir, the capillary and the power supply unit;
A calculation unit for determining the effective mobility of the test substance from the migration time by capillary electrophoresis;
With
The controller is
Means for setting a sample injection time for injecting the sample into the capillary by electric sample injection;
Means for filling the capillary with the leading electrolyte, filling the sample by electrical sample injection according to the set sample injection time, and filling the terminal electrolyte in a predetermined order;
Means for applying an electrophoresis voltage so that electrophoresis is performed by separating the leading electrolyte, the sample, and the terminal electrolyte in that order;
Means for measuring the absorbance and migration time of each electrolyzed electrolyte and sample;
Means for starting the acquisition of separation window data indicating the absorbance of the sample separation window by increasing the absorbance sensitivity by determining that the absorbance measured at a predetermined absorbance sensitivity has increased by a predetermined threshold value or more. When,
Means for terminating the acquisition of the separation window data by determining that the absorbance has decreased by a predetermined threshold value or more;
Based on the separation window data and the running time, the sample injection time and / or sample concentration and / or pH of the packed sample was measured under conditions where the measurement sensitivity is saturated, or the sample injection time and / or sample concentration And / or means for determining whether the measurement was performed under a plurality of predetermined conditions for pH;
Means for changing the measurement conditions according to the determination result, and repeatedly acquiring the separation window data and the corresponding migration time;
The computing unit is
Means for storing the obtained separation window data in correspondence with the migration time;
A capillary electrophoresis apparatus is provided.
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
0. Various electrophoresis methods and their theory
In order to make the contents of the present invention easy to understand, first, the principle of the electrophoresis method related to the present invention will be described, and the conventional problems in the electrophoresis method will be clarified.
[0016]
Ionic substances present in the solution (eg Na⁺, Cl⁻When ionizing small ionized ions (such as proteins, large particles such as proteins and colloidal particles), the ionic substance moves toward the positive or negative electrode depending on its charge, molecular size, molecular weight, etc. Run in solvent (supported electrolyte). Such a phenomenon is called electrophoresis, and the object of analysis of electrophoresis using this phenomenon is limited to those that can be separated as ions. Electrophoretic analysis is a technique for separating and analyzing ionic substances based on the ease of movement of ions in an electric field (mobility), and isotachophoresis (ITP), capillary electrophoresis (CZE), isoelectric focusing It is classified into electrophoresis (IEF: isoelectric focusing) and electrokinetic chromatography (EKC). The most important basic concept of any method is mobility, and the important issue in performing separation optimization is how to select experimental conditions that maximize the difference in mobility. Become. Many of the inorganic ions and organic compounds to be analyzed are weak acids, weak bases, or amphoteric electrolytes, and the dissociation of these substances in an aqueous solution is affected by the concentration, pH (hydrogen ion concentration), and the like.
[0017]
A. Mobility
A-1 Absolute mobility
Electrophoresis is an analysis method that uses the difference in mobility of a sample. Mobility is defined by the migration velocity of ions in the electric field of the potential gradient (E).
[0018]
[Expression 1]

[0019]
Where m is the mobility (cm²・ V^-1・ S^-1), V is the velocity at the time of migration (cm · s^-1) And E are potential gradients (V · cm^-1).
[0020]
For mobility, absolute mobility m₀And effective mobility m. Absolute mobility is the mobility of a completely dissociated state in an infinitely diluted solution (ionic strength is 0), and the effective mobility is the movement in an actual solution with interactions between ions. It is a degree. This absolute mobility is a physical constant determined by the specific properties of the ion such as the size and diffusion coefficient of the ion and the viscosity and temperature of the solvent. That is, the value shows a unique value depending on the ion species. M₀Is usually 10 at 25 ° C.^-4(Cm²・ V^-1・ S^-1) Order. M₀Has a temperature dependency of about 2% per 1 ° C.
[0021]
If the radius of the hydrated ion is regarded as the Stokes radius, the absolute mobility is given by the following equation according to Stokes' law.
[0022]
[Expression 2]

[0023]
Here, Z is an electric charge, e is an electron elementary quantity of 1.6022 × 10^-19(C), r is the hydration radius of the spherical particles, and η is the viscosity of the medium. The mobility of some organic ionic species can be calculated by Equation 1. On the other hand, when the hydration radius is accurately known, the absolute mobility can be obtained very accurately.
[0024]
However, this concept does not apply to complex polyatomic molecular ions. Therefore, Jokl derived the following empirical formula where the absolute mobility of organic ions and complex ions is inversely proportional to √M.
[0025]
[Equation 3]

[0026]
Here, Z is a charge, M is the formula weight of the complex, and k is a proportionality constant. This empirical formula calculated the absolute mobility of many complex ions.
[0027]
A-2 Effective mobility
What is important in considering mobility is that factors that affect the actual solution must be considered. Here, the mobility in an actual solution is referred to as an effective mobility m. m is not constant and varies greatly depending on, for example, the dielectric constant, ionic strength, pH, and the like of the solvent. Here, the mobility in the actual solution is the effective mobility, and the substance that can be ionized in the solution is A. This substance A contains neutral molecules and ionic species A₀, A₁, A₂, A_kIt represents the whole and behaves as if they are in a fast and dynamic chemical equilibrium and exist in a macroscopic view. For example, phosphate is a neutral molecule H in aqueous solution.₃PO₄And each ion species H₂PO^4-, HPO₄ ^2-, PO₄ ^3-It exists in the form of
In an electrophoretic field, all particles are A₀, A₁, A₂, A_k, M₀, M₁, M₂………… m_kAnd each concentration c₀, C₁, C₂, C_kThen, they are effective mobility m as the same substance in the electric field._AAnd is represented by the following formula.
[0028]
[Expression 4]

[0029]
Where x_iIs the molar fraction of ion i and c_AIs the total concentration of substance A.
[0030]
[Equation 5]

[0031]
Thereby, the effective mobility of a phosphate is represented as follows.
[0032]
[Formula 6]

[0033]
Since the chemical equilibrium is affected by pH, the effective mobility is naturally affected by pH. The dependence relationship between the pH and the effective mobility m of a monovalent weak acid and weak base has a characteristic relationship corresponding to the dissociation curve of weak acid and the protonation curve of weak base, respectively. For weak acid HA, the effective mobility is expressed by the following equation.
[0034]
[Expression 7]

[0035]
Where K_HAIs the dissociation constant of the acid HA and is represented by the following formula.
K_HA= [H⁺] [A⁻] / [HA]
[0036]
FIG. 34 is a diagram showing the relationship between pH and effective mobility in acetic acid. The curve shown in FIG. 34 shows the ion mobility m._Ac= 40 × 10^-9(M²・ V^-1・ S^-1) And pK_aIt represents the mobility curve of acetate with (acid dissociation constant) = 4.76. That is, at pH> 8, 40 × 10^-9(M²・ V^-1・ S^-1), 20 × 10 at pH = 4.76^-9(M²・ V^-1・ S^-1), 0 at pH <2.
[0037]
As another example, amphoteric electrolytes such as amino acids and proteins will be described. These compounds exist as cations and anions depending on the surrounding pH. For example, the zwitterionic form of β-alanine is as follows.
CH₂-CH₂-COO^-
｜
NH₃ ⁺
The characteristic of an amino acid as an ampholyte is represented by a dissociation constant when moving from an acidic region to a basic region. First dissociation constant pK₁The value of indicates the protonation of the carboxyl group in the acidic region, that is, the process in which the zwitterion constitutes a cation.
[0038]
[Equation 8]

[0039]
On the other hand, the second dissociation constant pK₂Shows a process in which the proton of the amino group is dissociated and the zwitterion constitutes an anion.
[0040]
[Equation 9]

[0041]
β-alanine is pK₁= 3.8, it exists as a cation (+), and its mobility is 36 × 10^-9(M²・ V^-1・ S^-1), PK₂= 9.6 exists as an anion (−), and its mobility is −31 × 10^-9(M²・ V^-1・ S^-1)
[0042]
FIG. 35 shows the relationship between the effective mobility of β-alanine and pH. That is, at pH> 11, −31 × 10^-9(M²・ V^-1・ S^-1), 7.5> pH> 5, 0, pH <2 36 × 10^-9(M²・ V^-1・ S^-1Therefore, when β-alanine is electrophoresed in an electrolyte solution of pH> 7.5, β-alanine ion moves to the minus side, and when electrophoresed in an electrolyte solution of 5> pH, it is on the plus side. Move to. Therefore, when the electrolyte solution of pH> 7.5 and the electrolyte solution of 5> pH are placed adjacent to each other, β-alanine is present in the electrolyte solution and electrophoresed on the boundary surface between the two electrolyte solutions. It is concentrated or discrete from the boundary surface to the opposite side.
[0043]
PK1 and pK2 in the figure are acid dissociation constants, respectively, the pH value when the amino group part of the amino acid is half dissociated (mobility is about +20 half of the absolute mobility +40), and when the carboxylic acid part is half dissociated Represents the pH value. PI is the isoelectric point, and when the pH is this value, the charge of the ion is 0 (thus, the ion mobility is 0). pI can be expressed as follows.
pI = (pK1 + pK2) / 2
[0044]
A-3 Relative mobility
The relative mobility is defined by the following equation.
[0045]
[Expression 10]

[0046]
Sodium ion is a reference ion, and mobility at 25 ° C. is given by the following equation.
[0047]
## EQU11 ##

[0048]
The above formula is the reference concentration c₀Is expressed as ionic strength based on₀10^-5(Cm²・ V^-1・ S^-1). Z_iIs a charge.
[0049]
A-4 Mobility and conductivity
FIG. 36 is a diagram showing a model of ion electrophoresis and current. From a microscopic point of view, the electrophoresis of ions in solution is considered as conduction of current through the electrolyte solution. The current I, the plane width area S of ion movement, and the current density i have the following relationship.
[0050]
[Expression 12]

[0051]
Individual ionic species contribute to the current density in proportion to their concentration, charge, and migration speed. The formula is expressed by the following formula.
[0052]
[Formula 13]

[0053]
Where c_jIs the concentration of ionic species j and the unit is (mol · m^-3) And F are Faraday constants (96487 (C · mol^-1)). The current density i has the following relationship with the electric field strength E according to Ohm's law.
[0054]
[Expression 14]

[0055]
Thereby, the conductivity κ, which is a physical property value, and the mobility have the following relationship.
[0056]
[Expression 15]

[0057]
In the figure, v is the electrophoresis speed of ions under a certain potential gradient (E). F of Fc is the Faraday constant and c is the molar concentration of ions. Fc represents the amount of electricity carried by the ion species j. When the ion species j has a valence of Z, ZFc represents the quantity of electricity of the ion species j by multiplying by Z.
[0058]
A-5 pH effect
In order to allow the mixed samples to be separated from each other, an appropriate difference needs to be generated in the effective mobility of each component. For this purpose, it is important to select appropriate electrolyte conditions, and it is particularly important to select a pH for a sample containing a weak electrolyte.
[0059]
For the separation of weak acids, weak base substances and amphoteric substances by electrophoresis, the absolute mobilities of these substances are not so different, and it is more effective to separate them using the difference in dissociation degree constant. The effective mobility can be changed by adjusting the pH of the electrolytic solution to change the dissociation degree of ionic species. The relationship between the dissociation degree α, pH, and acid dissociation constant pKa is given by the following equation.
[0060]
[Expression 16]

[0061]
In order to separate the given sample ions from each other, it is first necessary to determine what value the pH of the leading electrolyte should be. If the absolute mobility and pKa are known, the optimum conditions for separation can be determined by computer simulation techniques. It becomes possible to find. On the contrary, it is possible to measure the effective mobility of each sample and calculate the stability constant and the absolute mobility so as to best fit the effective mobility by simulation. FIG. 34 shows a pH dependence curve of the effective mobility of an organic acid using computer simulation. Separation can be easily achieved by creating such a graph and setting the pH region so that the effective mobility difference of the ion species targeted for separation is increased.
[0062]
B Capillary electrophoresis
B-1 Overview
Capillary electrophoresis CE is an analysis method in which a substance having a charge in a solution is influenced by an electric field and moves in a capillary at a constant speed depending on the type of charge in either the positive or negative direction. CE is an electrophoresis that uses a capillary having an inner diameter of about 100 μm or less, which was developed from the late 1970s to the early 80s. There are many advantages to using capillaries. In particular, the great feature is that the adverse effect of Joule heat can be reduced. Since the capillary has a high electric resistance, even when a very strong electric field (100 to 500 (V / cm)) is applied, the flowing current is small and the generation of heat can be minimized. Further, the capillary has a large surface area ratio to the internal volume, and can efficiently dissipate the generated heat. Thereby, since a high voltage can be applied, the analysis time is shortened and high separation efficiency and separation performance can be obtained. When a high voltage is applied, a flow of solution, i.e., an electroosmotic flow, is generated in the capillary, but this flow is not laminar but has a planar flow, so often 10⁵A theoretical plate number exceeding (stage / m) is obtained. This electroosmotic flow allows all solutes to be analyzed simultaneously regardless of the type of charge. In addition, CE has many separation modes with various separation mechanisms and selectivity, requires only a small amount of sample, enables on-capillary detection and quantitative analysis, and has a simple separation system. Excellent features such as easy theoretical handling. On the other hand, since the sample injection amount is small, there is a problem in the injection method and reproducibility. In general, CE is limited to analytical purposes and is often not available for sorting. In addition, it has been pointed out that it is difficult to handle substances adsorbed on the inner wall of the capillary such as proteins.
[0063]
B-2 Electroosmotic flow
Electroosmotic flow EOF is a very important factor for CE. EOF is the flow of the entire liquid in the capillary and is based on the surface charge of the inner wall of the capillary. In an electrolyte solution, a solid surface usually carries an excessive negative charge caused by ionization of the solid surface (ie, acid-base equilibrium) or adsorption of ionic species on the solid surface, or both. Both of these phenomena are also expected to occur in fused silica capillaries, and the ionization of many silanol groups (SiOH) on the inner wall (SiO⁻) Forms an electric double layer on the inner wall, and when a voltage is applied thereto, EOF occurs. This electric double layer causes a potential difference near the wall surface. This potential difference is referred to as zeta potential (ζ). As a process of generating EOF, when a voltage is applied to both ends of the capillary, the cation forming the electric double layer is attracted toward the cathode, but the silanol group which is an anion is fixed to the tube wall. I can't move. However, since the cation is dissolved in the solution, the entire solution in the capillary is pulled toward the cathode by the movement of the cation. This is EOF.
[0064]
Electroosmotic flow velocity v_EOFIs the dielectric constant ε and viscosity η of the supporting electrolyte, zeta potential ζ₁And the following equation (Smoluchowski equation) as a function of the electric field strength E applied along the capillary.
[0065]
[Expression 17]

[0066]
Zeta potential ζ₁Can take either a positive or negative sign depending on the charge state of the inner wall of the capillary, but in a normal state (such as when the fused silica base tube is filled with a neutral to alkaline supporting electrolyte), it becomes negative. Electroosmotic flow velocity v_EOFBecomes positive, so the electroosmotic flow is from the anode to the cathode. ε and η are governed by the electrolyte concentration, pH, temperature, etc. of the supporting electrolyte. Under the set conditions, dielectric constant ε, viscosity η and zeta potential ζ₁Is constant, so v_EOFDepends on the potential gradient E, and both are in a proportional relationship. E is the ratio of the applied voltage V to the capillary length L and is therefore proportional to V. After all, electroosmotic flow velocity v_EOFIncreases with V, and the higher the voltage, the faster the electroosmotic flow velocity.
[0067]
Two unique features of EOF that occur in capillaries include the following.
(1) Since the flow is flat, it does not cause diffusion of the sample zone
(2) Move almost all species in the same direction regardless of charge
Each feature will be explained. In the first case, since the driving force of the flow is uniformly distributed along the capillary (that is, on the inner wall surface), there is no pressure drop in the capillary, so the flow becomes uniform. . For the second, under normal conditions (ie, a negatively charged capillary surface), the flow is from the anode to the cathode. Since the EOF speed is an order of magnitude greater than the electrophoretic speed of the anion, the anion is also swept toward the cathode. Accordingly, the cation, the neutral substance, and the anion all move in the same direction, and the electrophoretic analysis can be performed by one measurement. Considering the moving speed, the cation is the fastest because it is the same as the migration direction, and the neutral substances are not separated from each other, but they are all the same as the EOF, and the anion is electrophoretically opposite to the EOF, but the EOF moves to the cathode side. Run the slowest.
[0068]
For various reasons, fused silica is frequently used as the material of the capillary. When a fused silica capillary is used, if the pH of the supporting electrolyte is low, the ionization of the silanol groups on the inner wall is suppressed, and the charging is weak.₁Becomes smaller_EOFDecrease. Conversely, when the pH increases, ζ₁The absolute value of increases and v_EOFRises.
[0069]
B-3 Zone electrophoresis
FIG. 37 is a principle diagram of capillary zone electrophoresis (CZE). The diagram shown in FIG. 37 shows the relationship between the schematic diagram of each zone state in the capillary and the potential gradient (E) when samples having different effective mobilities are separated by zone electrophoresis.
[0070]
In the zone electrophoresis method, one supporting electrolyte (SE) is used as the electrolyte to be used. Therefore, the potential gradient (E) is constant through the capillary. A capillary is filled with an electrolytic solution (supporting electrolytic solution: SE) containing a counter ion (Q) having a buffering capacity, and a sample is injected therebetween. When energization is started, the anion and cation components in the sample migrate toward the counter electrode at a specific speed (effective mobility), but all components migrate toward the cathode due to electroosmotic flow. In the zone electrophoresis method, the sample zone is discontinuous because there is no interfacial self-holding action of the sample zone.
[0071]
Migration speed of each zone (v_mig) Is the electrophoresis velocity (v_ep) And electroosmotic flow velocity (v_EOF).
[0072]
[Formula 18]

[0073]
Here, m is the effective mobility of a certain sample component ion, E is the potential gradient, ε, ζ, and η are the dielectric constant of the solvent, the zeta potential of the inner wall of the capillary, and the viscosity of the solvent, respectively. The electroosmotic flow velocity is constant throughout the capillary. The effective mobility of ions SE, A, B, and C is
[0074]
[Equation 19]

[0075]
Therefore, if the potential gradient is constant, the following relationship holds for the migration velocity v.
[0076]
[Expression 20]

[0077]
The sample is detected after moving to a detector fixed at the end of the capillary.
[0078]
B-4 Isotachophoresis
(principle)
In isotachophoresis, there are two types of electrolytes: an electrolyte containing ions with higher mobility than any ion in the analysis sample (leading electrolyte) and an electrolyte containing ions with low mobility (terminal electrolyte). This is characterized in that electrophoresis is performed by injecting a sample into the interface between the two and energizing them. Since each separated ion migrates at a constant speed in a steady state, it has such a name.
[0079]
FIG. 38 shows a principle diagram of isotachophoresis separation. In cation analysis, a leading electrolyte is used on the cathode side and a terminal electrolyte is used on the anode side, and a cation mixed sample S (for example, ions A and B) having different effective mobilities for separation is provided near the interface between the two electrolytes. Inject) (a). When this system is energized, each cation begins to migrate, and ions A and B that have a difference in effective mobility begin to separate, but in this state, there is a mixed zone M of A and B, and the separation is incomplete. There is (b). Further, when the current is applied, the mixing zone disappears, and when the separation is completed, each sample zone is separated by a sharp interface (interface self-holding effect), and in principle migrates in the order of effective mobility (c). The separated zones A and B keep the same state (steady state) and move to the cathode side. In the figure, the graph of cl represents the effective mobility of each zone of c, the graph of c2 represents the potential gradient of each zone of c, and the graph of c3 represents the temperature of each zone of c.
[0080]
Although very rare, the order of migration may be reversed. When sample ions migrate in the order of A and B, the necessary and sufficient condition for determining the order of migration is m_A> M_BInstead, the two conditions are represented by the following equation.
[Expression 21]

[0081]
Where m_{B, A}Is the mobility of B in zone A, and so on. That is, it is necessary and sufficient that the sample ion B is slower than the A ion in the A zone and the sample ion A is faster than the B ion in the B zone.
[0082]
The effective mobility of ions L, A, B, and T is m_L, M_A, M_B, M_T, The potential gradient of each zone is E_L, E_A, E_B, E_T, The conductivity of each zone κ_L, Κ_A, Κ_B, Κ_TThen, since the electrophoresis is performed at a constant speed in the steady state, the following relational expression is established.
[0083]
[Expression 22]

[0084]
The effective mobility of each ion has the following relationship.
[0085]
[Expression 23]

[0086]
Therefore, the potential gradient of each zone has the following relationship.
[0087]
[Expression 24]

[0088]
In the isotachophoresis, since the electrophoretic current is constant, according to the modified Ohm's law, the conductivity (κ) of each zone has the following relationship.
[0089]
[Expression 25]

[0090]
Thus, a potential gradient detector capable of measuring the potential gradient (E) and a conductivity detector capable of measuring the conductivity (κ) are used in isotachophoresis.
[0091]
Isotachophoresis is characterized in that thin sample components are concentrated in the separation process depending on the concentration of leading ions, and conversely, dark sample components are diluted. This is an advantage for the analysis of trace components in the matrix. In addition, sample ions have a recovery rate of 100% for the components that migrate between the reading and the terminal, and a large amount of sample can be injected and there is no useless fraction. Are better.
[0092]
(Concentration effect)
Usually, in the steady state of isotachophoresis analysis performed at a certain concentration of a certain leading electrolyte, the concentration of a certain sample is adjusted to be constant and does not depend on the concentration before electrophoresis. From this, the volume of a certain sample zone can be used as a quantitative parameter. If a sample having a concentration higher than the adjusted concentration is migrated, the sample is diluted. Conversely, if a sample having a concentration lower than the adjusted concentration is migrated, the sample is concentrated. If this effect is utilized, even a trace amount component in a sample can be analyzed, which is important for actual analysis.
[0093]
1. Capillary zone electrophoresis device
FIG. 1 is a configuration diagram of a capillary zone electrophoresis apparatus. This apparatus includes a power supply unit 201, reservoirs 202 and 202 ′ for filling various electrolytes, a vial 203 for filling a sample containing a test substance (hereinafter sometimes simply referred to as a sample), and a capillary 204 for generating electrophoresis. , Turntables 206 and 206 ′ for placing reservoirs, driving units 207 and 207 ′ for driving the turntable up / down / left / right / rotation, absorbance detection unit 210, controller 220 for controlling each unit, means, etc., data processing The unit 230 is provided. The capillary zone electrophoresis apparatus may further include a suction pump 205, a preamplifier 221, and an A / D converter 222.
[0094]
The absorbance detection unit 210 includes, for example, a lamp (for example, a UV lamp), an aperture (aperture), a shutter, a spectroscope slit, a greeting (diffraction grating), and a detector 215 (for example, a 512ch photodiode array). The data processing unit 230 includes a calculation unit 231, an interface 232, a storage unit 233, a display unit 234, and an output unit 235. The controller 220 and the calculation unit 231 can be shared by a microcomputer, for example.
[0095]
The power supply unit 201 includes, for example, a high voltage power supply with an output of 0 to 30 kV, and is connected to the reservoirs 202 and 202 ′ filled with the supporting electrolyte and the vial 203 filled with the sample via wiring.
[0096]
A plurality of reservoirs 202 and 202 'are placed on the turntables 206 and 206'. The reservoirs 202 and 202 ′ are filled with an appropriate supporting electrolyte having UV absorption, a leading electrolyte containing ions having a higher mobility than any ions of the analysis sample, and a terminal electrolyte containing ions having a low mobility, respectively. Is done. The vial 203 is filled with a sample to be analyzed (for example, a sample having no UV absorption) and can be placed on the turntable 206 or 206 '. Further, for example, a plurality of vials 203 for filling samples with different concentrations and pH may be provided.
[0097]
The reservoir is sufficiently large with respect to the volume of the capillary 204, and is a liquid reservoir in which the original state does not change even when voltage is applied or a little liquid flows in the capillary 204, and in some cases, the reservoir is filled. Says the electrolyte solution. On the other hand, the vial is simply a liquid reservoir filled with a liquid. In the above example, the vial 203 is filled with a sample. However, it is not necessary to distinguish between the reservoir and the vial as the reservoir container itself for filling the liquid.
[0098]
The capillary 204 is a tube having an appropriate inner diameter and length (for example, an inner diameter of 75 μm and a length of 100 cm). For example, one end of the capillary 204 is inserted into the reservoir 202 and the other end is inserted into the reservoir 202 ′. .
[0099]
Since the electrophoresis apparatus according to the present embodiment uses the capillary 204, for example, analysis can be performed with a sample of nanoliter order, and since a high voltage can be applied, analysis can be performed for a short time. On the other hand, Joule heat is generated when a high voltage is applied, and it is necessary to consider the effect. For example, the capillary temperature can be adjusted by using a Peltier element that can control the generation and absorption of heat by controlling the current flowing in different conductors or semiconductors. In addition to the control by the Peltier element, the open portion of the capillary 204 has a great influence on the temperature.
[0100]
The turntables 206 and 206 ′ are switching means for rotating up and down, right and left, and rotating to switch the electrolyte solution and the like filled in the capillary 204. On the turntables 206 and 206 ′, reservoirs 202, 202 ′ and vials 203 that are filled with an electrolyte and a sample necessary for measurement are placed. Note that the turntables 206 and 206 ′ shown in FIG. 1 are switched to the electrolytic solution filled in the capillary 204 by rotating, but may be moved in the horizontal and vertical directions, for example.
[0101]
The drive units 207 and 207 ′ are drive means for rotating the turntables 206 and 206 ′ up and down, left and right, and are controlled by the controller 220.
[0102]
The lamp of the absorbance detection unit 210 emits UV light (or white light), and the emitted light enters the capillary 204 through an aperture and a shutter. The spectroscope slit has a gap for limiting the width of ultraviolet rays emitted from the lamp, and is disposed or attached in the vicinity of the capillary 204. The light transmitted through the capillary 204 reaches the greeting through the spectroscopic slit, is split into light of, for example, 190 to 600 nm, and forms an image on the detector 215.
[0103]
The detector 215 is, for example, an array of 512 photodiode arrays having a dynamic range over a wide range from ultraviolet to near infrared, and detects light dispersed as a video signal proportional to the amount of light for each wavelength of 512ch. To do. A photodiode array is a photoelectric conversion device that utilizes the fact that the reverse current of the contact between a PN junction or a rectifying metal and a semiconductor increases due to a high electromotive force effect by light irradiation. By using 512 of these, multi-wavelength simultaneous detection with high accuracy is possible.
[0104]
The preamplifier 221 amplifies the output from the detector 215. The A / D converter 222 converts the amplified signal into a digital signal and outputs the digital signal to the controller 220 and the data processing unit 230.
[0105]
The controller 220 controls the operation of the sample analysis by controlling the power supply unit 201, the driving units 207 and 207 ', and the like. For example, the controller 220 performs filling of each electrolyte and sample, application of voltage for electrophoresis, adjustment of absorbance sensitivity, adjustment of sample injection time indicating the time of voltage application by electrical sample injection, and the like. By adjusting the detection sensitivity and sample injection time by the controller 220, more accurate sample analysis is possible, and analysis of a low concentration sample is possible. In addition, by providing the controller 220 and the turntables 206 and 206 ', individual differences due to analysis are eliminated, and highly reproducible data can be obtained. In addition, automatic measurement can be performed by an easy operation simply by setting multiple samples.
[0106]
The calculation unit 231 of the data processing unit 230 inputs the absorbance signaled by the detector 215 via the interface 232. In addition, based on the input absorbance, the calculation unit 231 grasps and records the time required from the start of electrophoresis to the output of the detector 215 as the migration time of the test substance. The calculation unit 231 performs appropriate data processing such as effective mobility calculation by a TCDT method described later based on the migration time, and outputs the processing result to the display unit 234 or the output unit 235. Based on the effective mobility, the calculation unit 231 may identify, for example, a component included in the sample by referring to a file in which the effective mobility and the substance name are stored in advance.
[0107]
2. Electrophoresis and operation
FIG. 2 is a main flowchart of sample analysis.
First, initial setting is performed (S100). For example, a vial 203 containing a sample, a reservoir 202 containing a supporting electrolyte, a leading electrolyte, and a terminal electrolyte are set on the turntable 206, and a reservoir 202 ′ containing a supporting electrolyte is set on the turntable 206 ′. Set to. A plurality of vials 203 containing samples having different concentrations or pH may be set on the turntable 206. The controller 220 sets the sample injection time. For example, the upper and lower limits of the sample injection time are set in advance, and the controller 220 can set the upper or lower limit as the sample injection time.
[0108]
Next, the controller 220 controls the drive units 207 and 207 ', the power supply unit 201, and the like, and fills the capillary 204 with the electrolytic solution and the sample (S101). The controller 220 applies a voltage to both ends of the capillary 204 to start electrophoresis, and in a state where the leading electrolyte, the sample, and the terminal electrolyte are electrophoresed and separated, the absorbance (in the separation window portion which is the window of the sample) ( Separation window data) and migration time are measured (S103). The controller 220 detects a separation window in which components in the sample are separated based on the output from the detector 215, and collects separation window data.
[0109]
In addition, the controller 220 outputs the collected separation window data and migration time to the calculation unit 231 of the data processing unit 230. The controller 220 outputs a signal indicating the start of electrophoresis and an appropriate signal indicating detection of the separation window to the calculation unit 231, the calculation unit 231 measures the migration time, and inputs separation window data from the detector 215. You may do it. Details of the filling operation and absorbance measurement will be described later.
[0110]
The calculation unit 231 inputs the separation window data and the migration time via the interface 232 and stores them in the storage unit 233 (S105). Note that the calculation unit 231 may input and store data each time the separation window data during measurement in step S103 is collected.
[0111]
Next, the controller 220 determines whether to measure again under different conditions (S107). For example, based on the separation window data and the migration time, the controller can determine whether to perform another measurement based on whether the amount of the filled sample is a sample injection limit that does not improve the measurement sensitivity even when a sample is injected. Alternatively, the controller 220 can determine that measurement is performed again until all of the plurality of measurement conditions stored in the storage unit 233 are measured.
[0112]
As an example, first, the controller 220 calculates the absorbance peak area of the predetermined component (the area surrounded by the absorbance change of the peak portion and the time axis) based on the separation window data and the migration time, and corresponds to the sample injection time or the sample concentration. Then, it is stored in a memory provided inside. The controller 220 determines the linearity of the increase in peak area based on the accumulated absorbance peak area. For example, the controller 220 can obtain a slope (change amount) from an appropriate number of accumulated data, and determine linearity when the slope change is equal to or less than a threshold value. The controller 220 may determine linearity by performing linear approximation or polynomial approximation.
[0113]
The controller 220 can determine that “measure once again” when the linearity of the peak area increase is maintained, and can determine that “do not measure again” when the linearity is not maintained. . In addition, for example, the controller 220 may determine whether to perform the measurement again a predetermined number of times or based on conditions such as whether the sample injection time exceeds a predetermined threshold.
[0114]
If the controller 220 determines that “measure again” (S107), the measurement condition is changed (S108), and the process returns to step S101. As a change in the measurement conditions, the controller 220, for example, sets the sample injection time to be larger by a predetermined time, designates the vial 203 containing the sample with a different concentration or pH, adjusts the pH of the sample, and corresponds to a leading electrolyte equivalent substance And so on. Moreover, you may mix the substance which adjusts pH or suppresses an osmotic flow rate into each electrolyte solution.
[0115]
Increasing the sample injection time makes it possible to analyze a low concentration sample as shown in the experimental results described later. However, if the sample injection time is too long, a separation field is generated, and an improvement in sensitivity cannot be expected. Therefore, it is important to appropriately adjust the sample injection time.
[0116]
In addition, as an example of specifying different vials 203, a plurality of samples or electrolytes adjusted to different concentrations or pHs in advance are prepared on the turntable 206, and these are switched for each measurement, and the samples or electrolytes used in the previous operation are prepared. An example is a measurement in which a sample or electrolyte having a concentration or pH different from that of the solution is introduced into the capillary 204 and the same operation is repeated. In this case, in step S108, the controller 220 designates the reservoir 202 and the vial 203 containing the sample and the electrolyte solution to be filled in the capillary 204 in the next measurement.
[0117]
Further, as an example of pH adjustment, for example, a vial filled with an acid solution and / or an alkali solution for adjusting the pH of the electrolyte solution 202 filled in the reservoir or the sample filled in the vial 203 on the turntables 206 and 206 ′ After the completion of one measurement operation, this acid or alkali solution is added to the reservoir 202 or the vial 203 using a liquid suction / discharge means (not shown) to change the pH of the electrolyte or sample. For example, the same operation as described above may be performed again.
[0118]
On the other hand, if the controller 220 determines not to perform measurement (S107), for example, the controller 220 transmits a measurement end signal to the calculation unit 231 and proceeds to the process of step S109. Upon receiving the measurement end signal from the controller 220, the calculation unit 231 refers to the separation window data and the migration time stored in the storage unit 233, obtains optimal data or one or more data indicating appropriate values, and Various data such as effective mobility are calculated based on the separation window data and / or the migration time (S109). For example, the calculation unit 231 reads the most recently stored separation window data and migration time from the storage unit 233 and converts them into effective mobility. The calculation of effective mobility will be described later.
[0119]
In the apparatus of this embodiment, as will be described later, the absolute value of the absorbance peak increases and the peak width increases according to the concentration or pH value, and the peak and peak width are saturated when reaching a certain concentration or pH. . Therefore, the calculation unit 231 can obtain optimum or appropriate data by calculating a peak, a peak width, or a peak area based on a plurality of data in the storage unit 233. In the apparatus of this embodiment, the sample injection amount increases as the sample injection time increases, and the absolute value of the absorbance peak increases, but the sensitivity decreases. Therefore, the calculation unit 231 determines whether or not the peak absolute value and / or sensitivity are included in the range indicated by the predetermined upper limit and / or lower limit threshold values from the plurality of data in the storage unit 233. Optimal or appropriate data can be determined. Further, the calculation unit 233 may obtain optimum or appropriate data by using any combination of these concentrations, pH, and sample injection time.
[0120]
Further, for a substance whose effective mobility is known, the effective mobility and substance name are stored in the storage unit 233 of the data processing unit 230, and the stored information on the effective mobility of the test substance calculated by the calculation unit 231 is stored. By executing a program that searches for the test substance, it becomes possible to quickly identify the test substance. Of course, in addition to the identification by such a method, each test substance is fractionated by electrophoresis in the process of performing the measurement. Therefore, if, for example, a mass spectrometer is connected to the capillary, each test substance is analyzed by mass spectrometry. Can also be identified.
[0121]
Further, since the separation window data causes undulations in the baseline, the arithmetic unit 231 may perform baseline correction by the following method before conversion to the effective mobility. First, the computation unit 231 samples the separation window data for baseline correction at an appropriate time interval with respect to the migration time stored in the storage unit 233. The baseline correction data may be stored in the storage unit 233 by the calculation unit 231 at an appropriate interval when the separation window data is collected. Next, the calculation unit 231 performs polynomial approximation of the baseline by the least square method or the like based on the baseline correction data. The computing unit 231 calculates the absorbance of the baseline based on the obtained baseline polynomial, and obtains the difference between the calculated absorbance and the actual measurement value to obtain the baseline-corrected data.
[0122]
The computing unit 231 outputs the converted effective mobility and / or substance name to the display unit 234 or the output unit 235 (S111). The calculation unit 231 may output the measured separation window data to the display unit 234 or the output unit 235.
[0123]
FIG. 3 is a flowchart of filling a capillary with a sample or the like. The flowchart shown in FIG. 3 is a sub-flowchart of step S101 described above.
[0124]
First, the supporting electrolyte is filled into the capillary 204 (S201). Specifically, the controller 220 controls the driving unit 207 to rotate the turntable 206 so that the reservoir 202 filled with the supporting electrolyte adjusted to an arbitrary pH is located immediately below the left end of the capillary 204. The left end of the capillary 204 is inserted into the reservoir 202 and immersed in the supporting electrolyte. Further, the controller 220 controls the drive unit 207 ′ and inserts it into the empty reservoir 202 ′ immediately below the right end of the capillary 204 as described above. Next, the right reservoir 202 ′ is sealed, and the controller 220 operates the suction pump 205 for a predetermined time to fill the capillary 204 with the supporting electrolyte.
[0125]
Next, the leading electrolyte is filled into the capillary 204 (S203). First, the controller 220 controls the driving unit 207 to lower the left turntable 206, takes the left end of the capillary 204 out of the reservoir 202, and controls the driving unit 207 again to move the left turntable 206. Rotate and move the reservoir 202 filled with leading electrolyte directly under the left end of the capillary 204. Thereafter, the controller 220 controls the drive unit 207 to raise the left turntable 206, insert the left end of the capillary 204 into the reservoir 220, and immerse the left end in the leading electrolyte. The controller 220 operates the suction pump 205 again for a predetermined time and fills the capillary 204 with the leading electrolyte.
[0126]
Next, the sample is filled into the capillary 204 by EKI (S205). The controller 220 controls the drive unit 207 to move the left turntable 206 in the same manner as described above, and inserts the left end of the capillary 204 into the vial 203 so that it is immersed in the sample. In addition, the controller 220 controls the driving unit 207 ′ so that the right end of the capillary 204 is charged into a reservoir 202 ′ filled with an electrolytic solution (for example, a supporting electrolytic solution having the same composition and pH as that filled in the capillary 204). Insert and immerse the right end in the electrolyte. The controller 220 applies a voltage to both ends of the capillary 204 by the power supply unit 201 to inject the test sample in the vial 203 into the capillary 204. The controller 220 applies a voltage during the sample injection time set in advance or set in step S108 described above.
[0127]
Next, the terminal electrolyte is filled into the capillary 204 (S207). After injecting the sample of the vial 203 into the capillary 204 as described above, the controller 220 appropriately lowers, rotates, and raises the left turntable 206 by the drive unit 207, and the capillary 204 fills the reservoir 202 filled with the terminal electrolyte. Insert the left end of. Further, at the right end of the capillary 204, the turntable 206 ′ is appropriately lowered, rotated, and raised so that an empty reservoir 202 ′ is inserted, and the terminal electrolyte is supplied to the capillary in the same manner as the above-described filling of the supporting electrolyte. 204. After introducing the terminal electrolyte, the process proceeds to step S103 in FIG.
[0128]
As a result of the above operation, the supporting electrolyte, leading electrolyte, sample, and terminal electrolyte are sequentially arranged in the capillary 204. Note that step S203 can also be performed after step S205. In this case, in the capillary 204, the supporting electrolyte, the sample, the leading electrolyte, and the terminal electrolyte are arranged in order. Alternatively, step S203 may be omitted, and the capillary 204 may be filled with an electrolytic solution obtained by mixing the leading solution and the terminal solution in step S207.
[0129]
The sample can contain a standard substance with a well known migration time for calculating the effective mobility. Alternatively, a standard substance may be included in any of the electrolyte solutions. Furthermore, the standard mobility may not be included in the sample or the electrolytic solution, and the effective mobility may be obtained based on the leading electrolytic solution or the terminal electrolytic solution.
[0130]
FIG. 4 is a flowchart of absorbance measurement. The flowchart shown in FIG. 4 is a sub-flowchart of step S103 described above.
[0131]
The controller 220 starts applying the migration voltage by the power supply unit 201 (S301). At this time, the controller 220 first lowers, rotates, and raises the left and right turntables 206 and 206 ′ as appropriate, and fills the left and right ends of the capillary 204 with the supporting electrolyte (for example, in the capillary in step S200). Are inserted into reservoirs 202 and 202 'filled with a supporting electrolyte having the same composition and pH. After the left and right ends of the capillary 204 are inserted into the electrolyte solution filled in the reservoirs 202 and 202 ', a voltage is applied to both ends of the capillary 204 by the power supply unit 201 to start electrophoresis. In addition, the controller 220 starts detecting the absorbance and measuring the migration time after the start of electrophoresis. For example, the controller 220 outputs a signal for opening the shutter, and irradiates the capillary with light emitted from the lamp.
[0132]
The sample migrates in the capillary 204 by an effective length (distance from the vicinity of one end of the capillary 204 into which the sample is introduced to the slit along the capillary 204). The direction of migration of ions in the sample is, for example, from the reservoir 202 toward the reservoir 202 '. During this time, each ion in the sample is separated by the difference in migration speed (effective mobility) of each ion. The sample separated by the difference in the migration speed (effective mobility) is detected as spectral data for every predetermined time by the greeting described above. This spectral data is signaled as absorbance by the detector 215. The detector 215 outputs the absorbance to the controller 220 and the data processing unit 230 via the preamplifier 221 and the A / D converter 222.
[0133]
The controller 220 monitors the detected absorbance (here, the absorbance of the supporting electrolyte and the leading electrolyte is detected) and determines whether the absorbance has increased by a predetermined threshold or more (S303). The increase in absorbance indicates that the absorbance of the separation window portion where the leading electrolyte passes through the slit portion and the sample is separated can be measured. If the absorbance does not increase by more than the threshold value (S303), the controller 220 maintains the detection sensitivity (S305) and continues monitoring. On the other hand, when the absorbance increases by more than the threshold value (S303), the controller 220 increases the detection sensitivity (S307). Since the absorbance of the separation window portion is larger than that of the reading solution or terminal solution, the detection sensitivity is increased in this embodiment by determining the passage of the reading solution. The controller 220 starts collecting separation window data after increasing the sensitivity (S309).
[0134]
During the collection of the separation window data (S311), the controller 220 determines whether the collected absorbance has decreased by a predetermined threshold or more (S313). A significant decrease in absorbance indicates that the separation window portion has passed through the slit portion and the terminal electrolyte has begun to absorb light. If the absorbance has not decreased by the threshold value or more (S313), the controller 220 returns to step S311 and continues to collect the separation window data. On the other hand, if the absorbance has decreased by the threshold value or more (S313), the separation of the separation window data is finished (S315), and the process proceeds to step S105 in FIG.
[0135]
Note that the threshold values used for the determination of the increase or decrease in absorbance described above may be the same value or different values.
[0136]
(Effective mobility calculation)
An outline of the measurement of effective mobility by the TCDT method will be described below (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-5886).
[0137]
In a normal method for obtaining the effective mobility from the migration time, the effective mobility (m) is obtained as shown in the following formula (1).
m = ν_ion/ E = (l / t−ν_eof) / (V / L) (1)
Where V is the applied voltage, E is the potential gradient, l is the effective length, L is the entire capillary length, ν_ionIs the migration speed of the test substance, and t is the time until the test substance is detected by the detector 215 (migration time). Also, ν_eof(Electroosmotic flow velocity, electrokinetic flow velocity) is the migration time of a substance with a mobility of 0 or the migration time of a system peak (t_eof) From the following formula (2).
ν_eof= L / t_eof    (2)
Therefore, the formula (1) becomes the following formula (1) ′.
m = (l / t-1 / t_eof) / (V / L) (1) '
[0138]
Note that the system peak means that if the indirect absorption method is used, a liquid in the capillary 204 is caused to flow by electroosmotic flow, and a substance that appears as if a part where the sample is introduced reaches the detector 215. A peak as if it was detected. Therefore, the migration time of the system peak (t_eof) Means the time until the system peak appears. Here, the indirect absorption method means that, for example, when the test substance does not absorb UV (ultraviolet light), if a substance having UV absorption is used as the electrolyte, the electrolyte is reduced only by a portion of the test substance. This is a detection method utilizing the increase in absorbance. For example, when using a silica capillary, the electroosmotic flow means that the silanol group on the inner wall of the capillary is dissociated and the inner wall becomes negatively charged, and the solution in the capillary is apparently positively charged, thereby This is a phenomenon in which the entire liquid flows to the negative electrode side when applied. This electroosmotic flow is almost always generated even if another substance is used for the capillary 204 (however, the flowing direction may change depending on the composition of the substance or the electrolyte).
[0139]
Electrophoresis time of the substance with mobility 0 (t_eof) Is a substance that has no mobility (that is, mobility 0) because the entire liquid in the capillary 204 is swept away due to electroosmotic flow by application of an electric field as described above (for example, medium) (Substance) is also detected by the detector 215, and means the time from application of such an electric field to detection. In addition, as a substance with 0 mobility, benzyl alcohol can be illustrated, for example.
[0140]
In the above, when the change in mobility due to temperature is examined in detail, the temperature dependence of the effective mobility (m) of the test substance is expressed by the term (f (T )) And the term of temperature dependency on the supporting electrolyte (g (T) = ε / η (ε: dielectric constant, η: viscosity coefficient)).
m = f (T) · g (T) (3)
[0141]
The above equation (3) is changed to the reference temperature T₀When Taylor is expanded around, the following equation (4) is obtained (where ΔT = T−T₀, F₀= F (T₀), G₀= G (T₀)). In the present invention, the reference temperature T₀As an example, 25 ° C., which is used as a standard for physicochemical constants, is often used.
m = (f₀+ F₁ΔT + f₂ΔT²+ ...) (g₀+ G₁ΔT + g₂ΔT²+ ...) (4)
[0142]
In the above equation (4), the change in ion size due to temperature change is very small compared to the temperature dependence of the viscosity and dielectric constant of the solvent. The degree (m) is represented by the following formula (5).
m = f₀(G₀+ G₁ΔT + g₂ΔT²+ ...)
= F₀g₀(1 + g₁/ G₀・ ΔT + g₂/ G₀・ ΔT²+ ...) (5)
[0143]
In the equation (5), the term after the second order can be ignored when ΔT is small, and f₀g₀= M_T0, G₁/ G₀If it is replaced by = α, the mobility is expressed by the following formula (6) regardless of the substance.
m = (1 + αΔT) · m_T0    (6)
[0144]
Where m_T0Represents the effective mobility of the test substance at the reference temperature, and α represents a temperature coefficient independent of the test substance ions. Generally, the value of the temperature coefficient α at 25 ° C. is about 0.02 (eg, K 0.0191, Li 0.0228).
[0145]
A method for measuring the effective mobility from the migration time in consideration of the temperature coefficient in the TCDT method will be described below.
Reference temperature of reference material (T₀) Effective mobility (m_{0, s}) Is the known effective mobility (m_s) From the above equation (1) 'as follows.
m_{0, s}= (L / t_s-L / t_eof) / {(1 + αΔT) E}
[0146]
Furthermore, m from the formula (6)._sAnd m_{0, s}Is represented by the following formula (7).
1 + αΔT = m_s/ M_{0, s}    (7)
In addition, the reference temperature T of the test substance₀Effective mobility at m (m_T0) Is obtained from the effective mobility (m) using the equation (1) 'as follows.
m_T0= (L / t-1 / t_eof) / {(1 + αΔT) E}
[0147]
Where m and m_T0The following relationship is established from the equation (6).
1 + αΔT = m / m_T0
From the above equation, the reference temperature T₀Effective mobility of test substance (ion) in_T0) Is obtained by the following equation (8).
m_T0= M / (1 + αΔT) = (l / t−1 / t_eof) / {(1 + αΔT) E} = {(t_eof/ T-1) / (t_eof/ T_s-1)} · m_{0, s}    (8)
[0148]
According to the equation (8), the parameters depending on the capillary zone electrophoresis apparatus such as E, V, I, and L as described above are deleted, and the electrophoresis data that does not depend on the conditions of the apparatus is deleted. Standardization is possible. Here, the formula (8) is the above-described formula 1.
[0149]
The first aspect of the TCDT method that can be employed to determine the effective mobility of a test substance from the results of capillary zone electrophoresis is the use of the above-described theory for any sample containing a test substance and at least a standard substance. Capillary zone electrophoresis is performed at different pHs, and correction is performed assuming that the effective mobility is affected only by temperature. The migration time of a substance with mobility 0 that does not have mobility in electrophoresis or the system peak Running time (t_eof), Migration time of test substance (t), migration time of standard substance (t_s) And the reference temperature T of the reference material₀Effective mobility at m (m_{0, s}) To the effective mobility (m) of the test substance using the formula 1 (formula (8))._T0).
[0150]
M which is a parameter included in the above-described formula 1 (formula (8))_{0, s}Can be determined from papers, existing data, and results (ferrograms) of preliminary experiments by the practitioner. T_eofIs measured by, for example, non-uniformity in the concentration of the electrolytic solution in the capillary 204. Furthermore, t_eof, T and t_sSince it is possible to determine which detection peak corresponds to which substance from existing data, experimental values, and roughly estimated values, the respective migration times can be determined from pherograms obtained from experiments. Note that the effective mobility can be measured with further consideration of time correction.
[0151]
3. Experimental result
3-1 Online preconcentration using stacking effect
A stacking effect is known as a concentration phenomenon of a low-concentration sample in CE. In this comparative example, experimental results on the separation / detection concentration lower limit of rare earth samples when only stacking is used are shown.
[0152]
(Principle of stacking)
FIG. 5 is a schematic diagram of stacking. The schematic diagram of FIG. 5 shows a potential gradient and a concentration gradient along the capillary length during stacking. First, the electrophoresis buffer solution (B) is injected into the capillary 204, and then the low concentration sample solution (S) is supplied into the capillary 204 to start electrophoresis. In order to exert the stacking effect, it is necessary that the potential gradient of the sample plug is relatively higher than that of the supporting electrolyte portion (electrophoresis buffer solution). Due to this potential gradient difference, the sample is concentrated at the interface between the sample plug and the supporting electrolyte.
[0153]
At the start of electrophoresis, the low concentration sample in the sample solution migrates and reaches the boundary with the electrophoresis buffer solution. When each component in the sample migrated at a high speed in the sample plug reaches the interface, since the potential gradient is low thereafter, the migration speed is drastically reduced. As a result, the sample stays at the interface and is concentrated. Therefore, when a large amount of coexisting ions are included and the potential gradient of the sample plug does not increase, normally concentration cannot be expected (a certain amount of concentration can be expected when ions with extremely high effective mobility coexist. For example). In such a case, it is necessary to use a supporting electrolyte having an extremely high concentration (high ionic strength) in order to create a potential gradient difference. Concentration is complete when all the components in the sample plug reach the interface.
[0154]
(Experimental conditions)
FIG. 25 shows experimental conditions for stacking. As the supporting electrolyte, an electrolyte having a composition that achieves total separation of 15 types of rare earth ions (La to Lu + Y) optimized by the inventors was used. Creatinine is a UV visible agent, and α-hydroxyisobutyric acid (HIBA) and malonic acid are used as a complexing agent with rare earth ions. The drop method (25 mm) was used for filling the sample. Typical sample filling times are 100 s, 500 s, 900 s, 1300 s. According to the Hagen Pois Jule equation, the sample filling volume is 21, 107, 193, 278 nl, the sample plug length is 4.8, 24, 44, 63 mm, and the absolute amount of each sample component is 0.03 for a sample of 0.2 ppm. , 0.13, 0.23, and 0.33 pmol, respectively. The ratio of the sample plug length to the capillary effective length (87.7 cm) is 0.6%, 3%, 5%, and 7%, respectively, according to the Hagen Poiseuille equation.
[0155]
(Results and discussion)
6 and 7 are electropherograms in CZE separation of lanthanide ions using the stacking effect. The electropherograms of FIGS. 6 and 7 show the migration time (second) on the horizontal axis and the absorbance at a wavelength of 220 nm on the vertical axis. In general, the phenomenon of light absorption is due to the decrease in absorbance because the concentration of the UV-absorbing reagent in the separation electrolyte in the portion where the sample is present decreases by the sample concentration. Therefore, the present embodiment is a method based on, for example, the UV indirect absorption method, and the direction of increase / decrease in the actually measured absorbance is opposite to the actual one shown in the present embodiment. That is, actually, the absorbance scale shows a negative absolute value, and an electropherogram upside down from the electropherogram shown in each figure is obtained. Therefore, in the figure, when the absorbance changes in the upward direction, it is expressed as “absorbance decreases”, while when the absorbance changes in the downward direction, it is expressed as “increase in absorbance”. The same applies to the graphs of absorbance shown in the present embodiment.
[0156]
FIG. 6 is an electropherogram obtained when increasing the sample injection time of a 2 ppm rare earth sample. In FIG. 6-c (sample 500s filling: 3% of capillary effective length) and FIG. 6-d (100s filling: 0.6% of capillary effective length), peak separation can be confirmed, but when a larger amount of sample is introduced, Separation is no longer possible (FIGS. 6-a, b). This is because the electroosmotic flow mobility of the dilute sample portion is large, and as a result, the permeation flow velocity increases with the increase of the sample plug length and conversely the electrophoresis velocity decreases, resulting in a narrow separation window. In addition, the peak width increases when a large amount of sample is injected. This is due to a mismatch between the electroosmotic flow velocity of the sample plug and the electroosmotic flow velocity of the buffer part, and disturbance of the sample concentrated at the interface between the sample plug and the electrophoresis buffer due to stacking. Because it happens. From this experiment, it is clear that a large amount of sample cannot be filled if only stacking is used in the usual way.
[0157]
FIG. 7 is an electropherogram obtained for a 0.2 ppm rare earth sample. The detection concentration limit LLDC corresponding to S / N = 3 was evaluated as 120 ppb from the Er peak in FIG. 7-c (500 s filling) in which separation of all ions was confirmed. However, in the calculation of S / N, the disturbance of the base line having a large period observed in FIG.
[0158]
This result suggests that it is possible to know when the concentration of the sample reaches saturation by following the absorbance at the boundary between the electrophoresis buffer and the sample over time. That is, when the photodiode array signal is sampled at a certain time interval, it is possible to trace the growth of the absorbance while causing a peak in the capillary length direction. The peak value continues to grow with time, and the growth stops from a certain time. With this time, it can be known that the concentration by stacking has been completed.
[0159]
3-2 Transient isotachophoresis pre-concentration-CZE
When only stacking was used as in 3-1 above, the sample plug length that could maintain the total separation of peaks was only 3% of the effective capillary length (FIG. 6-c). This was the limit of total peak separation, and it was impossible to achieve total separation of sample peaks by simply filling a 5% sample (FIG. 6b). In order to improve concentration sensitivity, it is necessary to achieve total separation of the samples even when more samples are loaded. Use of transient isotachophoretic preconcentration (tr-ITP) is useful for sensitive analysis by CZE. In this example, the result of performing transient isokinetic electrophoresis preconcentration is shown.
[0160]
(Principle of transient isotachophoresis pre-concentration)
FIG. 8 is a schematic diagram of preconcentration before transient isotachophoresis. The schematic diagram of FIG. 8 shows a potential gradient and a concentration gradient along the capillary length during preconcentration of transient isotachophoresis.
[0161]
First, the capillary 204 is filled with the leading electrolyte (L), the diluted sample (S), and the terminal electrolyte (T) in this order (FIG. 8-upper stage). In the stacking transient isotachophoresis process, when a voltage is applied, the sample concentration is concentrated at the interface between the sample plug and the leading electrolyte according to the principle of isotachophoresis according to the concentration of the leading electrolyte. The concentration of the terminal electrolyte is also adjusted at this interface, and a transitional isotachophoresis state is obtained (FIG. 8-middle). Subsequently, the mode shifts to the CZE mode, and each peak separated in the capillary 204 is detected by the detector 215 (FIG. 8-lower).
[0162]
The advantage of using transient isotachophoresis is that the concentrated state lasts for a long time due to the presence of L and T. When only normal stacking is used, the concentrated peak diffuses until reaching the detector, and the peak is considered to be low. However, the concentrated state (transient isotachophoresis state) continues for a long time and shifts to CZE. If it is late, the peak can be detected in a high state. Although there is a problem of peak separation, it is considered that this is effective in improving the concentration sensitivity. Second, there is an effect of suppressing disturbance of the concentrated peak due to EOF mismatch. When only a stacking is used when a relatively large amount of sample is introduced into the capillary 204, the peak concentrated at the interface between the sample plug and the electrophoresis buffer is disturbed by the EOF mismatch (FIG. 6b). Is considered to suppress this disturbance. This is important in terms of concentration sensitivity and total peak separation.
[0163]
(Effects of concentration prior to transient isotachophoresis)
FIG. 26 shows experimental conditions to which transient isokinetic electrophoresis preconcentration was applied. In order to confirm the effect of transient isotachophoresis preconcentration, the experimental conditions correspond to the case where total separation cannot be achieved by using only stacking (FIG. 6B).
[0164]
FIG. 9 is a pherogram showing experimental results of the concentration before transient isotachophoresis. FIG. 9 also shows transient isotachophoresis pre-concentration (A) and ferrogram (B) by stacking as a comparison target. The injection time of each liquid in A is L = 800 s, S = 900 s, T = 80 s, and B is the result of an experiment with L = 0 s, S = 900 s, and T = 0 s. That is, the injection time is 900 s as in FIG.
[0165]
As can be seen from FIG. 9, the total separation could be achieved by applying transient isotachophoresis when the total separation could not be achieved by stacking alone (FIG. 9-B) (FIG. 9). 9-A). Despite the fact that the peak appearance time does not change significantly, the concentration and separation are better in FIG. 9-A, as described in the principle of preconcentration before transient isotachophoresis. This is considered to be because the mismatch of EOF is suppressed.
[0166]
This also means that the limit of the plug length of the sample that can fill the capillary 204 and completely separate the peaks is increased from 3% of the effective capillary length (when only stacking is used) to 5%. When the sample was further filled, the separation field became narrower. This is presumably because an increase in EOF in the sample plug portion is unavoidable as long as the dilute sample is filled into the capillary 204. The LLDC of Er corresponding to S / N = 3 was estimated to be 40 ppb.
[0167]
In this example, as in the case of stacking, sample concentration occurs at the boundary between the reading solution and the sample, so that the sample concentration reached saturation by tracking the change in absorbance over time in the capillary length direction. You can know the time.
[0168]
3-3 Change of filling order of sample solution (S), leading (L), and terminal (T) electrolyte when using transient isotachophoresis
Conventionally, in the isotachophoresis, the electrolyte system has been performed in an electrolyte arrangement in which a leading electrolyte is filled in front of a sample and a terminal electrolyte is filled behind the sample as shown in FIG. Considering the principle of transient isotachophoresis described in FIG. 8, stacking occurs first when a voltage is applied. Therefore, when using a dilute sample, it is not always necessary to fill the leading electrolyte with the front of the sample.
[0169]
FIG. 10 is a schematic diagram showing an effect when the order of electrolyte filling is changed. As shown in FIG. 10, when the leading electrolyte is filled behind the sample and this solution is also stacked when a voltage is applied, the transient isotachophoresis state similar to FIG. 8 can be realized at the interface between the sample plug and the electrophoresis buffer. .
[0170]
(Experimental conditions)
FIG. 27 shows the experimental conditions when the electrolyte filling sequence is changed. The drop method was used for sample injection, and the capillary was filled in the order of the sample, leading electrolyte, and terminal electrolyte, and then a voltage was applied.
[0171]
(Results and discussion)
FIG. 11 is a ferrogram showing the effect of changing the electrolyte filling sequence.
FIG. 11-B is an electropherogram when the electrolytic solution filling sequence is changed. As shown in FIG. 11-B, when the separation is not achieved by stacking alone by the method of filling the leading and terminal electrolytes behind the sample (900s filling: sample plug length is 5% of capillary effective length, FIG. 11). Even in -C), the La peak disappears, but it can be seen that the total separation of the other peaks can be achieved. The peak of La can be confirmed by reducing the filling amount of the leading electrolyte. Therefore, it can be said that this method has the same effect as the filling mode of the electrolyte system in the conventionally known transient isotachophoresis preconcentration. Further, as an application of filling the electrolyte system behind the sample, the same effect can be obtained by mixing the leading electrolyte and the terminal electrolyte. When an experiment was actually performed, the same results as in FIG. 11-B were obtained as shown in FIG. 11-A. An advantage of the method of filling the leading electrolyte behind the sample is that it is not necessary to adjust the pH of the leading electrolyte. In the conventional filling method, selection of the pH of the leading electrolyte and the counter ion was important. However, in this method, for example, KCl or the like can be used as it is as the leading electrolyte, and the selection is simpler. Moreover, it can be said that the method of filling the leading electrolyte and the terminal electrolyte behind the sample is simpler because one electrolyte filling step can be reduced. The plug length of the sample that can be filled in the capillary 204 is about 5% as in the conventional method. Transient isotachophoresis pre-concentration has been found to be superior to stacking in terms of concentration sensitivity, but leading electrolyte and terminal electrolyte types, concentrations, and introduction into capillary 204 to obtain optimal concentration and separation Quantity optimization is required.
[0172]
3-4 Transient isotachophoresis preconcentration based on sample composition
From the above considerations, it was thought that a large amount of sample could not be introduced unless the permeation flow velocity of the sample plug portion was suppressed. Therefore, a sample composition (15 mM ammonium acetate) was mixed with the sample to play a role equivalent to the leading electrolyte. Based on the above, transient isotachophoresis was performed.
[0173]
(Experimental conditions)
FIG. 28 shows experimental conditions in transient isotachophoresis based on the sample composition. The sample filling time is 1300 s, 3600 s, 5400 s. According to the Hagen Poor Schule equation, the sample filling volume is 278, 770, 1160 nl, the sample plug length is 63, 176, 624 mm, and the ratio of the sample plug length to the effective capillary length (87.7 cm) is 7%, 20%, 30 %Met.
[0174]
(Results and discussion)
FIG. 12 is a ferrogram showing transient isotachophoresis when a substance corresponding to the leading electrolyte is mixed into the sample composition. FIGS. 12-D and E are pherograms obtained when conventional transient isotachophoresis and stacking are applied when the sample is filled with 7% of the capillary effective length. Considering that the limit of the plug length of the sample that can be filled when using transient isotachophoresis was 5%, the separation window is narrowed due to the increase in the permeate flow velocity. As shown in FIG. 12-C, total separation could be achieved by adding 15 mM acetic acid with the same plug length. Further, even when the plug length was increased to 20%, total separation could be achieved (FIG. 12-B). At this time, the LLDC of Er corresponding to S / N = 3 was estimated to be 17 ppb. When more samples were introduced, EOF increased and total separation became impossible (FIG. 12-A), but sensitivity could be improved by further optimization.
[0175]
3-5 Relationship between sample concentration and sample introduction amount during electrical sample injection (EKI) -EKI
Electrical sample injection (EKI) is performed by applying a voltage between the sample vial and the running buffer vial. In injection by EKI, the sample is introduced into the capillary 204 by both the inherent mobility of each sample and the pumping action of EOF. A characteristic of EKI is that the amount of sample generally introduced depends on the mobility of each sample. That is, ions having a high mobility are introduced in a larger amount than ions having a low mobility, resulting in a difference in implantation amount depending on the ion species. In addition, when the conductivity of the sample matrix is high, the matrix component bears most of the amount of electricity that flows during EKI, so that there is a problem that the introduction amount of the target sample component is reduced.
[0176]
However, when handling a dilute sample with a small matrix component, such as river water, introduction of a large amount of sample into the capillary 204 can be expected from the following two points.
(1) Continuous stacking at the running buffer and sample interface.
{Circle around (2)} Similar effects as the introduction of a large amount of sample (in the case of introducing a sample by pressure difference, the limit of the introduced sample volume is about 1 μL, but a sample vial can contain about 100 μL).
In this example, the detection density sensitivity improvement by EKI and the sample conditions to which EKI can be applied are confirmed.
[0177]
FIG. 29 shows experimental conditions for examining changes in the amount of sample introduced with respect to the sample concentration. If the supporting electrolyte to be used and the applied voltage are fixed, the amount of electricity flowing during a certain EKI time is considered to be constant. Therefore, when the sample concentration increases, the amount of sample introduced into the capillary 204 by EKI is considered to converge to a certain value. In order to confirm this, yttrium chloride was used as a sample, the experimental conditions shown in FIG. 29 were used, and the concentration was changed from 2 ppb to 3000 ppm to examine how the sample introduction amount changed with respect to the sample concentration.
[0178]
13 and 14 show electropherograms with respect to yttrium (Y) concentration change. FIG. 13 is an electropherogram for a concentration change of 2 ppb to 2 ppm, and FIG. 14 is an electropherogram for a concentration change of 2 ppm to 2000 ppm. The sample injection time (EKI time) is 200 s. 15 and 16 show the relationship between the yttrium (Y) concentration (unit: ppb, ppm) and the yttrium peak area. 15 and 16 also show cases where the EKI time is 300 s and 100 s (● and ■ in the figure) in addition to the 200 s (▲ in the figure).
[0179]
15 and 16, from 2ppb to about 2ppm, there is linearity between the concentration and the area of the yttrium peak, but when the sample concentration increases to 10ppm and 20ppm, the linearity is lost and the area increases from 100ppm to 300ppm. Was not seen. For the 100 ppm sample and the 1000 ppm sample, the 1000 ppm sample does not contain 10 times the 100 ppm sample, even though the absolute amount of sample in the sample vial is 10 times different. This is an expected result considering that the amount of current flowing during EKI is constant. FIG. 16 also shows the results of sample injection by the drop method, which are simultaneously shown for 1000, 2000, and 3000 ppm samples (indicated by X in the figure), and EKI was performed for 200 seconds for the 3000 ppm sample. More samples are injected by the drop method than sometimes. In the capillary electrophoresis method in the present embodiment, it is determined whether the sample injection amount is saturated by determining the linearity of the absorbance peak area of the predetermined component, and the effect of sample injection by EKI can be obtained. Is controlled.
[0180]
When the sample is filled by the drop method with respect to the sample of each concentration from 2 ppb to 3000 ppm based on the peak area when the 1000 ppm yttrium sample is filled by the drop method (25 mm × 650 s) shown in FIG. The peak area can be calculated from the proportional relationship.
[0181]
FIG. 17 is a diagram showing the relationship between the ratio (A) of the peak area by EKI to the peak area by the drop method and the concentration. The result shown in FIG. 17 is a result of calculating how many times the peak area value of each concentration when EKI is performed for 200 seconds with respect to the value calculated from the above-described proportional relationship. In addition, the magnification of the yttrium peak area by EKI with respect to the peak area of yttrium by the drop method was A. From FIG. 17, the A value starts to decrease from A = 200 times at 2 ppm, A = 100 times at 10 ppm, A = 70 times at 20 ppm, A = 2 times at 1000 ppm, and the effect of EKI decreases. I understand.
[0182]
From the above, it can be seen that EKI is an effective method for filling a large amount of a low concentration sample into the capillary 204. In this case, it is difficult to detect the saturation point of sample concentration from the absorbance measurement in the capillary length direction. That is, because samples are introduced one after another by EKI, the absorbance peak grows indefinitely without saturation. Therefore, in order to know the sample injection limit in this case, it is desirable to set a sample introduction time in advance and make a determination with reference to the linearity of growth of the absorbance peak area. In other words, if the linearity is maintained within the preset sample introduction time, the introduction is continued until that time, and if the linearity is lost within the time, the introduction is stopped at that point. is necessary. In addition to the above method, an appropriate method for knowing the sample injection limit can be used.
[0183]
3-6 Electrical sample injection (EKI)-Application of EKI to dilute rare earth samples
FIG. 30 shows experimental conditions for applying EKI to a diluted rare earth sample. FIG. 18 is a ferrogram when EKI is applied to a rare earth sample. FIG. 18 shows the results of an experiment conducted on the 200 ppb sample under the conditions shown in FIG. 30 regarding the application of EKI to a diluted rare earth sample. As a comparison object, when sample injection by the pressurization method is used, an electropherogram by transient isotachophoresis based on a sample composition having a high concentration sensitivity at the present stage is also shown (FIG. 18-D).
[0184]
As shown in FIG. 18-C, it was confirmed that a larger amount of sample was introduced by EKI than when the sample introduction by the pressurization method was used (FIG. 18-D). When the sample injection time was further increased, it was confirmed that a larger amount of sample was introduced (FIGS. 18A and 18B). This shows that EKI is effective for improving density sensitivity.
[0185]
3-7 EKI application range-Influence of sample pH on sample introduction amount
As described in the above description of stacking, when the conductivity of the sample matrix is high, it is considered that mass introduction of the target component into the capillary 204 cannot be expected. Therefore, it was examined how the amount of sample introduced changes when EKI is applied to a sample having a different pH, assuming that a sample other than the target component is contained in the sample.
[0186]
FIG. 31 shows experimental conditions regarding the influence of the pH of the sample on the sample introduction amount. As an experiment, EKI was performed by changing the pH of the sample from 2 to 7. The EKI time was fixed at 20 seconds. The pH 2 sample was adjusted by adding 10 μL of 100 mM HCl to 100 μL (pH 7) sample. Other samples were prepared in the same manner.
[0187]
FIG. 19 is a pherogram showing the effect of sample pH on the amount of target sample introduced during EKI. The results shown in FIG. 19 are experimental results for the conditions of FIGS. 31 (a) and (b). As the pH decreased, the sample introduction amount decreased, and at pH 2 (FIG. 19-D), the sample peak could not be confirmed. This is because the addition of HCl to the sample increases the conductivity of the sample components, making it difficult for continuous stacking to occur at the electrophoresis buffer / sample interface, and the amount of electricity that more HCl flows during EKI. This is thought to be due to most of them.
[0188]
FIG. 20 is a pherogram showing the effect of sample pH and EKI time. The results shown in FIG. 19 are experimental results for the conditions of FIGS. 31 (a) and (c). FIG. 20-A shows a ferrogram when the EKI time of the sample of pH 2 is made 10 times longer than the time (20 sec) in FIG. 19-D (200 sec). For comparison, FIG. 20-C also shows a pherogram obtained when the sample is filled for 500 seconds by the drop method and stacking is used.
[0189]
As is clear from FIG. 20, the appearance of a peak was confirmed by increasing the EKI time from 20 s (FIG. 20-B) to 200 s (FIG. 20-A). However, the peak intensity is similar to that when the sample is filled in the capillary 204 by the pressurization method, and EKI is not better as the sample injection method. In FIG. 20-A, the light rare earth (La to Na) peaks disappear, which will be described later. From the above, it was confirmed that EKI is effective in improving the concentration sensitivity of a dilute sample with few matrix components.
[0190]
3-8 Concentration sensitivity improvement of 15 rare earth ions by EKI
As described above, it has become clear that EKI is effective in introducing a large amount of a dilute sample having almost no ionic matrix in the sample into the capillary 204. Moreover, about the rare earth sample, the big intensity | strength peak was confirmed regarding the sample of 200 ppb (FIG. 19-AC). That is, it is effective to increase the EKI time in order to improve the density sensitivity by EKI. Here, it was examined how the peak intensity and the separation behavior change when EKI is applied and the EKI time is extended for a 20 ppb rare earth sample having a lower concentration.
[0191]
FIG. 32 shows experimental conditions for sample peak separation behavior with respect to EKI time. FIG. 21 shows the separation behavior (electropherogram) of the sample peak with respect to the EKI time. FIG. 21 shows that the peak intensity increases as the EKI time is increased. However, as can be seen from FIGS. 21A and 21B, at EKI time of 150 s (FIG. 21C) or more, a system peak appears and the separation field becomes narrow. The appearance of this system peak is thought to be because a thin sample was introduced into the capillary 204 by electroosmotic flow (EOF) generated in the capillary 204 during EKI. Therefore, adding hydroxypropyl cellulose (HPC) or the like to the electrolytic solution to suppress EOF generated in the capillary 204 seems to be effective for introducing a large amount of sample into the capillary 204. In this case, it may be necessary to shorten the capillary 204 because the peak appearance time is considered to be delayed.
[0192]
Further, as the EKI time becomes longer, the light rare earth (La to Na) peaks become broader, but the heavy rare earth peaks after Sm maintain sharpness. At the EKI time of 150 s (FIG. 21-c), the peak of all rare earths can be confirmed. However, in order to detect all the rare earth samples having a lower concentration, it is necessary to suppress the diffusion of light rare earths. The LLDC capable of detecting all rare earths with S / N = 3 for the La peak having the lowest peak in FIG. 21-c was estimated to be 2.6 ppb.
[0193]
3-9 Sample analysis by capillary electrophoresis method according to this embodiment
As described above, tests were conducted under various conditions, and EKI injection and transient isotachophoresis of the sample were effective for concentration of the sample components. For isolating the concentrated components, transient isotachoelectricity in the capillary 204 was used. Electrophoresis was found to be effective. However, if the EKI injection time is unnecessarily long, the sample injection amount is saturated and the window is narrowed in the separation process, which is not only disadvantageous for the separation of the component peaks, but also may not be expected to improve sensitivity. found.
[0194]
FIG. 33 shows experimental conditions for sample analysis by the capillary electrophoresis method according to the present embodiment. Apply EKI to a 200 ppb sample, perform transient isotachophoresis using the sample composition with the best concentration sensitivity at the present stage, extract only the window part from the obtained electropherogram, and convert it to effective mobility. An example of a displayed pherogram is shown.
[0195]
22 and 23 are electropherograms detected by introducing a sample by the method of the present embodiment. As the sample injection time is increased, the absorbance sensitivity increases, but the separation window of isotachophoresis is narrowed. In the present embodiment, the pherogram is extracted with increased sensitivity from the location where the absorbance of the reading liquid increases. If only the portion of the separation window is enlarged, a ferrogram as shown in FIG. 23 is obtained. When the separation window ends, the terminal solution begins to absorb light, so the data sampling is finished. The longer the sample injection time, the narrower the separation window.
[0196]
Here, in the separation window, the base line swells as shown in FIGS. 19 and 21, for example, and is corrected. Moreover, since it is difficult to determine the separation of each component due to the overlap of peaks, the migration time of these data is converted into effective mobility.
[0197]
FIG. 24 shows an output pherogram obtained by converting the migration time into the effective mobility. By performing such a process, the components of the diluted sample can be concentrated and detected with high sensitivity, and the unknown substance can be immediately identified.
[0198]
4). Appendix
The capillary electrophoresis method with preconcentration of transient isotachophoresis according to the present invention includes a capillary electrophoresis program for causing a computer to execute each procedure, a computer-readable recording medium recording the capillary electrophoresis program, and capillary electrophoresis. The program product can be provided by a program product that can be loaded into an internal memory of the computer, a computer such as a server that includes the program, and the like.
[0199]
【The invention's effect】
According to the present invention, a capillary electrophoresis method capable of simple and highly sensitive analysis can be provided. Further, according to the present invention, it is possible to provide a capillary electrophoresis method capable of introducing a large amount of a low concentration sample into the capillary and performing on-line preconcentration. Furthermore, the present invention can provide a capillary electrophoresis method for automatically determining the concentration limit of a sample to be injected and automatically performing electrophoresis separation and analysis.
[0200]
Further, according to the present invention, the following effects can be provided.
(1) Sample injection using EKI can introduce a sample several tens of times that of the conventional method. That is, the detection sensitivity can be increased several tens of times. It should be noted that the amount of sample injection can be further increased and can be increased to about 1000 times.
(2) Sorting at the capillary zone outlet is possible
(3) If electrophoresis separation is applied only for the purpose of fractionation, the amount of sample injection by EKI can be further increased.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a capillary zone electrophoresis apparatus.
FIG. 2 is a flowchart of sample analysis.
FIG. 3 is a flowchart of sample filling.
FIG. 4 is a flowchart of separation window data measurement.
FIG. 5 is a schematic diagram of stacking.
FIG. 6 is an electropherogram (1) in CZE separation of lanthanide ions using the stacking effect.
FIG. 7 shows an electropherogram (2) in CZE separation of lanthanide ions using the stacking effect.
FIG. 8 is a schematic diagram of concentration before transient isotachophoresis.
FIG. 9 is a pherogram showing the effect of transient isotachophoresis pre-concentration.
FIG. 10 is a schematic diagram showing the effect when the order of electrolyte filling is changed.
FIG. 11 is a ferrogram showing the effect of changing the electrolyte filling sequence.
FIG. 12 is a ferrogram showing transient isotachophoresis when a substance corresponding to the leading electrolyte is mixed into the sample composition.
FIG. 13 is an electropherogram for changes in yttrium (Y) concentration (2 ppb to 2 ppm).
FIG. 14 is an electropherogram for yttrium (Y) concentration change (2 ppm to 2000 ppm).
FIG. 15 shows the relationship between yttrium concentration (Y) and peak area.
FIG. 16 shows the relationship between yttrium concentration and peak area.
FIG. 17 shows the relationship between the ratio (A) of the peak area by EKI to the peak area by the drop method and the concentration.
FIG. 18 is a ferrogram when EKI is applied to a rare earth sample (result of application to a 200 ppb sample).
FIG. 19 is a pherogram showing the effect of sample pH on the amount of target sample introduced during EKI.
FIG. 20 is a pherogram showing the effect of sample pH and EKI time.
FIG. 21 shows the separation behavior of a sample peak with respect to EKI time.
FIG. 22 is an electropherogram detected by introducing a sample by the method of the present invention.
FIG. 23 is a ferrogram in which a window portion is enlarged.
FIG. 24 is an output pherogram obtained by converting the migration time into effective mobility.
FIG. 25 shows experimental conditions in stacking.
FIG. 26: Experimental conditions applying transient isotachophoresis preconcentration.
FIG. 27 shows experimental conditions when the electrolytic solution filling sequence is changed.
FIG. 28 shows experimental conditions in transient isotachophoresis based on sample composition.
FIG. 29 shows experimental conditions for examining changes in sample introduction amount with respect to sample concentration.
FIG. 30 shows experimental conditions for application of EKI to dilute rare earth samples.
FIG. 31 shows experimental conditions for the influence of sample pH on the amount of sample introduced.
FIG. 32 shows experimental conditions of sample peak separation behavior with respect to EKI time.
FIG. 33 shows experimental conditions for sample analysis by capillary electrophoresis.
FIG. 34 shows the relationship between pH and effective mobility in acetic acid.
FIG. 35 shows the relationship between effective mobility and pH in β-alanine.
FIG. 36 is a diagram showing a model of ion electrophoresis and current.
FIG. 37 is a principle diagram of capillary zone electrophoresis (CZE).
FIG. 38 is a principle diagram of isokinetic electrophoresis separation.
[Explanation of symbols]
201 Power supply unit
202, 202 'reservoir
203 vials
204 Capillary
205 Suction pump
206, 206 'turntable
207, 207 'drive unit
210 Absorbance detector
215 detector
220 controller
221 Preamplifier
222 A / D Converter
230 Data processing unit
231 Calculation unit
232 interface
233 storage unit
234 display
235 output section

Claims (15)

Setting a sample injection time for injecting the sample into the capillary by electrical sample injection;
Filling the capillary with the leading electrolyte, filling the sample by electrical sample injection according to the set sample injection time, and filling the terminal electrolyte in a predetermined order;
Applying an electrophoresis voltage so that electrophoresis is performed by separating the leading electrolyte, the sample, and the terminal electrolyte in this order;
Measuring the absorbance and migration time of each electrolyzed electrolyte and sample;
A step of increasing the absorbance sensitivity by determining that the absorbance measured at a predetermined absorbance sensitivity has increased by a predetermined threshold value or more and starting acquisition of separation window data indicating the absorbance of the sample separation window When,
Ending the acquisition of separation window data by determining that the absorbance has decreased by more than a predetermined threshold; and
Storing the acquired separation window data in association with the migration time;
Based on the separation window data and the running time, the sample injection time and / or sample concentration and / or pH of the packed sample was measured under conditions where the measurement sensitivity is saturated, or the sample injection time and / or sample concentration And / or determining whether the measurement was performed under a plurality of predetermined conditions for pH;
A capillary electrophoresis method comprising: a step of repeating the acquisition of separation window data and the corresponding electrophoresis time again by changing measurement conditions according to the determination result. The capillary electrophoresis method according to claim 1, further comprising a step of calculating an effective mobility based on the acquired electrophoresis time. Measure the separation window data and migration time multiple times under a plurality of predetermined measurement conditions, and determine the absolute value, peak width or peak area of the absorbance peak based on one or more of the concentration, pH and sample injection time. The capillary electrophoresis method according to claim 1, further comprising a step of obtaining an optimum measurement condition, a separation window data, and an electrophoretic time that are within a value range or a maximum. The step of determining includes
Calculating the absolute value of the absorbance peak of the predetermined component, the peak width or the absorbance peak area based on the obtained separation window data and electrophoresis time;
Accumulating the absolute value, peak width or absorbance peak area of the calculated absorbance peak corresponding to the sample injection time or sample concentration or sample pH;
Based on the absolute value, peak width or absorbance peak area of the absorbance peak calculated and accumulated in the previous measurement, the absolute value of the absorbance peak, peak width, or relative to the sample injection time or sample concentration or sample pH Determining a change in absorbance peak area;
The capillary electrophoresis method according to claim 1, further comprising a step of determining whether the sample injection limit is reached based on the determination result of the change. The step for repeating is as follows:
Change the measurement conditions by setting the sample injection time larger by a predetermined time,
The capillary electrophoresis method according to claim 1, wherein the separation window data and the electrophoresis time are obtained again using the sample injection time. The step for repeating is as follows:
Change the measurement conditions by specifying a sample with a different concentration or pH as the sample to be filled,
The capillary electrophoresis method according to claim 1, wherein the separation window data and the electrophoresis time are obtained again using the designated sample. The step for repeating is as follows:
Change the measurement conditions by mixing the substance that adjusts the pH or the substance that suppresses the osmotic flow rate into the sample or the electrolyte.
The capillary electrophoresis method according to any one of claims 1 to 4, wherein separation window data and electrophoresis time are obtained again using the mixed sample or electrolyte. Sampling the data for each predetermined migration time interval from the obtained separation window data;
Obtaining an approximate polynomial for the baseline of the separation window data based on the data;
8. The method according to claim 1, further comprising a step of correcting the separation window data by obtaining a difference between the absorbance of the baseline based on the obtained polynomial of the baseline and the absorbance of the obtained separation window data. Capillary electrophoresis method. The filling step includes
The capillary according to any one of claims 1 to 8, wherein the capillary is executed so that the leading electrolyte, the sample, and the terminal electrolyte are filled in that order, or the sample, the leading electrolyte, and the terminal electrolyte are filled in that order. Electrophoresis method. The filling step includes
The capillary electrophoresis method according to any one of claims 1 to 9, wherein in the filling of the leading electrolyte and the terminal electrolyte, a mixture of the leading electrolyte and the terminal electrolyte is filled behind the sample. Setting a sample injection time for injecting the sample into the capillary by electrical sample injection;
Filling the capillary with the leading electrolyte, filling the sample by electrical sample injection according to the set sample injection time, and filling the terminal electrolyte in a predetermined order;
Applying an electrophoresis voltage so that electrophoresis is performed by separating the leading electrolyte, the sample, and the terminal electrolyte in this order;
Increase the absorbance sensitivity by measuring the absorbance and migration time of each electrolyzed electrolyte and sample, and determining that the absorbance measured at a given absorbance sensitivity has increased by more than a predetermined threshold. Starting the acquisition of separation window data indicating the absorbance of the separation window of the sample;
Ending the acquisition of separation window data by determining that the absorbance has decreased by more than a predetermined threshold; and
Storing the acquired separation window data in association with the migration time;
Based on the separation window data and the running time, the sample injection time and / or sample concentration and / or pH of the packed sample was measured under conditions where the measurement sensitivity is saturated, or the sample injection time and / or sample concentration And / or determining whether the measurement was performed under a plurality of predetermined conditions for pH;
A capillary electrophoresis program for causing a computer to execute a step for repeating the acquisition of separation window data and the corresponding electrophoresis time again by changing measurement conditions according to the determination result. Setting a sample injection time for injecting the sample into the capillary by electrical sample injection;
Filling the capillary with the leading electrolyte, filling the sample by electrical sample injection according to the set sample injection time, and filling the terminal electrolyte in a predetermined order;
Applying an electrophoresis voltage so that electrophoresis is performed by separating the leading electrolyte, the sample, and the terminal electrolyte in this order;
Increase the absorbance sensitivity by measuring the absorbance and migration time of each electrolyzed electrolyte and sample, and determining that the absorbance measured at a given absorbance sensitivity has increased by more than a predetermined threshold. Starting the acquisition of separation window data indicating the absorbance of the separation window of the sample;
Ending the acquisition of separation window data by determining that the absorbance has decreased by more than a predetermined threshold; and
Storing the acquired separation window data in association with the migration time;
Based on the separation window data and the running time, the sample injection time and / or sample concentration and / or pH of the packed sample was measured under conditions where the measurement sensitivity is saturated, or the sample injection time and / or sample concentration And / or determining whether the measurement was performed under a plurality of predetermined conditions for pH;
A computer-readable record that records a capillary electrophoresis program for changing the measurement conditions according to the determination result and causing the computer to execute the separation window data and the step for repeatedly acquiring the corresponding migration time. Medium. A vial containing a sample having a test substance;
A plurality of reservoirs each containing a leading electrolyte and a terminal electrolyte, or a mixture thereof;
A capillary for performing electrophoresis;
A power supply unit for electrical sample injection and electrophoresis;
A detector for detecting the absorbance and migration time of substances contained in each electrolyte and sample;
A control unit for controlling the vial, the reservoir, the capillary and the power supply unit;
A calculation unit for obtaining the effective mobility of the test substance from the migration time by capillary electrophoresis;
The controller is
Means for setting a sample injection time for injecting the sample into the capillary by electric sample injection;
Means for filling the capillary with the leading electrolyte, filling the sample by electrical sample injection according to the set sample injection time, and filling the terminal electrolyte in a predetermined order;
Means for applying an electrophoresis voltage so that electrophoresis is performed by separating the leading electrolyte, the sample, and the terminal electrolyte in that order;
Means for measuring the absorbance and migration time of each electrolyzed electrolyte and sample;
Means for starting the acquisition of separation window data indicating the absorbance of the sample separation window by increasing the absorbance sensitivity by determining that the absorbance measured at a predetermined absorbance sensitivity has increased by a predetermined threshold value or more. When,
Means for terminating the acquisition of the separation window data by determining that the absorbance has decreased by a predetermined threshold value or more;
Based on the separation window data and the running time, the sample injection time and / or sample concentration and / or pH of the packed sample was measured under conditions where the measurement sensitivity is saturated, or the sample injection time and / or sample concentration And / or means for determining whether the measurement was performed under a plurality of predetermined conditions for pH;
Means for changing the measurement conditions according to the determination result, and repeatedly acquiring the separation window data and the corresponding migration time;
The computing unit is
Means for storing the obtained separation window data in correspondence with the migration time;
Capillary electrophoresis apparatus. The capillary electrophoresis apparatus according to claim 13, wherein the calculation unit further includes means for calculating an effective mobility based on the acquired migration time. The controller is configured to measure the separation window data and the migration time multiple times under a plurality of predetermined measurement conditions;
The computing unit is based on one or more of the concentration, pH, and sample injection time, and the optimum measurement conditions for the absolute value, peak width, or peak area of the absorbance peak within a predetermined value range or maximum, separation window data, and electrophoresis The capillary electrophoresis apparatus according to claim 13 or 14, further comprising means for obtaining time.

Images