JP4075682B2

JP4075682B2 - Method for measuring alkaline phosphatase 6 and kit used therefor

Info

Publication number: JP4075682B2
Application number: JP2003131941A
Authority: JP
Inventors: 建也大橋; 豊二佐藤; 俊英三浦; 孝和池田; 文夫野村; 毅朝長; 雅彦須永; 勝博片山
Original assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Current assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Priority date: 2003-05-09
Filing date: 2003-05-09
Publication date: 2008-04-16
Anticipated expiration: 2023-05-09
Also published as: JP2004333385A

Description

【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、アルカリ性ホスファターゼ 6（以下、ALP 6 と記載することもある）の測定方法およびそれに用いるキットに関する。更に詳細には、測定対象検体中にアルカリ性ホスファターゼ 6 を含む場合、これまでのように電気泳動による煩雑な操作や視覚的判断を必要とせず、正確な定量値として ALP 6 の値を知ることができる方法およびそれに用いるキットであり、肝疾患の状態把握、慢性関節リウマチ、悪性腫瘍、潰瘍性大腸炎などの臨床検査医学の分野において極めて有効となる。
【０００２】
【従来の技術】
アルカリ性ホスファターゼ（Alkaline Phosphatase:ALP)(EC.3.1.3.1）はリン酸モノエステルを加水分解する酵素のうちでアルカリ側に至適 pH をもち、活性中心に亜鉛イオンを有する酵素の総称である。また生体中での機能は物質やエネルギー輸送、無機リン酸の供給、骨の石灰化に関与するものと考えられている。血清中においては主に肝型、骨型、小腸型、胎盤型や腫瘍型（Nagao 型、Reagan型、Kasahara 型、胎児小腸型など）など臓器特異性を示すアイソザイムが存在し、これまでも肝胆道系疾患、骨疾患、腫瘍などの診断に広く用いられてきた。
しかし、血清中総 ALP 活性が広く用いられて有効である一方で、測定結果単独では疾患の特定に結びつきづらい。それには先の血清中アイソザイムの問題がある。ALP の電気泳動をおこなうと 6、7 本のバンドが分離されるが、抗血清を用いて蛋白質としての抗原性から ALP を考察すると、臓器特異型（Tissue Specific ALP:TSALP) と臓器非特異型 (Tissue-Non Specific ALP:TNSALP) の 2 種類に大きく分類される。臓器特異型 (Tissue Specific ALP:TSALP) と呼ばれている胎盤型 (ALP 4)、小腸型 (ALP 5)、生殖細胞型の 3 種については、2q34-37に存在する遺伝子によって産生されていることがわかっている。次に臓器非特異型 (Tissue-Non Specific ALP:TNSALP) は肝、骨、腎、白血球に見られるタイプで同一のアミノ酸配列を有し、遺伝子 1p34-36.1 から発現することが知られている。その中でも肝型と骨型では同一遺伝子から転写調節の違いで二種類の mRNA が作られるが、酵素の成熟にしたがってまた全く同一の配列を持つようになることが知られている（非特許文献１）。しかし、酵素に結合する糖鎖の違いからN 型糖鎖を 3 本持つ肝型（ALP 2）と N 型糖鎖 2 本と O 型糖鎖 1 本をもつ骨型（ALP 3）が電気泳動上で分けられると考えられる。さらに膜成分、GPI アンカーとの結合から ALP 1、そして免疫グロブリンの結合から ALP 6 が分離確認される。そしてこの全てのアイソザイム活性の総和が血清中 ALP 値として反映されるため、ALP 高値が疾患と一対一対応しにくい現状である。
【０００３】
これらアイソザイムの総和としての ALP 測定では、使用される試薬の基質や緩衝液の種類、pH などにおいて活性が異なるため、近年標準化が盛んに行われるようになり、現在では国際臨床化学連合（IFCC）や日本臨床化学会（JSCC）から勧告法が提示されて総 ALP 測定値の標準化が進んでいる。しかしながら依然としてアイソザイム自体の標準検出法は未だに無い状況にある（非特許文献２）。
アイソザイムの測定法としては、これまでに L-フェニルアラニンによる肝型、骨型（ALP 2、3）の測定、L-ホモアルギニンによる胎盤型、小腸型（ALP 4、5）の測定など阻害アミノ酸を利用してアイソザイムを測定する方法や（非特許文献３)、加熱によって胎盤型 (ALP 4) 活性だけを残し、ALP 4 を特異的に測定する方法 (非特許文献４、非特許文献５)、先に述べた肝型、骨型 ALP 糖鎖の差を利用してレクチンを利用し、肝型 (ALP 2) や骨型 (ALP 3)を測定する方法 (非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９)、骨型 ALP (ALP 3) に対する特異的モノクローナル抗体を使用する方法（非特許文献１０）などが開発されていくつかのアイソザイムは測定が可能となっている。しかし、イムノグロブリン結合型である ALP 6 は臨床的にも意義が唱えられながら依然その絶対値を知る方法がないために電気泳動法から存在の有無を知ることで臨床診断に使用されている状況にある。
【０００４】
はじめ、ALP 6 は ALP 結合型イムノグロブリン (非特許文献１１)として Nagamine らによって、厚生労働省指定難治性疾患である潰瘍性大腸炎において発見された (非特許文献１２)。その後加野らがこの ALP 6 が病態を反映して増減することを報告し（非特許文献１３)、さらに 1981 年に菅野らが全国アンケートを行って病態解析をまとめた（非特許文献１４)。その結果、多くの症例が自己抗体であることがわかった。イムノグロブリンの結合するアイソザイム種については Crofton らが ALP 6 のイムノグロブリン結合 ALP はそのほとんどが TNSALP であると報告している (非特許文献１５)。イムノグロブリンについても最近 Owen らはマクロ ALP に IgG のκ鎖が結合しているという報告をしている (非特許文献１６)。今日では一般に健常人では上記高分子複合体である ALP 6 発現は低頻度であるが、他方総 ALP 活性が 1,000 単位以上にもなるような高活性の ALP を含む血清には高頻度に ALP 6 が検出されるようになること、また慢性関節リウマチや腫瘍などでも ALP 6 が高値となることがあることが知られている。このような状況において臨床的意義をより確立するために ALP 6 の精密測定が行われることが強く望まれていた。
【０００５】
【非特許文献１】
Biochem Biophys Res Com 168,993-1000:1990
【非特許文献２】
臨床検査 37(9), 1041-1044:1993
【非特許文献３】
Histochem J. 13,941-951:1981
【非特許文献４】
Prenat Diagn. 16,1051-1054:1996
【非特許文献５】
Enzyme Protein. 49,313-203:1996
【非特許文献６】
J Clin Pathol. 1992 45,68-71:1992
【非特許文献７】
Clin Chem. 40,1749-1756:1994
【非特許文献８】
Clin Chem. 42,1970-1974:1996
【非特許文献９】
Calcif Tissue Int. 71:508-518:2002
【非特許文献１０】
Clin Chem 44,2139-2147:1998
【非特許文献１１】
Clin Chim Acta 65,39-46:1975
【非特許文献１２】
日消誌 73,162-168:1976
【非特許文献１３】
生物物理化学20,325:1977
【非特許文献１４】
酵素結合性免疫グロブリンの我が国での発症頻度ならびに分布に関す
る研究報告:1981
【非特許文献１５】
Clin Chim Acta 112,33-42:1981
【非特許文献１６】
Ann Clin Biochem 39,523-5:2002
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明で測定対象とする ALP 6 はその精密測定が臨床的に有意な意義を持つと言われながら長く不可能であった。それにはどの ALP アイソザイムに自己免疫的イムノグロブリンが結合しやすいのか、またどのクラスのイムノグロブリンが ALP 6 として結合しているのかが不明であったことが原因であった。本発明はかかる問題に鑑み、例えば、まず ALP と反応する一次抗体とその ALP に自己免疫的に結合していたイムノグロブリンと反応する二次抗体を組み合わせて使用することで反応系中の他の ALP の影響を除き、ALP 6 を特異的に精密測定する測定系の提供を目的とする。この方法で開発した ALP 6 測定を臨床診断薬として利用可能であり、また自己抗体のメカニズムなど基礎医学の発展にも貢献し利用できるものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、検体中のアルカリ性ホスファターゼ 6 の測定方法であって、検体中のアルカリ性ホスファターゼ 6 と、アルカリ性ホスファターゼ 6 の構成成分であるアルカリ性ホスファターゼ部位を認識するアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質と、アルカリ性ホスファターゼ 6 の構成成分である免疫グロブリン部位を認識する免疫グロブリン部位認識物質とを反応させ、得られるアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質とアルカリ性ホスファターゼ 6 と免疫グロブリン部位認識物質との結合物のレベルからアルカリ性ホスファターゼ 6 を測定することを特徴とする、アルカリ性ホスファターゼ 6 の測定方法である。
より具体的には、本発明は、検体中のアルカリ性ホスファターゼ 6 の測定方法であって、検体中のアルカリ性ホスファターゼ 6 とヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼに反応する抗体とを抗原抗体反応させ、次いで、得られる抗原抗体反応物と、アルカリ性ホスファターゼ 6 の構成成分である免疫グロブリン部位を認識する免疫グロブリン部位認識物質とを反応させ、得られるヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼに反応する抗体とアルカリ性ホスファターゼ 6 と免疫グロブリン部位認識物質との結合物のレベルからアルカリ性ホスファターゼ 6 を測定することを特徴とする、アルカリ性ホスファターゼ 6 の測定方法である。
【０００８】
更に本発明は、検体中のアルカリ性ホスファターゼ 6 の測定方法であって、 i）検体中のヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼをヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼに反応する抗体と抗原抗体反応させ、次いで、抗原抗体反応したヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼを、アルカリ性ホスファターゼ用酵素基質と反応させ、反応した酵素活性のレベルから、検体中のヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼ活性を求め、
ii）上記 i）とは独立に、上記の測定方法により検体中のアルカリ性ホスファターゼ 6 のレベルを求め、
iii）上記 i）で得られるヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼ活性値と上記 ii）で得られるアルカリ性ホスファターゼ 6 のレベル値との乗法値を求め、その乗法値から検体中のアルカリ性ホスファターゼ 6 の量を求める、
ことを特徴とする、アルカリ性ホスファターゼ 6 の測定方法である。
更に本発明は、検体中のアルカリ性ホスファターゼ 6 を測定するためのキットであって、
i）固相支持体、
ii）アルカリ性ホスファターゼ 6 の構成成分であるアルカリ性ホスファターゼ部位を認識するアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質、
iii）アルカリ性ホスファターゼ 6 の構成成分である免疫グロブリン部位を認識する、標識された免疫グロブリン部位認識物質、および
iv）標識を検出するための成分、
を含むキットである。
【０００９】
本発明の測定方法により、これまで使用されてきた電気泳動法よりも更に精密に ALP 6 を測定することができる。例えば、ヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼ（TNSALP）以外のアイソザイムと殆ど反応しない第一のモノクローナル抗体として、抗 TNSALP モノクローナル抗体を用い、第二のモノクローナル抗体として、ALP 6 の構成成分である免疫グロブリン部位と反応する標識抗ヒト IgG1 モノクローナル抗体を利用することにより、またはこれら２種の抗体を組み合わせて利用することで、免疫グロブリン非結合血中アイソザイム（肝型、骨型、小腸型、胎盤型、他腫瘍型）の影響を殆ど受けず、ALP 6 のみを特異的に測定することができる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明において、検体とは、ALP 6 を含む可能性のある液体または混合物であれば特に限定しないが、通常、血液、血清、血漿、尿等の生体内試料が好適である。
本発明の ALP 6 の測定方法においては、ALP 6 の構成成分であるアルカリ性ホスファターゼ部位を認識するアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質と、ALP 6 の構成成分である免疫グロブリン部位を認識する免疫グロブリン部位認識物質とを反応させ、得られるアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質と ALP 6 と免疫グロブリン部位認識物質との結合物のレベルから ALP 6 を測定する。
【００１１】
本発明において、アルカリ性ホスファターゼ部位認識物質とは、ALP 6 中のアルカリ性ホスファターゼ部位と結合可能な物質をいう。具体的には、肝臓由来 ALP 、骨由来 ALP 等のヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼ（TNSALP）に結合可能な物質を例示できる。ヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼ（TNSALP）は、通常、遺伝子 1P34-36.1 から発現する蛋白質を指すが、一般的には、肝型 ALP（ALP 2）、骨型 ALP（ALP 3）、腎臓型 ALP、白血球型 ALP を例示できる。TNSALP に結合可能な物質としては、TNSALP に対する抗体が好ましく挙げられる。抗体としては、抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。
ALP 6 を正確に測定するためには、TNSALP に特異的なモノクローナル抗体であることが好ましい。具体的には、後述する参考例１に示すように、同じ酵素活性量の小腸型、胎盤型、肝臓型および骨型 ALP と反応させた時に、小腸型 ALP と反応する ALP 酵素活性値と胎盤型 ALP と反応する ALP 酵素活性値との和が、肝臓型 ALP と反応する ALP 酵素活性値と骨型 ALP と反応する ALP 酵素活性値との和の 1/10 以下である抗ヒト TNSALP モノクローナル抗体が好ましい。特に、骨型 ALP と反応する ALP 酵素活性値が、肝臓型 ALP と反応する ALP 酵素活性値の 0.7 以下である抗ヒト TNSALP モノクローナル抗体が更に好ましい。本発明に使用可能な抗ヒト TNSALP 抗体としては、本発明者が確立し製造法を後述する製造例１で示すモノクローナル抗体 3-29-3R、2C5-32 および 1A5-7 を例示でき、モノクローナル抗体 3-29-3R および 2C5-32 が好ましい。また、HLMS―1、HLMS―2、HLMS―3、HLMS―4（以上、特開平２−３５０９８号公報）等のモノクローナル抗体も好ましく、それらと類似している既知の抗 TNSALP モノクローナル抗体も使用可能である。
【００１２】
本発明において、免疫グロブリン部位認識物質とは、ALP ６中の免疫グロブリン部位と結合可能な物質をいう。好ましくは IgG1 に結合可能な物質、具体的には、 IgG1 に対する抗体である。抗体としては、抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよいが、特に抗ヒト IgG1 モノクローナル抗体が好ましい。また、IgG1 に結合可能な物質として、プロテイン G、プロテイン A も例示できる。この場合、上記したアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質として抗体を用いるとき、あらかじめ、その抗体中の CH2CH3 部位をブロックしておき、プロテイン G 等がその抗体には結合しないようにしておくことはもちろん必要である。
【００１３】
以上に記載した、例えば TNSALP あるいは IgG1 に対する抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体は、それ自体周知の方法により調製することができる。IgG1 に対する抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体は、市販品を利用することもできる。以下に、TNSALP に対するモノクローナル抗体を例にとってその調製について詳細に説明する。
本発明に使用可能な抗 TNSALP モノクローナル抗体は、例えば、ヒト血液由来精製 ALP 6 を免疫原として使用することにより得ることができる。また、ALP 6は、その構造から ALP 部位と免疫グロブリン部位にわけられることから、ALP と免疫グロブリンそれぞれを抗原として用いることもできる。ALP 抗原として培養骨芽細胞株による抗原により免疫を行なうことができるが、これに限らず、正常骨芽細胞などの ALP も抗原として用いることができる。遺伝子工学的に作製された完全長の組換え体、変異体、部分抗原を用いることも常套手段であり、これは抗免疫グロブリン抗体作製についても全く同様であって利用されうるものである。
モノクローナル抗体は精製ヒト ALP 6 単独に、または、ALP と免疫グロブリンとを別に、免疫原として動物を免疫し、その抗ヒト ALP 6 抗体産生細胞、または抗 ALP 抗体産生細胞もしくは抗免疫グロブリン抗体産生細胞と、骨髄腫瘍細胞とを融合させることによって得られるハイブリドーマによって産生される。
【００１４】
ハイブリドーマは以下の方法によって得ることができる。即ち上述したような例えば ALP をフロイントの完全、不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、百日咳アジュバント等既に公知のものを用いてともに混和し、感作用アジュバント液を作製して数回に分けてマウス、ラット等の動物に 1〜3 週間おきに腹腔内皮下、または尾静脈投与することによって免疫する。感作抗原量は 1μg〜100 mg の間とされているが、一般的には 50μg 程度が好ましい。免疫回数は 2〜7 回が一般的であるがさまざまな方法が知られている。次いで脾臓等に由来する抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞（ミエローマ細胞）等の試験管内で増殖能力を有する細胞を融合する。抗体産生細胞はマウス、ヌードマウス、ラットより得ることができる。
【００１５】
融合法としては既にそれ自体公知であるケーラーとミルスタインの定法（Nature.256,495.1975）によってポリエチレングリコール（PEG）を用いることで融合できる。またセンダイウィルス、電気融合法によっても融合を行うことができる。融合した細胞からヒト ALP を認識する抗体を産生するハイブリドーマを選択する方法としては以下のようにして行うことができる。即ち、上記融合した細胞から限界希釈法によって HAT 培地及び HT 培地で生存している細胞により作られるコロニーからハイブリドーマを選択する。96 穴ウェルなどにまかれた融合細胞からできたコロニー培養上清中にヒト ALP に対する抗体が含まれている場合には、ヒト ALP をプレート上に固定化したアッセイプレート上に上清をのせ、反応後に抗マウス免疫グロブリン-HRP 標識抗体等、二次標識抗体を反応させる ELISA 法により、ヒト ALP に対するモノクローナル抗体産生クローンを選択できる。標識抗体の標識物質には HRP の他、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、蛍光物質、放射性物質等を用いることができる。またコントロールとしてブロッキング剤である BSA のみを結合したアッセイプレートによる ELISA を同時に行うことでヒト ALP 特異的抗体のスクリーニングができる。つまりヒト ALP プレートで陽性であり、BSA による ELISA で陰性のクローンを選択する。また、同時に抗マウス免疫グロブリン抗体をマイクロタイタープレートにまき、ここに融合細胞培養上清を加えて反応させ、更に精製 ALP を加えて活性酵素を結合させて免疫複合体を作製し、この結合酵素活性をフェニルリン酸のような発色基質を利用して測定することもできる。
【００１６】
本発明で使用可能な抗体を産生するハイブリドーマとしては、ヒト ALP を特異的に認識するモノクローナル抗体のうち、特に活性型ヒト TNSALP と反応し、かつヒト胎盤型 ALP、ヒト小腸型 ALP と殆ど交差反応しないモノクローナル抗体が産生するものが好ましい。例えば本発明者が樹立したハイブリドーマ 3-29-3R および 2C5-32 が挙げられる。ハイブリドーマ 3-29-3R および 2C5-32 は、平成15年4月16日に工業技術院生命工学工業技術研究所にそれぞれ、受託番号 FERM BP-8360 および FERM BP-8359 として寄託されている。
【００１７】
ハイブリドーマは、通常細胞培養に用いられる培地、例えばα-MEM、RPMI1640、ASF、S-clone などで培養し、その培養上清よりモノクローナル抗体を回収することができる。またハイブリドーマが由来する動物、ヌードマウスをあらかじめプリスタン処理しておき、その動物に細胞を腹腔内注射することによって腹水を貯留させ、その腹水からモノクローナル抗体を回収することもできる。上清、腹水よりモノクローナル抗体を回収する方法としては、常法を用いることができる。例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法やクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡなどによるアフィニティークロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００１８】
以上に説明したような抗 TNSALP モノクローナル抗体等のアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質と、抗 IgG1 モノクローナル抗体等の免疫グロブリン部位認識物質とを、検体中の ALP 6 と反応させ、得られるアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質と ALP 6 と免疫グロブリン部位認識物質との結合物のレベルを求めることにより、検体中の ALP 6 を測定することができる。より具体的には、、例えば ELISA 法により、検体中の ALP 6 と抗ヒト TNSALP モノクローナル抗体とを抗原抗体反応させ、次いで、得られる抗原抗体反応物と抗 IgG1 モノクローナル抗体とを反応させ、得られる抗ヒト TNSALP モノクローナル抗体と ALP 6と抗 IgG1 モノクローナル抗体との結合物のレベルから検体中の ALP 6 を測定することができる。
ELISA 法により、抗原抗体反応した結合物のレベルを求めるためには、抗 IgG1 モノクローナル抗体などの免疫グロブリン部位認識物質としては、標識された免疫グロブリン部位認識物質を用いることが好ましい。標識法としては、通常、免疫測定法で標識に使用できるものであれば、とくに限定しないが、ペルオキシダーゼ等の酵素、放射線同位元素、蛍光物質、磁性物質、コロイドなどでもよい。
【００１９】
本発明の測定方法として、サンドイッチアッセイ ELISA 法により実施する具体例は、以下の通りである。まず一次抗体として、アルカリ性ホスファターゼ部位認識物質である抗 TNSALP モノクローナル抗体を、固相支持体、例えば、プレートに吸着させ、血清などの検体中の ALP 6 のアルカリ性ホスファターゼ部位と反応させ、固相支持体を洗浄する。次いで、吸着した ALP 6 の免疫グロブリン部位と、二次抗体として、免疫グロブリン部位認識物質である、例えばビオチン化した抗 IgG1 モノクローナル抗体とを反応させ、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンと反応させた後、ペルオキシダーゼ酵素反応、次いで、発色反応を行うことにより、ALP 6 を検出することができる。また、二次抗体として、直接、HRP 等のペルオキシダーゼにより酵素標識した抗 IgG1 モノクローナル抗体を用いることにより、ALPと二次抗体と反応させた後、標識酵素に対する基質、例えば、OPD（ｏ-フエニレンジアミン）、DAB（ジアミノベンジジン）、TMB（テトラメチルベンジジン）等と更に反応させて発色させることにより、ALP 6 を検出することもできる。また、二次標識抗体に結合させる標識物質は測定方法によって酵素に限られるものではなく、放射線同位元素、蛍光物質、磁性物質、コロイドなどでもよい。
【００２０】
本発明の測定方法では、上記した測定方法により検体中の ALP 6 のレベルを求め、他方それとは独立に、検体中のヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼ（TNSALP）活性を求め、検体中の ALP 6 のレベル値と検体中のヒト TNSALP 活性値との乗法値を求め、その乗法値から検体中の ALP 6 の量を求めることもできる。この乗法値を利用する方法の場合には、上記した測定方法により検体中の ALP 6 のレベルを求める際に実施する、検体中の ALP 6 と一次抗体であるヒト TNSALP に対する抗体との抗原抗体反応において、検体中に存在する ALP 6 以外の他の ALP との競争反応の影響を考慮することができ、従って上記の乗法値は、検体中の ALP 6 の実際の存在量をより反映した値となる。
この乗法値を利用する測定方法において、検体中のヒト TNSALP 活性を求めるには、検体中のヒト TNSALP をヒト TNSALP に反応する抗体と抗原抗体反応させ、次いで、抗原抗体反応したヒト TNSALP を、アルカリ性ホスファターゼ用酵素基質と反応させ、反応した酵素活性のレベルから、検体中のヒト TNSALP 活性を求めることにより実施できる。アルカリ性ホスファターゼ用酵素基質としては、通常用いられる基質を用いることができる。例えば、フェニルリン酸などの発色基質を、抗原抗体反応したヒト TNSALP と酵素反応させて発色させ、吸光度を測定すことにより、検体中のヒト TNSALP を求めることができる。
【００２１】
本発明において、上記したように、例えば ELISA 法により検体中の ALP 6 の測定を行うときは、ELISA 用のキットを用いて実施することができる。ELISA 法で本発明の測定方法を実施するときは、例えば、ALP 6 を測定するためのキットであって、i) 固相支持体、ii) TNSALP に対するモノクローナル抗体等のアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質、iii) 抗 IgG1 モノクローナル抗体等の標識された免疫グロブリン部位認識物質及び iv)標識を検出するための成分を含むキットを用いることによって、効率良く ALP 6 を測定することができる。
標識を検出するための成分とは、抗体が標識されたものを測定するための成分で、標識がビオチンの場合、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン、テトラメチルベンジジンのペルオキシダーゼ酵素基質、及び過酸化水素水を含む試薬であり、標識がペルオキシダーゼの場合、OPD （ｏ−フエニレンジアミン）、DAB（ジアミノベンジジン）、TMB（テトラメチルベンジジン）等のペルオキシダーゼ基質を含む試薬である。このキットには、必要に応じ、洗浄剤液含んでもよい。本発明において、このキットを使用するときは、検体中の ALP 6 を一次抗体に結合させた後、固相支持体に吸着しなかった成分を除去するために、洗浄液を含むことが好ましい。洗浄液としては、例えば、界面活性剤を含むトリス緩衝液を使用することができる。さらに、本発明のキットには、必要に応じ、検体希釈液を加えて含むこともできる。検体希釈液としては、例えば、トリス等緩衝液を使用できる。その緩衝液には、必要に応じて、EDTA・2Na 等のキレート剤、食塩等の無機塩を加えてもよい。
【００２２】
【実施例】
以下、本発明を製造例、参考例および実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらの例に何ら限定されるものではない。
製造例１
抗ヒト TNSALP モノクローナル抗体の製造
（１）モノクローナル抗体作製用抗原の選択と準備
本発明者達は抗ヒト TNSALP モノクローナル抗体作成のための抗原として、TNSALP を発現していることが知られているヒト骨芽細胞株 Saos-2 由来の ALP を精製した。以下に精製法を述べる。
Saos-2（HTB-85）は ATCC（American Type Culture Collection）より入手し、10% 牛胎児血清（FCS）を含むα-MEM（大日本製薬）にて培養した。80% 程度細胞がコンフルーエントになったら、50 mMトリス緩衝液（pH 7.5）にて 3 回デイッシュを洗浄し、0.5% アデカトール SO-135 を含む 50 mMトリス緩衝液（pH 7.5）を加えた。ラバーポリスマンを使用して上記細胞を回収し、氷上にて超音波ホモジナイザーにて 1 分間ホモジナイズした。その細胞破砕液を遠心分離（22,000 rpm 30 min RT）操作してその上清を40% 硫安分画した。遠心分離（10,000 rpm 30 min RT）を行って、その上清に硫安を追加溶解して 60% 硫安となるように調整し再分画を行った。この 40-60% 硫安分画沈殿を 50 mM トリス緩衝液（pH 7.5）に再溶解して 50 mM トリス緩衝液（pH 7.5）に対して透析した。透析済みサンプルを DEAE カラム（アマシャムバイオサイエンス社）にアプライし、吸着したタンパク質は NaCl を含む上記トリス緩衝液の直線濃度勾配（0-0.5 M NaCl）で溶出した。
ピークの ALP 活性は日立 7150 自動分析装置を使用して、N−アッセイ ALP-LS 試薬（日東紡）を用いて測定した。活性のあったフラクションは限外ろ過法によって濃縮し、S-300 カラム（アマシャムバイオサイエンス）によって精製した。この活性フラクションを先の DEAE と同様に濃縮して SDS-PAGE により確認するとほぼ TNSALP がメジャーになっており、これを免疫用抗原として使用した。
【００２３】
（２）免疫
精製 TNSALP を 1 mg/ml となるように 50 mM トリス酸緩衝液（pH 7.5）で希釈し、50μg（50μl）をとってフロインド完全アジュバンド（WAKO）50μl と乳化するまでよく混和した。調製した懸濁液を Balb/c 6週齢雌マウス（日本クレアー）にジエチルエーテル麻酔下にて腹腔内投与した。2 週間後には同量の TNSALP （50μg/ml）をフロインド不完全アジュバンド（和光純薬）と混和してフロインド完全アジュバンドの時と全く同様の操作により乳化懸濁液とし、それぞれマウスに感作した。以降 2 週間後に同様の操作を行い、4 回目には最終免疫として TNSALP 50μg/ml を 50 mM トリス酸緩衝液（pH 7.5）で調製しマウス尾静脈注射により投与した。
【００２４】
（３）ハイブリドーマの確立
最終免疫より 3 日後に TNSALP により感作済みのマウスよりジエチルエーテル麻酔下に外科的摘出された脾臓を無菌的に分散し脾臓細胞を調製した。融合はケーラーとミルスタインの方法（Nature. 256, 495. 1975）に従って行われ、ポリエチレングリコール（PEG 4000）（メルク社）を用いて脾細胞と骨髄腫細胞 P3-X63-Ag8-U1 (P3U1) を融合した。その融合比率は脾臓細胞数 10×10⁷個に対して骨髄腫細胞 P3-X63-Ag8-U1 (P3U1) 2×10⁷個で、 5:1 であった。融合細胞は 10% FCS（インビトロジェン）α-MEM（アーバイン）HAT（コスモバイオ）培地に分散し 96 穴マイクロタイターカルチャープレート（住友ベークライト）に分注して 37 ℃、5% CO₂ 条件にて培養した。
【００２５】
（４）スクリーニング
約 2 週間後にコロニーの生育を確認してスクリーニングを実施した。スクリーニングの実施法を以下に述べる。
スクリーニング用プレートを作製するために上記（１）にて精製した TNSALP を 50 mM トリス酸緩衝液中に溶解し、0.5 μg/100μl/well となるように 96 穴ウエル（ヌンク社）に分注した。プレートを 4℃ で 2 晩静置した後に 0.05% Tween 20 を含むトリス緩衝液で 3 回洗浄し、非特異的反応を抑えるために 1.5% BSA 溶液を 200μl 分注して、更に 4℃ で 1 晩静置した。完成したプレートを 0.05% Tween 20 を含むトリス緩衝液で 3 回洗浄した後に培養上清 100μlを反応させ、更に洗浄を行った後に二次抗体である HRP 標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ザイメッド社) を加えて反応させた。洗浄後に HRP の発色基質である 3 mg/ml o-フェニレンジアミン (OPD) (ナカライテスク社)クエン酸発色溶液を 100μl 加えて一定時間の発色後、1 N 硫酸を停止液として更に 100μl 添加し、測定波長 492 nm にて吸光度を測定した。上記のようにして陽性になったクローンは限界希釈法によって再クローニングされ上清を再度チェックした。
【００２６】
（５）抗体の確認
ELISA によって精製 TNSALP との反応性を確認し、発明者達はクローン 3-29-3R、2C5-32、1A5-7 の 3 種類が TNSALP を認識したものとして選択した。得られた抗体をモノクローナル抗体タイピングキット（アマシャムバイオサイエンス社）にて検定した結果を以下の表１に示す。
【００２７】
【表１】

【００２８】
（６）モノクローナル抗体の作製及び精製
上記（５）で得られたハイブリドーマ 3-29-3R、2C5-32、1A5-7 細胞 1×10⁷細胞個をプリスタン（アルドリッチ社）0.5 ml 投与後 2 週間の Balb/c マウス（日本クレアー社）、10 週齢、雌性に腹腔内投与し、約 2 週間後にマウス腹腔内に貯留した腹水をジエチルエーテル麻酔下にて外科的に採取した。スクリーニングで行った ELISA 法により、腹水をサンプルとして段階希釈して確認すると高濃度のモノクローナル抗体が含まれていた。この腹水を硫安 40% で処理し、PBS に透析した後、3-29-3R、1A5-7 はプロテイン G カラム（アマシャムバイオサイエンス社）により精製して SDS-PAGE により確認した。2C5-32 は S-300 を用いて精製した。その結果 3-29-3R、1A5-7 は非還元では分子量約 150,000 に単一の、メルカプトエタノール還元では分子量約 50,000 のバンドと 25,000 の 2 本のバンドが確認された。2C5-32 は非還元では分子量約 900,000 に単一の、メルカプトエタノール還元では分子量約 70,000 のバンドと 25,000 の２本のバンドが確認された。精製されたモノクローナル抗体 3-29-3R、1A5-7、2C5-32 ともにマウス１匹あたりそれぞれ約 10mg 以上であって工業的利用を行うには十分量であった。
【００２９】
参考例１
抗ヒト TNSALP モノクローナル抗体の特異性検定
モノクローナル抗体 3-29-3R、2C5-32、1A5-7 の特異性を調べるためにさまざまなアイソザイム（Saos-2 由来 TNSALP、肝型 ALP (常光)、骨型 ALP (常光)、小腸型 ALP (常光)、胎盤型 ALP（シグマ社）を用いて下記の実験を行った。測定方法は以下のとおりである。
固層プレート（ヌンク社）上に精製したモノクローナル抗体を 2μg/100μL PBS/well になるように分注し、4℃で 2 日間静置した。0.05% Tween 20 を含む 20mM トリス緩衝液（pH 7.0）洗浄液にて 3 回洗浄した後、1.5% BSA トリス緩衝液（pH 7.0）を 200μl 加えて 4℃で一晩ブロッキングした。このようにして作製したプレートを先の洗浄液で 1 回洗浄して、各種アイソザイムを反応させた。アイソザイムの酵素活性は Kind-King 変法（ホルマザン法，日東紡 N−テスト ALP K-K キット使用）試薬を用いて測定し、全て 25IU/L にあわせてその 100μl を抗体結合プレート上に加えた。室温で 2 時間反応させ、反応終了後、前出の洗浄液にて 3 回洗浄して Kind-King 変法（ホルマザン法）に従い酵素活性を測定した。すなわち、抗体プレートに結合した ALP に、100μl の基質溶液（フェニルリン酸二ナトリウムと 4−アミノアンチピリン溶液とを含む溶液）を加えて、37℃、1 時間反応させて、抗体が捕らえた ALP 酵素と合成基質とで酵素反応させ、ついで、得られる混合物に発色試薬（メタ過ヨウ素酸ナトリウムを含む溶液）を加えて発色させ、492nm で吸光度を測定した。このときのデータを表２に示す。なお、このとき、ALP を入れないで同様に操作して得られるブランク値を求め、各測定値からブランク値を差し引いた値が抗体に対する各 ALP の活性値となる。
【００３０】
【表２】

【００３１】
表２から分かるように、抗体 3-29-3R、2C5-32 は Saos-2 由来 TNSALP、肝型、骨型としか反応せず、他アイソザイムとの交差反応性を殆ど示さないことからヒト TNSALP に特異性の高いモノクローナル抗体であることがわかった。すなわち、抗体 3-29-3R、2C5-32 は、TNSALP に特異的、例えば、小腸型 ALP 活性値と胎盤型 ALP 活性値との和が、肝臓型 ALP 活性値と骨型 ALP 活性値との和の 1/10 以下であることが判明した。
また、1A5-7 は Saos-2 由来 TNSALP をはじめ全てのアイソザイムとよく反応した。つまり 1A5-7 はあらゆる ALP アイソザイムと反応することがわかった。
尚、2 つのモノクローナル抗体の 25 IU/L における肝型、骨型反応比率（肝：骨反応比率）はそれぞれ 3-29-3R が 1：0.50 であり、2C5-32 が 1：0.93 であった。ところで、高 ALP 検体の電気泳動結果で一般的に骨型よりも肝型が強くなった場合に ALP 6 が現れやすい。そのため、抗体 3-29-3R では、骨型 ALP 活性が肝型 ALP 活性の 0.7 以下なので、本発明に用いると、より有効である。
【００３２】
参考例２
モノクローナル抗体を用いた血清中 ALP 6 の精製、およびその構造決定
（１）アフィニティーカラム作製
ALP 6 を構成する ALP はほとんどが TNSALP と考えられることから、実際に抗 TNSALP モノクローナル抗体である 3-29-3R を利用して ALP 6 の精製を試みた。
はじめに血清中から TNSALP だけを精製するために TNSALP に対して反応することが確認されたクローン 3-29-3R を腹腔内投与したマウスの腹水から精製されたモノクローナル抗体をプレパックカラムである HiTrap NHS-activated HP（アマシャムバイオサイエンス社）に結合させ、抗ヒト TNSALP カラムを作製した。以下、簡単に実験方法を示す。
はじめに未使用カラムを開封し 5 mL の氷冷した 1 mM 塩酸溶液を流速 1 mL/min で送液した。次に 1 mL のモノクローナル抗体溶液（15 mg/mL）を送液し、ドムナットで密閉して 4℃、4 時間静置した。放置後、カップリングバッファー（0.2 M 炭酸水素ナトリウム緩衝液 0.5 M NaCl pH 8.3）を 3 mL 流して、6 mL のブロッキングバッファー（0.5 M モノエタノールアミン溶液 0.5 M NaCl pH 8.3）にてブロッキングした。6mL の洗浄液（0.1 M 酢酸ナトリウム緩衝液 0.5 M NaCl pH 4.0）にて洗浄後、再び 6 mL のブロッキングバッファー（0.5 M モノエタノールアミン溶液 0.5 M NaCl pH 8.3）を通して、室温にて 30 分間放置した。その後 6 mL の洗浄液、ブロッキング液、洗浄液と交互に流して最後に 20 mM Tris 緩衝液 pH 8.0 にてカラムを平衡化した。
【００３３】
（２）アフィニティーカラムによる血清中 TNSALP の精製
完成した 3-29-3R の HiTrap NHS-activated HP カラムを用いて血清中反応物を精製した。はじめにボランティアより得た成人血清 40 mL を 4℃、流速 0.2 mL/min で一晩、カラムに環流させた。その後 20 mM Tris 緩衝液 pH 8.0 にてカラムを洗浄し、100 mM グリシン緩衝液 pH 2.7 で溶出させた。また、全く同様にインフォームド・コンセントを行って得た 700 IU/L 以上の ALP 高値検体プール 40 mL を環流しつづけた後、同様に溶出フラクションを回収した。回収フラクションには 1/10 量の 1 M Tris 緩衝液 pH 9.0 を加えておき、回収後即座に中和した。
【００３４】
（３）アフィニティーカラム溶出分画からの Protein G カラムによる ALP 6 の精製
この 3-29-3R アフィニティーカラム溶出フラクションを健常人、ALP 高値にわけて解析した。方法は製造例１の（６）でおこなった抗体精製と同様である。簡単には、3-29-3R カラム溶出フラクションを更に 5 mL のHiTrap プロテイン G カラム（アマシャムバイオサイエンス）にかけて精製を行った。まず、3-29-3R アフィニティーカラム溶出フラクションピークを 5 mL にあわせてカラムへ充填し、4℃で一晩反応させた。その後 100 mMトリス緩衝液（pH 8.0）で洗浄し、はじめのスルー画分を予備に 5 mL 集めた後続いて比色計にて A₂₈₀がブランクと同値になるまで洗浄した。続いて 100 mM グリシン緩衝液（pH 2.0）にて溶出させ、直ちにフラクションを 1 M トリス緩衝液（pH 9.0）で中和した。すると ALP 高値検体からのフラクションのみに特に高い濃度の蛋白質の溶出が認められた。健常人検体からは殆ど溶出が認められなかった。
【００３５】
（４）電気泳動及びウエスタン・ブロッティング
この高 ALP 患者検体フラクション及び健常人検体フラクションを電気泳動法、ウエスタン・ブロッティングにより解析した。溶出フラクション蛋白質を 20μg/Lane にあわせて 10% SDS-PAGE をおこなった。ゲルは PAG ミニ「第一」4/20% グラジエントゲル（第一化学薬品）である。泳動終了後一部を切り取りクマシーブリリアントブルー染色による蛋白質染色を実施した。残りのゲルはウエットブロットによりウエスタン・ブロッティングを行った。ブロッテイングが終了したら、ブロックエース（大日本製薬）を用いて 4℃、一晩ブロッキングをした。翌日、0.05% Tween 20 を含む 50 mMトリス溶液（pH 7.5）にて膜を軽く洗浄し、室温、2 時間、抗体を反応させた。ウエスタン・ブロッティングの反応抗体は 1/500 希釈抗 IgG1-HRP（大日本製薬）と 1/300 希釈抗 3-29-3R-HRP 標識である。反応後 10 分づつ 3 回 0.05% Tween 20 を含む 50 mM トリス溶液（pH 7.5）にて膜を洗浄し、HRP 用発色試薬（和光純薬）を用いて発色した。
【００３６】
結果を図１に示した。図１の結果から ALP 高値検体のサンプル中に分子量約 220 kDa と 300 kDa 近い巨大分子が存在することがわかった。この分子はウエスタン・ブロッティングによって IgG1 とも TNSALP とも反応し、同じ位置に反応バンドが検出されることから一量体 ALP (68 kDa) と IgG1 (150 kDa) の結合した ALP 6 (218 kDa) と二量体 ALP (136 kDa) と IgG1 が結合した ALP 6 (286 kDa) と考えられた。一方、健常人フラクションは全く反応しなかった。上記実験から以下のことが言える。
１）抗 3-29-3R アフィニティークロマトグラフィーで ALP 6 が TNSALP を抗原部位としてカラムに結合し、その際溶出に使用するグリシン緩衝液（pH 2.0）によって、ALP とイムノグロブリンの結合を解除しながらフラクションサンプルとなった。
２）１）で分離した TNSALP とイムノグロブリンは中和操作によって再び in vitro において高分子化 ALP 複合体となった。これは native PAGE によるウエスタン・ブロッティングにて高分子量域に ALP、IgG どちらとも反応するバンドがあることで証明された。よって抗体 3-29-3R は IgG の結合、非結合に関係なく TNSALP を認識して結合させ、この TNSALP に自己免疫的に結合していた IgGを認識する標識二次抗体が結合する反応系によって ALP 6 が測定可能であることが示された。
【００３７】
参考例３
免疫酵素活性測定法による血清中の TNSALP 値の測定
上記方法によって作製、精製されたモノクローナル抗体 3-29-3R 、1A5-7 を参考例１と全く同様の方法で Nunc 社製プレートに 2μg/100μL PBSで分注、ブロッキングして抗体結合プレートを作製した。使用前にそのプレートを、0.05% Tween 20 を含む 100 mM トリス緩衝液 (pH 7.5) 200 μL で 1 回洗浄し、ここにインフォームド・コンセントを行ったボランティア及び患者検体 10 μL と 100 mM トリス緩衝液 (pH 7.5) 90μL を加えて室温、1 時間反応させた。反応終了後、そのプレートを 0.05% Tween 20 を含む 100 mM トリス緩衝液 (pH 7.5) 200 μL で 3 回洗浄した。次いで、そのプレートに 100 μl の N テスト ALP Kind-King 試薬 (日東紡) の基質溶液、すなわち、フェニルリン酸二ナトリウムと4-アミノアンチピリンを含む溶液) を加えて更に 37℃、pH 10 で 1 時間、酵素反応させた。さらに、その反応液に、発色試薬（メタ過ヨウ素酸ナトリウムを含む溶液) 100 μL を添加してその発色値を 492 nm にて比色することにより TNSALP 値を求めた。測定範囲を超える高値検体については希釈して再測定をした。
表３に、モノクローナル抗体 3-29-3R、1A5-7 を用いて得られる TNSALP 値の結果を示す。これらの結果を、Total ALP 活性値 (JSCC 準拠値) と比較した。
【００３８】
【表３】

【００３９】
モノクローナル抗体 3-29-3R を用いて得られる TNSALP 値と Total ALP 活性値とは、検体 15 のデータにおいて強く乖離している。一方、モノクローナル抗体 1A5-7 を用いて得られる TNSALP 値と、Total ALP 活性値（JSCC 準拠値）とは、検体 15 のデータも含め、両値に相関関係が強くみられる。つまり、抗体 3-29-3R を用いて得られる TNSALP 活性値は、胎盤型 ALP や小腸型 ALP の活性値は含まれない点で Total ALP 活性値とは異なり、妊娠、腫瘍からくる胎盤型（ALP）の上昇や血液型 O、B 型の食後における小腸型分泌（ALP）による ALP 上昇などの原因で ALP 値が上昇するのを排除できている。したがって、一次抗体として抗体 3-29-3R を用いることは、ALP 6 を ELISA 法で測定する際にさらに有利と考えられる。
【００４０】
実施例１
種々の二次抗体を用いた ELISA 法による ALP 6 の測定
ALP 6 内の免疫グロブリンに対する各種抗体の親和性を調査するため、二次抗体として各種抗体を用い、ELISA 法により ALP 6 を測定した。その結果、二次抗体としてヒト IgG1 モノクローナル抗体を用いると最良の結果を得た。以下に詳述する。
一次抗体として二種類の抗体 3-29-3R 、1A5-7 プレートを用い、二次抗体として、(1)免疫グロブリン結合物質として 200 倍希釈 HRP 標識抗ヒト IgG1 モノクローナル抗体（大日本製薬）、(2) 200 倍希釈 HRP 標識抗ヒト IgM モノクローナル抗体（第日本製薬）、(3) 1/200 希釈 HRP 標識抗 IgA モノクローナル抗体（ザイメッド社）、(4) 250 倍希釈 HRP 標識抗ヒトイムノグロブリンポリクローナル抗体（ダコ社）、(5) 500 倍希釈 HRP 標識抗ヒトイムノグロブリンポリクローナル抗体（ダコ社）を用いた。検体としては、参考例３と同一検体を用いた。まず、抗体 3-29-3R または 1A5-7 プレートを、0.05% Tween 20 を含む 100 mMトリス緩衝液（pH 7.5）200μL で 1 回洗浄した。次いで、これらのプレートに、インフォームド・コンセントを行った健常人ボランティア及び患者検体 30 μL と100 mM トリス緩衝液（pH 7.5）70μL を加えて室温、1 時間反応させた。一次抗体反応終了後、そのプレートを、0.05% Tween 20 を含む 100 mMトリス緩衝液（pH 7.5）200μL で 3 回洗浄し、100μl の上記 (1)〜(5)の各種二次標識抗体を加えて更に 37℃、1 時間反応させた。1 時間後に洗浄を行い、標識 HRP に対する基質溶液（OPD 溶液）を反応させ、一定時間後に発色停止試薬 1 N 硫酸 100μL を添加してその発色値を 492 nm にて比色し ELISA 法による ALP 6 値を求めた。
【００４１】
結果として一次抗体が 3-29-3R、1A5-7 のどちらであっても、免疫グロブリン部位認識物質に関しては、ほぼ同様の結果が得られた。つまり二次抗体として抗 IgG1 モノクローナル抗体を使用した時には電気泳動法の結果とよく相関する結果を得た（実施例２で結果を詳述する）。一方、抗 IgM 抗体、抗 IgA 抗体ではほとんど発色せずブランクと変わらなかった。更に、二次抗体として、イムノグロブリンのポリクローナル抗体を用いた実験区では全て吸光度それぞれ 1.5、2.6 程度に高くなってしまい、結果が不明瞭になった。なお、以上のことから、ALP に結合している自己免疫様イムノグロブリンはほとんどが IgG1 であり、IgM、IgA はあまり結合していないと判明した。したがって、二次抗体として IgG1 と結合可能な抗体を用いると特に良好な結果をもたらすことが判明した。
【００４２】
実施例２
ELISA 法、乗法値法による ALP6 値と電気泳動検出法との比較
一次抗体として抗体 3-29-3R、抗体 1A5-7 を用い、かつ、二次抗体として抗 IgG1 モノクローナル抗体を用いて、ELISA 法による ALP 6 値、また、乗法値による ALP 6 値を求めた。ELISA 法による ALP 6 値は、実施例１と同様な方法により求めた。また、乗法値による ALP 6 値は、「ELISA 法による ALP 6 値」と「表３に示される TNSALP 値」との乗法値を計算して求めた。また、比較のため、キャピラリー等電点電気泳動法による ALP 6 の判定、TNSALP の肝型と骨型との優勢判定を行った。これらの結果を表４及び図２に示す。そのうち特に、検体９から１２について電気泳動の実際の結果を図３に示す。
【００４３】
【表４】

【００４４】
表４の結果より、ALP 6 値を測定する際、乗法値法の方が ELISA 法より、電気泳動の結果によく一致することが判明した。また、一次抗体として抗体 3-29-3Rを用いたときは、ALP 6 の ELISA 値や乗法値は、特に電気泳動の結果に良く相関していた。このことは、本発明において、アルカリ性ホスファターゼ部位認識物質として、TNSALP を特異的に結合するモノクローナル抗体を用いることが特に好ましい結果をもたらすことを示している。また、電気泳動の TNSALP の判定では、肝型 ALP が骨型 ALP 優勢のときと本発明の ALP 6 値は高い傾向を示し、そのとき、電気泳動の ALP 6 は陽性になりやすいことが判明した。
よって抗体 3-29-3R は IgG の結合、非結合に関係なく TNSALP を認識して結合させ、この TNSALP に自己免疫的に結合していた IgG を認識する標識二次抗体が結合する反応系によって ALP 6 が特に正確に測定可能であることが示された。
以上の結果から本発明の反応系例（一次抗体：ヒト TNSALP 認識モノクローナル抗体、二次標識抗体：HRP 標識抗ヒト IgG1 モノクローナル抗体）を用いて ALP 6 精密測定を行うことが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】ウエスタン・ブロッティング及び SDS-PAGE の結果を示す。矢印に ALP 6 のバンドが確認できる。二量体 ALP (136 kDa) と IgG (150 kDa) の結合した分子は約 286 kDaに、一量体 ALP (68 kDa) と IgG の結合分子は 218 kDa に確認できる。
【図２】本発明の乗法値法による ALP 6 値と電気泳動法の判定を比較している。結果として TNSALP 認識抗体 3-29-3R と二次抗体HRP 標識抗 IgG1 の組み合わせ結果が電気泳動の結果とも特によく相関していた。
【図３】キャピラリー電気泳動法の結果を示す。検体 9、10、11 は肝型が強く、12 は骨型が強い。ALP 6 は検体 No.10、11 で強陽性であり、No.9 は陽性、No. 12 では ALP 6 がほとんど認められなかった。[0001]
[Technical field to which the invention belongs]
The present invention relates to a method for measuring alkaline phosphatase 6 (hereinafter sometimes referred to as ALP 6) and a kit used therefor. More specifically, when alkaline phosphatase 6 is included in the sample to be measured, it is possible to know the value of ALP 6 as an accurate quantitative value without requiring complicated operations and visual judgment as in the past. And a kit used therefor, which are extremely effective in the field of clinical laboratory medicine such as grasping the state of liver disease, rheumatoid arthritis, malignant tumor, and ulcerative colitis.
[0002]
[Prior art]
Alkaline Phosphatase (ALP) (EC.3.1.3.1) is a generic name for enzymes that hydrolyze phosphate monoesters, have an optimum pH on the alkali side, and have zinc ions at the active center. The function in the living body is considered to be involved in substance and energy transport, supply of inorganic phosphate, and bone mineralization. In serum, there are isozymes that exhibit organ specificity such as liver type, bone type, small intestine type, placenta type and tumor type (Nagao type, Reagan type, Kasahara type, fetal small intestine type, etc.). It has been widely used for diagnosis of vascular diseases, bone diseases, tumors and the like.
However, while total ALP activity in serum is widely used and effective, the measurement results alone are difficult to identify the disease. It has a problem with the previous serum isozyme. When ALP is electrophoresed, 6 and 7 bands are separated, but considering ALP from the antigenicity of the protein using antiserum, organ-specific (Tissue Specific ALP: TSALP) and organ-nonspecific (Tissue-Non Specific ALP: TNSALP) Three types of placenta type (ALP 4), small intestine type (ALP 5), and germ cell type called tissue-specific ALP (TSALP) are produced by the gene present in 2q34-37. I know that. Next, it is known that tissue-nonspecific ALP (TNSALP) is the type found in liver, bone, kidney, and leukocyte, has the same amino acid sequence, and is expressed from gene 1p34-36.1. Among them, in the liver type and the bone type, two types of mRNA are produced from the same gene due to the difference in transcriptional regulation, but it is known that they have the same sequence as the enzyme matures (non-patent literature). 1). However, due to the difference in sugar chains bound to the enzyme, the liver type (ALP 2) with 3 N-type sugar chains and the bone type (ALP 3) with 2 N-type sugar chains and 1 O-type sugar chain are electrophoresed. It is thought to be divided above. Furthermore, ALP 1 is separated from the binding of membrane components and GPI anchor, and ALP 6 is separated from the binding of immunoglobulin. Since the sum of all the isozyme activities is reflected as the ALP value in serum, it is difficult for the high ALP value to correspond to the disease on a one-to-one basis.
[0003]
In the ALP measurement as a sum of these isozymes, the activity varies depending on the substrate of the reagent used, the type of buffer, the pH, etc., and standardization has become active in recent years, and now the International Clinical Chemistry Union (IFCC) Recommendation methods are presented by the Japan Society for Clinical Chemistry (JSCC), and standardization of total ALP measurements is progressing. However, there is still no standard detection method for isozyme itself (Non-patent Document 2).
The methods for measuring isozymes include amino acids that inhibit L-phenylalanine, liver type, bone type (ALP 2, 3), placental type with L-homoarginine, and small intestine type (ALP 4, 5). A method of measuring isozymes by utilizing (non-patent document 3), a method of specifically measuring ALP 4 while leaving only placental (ALP 4) activity by heating (non-patent document 4, non-patent document 5), Methods for measuring liver type (ALP 2) and bone type (ALP 3) using lectins using the difference between the above-mentioned liver type and bone type ALP sugar chains (Non-patent document 6, Non-patent document 7) , Non-Patent Document 8, Non-Patent Document 9), a method using a specific monoclonal antibody against bone type ALP (ALP 3) (Non-Patent Document 10), etc. has been developed, and some isozymes can be measured. Yes. However, the immunoglobulin-binding ALP 6 is used for clinical diagnosis by knowing the presence or absence of its presence from electrophoresis because there is still no way to know its absolute value, although clinical significance has been advocated. It is in.
[0004]
First, ALP 6 was discovered by Nagamine et al. As an ALP-conjugated immunoglobulin (Non-patent Document 11) in ulcerative colitis, which is an intractable disease designated by the Ministry of Health, Labor and Welfare (Non-patent Document 12). Kano et al. Then reported that ALP 6 increased or decreased reflecting the pathological condition (Non-patent Document 13). In addition, Kanno et al. Conducted a nationwide questionnaire in 1981 and summarized the pathological analysis (Non-patent Document 14). As a result, many cases were found to be autoantibodies. Regarding the isozyme species to which immunoglobulin binds, Crofton et al. Reported that most of ALP 6 immunoglobulin-bound ALP is TNSALP (Non-patent Document 15). Recently, Owen et al. Also reported that IgG kappa chains are bound to macro ALP (Non-patent Document 16). In general, ALP 6 expression, which is the above-mentioned polymer complex, is generally infrequent in healthy individuals, while serum containing high-activity ALP that has a total ALP activity of 1,000 units or more is frequently observed in ALP 6 It is known that ALP 6 may be elevated even in rheumatoid arthritis and tumors. In such a situation, it was strongly desired that precise measurement of ALP 6 be performed in order to further establish clinical significance.
[0005]
[Non-Patent Document 1]
Biochem Biophys Res Com 168,993-1000: 1990
[Non-Patent Document 2]
Laboratory test 37 (9), 1041-1044: 1993
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Regarding the incidence and distribution of enzyme-linked immunoglobulin in Japan
Research report: 1981
[Non-Patent Document 15]
Clin Chim Acta 112,33-42: 1981
[Non-Patent Document 16]
Ann Clin Biochem 39,523-5: 2002
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
ALP 6 to be measured in the present invention has been impossible for a long time although it is said that precise measurement has clinical significance. This was because it was unclear which ALP isozyme was likely to bind autoimmune immunoglobulin and which class of immunoglobulin was bound as ALP 6. In view of such a problem, the present invention, for example, first uses a combination of a primary antibody that reacts with ALP and a secondary antibody that reacts with immunoglobulin that has been autoimmunely bound to the ALP, in combination with other antibodies in the reaction system. The purpose is to provide a measurement system that specifically and precisely measures ALP 6 without the influence of ALP. The ALP 6 measurement developed by this method can be used as a clinical diagnostic agent, and can contribute to the development of basic medicine such as autoantibody mechanism.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present invention relates to a method for measuring alkaline phosphatase 6 in a sample, comprising alkaline phosphatase 6 in a sample, an alkaline phosphatase site recognition substance that recognizes an alkaline phosphatase site that is a component of alkaline phosphatase 6, and alkaline phosphatase 6 Measures alkaline phosphatase 6 from the level of the resulting alkaline phosphatase site recognition substance, alkaline phosphatase 6 and immunoglobulin site recognition substance by reacting with an immunoglobulin site recognition substance that recognizes the immunoglobulin site as a constituent component. This is a method for measuring alkaline phosphatase 6.
More specifically, the present invention relates to a method for measuring alkaline phosphatase 6 in a specimen, wherein an alkaline phosphatase 6 in a specimen and an antibody that reacts with human organ non-specific alkaline phosphatase are subjected to an antigen-antibody reaction, An antigen-antibody reaction product obtained is reacted with an immunoglobulin site-recognizing substance that recognizes an immunoglobulin site that is a component of alkaline phosphatase 6, and the resulting antibody and alkaline phosphatase 6 react with non-human organ-specific alkaline phosphatase. A method for measuring alkaline phosphatase 6, wherein alkaline phosphatase 6 is measured from the level of a conjugate with an immunoglobulin site recognition substance.
[0008]
Furthermore, the present invention relates to a method for measuring alkaline phosphatase 6 in a sample, comprising i) reacting a human organ non-specific alkaline phosphatase in a sample with an antibody that reacts with a human organ non-specific alkaline phosphatase, and then antigen-antibody reaction; Antigen-antibody-reacted human organ non-specific alkaline phosphatase is reacted with an enzyme substrate for alkaline phosphatase, and from the level of the reacted enzyme activity, human organ non-specific alkaline phosphatase activity in the sample is obtained,
ii) Independently of i) above, the level of alkaline phosphatase 6 in the sample is determined by the above measurement method,
iii) Obtain the multiplicative value of the human organ non-specific alkaline phosphatase activity value obtained in i) above and the alkaline phosphatase 6 level value obtained in ii) above, and determine the amount of alkaline phosphatase 6 in the sample from the multiplicative value. Ask,
This is a method for measuring alkaline phosphatase 6.
Furthermore, the present invention provides a kit for measuring alkaline phosphatase 6 in a specimen,
i) a solid support,
ii) an alkaline phosphatase site recognition substance that recognizes an alkaline phosphatase site that is a constituent of alkaline phosphatase 6;
iii) a labeled immunoglobulin site recognition substance that recognizes an immunoglobulin site that is a component of alkaline phosphatase 6; and
iv) components for detecting the label,
It is a kit containing.
[0009]
According to the measurement method of the present invention, ALP 6 can be measured more precisely than the electrophoresis method used so far. For example, an anti-TNSALP monoclonal antibody is used as the first monoclonal antibody that hardly reacts with an isozyme other than human organ non-specific alkaline phosphatase (TNSALP), and an immunoglobulin site that is a component of ALP 6 is used as the second monoclonal antibody. By using a labeled anti-human IgG1 monoclonal antibody that reacts with or by combining these two antibodies, blood non-immunoglobulin isozymes (liver type, bone type, small intestine type, placenta type, etc.) It is almost unaffected by the tumor type) and only ALP 6 can be specifically measured.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, the specimen is not particularly limited as long as it is a liquid or mixture that may contain ALP 6, but in vivo samples such as blood, serum, plasma, and urine are usually preferable.
In the method for measuring ALP 6 of the present invention, an alkaline phosphatase site recognition substance that recognizes an alkaline phosphatase site that is a constituent of ALP 6, and an immunoglobulin site recognition substance that recognizes an immunoglobulin site that is a constituent of ALP 6, Then, ALP 6 is measured from the level of the resulting conjugate of alkaline phosphatase site recognition substance, ALP 6 and immunoglobulin site recognition substance.
[0011]
In the present invention, the alkaline phosphatase site recognition substance refers to a substance that can bind to the alkaline phosphatase site in ALP 6. Specifically, substances capable of binding to human organ non-specific alkaline phosphatase (TNSALP) such as liver-derived ALP and bone-derived ALP can be exemplified. Human organ non-specific alkaline phosphatase (TNSALP) is usually a protein expressed from the gene 1P34-36.1, but in general, liver type ALP (ALP 2), bone type ALP (ALP 3), kidney type ALP And white blood cell type ALP. Preferred examples of the substance capable of binding to TNSALP include an antibody against TNSALP. The antibody may be any of antiserum, polyclonal antibody, and monoclonal antibody.
In order to accurately measure ALP 6, a monoclonal antibody specific for TNSALP is preferable. Specifically, as shown in Reference Example 1 described later, the ALP enzyme activity value that reacts with small intestine type ALP and the placenta when reacted with small intestine type, placenta type, liver type and bone type ALP of the same enzyme activity amount. Anti-human TNSALP monoclonal antibody whose sum of ALP enzyme activity reacting with type ALP is less than 1/10 of sum of ALP enzyme activity reacting with liver type ALP and ALP enzyme activity reacting with bone type ALP Is preferred. In particular, an anti-human TNSALP monoclonal antibody having an ALP enzyme activity value that reacts with bone type ALP is 0.7 or less of an ALP enzyme activity value that reacts with liver type ALP is more preferable. Examples of anti-human TNSALP antibodies that can be used in the present invention include monoclonal antibodies 3-29-3R, 2C5-32, and 1A5-7 shown in Production Example 1 established by the present inventor and described later. 3-29-3R and 2C5-32 are preferred. Monoclonal antibodies such as HLMS-1, HLMS-2, HLMS-3, and HLMS-4 (above, JP-A-2-35098) are also preferred, and known anti-TNSALP monoclonal antibodies similar to them can also be used. It is.
[0012]
In the present invention, the immunoglobulin site recognition substance refers to a substance that can bind to the immunoglobulin site in ALP 6. Preferably, it is a substance capable of binding to IgG1, specifically an antibody against IgG1. The antibody may be any of antiserum, polyclonal antibody, and monoclonal antibody, but anti-human IgG1 monoclonal antibody is particularly preferable. Examples of substances that can bind to IgG1 include protein G and protein A. In this case, when using an antibody as the alkaline phosphatase site recognition substance described above, it is of course necessary to block the CH2CH3 site in the antibody in advance so that protein G or the like does not bind to the antibody. .
[0013]
The antiserum, polyclonal antibody, and monoclonal antibody described above, for example, against TNSALP or IgG1, can be prepared by a method known per se. Commercially available products can be used as antisera, polyclonal antibodies, and monoclonal antibodies against IgG1. The preparation will be described in detail below using a monoclonal antibody against TNSALP as an example.
The anti-TNSALP monoclonal antibody that can be used in the present invention can be obtained, for example, by using purified human blood-derived ALP 6 as an immunogen. Moreover, since ALP 6 is divided into an ALP site and an immunoglobulin site due to its structure, each of ALP and immunoglobulin can be used as an antigen. Immunization can be performed with an antigen from a cultured osteoblast cell line as an ALP antigen, but not limited thereto, ALP such as normal osteoblasts can also be used as the antigen. The use of full-length recombinants, mutants, and partial antigens prepared by genetic engineering is also a conventional method, and this is exactly the same for the production of anti-immunoglobulin antibodies and can be used.
Monoclonal antibodies are immunized with purified human ALP 6 alone or ALP and immunoglobulin separately as an immunogen, and anti-human ALP 6 antibody-producing cells, or anti-ALP antibody-producing cells or anti-immunoglobulin antibody-producing cells. And a hybridoma obtained by fusing bone marrow tumor cells.
[0014]
The hybridoma can be obtained by the following method. That is, for example, ALP as described above is mixed together using Freund's complete, incomplete adjuvant, aluminum hydroxide adjuvant, pertussis adjuvant, and the like, and a sensitive adjuvant solution is prepared and divided into several times. Animals such as rats are immunized by intraperitoneal subcutaneous or tail vein administration every 1 to 3 weeks. The amount of sensitizing antigen is between 1 μg and 100 mg, but generally about 50 μg is preferred. The number of immunizations is generally 2-7, but various methods are known. Next, antibody-producing cells derived from the spleen and the like are fused with cells having proliferation ability in a test tube such as bone marrow tumor cells (myeloma cells). Antibody-producing cells can be obtained from mice, nude mice, and rats.
[0015]
As a fusion method, fusion can be performed by using polyethylene glycol (PEG) according to the conventional method of Kohler and Milstein (Nature. 256, 495.1975) which is already known per se. Fusion can also be performed by Sendai virus or electrofusion. A method for selecting a hybridoma that produces an antibody that recognizes human ALP from the fused cells can be performed as follows. That is, hybridomas are selected from colonies produced by cells surviving in the HAT medium and HT medium from the fused cells by the limiting dilution method. If colony culture supernatant made of 96-well wells contains antibodies against human ALP, place the supernatant on an assay plate with human ALP immobilized on the plate, Monoclonal antibody-producing clones against human ALP can be selected by ELISA in which a secondary labeled antibody such as an anti-mouse immunoglobulin-HRP labeled antibody is reacted after the reaction. In addition to HRP, enzymes such as alkaline phosphatase, fluorescent substances, radioactive substances, etc. can be used as the labeling substance for the labeled antibody. As a control, human ALP-specific antibodies can be screened by simultaneously performing ELISA using an assay plate that binds only BSA, which is a blocking agent. In other words, clones that are positive on the human ALP plate and negative on the BSA ELISA are selected. At the same time, an anti-mouse immunoglobulin antibody is spread on a microtiter plate, and the fusion cell culture supernatant is added and reacted therewith. Further, purified ALP is added to bind the active enzyme to produce an immune complex. The activity can also be measured using a chromogenic substrate such as phenyl phosphate.
[0016]
Among the hybridomas producing antibodies that can be used in the present invention, among monoclonal antibodies that specifically recognize human ALP, it reacts particularly with active human TNSALP and almost cross-reacts with human placental ALP and human small intestine ALP. Preferred are those produced by monoclonal antibodies that do not. Examples thereof include hybridomas 3-29-3R and 2C5-32 established by the present inventor. Hybridomas 3-29-3R and 2C5-32 were deposited at the Institute of Biotechnology, AIST on April 16, 2003, under the accession numbers FERM BP-8360 and FERM BP-8359, respectively.
[0017]
The hybridoma can be cultured in a medium usually used for cell culture, such as α-MEM, RPMI1640, ASF, S-clone, and the monoclonal antibody can be recovered from the culture supernatant. Alternatively, an animal from which a hybridoma is derived or a nude mouse can be treated in advance with pristane, and ascites can be retained by intraperitoneal injection of cells into the animal, and a monoclonal antibody can be recovered from the ascites. As a method for recovering the monoclonal antibody from the supernatant or ascites, a conventional method can be used. For example, salting-out methods using ammonium sulfate, sodium sulfate, etc., chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography using protein A, and the like can be mentioned.
[0018]
The alkaline phosphatase site recognition substance such as the anti-TNSALP monoclonal antibody as described above and the immunoglobulin site recognition substance such as the anti-IgG1 monoclonal antibody are reacted with ALP 6 in the specimen, and the resulting alkaline phosphatase site recognition substance and ALP 6 in a sample can be measured by determining the level of a conjugate of ALP 6 and an immunoglobulin site recognition substance. More specifically, it can be obtained by, for example, reacting ALP 6 in a specimen with an anti-human TNSALP monoclonal antibody by an antigen-antibody reaction by ELISA, and then reacting the obtained antigen-antibody reaction product with an anti-IgG1 monoclonal antibody. ALP 6 in a sample can be measured from the level of a conjugate of anti-human TNSALP monoclonal antibody, ALP 6 and anti-IgG1 monoclonal antibody.
In order to determine the level of a bound substance that has undergone an antigen-antibody reaction by ELISA, it is preferable to use a labeled immunoglobulin site recognition substance as an immunoglobulin site recognition substance such as an anti-IgG1 monoclonal antibody. The labeling method is not particularly limited as long as it can be used for labeling in an immunoassay method, but it may be an enzyme such as peroxidase, a radioisotope, a fluorescent material, a magnetic material, or a colloid.
[0019]
As a measuring method of the present invention, a specific example carried out by sandwich assay ELISA method is as follows. First, as a primary antibody, an anti-TNSALP monoclonal antibody, which is an alkaline phosphatase site recognition substance, is adsorbed on a solid support, for example, a plate, and reacted with an alkaline phosphatase site of ALP 6 in a sample such as serum. Wash. Next, after reacting the adsorbed immunoglobulin part of ALP 6 with a secondary antibody such as a biotinylated anti-IgG1 monoclonal antibody as a secondary antibody and reacting with peroxidase-labeled streptavidin, the peroxidase enzyme ALP 6 can be detected by performing a reaction and then a color reaction. In addition, by using an anti-IgG1 monoclonal antibody directly labeled with peroxidase such as HRP as a secondary antibody, after reacting with ALP and the secondary antibody, a substrate for the labeled enzyme, for example, OPD (o-phenylene) ALP 6 can also be detected by further reacting with (diamine), DAB (diaminobenzidine), TMB (tetramethylbenzidine) and the like to cause color development. The labeling substance to be bound to the secondary labeled antibody is not limited to the enzyme depending on the measurement method, and may be a radioisotope, a fluorescent substance, a magnetic substance, a colloid, or the like.
[0020]
In the measurement method of the present invention, the level of ALP 6 in the sample is determined by the above-described measurement method, and on the other hand, human organ non-specific alkaline phosphatase (TNSALP) activity in the sample is determined independently, and ALP 6 in the sample is determined. It is also possible to obtain a multiplicative value between the level value of the human and the activity value of human TNSALP in the specimen, and to determine the amount of ALP 6 in the specimen from the multiplicative value. In the case of the method using this multiplicative value, the antigen-antibody reaction between the ALP 6 in the sample and the antibody against the primary antibody human TNSALP, which is performed when the level of ALP 6 in the sample is determined by the above-described measurement method Therefore, the effect of competitive reaction with other ALPs other than ALP 6 present in the sample can be taken into account, and the above multiplicative value is a value more reflecting the actual abundance of ALP 6 in the sample. Become.
In the measurement method using this multiplicative value, human TNSALP activity in a sample is obtained by reacting human TNSALP in the sample with an antibody that reacts with human TNSALP and then reacting the antigen-antibody-reacted human TNSALP with an alkaline solution. It can be carried out by reacting with an enzyme substrate for phosphatase and determining the human TNSALP activity in the sample from the level of the enzyme activity reacted. As the enzyme substrate for alkaline phosphatase, a commonly used substrate can be used. For example, human TNSALP in a sample can be obtained by causing a color developing substrate such as phenyl phosphate to undergo an enzymatic reaction with antigen-antibody-reacted human TNSALP to develop color, and measuring the absorbance.
[0021]
In the present invention, as described above, when ALP 6 in a specimen is measured by, for example, ELISA, it can be carried out using an ELISA kit. When the measurement method of the present invention is carried out by ELISA, for example, a kit for measuring ALP 6 comprising: i) a solid support, ii) an alkaline phosphatase site recognition substance such as a monoclonal antibody against TNSALP, iii ALP 6 can be measured efficiently by using a kit containing a labeled immunoglobulin site recognition substance such as an anti-IgG1 monoclonal antibody and iv) a component for detecting the label.
The component for detecting the label is a component for measuring the labeled antibody. When the label is biotin, it contains peroxidase-labeled streptavidin, tetramethylbenzidine peroxidase enzyme substrate, and hydrogen peroxide solution. When the label is peroxidase, it is a reagent containing a peroxidase substrate such as OPD (o-phenylenediamine), DAB (diaminobenzidine), TMB (tetramethylbenzidine) and the like. This kit may contain a detergent solution as required. In the present invention, when this kit is used, it is preferable to include a washing solution in order to remove components that have not been adsorbed to the solid support after binding ALP 6 in the specimen to the primary antibody. As the cleaning liquid, for example, a Tris buffer containing a surfactant can be used. Furthermore, the kit of the present invention may contain a sample diluent as necessary. As the sample dilution solution, for example, a buffer solution such as Tris can be used. If necessary, a chelating agent such as EDTA · 2Na and an inorganic salt such as sodium chloride may be added to the buffer solution.
[0022]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although a manufacture example, a reference example, and an Example demonstrate this invention further in detail, this invention is not limited to these examples at all.
Production Example 1
Anti-human TNSALP Production of monoclonal antibodies
(1) Selection and preparation of antigen for monoclonal antibody production
The present inventors purified ALP derived from a human osteoblast cell line Saos-2, which is known to express TNSALP, as an antigen for producing an anti-human TNSALP monoclonal antibody. The purification method is described below.
Saos-2 (HTB-85) was obtained from ATCC (American Type Culture Collection) and cultured in α-MEM (Dainippon Pharmaceutical) containing 10% fetal calf serum (FCS). When about 80% of the cells became confluent, the dish was washed 3 times with 50 mM Tris buffer (pH 7.5), and 50 mM Tris buffer (pH 7.5) containing 0.5% adekatol SO-135 was added. The cells were collected using a rubber policeman and homogenized for 1 minute on ice with an ultrasonic homogenizer. The cell lysate was centrifuged (22,000 rpm 30 min RT), and the supernatant was fractionated with 40% ammonium sulfate. Centrifugation (10,000 rpm 30 min RT) was performed, and ammonium sulfate was further dissolved in the supernatant to adjust to 60% ammonium sulfate, followed by re-fractionation. This 40-60% ammonium sulfate fraction precipitate was redissolved in 50 mM Tris buffer (pH 7.5) and dialyzed against 50 mM Tris buffer (pH 7.5). The dialyzed sample was applied to a DEAE column (Amersham Bioscience), and the adsorbed protein was eluted with a linear concentration gradient (0-0.5 M NaCl) of the above Tris buffer containing NaCl.
The peak ALP activity was measured using an N-assay ALP-LS reagent (Nittobo) using a Hitachi 7150 automatic analyzer. The active fraction was concentrated by ultrafiltration and purified by S-300 column (Amersham Bioscience). When this active fraction was concentrated in the same manner as DEAE and confirmed by SDS-PAGE, TNSALP was almost the major, and this was used as an antigen for immunization.
[0023]
(2) Immunity
Purified TNSALP was diluted with 50 mM Tris-acid buffer (pH 7.5) to 1 mg / ml, and 50 μg (50 μl) was taken and mixed well with 50 μl Freund complete adjuvant (WAKO) until emulsified. The prepared suspension was intraperitoneally administered to Balb / c 6-week-old female mice (Clear Japan) under diethyl ether anesthesia. Two weeks later, the same amount of TNSALP (50 μg / ml) was mixed with Freund's incomplete adjuvant (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to make an emulsified suspension by the same procedure as Freund's complete adjuvant, Made. Thereafter, the same procedure was performed 2 weeks later. In the fourth round, 50 μg / ml of TNSALP was prepared as a final immunization in 50 mM tris-acid buffer (pH 7.5) and administered by tail vein injection of mice.
[0024]
(3) Establishment of hybridoma
Three days after the final immunization, the spleen surgically removed under anesthesia with diethyl ether from mice sensitized with TNSALP was aseptically dispersed to prepare spleen cells. Fusion is performed according to the method of Kohler and Milstein (Nature. 256, 495. 1975), and splenocytes and myeloma cells using polyethylene glycol (PEG 4000) (Merck) P3-X63-Ag8-U1 (P3U1) Fused. The fusion ratio is 10 x 10 spleen cells⁷Myeloma cells per cell P3-X63-Ag8-U1 (P3U1) 2 × 10⁷It was 5: 1. The fused cells are dispersed in 10% FCS (Invitrogen) α-MEM (Irvine) HAT (Cosmo Bio) medium and dispensed into a 96-well microtiter culture plate (Sumitomo Bakelite) at 37 ° C, 5% CO₂ Cultured under conditions.
[0025]
(4) Screening
About 2 weeks later, the colonies were confirmed for growth and screened. The screening method is described below.
To prepare the screening plate, TNSALP purified in (1) above was dissolved in 50 mM tris-acid buffer and dispensed into 96-wells (NUNK) at 0.5 μg / 100 μl / well. . The plate is allowed to stand at 4 ° C for 2 nights, then washed 3 times with Tris buffer containing 0.05% Tween 20, and 200 µl of 1.5% BSA solution is added to suppress non-specific reaction. I left still overnight. The completed plate was washed 3 times with Tris buffer containing 0.05% Tween 20, and then 100 µl of the culture supernatant was reacted. After further washing, the secondary antibody, HRP-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody (Zymed) was added. In addition, it was made to react. After washing, add 100 μl of 3 mg / ml o-phenylenediamine (OPD) (Nacalai Tesque) citric acid coloring solution, which is a color developing substrate of HRP, and after a certain period of color development, add another 100 μl of 1 N sulfuric acid as a stop solution, Absorbance was measured at a measurement wavelength of 492 nm. Clones that became positive as described above were recloned by limiting dilution and the supernatant was checked again.
[0026]
(5) Confirmation of antibody
The reactivity with purified TNSALP was confirmed by ELISA, and the inventors selected that clones 3-29-3R, 2C5-32, and 1A5-7 recognized TNSALP. The results of assaying the obtained antibodies with a monoclonal antibody typing kit (Amersham Biosciences) are shown in Table 1 below.
[0027]
[Table 1]

[0028]
(6) Production and purification of monoclonal antibodies
Hybridoma 3-29-3R, 2C5-32, 1A5-7 cells obtained in (5) above 1 × 10⁷The cells were intraperitoneally administered to Balb / c mice (CLEA Japan, Inc.), 10 weeks old, female for 2 weeks after administration of 0.5 ml of pristane (Aldrich), and ascites collected in the abdominal cavity of the mice about 2 weeks later was added to diethyl ether. It was surgically collected under anesthesia. When the ascitic fluid was used as a sample and confirmed by serial dilution by ELISA, a high concentration of monoclonal antibody was contained. This ascites was treated with 40% ammonium sulfate and dialyzed against PBS. 3-29-3R and 1A5-7 were purified with a protein G column (Amersham Biosciences) and confirmed by SDS-PAGE. 2C5-32 was purified using S-300. As a result, 3-29-3R and 1A5-7 showed a single band with a molecular weight of about 150,000 in non-reduction, and a band with a molecular weight of about 50,000 and two bands of 25,000 in reduction with mercaptoethanol. 2C5-32 showed a single band with a molecular weight of about 900,000 when it was not reduced, and two bands with a molecular weight of about 70,000 and 25,000 when it was reduced with mercaptoethanol. The purified monoclonal antibodies 3-29-3R, 1A5-7, and 2C5-32 were each about 10 mg or more per mouse and were sufficient for industrial use.
[0029]
Reference example 1
Anti-human TNSALP Monoclonal antibody specificity assay
In order to investigate the specificity of monoclonal antibodies 3-29-3R, 2C5-32, 1A5-7, various isozymes (Saos-2 derived TNSALP, liver type ALP (normal light), bone type ALP (normal light), small intestine type ALP ( The following experiment was conducted using placenta type ALP (Sigma), and the measurement method is as follows.
The purified monoclonal antibody was dispensed on a solid layer plate (NUNC) to 2 μg / 100 μL PBS / well and allowed to stand at 4 ° C. for 2 days. After washing three times with a 20 mM Tris buffer (pH 7.0) washing solution containing 0.05% Tween 20, 200 μl of 1.5% BSA Tris buffer (pH 7.0) was added and blocked overnight at 4 ° C. The plate thus prepared was washed once with the previous washing solution and reacted with various isozymes. The enzyme activity of the isozyme was measured using the Kind-King modified reagent (formazan method, using Nittobo N-Test ALP K-K kit), and 100 μl of the total was added to the antibody-binding plate in accordance with 25 IU / L. The reaction was allowed to proceed at room temperature for 2 hours, and after the completion of the reaction, the plate was washed 3 times with the above washing solution, and the enzyme activity was measured according to the Kind-King modified method (formazan method). That is, ALP enzyme bound to the antibody plate was added with 100 μl of a substrate solution (a solution containing disodium phenylphosphate and 4-aminoantipyrine solution) and reacted at 37 ° C. for 1 hour to capture the ALP enzyme captured by the antibody. Then, a color developing reagent (solution containing sodium metaperiodate) was added to cause color development, and the absorbance was measured at 492 nm. The data at this time is shown in Table 2. At this time, a blank value obtained by the same operation without adding ALP is obtained, and a value obtained by subtracting the blank value from each measured value becomes the activity value of each ALP against the antibody.
[0030]
[Table 2]

[0031]
As can be seen from Table 2, antibodies 3-29-3R and 2C5-32 react only with Saos-2-derived TNSALP, liver and bone, and show little cross-reactivity with other isozymes. It was found to be a highly specific monoclonal antibody. That is, antibodies 3-29-3R and 2C5-32 are specific to TNSALP.For example, the sum of small intestine type ALP activity value and placental type ALP activity value is the difference between liver type ALP activity value and bone type ALP activity value. It was found to be less than 1/10 of the sum.
1A5-7 reacted well with all isozymes including TNSALP derived from Saos-2. In other words, 1A5-7 was found to react with any ALP isozyme.
In addition, the liver type and bone type reaction ratio (liver: bone reaction ratio) at 25 IU / L of the two monoclonal antibodies was 1: 29.30 for 3-29-3R and 1: 0.93 for 2C5-32. . By the way, in general, ALP 6 tends to appear when the liver type becomes stronger than the bone type in the electrophoresis result of the high ALP sample. Therefore, antibody 3-29-3R is more effective when used in the present invention because it has a bone type ALP activity of 0.7 or less of liver type ALP activity.
[0032]
Reference example 2
Serum using monoclonal antibody ALP 6 Purification and structure determination
(1) Affinity column production
Since most of the ALP that constitutes ALP 6 is considered to be TNSALP, we attempted purification of ALP 6 using 3-29-3R, which is actually an anti-TNSALP monoclonal antibody.
First, a monoclonal antibody purified from the ascites of a mouse intraperitoneally injected with clone 3-29-3R confirmed to react with TNSALP in order to purify only TNSALP from the serum HiTrap NHS- An anti-human TNSALP column was prepared by binding to activated HP (Amersham Biosciences). The experimental method is briefly described below.
First, an unused column was opened, and 5 mL of ice-cooled 1 mM hydrochloric acid solution was fed at a flow rate of 1 mL / min. Next, 1 mL of the monoclonal antibody solution (15 mg / mL) was fed, sealed with a domnut and allowed to stand at 4 ° C. for 4 hours. After standing, 3 mL of coupling buffer (0.2 M sodium bicarbonate buffer 0.5 M NaCl pH 8.3) was flowed and blocked with 6 mL blocking buffer (0.5 M monoethanolamine solution 0.5 M NaCl pH 8.3). After washing with 6 mL of washing solution (0.1 M sodium acetate buffer 0.5 M NaCl pH 4.0), the solution was again passed through 6 mL of blocking buffer (0.5 M monoethanolamine solution 0.5 M NaCl pH 8.3) and left at room temperature for 30 minutes. Thereafter, 6 mL of washing solution, blocking solution, and washing solution were alternately flowed, and the column was finally equilibrated with 20 mM Tris buffer pH 8.0.
[0033]
(2) Purification of serum TNSALP by affinity column
The serum reaction was purified using the completed 3-29-3R HiTrap NHS-activated HP column. First, 40 mL of adult serum obtained from volunteers was refluxed overnight at 4 ° C at a flow rate of 0.2 mL / min. The column was then washed with 20 mM Tris buffer pH 8.0 and eluted with 100 mM glycine buffer pH 2.7. In addition, 40 mL of ALP high sample pool of 700 IU / L or more obtained by informed consent was refluxed, and the eluted fraction was collected in the same manner. 1/10 volume of 1 M Tris buffer pH 9.0 was added to the collected fraction, and neutralized immediately after collection.
[0034]
(3) Purification of ALP 6 from the affinity column elution fraction by Protein G column
This 3-29-3R affinity column elution fraction was analyzed by dividing it into healthy individuals and high ALP values. The method is the same as the antibody purification performed in (6) of Production Example 1. In brief, the 3-29-3R column elution fraction was further purified on a 5 mL HiTrap Protein G column (Amersham Biosciences). First, the 3-29-3R affinity column elution fraction peak was combined with 5 mL and packed into a column, and reacted at 4 ° C. overnight. After that, it was washed with 100 mM Tris buffer (pH 8.0), and 5 mL of the first thru fraction was collected in advance.₂₈₀Was washed until the value was equal to that of the blank. Subsequently, elution was performed with 100 mM glycine buffer (pH 2.0), and the fraction was immediately neutralized with 1 M Tris buffer (pH 9.0). The elution of a particularly high concentration of protein was observed only in the fraction from the high ALP sample. Almost no elution was observed from healthy human specimens.
[0035]
(4) Electrophoresis and Western blotting
The high ALP patient specimen fraction and the healthy subject fraction were analyzed by electrophoresis and Western blotting. The eluted fraction protein was adjusted to 20 μg / Lane and subjected to 10% SDS-PAGE. The gel is a PAG mini “first” 4/20% gradient gel (first chemical). A part of the electrophoresis was cut out and protein staining was performed by Coomassie Brilliant Blue staining. The remaining gel was Western blotted by wet blot. When blotting was completed, blocking was performed overnight at 4 ° C using Block Ace (Dainippon Pharmaceutical). On the next day, the membrane was gently washed with a 50 mM Tris solution (pH 7.5) containing 0.05% Tween 20, and the antibody was allowed to react at room temperature for 2 hours. The Western blotting antibodies are 1/500 diluted anti-IgG1-HRP (Dainippon Pharmaceutical) and 1/300 diluted anti 3-29-3R-HRP. The membrane was washed with 50 mM Tris solution (pH 7.5) containing 0.05% Tween 20 three times every 10 minutes after the reaction, and the color was developed using a coloring reagent for HRP (Wako Pure Chemicals).
[0036]
The results are shown in FIG. From the results in FIG. 1, it was found that macromolecules with molecular weights of about 220 kDa and about 300 kDa exist in the sample of the ALP high-value specimen. This molecule reacts with both IgG1 and TNSALP by Western blotting, and a reaction band is detected at the same position.Therefore, ALP 6 (218 kDa) bound to monomeric ALP (68 kDa) and IgG1 (150 kDa) bind to the molecule. It was thought to be ALP 6 (286 kDa) in which the monomer ALP (136 kDa) and IgG1 were bound. On the other hand, the healthy person fraction did not react at all. The following can be said from the above experiment.
1) ALP 6 binds to the column using TNSALP as an antigen site in anti-3-29-3R affinity chromatography, and the binding between ALP and immunoglobulin is released with glycine buffer (pH 2.0) used for elution. It became a fraction sample.
2) The TNSALP and immunoglobulin separated in 1) were again converted to a polymerized ALP complex in vitro by neutralization. This was proved by Western blotting by native PAGE that there was a band that reacted with both ALP and IgG in the high molecular weight range. Therefore, antibody 3-29-3R recognizes and binds TNSALP regardless of whether IgG is bound or not, and reacts with a labeled secondary antibody that recognizes IgG that was autoimmunely bound to TNSALP. ALP 6 was shown to be measurable.
[0037]
Reference example 3
In serum by immunoenzyme activity assay TNSALP Value measurement
Monoclonal antibodies 3-29-3R and 1A5-7 prepared and purified by the above method are dispensed onto Nunc plates in 2 μg / 100 μL PBS in the same manner as in Reference Example 1 and blocked to prepare an antibody-binding plate. did. Prior to use, the plate was washed once with 200 μL of 100 mM Tris buffer (pH 7.5) containing 0.05% Tween 20, and 10 μL of informed consent volunteers and patient samples and 100 mM Tris were added. 90 μL of buffer solution (pH 7.5) was added and reacted at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction, the plate was washed 3 times with 200 μL of 100 mM Tris buffer (pH 7.5) containing 0.05% Tween 20. Next, add 100 μl of N-test ALP Kind-King reagent (Nittobo) substrate solution (ie, a solution containing disodium phenylphosphate and 4-aminoantipyrine) to the plate and add 1 more at 37 ° C, pH 10. The enzyme reaction was performed for a time. Further, 100 μL of a coloring reagent (solution containing sodium metaperiodate) was added to the reaction solution, and the TNSALP value was determined by colorimetrically comparing the coloring value at 492 nm. High-value samples exceeding the measurement range were diluted and remeasured.
Table 3 shows the results of TNSALP values obtained using monoclonal antibodies 3-29-3R and 1A5-7. These results were compared with the total ALP activity value (JSCC compliant value).
[0038]
[Table 3]

[0039]
The TNSALP value obtained using monoclonal antibody 3-29-3R and the total ALP activity value are strongly different from each other in the sample 15 data. On the other hand, there is a strong correlation between the TNSALP value obtained using monoclonal antibody 1A5-7 and the total ALP activity value (JSCC compliant value), including the sample 15 data. In other words, the TNSALP activity value obtained using antibody 3-29-3R differs from the total ALP activity value in that it does not include the placental type ALP or small intestine type ALP activity values. ALP increases due to increased ALP and increased ALP due to small intestine type secretion (ALP) after meals of blood group O and B. Therefore, use of antibody 3-29-3R as the primary antibody is considered to be more advantageous when ALP 6 is measured by ELISA.
[0040]
Example 1
Using various secondary antibodies ELISA By law ALP 6 Measurement
In order to investigate the affinity of various antibodies for immunoglobulins in ALP 6, ALP 6 was measured by ELISA using various antibodies as secondary antibodies. As a result, the best results were obtained when a human IgG1 monoclonal antibody was used as the secondary antibody. This will be described in detail below.
Using two types of antibodies 3-29-3R and 1A5-7 plates as the primary antibody, (1) 200-fold diluted HRP-labeled anti-human IgG1 monoclonal antibody (Dainippon Pharmaceutical), 2) 200-fold diluted HRP-labeled anti-human IgM monoclonal antibody (Dainippon Pharmaceutical), (3) 1 / 200-diluted HRP-labeled anti-IgA monoclonal antibody (Zymed), (4) 250-fold diluted HRP-labeled anti-human immunoglobulin polyclonal antibody (Dako), (5) 500-fold diluted HRP-labeled anti-human immunoglobulin polyclonal antibody (Dako) was used. As the sample, the same sample as in Reference Example 3 was used. First, the antibody 3-29-3R or 1A5-7 plate was washed once with 200 μL of 100 mM Tris buffer (pH 7.5) containing 0.05% Tween 20. Then, 30 μL of healthy volunteers and patient specimens with informed consent and 70 μL of 100 mM Tris buffer (pH 7.5) were added to these plates and reacted at room temperature for 1 hour. After completion of the primary antibody reaction, the plate is washed 3 times with 200 μL of 100 mM Tris buffer (pH 7.5) containing 0.05% Tween 20, and 100 μl of the various secondary labeled antibodies described in (1) to (5) above are added. The mixture was further reacted at 37 ° C for 1 hour. After washing for 1 hour, react with the substrate solution (OPD solution) for labeled HRP. After a certain time, add 100 μL of color stop reagent 1 N sulfuric acid and colorize the color value at 492 nm. The value was determined.
[0041]
As a result, the same results were obtained for the immunoglobulin site recognition substance regardless of whether the primary antibody was 3-29-3R or 1A5-7. That is, when an anti-IgG1 monoclonal antibody was used as a secondary antibody, a result well correlated with the result of electrophoresis was obtained (the result will be described in detail in Example 2). On the other hand, the anti-IgM antibody and the anti-IgA antibody hardly developed color and were not different from the blank. Furthermore, in the experimental group using an immunoglobulin polyclonal antibody as the secondary antibody, the absorbances were all increased to about 1.5 and 2.6, respectively, and the results were unclear. From the above, it was found that most of the autoimmune-like immunoglobulins bound to ALP are IgG1, and IgM and IgA are not so bound. Therefore, it has been found that the use of an antibody capable of binding IgG1 as the secondary antibody gives particularly good results.
[0042]
Example 2
ELISA Method, multiplicative value method ALP6 Values and comparison with electrophoretic detection
Using antibody 3-29-3R and antibody 1A5-7 as the primary antibody and anti-IgG1 monoclonal antibody as the secondary antibody, ALP 6 value by ELISA method and ALP 6 value by multiplicative value were determined. The ALP 6 value by ELISA was determined by the same method as in Example 1. Also, the ALP 6 value by the multiplicative value was obtained by calculating the multiplicative value of the “ALP 6 value by ELISA method” and the “TNSALP value shown in Table 3”. For comparison, ALP 6 was determined by capillary isoelectric focusing, and TNSALP was determined to be predominant between liver and bone. These results are shown in Table 4 and FIG. Among them, in particular, the actual results of electrophoresis for specimens 9 to 12 are shown in FIG.
[0043]
[Table 4]

[0044]
From the results in Table 4, it was found that when measuring ALP 6 values, the multiplicative value method more closely matched the result of electrophoresis than the ELISA method. When antibody 3-29-3R was used as the primary antibody, the ELISA value and multiplicative value of ALP 6 correlated particularly well with the results of electrophoresis. This indicates that in the present invention, it is particularly preferable to use a monoclonal antibody that specifically binds TNSALP as the alkaline phosphatase site recognition substance. In addition, the determination of TNSALP by electrophoresis revealed that the ALP 6 value of the present invention tended to be positive when hepatic ALP was dominant in bone type ALP and the ALP 6 value of the present invention. .
Therefore, antibody 3-29-3R recognizes and binds TNSALP regardless of whether IgG is bound or not, and reacts with a labeled secondary antibody that recognizes IgG that was autoimmunely bound to TNSALP. It has been shown that ALP 6 can be measured particularly accurately.
From the above results, it became possible to perform ALP 6 precise measurement using the reaction system example of the present invention (primary antibody: human TNSALP-recognizing monoclonal antibody, secondary labeled antibody: HRP-labeled anti-human IgG1 monoclonal antibody).
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of Western blotting and SDS-PAGE. You can see the ALP 6 band on the arrow. The dimer ALP (136 kDa) and IgG (150 kDa) bound molecule can be confirmed at about 286 kDa, and the monomeric ALP (68 kDa) and IgG bound molecule can be confirmed at 218 kDa.
FIG. 2 compares the ALP 6 value according to the multiplicative value method of the present invention and the determination of electrophoresis. As a result, the combination of TNSALP-recognizing antibody 3-29-3R and secondary antibody HRP-labeled anti-IgG1 correlated particularly well with the electrophoretic results.
FIG. 3 shows the results of capillary electrophoresis.

Specimens

9, 10, and 11 have a strong liver type and 12 have a strong bone type. ALP 6 was strongly positive in specimens Nos. 10 and 11, No. 9 was positive, and No. 12 showed almost no ALP 6.

Claims

A method for measuring alkaline phosphatase 6 in a sample, comprising alkaline phosphatase 6 in a sample, an alkaline phosphatase site recognition substance that recognizes an alkaline phosphatase site that is a component of alkaline phosphatase 6, and a component of alkaline phosphatase 6 It is characterized in that alkaline phosphatase 6 is measured from the level of the resulting alkaline phosphatase site recognition substance and the combination of alkaline phosphatase 6 and immunoglobulin site recognition substance by reacting with an immunoglobulin site recognition substance that recognizes the immunoglobulin site. A method for measuring alkaline phosphatase 6.

2. The method according to claim 1, wherein the alkaline phosphatase site recognition substance is a substance capable of binding to human organ non-specific alkaline phosphatase.

The method according to claim 2, wherein the substance capable of binding to human organ non-specific alkaline phosphatase is an anti-human organ non-specific alkaline phosphatase monoclonal antibody.

4. The method according to claim 1, wherein the immunoglobulin site recognition substance is a substance capable of binding to IgG1.

The method according to claim 4, wherein the substance capable of binding to IgG1 is an anti-human IgG1 monoclonal antibody.

A method for measuring alkaline phosphatase 6 in a sample, comprising reacting alkaline phosphatase 6 in a sample with an antibody that reacts with human organ non-specific alkaline phosphatase, followed by antigen-antibody reaction and alkaline phosphatase Reaction of an immunoglobulin site recognition substance that recognizes the immunoglobulin site, which is a component of component 6, and the resultant antibody-reactive human organ non-specific alkaline phosphatase-binding product of alkaline phosphatase 6 and the immunoglobulin site recognition substance A method for measuring alkaline phosphatase 6, which comprises measuring alkaline phosphatase 6 from the level.

The method according to claim 6, wherein the immunoglobulin site recognition substance is a substance capable of binding to IgG1.

The method according to claim 7, wherein the substance capable of binding to IgG1 is an anti-human IgG1 monoclonal antibody.

A method for measuring alkaline phosphatase 6 in a sample, comprising:
i) Human organ non-specific alkaline phosphatase in a specimen is antigen-antibody reacted with an antibody that reacts with human organ non-specific alkaline phosphatase, and then the antigen-antibody-reacted human organ non-specific alkaline phosphatase is converted into an enzyme substrate for alkaline phosphatase From the level of the enzyme activity that was reacted, the human organ non-specific alkaline phosphatase activity in the sample was determined,
ii) Independently of i) above, the level of alkaline phosphatase 6 in the sample is determined by the method of any one of claims 6 to 8,
iii) Multiply the non-human organ-specific alkaline phosphatase activity value obtained in i) above by the level value of alkaline phosphatase 6 obtained in ii) above, and determine the amount of alkaline phosphatase 6 in the sample from the multiplicative value. Ask,
A method for measuring alkaline phosphatase 6, characterized in that:

A kit for measuring alkaline phosphatase 6 in a sample,
i) a solid support,
ii) an alkaline phosphatase site recognition substance that recognizes an alkaline phosphatase site that is a constituent of alkaline phosphatase 6;
iii) a labeled immunoglobulin site recognition substance that recognizes an immunoglobulin site that is a component of alkaline phosphatase 6; and
iv) components for detecting the label,
Including kit.

The kit according to claim 10, wherein the alkaline phosphatase site recognition substance is a substance capable of binding to a human organ non-specific alkaline phosphatase.

The kit according to claim 11, wherein the substance capable of binding to human organ non-specific alkaline phosphatase is an anti-human organ non-specific alkaline phosphatase monoclonal antibody.

The kit according to any one of claims 10 to 12, wherein the immunoglobulin site recognition substance is a substance capable of binding to IgG1.

The kit according to claim 13, wherein the substance capable of binding to IgG1 is an anti-human IgG1 monoclonal antibody.