JP4085410B2

JP4085410B2 - Kidney stem cell / progenitor cell, method for separating kidney stem cell / progenitor cell, and method for treating kidney disease

Info

Publication number: JP4085410B2
Application number: JP2003071029A
Authority: JP
Inventors: 真治喜多村; 康司山▲崎▼; 洋平前島; 博史槇野
Original assignee: 株式会社バイオリンクインク
Priority date: 2003-03-14
Filing date: 2003-03-14
Publication date: 2008-05-14
Anticipated expiration: 2023-03-14
Also published as: JP2004275079A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳動物の腎臓から分離される腎臓幹細胞／前駆細胞、哺乳動物の腎臓から腎臓幹細胞／前駆細胞を分離する方法、及び腎臓幹細胞／前駆細胞を利用した腎臓の治療方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
腎臓とは、主に排泄機能、内分泌機能、調節機能をもつ臓器であり、ホルモンを生成して分泌したり、尿を生成する。ヒトでは、腎臓は、腹腔の背側に２個存在しており、それぞれ膀胱まで伸びた尿管を有している。
【０００３】
腎臓には、ネフロンと呼ばれる基本構造が約１００万個ある。ネフロンは、血液から老廃物を含む水分を濾過し、原尿を生成する糸球体を備えている。糸球体で生成された原尿は、近位尿細管、ヘンレのループ、遠位尿細管、集合管を通過して尿管へ運ばれる。近位尿細管、ヘンレのループ、遠位尿細管では、ナトリウムや水分などを再吸収し、エリスロポイエチンや、ビタミンＤ３を活性化する。また、ネフロンの周囲には間質細胞などがある。原尿は、尿管へ運ばれるまでに約１００倍に濃縮された後、尿管を通過して膀胱まで運ばれ、膀胱から体外へ排泄される。
【０００４】
また、腎臓は、中間中胚葉から発生し、前腎、中腎、後腎の３段階を経て形成される。哺乳動物では、前腎及び中腎のほとんどが後に退行変性し、主に後腎から腎臓が生じる。後腎は、中腎の最も尾側に発生する尿管芽と呼ばれる突起の周りに間葉系細胞が集合して生じる。そして、尿管芽と間葉系細胞とが相互作用し、間葉系細胞が上皮化してＳ字体と呼ばれる状態を経ることによって、糸球体、近位尿細管、ヘンレのループ、遠位尿細管が発生する。また、集合管及び尿管上皮細胞などは、尿管芽より分化する。
【０００５】
近年、慢性腎不全の患者数が増加している。慢性腎不全は、腎臓における疾病又は腎臓以外の器官における疾病が原因で生じた腎臓障害が進行した病態であり、血液中に含有される尿毒素を除去する機能、内分泌機能、調節機能など、正常の腎臓が有する機能が廃絶する。
【０００６】
慢性腎不全が進行すると、正常の腎臓が有する機能が廃絶するために、体内の各臓器に影響が及び、尿毒症となる。具体的には、中枢神経障害、末梢神経障害、心・循環器障害、消化器障害、視力・眼障害、血液・凝固障害、免疫障害、内分泌障害、皮膚障害、骨・関節障害、電解質障害、酸塩基平衡障害などになる。
【０００７】
慢性腎不全は、進行性であり且つ治癒が不可能である。そのため、治療としては腎臓の機能が廃絶する速度を遅らせる保存的加療に主眼がおかれており、最終的には、人工透析や腎臓移植など、腎臓の機能を代替するための治療が必要となる（例えば、特許文献１）。
【０００８】
【特許文献１】
特開平６−１４２１９３号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、腎臓移植は、提供される腎臓の数が絶対的に不足しているために、実施が困難である。具体的に説明すると、新たに人工透析を受ける患者が１年間におよそ３万人であるのに対し、腎臓移植は１年間に約５００〜６００件しか行われていない。そこで、慢性腎不全の患者の大多数は、人工透析を受けている。
【００１０】
人工透析は、主に血液透析と腹膜透析との２つに分類される。
【００１１】
血液透析は、病院で行われ、内シャントという局所麻酔の手術で作った特別な血管に針を刺したり、透析用の管を首などの太い血管に挿入することなどにより、身体から少しずつ血液を取り出し、取り出した血液中に含まれる尿毒素をこし出す装置に通すことによって清浄化し、身体に返す方法である。
【００１２】
また、腹膜透析は、腹腔にカテーテルという管を埋め込んで、カテーテルから透析液を注入してしばらく貯留させることで血液中の尿毒素を透析液に溶け込ませ、尿毒素が溶け込んだ透析液を腹腔の外部に捨てるという操作を繰り返すことによって、血液を清浄化する方法である。
【００１３】
しかしながら、血液透析では、血液中の尿毒素は除去されるものの、内分泌機能、調節機能などの代替となる治療を行うことができない。また、身体の血を一度に全部抜くことはできないことから、少しずつ血液を抜き、抜いた血液を清浄化することとなるため、１回の透析に要する時間が長くなる。具体的には、１回に４時間から５時間程度の時間を要する。さらに、血液透析は、週に３回程度行う必要がある。したがって、血液透析を行うと、患者は、頻繁に通院しなくてはならなくなるとともに病院に拘束される時間が長くなるために、生活に負担がかかる虞がある。
【００１４】
また、腹膜透析では、自己管理ができるために、患者は通院回数を減らすことができるが、代謝障害を受け易いことや、腹膜への負担が大きくなることなどの問題が生じる。
【００１５】
さらに、慢性腎不全の患者は、人工透析を受けるために通院回数が多い。また、例えばカテーテルに埃がたまることで腹膜炎を起こすなどの理由により緊急治療室を訪れたり入院する可能性が高い。したがって、治療にかかる時間及び費用が大きくなり、慢性腎不全の患者とその家族には、多大な負担がかかる。
【００１６】
さらに、現在、人工透析を行う患者の数は約１８万人といわれており、人工透析にかかる医療費は、日本の総医療費の大きな割合を占めている。具体的には、日本の総医療費１３兆円に対して１兆円を占めている。また、人工透析を行う患者は、１年間に３万人増えている。したがって、今後人工透析にかかる医療費はさらに増大し、医療経済が圧迫されることが懸念される。
【００１７】
さらに、現在の医療では、腎疾患を根本的に治癒する方法も確立されていない。腎疾患の治癒方法が確立されていない理由としては、腎臓の形態が複雑であることに加えて、病態が多岐に及んでいることなどが挙げられる。例えば慢性腎炎では、ステロイドや免疫抑制剤を利用した免疫抑制療法、抗血小板剤を利用した方法、抗凝固剤を利用した方法などにより治療を行うが、治癒は困難である。したがって、腎疾患が生じたときには、患者に対して保存的加療を行うことに主眼をおくようになり、その後腎臓の機能が低下して腎不全となると、人工透析、腎臓移植を行う必要が生じる。
【００１８】
腎疾患を治癒する方法としては、腎臓移植の他に遺伝子療法などの研究が進められているが、例えばベクターによって副作用が生じるなどの問題点があり、研究の域を出ていない状態である。
【００１９】
本発明は、以上説明した従来の実状を鑑みて提案されたものであり、腎臓に分化可能であり未分化な細胞である腎臓幹細胞／前駆細胞、及び当該腎臓幹細胞／前駆細胞の分離方法、及び腎臓疾患の治癒方法を提供することを目的とする。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
本願発明者等は、上述の目的を達成するために鋭意検討を重ね、腎臓に高い増殖能を有する細胞が存在することを確認し、この高い増殖能を有する細胞を腎臓から分離した。そして、さらに検討した結果、分離した細胞は、増殖能、自己複製能、分化能を有することが判明した。
【００２１】
すなわち、本発明に係る腎臓幹細胞／前駆細胞は、哺乳動物の腎臓から分離され、増殖能、自己複製能、分化能を有することを特徴とする。
【００２２】
また、本発明に係る腎臓幹細胞／前駆細胞の分離方法は、腎臓を各部位毎に分離する分離ステップと、上記分離ステップで分離された各部位の細胞を単離する単離ステップと、上記分離ステップで分離された各部位の細胞を、支持細胞又は支持細胞培養液を含む培養液中で培養し、増殖能が高い細胞を得る培養ステップとを備えることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明を適用した腎疾患の治療方法は、哺乳動物の腎臓から分離され、増殖能、自己複製能、分化能を有する腎臓幹細胞／前駆細胞を、機能が低下している腎臓に移植することを特徴とする。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００２５】
腎臓幹細胞／前駆細胞が存在する部位の同定
図１に示すように、腎臓中のネフロン１は、腎動脈から分岐した輸出入細動脈、内皮細胞、上皮細胞、メサンギウム細胞、ボーマン嚢上皮細胞よりなる糸球体２を備えている。糸球体２は、血液を濾過して原尿を生成する。糸球体２で生成された原尿は、ボーマン嚢３により集められ、近位尿細管４、ヘンレのループ５、遠位尿細管６、集合管７を通過して尿管へと運ばれる。近位尿細管４は、ボーマン嚢３に続いておりまっすぐに伸びているＳ１セグメント１１と、Ｓ１セグメント１１に続いており屈曲したＰＣＴ（proximal convoluted tubules）１２と、ＰＣＴ１２に続いており皮質に入ってから皮髄境界まで比較的まっすぐに伸びているＳ２セグメント１３と、Ｓ２セグメント１３に続いており皮髄境界からヘンレのループ５まで伸びているＳ３セグメント１４とからなる。また、ネフロン１の周囲には間質細胞などがある。
【００２６】
糸球体２で生成された原尿は、尿管へ運ばれるまでに約１００倍に濃縮される。具体的に説明すると、原尿は、約１日１５０ｌ生成されるが、濃縮されることにより約１．５ｌとなる。
本実施の形態では、最初に、ネフロン１における増殖能を有する細胞の存在位置を確認した。
【００２７】
先ず、約８〜１０週齢である正常なSprague-Dawleyラット（以下、ＳＤラットという。）を準備し、２つのグループに分ける。そして、一方のグループに属するＳＤラットを虚血性急性腎不全とする。なお、以下では、虚血性急性腎不全であるＳＤラットを虚血性急性腎不全モデルという。虚血性急性腎不全モデルは、先ず左腎臓の腎動脈を４０分間駆血することによって左腎臓を虚血し、左腎臓を虚血している間に右腎臓を摘出し、最後に虚血を解除することによって作成した。虚血性急性腎不全モデルは、通常腎不全モデルとして使われている。虚血性急性腎不全モデルは、虚血してから４日後に、近位尿細管４、ヘンレのループ５、遠位尿細管６などが壊死を起こして脱落するが、再生することが知られている。また、他方のグループに属するＳＤラットには、偽手術を施す。
【００２８】
次に、生理食塩水で希釈したブロモデオキシウリジン（以下、ＢｒｄＵという。）を、両方のグループに属する全てのＳＤラットの腹腔内に、体重１ｋｇあたりＢｒｄＵが５０ｍｇとなるように投与した。
【００２９】
そして、ＢｒｄＵを投与してから１週間後に、両方のグループに属する全てのＳＤラットを屠殺して左腎臓を摘出し、摘出した腎臓の切片を作成した。
【００３０】
次に、摘出した腎臓の切片をＢｒｄＵ染色する。具体的に説明すると、先ず、プロテナーゼＫ（Sigma社製）によってＤＮＡを露出させる。次に、０．３％Ｈ_２Ｏ_２とメタノールとを３対１０００の割合で混合した溶液によって内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害した後、ＰＢＳにて洗浄する。次に、３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で予備インキュベートを行うことにより、切片をブロッキングする。次に、１次抗体である抗ＢｒｄＵ抗体（Sigma社製）と反応させた後、２次抗体であるビオチン標識抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ抗体（ニチレイ社製）と反応させ、ＤＡＢ発色キットによって発色させる。
【００３１】
ＢｒｄＵ染色した切片を位相差顕微鏡によって４００倍の視野で観察し、染色されている細胞の数を各部位毎にカウントしたところ、図２に示すように、第１のグループに属するＳＤラットすなわち急性腎不全モデルであるＳＤラットのＳ３セグメント１４に、ＢｒｄＵ染色されている細胞が多く観察された。なお、図２中Ｉは第１のグループに属するＳＤラットにおいてＢｒｄＵ染色されている細胞の数を示し、図２中ＩＩは第２のグループに属するＳＤラットにおいてＢｒｄＵ染色されている細胞の数を示す。また、図２の縦軸は、４００倍の倍率で切片を観察したときに数えられる細胞数を示している。
【００３２】
以上の結果に基づき、Ｓ３セグメント１４に高い増殖能を有する細胞が存在することが判明した。
【００３３】
腎臓幹細胞／前駆細胞の分離方法
つぎに、腎臓から高い増殖能を有する細胞を分離する。
【００３４】
先ず、約８〜１０週齢であるＳＤラットを準備し、腎臓を摘出する。また、表１（Ａ）に示す組成であるSolution Aと、表２に示す組成であるSolution Bとを、それぞれ別々の注射器に入れて氷冷する。本実施の形態では、solution Aとsolution Bとを２０ｍｌずつ使用する。また、残りのSolution Aを冷却する。なお、表１（Ａ）中Inorganic Mixは、表１（Ｂ）に示す終濃度となるように、ＮａＣｌと、ＣＨ_３ＣＯＯＮａと、ＮａＨ_２ＰＯ_４（２Ｈ_２Ｏ）と、ＭｇＳＯ_４（７Ｈ_２Ｏ）とを、５０ｍｌの蒸留水に対して添加したものである。
【００３５】
【表１】

【００３６】
【表２】

【００３７】
次に、摘出した腎臓の大動脈（aorta）から腎臓の動脈（lt renal artery）へ、注射器に入れ氷冷してあるSolution AとSolution Bとを、順次注入する。
【００３８】
次に、腎臓を、冷却したSolution Aに浸漬し、切片を切り出す。
【００３９】
次に、切り出した切片を、Solution B３ｍｌにＶＲＣ１５０μｌを添加したSolution B1に浸漬し、３７℃で１０分間、Ｏ_２を注入しながらインキュベートする。インキュベートするときには、時々Ｏ_２がでていることを確認する。
【００４０】
次に、Solution B1を捨て、切片を、Solution A１９ｍｌに対してＶＲＣ（Ribonucleoside Vanadyl complexes ２００ｍＭ溶液；Sigma社製）４００μｌを添加したSolution A1に浸漬し、冷却する。
【００４１】
次に、２〜３ｍｌのSolution A1が入れられたペトリ皿に切片を入れ、ミクロディスセクション（microdissection）を行い、腎臓を各部位毎に分別する。
【００４２】
そして、ミクロディスセクションにより得られた各部位を、表面をtypeIVコラーゲン（ＢＤバイオサイエンス社製）でコートした９６ウェルプレートに播種し、それぞれ４．５ｇ／ｌグルコースを含有するダルベッコ改変イーグル培地に１０％ウシ胎児血清（以下、ＦＣＳという。）を添加した培養液中で洗浄した後、以下の表３に示す組成の培養液中で２日に１回培養液を交換しながら１週間培養することにより、細胞が生える。本実施の形態では、各部位ともに約８０％の細胞が生えた。なお、ダルベッコ改変イーグル培地（以下、ＤＭＥＭという。）としては、Sigma社製のものを使用した。
【００４３】
【表３】

【００４４】
なお、表３に示す支持細胞培養液は、支持細胞を、４．５ｇ／ｌのグルコース入りのＤＭＥＭに、１０％のＦＣＳと１００ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリンＧと１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンとを添加した培養液中で、２日間支持細胞を培養した後の培養液を、フィルタに通したものである。また、ＩＴＳ−ｍｉｘはGibco社製であり、インスリン、トランスフェリン、セレニウムを含有する。また、ＨＧＦは、肝細胞増殖因子であり、Sigma社製である。
【００４５】
なお、以下の表４に示す組成の培養液を、K-1mediumという。すなわち、表３に示す培養液には、K-1mediumが含有されている。
【００４６】
【表４】

【００４７】
次に、生えた細胞をマイクロウェル法により単細胞とし、表面をtypeIVコラーゲン（ＢＤバイオサイエンス社製）でコートした９６ウェルプレートに播種し、表３に示す組成の培養液中で各細胞毎に培養すると、図３（Ａ）に示すように、Ｓ３セグメント１４の細胞からは、高い増殖能を示す細胞が得られる。また、本実施の形態では、図３（Ｂ）〜（Ｄ）に示すように、他の部位からは、特に高い増殖能を示す細胞は得られなかった。
【００４８】
本実施の形態では、Ｓ３セグメント１４から得られた細胞のうち０．８％は高い増殖能を示し、細胞倍化時間が約１０〜１６時間であった。
【００４９】
また、以上説明したようにＳ３セグメント１４から得られた細胞の外観を倒立型リサーチ顕微鏡power ＩＸ-71（以下、単に顕微鏡という。）で観察したところ、図４に示すような敷石状形状であった。
【００５０】
幹細胞及び前駆細胞は、高い増殖能、自己複製能、分化能をもつ細胞であるため、以下では、上述した方法によってＳ３セグメント１４から分離された細胞の増殖能をさらに検討するとともに、自己複製能、分化能について検討した。
【００５１】
腎臓幹細胞／前駆細胞の増殖能
つぎに、以上説明した方法によって分離された細胞の増殖能を調べる。
【００５２】
上述した方法によって生えた各部位の細胞を、マイクロウェル法により単細胞にし、表面をtypeIVコラーゲン（ＢＤバイオサイエンス社製）でコートしたスライドガラスに播種し、表３に示す組成の培養液中で各細胞毎に培養したところ、Ｓ３セグメント１４より得られた細胞からは、他の部位と比較して３個以上の細胞からなるコロニーが多く形成された。
【００５３】
具体的には、図５（Ａ）に示すように、培養後２４時間が経過したときには、Ｓ３セグメント１４より得られた細胞からは、３個以上の細胞からなるコロニーが１２０ウェルあたり１１ユニット形成されたのに対し、Ｓ２セグメント１３より得られた細胞からは、３個以上の細胞からなるコロニーが１２０ウェルあたり１ユニットしか形成されず、さらに、ヘンレのループ５及び糸球体２より得られた細胞からは、３個以上の細胞からなるコロニーがほとんど形成されなかった。また、培養後４８時間が経過したときには、図５（Ｂ）に示すように、Ｓ３セグメント１４より得られた細胞からは、３個以上の細胞からなるコロニーが１２０ウェルあたり２０ユニット形成されたのに対し、Ｓ２セグメント１３より得られた細胞からは、３個以上の細胞からなるコロニーが１２０ウェルあたり３ユニットしか形成されず、さらに、ヘンレのループ５及び糸球体２より得られた細胞からは。３個以上の細胞からなるコロニーが２ユニットしか形成されなかった。
【００５４】
すなわち、Ｓ３セグメント１４から分離した細胞（以下、高増殖能細胞）は、増殖能が高いと考えられる。
【００５５】
細胞表面マーカーの検出
つぎに、高増殖能細胞の表面に発現しているマーカーを検出する。
【００５６】
先ず、高増殖能細胞を、表面をtypeIVコラーゲンでコートした１２ウェルのチャンバースライドに播種し、表３に示す組成の培養液で１４日間培養した後、チャンバースライドを風乾し、ＰＢＳで洗浄する。
【００５７】
次に、チャンバースライドを５つのグループに分け、それぞれ１次抗体である抗aquaporin-1（以下、AQP-1という。）抗体（ケミコン社製）、抗h-met抗体（サンタクルツ社製）、抗Vimentin抗体（Sigma社製）、抗E-cadherin（以下、E-cadという。）抗体（サンタクルツ社製）、抗pan-cytokeratin抗体（サンタクルツ社製）が添加されたＰＢＳ中でインキュベートする。
【００５８】
なお、AQP-1は近位尿細管４の細胞のマーカーであり、pan-cytokeratin及びE-cadは上皮細胞のマーカーである。また、Vimentinは発生時のみに発現する間葉系細胞のマーカーである。また、h-metは、再生時に働くとされている肝細胞増殖因子に対するレセプターであるc-metを認識する抗体である。
【００５９】
次に、抗AQP-1抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートされたチャンバースライド、抗h-met抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートされたチャンバースライド、抗E-cad抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートされたスライドを、それぞれ２次抗体であるＦＩＴＣ標識抗ラビットＩｇＧ抗体（ケミコン社製）が添加されたＰＢＳ中でインキュベートする。また、抗Vimentin抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートされたチャンバースライド、抗pan-cytokeratin抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートされたチャンバースライドを、それぞれ２次抗体であるロダミン標識抗ラットＩｇＧ抗体（ケミコン社製）が添加されたＰＢＳ中でインキュベートする。
【００６０】
以上の処理を施した各チャンバースライドを蛍光顕微鏡で観察したところ、高増殖能細胞では、図６に示すように、間葉系細胞のマーカーであり発生時に発現するVimentin、上皮細胞のマーカーであるpan-cytokeratinが強く発現していた。また、再生因子のレセプターであるE-cadも強く発現していた。また、近位尿細管４のマーカーであるAQP-1、上皮細胞のマーカーであるE-cadについては、弱い発現を示した。
【００６１】
すなわち、高増殖能細胞は、近位尿細管４を構成するＳ３セグメント１４に存在する細胞であるにも拘わらず近位尿細管４の形質を示していないことから、未分化である可能性が示唆された。また、再生因子に対するレセプターを発現していることから、分化能を有する可能性が示唆された。
【００６２】
未分化マーカーの発現の検討
つぎに、未分化な細胞のマーカーであるといわれているPax-2、Wnt-4の発現を検討した。
【００６３】
まず、ｍＲＮＡを抽出することにより、Pax-2、Wnt-4の発現を検討した。
【００６４】
先ず、高増殖能細胞を、表面をtypeIVコラーゲンでコートした直径１０ｃｍのポリスチレンプレートに播種し、表３に示す培養液中で細胞を培養して回収する。
【００６５】
そして、Rneasy Midi Kit（QIAGEN社製）を使用して高増殖能細胞からｍＲＮＡを抽出し、得られたｍＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを得る。
【００６６】
次に、J. Am. Soc. Nephrol. 2002 Dec;13(12):2850-2859に記載されている方法に従いながら、ｃＤＮＡを増幅する。なお、文献中では全容積を１００μｌとしているが、本実施の形態では５０μｌとした。
【００６７】
次に、配列番号１に示すセンスプライマーと、配列番号２に示すアンチセンスプライマーとを使用して、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で５９秒間のサイクルを３０回繰り返すＰＣＲを行い、Pax-2のｃＤＮＡを増幅する。
【００６８】
また、配列番号３に示すセンスプライマーと、配列番号４に示すアンチセンスプライマーとを使用して、９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、７２℃で３０秒間のサイクルを３０回繰り返すＰＣＲを行い、Wnt-4のｃＤＮＡを増幅する。
【００６９】
次に、ＰＣＲによって増幅されたそれぞれのｃＤＮＡを、１．２％アガロースゲル電気泳動によって分離する。増幅されたｃＤＮＡのサイズは、図７に示すように、Pax-2は３８９ｂｐであり、Pax-2をコードするＤＮＡのサイズと同じであった。また、Wnt-4は３６６ｂｐであり、Wnt-4をコードするＤＮＡのサイズと同じであった。
【００７０】
つぎに、タンパク質を抽出することにより、Pax-2、Wnt-4の発現を検討する。
【００７１】
先ず、高増殖能細胞を、表面をtypeIVコラーゲンでコートした直径１０ｃｍのポリスチレンプレートに播種し、表３に示す培養液中で細胞を培養して回収する。
【００７２】
次に、表５に示す組成のバッファで高増殖能細胞を破砕し、遠心して上清を取ることにより、タンパク質の抽出液を得る。
【００７３】
【表５】

【００７４】
次に、抽出液中のタンパク質を、ポリアクリルアミドの濃度が１０％であるゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、ウェスタンブロッティングによりゲルからＰＶＤＦ膜へ転写する。
【００７５】
なお、本実施の形態では、陰性対照となり、J. Am. Soc. Nephrol. 1996 Nov; 7(11): 2357-63に記載されているヒトメサンギウム細胞（以下、ＨＭＣという。）についても、タンパク質の抽出液を作成し、抽出液中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、ウェスタンブロッティングによりゲルからＰＶＤＦ膜へ転写した。
【００７６】
次に、ＰＶＤＦ膜を、Ｔｗｅｅｎ１ｍｌが加えられたＴＢＳ１ｌのうち５０ｍｌに、２．５ｇのスキムミルクを添加したブロッキング緩衝液中に浸漬してブロッキングを行う。
【００７７】
そして、１次抗体である抗Pax-2ポリクローナル抗体（Berkeley antibody company製）、又は抗Wnt-4抗体（サンタクルツ製）と反応させた後、２次抗体であるＨＲＰ標識抗ラビットＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch製）と反応させる。
【００７８】
そして、ウェスタンブロッティング検出システム（ECL western blotting detection reagent；アマシャム社製）に従った反応を行い、Ｘ線フィルムに露光させることにより、図８（Ａ），（Ｂ）に示すように、Pax-2及びWnt-4の両方が確認された。また、ＨＭＣでは、Pax-2及びWnt-4ともに発現していないことが確認された。
【００７９】
したがって、高増殖能細胞は、Pax-2及びWnt-4が発現していることから、未分化である可能性が示唆された。
【００８０】
高増殖能細胞の cell line の作成
以上説明したように、高増殖能細胞は、増殖能が高く、自己複製能、分化能を有することから、腎臓への分化が可能である腎臓幹細胞又は腎臓前駆細胞（以下、腎臓幹細胞／前駆細胞という。）である可能性がある。そこで、高増殖能細胞をcell line化した。
【００８１】
高増殖能細胞に対してリポフェクション法によりＳＶ４０遺伝子を組み込むことで、高増殖能細胞をcell line化する。具体的には、ＦｕＧＥＮＥ６（ロシュダイアグノシス社製）を使用して、高増殖能細胞をcell line化した。高増殖能細胞の外観は、ＳＶ４０遺伝子を組み込んだときにも敷石形状を保ったままであった。なお、以下では、cell line化した高増殖能細胞を、ｒＫＳ（Rat Kidney Stem cell line）５６という。
【００８２】
腎臓幹細胞／前駆細胞の自己複製能
つぎに、ｒＫＳ５６の自己複製能について検討する。
【００８３】
一般に細胞は、培養するだけで自然に不死化することはなく、３０〜５０世代、期間で示すと約９０日で分裂停止期に入り、継代できなくなり死ぬ。
【００８４】
しかし、ｒＫＳ５６を、表面をtypeIVコラーゲンでコートした９６ウェルプレートに播種し、表３に示す培養液中で培養しながら継代し続けたところ、図９に示すように、１５０日継代しても細胞の増殖能や外観が保たれていた。
【００８５】
また、ｒＫＳ５６に、vybrant cell-labeling solution（Molecular purobe社製）を使用してＤｉＯ色素を取り込ませ、表面をtypeIVコラーゲンでコートした９６ウェルプレートに播種し、表３に示す組成の培養液中で低密度培養を行って顕微鏡で観察したところ、図１０（Ａ）に示すように、ＤｉＯ色素が取り込まれた高増殖能細胞（以下ＤｉＯ細胞という。）が増殖した（１継代目）。次に、増殖したＤｉＯ細胞を回収して単細胞とし、再び低密度培養したところ、図１０（Ｂ）に示すように、ＤｉＯ細胞が再び増殖した（２継代目）。再度、増殖したＤｉＯ細胞を回収して単細胞とし、再び低密度培養したところ、図１０（Ｃ）に示すように、ＤｉＯ細胞が再び増殖した（３継代目）。
【００８６】
なお、図１０中ＬＭは、低密度培養した細胞を光学顕微鏡によって観察した画像であり、ＦＬは蛍光顕微鏡によって観察した画像であり、ｍｅｒｇｅ１は光学顕微鏡によって観察した画像と蛍光顕微鏡によって観察した画像との二重像である。なお、図１０（Ｂ）は、図１０（Ａ）ＦＬ中において四角で囲った細胞を低密度培養した状態を示した図であり、図１０（Ｃ）は、図１０（Ｂ）において発光している細胞を低密度培養した状態を示した図である。
【００８７】
以上説明した結果より、高増殖能細胞は、自己複製能をもつと考えられる。
【００８８】
ｒＫＳ５６の分化能の検討
つぎに、ｒＫＳ５６の分化能について検討する。
【００８９】
先ず、ｒＫＳ５６を、表面をtypeIVコラーゲンでコートした９６ウェルプレートに播種し、以下の表６中Ａ〜Ｈに示す組成の培養液で、７日間培養する。
【００９０】
【表６】

【００９１】
なお、表６中Ｄで示す条件は、通常の培養液である。なお、表６中ＬＩＦは、白血病阻害因子である。
【００９２】
そして、培養したｒＫＳ５６について、細胞数の変化、細胞の形状、副甲状腺ホルモン（以下、ＰＴＨという。）及びバソプレシン（以下、ＡＶＰという。）に対する反応性を調べる。
【００９３】
細胞数と細胞の形状は、顕微鏡でスライドガラスの表面を観察することによって調べる。また、ＰＴＨ及びＡＶＰに対する反応性は、アマシャム社のcAMP enzymeimmunoassay (EIA) systemによりｃＡＭＰ量を測定することによって調べる。
【００９４】
細胞数の変化、細胞の形状、ＰＴＨに対する反応性、ＡＶＰに対する反応性を調べた結果、図１１に示すように、表６中Ｂの条件で培養したときに、細胞数の増加が顕著に見られた。また、細胞の形状は敷石形状であり、変化が見られなかった。また、表６中Ｂ、Ｆの条件で培養したときには、図１２（Ａ），（Ｂ）に示すように、図１２（Ｃ）に示す通常の培養液で培養した結果と比較して、ＡＶＰ及びＰＴＨに反応してｃＡＭＰの量が増加するが、ＰＴＨに対する反応性がＡＶＰに対する反応性よりもさらに高く、ＰＴＨ及びＡＶＰに対する反応性が近位尿細管４の細胞の反応性に類似していた。
【００９５】
また、表６中Ｅの条件で培養したときには、細胞の形状は敷石形状であり、変化は見られなかった。しかし、図１２（Ｄ）に示すように、通常の培養液で培養した結果と比較して、ＡＶＰ及びＰＴＨに反応してｃＡＭＰの量が増加するが、ＡＶＰに対する反応性がＰＴＨに対する反応性よりもさらに高く、ＰＴＨ及びＡＶＰに対する反応性が、ヘンレのループ５の細胞、遠位尿細管６の細胞の反応性に類似していた。すなわち、ｒＫＳ５６は、分化能を有する可能性が示唆された。
【００９６】
支持細胞培養液存在下でのｒＫＳ５６の分化
つぎに、ｒＫＳ５６の形質保持因子であると考えられる支持細胞の培養液の存在下でｒＫＳ５６を培養したときと、支持細胞の培養液の非存在下でｒＫＳ５６を培養したときとのｒＫＳ５６の分化の違いについて検討した。
【００９７】
先ず、ｒＫＳ５６を、表面をtypeIVコラーゲンでコートした直径１０ｃｍのプリスチレンプレートに播種し、以下の表７中Ｊ、Ｋに示す組成の培養液で７日間培養すし、回収する。
【００９８】
【表７】

【００９９】
次に、表５に示す組成のバッファでｒＫＳ５６を破砕し、遠心して上清を取ることにより、Ｊに示す組成の培養液で培養したｒＫＳ５６中のタンパク質の抽出液（以下、Ｊ抽出液という。）と、Ｋに示す組成の培養液で培養したｒＫＳ５６中のタンパク質の抽出液（以下、Ｋ抽出液という。）とを得る。
【０１００】
次に、抽出液中のタンパク質を、ポリアクリルアミドの濃度が１０％であるゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、ウェスタンブロッティングによりゲルからＰＶＤＦ膜へ転写する。そして、ＰＶＤＦ膜をブロッキング緩衝液中に浸漬してブロッキングを行う。
【０１０１】
次に、１次抗体である抗Pax-2ポリクローナル抗体、抗Wnt-4抗体、抗h-met抗体、抗AQP-1抗体、又は抗Flk-1抗体（サンタクルツ社製）と反応させた後、２次抗体であるＨＲＰ標識抗ラビットＩｇＧ抗体と反応させる。
【０１０２】
そして、ウェスタンブロッティング検出システムに従った反応を行い、１次抗体と反応したタンパク質を発色させると、図１３に示す結果が得られる。
【０１０３】
図１３（Ａ）に示すように、Ｋ抽出液では、Ｊ抽出液と比較してPax-2の含有量が低減していた。また、図１３（Ｂ）に示すように、Ｋ抽出液では、Ｊ抽出液と比較してWnt-4の含有量が低減していた。すなわち、支持細胞培養液が含有されていない条件で培養すると、分化が進む可能性が示唆された。
【０１０４】
また、図１３（Ｃ）に示すように、Ｊ抽出液では、血管内皮細胞のマーカーとされているFlk-1が検出された。すなわち、ｒＫＳ５６は、未分化であるときには血管内皮細胞に分化する可能性があることが示唆された。
【０１０５】
なお、図１４（Ａ），（Ｂ）に示すように、Ｊ抽出液及びＫ抽出液共に、h-metとAQP-1との含有量はほぼ同じであった。
【０１０６】
なお、図１３及び図１４の縦軸は、アクチンのバンドの濃さを１としたときの各バンドの濃さを示している。
【０１０７】
また、フローサイトメータにより、Ｊに示す組成の培養液で培養された細胞の大きさとＫに示す組成の培養液で培養された細胞の大きさとを測定すると、図１５（Ａ），（Ｂ）に示すように、Ｊに示す組成の培養液で培養した細胞と比較して、図１５（Ｃ），（Ｄ）に示すように、Ｋに示す組成の培養液で培養した細胞には１回り大きな細胞が含まれることが判明した。
【０１０８】
以上の結果から、Ｊに示す組成の培養液、すなわち、支持細胞培養液が存在することにより、ｒＫＳ５６の分化が抑制される可能性が示唆された。
【０１０９】
ｒＫＳ５６の近位尿細管の細胞、ヘンレのループの細胞への分化
つぎに、ｒＫＳ５６を近位尿細管の細胞、ヘンレのループの細胞へ分化させる。
【０１１０】
先ず、近位尿細管４の細胞へ分化させるために、ｒＫＳ５６を、表面をtypeIVコラーゲンでコートしたチャンバースライドに播種し、表８中Ｌで示す組成の培養液で３週間培養する。また、未分化のままとするために、ｒＫＳ５６を、表８中Ｍで示す組成の培養液で３週間培養する。また、ヘンレのループ５の細胞、遠位尿細管６の細胞、又は集合管７の細胞へ分化させるために、ｒＫＳ５６を、表８中Ｎで示す組成の培養液で３週間培養する。
【０１１１】
【表８】

【０１１２】
次に、チャンバースライドを風乾し、ＰＢＳで洗浄する。
【０１１３】
次に、表８中Ｌ、Ｍ、Ｎの条件で細胞を培養したチャンバースライドを、それぞれ１次抗体である抗AQP-1抗体又は抗THP抗体（Biochemical Technologies社製）が添加されたＰＢＳ中でインキュベートする。なお、THPは、ヘンレのループ５の上行脚の細胞、遠位尿細管６の細胞のマーカーである。
【０１１４】
次に、各チャンバースライドを、２次抗体であるＦＩＴＣ標識抗ラビットＩｇＧ抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートする。
【０１１５】
以上の処理を施した各チャンバースライドを顕微鏡で観察したところ、図１６に示すように、表８中Ｌの条件で培養された細胞では、AQP-1は強く発現しており、THPの発現は見られなかった。また、表８中Ｍの条件で培養された細胞では、AQP-1は弱く発現しており、THPの発現は見られなかった。また、表８中Ｎの条件で培養された細胞では、THPの発現は弱いものの全体に見られた。
【０１１６】
したがって、ｒＫＳ５６は、表８中Ｌで示す組成の培養液で培養したときには近位尿細管４の細胞に分化し、表８中Ｎで示す組成の培養液で培養したときにはヘンレのループ５の細胞、遠位尿細管６の細胞、又は集合管７の細胞へ分化することが確認された。すなわち、ｒＫＳ５６は、分化能を有することが確認された。
【０１１７】
ｒＫＳ５６による管腔構造の形成
つぎに、ｒＫＳ５６が管空構造を形成する能力を有するか否かを確認した。
【０１１８】
先ず、約１５０ｇの成体ＳＤラットに対し、約５×１０^４個のｒＫＳ５６を、腹壁筋肉内の所定の位置に、墨汁とともに移植する。
【０１１９】
そして、２８日後にＳＤラットを屠殺し、筋肉に切片を作成する。
【０１２０】
次に、切片をヘマトキシリン染色する。なお、墨汁によって染まっている位置に移植した細胞が存在すると考えられるので、墨汁によって染まっている位置をヘマトキシリン染色する。
【０１２１】
ヘマトキシリン染色した位置を蛍光顕微鏡などによって確認したところ、図１７（Ａ）〜（Ｄ）に示すように、管腔形成している組織が確認された。なお、図１７（Ａ）、（Ｂ）は管腔の横断面を示しており、図１７（Ｃ）、（Ｄ）は管腔構造を接線方向に切断した断面を示している。さらに、図１７（Ａ），（Ｃ）は、倍率１００倍の画像であり、図１７（Ｂ），（Ｄ）は、倍率４００倍の画像である。
【０１２２】
次に、切片を、１次抗体である抗AQP-1抗体、抗h-met抗体、抗Vimentin抗体、抗E-cad抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートする。
【０１２３】
次に、抗AQP-1抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートされたチャンバースライド、抗h-met抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートされたチャンバースライド、抗E-cad抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートされたチャンバースライドを、それぞれ２次抗体であるＦＩＴＣ標識抗ラビットＩｇＧ抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートする。また、抗Vimentin抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートされたチャンバースライドを、それぞれ２次抗体であるロダミン標識抗ラットＩｇＧ抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートする。
【０１２４】
以上の処理を施した各チャンバースライドを顕微鏡で観察したところ、図１８に示すように、Vimentin、h-metは強く発現していることが確認された。また、AQP-1、E-cadについては部分的に陰性であるものの、発現が確認された。なお、他のマーカーの発現は確認されなかった。したがって、ｒＫＳ５６は、例えば近位尿細管４など、管腔を形成する系統への分化能を有していると考えられる。
【０１２５】
以上検討した結果から、ｒＫＳ５６は、増殖能、自己複製能、分化能を有しており、腎臓の幹細胞／前駆細胞であることが確認された。
【０１２６】
ｒＫＳ５６の腎臓への生着
つぎに、ｒＫＳ５６が腎臓に生着するか否かを検討した。
【０１２７】
最初に、ｒＫＳ５６にvybrant cell-labeling solution（Molecular probe社製）を使用してＤｉＯ色素を取り込ませる。
【０１２８】
次に、約１５０ｇである成体ＳＤラットを使用して虚血性急性腎不全モデルを作成する。
【０１２９】
次に、ＤｉＯ色素を取り込ませたｒＫＳ５６を、表３に示す培養液に混合し、虚血性急性腎不全モデルの腎皮膜下経路に、注射器によって移植した後、閉腹する。
【０１３０】
そして、７日後に屠殺して腎臓を摘出して切片を作成し、顕微鏡で観察する。観察した結果、図１９（Ａ）、（Ｂ）に示すように、ＤｉＯ色素が取り込まれたｒＫＳ５６は、近位尿細管４に生着しており、また、間質にも存在していた。
【０１３１】
なお、図１９（Ｃ）、（Ｄ）に示す顕微鏡写真の右下部分には糸球体２が存在するが、糸球体２が存在する位置には、ＤｉＯ色素が取り込まれたｒＫＳ５６の存在は認められなかった。しかしながら、糸球体２の周囲の尿細管にはＤｉＯ色素が取り込まれたｒＫＳ５６の存在が認められた。
【０１３２】
なお、図１９（Ａ）、（Ｃ）は光学顕微鏡で観察した結果を示す画像であり、（Ｂ）、（Ｄ）は蛍光顕微鏡で観察した結果を示す画像である。
【０１３３】
ｒＫＳ５６を使用した虚血性腎不全モデルへの治療
最後に、ｒＫＳ５６を機能が低下した腎臓に移植することにより、腎臓の機能を回復させることが可能であることを確認した。
【０１３４】
先ず、約１５０ｇである成体ＳＤラットを使用して虚血性急性腎不全モデルを作成する。
【０１３５】
次に、虚血性急性腎不全モデルを２つのグループに分け、一方のグループに属するラットには、ＤｉＯ色素が取り込まれており、表３に示す培養液に懸濁した１．６×１０^６個のｒＫＳ５６を、注射によって腎皮膜下経路に移植する。なお、以下では、ｒＫＳ５６を移植したＳＤラットのグループを治療群といい、ｒＫＳ５６を移植していないグループを未治療群という。
【０１３６】
そして、治療群のＳＤラットと未治療群のＳＤラットとを、治療群のＳＤラットに対して治療を施してから４日目及び７日目に屠殺する。虚血性急性腎不全モデルは、通常、約４日目に最も腎臓の機能が悪化して約７日目に回復することから、本実施の形態では、４日目及び７日目に屠殺した。
【０１３７】
そして、４日目に屠殺したラットから腎臓を摘出して切片を作成する。作成した切片を顕微鏡で観察したところ、図２０に示すように、治療群のＳＤラットでは、ｒＫＳ５６は主にＳ２セグメント１３及びＳ３セグメント１４に生着していた。
【０１３８】
また、作成した切片を、１次抗体である抗AQP-1抗体が添加されたＰＢＳ中でインキュベートした後、２次抗体であるロダミン標識抗ラビットＩｇＧ抗体（ケミコン製）が添加されたＰＢＳ中でインキュベートし、顕微鏡で観察したところ、治療群のＳＤラットに生着したｒＫＳ５６には、図２０に示すように、AQP-1の発現が見られた。
【０１３９】
なお、図２０中ＦＬは、ＤｉＯ色素が取り込まれている細胞が生着している状態を顕微鏡で観察した画像であり、図２０中AQP-1は、AQP-1が発現している状態を顕微鏡で観察した画像であり、図２０中ｍｅｒｇｅ２は、ＤｉＯ色素が取り込まれている細胞が生着している状態を顕微鏡で観察した画像とAQP-1が発現している状態を顕微鏡で観察した画像との二重像である。
【０１４０】
また、４日目に屠殺したラット及び７日目に屠殺したＳＤラットから、血液と尿を採取し、クレアチニン濃度、クレアチニンクリアランス、尿中Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（以下、Ｕ−ＮＡＧという。）濃度、１，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール（以下、活性化ビタミンＤ３という。）濃度を測定することで、腎臓の機能について調べたところ、図２１に示す結果が得られた。なお、クレアチニン濃度、Ｕ−ＮＡＧ濃度、活性化ビタミンＤ３濃度の測定は、株式会社エスアールエルにて行われた。また、クレアチニンクリアランスは、クレアチニン濃度から算出した。なお、本実施の形態では、４日目に屠殺した６匹のＳＤラットと、６日目に屠殺した６匹のＳＤラットとから、それぞれ血液及び尿を採取した。
【０１４１】
図２１（Ａ）に示すように、クレアチニン濃度は、４日目及び７日目共に、治療群と未治療群との間で有意差は見られなかった。また、図２１（Ｂ）に示すように、クレアチニンクリアランスは、治療群では４日目にすでに回復しているのに対し、未治療群では７日目に回復した。また、図２１（Ｂ）に示すように、Ｕ−ＮＡＧは、未治療群では低下していないのに対し、治療群では悪化が抑制されていた。また、図２１（Ｄ）に示すように、活性化ビタミンＤ３濃度は、治療群で有意に上昇していた。
【０１４２】
したがって、ｒＫＳ５６を移植することにより、虚血性急性腎不全のラットでは、４日目にクレアチニンクリアランスが軽度回復していることから、糸球体２の病変が抑制されたと考えられる。また、Ｕ−ＮＡＧ濃度の上昇が抑制されたことから、近位尿細管４、遠位尿細管６、間質の病変が抑制されたと考えられる。また、活性化ビタミンＤ３濃度が上昇していることから、ＰＴＨの分泌が惹起されたと考えられる。すなわち、ｒＫＳ５６を移植することにより、腎不全を治癒できる可能性が示唆された。
【０１４３】
【発明の効果】
本発明に係る腎臓幹細胞／前駆細胞は、哺乳動物の腎臓から分離され、増殖能、自己複製能、分化能を有している。したがって、腎臓に移植することによって、腎疾患の治癒が可能となる。
【０１４４】
また、本発明に係る腎臓幹細胞／前駆細胞の単離方法は、腎臓を各部位毎に分離する分離ステップと、分離ステップで分離された各部位の細胞を単離する単離ステップと、分離ステップで分離された各部位の細胞を、支持細胞又は支持細胞培養液とともに培養し、増殖能が高い細胞を得る培養ステップとを備える。したがって、本発明に係る腎臓幹細胞／前駆細胞の単離方法によれば、増殖能、複製能、分化能を有した腎臓幹細胞を単離することができる。
【０１４５】
また、本発明に係る腎疾患の治療方法では、哺乳動物の腎臓から分離され、増殖能、自己複製能、分化能が高い腎臓幹細胞／前駆細胞を、機能が低下した腎臓に移植する。したがって、本発明に係る腎疾患の治療方法によれば、腎臓を再生して腎臓の機能を回復することが可能となるため、腎疾患の治癒が可能となる。
【配列表】

【配列表フリーテキスト】
配列番号１〜４は合成プライマーである、配列番号１，３はセンスプライマーであり、配列番号２，４はアンチセンスプライマーである。
【図面の簡単な説明】
【図１】腎臓を説明するための模式図である。
【図２】各部位において、ＢｒｄＵ染色された細胞の数を示す図である。
【図３】Ｓ３セグメントから分離された細胞が、他の部位から分離された細胞と比較して増殖能が高いことを示す図である。
【図４】各部位より分離された細胞を培養したときにおける３個以上のコロニーの数を示す図である。
【図５】Ｓ３セグメントから分離された高増殖能細胞の外観を示す図である。
【図６】Ｓ３セグメントから分離された高増殖能細胞を培養した日数と、日数に応じた外観とを示す図である。
【図７】Ｓ３セグメントから分離された高増殖能細胞が自己増殖能をもつことを示す図である。
【図８】高増殖能細胞の表面における、h-met、pan-cytokeratin、Vimentin、AQP-1、E-cadの発現を示す図である。
【図９】高増殖能細胞から分離したPax-2のＤＮＡとWnt-4のＤＮＡとを電気泳動した状態を示す図である。
【図１０】高増殖能細胞にPax-2とWnt-４とが発現していることを示す図である。
【図１１】各条件でｒＫＳ５６を培養したときの、ｒＫＳ５６の数を示す図である。
【図１２】各条件でｒＫＳ５６を培養したときの、ホルモン反応性の違いを示す図である。
【図１３】ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で支持細胞を培養して得られた培養液を添加しないことで、Pax-2、Wnt-4、Flk-1の発現が低減することを示す図である。
【図１４】ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で支持細胞を培養して得られた培養液の添加に拘わらず、AQP-1、h-metの発現が変化しないことを示す図である。
【図１５】ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で支持細胞を培養して得られた培養液を添加しないでｒＫＳ５６を培養したときには、１回り大きな細胞が見られることを示す図である。
【図１６】表８に示す組成の培養液でｒＫＳ５６を培養したときの、AQP-1とTHPの発現の違いを示す図である。
【図１７】ｒＫＳ５６がＳＤラットの腹壁筋肉内に移植され、管腔構造を形成していることを示す図である。
【図１８】腹壁筋肉内にｒＫＳ５６が移植されたＳＤラットにおいて、移植されたｒＫＳ５６に、AQP-1、h-met、Vimentinが、発現していることを示す図である。
【図１９】移植したｒＫＳ５６が生着していることを示す図である。
【図２０】急性腎不全モデルにｒＫＳ５６が生着していることを示す図である。
【図２１】クレアチニン濃度、クレアチニンクリアランス、Ｕ−ＮＡＧ濃度、活性化ビタミンＤ３濃度などを示す図である。
【符号の説明】
１ネフロン、２糸球体、３ボーマン嚢、４近位尿細管、５ヘンレのループ、６遠位尿細管、７集合管、１１Ｓ１セグメント、１２ＰＣＴ、１３Ｓ２セグメント、１４Ｓ３セグメント[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a renal stem cell / progenitor cell isolated from a mammalian kidney, a method for separating a renal stem cell / progenitor cell from a mammalian kidney, and a method for treating a kidney using the renal stem cell / progenitor cell.
[0002]
[Prior art]
The kidney is an organ mainly having an excretory function, an endocrine function, and a regulating function, and produces and secretes hormones or generates urine. In humans, there are two kidneys on the dorsal side of the abdominal cavity, each having a ureter extending to the bladder.
[0003]
The kidney has about 1 million basic structures called nephrons. Nephrons are provided with glomeruli that filter raw water from waste and generate raw urine. The original urine produced in the glomerulus is transported to the ureter through the proximal tubule, the Henle loop, the distal tubule, and the collecting duct. The proximal tubule, the Henle loop, and the distal tubule reabsorb sodium and water and activate erythropoietin and vitamin D3. There are stromal cells around the nephron. The raw urine is concentrated about 100 times before being transported to the ureter, then passes through the ureter to the bladder, and is excreted from the bladder.
[0004]
In addition, the kidney develops from the intermediate mesoderm and is formed through three stages: the pronephros, the middle kidneys, and the metanephros. In mammals, most of the pronephros and middle kidneys later undergo degenerative degeneration, mainly from the metanephros. In the metanephros, the mesenchymal cells gather around a process called a ureteric bud that occurs on the caudal side of the middle kidney. Then, ureteric buds and mesenchymal cells interact with each other, and the mesenchymal cells become epithelialized and go through a state called S-shaped body, thereby causing glomeruli, proximal tubules, Henry's loop, distal tubules. Occurs. In addition, collecting ducts and ureteral epithelial cells differentiate from ureteric buds.
[0005]
In recent years, the number of patients with chronic renal failure has increased. Chronic renal failure is a condition in which kidney damage caused by a disease in the kidney or a disease in an organ other than the kidney has progressed and is normal, such as a function to remove uremic toxins contained in blood, an endocrine function, and a regulatory function The function of the kidneys is abolished.
[0006]
As chronic renal failure progresses, the functions of normal kidneys are abolished, affecting each organ in the body and causing uremia. Specifically, CNS disorders, peripheral nerve disorders, cardiovascular disorders, digestive disorders, vision / eye disorders, blood / coagulopathy, immune disorders, endocrine disorders, skin disorders, bone / joint disorders, electrolyte disorders, It becomes an acid-base balance disorder.
[0007]
Chronic renal failure is progressive and cannot be cured. Therefore, the main focus of the treatment is conservative treatment that slows down the rate at which kidney function is abolished, and eventually treatment to replace kidney function, such as artificial dialysis and kidney transplantation, is required. (For example, patent document 1).
[0008]
[Patent Document 1]
JP-A-6-142193
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
However, kidney transplants are difficult to perform because of the absolute lack of provided kidneys. More specifically, while about 30,000 new patients undergo artificial dialysis per year, only about 500 to 600 kidney transplants are performed per year. Thus, the majority of patients with chronic renal failure undergo artificial dialysis.
[0010]
Artificial dialysis is mainly classified into two types, hemodialysis and peritoneal dialysis.
[0011]
Hemodialysis is performed in hospitals, and the blood is gradually removed from the body by inserting a needle into a special blood vessel created by local anesthesia called an internal shunt, or by inserting a dialysis tube into a large blood vessel such as the neck. This is a method of removing the urine toxin by passing it through a device that rubs out the uremic toxin contained in the removed blood and returning it to the body.
[0012]
Peritoneal dialysis is performed by embedding a tube called a catheter in the abdominal cavity, injecting dialysate from the catheter and storing it for a while, so that the uremic toxin in the blood is dissolved in the dialysate. It is a method of purifying blood by repeating the operation of throwing it outside.
[0013]
However, hemodialysis removes uremic toxins in the blood, but cannot perform treatments that are alternative to endocrine function, regulatory function, and the like. In addition, since it is not possible to draw all blood from the body at once, blood is drawn little by little and the drawn blood is purified, so that the time required for one dialysis is increased. Specifically, it takes about 4 to 5 hours at a time. Furthermore, hemodialysis needs to be performed about 3 times a week. Therefore, when hemodialysis is performed, the patient has to go to the hospital frequently and the time that he / she is restrained by the hospital becomes longer.
[0014]
In peritoneal dialysis, self-management can be performed, so that the patient can reduce the number of hospital visits. However, problems such as being susceptible to metabolic disorders and increasing the burden on the peritoneum arise.
[0015]
In addition, patients with chronic renal failure have frequent visits to receive artificial dialysis. In addition, there is a high possibility of visiting an emergency room or being hospitalized for reasons such as causing peritonitis due to dust accumulated in the catheter. Therefore, the time and cost for treatment are increased, and a great burden is imposed on patients with chronic renal failure and their families.
[0016]
Furthermore, the number of patients undergoing artificial dialysis is said to be about 180,000, and the medical costs for artificial dialysis account for a large percentage of the total medical costs in Japan. Specifically, it accounts for 1 trillion yen of Japan's total medical expenses of 13 trillion yen. In addition, the number of patients performing artificial dialysis has increased by 30,000 per year. Therefore, there is a concern that the medical costs for artificial dialysis will increase further and the medical economy will be under pressure.
[0017]
Furthermore, the current medical treatment has not established a method for radically curing kidney disease. The reason why the cure for kidney disease has not been established includes the fact that the form of the kidney is complicated and the pathology is diverse. For example, chronic nephritis is treated by immunosuppressive therapy using steroids and immunosuppressive agents, methods using antiplatelet agents, and methods using anticoagulants, but is difficult to cure. Therefore, when renal disease occurs, the focus is on conservative treatment for patients, and if renal function declines and kidney failure occurs, it is necessary to perform artificial dialysis and kidney transplantation. .
[0018]
As a method for curing kidney disease, research such as gene therapy is being promoted in addition to kidney transplantation. However, there are problems such as the occurrence of side effects caused by vectors, and it has not been out of the field of research.
[0019]
The present invention has been proposed in view of the above-described conventional situation, a kidney stem cell / progenitor cell that is an undifferentiated cell that can be differentiated into the kidney, a method for separating the kidney stem cell / progenitor cell, and It aims at providing the cure method of a kidney disease.
[0020]
[Means for Solving the Problems]
The inventors of the present invention have made extensive studies in order to achieve the above-mentioned object, confirmed that cells having high proliferative ability exist in the kidney, and separated the cells having high proliferative ability from the kidney. As a result of further examination, it was found that the separated cells have proliferation ability, self-replication ability, and differentiation ability.
[0021]
That is, the kidney stem cell / progenitor cell according to the present invention is isolated from a mammalian kidney and is characterized by having a proliferation ability, a self-replication ability, and a differentiation ability.
[0022]
In addition, the method for separating kidney stem cells / progenitor cells according to the present invention includes a separation step for separating the kidney for each part, an isolation step for isolating cells at each part separated in the separation step, and the separation described above. And a culture step of culturing the cells of each site separated in the step in a culture medium containing a support cell or a support cell culture medium to obtain a cell having a high proliferation ability.
[0023]
In addition, a method for treating renal disease to which the present invention is applied, transplants kidney stem cells / progenitor cells isolated from a mammalian kidney and having proliferative ability, self-replicating ability, and differentiation ability into a kidney with reduced function. It is characterized by that.
[0024]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
[0025]
Identification of sites where kidney stem / progenitor cells are present
As shown in FIG. 1, the nephron 1 in the kidney includes glomeruli 2 composed of import / export arterioles branched from the renal artery, endothelial cells, epithelial cells, mesangial cells, and Bowman's sac epithelial cells. The glomerulus 2 filters the blood to produce raw urine. The raw urine produced in the glomerulus 2 is collected by the Bowman's sac 3 and is transported to the ureter through the proximal tubule 4, the Henle's loop 5, the distal tubule 6, and the collecting tube 7. The proximal tubule 4 follows the Bowman's sac 3 and extends straightly into the S1 segment 11, followed by the S1 segment 11 and bent PCT (proximal convoluted tubules) 12, and continues to the PCT 12 and enters the cortex. S2 segment 13 extending relatively straight from the skin boundary to the spinal cord boundary, and S3 segment 14 following S2 segment 13 and extending from the spinal cord boundary to Henle's loop 5. In addition, there are stromal cells around the nephron 1.
[0026]
The raw urine produced by the glomerulus 2 is concentrated about 100 times before being transported to the ureter. Specifically, the raw urine is produced about 150 liters a day, but becomes about 1.5 liters when concentrated.
In the present embodiment, first, the location of cells having proliferation ability in nephron 1 was confirmed.
[0027]
First, normal Sprague-Dawley rats (hereinafter referred to as SD rats) that are about 8 to 10 weeks old are prepared and divided into two groups. And the SD rat which belongs to one group is made into ischemic acute renal failure. Hereinafter, the SD rat having ischemic acute renal failure is referred to as an ischemic acute renal failure model. In the ischemic acute renal failure model, the left kidney is first ischemic by driving the renal artery of the left kidney for 40 minutes, and the right kidney is removed while the left kidney is ischemic, and finally ischemia is performed. Created by releasing. The ischemic acute renal failure model is usually used as a renal failure model. In the ischemic acute renal failure model, 4 days after ischemia, the proximal tubule 4, the Henle loop 5, the distal tubule 6 and the like are necrotized and fall off but are known to regenerate. Yes. Sham surgery is performed on the SD rats belonging to the other group.
[0028]
Next, bromodeoxyuridine (hereinafter referred to as BrdU) diluted with physiological saline was administered intraperitoneally to all SD rats belonging to both groups so that the BrdU was 50 mg per kg body weight.
[0029]
One week after administration of BrdU, all SD rats belonging to both groups were sacrificed, the left kidney was removed, and excised kidney sections were prepared.
[0030]
Next, the excised kidney section is stained with BrdU. Specifically, first, DNA is exposed by proteinase K (manufactured by Sigma). Next, 0.3% H₂O₂Endogenous peroxidase activity is inhibited by a solution in which methanol and methanol are mixed at a ratio of 3 to 1000, and then washed with PBS. Next, the sections are blocked by preincubation in PBS containing 3% BSA. Next, after reacting with an anti-BrdU antibody (manufactured by Sigma) as a primary antibody, it is reacted with a biotin-labeled anti-mouse IgG + IgA + IgM antibody (manufactured by Nichirei) as a secondary antibody and developed with a DAB coloring kit.
[0031]
The sections stained with BrdU were observed with a phase contrast microscope at a field of magnification of 400 times, and the number of stained cells was counted for each site. As shown in FIG. 2, SD rats belonging to the first group, ie, acute A number of BrdU-stained cells were observed in S3 segment 14 of SD rat, which is a renal failure model. 2 indicates the number of cells stained with BrdU in SD rats belonging to the first group, and II in FIG. 2 indicates the number of cells stained with BrdU in SD rats belonging to the second group. Show. Moreover, the vertical axis | shaft of FIG. 2 has shown the number of cells counted when a section | slice is observed by 400 time magnification.
[0032]
Based on the above results, it was found that cells having high proliferation ability exist in the S3 segment 14.
[0033]
Separation method of kidney stem cells / progenitor cells
Next, cells having high proliferative ability are separated from the kidney.
[0034]
First, SD rats that are about 8 to 10 weeks old are prepared, and the kidneys are removed. In addition, Solution A having the composition shown in Table 1 (A) and Solution B having the composition shown in Table 2 are placed in separate syringes and ice-cooled. In this embodiment, 20 ml each of solution A and solution B are used. Also cool the remaining Solution A. It should be noted that Inorganic Mix in Table 1 (A) is NaCl and CH so that the final concentrations shown in Table 1 (B) are obtained.₃COONa and NaH₂PO₄(2H₂O) and MgSO₄(7H₂O) is added to 50 ml of distilled water.
[0035]
[Table 1]

[0036]
[Table 2]

[0037]
Next, Solution A and Solution B, which are placed in a syringe and cooled with ice, are sequentially injected from the removed aorta of the kidney into the lt renal artery.
[0038]
The kidneys are then immersed in chilled Solution A and sections are cut out.
[0039]
Next, the excised section was immersed in Solution B1 in which 150 μl of VRC was added to 3 ml of Solution B, and the solution was washed at 37 ° C. for 10 minutes.₂Incubate while injecting. When incubating, sometimes O₂Make sure that
[0040]
Next, Solution B1 is discarded, and the section is immersed in Solution A1 to which 19 μl of Solution A is added 400 μl of VRC (Ribonucleoside Vanadyl complexes 200 mM solution; manufactured by Sigma) and cooled.
[0041]
Next, a section is put into a Petri dish containing 2-3 ml of Solution A1, microdissection is performed, and the kidney is fractionated at each site.
[0042]
Then, each part obtained by microdissection was seeded in a 96-well plate whose surface was coated with type IV collagen (BD Biosciences) and 10% each in Dulbecco's modified Eagle medium containing 4.5 g / l glucose. 1% fetal bovine serum (hereinafter referred to as FCS) was washed in a culture solution, and then cultured in the culture solution having the composition shown in Table 3 below for 1 week while changing the culture solution once every two days. Due to this, cells grow. In the present embodiment, about 80% of cells grew at each site. As Dulbecco's modified Eagle medium (hereinafter referred to as DMEM), a Sigma product was used.
[0043]
[Table 3]

[0044]
The support cell culture solution shown in Table 3 is a culture obtained by adding 10% FCS, 100 unit / ml penicillin G, and 100 mg / ml streptomycin to DMEM containing 4.5 g / l glucose. The culture solution after culturing the feeder cells in the solution for 2 days is passed through a filter. ITS-mix is manufactured by Gibco and contains insulin, transferrin, and selenium. HGF is a hepatocyte growth factor, manufactured by Sigma.
[0045]
The culture solution having the composition shown in Table 4 below is referred to as K-1 medium. That is, the culture solution shown in Table 3 contains K-1 medium.
[0046]
[Table 4]

[0047]
Next, the grown cells were converted into single cells by the microwell method, and the surface was seeded in a 96-well plate coated with type IV collagen (manufactured by BD Biosciences), and cultured for each cell in a culture solution having the composition shown in Table 3. Then, as shown to FIG. 3 (A), the cell which shows high proliferation ability is obtained from the cell of S3 segment 14. FIG. Moreover, in this Embodiment, as shown to FIG.3 (B)-(D), the cell which shows especially high proliferation ability was not obtained from another site | part.
[0048]
In the present embodiment, 0.8% of the cells obtained from the S3 segment 14 showed high proliferation ability, and the cell doubling time was about 10 to 16 hours.
[0049]
As described above, the appearance of the cells obtained from the S3 segment 14 was observed with an inverted research microscope power IX-71 (hereinafter simply referred to as a microscope). It was.
[0050]
Since stem cells and progenitor cells are cells having high proliferative ability, self-replicating ability, and differentiation ability, in the following, the proliferating ability of cells separated from the S3 segment 14 by the above-described method will be further examined and self-replicating ability will be described. The differentiation potential was examined.
[0051]
Proliferation capacity of kidney stem cells / progenitor cells
Next, the proliferation ability of the cells isolated by the method described above is examined.
[0052]
Cells at each site grown by the above-described method are converted into single cells by the microwell method, and the surface is seeded on a glass slide coated with type IV collagen (BD Bioscience), and each cell is cultured in a culture solution having the composition shown in Table 3. When the cells were cultured for each cell, many colonies composed of 3 or more cells were formed from the cells obtained from the S3 segment 14 as compared with other sites.
[0053]
Specifically, as shown in FIG. 5 (A), when 24 hours have elapsed after culturing, colonies composed of 3 or more cells form 11 units per 120 wells from the cells obtained from the S3 segment 14. On the other hand, from the cells obtained from the S2 segment 13, only one unit of a colony composed of 3 or more cells was formed per 120 wells, and further, it was obtained from Henle loop 5 and glomerulus 2. From the cells, colonies consisting of 3 or more cells were hardly formed. In addition, when 48 hours passed after culturing, as shown in FIG. 5 (B), 20 units of colonies composed of 3 or more cells were formed from the cells obtained from the S3 segment 14 per 120 wells. On the other hand, from the cells obtained from the S2 segment 13, only 3 units of colonies composed of 3 or more cells were formed per 120 wells. Further, from the cells obtained from the Henle loop 5 and the glomerulus 2, . Only 2 units of colonies consisting of 3 or more cells were formed.
[0054]
That is, it is considered that cells separated from the S3 segment 14 (hereinafter, high proliferative cells) have high proliferative ability.
[0055]
Cell surface marker detection
Next, a marker expressed on the surface of the highly proliferative cell is detected.
[0056]
First, high-proliferative cells are seeded on a 12-well chamber slide whose surface is coated with type IV collagen, cultured for 14 days in a culture solution having the composition shown in Table 3, and then the chamber slide is air-dried and washed with PBS.
[0057]
Next, the chamber slides are divided into five groups, each of which is a primary antibody, anti-aquaporin-1 (hereinafter referred to as AQP-1) antibody (Chemicon), anti-h-met antibody (Santa Cruz), anti- Incubate in PBS to which Vimentin antibody (Sigma), anti-E-cadherin (hereinafter referred to as E-cad) antibody (Santa Cruz), and anti-pan-cytokeratin antibody (Santa Cruz) are added.
[0058]
AQP-1 is a marker for cells in the proximal tubule 4, and pan-cytokeratin and E-cad are markers for epithelial cells. Vimentin is a marker for mesenchymal cells that is expressed only during development. H-met is an antibody that recognizes c-met, which is a receptor for hepatocyte growth factor that is supposed to work during regeneration.
[0059]
Next, chamber slides incubated in PBS with added anti-AQP-1 antibody, chamber slides incubated in PBS with added anti-h-met antibody, in PBS with added anti-E-cad antibody Incubate the slides incubated in step 1 in PBS to which FITC-labeled anti-rabbit IgG antibody (Chemicon), which is a secondary antibody, was added. In addition, a chamber slide incubated in PBS to which an anti-vimentin antibody was added and a chamber slide incubated in PBS to which an anti-pan-cytokeratin antibody was added were each a rhodamine-labeled anti-rat IgG antibody (secondary antibody) ( Incubate in PBS supplemented with Chemicon.
[0060]
When each chamber slide subjected to the above treatment was observed with a fluorescence microscope, as shown in FIG. 6, in the high proliferative cells, it is a marker for mesenchymal cells and a marker for vimentin and epithelial cells that are expressed at the time of development. Pan-cytokeratin was strongly expressed. In addition, E-cad, a receptor for the regeneration factor, was also strongly expressed. In addition, AQP-1 which is a marker of proximal tubule 4 and E-cad which is a marker of epithelial cells showed weak expression.
[0061]
That is, since the high proliferative ability cell is a cell existing in the S3 segment 14 constituting the proximal tubule 4 and does not show the trait of the proximal tubule 4, there is a possibility that it is undifferentiated. It was suggested. In addition, the expression of a receptor for a regeneration factor suggested the possibility of having differentiation potential.
[0062]
Examination of undifferentiated marker expression
Next, the expression of Pax-2 and Wnt-4, which are said to be markers of undifferentiated cells, was examined.
[0063]
First, expression of Pax-2 and Wnt-4 was examined by extracting mRNA.
[0064]
First, highly proliferative cells are seeded on a polystyrene plate having a surface of 10 cm in diameter coated with type IV collagen, and the cells are cultured and collected in the culture solution shown in Table 3.
[0065]
Then, mRNA is extracted from the highly proliferative cells using Rneasy Midi Kit (manufactured by QIAGEN), and cDNA is obtained by reverse transcription reaction from the obtained mRNA.
[0066]
Next, the cDNA is amplified according to the method described in J. Am. Soc. Nephrol. 2002 Dec; 13 (12): 2850-2859. In the literature, the total volume is 100 μl, but in this embodiment it is 50 μl.
[0067]
Next, PCR using the sense primer shown in SEQ ID NO: 1 and the antisense primer shown in SEQ ID NO: 2 is repeated 30 times at 94 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 59 seconds To amplify Pax-2 cDNA.
[0068]
In addition, PCR using the sense primer shown in SEQ ID NO: 3 and the antisense primer shown in SEQ ID NO: 4 was repeated 30 times in a cycle of 94 ° C. for 20 seconds, 55 ° C. for 20 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds. And amplify the Wnt-4 cDNA.
[0069]
Next, each cDNA amplified by PCR is separated by 1.2% agarose gel electrophoresis. As shown in FIG. 7, the size of the amplified cDNA was 389 bp for Pax-2, which was the same as the size of DNA encoding Pax-2. Wnt-4 was 366 bp, which was the same size as the DNA encoding Wnt-4.
[0070]
Next, the expression of Pax-2 and Wnt-4 is examined by extracting the protein.
[0071]
First, highly proliferative cells are seeded on a polystyrene plate having a surface of 10 cm in diameter coated with type IV collagen, and the cells are cultured and collected in the culture solution shown in Table 3.
[0072]
Next, highly proliferative cells are disrupted with a buffer having the composition shown in Table 5, centrifuged, and the supernatant is taken to obtain a protein extract.
[0073]
[Table 5]

[0074]
Next, the proteins in the extract are separated by SDS-PAGE using a gel having a polyacrylamide concentration of 10%, and then transferred from the gel to the PVDF membrane by Western blotting.
[0075]
In this embodiment, human mesangial cells (hereinafter referred to as HMC) described in J. Am. Soc. Nephrol. 1996 Nov; 7 (11): 2357-63 also serve as negative controls. After the protein in the extract was separated by SDS-PAGE, it was transferred from the gel to the PVDF membrane by Western blotting.
[0076]
Next, blocking is performed by immersing the PVDF membrane in a blocking buffer containing 2.5 g of skim milk in 50 ml of TBS1 l to which 1 ml of Tween has been added.
[0077]
Then, after reacting with an anti-Pax-2 polyclonal antibody (Berkeley antibody company) that is a primary antibody or an anti-Wnt-4 antibody (manufactured by Santa Cruz), an HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody (Jackson ImmunoResearch) that is a secondary antibody. Made).
[0078]
Then, a reaction according to a western blotting detection system (ECL western blotting detection reagent; manufactured by Amersham) is performed, and an X-ray film is exposed to light, as shown in FIGS. 8 (A) and 8 (B). And Wnt-4 were both confirmed. Further, it was confirmed that neither Pax-2 nor Wnt-4 was expressed in HMC.
[0079]
Therefore, high proliferative cells expressed Pax-2 and Wnt-4, suggesting the possibility of being undifferentiated.
[0080]
Highly proliferative cells cell line Create
As described above, high proliferative cells have high proliferative ability, self-replicating ability, and differentiation ability, and therefore can be differentiated into kidney stem cells or kidney progenitor cells (hereinafter referred to as kidney stem cells / progenitor cells). There is a possibility that. Therefore, high proliferative cells were cell lined.
[0081]
By incorporating the SV40 gene into the high proliferative cells by lipofection, the high proliferative cells are cell lined. Specifically, using FuGENE 6 (manufactured by Roche Diagnostics), cells with high proliferative potential were made into cell lines. The appearance of the highly proliferative cells remained paved when the SV40 gene was incorporated. Hereinafter, the highly proliferative cells that have become cell lines are referred to as rKS (Rat Kidney Stem cell line) 56.
[0082]
Self-renewal ability of kidney stem / progenitor cells
Next, the self-replication ability of rKS56 will be examined.
[0083]
Generally, cells are not naturally immortalized only by culturing them, and when they are shown in the period of 30 to 50 generations, they enter a mitotic arrest period in about 90 days and cannot pass through and die.
[0084]
However, when rKS56 was seeded in a 96-well plate coated with type IV collagen on the surface and continued to be cultured while culturing in the culture medium shown in Table 3, it was subcultured for 150 days as shown in FIG. The cell proliferation ability and appearance were maintained.
[0085]
In addition, DiKS dye was incorporated into rKS56 using a vybrant cell-labeling solution (manufactured by Molecular purobe), seeded in a 96-well plate coated with type IV collagen, and cultured in a culture solution having the composition shown in Table 3. When low-density culture was performed and observed with a microscope, high proliferation cells (hereinafter referred to as DiO cells) into which DiO dye had been incorporated proliferated (first passage), as shown in FIG. 10 (A). Next, the proliferated DiO cells were collected and made into single cells and cultured again at a low density. As shown in FIG. 10 (B), the DiO cells proliferated again (second passage). When the proliferated DiO cells were collected again to form single cells and cultured again at a low density, the DiO cells proliferated again (passage 3) as shown in FIG. 10 (C).
[0086]
In FIG. 10, LM is an image obtained by observing low-density cultured cells with an optical microscope, FL is an image observed with a fluorescent microscope, and merge1 is an image observed with an optical microscope and an image observed with a fluorescent microscope. It is a double image. Note that FIG. 10B is a diagram showing a state in which cells surrounded by squares in FIG. 10A FL are cultured at a low density, and FIG. 10C shows the light emission in FIG. 10B. It is the figure which showed the state which carried out the low-density culture | cultivation of the living cell.
[0087]
From the results described above, it is considered that high-proliferative cells have a self-replicating ability.
[0088]
Examination of differentiation ability of rKS56
Next, the differentiation ability of rKS56 is examined.
[0089]
First, rKS56 is seeded on a 96-well plate whose surface is coated with type IV collagen, and cultured for 7 days in a culture solution having the composition shown in A to H in Table 6 below.
[0090]
[Table 6]

[0091]
In addition, the conditions shown by D in Table 6 are normal culture solutions. In Table 6, LIF is a leukemia inhibitory factor.
[0092]
Then, the cultured rKS56 is examined for changes in cell number, cell shape, reactivity to parathyroid hormone (hereinafter referred to as PTH) and vasopressin (hereinafter referred to as AVP).
[0093]
The number of cells and the shape of the cells are examined by observing the surface of the slide glass with a microscope. The reactivity to PTH and AVP is examined by measuring the amount of cAMP using an Amersham cAMP enzyme immunoassay (EIA) system.
[0094]
As a result of investigating changes in cell number, cell shape, reactivity to PTH, and reactivity to AVP, as shown in FIG. It was. Moreover, the shape of the cell was a paving stone shape, and no change was seen. Further, when cultured under the conditions of B and F in Table 6, as shown in FIGS. 12 (A) and (B), the AVP was compared with the result of culturing with the normal culture solution shown in FIG. 12 (C). And cTH increased in response to PTH and PTH, but the reactivity to PTH was much higher than that to AVP, and the reactivity to PTH and AVP was similar to that of cells in proximal tubule 4 .
[0095]
Moreover, when it culture | cultivated on the conditions of E in Table 6, the shape of a cell was a paving stone shape, and the change was not seen. However, as shown in FIG. 12 (D), the amount of cAMP increases in response to AVP and PTH as compared to the result of culturing in a normal culture solution, but the reactivity to AVP is more than the reactivity to PTH. The reactivity to PTH and AVP was similar to that of Henle's loop 5 cells and distal tubule 6 cells. That is, it was suggested that rKS56 may have differentiation potential.
[0096]
Differentiation of rKS56 in the presence of feeder cell cultures
Next, the differentiation of rKS56 between when culturing rKS56 in the presence of a culture medium of supporting cells, which is considered to be a rKS56 phenotype, and when culturing rKS56 in the absence of the culture medium of supporting cells. The difference was examined.
[0097]
First, rKS56 is seeded on a 10 cm diameter prestyrene plate whose surface is coated with type IV collagen, cultured for 7 days in a culture medium having the composition shown in J and K in Table 7 and collected.
[0098]
[Table 7]

[0099]
Next, the rKS56 was crushed with a buffer having the composition shown in Table 5, centrifuged, and the supernatant was taken, whereby a protein extract in rKS56 cultured in the culture solution having the composition shown in J (hereinafter referred to as J extract). And an extract of protein in rKS56 cultured in a culture solution having the composition shown in K (hereinafter referred to as K extract).
[0100]
Next, the proteins in the extract are separated by SDS-PAGE using a gel having a polyacrylamide concentration of 10%, and then transferred from the gel to the PVDF membrane by Western blotting. Then, blocking is performed by immersing the PVDF membrane in a blocking buffer.
[0101]
Next, after reacting with anti-Pax-2 polyclonal antibody, anti-Wnt-4 antibody, anti-h-met antibody, anti-AQP-1 antibody, or anti-Flk-1 antibody (manufactured by Santa Cruz) which is the primary antibody, It reacts with the HRP labeled anti-rabbit IgG antibody which is a secondary antibody.
[0102]
Then, when the reaction according to the Western blotting detection system is performed and the protein reacted with the primary antibody is colored, the result shown in FIG. 13 is obtained.
[0103]
As shown in FIG. 13 (A), the content of Pax-2 was reduced in the K extract compared to the J extract. Further, as shown in FIG. 13B, the content of Wnt-4 was reduced in the K extract compared to the J extract. That is, it was suggested that differentiation may proceed when cultured under conditions that do not contain feeder cell culture medium.
[0104]
As shown in FIG. 13C, Flk-1, which is a marker for vascular endothelial cells, was detected in the J extract. That is, it was suggested that rKS56 may differentiate into vascular endothelial cells when undifferentiated.
[0105]
Note that, as shown in FIGS. 14A and 14B, the contents of h-met and AQP-1 were almost the same in both the J extract and the K extract.
[0106]
The vertical axis in FIGS. 13 and 14 indicates the density of each band when the density of the actin band is 1.
[0107]
Further, when the size of the cells cultured in the culture solution having the composition shown in J and the size of the cells cultured in the culture solution having the composition shown in K are measured by a flow cytometer, FIGS. As shown in FIGS. 15 (C) and 15 (D), the cells cultured in the culture medium having the composition shown in FIG. 15 are compared with the cells cultured in the culture medium having the composition shown in FIG. It was found to contain large cells.
[0108]
From the above results, it was suggested that the differentiation of rKS56 may be suppressed by the presence of the culture solution having the composition shown in J, that is, the feeder cell culture solution.
[0109]
Differentiation of rKS56 into proximal tubule cells, Henle loop cells
Next, rKS56 is differentiated into cells in the proximal tubule, cells in the Henle loop.
[0110]
First, in order to differentiate into cells of the proximal tubule 4, rKS56 is seeded on a chamber slide whose surface is coated with type IV collagen, and cultured for 3 weeks in a culture medium having the composition indicated by L in Table 8. In order to keep undifferentiated, rKS56 is cultured for 3 weeks in a culture solution having the composition indicated by M in Table 8. In addition, rKS56 is cultured in a culture medium having a composition indicated by N in Table 8 for 3 weeks in order to differentiate into cells of Henle loop 5, cells of distal tubule 6 or cells of collecting tube 7.
[0111]
[Table 8]

[0112]
The chamber slide is then air dried and washed with PBS.
[0113]
Next, the chamber slides in which the cells were cultured under the conditions of L, M, and N in Table 8 were each added in PBS to which anti-AQP-1 antibody or anti-THP antibody (manufactured by Biochemical Technologies) as the primary antibody was added. Incubate. THP is a marker for cells in the ascending limb of Henle's loop 5 and cells in the distal tubule 6.
[0114]
Next, each chamber slide is incubated in PBS supplemented with FITC-labeled anti-rabbit IgG antibody, which is a secondary antibody.
[0115]
When each chamber slide subjected to the above treatment was observed with a microscope, as shown in FIG. 16, AQP-1 was strongly expressed in cells cultured under the conditions of L in Table 8, and the expression of THP was I couldn't see it. Further, in the cells cultured under the conditions of M in Table 8, AQP-1 was weakly expressed and THP expression was not observed. Moreover, in the cells cultured under the conditions of N in Table 8, although THP expression was weak, it was observed throughout.
[0116]
Therefore, rKS56 differentiates into cells of the proximal tubule 4 when cultured in the culture medium having the composition indicated by L in Table 8, and Henle loop 5 cells when cultured in the culture medium having the composition indicated by N in Table 8. It was confirmed that the cells differentiated into cells of the distal tubule 6 or cells of the collecting duct 7. That is, it was confirmed that rKS56 has differentiation potential.
[0117]
Formation of lumen structure by rKS56
Next, it was confirmed whether or not rKS56 has the ability to form a hollow structure.
[0118]
First, about 5 x 10 for about 150 g of adult SD rat.⁴The individual rKSs 56 are transplanted together with the ink at a predetermined position in the abdominal wall muscle.
[0119]
Then, after 28 days, the SD rat is sacrificed and a section is prepared in the muscle.
[0120]
The sections are then stained with hematoxylin. In addition, since it is thought that the transplanted cell exists in the position dye | stained with ink, the position dye | stained with ink is stained with hematoxylin.
[0121]
When the position stained with hematoxylin was confirmed by a fluorescence microscope or the like, as shown in FIGS. 17 (A) to (D), a tissue forming a lumen was confirmed. FIGS. 17A and 17B show cross sections of the lumen, and FIGS. 17C and 17D show cross sections obtained by cutting the lumen structure in the tangential direction. Further, FIGS. 17A and 17C are images with a magnification of 100 times, and FIGS. 17B and 17D are images with a magnification of 400 times.
[0122]
Next, the sections are incubated in PBS to which anti-AQP-1 antibody, anti-h-met antibody, anti-Vimentin antibody, and anti-E-cad antibody, which are primary antibodies, are added.
[0123]
Next, chamber slides incubated in PBS with added anti-AQP-1 antibody, chamber slides incubated in PBS with added anti-h-met antibody, in PBS with added anti-E-cad antibody The chamber slides incubated in the above are incubated in PBS supplemented with FITC-labeled anti-rabbit IgG antibody, each of which is a secondary antibody. Moreover, the chamber slide incubated in PBS to which the anti-vimentin antibody is added is incubated in PBS to which the rhodamine-labeled anti-rat IgG antibody, which is a secondary antibody, is added.
[0124]
When each chamber slide subjected to the above treatment was observed with a microscope, it was confirmed that Vimentin and h-met were strongly expressed as shown in FIG. AQP-1 and E-cad were partially negative, but their expression was confirmed. In addition, the expression of other markers was not confirmed. Therefore, rKS56 is considered to have the ability to differentiate into a line forming a lumen such as the proximal tubule 4.
[0125]
From the results examined above, it was confirmed that rKS56 has proliferation ability, self-replication ability, and differentiation ability, and is a kidney stem / progenitor cell.
[0126]
Engraftment of rKS56 to the kidney
Next, it was examined whether rKS56 was engrafted in the kidney.
[0127]
First, the DiKS dye is incorporated into rKS56 using a vybrant cell-labeling solution (Molecular probe).
[0128]
Next, an adult SD rat that is approximately 150 g is used to create an ischemic acute renal failure model.
[0129]
Next, rKS56 into which DiO dye is incorporated is mixed with the culture solution shown in Table 3, and transplanted into the subcapsular route of the ischemic acute renal failure model, and then the abdomen is closed.
[0130]
After 7 days, the animals are sacrificed, the kidneys are excised, sliced, and observed with a microscope. As a result of observation, as shown in FIGS. 19A and 19B, the rKS 56 into which the DiO dye was incorporated was engrafted in the proximal tubule 4 and was also present in the stroma.
[0131]
In addition, although the glomerulus 2 exists in the lower right part of the micrographs shown in FIGS. 19C and 19D, the presence of the rKS 56 into which the DiO dye is incorporated is recognized at the position where the glomerulus 2 exists. I couldn't. However, the presence of rKS56 into which DiO dye was incorporated was observed in the tubules around glomerulus 2.
[0132]
19A and 19C are images showing the results of observation with an optical microscope, and FIGS. 19B and 19D are images showing the results of observation with a fluorescence microscope.
[0133]
Treatment of ischemic renal failure model using rKS56
Finally, it was confirmed that the function of the kidney can be recovered by transplanting rKS56 into the kidney with reduced function.
[0134]
First, an ischemic acute renal failure model is created using adult SD rats weighing approximately 150 g.
[0135]
Next, the ischemic acute renal failure model was divided into two groups, and the rats belonging to one group incorporated DiO dye and were suspended in 1.6 × 10 6 in the culture medium shown in Table 3.⁶Pieces of rKS56 are implanted into the subrenal route by injection. Hereinafter, a group of SD rats transplanted with rKS56 is referred to as a treatment group, and a group not transplanted with rKS56 is referred to as an untreated group.
[0136]
Then, the SD rat in the treatment group and the SD rat in the non-treatment group are sacrificed on the 4th and 7th days after the treatment of the SD rat in the treatment group. The ischemic acute renal failure model is usually sacrificed on the 4th and 7th days in this embodiment because the kidney function deteriorates most on about the 4th day and recovers on the 7th day.
[0137]
Then, the kidneys are removed from the rats sacrificed on the 4th day, and sections are prepared. When the prepared section was observed with a microscope, as shown in FIG. 20, in the SD rat in the treatment group, rKS56 was mainly engrafted in S2 segment 13 and S3 segment 14.
[0138]
Further, the prepared section was incubated in PBS to which an anti-AQP-1 antibody as a primary antibody was added, and then in PBS to which a rhodamine-labeled anti-rabbit IgG antibody (manufactured by Chemicon) as a secondary antibody was added. When incubated and observed under a microscope, expression of AQP-1 was observed in rKS56 engrafted in SD rats of the treatment group, as shown in FIG.
[0139]
Note that FL in FIG. 20 is an image obtained by observing a state in which cells incorporating DiO dye are engrafted, and AQP-1 in FIG. 20 indicates a state in which AQP-1 is expressed. FIG. 20 is an image observed with a microscope, and merge2 in FIG. 20 is an image obtained by observing a state where cells incorporating DiO dye are engrafted and a state where AQP-1 is expressed. It is a double image with an image.
[0140]
In addition, blood and urine were collected from rats sacrificed on day 4 and SD rats sacrificed on day 7, and creatinine concentration, creatinine clearance, urinary N-acetyl-β-D-glucosaminidase (hereinafter referred to as U-NAG). The concentration of 1,25-dihydroxycholecalciferol (hereinafter referred to as activated vitamin D3) concentration was measured to examine the kidney function, and the results shown in FIG. 21 were obtained. In addition, the measurement of the creatinine density | concentration, the U-NAG density | concentration, and the activated vitamin D3 density | concentration was performed in SRL Corporation. Creatinine clearance was calculated from the creatinine concentration. In the present embodiment, blood and urine were collected from 6 SD rats sacrificed on the 4th day and 6 SD rats sacrificed on the 6th day, respectively.
[0141]
As shown in FIG. 21 (A), the creatinine concentration was not significantly different between the treated group and the untreated group on both the 4th and 7th days. Moreover, as shown in FIG. 21 (B), creatinine clearance had already recovered on the 4th day in the treated group, whereas it recovered on the 7th day in the untreated group. In addition, as shown in FIG. 21B, U-NAG was not decreased in the untreated group, whereas the deterioration was suppressed in the treated group. In addition, as shown in FIG. 21 (D), the activated vitamin D3 concentration was significantly increased in the treatment group.
[0142]
Therefore, it is considered that the lesion of glomerulus 2 was suppressed by transplanting rKS56 because the creatinine clearance was slightly recovered on the 4th day in rats with ischemic acute renal failure. In addition, since the increase in the U-NAG concentration was suppressed, it is considered that the proximal tubule 4, the distal tubule 6, and the interstitial lesion were suppressed. Moreover, since the activated vitamin D3 concentration is rising, it is thought that the secretion of PTH was induced. That is, it was suggested that transplantation of rKS56 may cure renal failure.
[0143]
【The invention's effect】
The kidney stem cell / progenitor cell according to the present invention is isolated from a mammalian kidney and has a proliferation ability, a self-replication ability, and a differentiation ability. Therefore, the kidney disease can be cured by transplanting to the kidney.
[0144]
In addition, the method for isolating kidney stem cells / progenitor cells according to the present invention includes a separation step for separating the kidney for each site, an isolation step for isolating cells at each site separated in the separation step, and a separation step And the step of culturing the cells of each site separated in (1) together with supporting cells or a supporting cell culture solution to obtain cells having high proliferation ability. Therefore, according to the method for isolating kidney stem cells / progenitor cells according to the present invention, kidney stem cells having proliferation ability, replication ability, and differentiation ability can be isolated.
[0145]
In the method for treating renal disease according to the present invention, kidney stem cells / progenitor cells isolated from a mammalian kidney and having high proliferation ability, self-replication ability, and differentiation ability are transplanted into a kidney having reduced function. Therefore, according to the renal disease treatment method of the present invention, it is possible to regenerate the kidney and restore the function of the kidney, so that the renal disease can be cured.
[Sequence Listing]

[Sequence Listing Free Text]
SEQ ID NOs: 1 to 4 are synthetic primers, SEQ ID NOs: 1 and 3 are sense primers, and SEQ ID NOs: 2 and 4 are antisense primers.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram for explaining a kidney.
FIG. 2 is a diagram showing the number of BrdU-stained cells at each site.
FIG. 3 is a graph showing that the cells isolated from the S3 segment have a higher proliferation ability than cells isolated from other sites.
FIG. 4 is a diagram showing the number of three or more colonies when cells separated from each site are cultured.
FIG. 5 is a diagram showing the appearance of highly proliferative cells separated from the S3 segment.
FIG. 6 is a diagram showing the number of days in which highly proliferative cells separated from the S3 segment are cultured and the appearance according to the number of days.
FIG. 7 is a view showing that a high proliferative cell separated from an S3 segment has an autoproliferative ability.
FIG. 8 is a diagram showing the expression of h-met, pan-cytokeratin, vimentin, AQP-1, and E-cad on the surface of highly proliferative cells.
FIG. 9 is a diagram showing a state in which Pax-2 DNA and Wnt-4 DNA separated from highly proliferative cells are electrophoresed.
FIG. 10 shows that Pax-2 and Wnt-4 are expressed in highly proliferative cells.
FIG. 11 is a diagram showing the number of rKS56 when rKS56 is cultured under each condition.
FIG. 12 is a graph showing differences in hormone reactivity when rKS56 is cultured under each condition.
FIG. 13 shows that expression of Pax-2, Wnt-4, and Flk-1 is reduced by not adding a culture solution obtained by culturing feeder cells in DMEM / F12.
FIG. 14 is a view showing that the expression of AQP-1 and h-met does not change regardless of the addition of a culture solution obtained by culturing feeder cells in DMEM / F12.
FIG. 15 is a diagram showing that one round of larger cells is observed when rKS56 is cultured without adding a culture solution obtained by culturing feeder cells in DMEM / F12.
FIG. 16 is a diagram showing the difference in expression of AQP-1 and THP when rKS56 is cultured in a culture solution having the composition shown in Table 8.
FIG. 17 shows that rKS56 is implanted into the abdominal wall muscle of an SD rat to form a luminal structure.
FIG. 18 shows that AQP-1, h-met, and Vimentin are expressed in the transplanted rKS56 in SD rats transplanted with rKS56 in the abdominal wall muscle.
FIG. 19 is a view showing that the transplanted rKS56 is engrafted.
FIG. 20 is a diagram showing that rKS56 is engrafted in an acute renal failure model.
FIG. 21 is a graph showing creatinine concentration, creatinine clearance, U-NAG concentration, activated vitamin D3 concentration, and the like.
[Explanation of symbols]
1 Nephron, 2 Glomerulus, 3 Bowman's sac, 4 Proximal tubule, 5 Henle loop, 6 Distal tubule, 7 Collection tube, 11 S1 segment, 12 PCT, 13 S2 segment, 14 S3 segment

Claims

A separation step of separating the adult rat kidney for each site;
An isolation step of isolating cells at each site separated in the separation step;
Among the parts separated in the separation step, the cells of the S3 segment, insulin, transferrin, using selenium, hepatocyte growth factor, Nikochinamaido, dexamethasone, and the serum-containing culture solution containing feeder cells or feeder cell cultures A method for separating kidney stem cells / progenitor cells , comprising culturing on collagen to obtain cells having high proliferation ability.

A kidney stem cell / progenitor cell, which is separated by the method for separating kidney stem cells / progenitor cells according to claim 1 and has proliferation ability, self-replication ability, and differentiation ability.

3. The renal stem / progenitor cell according to claim 2, wherein Pax-2 and Wnt-4 are expressed.

A kidney stem cell / progenitor cell separated by the method for separating kidney stem cells / progenitor cells according to claim 1, wherein insulin, transferrin, selenium, hepatocyte growth factor, nicotinamide, dexamethasone, leukemia inhibitory factor, and feeder cell or feeder cell culture A method for inducing differentiation of kidney stem cells / progenitor cells, comprising culturing on collagen using a serum-containing culture solution containing the solution and allowing the cells to differentiate into proximal tubular cells.

A serum containing insulin, transferrin, selenium, hepatocyte growth factor, nicotinamide, dexamethasone, and feeder cells or feeder cell culture medium, wherein the kidney stem cells / progenitor cells separated by the method of separating kidney stem cells / progenitor cells according to claim 1 It is maintained undifferentiated by culturing on collagen using the culture medium containing it, and further differentiated into proximal tubule cells by culturing on collagen using the serum-containing culture medium containing the leukemia inhibitory factor. A method for regulating differentiation of kidney stem cells / progenitor cells, characterized by comprising: