JP4092201B2 - 病原微生物の検出方法 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、病原微生物の検出に有用なオリゴヌクレオチドプローブ、プライマー、これらを使用する病原微生物の検出方法、ならびに該方法のためのキットに関する。
背景技術
病原微生物の検出方法としては、当該微生物由来のタンパク質を免疫学的に検出する方法あるいは当該微生物由来の遺伝子の特定の領域を核酸増幅反応により増幅して検出する方法等が知られている。上記遺伝子の特定の領域を検出する方法としては、核酸増幅反応を用いる検出法が例示される。該核酸増幅反応としては、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号および第４，８００，１５９号に記載のポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）、トレンズ イン バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）第１０巻、１４６〜１５２頁（１９９２）に記載の当該方法と逆転写酵素反応を組合わせた逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ法）、１９８９年６月１４日に公開された欧州特許出願第３２０，３０８号に記述されているリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＰＣＲ プロトコールズ（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．，１９９０）２４５〜２５２頁に記述されている転写増幅システム（ＴＡＳ；ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）法が挙げられる。
また、等温状態で実施可能な核酸増幅法が開発された。例えば、特公平７−１１４７１８号に記載の鎖置換型増幅（ＳＤＡ；ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、自立複製（３ＳＲ；ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）法、日本国特許番号第２６５０１５９号に記載の核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ；ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、日本国特許番号第２７１０１５９号に記載のＱβレプリカーゼ法、さらに米国特許番号第５，８２４，５１７号、国際公開第９９／０９２１１号パンフレット、国際公開第９５／２５１８０号パンフレットあるいは、国際公開第９９／４９０８１号パンフレット等に記載の種々の改良ＳＤＡ法が挙げられる。米国特許番号第５，９１６，７７７号には等温状態でのオリゴヌクレオチドの酵素的合成方法が記載されている。さらに、国際公開第００／２８０８２号パンフレットに記載のＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、国際公開第００／５６８７７号パンフレットに記載のＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）法がある。
このように、病原微生物の検出方法において利用できる核酸増幅法はいろいろあるが、実際の病原微生物を検査する現場が要求する検出感度を満たすように、それぞれの核酸増幅反応に適した標的核酸領域、それぞれの核酸増幅方法に適したプライマーならびにそれぞれの核酸増幅反応に続く標的核酸検出方法に適したプローブを選択することは困難であった。さらに、低ランニングコストで、かつ再現性のある結果を得ることができる病原微生物の検出方法が求められていた。以下、病原微生物として、結核菌群、リン菌、クラミジア、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を例に挙げて説明する。
（ａ）結核菌群
結核は、過去において人間の死因の上位を占める疾患であり、種々の治療法が開発された現在においてもなお多数の患者が存在する。
結核の診断は、従来、培養法、塗抹法によって行われてきたが、結核菌は発育が遅いことから、検査結果が得られるまで１〜８週間、通常約１ヶ月と迅速性に欠け、正確さも７０％以下であるなど十分な診断法ではなかった。このような背景から、近年、結核菌の遺伝子をターゲットとした、喀痰などからの直接、迅速、正確な検出法ならびに試薬が開発されている。上記結核菌群には、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｅｔｔｉが含まれる。
例えば、喀痰などの検体からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法により結核菌の存在を迅速に検出する方法［ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、第８６７１号、第１０６９頁（１９８９）］が報告されている。該方法は結核菌の６５ｋＤａ抗原をコードする遺伝子をターゲットとしてＰＣＲ法により増幅し、電気泳動法で検出する方法である。また、１６ＳリボソームＲＮＡを増幅し、増幅産物を化学発光プローブで検出するキットも市販されている［ジェン−プローブ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ）社］。さらに、１６ＳリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡをターゲットとしたＰＣＲキットも市販されている（ロシュ社）。
一方、結核菌群に特異的なＩＳ６１１０という遺伝子の配列が公表されており［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１８巻、第１８８頁（１９９０年）］、結核菌群の検出のためのプローブとして有用であろうことが記載されている。実際、ＰＣＲ法によるＩＳ６１１０遺伝子の検出方法が報告されている［ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、第２８巻、第２６６８頁（１９９０）］。その後、ＩＳ６１１０遺伝子をターゲットとしたＰＣＲ法に関する論文は多数報告され、その有用性が記載されている。また、ＰＣＲ法とは別の核酸増幅法であるＳＤＡ法によるＩＳ６１１０遺伝子の検出に関する日本特許第２８１４４２２号、ＬＣＲ法によるＩＳ６１１０遺伝子の検出に関する特表平１０−５０００２３号がある。
しかしながら、上記の結核菌の検出方法は臨床の現場ではまだまだ満足できる方法ではなく、さらなる改善が要望されている。例えば、リボソームＲＮＡ遺伝子をターゲットとした核酸増幅検出法が広く報告されているが、あくまでもＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に共通な部分を増幅し、種特異的なプローブで結核菌を同定するものである。該方法では結核菌への特異性を決定するのはプローブの配列だけであり、検出感度の点を含めて不安があり、培養陽性検体であっても検出できない症例が存在することが多々報告されている。一方、特異性と検出感度を上げるため上記のようにＩＳ６１１０という結核菌特異的な遺伝子をターゲットとしたＰＣＲ法も報告されている。しかし、７つの施設でのＩＳ６１１０をターゲットとした検査の比較研究では、当該方法による偽陽性の割合が３〜７７％、感度が２〜９０％と各施設ごとに検査結果が大きく異なることが明らかとされている［ジャーナル オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー、第３２巻、第２７７頁（１９９４）］。
一方、検体からの核酸の抽出方法も煩雑で、検査員の感染という面でも十分配慮された抽出法ではなかった。
また、増幅産物の検出法においてハイブリダイゼーション法が利用されるが、従来は増幅された二本鎖の核酸をまず液層で強アルカリで変成させ、次に変成した一本鎖核酸を剥がれた相補的核酸の共存下で中性条件でプローブとハイブリダイズさせる方法が用いられていた（ロシュ社アンプリコアキット説明書）。これでは、プローブのハイブリダイゼーションが、２本鎖から剥がれた相補的増幅核酸に競合的に妨害され感度・特異性が上がらないという問題点があった。すなわち、増幅された二本鎖ＤＮＡをいったんアルカリ変性によって一本鎖とし、これを中和した後に中性条件下でプローブとハイブリダイズさせていた。また、アルカリ変性を嫌って熱変性を行う場合もあったが、これでは多数の検体を精度良く検査することは不可能であった。このため、工程も多く、また一本鎖とされたＤＮＡの一方がプローブと競合してハイブリダイズし、標的核酸の検出感度を低下させることにもなった。
また、従来の方法ならびに市販のキットでは検体採取から結果報告まで約６時間以上を要し、結核症という感染症であるがゆえに一刻も早い診断と患者隔離などの対処が要求されるにもかかわらず、検体採取から結果報告とそれに伴う患者への対処が即日対応できず翌日になってしまい、結核感染の伝播を最小限に食い止めることができないという公衆衛生上重大な問題点が解決されず残っていた。
以上のように公開されている情報から、結核菌に対する信頼でき、かつ医療の場に有用なものは未だ存在しないことが明らかになった。
（ｂ）リン菌
リン菌（すなわちナイセリア・ゴノルホエア、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）は、アメリカ合衆国において最も一般的に報告される細菌感染の１つである淋病の病原体である。Ｍｉｙａｄａ ａｎｄ Ｂｏｒｎ，１９９１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ５：３２７−３３５；アメリカ特許第５，２５６，５３６号；及びアメリカ特許第５，５２５，７１７号は、Ｎ．ゴノルホエア シトシンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｍ．Ｎｇｏ ＰＩＩ）の配列と有意な相同性を有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）を含むゲノムフラグメントに由来するＤＮＡプローブを用いてのＮ．ゴノルホエアの検出を記載している。しかしながら、リン菌を特異的にかつ十分な感度で検出できる方法はなかった。
また、リン菌により感染された患者は、クラミジア トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）にも感染している事例が報告されている。
（ｃ）クラミジア
「クラミジア」とはクラミジア属に属する微生物をいう。クラミジア属の三つの種、クラミジア トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミジアシッタシ（Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ）、クラミジア ニューモニエ（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）はヒト宿主に感染し、疾患を起こしうることから臨床的に重要である。特にクラミジア トラコマチスは、男女両性で性器感染症を引き起こす、先進社会で最も一般的な性的伝染病であると報告されている。従って、クラミジア トラコマチスを特異的に、そして適時に検出できる方法および試薬が必要とされている。
（ｄ）ＨＣＶ
従来より、血清等の試料中のＨＣＶの検出は、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法により行われている。この方法は、（１）血清からのＨＣＶのＲＮＡの抽出、（２）抽出したＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡの合成、（３）温度を上下させるＰＣＲ法による増幅、（４）固定化プローブとのハイブリダイゼーション、（５）未反応試薬の洗浄除去、（６）標識試薬との反応、（７）未反応試薬の洗浄除去、（８）発色試薬の添加、（９）発色停止薬の添加、（１０）吸光度の測定の計１０工程で行われている。また、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｖｏｌ．６４，ｐｐ１４７−１５９（１９９７）記載のリアルタイム検出ＰＣＲ法を用いたホモジニアス検出法によるＨＣＶ検出も検討されている。
上記のようにＨＣＶを高感度に簡便に、かつ大量検体を迅速にかつ安価に測定することは、血液製剤、輸血、献血の品質管理、治療経過の判定、症例のモニタリング、あるいは治療費用の低減の観点からも非常に重要である。しかしながら、上記ＰＣＲ法では温度の厳密な制御が必須であり、そのための測定機械は複雑かつ大掛かりなものとなる一方で、その処理能力は、現時点では５時間で９６検体が限界である。そのため、血液センターや臨床検査センターで要求される２時間に１０００検体以上という大量検体を測定することは不可能であった。
このように従来の方法は、いろいろな問題をかかえており、一定時間内に多数の検体中のＨＣＶ核酸を簡便に短時間で測定する技術が求められていた。
発明の目的
本発明の主な目的は、一定時間内に多数の検体について病原微生物を高感度で正確に、かつ、簡便に短時間で、さらに安価で測定する手段を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは鋭意研究の結果、従来の核酸増幅方法より優れた核酸増幅方法を利用した病原微生物の検出方法を見出した。また、該方法のための標的核酸増幅用キメラオリゴヌクレオチドプライマーおよび標的核酸検出用プローブを見出した。さらに、該方法のためのキットを構築し、、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明の第１の発明は、結核菌群のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓＢＣＧ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｒｏｔｉ及び／又はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｅｔｔｉを検出可能なプローブであって、配列表の配列番号３９記載の塩基配列あるいはその一部を含有することを特徴とするプローブあるいは配列表の配列番号１１記載の塩基配列であること特徴とするプローブに関する。
本発明の第２の発明は、リン菌のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを検出可能なプローブであって、配列表の配列番号２７記載の塩基配列あるいはその一部を含有することを特徴とするプローブあるいは配列表の配列番号２１記載の塩基配列であること特徴とするプローブに関する。
本発明の第３の発明は、クラミジアのＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを検出可能なプローブであって、配列表の配列番号２２記載の塩基配列あるいはその一部を含有することを特徴とするプローブあるいは配列表の配列番号２０記載の塩基配列であること特徴とするプローブに関する。
本発明の第４の発明は、ＨＣＶを検出可能なプローブであって、配列表の配列番号３４、３５記載の塩基配列であること特徴とするプローブに関する。
本発明の第５の発明は、アルカリ領域において病原微生物の標的核酸にハイブリダイズ可能なプローブに関する。本発明の第５の発明においてｐＨ８〜１４のアルカリ領域において病原微生物の標的核酸にハイブリダイズ可能なプローブが好適であり、当該病原微生物の標的核酸は結核菌、リン菌、クラミジア、ＨＣＶ由来の標的核酸のいずれかであるプローブが好ましい。また、病原微生物の標的核酸は結核菌群のＩＳ６１１０遺伝子、リン菌のｃｐｐＢ遺伝子、クラミジアのｐＬＧＶ４４０、ＨＣＶの５’非翻訳領域の塩基配列から選択され、該遺伝子にハイブリダイズ可能なプローブが好適に使用できる。該プローブとしては、結核菌群のＩＳ６１１０遺伝子に存在する配列表の配列番号３９に示される塩基配列、又はその一部を含有する塩基配列からなるプローブ、好ましくは配列表の配列番号１１に示される塩基配列からなるプローブが例示される。また、リン菌のｃｐｐＢ遺伝子に存在する配列表の配列番号２７に示される塩基配列、又はその一部を含有する塩基配列からなるプローブ、好ましくは配列表の配列番号２１に示される塩基配列からなるプローブが例示される。また、クラミジアのｐＬＧＶ４４０に存在する配列表の配列番号２２に示される塩基配列、又はその一部を含有する塩基配列からなるプローブ、好ましくは配列表の配列番号２０に示される塩基配列からなるプローブが例示される。さらにＨＣＶの５’非翻訳領域に存在する配列表の配列番号３４、３５に示される塩基配列、又はその一部を含有する塩基配列からなるプローブ、好ましくは配列表の配列番号３４、３５に示される塩基配列からなるプローブが例示される。
本発明の第１〜第５の発明のプローブは、標識を付加されていてもよい。該プローブは、配列表の配列番号１１、２０、２１、３４、３５で示される塩基配列のうち連続する８塩基ないし５３塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであって、標的核酸とハイブリダイズした場合には蛍光強度が抑制されず、標的核酸とハイブリダイズしない場合は蛍光強度が抑制されるように蛍光標識されたものであることを特徴とする病原微生物検出用プローブであってもよい。また、配列表の配列番号１１、２０、２１、３４、３５に示される塩基配列のうち、連続する８塩基以上からなる病原微生物検出用プローブであってもよく、その５’末端がローダミン系蛍光色素またはオキサジン系蛍光色素で標識されたプローブであって、配列表の配列番号３４に示される塩基配列のうち、連続する８塩基以上からなることを特徴とする病原微生物検出用プローブであってもよい。当該標識蛍光色素がレポーター蛍光色素及びクエンチャー色素を有するプローブであって、配列表の配列番号１１、２０、２１、３４、３５に示される塩基配列のうち、連続する８塩基以上からなることを特徴とする病原微生物検出用プローブであってもよい。上記レポーター色素は、フルオレッセイン系色素であり、クエンチャー色素がＤＡＢＣＹＬ系色素であってもよい。さらに、蛍光物質、色素、酵素、ビオチン、金コロイド、および放射性同位体から選択される標識を付加されているプローブが好適に使用できる。
本発明の第６の発明は、本発明の第１〜第５の発明のプローブを使用し、病原微生物の標的核酸とハイブリダイゼーションを行う工程を包含する病原微生物の検出方法に関する。本発明の第６の発明において、アルカリ領域で病原微生物の標的核酸とハイブリダイゼーションを行うことができる。また、当該病原微生物としては結核菌群、リン菌、クラミジア、ＨＣＶが例示される。当該病原微生物が結核菌群の場合、標的核酸はＩＳ６１１０遺伝子またはその断片が好適であり、結核菌由来のＩＳ６１１０遺伝子および／またはその断片を増幅した後に、増幅物と本発明の第１または第５の発明のプローブとの間でハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、配列表の配列番号３６、３７にそれぞれ示される塩基配列、もしくは該配列に一部重複する配列を有するプライマーを使用して結核菌群由来のＩＳ６１１０遺伝子および／またはその断片が増幅されることが好ましい。また、病原微生物がリン菌の場合、標的核酸はｃｐｐＢ遺伝子またはその断片が好適であり、リン菌由来のｃｐｐＢ遺伝子および／またはその断片を増幅した後に、増幅物と本発明の第２または第５の発明のプローブとの間でハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、配列表の配列番号２８、２９にそれぞれ示される塩基配列、もしくは該配列に一部重複する配列を有するプライマーを使用してリン菌由来のｃｐｐＢ遺伝子および／またはその断片が増幅されることが好ましい。また、病原微生物がクラミジアの場合、標的核酸はｐＬＧＶ４４０またはその断片が好適であり、クラミジア由来のｐＬＧＶ４４０および／またはその断片を増幅した後に、増幅物と本発明の第３または第５の発明のプローブとの間でハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、配列表の配列番号２３〜２６にそれぞれ示される塩基配列、もしくは該配列に一部重複する配列を有するプライマーを使用してクラミジア由来のｐＬＧＶ４４０および／またはその断片が増幅されることが好ましい。また、病原微生物がＨＣＶの場合、標的核酸はＨＣＶの５’非翻訳領域またはその断片が好適であり、ＨＣＶ由来の５’非翻訳領域および／またはその断片を増幅した後に、増幅物と本発明の第４または第５の発明のプローブとの間でハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、配列表の配列番号３０〜３３にそれぞれ示される塩基配列、もしくは該配列に一部重複する配列を有するプライマーを使用してＨＣＶ由来の５’非翻訳領域および／またはその断片が増幅されることが好ましい。
本発明の第７の発明は、本発明の第６の発明の病原微生物の標的核酸の検出方法を用いて結核菌群、リン菌、クラミジア、ＨＣＶ由来の核酸を検出する工程を包含する病原微生物の検出方法に関する。
本発明の第８の発明は、下記工程を包含する核酸増幅方法で得られる増幅核酸を検出することを特徴とする病原微生物の検出方法。
（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種類のプライマー、およびＲＮａｓｅＨを混合して反応混合物を調製する工程；ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり、；および、
（ｂ）反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートする工程、
に関する。本発明の第８の発明において、さらに鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相同な配列を有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有する反応混合物を使用することが好ましい。また、当該キメラオリゴヌクレオチドプライマーが下記一般式で表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーであるものが好適に使用できる。
一般式：５’−ｄＮａ−Ｎｂ−ｄＮｃ−３’
（ａ：１１以上の整数、ｂ：１以上の整数、ｃ：０または１以上の整数、ｄＮ：デオキシリボヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ、Ｎ：未修飾リボヌクレオチド及び／又は修飾リボヌクレオチド、なお、ｄＮａの部位の一部のｄＮはＮで置換されていてもよい）
また、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーのｃが０であってもよく、ヌクレオチドアナログがデオキシリボイノシンヌクレオチド、デオキシリボウラシルヌクレオチドであり、修飾リボヌクレオチドが（α−Ｓ）リボヌクレオチドであってもよい。また、配列表の配列番号１３〜１６、２３〜２６、２８〜３１でそれぞれ表される塩基配列からなるキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用することが好ましい。さらに、本発明の第１〜第５の発明のプローブを用いて増幅核酸を検出する工程を包含してもよい。
本発明の第９の発明は、下記一般式で表される病原微生物検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマーに関する。
一般式：５’−ｄＮａ−Ｎｂ−ｄＮｃ−３’
（ａ：１１以上の整数、ｂ：１以上の整数、ｃ：０または１以上の整数、ｄＮ：デオキシリボヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ、Ｎ：未修飾リボヌクレオチド及び／又は修飾リボヌクレオチド、なお、ｄＮａの部位の一部のｄＮはＮで置換されていてもよい）
本発明の第９の発明において、ｃが０であるものが好適に使用でき、当該ヌクレオチドアナログがデオキシリボイノシンヌクレオチド、デオキシリボウラシルヌクレオチドであり、修飾リボヌクレオチドが（α−Ｓ）リボヌクレオチドであるキメラオリゴヌクレオチドプライマーが好適である。とくに限定はされないが、例えば配列表の配列番号１３〜１６、２３〜２６、２８〜３１でそれぞれ表される病原微生物検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマーが好適である。
本発明の第１０の発明は、配列表の配列番号３６、３７にそれぞれ示される塩基配列、もしくは該配列に一部重複する配列を有する、結核菌由来のＩＳ６１１０遺伝子および／またはその断片を増幅するためのプライマー、配列表の配列番号２７に示される塩基配列、もしくは該配列に一部重複する配列を有する、リン菌由来のｃｐｐＢ遺伝子および／またはその断片を増幅するためのプライマー、配列表の配列番号２２に示される塩基配列、もしくは該配列に一部重複する配列を有する、クラミジア由来のｐＬＧＶ４４０および／またはその断片を増幅するためのプライマー、配列表の配列番号４１〜４３にそれぞれ示される塩基配列、もしくは該配列に一部重複する配列を有する、ＨＣＶ由来の５’非翻訳領域および／またはその断片を増幅するためのプライマーに関する。
本発明の第１０の発明において、上記プライマーは塩基配列の一部がリボヌクレオチドに置換されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであってもよい。また、本発明の第９及び第１０の発明において、標識を付加されていてもよい。当該標識としては、蛍光物質、色素、酵素、ビオチン、および金コロイドが例示される。
本発明の第１１の発明は、本発明の第１〜第５の発明のプローブを含有することを特徴とする標的核酸検出用組成物に関する。
本発明の第１２の発明は、本発明の第９〜第１０の発明のプライマーを含有することを特徴とする標的核酸検出用組成物に関する。
本発明の第１１ならびに第１２の発明は、病原微生物の検出に使用できる。
本発明の第１３の発明は、本発明の第６〜第８の病原微生物の検出方法に使用するための組成物であって、標的核酸の増幅もしくはハイブリダイゼーションを行うための少なくとも１種の試薬を包含する病原微生物検出用組成物に関する。
本発明の第１３の発明において、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨ、及びデオキシリボヌクレオチド３リン酸から選択される試薬を含有してもよい。当該ＤＮＡポリメラーゼがバチルス カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼであってもよく、当該ＲＮａｓｅＨがピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来及び／又はアルカエオグロバス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）属細菌由来のＩＩ型ＲＮａｓｅＨであってもよい。
本発明の第１４の発明は、本発明の第１〜第５の発明のプローブを含有することを特徴とする病原微生物検出用キットに関する。
本発明の第１４の発明において、本発明の第９〜第１０のプライマーを含有してもよい。当該キットは、結核菌群、リン菌、クラミジア、ＨＣＶの検出に使用することができる。また、当該キットは、本発明の第６〜第８の病原微生物の検出方法に使用するためのキットであって、標的核酸の増幅もしくはハイブリダイゼーションを行うための少なくとも１種の試薬を包含してもよい。また、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨ、及びデオキシリボヌクレオチド３リン酸から選択される試薬を含有してもよい。当該ＤＮＡポリメラーゼがバチルス カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼが好適であり、ＲＮａｓｅＨがピロコッカス属細菌由来及び／又はアルカエオグロバス属細菌由来のＩＩ型ＲＮａｓｅＨであってもよい。さらに、増幅産物を捕捉するための担体を含有してもよく、該担体がマイクロタイタープレート、ビーズ、マグネチックビーズ、メンブラン、およびガラスから選択される担体であるものが好適に使用できる。
本発明の第１５の発明は、結核菌群の検出方法において、結核菌含有検体をムラミダーゼで処理し、核酸を抽出する工程を包含することを特徴とする結核菌群の検出方法に関する。
発明の詳細な説明
本明細書においてデオキシリボヌクレオチド（本明細書中ではｄＮとも記載する）とは、糖部分がＤ−２−デオキシリボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、例えば、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、チミンを有するものが挙げられる。さらに、７−デアザグアノシン等の修飾塩基を有するデオキシリボヌクレオチドやデオキシイノシンヌクレオチドのようなデオキシリボヌクレオチドアナログも上記のデオキシリボヌクレオチドに包含される。
本明細書においてリボヌクレオチド（本明細書中ではＮとも記載する）とは、糖部分がＤ−リボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、ウラシルを有するものが挙げられる。さらに、当該リボヌクレオチドには修飾リボヌクレオチドが包含され、例えばα位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えた修飾リボヌクレオチド［（α−Ｓ）リボヌクレオチド、（α−Ｓ）Ｎとも記載する］やこの他の誘導体等も含まれる。
本明細書においてキメラオリゴヌクレオチドプライマーとは、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有するプライマーのことを言う。該プライマーはヌクレオチドアナログおよび／または修飾ヌクレオチドを含有していてもよい。
本発明に使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、該プライマーの３’末端又は３’末端側にリボヌクレオチドを配置し、本発明の方法において核酸鎖が伸長でき、エンドヌクレアーゼで切断でき、鎖置換反応を行うことができるものであれば、いずれもが本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーに包含される。
本明細書において３’末端側とは、核酸、例えば、プライマーにおいてその中央より３’末端にかけての部分を指す。同様に５’末端側とは、核酸においてその中央より５’末端にかけての部分を指す。
本明細書においてエンドヌクレアーゼとは、鋳型核酸にアニーリングした上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーよりＤＮＡの伸長を行って生成した二本鎖ＤＮＡに作用して、該プライマーのリボヌクレオチド部分を特異的に切断するものであればよい。
本明細書においてＤＮＡポリメラーゼとは、ＤＮＡ鎖を鋳型として新たなＤＮＡ鎖を合成する酵素のことを言い、天然型のＤＮＡポリメラーゼの他、前記活性を有する変異体酵素も包含される。当該酵素としては、例えば鎖置換（Ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有していないＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素活性やエンドヌクレアーゼ活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
本明細書において「鎖置換活性」とは、鋳型となる核酸配列に従ってＤＮＡ複製を行う際、ＤＮＡ鎖を置き換えながら進行し、鋳型鎖にアニーリングしている相補鎖を遊離させる、即ち鎖置換（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）することができる活性のことをいう。また、本明細書においては、鎖置換により鋳型となる核酸配列から遊離したＤＮＡ鎖のことを「置換鎖」と称する。
本明細書においてアルカリ領域とは、ｐＨが７を越える領域のことをいう。
本明細書において、病原微生物とは、病原性の細菌ならびにウイルスのことをいう。
本明細書において標的核酸とは、核酸増幅あるいは検出の対象となる病原微生物由来の遺伝子の任意の領域のことをいい、ＤＮＡあるいはＲＮＡのいずれもが含まれる。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のプローブ
本発明のプローブは、病原微生物、例えば結核菌群、リン菌、クラミジアあるいはＨＣＶを検出しうることを特徴とする。本発明のプローブの好適な態様としては、アルカリ領域において標的核酸に安定してハイブリダイズできるものが例示される。すなわち本発明のアルカリ領域でハイブリダイズ可能なプローブとしては、特に限定はないが、例えばｐＨ７．０を超えるアルカリ領域、好ましくはｐＨ８〜１４の範囲、特に好ましくはｐＨ８〜ｐＨ１０の範囲のアルカリ条件下においてその塩基配列に相補的な配列を有する標的核酸とハイブリダイズすることが可能なプローブ挙げられる。特に限定はされないが例えば、配列表の配列番号１１、２０、２１、３４、３５記載の塩基配列を含有するものが挙げられる。なお、本発明のプローブは従来の中性領域でのハイブリダイゼーションに用いることができる。
本発明のプローブを使用する場合、二本鎖核酸をアルカリ処理によって一本鎖に変性した後、中和することなくハイブリダイゼーション工程に使用することが可能である。これによって工程も簡略化され、感度も従来の方法の１０倍以上向上する。また、アルカリ領域でハイブリダイズさせることにより、ハイブリダイゼーションの特異性を向上させることができる。
検体由来の核酸とハイブリダイズしたプローブの検出法には特に限定はなく、公知の検出方法のいずれもが本発明に適用できる。
上記の本発明のプローブを適切な方法で標識して使用することにより、試料中に存在する標的核酸を効率よくおよび／または高感度に検出することができる。
プローブの標識方法には限定はなく、例えば放射性同位体（^３２Ｐ等）、色素、蛍光物質、発光物質、種々のリガンド（ビオチン、ジゴキシゲニン等）、酵素等が使用できる。標識されたプローブは当該標識に応じた検出方法でその存在を確認することができる。直接検出できないリガンドの場合には、検出可能な標識を付されたリガンド結合性の物質と組み合わせればよい。例えば、リガンド標識したプローブと酵素標識した抗リガンド抗体とを組み合せ、シグナルを増幅することによって標的核酸を高感度に検出することが可能である。
さらに上記プローブは、検出のための標識物質を有していてもよい。標識物質は、特に限定はされないが例えばリガンドあるいはレセプター物質、放射性同位元素、蛍光、発光、発色のいずれもが好適に使用できる。
本発明の方法においては、標識物質を有したプローブと目的の領域を増幅した核酸とをハイブリダイズし、フリーのプローブを洗浄後に検出する方法やあるいは該洗浄工程を省いた、いわゆるホモジニアス検出法のいずれもが好適に使用できる。蛍光を利用した該ホモジニアス検出法としては、例えば、Ｐｒｏｃ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、ｖｏｌ．８５、ｐ８７９０〜８７９４（１９８８）に記載の蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ；Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）法、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１４、ｐ３０３〜３０８（１９９６）に記載の分子ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ）法、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、ｖｏｌ．７２、ｐ３７１７〜３７２４（２０００）に記載のスマートブローブ（Ｓｍａｒｔ ｐｒｏｂｅ）法等が好適に使用できる。
本発明の態様の一つとして、当該プローブの５’末端がローダミン系またはオキサジン系色素で標識され、３’末端がクエンチングを起こす塩基配列であるオリゴヌクレオチドやレポーター色素で標識され、さらに該プローブの５’末端側と３’末端側がセルフアニーリングしている、分子ビーコン法あるいはスマートプローブ法の場合が例示される。
上記のプローブを用いた場合、本発明の増幅方法によって増幅された核酸が存在すると、該増幅核酸にプローブがハイブリダイズして、プローブのセルフアニーリング構造が解消され、その結果として蛍光強度が抑制されずに蛍光シグナルを発するようになる。一方、増幅核酸が存在しない場合は、プローブはセルフアニーリング構造を保持し、蛍光強度が抑制されるため蛍光シグナルは検出されない。
すなわち、スマートプローブ法の場合、前記蛍光色素はローダミン系色素またはオキサジン系色素が好ましく、該色素は上記プローブの５’末端に結合され、３’末端の塩基配列と協調して標的核酸に該蛍光プローブが結合していないときは蛍光強度が抑制され、標的核酸に該蛍光プローブが結合した場合には蛍光強度が抑制されない性質を持つものであればよい。
一方、分子ビーコン法の場合は、標的核酸に該蛍光プローブが結合していない場合には蛍光共鳴エネルギー転移によってその蛍光強度が抑制され、結合した場合には蛍光強度が抑制されないような組み合わせになればよい。
これら蛍光色素としては、ＦＡＭ（６−カルボキシーフルオレッセイン）やＴＡＭＲＡ（６−カルボキシーテトラメチルーローダミン）やＪＡ２４２（オキサジン）やＤＡＢＣＹＬ（４−ジメチルアミノアゾベンゼン−４’−スルホニルクロライド）が好ましい。これらの蛍光色素は公知であり、市販されている。
なお、オリゴヌクレオチドに蛍光標識する方法は、例えば、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、ｖｏｌ．１２、ｐ３３８７〜３４０３（１９８４）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、ｖｏｌ．１１２、ｐ１２５３〜１２５４（１９９０）あるいは、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、ｖｏｌ．７０、ｐ４７７１〜４７７９（１９９８）に記載の方法が利用できる。
本発明のプローブの鎖長は、特に限定はされないが例えば、１２ｍｅｒ以上、好ましくは２０ｍｅｒ以上、特に好ましくは４０ｍｅｒ以上である。
本発明の結核菌群検出用プローブは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓＢＣＧ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｒｏｔｉ及び／又はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｅｔｔｉを検出することができる。当該プローブは、標的核酸は検出しようとする核酸、もしくは生物に応じて適切なものを選択すればよく、特に限定するものではないが、例えば結核菌群の検出においてはＩＳ６１１０遺伝子を標的核酸とするプローブが使用でき、配列表の配列番号１２に示される結核菌由来ＩＳ６１１０遺伝子の塩基配列から適切な領域を選択することにより設計することができる。特に限定はされないが例えば、配列表の配列番号３９に記載の塩基配列を含む領域から、好ましくは配列表の配列番号４０を含む領域から、さらに好ましくは配列表の配列番号３８を含む領域から選択することができる。特に配列表の配列番号１１記載の塩基配列を含む領域から選択することができる。上記のプローブは、結核菌群由来のＩＳ６１１０遺伝子、もしくはその断片と安定に、かつ高い特異性をもってハイブリダイズすることから、当該遺伝子の検出、さらには結核菌群の検出に特に有用である。
本発明のリン菌検出用プローブは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを検出することができる。当該プローブは、標的核酸は検出しようとする核酸、もしくは生物に応じて適切なものを選択すればよく、特に限定するものではないが、例えばリン菌の検出においてはｃｒｙｐｔｉｃ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎＢ（ｃｐｐＢ）遺伝子を標的核酸とするプローブが使用でき、配列表の配列番号２７に示されるリン菌由来ｃｐｐＢ遺伝子の塩基配列から適切な領域を選択することにより設計することができる。特に限定はされないが例えば、配列表の配列番号２７に記載の塩基配列を含む領域から、好ましくは配列表の配列番号２１を含む領域から選択することができる。上記のプローブは、リン菌由来のｃｐｐＢ遺伝子、もしくはその断片と安定に、かつ高い特異性をもってハイブリダイズすることから、当該遺伝子の検出、さらにはリン菌の検出に特に有用である。
本発明のクラミジア検出用プローブは、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを検出することができる。当該プローブは、標的核酸は検出しようとする核酸、もしくは生物に応じて適切なものを選択すればよく、特に限定するものではないが、例えばクラミジアの検出においてはクリプティック・プラスミド（ｃｒｙｐｔｉｃ ｐｌａｓｍｉｄ）ｐＬＧＶ４４０を標的核酸とするプローブが使用でき、配列表の配列番号２２に示されるクラミジア由来ｐＬＧＶ４４０の塩基配列から適切な領域を選択することにより設計することができる。特に限定はされないが例えば、配列表の配列番号２２に記載の塩基配列を含む領域から、好ましくは配列表の配列番号４４を含む領域から、さらに好ましくは配列表の配列番号２０を含む領域から選択することができる。上記のプローブは、クラミジア由来のｐＬＧＶ４４０、もしくはその断片と安定に、かつ高い特異性をもってハイブリダイズすることから、当該遺伝子の検出、さらにはクラミジアの検出に特に有用である。
また、本発明のＨＣＶ検出用プローブは、標的核酸増幅時に使用するフォワード側プライマー及びリバース側プライマーで挟まれた領域の塩基配列にハイブリダイズ可能なプローブであれば特に限定はされない。また、該プローブの長さは、特に限定はされないが、好ましくは８塩基〜５３塩基の範囲、特に好ましくは８塩基〜３６塩基の範囲で選択すればよい。例えば、配列表の配列番号４３に示される塩基配列から上記範囲で連続する８塩基以上の塩基配列を有するプローブを選択すればよく、特に限定はされないが、配列表の配列番号３４あるいは３５に示される塩基配列の中の連続する８塩基以上を有するプローブが挙げられる。
（２）本発明の検出方法
本発明の標的核酸の検出方法は、上記（１）記載のプローブを用いることにより、標的核酸の２本鎖から１本鎖への変性工程に続く中和工程を省略できる。すなわち、本発明の標的核酸の検出方法においてｐＨが７を越えるアルカリ条件、特に好ましくはｐＨ８〜１４の範囲のアルカリ条件下においてその塩基配列に相補的な配列を有する核酸とハイブリダイズすることが可能である。当該ハイブリダイゼーションの条件としては、特に限定するものではないが、「厳密な条件」として当業者に知られている条件を挙げることができる。このような条件は、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．）に記載のものや、本願実施例に記載されたものが使用できる。
代表的なハイブリダイゼーション溶液の組成としては次のものが挙げられる：０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ［Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ；０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００］及び１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム）。なお、本発明においてはハイブリダイゼーション溶液のｐＨは８〜１４の範囲に調整して実施してもよい。
ハイブリダイゼーションの温度は、特に限定されるものではないが、例えばプローブのＴｍ値より５℃以上低い温度で実施される。
ここで、プローブのＴｍ値は、例えば下記式：
Ｔｍ＝８１．５−１６．６（ｌｏｇ_１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）
（式中、Ｎはプローブの鎖長、％Ｇ＋Ｃはプローブ中のグアニンおよびシトシン残基の含量である）
により求められる。
また、プローブの鎖長が１８塩基よりも短い場合には、Ｔｍ値は下記式：
Ｔｍ＝（％Ａ＋Ｔ）×２＋（％Ｇ＋Ｃ）×４］
（式中、（％Ａ＋Ｔ）はプローブ中のアデニンおよびチミン残基の含量、（％Ｇ＋Ｃ）はプローブ中のグアニンおよびシトシン残基の含量である）
として推定することができる。
上記のハイブリダイゼーション条件でプローブと標的核酸のハイブリダイズを確認することにより、標的核酸の検出に適したプローブを選定することができる。
本発明の検出方法におけるハイブリダイゼーション条件には特に限定はなく、公知のハイブリダイゼーション条件、好ましくは厳密なハイブリダイゼーション条件が使用される。また、ハイブリダイゼーション溶液のｐＨは８〜１４の範囲に調整してもよい。
本発明の標的核酸の検出方法の一態様としては、例えば結核菌群の検出方法においては、結核菌群由来のＩＳ６１１０遺伝子の検出に適したプローブが好適に使用でき、特に限定するものではないが、例えば、配列表の配列番号３９記載の塩基配列もしくはその一部、好ましくは配列表の配列番号４０記載の塩基配列もしくはその一部、さらに好ましくは配列表の配列番号３８記載の塩基配列もしくはその一部、特に好ましくは配列表の配列番号１１を含有するプローブが本発明に好適に使用できる。また、例えばリン菌の検出方法においては、リン菌由来のｃｐｐＢ遺伝子の検出に適したプローブが好適に使用でき、特に限定するものではないが、例えば、配列表の配列番号２７記載の塩基配列もしくはその一部、好ましくは配列表の配列番号２１記載の塩基配列もしくはその一部を含有するプローブが本発明に好適に使用できる。また、クラミジアの検出方法においては、クラミジア由来のｐＬＧＶ４４０の検出に適したプローブが好適に使用でき、特に限定するものではないが、例えば、配列表の配列番号２２記載の塩基配列もしくはその一部、好ましくは配列表の配列番号４４記載の塩基配列もしくはその一部、さらに好ましくは配列表の配列番号２０記載の塩基配列もしくはその一部を含有するプローブが本発明に好適に使用できる。さらに、ＨＣＶの検出方法においては、特に限定するものではないが、５’非翻訳領域が好適であり、例えば、配列表の配列番号４３記載の塩基配列もしくはその一部、好ましくは配列表の配列番号３４記載の塩基配列もしくはその一部、又は配列番号３５記載の塩基配列もしくはその一部を含有するプローブが本発明に好適に使用できる。
本発明の病原微生物の検出方法は、上記（１）記載のプローブを用いることにより個々の病原微生物を特異的に検出することができる。すなわち、上記のプローブは各病原微生物由来の遺伝子、もしくはその断片と安定に、かつ高い特異性をもってハイブリダイズすることから、当該遺伝子の検出、さらには各病原微生物の検出に特に有用である。
さらに本発明の検出方法においては、上記（１）記載のプローブを使用することにより当該プローブと核酸を含有する試料との間で、ｐＨ７を越えるアルカリ条件下、好ましくはｐＨ８〜１４、特に好ましくはｐＨ８〜１０の条件下でハイブリダイゼーションを実施することができる。すなわち、当該方法により標的核酸の変性工程に続く中和工程を経ることなく、病原微生物由来の遺伝子、もしくはその断片を検出する方法が提供され、該方法によって検体中に含まれる結核菌等を検出することができる。
本発明の方法は、試料中に存在する特定の遺伝子の検出、定量に利用することができる。すなわちＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸を含む可能性のあるあらゆる試料から特定の遺伝子を検出、定量することができる。前述の試料としては、特に限定はないが、例えば、全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織（例えば、癌組織、リンパ節等）、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物等）のような生体由来試料、ウイルス又は細菌のような微生物が混入もしくは感染している可能性のある試料（食品、生物学的製剤等）、あるいは土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料から特定の遺伝子を検出、定量することができる。さらに例えば、標的核酸の存在の有無によって上記の病原微生物の存在の検出、定量等に利用することができる。特に、病原性の微生物の検出方法は衛生、環境分野で有用である。上記検出法のための鋳型として使用される核酸は、ＲＮＡあるいはＤＮＡのいずれもが好適に使用できる。
これら材料からの核酸含有調製物の調製には特に限定はなく、例えば、界面活性剤による溶解処理、超音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌、フレンチプレスの使用等により行うことができる。幾つかの例においては、さらに操作を加えて核酸を精製することが有利である（例えば、内在性ヌクレアーゼが存在するとき）。これらの例において、核酸の精製はフェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動または密度勾配遠心分離等の公知方法により実施される。
ＲＮＡ由来の配列を有する核酸を標的とする場合には、当該ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡを鋳型として本発明の方法を実施すればよい。
上記の逆転写反応に使用されるプライマーは、使用される反応条件において鋳型ＲＮＡにアニールするものであれば特に限定されるものではない。該プライマーは、特定の鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するプライマー（特異的プライマー）の他、オリゴｄＴ（デオキシチミン）プライマーやランダムな配列を有するプライマー（ランダムプライマー）であっても良い。逆転写用プライマーの長さは、特異的なアニーリングを行う観点から、好ましくは６ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは９ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは１００ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは３０ヌクレオチド以下である。さらに、逆転写用プライマーとして、逆転写後のｃＤＮＡを鋳型とした本発明の核酸増幅法を行う際に鎖置換反応のためのプライマーとして使用可能なキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用することができる。このようなプライマーは、下記（３）に記載された性質を有し、かつＲＮＡからの逆転写反応に使用できるものであれば特に限定はないが、例えば、配列表の配列番号３２及び３３に記載の塩基配列を有するプライマーが好適に使用できる。
上記の逆転写反応に使用される酵素としては、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定はなく、例えばトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用することもできる。また、本発明の目的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素が好適であり、例えばサーマス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ等）、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ等を使用できる。特に限定はないが、例えば、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼが好ましく、Ｂ．ｓｔ由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ）、さらにＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。例えば、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写反応にマンガンイオンを必要とせず、また、高温条件下で鋳型ＲＮＡの二次構造形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することができる。上記の逆転写酵素活性を有する酵素も、当該活性を有している範囲において天然体、変異体のいずれもが使用できる。
上記方法により単離したゲノムＤＮＡやＰＣＲフラグメントのような二本鎖ＤＮＡ、および全ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡのような一本鎖ＤＮＡのいずれもが本発明に使用される核酸増幅法において鋳型ＤＮＡとして好適に使用できる。上記二本鎖ＤＮＡの場合は、一本鎖ＤＮＡに変性する工程（デネーチャー）を施したものが好適に使用できる。
上記のように、本発明のプローブとハイブリダイズする標的核酸上の領域を適切な核酸増幅方法によって増幅し、これをハイブリダイゼーションに使用することができる。使用される核酸増幅方法には特に限定はなく、標的核酸上の領域を増幅可能なものであればよい。例えばポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ；ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号および第４，８００，１５９号）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、鎖置換型増幅法（ＳＤＡ；ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、特公平７−１１４７１８号）、自立複製法（３ＳＲ；ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、核酸配列増幅法（ＮＡＳＢＡ法；ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、特許第２６５０１５９号）、ＴＭＡ法（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、Ｑβレプリカーゼ法（特許番号第２７１０１５９号）、ＩＣＡＮ法（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ、国際公開第００／５６８７７号パンフレット）等を使用することができる。
ＩＣＡＮ法は、キメラヌクレオチドプライマーとエンドヌクレアーゼ、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して、等温条件下に鋳型核酸上の特定の塩基配列を有するＤＮＡを連続的に増幅する方法である。
ここで、「連続的に」とは、反応温度、反応液組成の変更を伴わずに反応が進行していることを意味する。また、本明細書において「等温」とは、酵素および核酸鎖が上記各工程において機能する、実質的に一定の温度条件のことを意味する。
通常、キメラオリゴヌクレオチドプライマーとしては、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドから構成され、リボヌクレオチドがその３’末端又は３’末端側に配置されたものが使用される。例えば、下記一般式で表す構造をもつオリゴヌクレオチドがＩＣＡＮ法のプライマーとして使用することができる。
一般式：５’−ｄＮａ−Ｎｂ−ｄＮｃ−３’
（ａ：１１以上の整数、ｂ：１以上の整数、ｃ：０または１以上の整数、ｄＮ：デオキシリボヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ、Ｎ：未修飾リボヌクレオチド及び／又は修飾リボヌクレオチド、なお、ｄＮａの部位の一部のｄＮはＮで置換されていてもよい）
なお、上記のヌクレオチドアナログとしては、例えば、デオキシリボイノシンヌクレオチドを、また修飾リボヌクレオチドとしては、例えば、（α−Ｓ）リボヌクレオチドを、それぞれ使用することができる。当該ヌクレオチドアナログは、プライマーとしての機能を実質的に失わない範囲で含有させることができる。
当該プライマーは、鋳型上の増幅が望まれる領域の５’側、３’側の塩基配列をもとに、５’側の塩基配列に相同な配列を有するもの、３’側の塩基配列に相補的なものの２種を作成し、増幅に使用される。
本発明に使用されるエンドヌクレアーゼとは、鋳型核酸にアニーリングした上記に記載のキメラオリゴヌクレオチドプライマーよりＤＮＡの伸長を行って生成した二本鎖ＤＮＡに作用して、鎖置換反応が起こるように伸長鎖を切断しうるものであればよい。即ち、上記の二本鎖ＤＮＡのうちのキメラオリゴヌクレオチドプライマー部分にニックを生成しうる酵素である。特に限定されるものではないが、例えば、本発明にはリボヌクレアーゼが使用でき、特にＤＮＡとＲＮＡとから形成された二本鎖核酸のＲＮＡ部分に作用するエンドリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）が好適に使用できる。また、該リボヌクレアーゼには、上記作用を有するものであれば、常温性から耐熱性のリボヌクレアーゼのいずれもが好適に本発明に使用できる。例えば、下記実施例に示すように、約５０℃〜約７０℃での反応では大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＲＮａｓｅＨが本発明の方法に使用することができる。また、本発明の方法においては、耐熱性のリボヌクレアーゼも好適に使用できる。該耐熱性リボヌクレアーゼとしては、特に限定はされないが、例えば市販のＨｙｂｒｉｄａｓｅ^ＴＭ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＲＮａｓｅＨ（エピセンターテクノロジーズ社製）の他、好熱性バチルス属細菌、サーマス属細菌、ピロコッカス属細菌、サーモトガ属細菌、アルカエオグロバス属細菌、メタノコッカス属細菌等由来のＲＮａｓｅＨ等も好適に使用できる。さらに、該リボヌクレアーゼは、天然体および変異体のいずれもが好適に使用できる。なお、本願明細書に記載されているＲＮａｓｅＨの酵素単位は、実施例中の参考例に示した酵素単位測定方法に基づいて表示された数値である。
また、上記ＲＮａｓｅＨは、本発明の方法に使用できるものであれば特に限定はなく、例えば、種々のウイルス、ファージ、原核、真核生物由来のいずれであってもよい。さらに、細胞性ＲＮａｓｅＨあるいはウイルス性ＲＮａｓｅＨのいずれであってもよい。例えば、上記細胞性ＲＮａｓｅＨとしては大腸菌ＲＮａｓｅＨＩが、ウイルス性ＲＮａｓｅＨとしてはＨＩＶ−１由来ＲＮａｓｅＨが例示される。本発明の方法においてＲＮａｓｅＨは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型のいずれもが使用できる。特に限定はされないが、例えば大腸菌由来ＲＮａｓｅＨＩ、ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカエオグロバス属細菌由来ＲＮａｓｅＨＩＩが好適に使用できる。
また、本発明の方法に使用するエンドヌクレアーゼ、例えば、ＲＮａｓｅＨの切断反応の効率は上記プライマーの３’末端近傍の塩基配列に左右され、所望のＤＮＡの増幅効率に影響することが考えられるので、使用するＲＮａｓｅＨに最適なプライマーをデザインすることは当然のことである。
ＩＣＡＮ法には、ＤＮＡの鎖置換（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を行う活性を有するＤＮＡポリメラーゼが使用される。また、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものが特に好適に使用される。
ＩＣＡＮ法に使用されるＤＮＡポリメラーゼは、上記の鎖置換活性を有するものであれば特に限定はなく、例えば、バチルス カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、以下、Ｂ．ｃａと称す）やバチルス ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、以下Ｂ．ｓｔと称す）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体や、大腸菌由来ＤＮＡポリメラーゼＩのラージ フラグメント（クレノウ断片）等が挙げられる。また、本発明に使用できるＤＮＡポリメラーゼは、常温性から耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。上記の酵素は、その本来の起源より精製して取得されたもの、あるいは遺伝子工学的に生産された組み換えタンパク質の何れであっても良い。また、該酵素は、遺伝子工学的あるいはその他の手法によって置換、欠失、付加、挿入等の改変を加えたものであっても良く、このような酵素の例として、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼであるＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）等が挙げられる。該酵素は５０℃〜７０℃で活性を示し、当該方法に好適に使用することができる。
なお、ＤＮＡポリメラーゼの中には、特定の条件でエンドヌクレアーゼ活性、例えば、ＲＮａｓｅＨ活性を有するものが知られている。このようなＤＮＡポリメラーゼを本発明の方法に用いることができる。すなわち、該ＤＮＡポリメラーゼをＲＮａｓｅＨ活性が発現されるような条件下、例えばＭｎ^２＋の存在下で使用する態様が挙げられる。該態様においては、上記ＲＮａｓｅＨを添加することなく本発明の方法を実施することができる。すなわち、Ｍｎ^２＋を含有する緩衝液中で上記のＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮａｓｅＨ活性を示すことができる、上記の態様はＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼに限定されるものではなく、ＲＮａｓｅＨ活性を併せ持つことが知られている公知のＤＮＡポリメラーゼ、例えばサーマス サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼも本発明に使用することができる。
ＩＣＡＮ法は、キメラオリゴヌクレオチドプライマー、鋳型となる核酸を含有する試料、エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）等を前記酵素が活性を示しうる組成の緩衝液中で混合し、当該反応液を適切な温度で反応産物が生成するのに十分な時間保温することにより実施される。
なお、反応に先立ってキメラオリゴヌクレオチドプライマーと鋳型となる核酸を混合し、２本鎖核酸が変性する温度、例えば、９０℃以上で保持した後、本発明の方法に使用される反応温度以下まで冷却してアニーリングを実施してもよいが、これは増幅反応に必須の操作ではない。
また本発明の検出方法において、ＲＮＡを鋳型とする場合は、逆転写反応と核酸増幅反応を１段階で行ってもよい。特に限定はされないが、逆転写酵素と鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせとして例えば、ＡＭＶ ＲＴａｓｅ、ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅあるいはＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅとＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせが好適に使用できる。さらに、逆転写酵素活性と鎖置換活性とを有する１種のＤＮＡポリメラーゼを用いてもよい。
本発明の標的核酸の検出方法は、核酸を含有する試料より直接、標的核酸を増幅することにより実施することができる。この場合、増幅される標的核酸の鎖長には、特に限定はないが、感度よく標的核酸を検出する観点からは、例えば２００ｂｐ以下、さらに好ましくは１５０ｂｐ以下の領域が有効である。該増幅鎖長となるように本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを設定することにより、高感度に試料中の標的核酸を検出することができる。
さらに、本発明の検出方法では、ビシン、トリシン、ヘペス、リン酸塩あるいはトリス緩衝成分を含有する反応バッファー、及びスペルミジンやプロピレンジアミンを含有するアニーリング溶液の使用により、微量の核酸試料からもさらに高感度に標的核酸を検出することができる。この場合、使用するエンドヌクレアーゼとＤＮＡポリメラーゼは特に限定はされないが、例えば大腸菌由来、ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカエオグロバス属細菌由来ＲＮａｓｅＨ及びＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせが好ましい。特に、上記エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼはともにその種類によって好適に使用できるユニット数が異なる場合が予想されるが、その際には検出感度の向上あるいは増幅産物量の増加を指標にして、該バッファーの組成および酵素の添加量を調整すればよい。
また、二本鎖の鋳型ＤＮＡと２種のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用する核酸増幅方法の態様においては、反応の条件等にもよるが、各プライマーから伸長反応中のそれぞれの鋳型−伸長鎖中間体の間で鋳型の交換が起こり、合成されたプライマー伸長鎖同士がアニーリングした二本鎖核酸を生成することがある。この二本鎖核酸は両端にキメラオリゴヌクレオチドプライマーを有しており、次いでその両端から再び鎖置換による相補鎖伸長反応を開始することができる。この反応の結果、一端にプライマーの配列を有する増幅産物が生成される。さらに、この反応中に鋳型の交換が起こった場合には前記と同様な二本鎖核酸が再度生成される。
本発明では、上記のような鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用し、鋳型交換反応を行う工程を包含する核酸の増幅方法を利用することができる。
鎖置換反応中に上記の鋳型交換反応を行う能力を有するＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼの変異体酵素が特に好適に使用される。当該酵素はＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）として市販されており、また、該酵素の遺伝子を含有する大腸菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐＵＩ２０５（ＦＥＲＭ ＢＰ−３７２０、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成３年５月１０日（原寄託日）に寄託）より日本特許第２９７８００１号に記載の方法によって調製することもできる。
本発明の検出方法においては、標的核酸の増幅の際に、ｄＵＴＰを基質として取り込ませることができる。したがって、ｄＵＴＰを基質に用いた場合には、ウラシル Ｎ−グリコシダーゼ（ｕｒａｃｉｌ Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ：ＵＮＧ）を利用して増幅産物を分解し、増幅産物のキャリーオーバーコンタミネーションによる偽陽性を防止することができる。
本発明の検出方法において上記の核酸増幅方法によって増幅された標的核酸を検出するには公知の核酸検出方法、例えば電気泳動により特定のサイズの反応産物を検出する方法や、プローブとのハイブリダイゼーションによる検出等を使用することができる。さらに、磁気ビーズ等を組み合わせた検出方法も好適に使用できる。上記電気泳動による検出には、通常、エチジウムブロマイド等の蛍光物質が使用されるが、プローブとのハイブリダイゼーションを組み合わせてもよい。また、プローブは放射性同位元素による標識の他、ビオチンや蛍光物質のような非放射性の標識を施したものが使用できる。この他、上記（ｂ）工程において標識ヌクレオチドを使用することにより、増幅産物に標識ヌクレオチドを取り込ませて検出を容易にすることや該標識を利用した検出用シグナルの増強を行うことができ、さらに蛍光偏光法、蛍光エネルギー転移等を利用した検出を行うことも可能である。さらに、適切な検出系を構築することにより、標的核酸を自動的に検出することや、あるいは標的核酸の定量を行うことが可能である。また、ハイブリッドクロマト法による肉眼検出法も好適に使用できる。
消光状態になるような距離で配置された２種類以上の蛍光物質で標識されたリボヌクレオチド（ＲＮＡ）プローブあるいはリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドで構成されるキメラオリゴヌクレオチドプローブのいずれもが本発明の検出方法に使用することができる。当該プローブは蛍光を発することはないが、これに相補的な標的核酸由来の増幅ＤＮＡにアニーリングした場合、ＲＮａｓｅＨは該プローブを分解する。この結果、プローブ上の蛍光物質間の距離が増大して蛍光が発せられるようになり、標的核酸の存在を知ることができる。ＲＮａｓｅＨを使用して本発明の核酸の増幅方法が実施された場合には、その反応液中に上記のプローブを添加するだけで標的核酸を検出することができる。当該プローブの標識に使用される蛍光物質としては、例えば、６−ＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）とＴＡＭＲＡ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−６−ｃａｒｂｏｘｙｒｈｏｄａｍｉｎｅ）との組み合わせが好適に使用できる。
本発明の検出方法において等温下における増幅方法を用いる場合には、サーマルサイクラーのような装置を必要としない。また本発明の増幅方法では、使用するプライマーを１種類もしくは２種類と従来法よりも少なくすることができる。ｄＮＴＰのような試薬もＰＣＲ等で用いられるものを流用できるため、ランニングコストを従来法よりも低くすることができる。そのため、ルーチンワークを行なっている遺伝子検査等の分野で好適に使用できる。さらに、本発明の方法はＰＣＲ法よりも短時間により多くの増幅産物を得られることから、簡便、迅速、高感度な遺伝子検出方法として利用することができる。
本発明の検出方法を用いる場合には、大量の検体を解析するために反応系を微量化し、さらに集積度を高める手段を組み合わせてもよい。その手段の一つとして、最先端の超微細加工技術を駆使して、本発明の検出方法の基本プロセス、例えば、ＤＮＡの細胞からの抽出、核酸増幅反応、目的ＤＮＡの検出等のプロセスを数ｃｍ角〜指先大のマイクロチップ上に集積化したものを組み合わせてもよい。さらに、必要に応じてゲル或いはキャピラリー電気泳動、検出用プローブとのハイブリダイゼーションのプロセスを組み合わせてもよい。該システムは、マイクロチップ、マイクロＣＥ（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）チップあるいはナノチップとも呼ばれている。
このようなシステムにおける核酸増幅反応としては目的のＤＮＡ断片が増幅されるものであればいずれの核酸増幅反応も利用することができる。特に限定はされないが例えば、ＩＣＡＮ法のような等温条件下で核酸を増幅できる方法が好適に使用できる。該方法を組み合わせることにより、当該システムの単純化が可能となり、上記のような集積化されたシステムでの利用に非常に好適である。さらに、本発明の技術を利用してさらに高い集積度のシステムの構築が可能となる。
本発明の検出方法においては、特に限定はされないが例えば、配列表の配列番号１３〜１６でそれぞれ表される塩基配列を有する結核菌群検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー、配列表の配列番号２８〜２９でそれぞれ表される塩基配列を有するリン菌検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー、配列表の配列番号２３〜２６でそれぞれ表される塩基配列を有するクラミジア検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー、配列表の配列番号３０〜３１でそれぞれ表される核酸配列を有するＨＣＶ検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマーが好適に使用できる。上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーを用いて試料中の標的核酸を増幅し、電気泳動あるいはリアルタイム検出により目的の増幅産物を確認することができる。
さらに本発明の検出方法においては、配列表の配列番号１１、１２、３８〜４０でそれぞれ表される塩基配列を含有する領域から選択される結核菌群検出用プローブ、配列表の配列番号２７で表される塩基配列を含有する領域から選択されるリン菌検出用プローブ、配列表の配列番号２２、４４でそれぞれ表される塩基配列を含有する領域から選択されるクラミジア検出用プローブ、配列表の配列番号４３〜４５でそれぞれ表される塩基配列を含有する領域から選択されるＨＣＶ検出用プローブを用いて標的核酸を検出することができる。
本発明の方法において等温核酸増幅方法を用いる場合、必要な反応装置としては恒温層があればよく、サーマルサイクラーのような厳密な装置は必要ない。また、標識シグナルを測定する装置としては、市販の分光光度計、蛍光検出器、プレートリーダー等を使用することができる。従って、通常の検査業務を行っている所で、大量迅速検体測定が可能である。さらに、本発明の方法に必要な試薬も市販されている。
本発明の方法を用いてＨＣＶの検出を行う場合、検体から常法によって抽出されたＨＣＶのＲＮＡ、逆転写反応用プライマー、逆転写酵素（逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用する場合は逆転写酵素は必要ない）、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを含むｄＮＴＰ混合溶液を調製し、一定温度でＨＣＶ−ＲＮＡから生成したｃＤＮＡを鋳型として、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマー及びＩＣＡＮ用ＤＮＡポリメラーゼで標的核酸を増幅させ、これに上記蛍光標識プローブとホモジニアス系でハイブリダイゼーションさせその蛍光強度を測定する。反応の具体的な条件は下記実施例に詳述されている。
反応では、まず、ＨＣＶ−ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡが合成され、ついで、このｃＤＮＡを鋳型としてＩＣＡＮ法によりＤＮＡの増幅がおこる。増幅ＤＮＡは、上記蛍光プローブと相補的な領域を含んでいるので、蛍光プローブは一本鎖状態の増幅ＤＮＡにハイブリダイズする。蛍光プローブがハイブリダイズすることによって、蛍光強度の抑制が解除され蛍光強度が増加する。一方、試料中にＨＣＶのＲＮＡが存在しない場合はハイブリダイゼーションがおこらず、蛍光強度は抑制されたままで蛍光強度は弱い。このため、蛍光強度を測定することにより簡便・迅速・高感度に試料中のＨＣＶのＲＮＡを検出することができる。
本発明の方法では、ホモジニアス系で洗浄工程無しにＨＣＶのＲＮＡを蛍光強度として測定する。本発明は蛍光色素を変え、測定波長を変化させることで多項目同時測定にも対応可能な点でも有利である。すなわち、血液センターではＨＣＶのみでなくＨＢＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶも重要な検査項目であり、各々に特異的なＩＣＡＮ用のプライマーとプローブを用意し各プローブを測定波長の異なる蛍光色素で標識することで上記項目を同時に測定することが可能である。また、反応のエンドポイントでの蛍光強度を測定することで定性測定として血液センターなど多量検体の高感度測定が可能となり、一方、反応をキネティックに蛍光測定することで定量測定として治療のモニタリング用としての定量測定も可能である。従って、本発明の方法によれば、従来のＲＴ−ＰＣＲ法のように温度を上げ下げする複雑で特殊な機器が不要であり、限られた時間、設備内で大量に検体を測定できない不便さも改良され、洗浄工程が不要であり、非常に便利である。
（３）本発明のプライマー
本発明の検出方法に用いられるプライマーとしては、キメラオリゴヌクレオチドプライマーが例示される。該プライマーは、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、非修飾あるいは修飾リボヌクレオチドから構成され、リボヌクレオチドがその３’末端又は３’末端側に配置されたものが使用される。例えば、下記一般式で表す構造をもつオリゴヌクレオチドがＩＣＡＮ法のプライマーとして使用することができる。
一般式：５’−ｄＮａ−Ｎｂ−ｄＮｃ−３’
（ａ：１１以上の整数、ｂ：１以上の整数、ｃ：０または１以上の整数、ｄＮ：デオキシリボヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ、Ｎ：未修飾リボヌクレオチド及び／又は修飾リボヌクレオチド、なお、ｄＮａの部位の一部のｄＮはＮで置換されていてもよい）
なお、上記のヌクレオチドアナログとしては、例えば、デオキシリボイノシンヌクレオチド、デオキシリボウラシルヌクレオチドあるいは修飾されたデオキシリボヌクレオチド等、また修飾リボヌクレオチドとしては、例えば、（α−Ｓ）リボヌクレオチドを、それぞれ使用することができる。
当該プライマーは、鋳型上の増幅が望まれる領域の５’側、３’側の塩基配列をもとに、５’側の塩基配列に相同な配列を有するもの、３’側の塩基配列に相補的なものの２種を作成し、増幅に使用される。
本発明においては、例えば、結核菌群を検出しようとする試料について上記方法による核酸増幅反応を実施したうえ、増幅物と本発明のプローブとの間でのハイブリダイゼーションを実施して結核菌群を検出することができる。核酸増幅のためのプライマーは、配列表の配列番号１２に示した結核菌群ＩＳ６１１０遺伝子の塩基配列を参考に、各種の核酸増幅方法での使用に適したものを設計し、作製することができる。特に限定はされないが、例えばＩＳ６１１０遺伝子中の配列表の配列番号３９に示される塩基配列あるいはその一部を含む領域、好ましくは配列表の配列番号４０に示される塩基配列あるいはその一部を含む領域、さらに好ましくは配列表の配列番号３８に示される塩基配列あるいはその一部を含む領域を増幅できるものが本発明に好適である。さらに、配列表の配列番号１１記載の塩基配列を含む領域を増幅できるものが好ましい。
さらに本発明のプライマーにおいては、従来報告されている結核菌群ＩＳ６１１０塩基配列の多型をＧｅｎＢａｎｋ遺伝子データベースから解析し、結核菌群のＩＳ６１１０と相同性を有する類縁配列も精査することにより、特に好ましくは、配列表の配列番号３６、３７でそれぞれ示される塩基配列を有する核酸増幅用プライマーを使用した場合に、高感度かつ定量性の核酸増幅を実施することができる。従って、当該プライマーは各種の核酸増幅法による結核菌群ＩＳ６１１０遺伝子もしくはその断片の増幅に有用である。
本発明においては、上記結核菌群の検出と同様に、リン菌、クラミジア、ＨＣＶを検出するためのプローブ、キメラオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより好適に検出することができる。
当該プライマーは上記の塩基配列に限定されるものではなく、当該塩基配列周辺、すなわち当該配列にその一部が重複した配列を有するものが本発明に好適に使用できる。すなわち、使用する核酸増幅方法の特徴に応じて当該配列に重複する適切な塩基配列を選択し、プライマーを作成することができる。
これらのキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、任意の核酸配列を持つように、例えばアプライド バイオシステムズ社（ＡＢＩ社、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであっても良い。
ＩＣＡＮ法により核酸増幅を行うためのプライマーとしては、当該方法に使用できるようにプライマーの３’末端部分のデオキシリボヌクレオチドをリボヌクレオチドに置換すればよい。このようなプライマーの一例として、配列表の配列番号１３〜１６、２３〜２６、２８〜３１にそれぞれ塩基配列を示すキメラオリゴヌクレオチドプライマーが挙げられる。
さらに、これらのプライマーは適切な物質、例えば蛍光物質、色素、リガンド類（ビオチン、ジゴキシゲニン等）、または金コロイド等で標識されていてもよく、例えば、リガンド類で標識したプライマーを使用することにより、増幅された標的核酸を担体に捕捉させるなど、高感度で簡便な定量性をもった測定方法が提供される。この場合、固相としてはマイクロタイタープレート、ビーズ、マグネチックビーズ、メンブラン、またはガラス等が例示される。
喀痰検体からの抽出ＤＮＡ試料中には、ヒトＤＮＡのみならず気道常在細菌ならびにウイルス由来のＤＮＡが含まれる。従って、本発明で開発されたプライマーの特異性を調べるため、結核菌の感染病歴のないボランティアからの喀痰を検体として結核菌群遺伝子の増幅を試みた。このような試験で陽性結果がでないことが本プライマーの特異性の証明となりうる。３８名のボランティアから採取された喀痰からの抽出ＤＮＡに対し、上記のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＩＣＡＮ法によるＩＳ６１１０遺伝子断片の増幅を行った。その結果、腸性結果は１例も認められず上記のプライマーの結核菌への特異性の高さが実証され、非ＩＳ６１１０標的ＤＮＡを偽陽性にしないことが示された。
（４）本発明の組成物
本発明は、前述（２）の本発明の検出方法に使用される組成物を提供する。該組成物としては、例えば、上記（１）に記載のプローブならびに上記（３）に記載のプライマーを含有するものが挙げられる。あるいは、上記プローブを含む検出用組成物及び上記プライマーを含む増幅用組成物の形態であってもよい。さらに、酢酸マグネシウムを含む組成物及びプライマーを含む組成物の形態であってもよい。さらに、緩衝成分やｄＮＴＰ等を含んでいてもよい。さらに、修飾されたデオキシリボヌクレオチドあるいはデオキシヌクレオチド３リン酸のアナログを含有していてもよい。さらに、本発明の組成物中の試薬の分解・失活等による非増幅状況（偽陰性）確認のための内部標準（ＩＣ；ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）を含有していてもよい。当該内部標準は、本発明のプライマーにより増幅することができる。
また別の態様としては、本発明の検出方法に適した組成で上記の各種成分が含有された組成物を挙げることができ、該組成物は適切な鋳型とキメラオリゴヌクレオチドプライマーを添加するのみで増幅反応を実施することができる。さらに、増幅対象があらかじめ明らかである場合には、当該増幅対象の増幅に適したキメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有する組成物が好適である。
特に好適な態様としては、本発明の核酸増幅方法に適した組成で上記の各種成分が含有された組成物を挙げることができ、該組成物は適切な鋳型を添加するのみで増幅反応を実施することができる。さらに、検出用プローブを含んでいる場合には、リアルタイムで病原微生物由来の標的核酸を検出することができる。
特に限定されないが例えば、ＨＣＶの検出において本発明の方法、該方法のための組成物あるいはキットを用いることにより、従来のアンプリコアＨＣＶキットが２オーダーの測定範囲にあったのに比較して３オーダーまで測定範囲を広げることができる。また、従来のアンプリコアＨＣＶキットでは、所用時間が約５時間であったのに比較して、本発明では約４５分間と大幅に所用時間を短縮することができる。従って、これまでよりも１日に処理できる検体数を増大させることが可能である。
（５）本発明のキット
本発明のキットは、病原微生物由来の標的核酸の検出のためのキットであり、特に限定はされないが、ｐＨ７を越えるアルカリ条件下で標的核酸とハイブリダイズ可能なプローブ、特に限定はされないが例えば、上記（１）記載のプローブを含有することを特徴とする。
また、本発明のキットの一態様としては、結核菌群の検出のためのキットが挙げられる。該キットは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｉｕｍ ｂｏｖｉｓＢＣＧ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｒｏｔｉ及び／又はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｅｔｔｉを特異的に検出可能なプローブを含有することを特徴とする。当該キットは、ｐＨ７を越えるアルカリ条件下で結核菌群の検出に用いることもできる。
また、本発明のキットの一態様としては、リン菌の検出のためのキットが挙げられる。該キットは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを特異的に検出可能なプローブを含有することを特徴とする。当該キットは、ｐＨ７を越えるアルカリ条件下でリン菌の検出に用いることもできる。
また、本発明のキットの一態様としては、クラミジアの検出のためのキットが挙げられる。該キットは、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを特異的に検出可能なプローブを含有することを特徴とする。当該キットは、ｐＨ７を越えるアルカリ条件下でクラミジアの検出に用いることもできる。
また、本発明のキットの一態様としては、ＨＣＶの検出のためのキットが挙げられる。該キットは、ＨＣＶを特異的に検出可能なプローブを含有することを特徴とする。当該キットは、ｐＨ７を越えるアルカリ条件下でＨＣＶの検出に用いることもできる。
さらに上記キットにおいては、別の実施態様としてプライマーを含有してもよい。さらに、標的遺伝子を増幅する核酸増幅法のための試薬（ＤＮＡポリメラーゼ等）、プローブの検出反応に使用される試薬、検体からの核酸の抽出に使用される試薬等を含むキットであってもよい。該キットは、本発明の結核菌群等の検出方法を簡便、かつ迅速に実施するうえで好適である。当該キットは、特に多数の試料について結核菌群等の存在を調べる際に、高い再現性、信頼性で検査結果を与えることができる。さらに、偽陰性確認のための内部標準（ＩＣ；ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）、該内部標準検出用のプローブを含有していてもよい。当該内部標準は、本発明のプライマーにより増幅することができる。
さらに１つの実施態様において、該キットは、パッケージされた形態において、本発明のプローブ、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼの使用のための指示書を含むことを特徴とする。さらに、市販のＤＮＡポリメラーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼを指示書に従って選択し、使用してもよい。さらに、ＲＮＡを鋳型とする場合の逆転写反応用試薬を含んでもよい。ＤＮＡポリメラーゼは、上記のＤＮＡポリメラーゼから選択することができる。また、エンドヌクレアーゼは、Ｐｆｕ由来ＲＮａｓｅＨＩＩあるいはＡｆｕ由来ＲＮａｓｅＨＩＩのいずれかから選択することができる。
上記「指示書」とは、当該キットの使用方法、例えば鎖置換反応用試薬液の調製方法、推奨される反応条件等を記載した印刷物であり、パンフレットまたはリーフレット形式の取り扱い説明書のほか、キットに添付されたラベル、キットが納められたパッケージ等に記載されたものを含む。さらに、インターネットのような電子媒体を通し、開示、提供された情報も含まれる。
また、本発明のキットにおいては、ビシン、トリシン、ヘペス、リン酸塩あるいはトリス緩衝成分を含有する反応バッファー、及びアニーリング溶液が含まれていてもよい。また、ＤＮＡポリメラーゼやＲＮａｓｅＨが含まれていてもよい。さらに、修飾されたデオキシリボヌクレオチドあるいはデオキシヌクレオチド３リン酸のアナログを含有していてもよい。
本発明のキットにおいて、検出用プローブを適宜選択することにより、リアルタイムで病原微生物由来の標的核酸を検出することができるキットが提供される。
（６）本発明の核酸抽出方法
本発明は、高感度に結核菌等を検出するための核酸抽出方法を提供する。すなわち、臨床標本からの核酸抽出は、デリケートで困難な工程であり、尿、胸水、髄液、血液などの液体検体から、膿、喀痰などのような濃厚粘性検体、さらには細胞、組織といったものまでその対象は幅広い。現在、これら検体から結核菌等の遺伝子を抽出するスタンダードな方法は存在せず、従って現在まで報告された結核菌等の遺伝子検査における報告では、様々な核酸抽出方法が用いられている。これら従来法では各種界面活性剤、アルカリ、有機溶媒、またはカオトロピック試薬を含む試薬中で混合したり、ガラスビーズ存在下で超音波処理をすることで実施されていた。
本発明者らは上記の各種の従来法と、これまでＬｉｓｔｅｒｉａ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属ならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属からの核酸抽出に用いられていたムラミダーゼ（ｍｕｒａｍｉｄａｓｅ、放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ由来のものが、ムタノリシン（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ）としてシグマ社より発売）を結核菌に使用する方法を比較し、結核菌をムラミダーゼ消化する方法が最も優れていることを発見した。また、該酵素で消化した菌体を５分間煮沸処理することでさらに優れた結果が得られることを発見した。
結核菌を含有する試料をムラミダーゼで３０分処理し、次いで９６℃、５分間の処理を行った後にＩＣＡＮ法で遺伝子を増幅し結核菌の検出を試みた。この結果、驚くべきことに、従来の界面活性剤などの試薬を用いた場合に比べ１０倍高い感度で結核菌ＤＮＡを検出することができ、これは結核菌５ゲノムコピーに相当する検出感度であることが解った。
上記の一連の検出操作は、従来の界面活性剤やカオトロピック試薬を用いた方法において核酸抽出液中に混入する成分の核酸増幅反応への阻害効果を排除することができる。さらに、加熱処理を加えることで結核菌等に対する殺菌効果も生まれ、従来検査員を悩ませていた検査室での結核菌等の感染を予防できる効果も生まれるというメリットを持つ。従って、本プロトコールの発明は、迅速に、安全に、かつ高感度に結核菌等のＤＮＡを抽出することができる。
例えば試料として、喀痰を使用する場合には、まず公知の喀痰処理方法であるＮＡＬＣ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ）−ＮａＯＨ法で喀痰を処理した後、上記の本発明の核酸抽出方法を実施することが好適である。すなわち、本発明の検出方法において、結核菌等を含有する検体をムラミダーゼで処理し、核酸を抽出する工程を包含していてもよい。
上記の本発明の検出方法に使用される全てのプロトコール、すなわちプローブ、プライマー、核酸の抽出法、核酸増幅法は、極めて迅速で信頼性があり、かつ高感度な結核菌等の検出を可能とする。該方法を用いれば、検体の採取から結果報告までを３時間以内に完了することができ、６時間を要した従来のキット（例えばロシュ社製キット）に比べ、検査時間が１／２に短縮された。つまり本発明の方法は同日中に検査結果を提供でき、感染患者の一刻も早い隔離を可能とし、公衆衛生上、結核の伝播を早期に予防できるという多大な社会的貢献をもたらす。
以下に実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。また、本発明に基づき、キャリーオーバーによる増幅産物のコンタミネーションを防ぐ改良や、内部標準物質や他の結核菌等の遺伝子を同時増幅、検出する改良は、いずれも当業者に容易に類推される改良である。
実施例
以下に本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は、下記実施例によって限定されるものではない。
参考例１ ピロコッカス フリオサスのＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
（１）ピロコッカス フリオサス ゲノムＤＮＡの調製
トリプトン（ディフコラボラトリーズ社製）１％、酵母エキス（ディフコラボラトリーズ社製）０．５％、可溶性でんぷん（ナカライテスク社製）１％、ジャマリンＳ・ソリッド（ジャマリンラボラトリー社製）３．５％、ジャマリンＳ・リキッド（ジャマリンラボラトリー社製）０．５％、ＭｇＳＯ_４ ０．００３％、ＮａＣｌ ０．００１％、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．０００１％、ＣｏＳＯ_４ ０．０００１％、ＣａＣｌ_２・７Ｈ_２Ｏ ０．０００１％、ＺｎＳＯ_４ ０．０００１％、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ ０．１ｐｐｍ、ＫＡｌ（ＳＯ_４）_２ ０．１ｐｐｍ、Ｈ_３ＢＯ_４ ０．１ｐｐｍ、Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．１ｐｐｍ、ＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ０．２５ｐｐｍの組成の培地２リットルを２リットル容のメジュウムボトルにいれ、１２０℃、２０分間殺菌した後、窒素ガスを吹き込み、溶存酸素を除去し、これにピロコッカス フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメンより購入：ＤＳＭ３６３８）を接種して、９５℃、１６時間静置培養した後、遠心分離によって菌体を得た。
次に、得られた菌体を４ｍｌの２５％ショ糖、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、０．４ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ塩化リゾチーム（ナカライテスク社製）水溶液を加えて、２０℃で１時間反応させた。反応終了後、この反応液に２４ｍｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（宝酒造社製）及び２ｍｌの１０％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、３７℃で１時間保温した。
反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行い、約１ｍｇのゲノムＤＮＡを調製した。
（２）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
ピロコッカス ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）の全ゲノム配列が公開されており〔ＤＮＡ リサーチ（ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第５巻、第５５−７６頁（１９９８）〕、ＲＮａｓｅＨＩＩのホモログをコードする遺伝子（ＰＨ１６５０）が１つ存在することが明らかになっている（配列番号１、日本国 独立行政法人製品評価技術基盤機構 ホームページ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／）。
そこで、このＰＨ１６５０遺伝子（配列番号１）と一部公開されているピロコッカス フリオサスのゲノム配列（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ，Ｕｔａｈ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｅｎｔｅｒホームページ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｕｔａｈ．ｅｄｕ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｈｔｍｌ）でホモロジー検索をおこなった。その結果、非常にホモロジーの高い配列が見つかった。
得られた配列もとにプライマー１６５０Ｎｄｅ（配列番号２）及び１６５０Ｂａｍ（配列番号３）を合成した。
上記（１）で得たピロコッカス フリオサス ゲノムＤＮＡ ２００ｎｇを鋳型にして、２０ｐｍｏｌの１６５０Ｎｄｅ及び２０ｐｍｏｌの１６５０Ｂａｍをプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲを行った。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカラＥｘタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとし、３０サイクル行った。増幅した約０．７ｋｂのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ（ともに宝酒造社製）で消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＥＴ３ａ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ間に組込んだプラスミドｐＰＦＵ２２０を作製した。
（３）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定
上記（２）で得られたｐＰＦＵ２２０の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨＩＩをコードすると考えられるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ、ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）が見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号４に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号５に示す。
なお、プラスミドｐＰＦＵ２２０で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＰＦＵ２２０と命名、表示され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター［日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）］に平成１２年９月５日（原寄託日）より受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８０２０として寄託され、ブタペスト条約のもと前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１３年７月９日（国際移管日）よりＦＥＲＭ ＢＰ−７６５４として移管されている。
（４）精製ＲＮａｓｅＨＩＩ標品の調製
上記（２）で得られたｐＰＦＵ２２０を大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（ノバジェン社製）に形質転換し、得られたｐＰＦＵ２２０を含む大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２リットルのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を６６．０ｍｌのソニケーションバッファー〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を６０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分の遠心分離を行い、上清を集め、６１．５ｍｌの熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファーＡ〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラムを素通りした。
素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩ画分６０．０ｍｌをバッファーＡで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｓカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出し、約１５０ｍＭ ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。
このＲＮａｓｅＨＩＩ画分２．０ｍｌをセントリコン−１０（アミコン社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、２５０μｌの濃縮液を１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過カラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、ＲＮａｓｅＨＩＩは、１７キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、ＲＮａｓｅＨＩＩが１量体として存在する場合に相当する。
こうして溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩをＰｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ標品とした。上記で得られたＰｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ標品を用いて下記の方法によりＲＮａｓｅＨ活性を測定した。
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭジチオスレイトール（ナカライテスク社製）、０．００３％ウシ血清アルブミン（フラクションＶ、シグマ社製）、４％グリセロール、２０μｇ／ｍｌポリ（ｄＴ）（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）、３０μｇ／ｍｌポリ（ｒＡ）（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を混合し、３７℃で１０分間保温した。これをＲＮａｓｅＨ活性を測定するための基質液として使用した。
１００μｌの基質液に１μｌの１Ｍ ＭｎＣｌ_２を加えて４０℃で保温し、これに上記のＰｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩ標品を適当に希釈したものを加えて反応を開始した。４０℃で３０分間反応を行った後、１０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを加えて反応を停止し、２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。
その結果、上記のＰｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩ標品を添加した反応液では、先に１０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを加えた後にこれを添加したものに比べて２６０ｎｍにおける吸光度の値が高かった。よって、当該標品がＲＮａｓｅＨ活性を有することが明らかになった。
参考例２ Ａｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩの調製
アルカエオグロバス フルギダスのＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
（１）アルカエオグロバス フルギダス ゲノムＤＮＡの調製
アルカエオグロバス フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツレンＧｍｂＨより購入：ＤＳＭ４１３９）８ｍｌ相当分の菌体を集め、１００μｌの２５％ショ糖、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、２０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ塩化リゾチーム（ナカライテスク社製）水溶液を加えて、２０℃で１時間反応させた。反応終了後、この反応液に８００μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（宝酒造社製）及び５０μｌの１０％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、３７℃で１時間保温した。反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿、風乾した後に５０μｌのＴＥに溶解してゲノムＤＮＡ溶液を得た。
（２）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
アルカエオグロバス フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）は全ゲノム配列が公開されており〔Ｋｌｅｎｋ，ＨＰら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３９０巻、第３６４−３７０頁（１９９７）〕、ＲＮａｓｅＨＩＩのホモログをコードする遺伝子（ＡＦ０６２１）が１つ存在することが明らかになっている（配列番号６、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ／ＣＭＲ／ｂｔｍ／ｈｔｍｌｓ／ＳｐｌａｓｈＰａｇｅ．ｈｔｍｌ）。
そこで、このＡＦＯ６２１遺伝子（配列番号６）の配列をもとにプライマーＡｆｕＮｄｅ（配列番号７）及びＡｆｕＢａｍ（配列番号８）を合成した。
上記（１）で得たアルカエオグロバス フルギダス ゲノムＤＮＡ ３０ｎｇを鋳型にして、２０ｐｍｏｌのＡｆｕＮｄｅ及び２０ｐｍｏｌのＡｆｕＢａｍをプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲを行なった。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはパイロベストＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとし、４０サイクル行った。増幅した約０．６ｋｂのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ（ともに宝酒造社製）で消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＴＶ１１９Ｎｄ（ｐＴＶ１１９ＮのＮｃｏＩサイトをＮｄｅＩサイトに変換したもの）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ間に組込んだプラスミドｐＡＦＵ２０４を作製した。
（３）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定
上記（２）で得られたｐＡＦＵ２０４の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨＩＩをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号９に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号１０に示す。
なお、プラスミドｐＡＦＵ２０４で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＡＦＵ２０４と命名、表示され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター［日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）］に平成１３年２月２２日（原寄託日）より受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８２２１として寄託され、ブタペスト条約のもと前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１３年８月２日（国際移管日）よりＦＥＲＭ ＢＰ−７６９１として移管されている。
（４）精製ＲＮａｓｅＨＩＩ標品の調製
上記（２）で得られたｐＡＦＵ２０４で大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られたｐＡＦＵ２０４を含む大腸菌ＪＭ１０９を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２リットルのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を３７．１ｍｌのソニケーションバッファー〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を７０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分の遠心分離を行い、上清を集め、４０．３ｍｌの熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファーＡ〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラムを素通りした。
バッファーＡで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｓカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｓカラムを素通りした。
素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩ画分４０．０ｍｌを５０ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーＢ〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕２１を外液として、２時間の透析を３回行なった。透析後の酵素液４０．２ｍｌを５０ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーＢで平衡化したＨｉＴｒａｐ−ｈｅｐａｒｉｎカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて５０〜５５０ｍＭ ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出した。その結果、約２４０ｍＭ ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。
このＲＮａｓｅＨＩＩ画分７．８ｍｌをセントリコン−１０（アミコン社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、約６００μｌの濃縮液を４回に分けて１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ゲルろ過カラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、ＲＮａｓｅＨＩＩは、３０．０キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、ＲＮａｓｅＨＩＩが１量体として存在する場合に相当する。こうして溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩをＡｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩ標品とした。
上記で得られたＡｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩ標品を用いて、参考例１−（４）に記載の方法により酵素活性を測定した結果、Ａｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩ標品にＲＮａｓｅＨ活性が認められた。
本発明の方法に使用される耐熱性ＲＮａｓｅＨのユニット数は、次の方法により算出した。
ポリ（ｒＡ）及びポリ（ｄＴ）（ともにアマシャム ファルマシア バイオテク製）１ｍｇをそれぞれ１ｍＭ ＥＤＴＡを含む４０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）１ｍｌに溶解し、ポリ（ｒＡ）溶液及びポリ（ｄＴ）溶液を調製した。
次に、４ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、０．００３％ＢＳＡ、４％グリセロールを含む４０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）に、終濃度２０μｇ／ｍｌとなるポリ（ｒＡ）溶液、終濃度３０μｇ／ｍｌとなるポリ（ｄＴ）溶液を加え、３７℃で１０分間反応後、４℃に冷却し、ポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）溶液を調製した。このポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）溶液１００μｌに任意に希釈した酵素液１μｌを加え、４０℃で１０分間反応させ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ １０μｌを加えて反応を停止させた後、２６０ｎｍの吸光度を測定した。対照として、上記反応液に０．５Ｍ ＥＤＴＡ １０μｌを加えた後、４０℃で１０分間反応させ、吸光度を測定した。その後、ＥＤＴＡ非存在下で反応させ求めた吸光度から対照の吸光度を引いた値（吸光度差）を求めた。すなわち、酵素反応によってポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）ハイブリッドから遊離したヌクレオチドの濃度を吸光度差から求めた。ＲＮａｓｅＨの１単位は、１ｎｍｏｌのリボヌクレオチドが遊離したのに相当するＡ_２６０を１０分間に増加させる酵素量とし、下記の式に従って算出した。
単位（ｕｎｉｔ）＝〔吸光度差×反応液量（ｍｌ）〕／０．０１５２×（１１０／１００）×希釈率
参考例３
本発明の方法に使用される常温性ＲＮａｓｅＨのユニット数は、以下の方法で測定した。
（１）使用する試薬液の調製
力価測定用反応液：最終濃度がそれぞれ４０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．７、３７℃）、４ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、０．００３％ ＢＳＡ、４％グリセロール、２４μＭ ポリ（ｄＴ）になるように滅菌水で調製した。
ポリ［８−^３Ｈ］アデニル酸溶液：３７０ｋＢｑのポリ［８−^３Ｈ］アデニル酸溶液を２００μｌの滅菌水に溶解した。
ポリアデニル酸溶液：ポリアデニル酸を３ｍＭになるように滅菌超純水で希釈した。
酵素希釈液：最終濃度がそれぞれ２５ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５、３７℃）、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５、３７℃）、３０ｍＭ 塩化ナトリウム、５０％グリセロールになるように滅菌水で調製した。
熱変性子牛胸腺ＤＮＡの調製：子牛胸腺ＤＮＡ２００ｍｇをＴＥバッファー１００ｍｌに懸濁し、膨潤させた。該溶液のＵＶ２６０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌの濃度に滅菌超純水で希釈した。次に、該溶液を１００℃で１０分間加熱後、氷浴中で急冷した。
（２）活性測定方法
上記（１）で調製した力価測定用反応液９８５μｌにポリ［８−^３Ｈ］アデニル酸溶液７μｌを加え３７℃で１０分間保持した。次にポリアデニル酸を最終濃度が２４μＭになるように８μｌ加え、さらに３７℃で５分間保持した。このようにしてポリ［８−^３Ｈ］ｒＡ−ポリｄＴ反応液１０００μｌを調製した。次に、該反応液２００μｌを分取し、３０℃で５分間保持した後、任意の希釈系列で希釈した酵素液１μｌを加え、これらの反応液を経時的に５０μｌずつサンプリングして、後の測定に用いた。酵素添加からサンプリングまでの間の時間をＹ分とした。また、全ＣＰＭ用反応液５０μｌおよびブランク用反応液５０μｌは、酵素液の代わりに酵素希釈液を１μｌ加えて調製した。該サンプリング溶液に１００ｍＭピロリン酸ナトリウム１００μｌ、熱変性子牛胸腺ＤＮＡ溶液５０μｌおよび１０％トリクロロ酢酸３００μｌ（全ＣＰＭ測定の場合は、超純水３００μｌ）を加え、０℃で５分間保持後、１００００ｒｐｍで１０分間遠心した。遠心後、得られた上清２５０μｌをバイアルに入れ、アクアゾル−２（ＮＥＮライフサイエンスプロダクツ社製）１０ｍｌを加え、液体シンチレーションカウンターでＣＰＭを測定した。
（３）ユニット計算
各酵素のユニット（Ｕｎｉｔ）数は、以下の計算式で算出した。
Ｕｎｉｔ／ｍｌ＝｛（測定したＣＰＭ−ブランクＣＰＭ）×１．２^＊×２０×１０００×希釈率｝×２００（μｌ）／（全ＣＰＭ×Ｙ分×５０（μｌ）×９^＊＊）
１．２^＊：全ＣＰＭ中に含まれるポリ［８−^３Ｈ］ｒＡ−ポリｄＴの５０μｌ当たりのｎｍｏｌ数
９^＊＊：補正係数
実施例１
（１）喀痰からのＤＮＡ抽出
米国ＣＤＣ（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）が推奨するＮＡＬＣ法により喀痰を処理した。すなわち、喀痰を５０ｍｌ容のスクリューキャップ付チューブに入れ、等量のＮＡＬＣ液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム ５０ｍｌと４％水酸化ナトリウム ５０ｍｌの混合液に０．５ｇのＮ−アセチル−Ｌ−システインを加えたもの）を加え、試験管ミキサーで２０秒間良くかき混ぜ検体を液状にした。室温で１５分間放置した後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で全量を５０ｍｌとし、次いで３０００ｇ以上で２０分遠心し沈殿を採取した。この沈殿に５０μｌの溶解緩衝液［ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ；１単位のムタノリシン（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ、シグマ社製）を含有する１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．８）］を加えよく混和する。３７℃で３０分反応し、ついで５分間水浴中煮沸または９６℃のヒートブロック中で加熱処理した。必要な場合は微量高速遠心器により遠心し、その上清を分取した。以上の操作により調製された上清を喀痰からのＤＮＡ抽出液として以降の操作に用いた。さらに、Ｇｅｎとるくん酵母用（宝酒造社製）も使用取扱説明書に従い、核酸抽出に使用した。
（２）プローブ、キメラオリゴヌクレオチドプライマーの作製
結核菌群由来のＩＳ６１１０遺伝子を検出するための特異的オリゴヌクレオチドプローブをＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ５２４７１記載の塩基配列をもとに作製した。すなわち、配列表の配列番号１１に示す塩基配列からなり、５’末端にＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）が付されたオリゴヌクレオチドプローブＭＴＩＳ−２ＢＦをＤＮＡ合成機により合成した。
結核菌群ＩＳ６１１０遺伝子由来のＤＮＡ断片をＩＣＡＮ法で合成するためのキメラオリゴヌクレオチドプライマーを作製した。すなわち配列表の配列番号１２に示された結核菌群ＩＳ６１１０遺伝子の塩基配列をもとに、配列表の配列番号１３に示された塩基配列からなるフォワードプライマーＭＴＩＳ−２Ｆ、配列表の配列番号１４に示された塩基配列からなり、５’末端にビオチンが付加されたリバースプライマーＭＴＩＳ２−ＲＢｉｏをそれぞれＤＮＡ合成機により合成した。同様に配列表の配列番号１５に示された塩基配列からなるフォワードプライマーＫ−Ｆ１０３３−２、配列表の配列番号１６に塩基配列からなり、５’末端にビオチンが付加されたリバースプライマーＫ−Ｒ１１３３−２ＢｉｏをそれぞれＤＮＡ合成機により合成した。
（３）ＩＣＡＮ法による増幅
表１に示すＩＣＡＮ反応のための反応液を調製し、６０℃で３０分インキュベートした。

また、同様にＫ−Ｆ１０３３−２／Ｋ−Ｒ１１３３−２プライマーの組み合わせでもＩＣＡＮ増幅反応を行った。反応終了後、上記反応液の一部を電気泳動に供して、目的の増幅断片を確認した。
（４）固層プレート発光法による検出
ストレプトアビジン（ナカライ社製）をＰＢＳに２μｇ／ｍｌの濃度に溶解し、この溶液を白色発光検出用９６ウェルマイクロタイタープレートに１５０μｌ／ウェルとなるように添加し、４℃で一晩放置し、固定化した。ストレプトアビジン溶液を捨てた後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を２００μｌ／ウェルとなるように分注して４℃で一晩放置し、ブロッキングを行った。この溶液を捨てたものをストレプトアビジンコートプレートとして以下の実験に使用した。
上記のストレプトアビジンコートプレートにハイブリダイゼーション緩衝液［１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％ＢＳＡを含む５×ＳＳＣ］５０μｌ／ウェルを加え、実施例１−（３）でＭＴＩＳ−２Ｆ／ＭＴＩＳ２−ＲＢｉｏプライマーの組み合わせで得られた増幅断片を含むＩＣＡＮ反応液を１０μｌ／ウェルずつ添加して良く混合し、室温で１５分間反応させ、プレート表面に捕捉させた。次にＤＮＡ変性液（０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液）を５μｌ／ウェルずつ添加し、良く混和して３分間のＤＮＡ変性を行い、プレート表面に捕捉された二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性した。引き続き上記のプローブＭＴＩＳ２ＢＦを５ｐｍｏｌ／ｍｌとなるようにハイブリダイゼーションバッファーに希釈し、これを１００μｌ／ウェルずつ添加してよく混合し、室温で４０分反応させた。この時、各ウェルのｐＨは１３〜１４であった。反応後、ウェル内の溶液を捨て、２００μｌ／ウェルの洗浄バッファー［２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０］で２回ウェルを洗浄する。その後、パーオキシダーゼ標識抗ＦＩＴＣウサギ抗体（ケミコン社製）をハイブリダイゼーションバッファーに２μｇ／ｍｌに溶解したものを１００μｌ／ウェルずつ添加し室温で２０分反応させた。反応後、液を捨て、２００μｌ／ウェルの洗浄バッファーで４回ウェルを洗浄した後、発光基質［ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ピアス社製）］を１００μｌ／ウェルずつ添加し、直ちに発光プレートリーダー（ラボシステムズ社製）で相対発光強度を測定した。
（５）検出感度の検討
０、５および１０コピー相当の結核菌群ゲノムを含む喀痰由来ＤＮＡ試料につき、上記のとおり結核菌群ＤＮＡの検出を実施した。その結果、表２に示すように５コピーにおいてもＳ／Ｎ比で約３００倍という強い発光が検出できた。

以上のように、本発明により、迅速かつ高感度な結核菌の検査が可能であることが示された。また、本発明の結核菌の検出方法において、本発明の核酸抽出方法及びＧｅｎとるくん酵母用試薬を用いた方法のいずれの方法においても好適に利用できることを確認した。従って、操作法の簡便さから見て、本発明の核酸抽出方法の有用性が確認できた。
実施例２
結核菌感染の疑いを持たれた患者２６例から喀痰を採取し、実施例１記載の操作に従って結核菌ＤＮＡの検出を行った。また、同一検体を用いて、既存の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡをターゲットとしたＰＣＲ法に基づくキットであるアンプリコア マイコバクテリウムツベルクロシス（ロシュ社製）を用いた検出、小川培地による培養法による結核菌検査を実施した。その結果を表３に示す。

表３に示したように、本発明法は培養検査の結果と良く一致したが、ＰＣＲ法では培養法で陰性であった２例が偽陽性として検出され、また、培養法陽性の１例が偽陰性として検出された。
すなわち従来の方法に比べ本発明の方法は正確な検査結果を超迅速に簡便に得られることが確認できた。
実施例３
本発明の検出方法の結核菌群に対する特異性について検討した。ゲノムＤＮＡは、表４に示す３７株を使用した。

各ゲノムＤＮＡは、ＯＤ値からコピー数を計算し、２×１０^７コピーになるように希釈した。上記鋳型となるゲノムＤＮＡを用いて、以下の表５に示す反応液組成で検出を行った。

上記反応液を６０℃で１時間保持した。検出は、実施例１（４）記載の方法で行った。その結果、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ株のみ特異的に検出することができた。このことから、本発明の方法が非常に特異性の高い検出方法であることを確認した。
実施例４
（１）磁気ビーズを用いた結核菌群の検出について検討した。プライマーは、ＭＴＩＳ−２Ｆプライマー及びＭＴＩＳ−２ＲＢｉｏプライマーを用いた。次に、鋳型として実施例２での陽性検体由来の抽出ゲノムを滅菌水にて３０倍、３００倍、３０００倍となるように希釈調製した。反応は以下のようにして行った。即ち、最終濃度３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、各５００μＭ ｄＮＴＰｓ、各５０ｐｍｏｌのＭＴＩＳ−２Ｆ及びＭＴＩＳ−２Ｒプライマー、８．７５ＵのＡｆｕ由来ＲＮａｓｅＨ、８ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、各鋳型量１μｌを添加し滅菌水で最終容量を５０μｌにした。該反応液はあらかじめ６０℃に設定したサーマルサイクラーパーソナルにセットし、６０分間保持した。得られた増幅断片を自動検出装置、ルミパルス（富士レビオ社製）にセットし、ストレプトアビジンコートされた磁気ビーズ（ピアス社製）による検出を行った。ビオチン結合能１００ｐｍｏｌ相当のストレプトアビジン固層化磁気ビーズをキュベット第１層でビオチン化増幅断片と５分間反応させ、次いで０．１Ｎ ＮａＯＨを加えてＦＩＴＣ標識プローブＭＴＩＳＢＦと５分間ハイブリダイズさせ、洗浄後ＰＯＤ標識抗ＦＩＴＣ抗体を加え、５分間反応後洗浄し発光基質を加えた。この結果、既存の自動化検出装置において磁気ビーズを用いて２０分間という短時間で半定量可能であることが示された。なお、試薬は実施例１と同様のものを用いた。検出は、発光量をフォトカウンティングすることで測定した。その結果を表６に示す。

表６に示した結果から、従来のプレート発光法と同等の感度で検出できることを確認した。
（２）内部標準（ＩＣ；ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）を組み合わせた場合の検出系について検討した。内部標準は以下のようにして調製した。すなわち、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号１７及び１８記載のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。得られた増幅断片を常法により精製し、ｐＴ７ Ｂｌｕｅ Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入した。該プラスミドを内部標準として用いた。反応は、実施例３記載の条件と同様にして、上記プラスミドを１、３、１０ｐｇを添加した。鋳型の結核菌ゲノムは、０、２及び２０コピーを用いた。検出は、配列表の配列番号１９記載の塩基配列を有し、５’末端にＦＩＴＣ標識を有するＩＣ用プローブ（ＩＣＦプローブ）及びＦＩＴＣ標識プローブＭＴＩＳＢＦを用いた。その結果、いずれのＩＣプラスミド濃度でも結核菌ゲノムを検出できた。特にＩＣプラスミドの濃度が３ｐｇの場合に好適であることが確認できた。
（３）上記増幅断片の検出方法として、ハイブリッド・クロマト法を検討した。即ち、ニトロセルロース膜にストレプトアビジン（ナカライテスク社製）を固定化し、吸水パッドを連結し、ハイブリ・クロマト・ストリップを作製した。これを用いて、実施例１で得られた増幅断片のハイブリ・クロマト法による検出を行った。検出は、１−ｓｔｅｐ ＴＭＢ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇ（ピアス社製）を用いた発色で行った。すなわち、ニトロセルロース膜上に増幅断片を含有する反応液を展開し、その後順に０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液、ＦＩＴＣ標識プローブ、洗浄液、発色液を展開した。その結果、結核菌陽性の増幅断片では、ブルーのバンドが検出された。また、この方法を用いる事により、本発明の方法実施後、５〜１０分で結果が肉眼で判明することから、迅速な遺伝子検査方法として有用であることが確認できた。
実施例５
実施例１〜４の結果を踏まえ、結核菌群のキットを構築した。各コンポーネントについて以下に示す。
（１）ＩＣＡＮ増幅用試薬；５０回分

（２）検出用試薬（５０回分）

上記試薬を用いてＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ株を検出したところ、迅速、高感度、高特異的に検出できることを確認した。
実施例６
（１）スワブ検体からのＤＮＡ抽出
男子尿道ならびに女子子宮頚部を綿棒で拭い取ったスワブ検体に界面活性剤を含む抽出バッファー（アンプリコアＳＴＤ用検体処理試薬（ロシュ社））を加え９５℃〜１００℃で１０分間加熱処理した。
（２）プローブ、キメラオリゴヌクレオチドプライマーの作製
クラミジアのクリプティック・プラスミドを検出するための特異的オリゴヌクレオチドプローブを作製した。すなわち、配列表の配列番号２０に示す塩基配列からなり、５’末端にＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）が付されたオリゴヌクレオチドプローブＣＴ１２３４をＤＮＡ合成機により合成した。また、リン菌のｃｐｐＢ遺伝子を検出するための特異的オリゴヌクレオチドプローブを作製した。すなわち、配列表の配列番号２１に示す塩基配列からなり、５’末端にＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）が付されたオリゴヌクレオチドプローブＣｐｐＢ３をＤＮＡ合成機により合成した。
クラミジアのクリプティック・プラスミド由来のＤＮＡ断片をＩＣＡＮ法で合成するためのキメラオリゴヌクレオチドプライマーを作製した。すなわち配列表の配列番号２２に示されたクラミジアのクリプティック・プラスミドの塩基配列をもとに、配列表の配列番号２３及び２４に示された塩基配列からなるフォワードプライマーＦ１２１２−２２、Ｆ１１６２−２２、配列表の配列番号２５及び２６に示された塩基配列からなり、５’末端にビオチンが付加されたリバースプライマーＲ１２７２−２２Ｂｉｏ、Ｒ１３７９−２２ＢｉｏをそれぞれＤＮＡ合成機により合成した。
リン菌ｃｐｐＢ遺伝子由来のＤＮＡ断片をＩＣＡＮ法で合成するためのキメラオリゴヌクレオチドプライマーを作製した。すなわち配列表の配列番号２７に示されたクラミジアのクリプティック・プラスミドの塩基配列をもとに、配列表の配列番号２８に示された塩基配列からなるフォワードプライマーｐＪＤＢＦ−１、配列表の配列番号２９に示された塩基配列からなり、５’末端にビオチンが付加されたリバースプライマーｐＪＤＢＲ−３ＢｉｏをそれぞれＤＮＡ合成機により合成した。
（３）ＩＣＡＮ法による増幅
表７に示すＩＣＡＮ反応のための反応液を調製し、５５℃で６０分インキュベートした。

反応終了後、上記反応液の一部を電気泳動に供して、目的の増幅断片を確認した。
（４）固層プレート発光法による検出
ストレプトアビジン（ナカライ社製）をＰＢＳに２μｇ／ｍｌの濃度に溶解し、この溶液を白色発光検出用９６ウェルマイクロタイタープレートに１５０μｌ／ウェルとなるように添加し、４℃で一晩放置し、固定化した。ストレプトアビジン溶液を捨てた後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を２００μｌ／ウェルとなるように分注して４℃で一晩放置し、ブロッキングを行った。この溶液を捨てたものをストレプトアビジンコートプレートとして以下の実験に使用した。
上記のストレプトアビジンコートプレートにハイブリダイゼーション緩衝液［１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％ＢＳＡを含む５×ＳＳＣ］５０μｌ／ウェルを加え、実施例１−（３）でＦ１２１２−２２／Ｒ１２７２−２２ＢｉｏならびにｐＪＤＢＦ−１／ｐＪＤＢＲ−３Ｂｉｏプライマーの組み合わせで得られた増幅断片を含むＩＣＡＮ反応液を１０μｌ／ウェルずつ１検体につき２ウェルに添加して良く混合し、室温で１５分間反応させ、プレート表面に捕捉させた。次にＤＮＡ変性液（０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液）を５μｌ／ウェルずつ添加し、良く混和して３分間のＤＮＡ変性を行い、プレート表面に捕捉された二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性した。引き続き上記のプローブＣＴ１２３４またはＣｐｐＢ３を５ｐｍｏｌ／ｍｌとなるようにハイブリダイゼーションバッファーに希釈し、これを１００μｌ／ウェルずつ添加してよく混合し、室温で４０分反応させた。この時、各ウェルのｐＨは１３〜１４であった。反応後、ウェル内の溶液を捨て、２００μｌ／ウェルの洗浄バッファー［２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０］で２回ウェルを洗浄する。その後、パーオキシダーゼ標識抗ＦＩＴＣウサギ抗体（ケミコン社製）をハイブリダイゼーションバッファーに２μｇ／ｍｌに溶解したものを１００μｌ／ウェルずつ添加し室温で２０分反応させた。反応後、液を捨て、２００μｌ／ウェルの洗浄バッファーで４回ウェルを洗浄した後、発光基質［ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ピアス社製）］を１００μｌ／ウェルずつ添加し、直ちに発光プレートリーダー（ラボシステムズ社製）で相対発光強度を測定した。
（５）検出感度の検討
０、１０および１００コピー相当のクラミジアゲノムを含むＤＮＡ試料につき、上記のとおりクラミジアＤＮＡの検出を実施した。その結果、表８に示すように１０コピーにおいてもＳ／Ｎ比で約３０倍という強い発光が検出できた。また、０、１０および１００コピー相当のリン菌ゲノムを含むＤＮＡ試料につき、上記のとおりリン菌ＤＮＡの検出を実施した。その結果、表９に示すように１０コピーにおいてもＳ／Ｎ比で約３００倍という強い発光が検出できた。

以上のように、本発明により、迅速かつ高感度なクラミジアならびにリン菌の検査が可能であることが示された。
実施例７
クラミジアとリン菌の混合感染の疑いを持たれた検体１２例から実施例１記載の操作に従ってクラミジアならびにリン菌ＤＮＡの同時増幅検出を行った。
その結果、クラミジアのみ陽性が５例、リン菌のみ陽性が１例、クラミジアとリン菌共に陽性が３例、共に陰性が３例であった。この結果は、既存のＰＣＲ法キット（アンプリコアＳＴＤ（ロシュ社））の結果と一致した。
実施例８
プライマー及びプローブの調製
ＨＣＶゲノムの塩基配列に従って、配列表の配列番号３０及び３１に記載の塩基配列を有するＨＣＶ−Ｆ及びＨＣＶ−Ｒ１キメラオリゴヌクレオチドプライマー及び配列表の配列番号３２及び３３に記載の塩基配列を有する逆転写反応用オリゴヌクレオチドプライマーを合成した。さらに、配列表の配列番号３４及び３５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを合成した。さらに、上記オリゴヌクレオチドプローブの５’末端にＴＡＭＲＡ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＡＢＩ社製）を自動ＤＮＡ合成機によって作製し、蛍光標識プローブとした。
（２）合成ＲＮＡの調製
インフォームド コンセントの得られたＨＣＶ−ＲＮＡ陽性血清をアンプリコアＨＣＶモニターキット（ロッシュ社製）でコピー数を算出し、これをキットに付属の検体希釈液で、１×１０^７コピーから１コピー／μｌまで１０倍希釈系列を作製し、ＨＣＶ−ＲＮＡとした。
（３）逆転写反応
上記（１）で作製した逆転写反応用プライマーならびにＦｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて上記（２）で調製したＨＣＶ−ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
（４）ＩＣＡＮ反応液の調製
上記ｃＤＮＡ溶液を用いてＩＣＡＮ反応を行った。１チューブあたりの反応液組成を表１０に示す。

（５）ホモジニアス検出
反応チューブ１本あたり、上記反応液４７μｌを加え、そこに（４）で作製したｃＤＮＡ溶液３μｌを添加し、５６℃で３０分間保持した。反応終了後、この反応液に上記（１）で調製した蛍光標識プローブを終濃度が３００ｎＭとなるように添加し、９８℃で２分間処理後、氷冷却により２５℃にし、保持した。該反応液を、蛍光検出器、フルオロスキャン（ラバオシステムズ社製）にて蛍光強度を測定した。さらに、対照として、市販のＰＣＲ法によるアンプリコアＨＣＶキット（ロシュ社製）でも同一の検体を用いて測定した。その結果を図１に示す。図１は、各種ＨＣＶ−ＲＮＡ濃度を測定した場合の蛍光強度の変化及び従来法との測定範囲の比較を示すグラフであり、左縦軸はＯＤ４５０値、右縦軸は蛍光強度（ＳＮ比）、横軸は、ＨＣＶ−ＲＮＡ量を示す。また、図１の黒四角は、本発明の方法による結果を示し、黒丸は、アンプリコアＨＣＶキットによる結果を示す。
図１に示したように本発明の方法では、蛍光強度（ＳＮ比）はＨＣＶ−ＲＮＡコピー数が多いほど増加することが確認できた。また、本発明のＨＣＶ検出方法の所用時間は４５分であった。一方、対照となるアンプリコアＨＣＶキットにおいては、所用時間は約５時間であった。さらに、ＨＣＶ−ＲＮＡの検出範囲については、図１に示したように吸光度で示すアンプリコアＨＣＶキットでは、ＨＣＶ−ＲＮＡのコピー数の増加にしたがって増大はするものの、測定範囲は２オーダーであり、１０^５コピー以上では、定量性がないことが確認できた。一方、本発明の方法は、３オーダーの広い検出範囲であることが確認できた。さらに、簡便性・迅速性においても本発明の方法は優れており、多検体を処理するのに適した方法であることが確認できた。
実施例９
（１）患者血清からのＨＣＶ−ＲＮＡの調製
臨床検体からのＨＣＶの検出について検討した。インフォームドコンセントの得られたＨＣＶ患者の血清２８検体各１００μｌからアンプリコアＨＣＶキット附属のＨＣＶ−ＲＮＡ抽出試薬（ロシュ社製）を用いてＲＮＡを調製した。
（２）患者血清中のＨＣＶ−ＲＮＡ検出
実施例１（３）及び（４）記載の方法と同じ方法でＨＣＶ−ＲＮＡを増幅し、本発明の検出方法に供した。本実施例においては、対照のＨＣＶ−ＲＮＡを含まない試料について行ったネガティブコントロール１０本の蛍光強度の平均値＋３ＳＤ（標準偏差値の３倍）をカットオフ値とし、このカットオフ値を超えた蛍光強度を示す検体を陽性とした。一方、同一の検体を市販のアンプリコアＨＣＶキットにより測定し、キットの取扱説明書に従って陽性・陰性を判定した。本発明の検出方法と従来法のアンプリコアＨＣＶキットの結果の比較を表１１に示す。

表１１に示したように、本発明の方法による測定結果は、従来法で得られた成績と良く相関していることが確認できた。また、本発明の方法が従来法に比較して、高感度で迅速・簡便に測定できることが確認できた。
産業上の利用の可能性
本発明により、病原性微生物を高感度、高特異的・迅速・簡便に測定できることが可能となり、特殊な機器を使用することなく多検体を限られた時間で処理することが可能な方法、プライマー及びプローブ、キットが提供される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１ 本発明の方法により、各種ＨＣＶ−ＲＮＡ濃度を測定した場合、ＨＣＶ−ＲＮＡ濃度と蛍光強度の変化の関係、ならびに従来法との測定範囲の差を比較した図である。

Claims (4)

1. 結核菌含有検体をムラミダーゼで処理し、核酸を抽出する工程；
   配列表の配列番号１３及び１４でそれぞれ表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマー、前記の核酸を含有する試料、ＲＮａｓｅＨ、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）を含む反応液を適切な温度で反応産物が生成するのに十分な時間保温することによって結核菌ＩＳ６１１０遺伝子の断片を増幅する工程；および
   増幅物と配列表の配列番号１１記載の塩基配列で示されるプローブとの間でアルカリ領域でのハイブリダイゼーションにより結核菌ＩＳ６１１０遺伝子の断片を検出する工程
   を包含する結核菌群の検出方法。
2. 請求項１記載の結核菌群の検出方法に使用するための組成物であって、配列表の配列番号１３及び１４でそれぞれ表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨ及びデオキシリボヌクレオチド３リン酸を含有することを特徴とする結核菌群検出用組成物。
3. 請求項１記載の結核菌群の検出方法に使用するためのキットであって、配列表の配列番号１１記載の塩基配列で示されるプローブ、配列表の配列番号１３及び１４でそれぞれ表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨ、デオキシリボヌクレオチド３リン酸及びムラミダーゼを含有することを特徴とする結核菌群検出用キット。
4. さらに、マイクロタイタープレート、ビーズ、マグネチックビーズ、メンブラン、およびガラスから選択される、増幅産物を捕捉するための担体を含有する請求項３記載のキット。

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