JP4095682B2

JP4095682B2 - 希土類元素集積微生物

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Publication number: JP4095682B2
Application number: JP26035195A
Authority: JP
Inventors: 啓一河合; 徹鈴木; 博宣村瀬
Original assignee: Shishiai KK
Current assignee: Shishiai KK
Priority date: 1995-10-06
Filing date: 1995-10-06
Publication date: 2008-06-04
Anticipated expiration: 2015-10-06
Also published as: JPH0998773A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な希土類元素集積微生物に関するものである。詳しく述べると、本発明は、特定の希土類元素を効率よく集積する能力を有する希土類元素集積微生物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
希土類元素は、周期表中では自然界に存在する最大の元素グループであり、原子番号５７番のランタン（Ｌａ）から７１番のルテチウム（Ｌｕ）までの１５元素（ランタノイド）にスカンジウム（Ｓｃ）とイットリウム（Ｙ）を加えた１７個の元素群の総称であり、イオンの不完全充填状態の４ｆ電子の挙動に基づく磁気的性質及び色などの光学的性質、さらには希土類独特の化学的性質により様々な広範囲な分野において使用されている。具体的には、４ｆ電子の性質を利用したものとしては、カラーテレビ受像機のブラウン管の赤色蛍光体（ユウロピウム）やクォーツの腕時計やウォークマン等の小型電子機器における磁石（サマリウムやネオジム）が、また、化学的性質を利用したものとしては、ガソリンの製造に使用される触媒（ランタンやセリウム）、酸化物高温超伝導体、水素吸蔵合金、セラミックスおよび原子炉の制御材等がそれぞれ挙げられる。
【０００３】
また、これらの希土類元素は、モナザイト(monazite)、バストネサイト(bastnaesite) 、ゼノタイム(zenotime)、ユウクセナイト(euxenite)及びガドリナイト(gadolinite)等の鉱物中に含まれている。これらのうち、主に軽希土（ランタンからユウロピウム）の資源としてモナザイト及びバストネサイトを、また、重希土（ガドリニウムからルテチウムにイットリウムを加えたもの）の資源としてゼノタイムを工業的規模で分解精練することによって、それぞれの希土類元素が資源として得られるが、希土類元素は、物理的及び化学的性質が相互に非常に類似しており、鉱物中に共存する形で存在しているため、それらの相互分離が著しく困難であるという問題がある。このため、従来の希土類元素の分離方法である分別結晶法や分別沈澱法は、元素間の溶解度の差が小さいため操作を何回も繰り返さなければならず相互分離は非常に困難な作業であった。このため、この欠点を解消するために、イオン交換樹脂を充填したカラムに希土類を吸着させておき、そこに溶離液として錯化剤を用いたものを流すイオン交換法が開発されたが、この方法は、連続処理ができず一回の操作に時間がかかることや、樹脂の再生、交換などのコストが大きいため、大量処理の方法としては適さなかった。そこで、この方法に代わって出てきたのが、互いに混じり合わない溶媒へのイオンの溶解の仕方の違いを利用した溶媒抽出法である。しかしながら、この方法は、一回の操作で高純度品を得ることは困難であり、純度を高めるために操作を何度も繰り返えさなければならないという問題がある。このため、工業的には、操作を連続的に数十回行なうことのできる向流多段抽出装置が開発され用いられており、イオン交換法に比べ処理量が多い、操作時間が短い、操作が容易などの利点を持っており、現在の希土類元素の大量分離法の主流になっている。
【０００４】
上記方法とは別に、特定の希土類元素を選択的に捕集することができる微生物を得、これから目的とする希土類元素を得る方法も開発され、提案されてきている。このような微生物としては、特開昭５９−１１８，８２５号に記載されている微生物がある。しかしながら、上記公報は、活性汚泥を用いてイットリウムを選択的に捕集する方法を開示しているのみであり、具体的に微生物を特定するまでには至っていない。
【０００５】
このように、希土類元素を効率的に集積する特定された微生物については依然として開発途中であり、実際に工業的に使用されているものは未だに存在せず、このような微生物の開発が望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、希土類元素を効率的に集積することのできる微生物を提供することを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記諸目的は、希土類元素を集積しうるメチロバクテリウム属に属する希土類元素集積微生物によって達成される。
【０００８】
本発明は、希土類元素のうち特にイッテルビウムを効率よく集積する希土類元素集積微生物を示すものである。本発明はまた、上記微生物がメチロバクテリウムフジサワエンスである希土類元素集積微生物を示すものである。本発明はさらに、受託番号がＦＥＲＭＰ−１５２１１号である希土類元素集積微生物を示すものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明による微生物は、メチロバクテリウム属（Methylobacterium）に属し、希土類元素を効率的に集積することができることを特徴とする微生物であり、この微生物の具体例としては、メチロバクテリウムフジサワエンス(Methylobacterium fujisawaense) ３−１株が挙げられ、この菌株は、以下のスクリーニング方法によって得られたものである。なお、以下のスクリーニング方法では、二価及び三価の原子価を有するイッテルビウム（Ｙｂ）をスクリーニングのための希土類元素として使用した。
【００１０】
低栄養状態で積極的に増殖できる微生物群に希土類を集積する能力を備えた目的とする菌株が存在する可能性が高いとの推測に基づいて、スクリーニングを２段階に分けて、つまり、一次スクリーニングとして低栄養性細菌の探索を行った後、二次スクリーニングとしてこれらの菌からイッテルビウム（Ｙｂ）を集積する能力を有する即ち培養液中のＹｂ濃度を減少させる菌株の選抜を行った。本発明において使用したスクリーニング方法を以下に具体的に記載する。
【００１１】
浜名湖から採取した水系試料を滅菌水で１０〜１０³倍に適宜希釈したものを１００μｌずつコンラージ棒で、以下の方法で作製された一次スクリーニング用寒天培地（ｐＨ：７．２〜７．４）に塗布し、この寒天培地を３０℃で３〜５日間培養した。次に、寒天培地上に形成されたコロニーを釣菌し、滅菌水１０ｍｌに懸濁してさらにこれを１０²〜１０³倍に希釈した後、同様の寒天培地に１００μｌずつ塗布し、さらにこの操作を数回繰り返して菌株を純化した。このような一次スクリーニングによって、栄養分の稀薄な状態においても増殖可能な細菌が得られた。
一次スクリーニング用寒天培地の作製方法：栄養分１／１００の肉汁培地（ポリペプトン０．０１％、肉エキス０．０１％、ＮａＣｌ０．００５％、ｐＨ７．２〜７．４）（以下、希釈肉汁培地と称する）を調製し、これに寒天１．５％（ｗｔ／ｖ）を添加して高圧滅菌したものを滅菌済のシャーレに約３０ｍｌずつ分注して平板培地（以下、希釈肉汁寒天培地と称する）とした。
【００１２】
次に、以下の方法で作製された、滅菌処理済みの二次スクリーニング用液体培地を５ｍｌずつシリコ栓をして予め高圧滅菌した試験管中に分注した。これに、上記一次スクリーニングで純化した各単離菌体を白金耳で一白金耳ずつ接種し、３０℃で１０日間振盪培養した。培養後、以下の方法に従って培養上清中に残存するイッテルビウム（Ｙｂ）濃度を測定し、目測で明かにＹｂ濃度が減少していると判別できたものを選び、さらにこのサンプルについて吸光度測定を行ない、培養上清中のＹｂ濃度が初濃度（５ｐｐｍ）より５０％以上減少した菌を候補菌として選別した。この際、選別された菌株は再度二次スクリーニング用培地に接種して同様の操作を繰り返し、Ｙｂ濃度減少に関する再現性を確認した。このようにして希土類元素を効率的に集積する菌株をスクリーニングした。
二次スクリーニング用培地の作製方法：肉汁（ポリペプトン１％、肉エキス１％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．２〜７．４）を脱塩水で１００倍希釈し、この希釈培地に５％（ｖ／ｖ）の硝酸イッテルビウム［Ｙｂ（ＮＯ₃）₃］溶液（１モル／リットル）を中和するのに相当する量［０．１％（ｖ／ｖ）］の５Ｎ水酸化ナトリウム溶液を予め加え、この溶液を攪拌しながらｐＨが約７．２になるように１，０００ｐｐｍのＹｂ（ＮＯ₃）₃溶液を徐々に滴下し、これを脱塩水で１リットルとし、孔径０．２μｍのポリサルホン製滅菌済フィルターで濾過滅菌し、これを二次スクリーニング用培地（Ｙｂ濃度：５ｐｐｍ）（以下、Ｙｂ含有培地と称する）とした。なお、このＹｂ含有培地の組成を表１に示す。
【００１３】
【表１】

【００１４】
また、培養上清中に残存するイッテルビウム（Ｙｂ）濃度の測定方法を以下に記載する。
スクリーニングする菌株を接種、培養した後の培養液サンプル約１．４ｍｌをエッペンドルフ遠心管に入れ、遠心分離（４℃、１２，０００ｒｐｍ×１０分間）することによって得られた培養上清１ｍｌを新しい試験管に入れる。さらに、この試験管に、予め調製しておいた０．１％アルセナゾIII (Arsenazo III)溶液及び塩酸・塩化カリウム緩衝液（２５ｍｌ０．２ＭＫＣｌ、５９ｍｌ０．２ＭＨＣｌ及び１６ｍｌ脱塩水を混合して１００ｍｌに定容した溶液）を各々０．５ｍｌずつ加えた後、最後に純水１ｍｌを加え、ボルテクスにより良く撹拌した。この混合溶液を暗所で３０〜６０分間放置した後、サンプル溶液の６５５ｎｍの吸光度を測定し、以下のようにして作成された標準直線に基づいて各サンプル中に含まれるイッテルビウム（Ｙｂ）の濃度を求めた。標準直線は、試験管に各々０、１、２、３、４、５μｌずつＹｂ（ＮＯ₃）₃溶液を加え、そこに純水１ｍｌを加えたものをサンプルとしかつ遠心分離を行わない以外は上記と同様の比色操作方法を行うことによって、作成した。なお、この際、Ｙｂ（ＮＯ₃）₃溶液としては、原子吸光用の硝酸イッテルビウム溶液［１モル／リットルの硝酸溶液におけるＹｂ（ＮＯ₃）₃濃度＝１．０ｍｇＹｂ／ｍｌ］（和光純薬製）を使用した。
【００１５】
上記スクリーニングによって、Ｙｂ含有培地中のイッテルビウム濃度を他の菌株と比べて著しく減少させる１菌株が得られた。以下に、この菌株の菌学的性質を示す。
【００１６】
（ａ）形態
１）細胞の形および大きさ：長桿菌で長さ１．０〜２．０μｍ、直径３．０〜４．０μｍ
２）細胞の多形性の有無：無し
３）運動性の有無：有り
４）胞子の有無：無し
（ｂ）培養的性質
１）肉汁寒天平板培養（３０℃）：コロニーは円形で不透明なピンク色でかつ凸状であり、表面は滑らかで光沢がある。コロニーの大きさは、３０℃で５日間培養した際、直径約２ｍｍであり、希釈肉汁寒天培地では、３０℃で５日間培養した際、直径約１ｍｍである。
２）ベネット寒天培地（３７℃）：＋
ベネット寒天培地（４１℃）：弱い＋
ベネット寒天培地（４５℃）： −
なお、ベネット寒天培地(Bennett′s agar) の組成は、酵母エキス０．１％、牛肉エキス０．１％、ＮＺアミンＡ０．２％、ブドウ糖１．０％、寒天２．０％（ｐＨ７．３）である。
【００１７】
（ｃ）生理学的性質（３０℃、１４日間）
１）グラム染色性： −
２）カタラーゼ：＋
３）オキシダーゼ： −
４）Ｏ−Ｆテスト： −
５）酸素に対する態度：好気性
（ｄ）その他の生理学的性質
１）メタノールの利用：＋
２）グルコースの利用： −
３）フラクトースの利用：＋
４）酢酸塩の利用：＋
５）ベタインの利用： −
６）メチルアミンの利用： −
７）Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの利用： −
８）水酸化テトラメチルアンモニウムの利用： −
９）トリメチルアミンの利用： −
１０）アスパラギン酸塩の利用：僅かに＋
１１）グルタミン酸塩の利用：＋
１２）フコースの利用：＋
１３）アラビノースの利用：＋
１４）クエン酸の利用：＋
本菌は、バージーズマニュアルオブシステマティックバクテリオロジー（Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology 8th ）だけでは分類不可能であったため、本菌の同定をザナショナルコレクションズオブインダストリアルアンドマリーンバクテリアリミテッド（ＮＣＩＭＢ）(The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited)に依頼（参照番号：ＩＤ２６６０／ＮＣＩＤ４２９５、日付：１９９５年３月２３日の報告書類における菌株３−１）したところ、非定型の陰性のグルコース反応を有するメチロバクテリウムフジサワエンス(Methylobacterium fujisawaense) に近似することが分かった［参考文献：グラム−ネガティブメチロトロフィックロッズアンドコッキー(Gram-negative Methylotrophic Rods and Cocci) 、ピーエヌグリーン(P.N. Green)、アイデンティフィケーションメソッズインアプライドアンドエンヴァーロメンタルマイクロバイオロジー(Identification Methods in Applied and Environmental Microbiology)１９９２年、アールジーボード(R.G. Board)、ディジョーンズ(D. Jones)及びエフエースキナー(F.A. Skinner)、ソサイエティフォーアプライドバクテリオロジーテクニカルシリーズ(Society for Applied Bacteriology Technical Series) ２９、ブラックウェルサイエンティフィック(Blackwell Scientific)における］。
【００１８】
従来まで、メチロバクテリウムフジサワエンス(Methylobacterium fujisawaense) が希土類元素を集積するという報告はなく、本菌は明らかに公知の菌種と区別されるため、本発明の微生物を新規な微生物であると判断し、本菌株をメチロバクテリウムフジサワエンス(Methylobacterium fujisawaense) ３−１株（以下、単に３−１株と称する）と命名した。また、この３−１株は、平成７年９月２９日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、その受託番号はＦＥＲＭＰ−１５２１１号である。
【００１９】
本発明では３−１株を使用したが、この菌株に限られることなく、希土類元素を集積することが可能なメチロバクテリウム属(Methylobacterium)に属する微生物であれば使用できる。
【００２０】
本発明の菌株の培養に使用する培地は、固体または液体培地のいずれでもよく、また、使用する細菌が資化しうる炭素源、適量の窒素源、無機塩及びその他の栄養素を含有する培地であれば、合成培地または天然培地のいずれでもよい。
【００２１】
本発明の菌株の培養において使用できる炭素源としては、使用する菌株が資化できる炭素源であれば特に制限されない。具体的には、微生物の資化性を考慮して、フラクトース、マルトース、ガラクトース、デンプン、デンプン加水分解物、糖蜜、廃糖蜜などの糖類、肉エキス、ペプトン、麦、米などの天然物、グリセロール、メタノール、エタノール等のアルコール類、酢酸、グルコン酸、ピルピン酸、クエン酸等の脂肪酸類、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸などを１種または２種以上選択して使用することができる。
【００２２】
本発明の菌株の培養において使用できる窒素源としては、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、大豆加水分解物、大豆粉末、ミルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸、コーンスティープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解物等の有機窒素化合物、アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、尿素等の無機窒素化合物より使用する微生物の資化性を考慮して、１種または２種以上選択して使用する。
【００２３】
本発明において使用できる無機塩としては、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、銅、鉄及び亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩及び酢酸塩等から選ばれた１種または２種以上を使用することができる。また、培地中に、必要に応じて、植物油、界面活性剤等を添加してもよい。
【００２４】
本発明の微生物に効率よく希土類元素を集積させるためには、培地中に希土類元素を添加することが好ましい。添加される希土類元素の種類及び添加量は、使用する微生物が集積しやすい希土類源の種類によるが、例えば、３−１株を使用する場合には、イッテルビウム、ランタン、ネオジム、テルビウム及びツリウムを、１〜２０ｐｐｍ、より好ましくは２〜１０ｐｐｍの濃度で、添加することが望ましい。この際、添加する希土類元素は２種以上の混合物または合金であってもよい。
【００２５】
本発明において、培養は、本発明の細菌は好気性であるため、好気的条件下で行われ、その際の培養条件は、培地の組成や培養法によって適宜選択され、本菌株が増殖できる条件であれば特に制限されない。通常は、培養温度が、２０〜７０℃、好ましくは２５〜４０℃であり、また、培養に適当な培地のｐＨは、５〜９、好ましくは６〜８である。
【００２６】
また、本発明において、希土類元素の微生物からの分離、精製方法としては、上記培養条件下で培養を行った後、菌体を瀘過あるいは遠心分離等によって集め、例えば、凍結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、磨砕処理等の物理的手段またはリゾチーム等の細胞壁溶解酵素処理若しくは界面活性剤との接触処理等の化学的処理を単独または組み合わせて行うことにより菌体を破砕し、破砕した菌体から目的とする希土類元素を、分別結晶法、分別沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー法および溶媒抽出法等の既知の方法を単独若しくは組み合わせて用いて精製する方法が挙げられる。破砕した菌体からの希土類元素の精製法としては、手間、時間および費用の点から、溶媒抽出法、特に溶媒抽出操作を連続して行う向流多段抽出法が好ましく用いられる。
【００２７】
本発明の微生物は、希土類元素を効率よく集積する特性を有するが、従来、メチロバクテリウム属(Methylobacterium)に属し、上記特性を有する微生物に関する報告はなかった。
【００２８】
【実施例】
以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。
【００２９】
実施例１
以下の実験を行うことにより、本発明の３−１株によるＹｂ濃度の経時的な変化を観察した。
【００３０】
０．２μｍのポリサルホン製滅菌済フィルターで濾過滅菌したＹｂ含有培地（Ｙｂ濃度：５ｐｐｍ）５ｍｌに斜面培地より３−１株を一白金耳接種して、３０℃で２４時間振盪培養することによって前培養を行った。このようにして得られた前培養液５ｍｌを、同様にして瀘過滅菌したＹｂ含有培地９５ｍｌの入った５００ｍｌの枝付き坂口フラスコに入れ、３０℃で１０日間本培養を行った。この培養期間中、２４時間おきに培養液を３ｍｌずつ採取し、採取した培養液について、作用において記載した測定方法に従ってＹｂ濃度を測定すると同時に、菌の生育を６６０ｎｍの波長における濁度（ＯＤ₆₆₀）として求め、さらに、培養液のｐＨの変化をｐＨメーターにて測定した。なお、濁度については、フラスコの側面にある試験管状部分に培養液を流し込み、ここに測定器を差し込んで計測を行った。
【００３１】
このようして得られた培養時間に対する３−１株の培養液のＹｂ濃度の変化および濁度及びｐＨの変化を図１に示す。図１より、３−１株は、３日目から急激に濁度が上がる（即ち、急速に増殖する）とともに、ｐＨの上昇及び急激なＹｂ濃度の減少が示され、その後は、５日目から生育が定常状態となり、ｐＨは６日目から、Ｙｂ濃度は９日目から一定になることが示された。Ｙｂ濃度の減少が逆Ｓ字曲線を描いており、菌株の成長と共にＹｂ濃度が減少していることから、菌株の増殖とＹｂの集積とは関連が有る、即ち、培養中に菌体内にイッテルビウムが蓄積されたのではないかと考えられる。
【００３２】
実施例２
以下の実験を行うことにより、本発明の３−１株の各種希土類元素に対する選択性を調べた。
【００３３】
図２に記載の各種希土類元素［プロメチウム（Ｐｍ）を除くランタノイド（Ｌａ〜Ｌｕ）及びイットリウム（Ｙ）］の硝酸溶液を硝酸イッテルビウム溶液の代わりに用いる以外は表１と同様の培地組成を有する液体培地を孔径０．２μｍのポリサルホン製滅菌済フィルターで瀘過滅菌し、希土類元素含有液体培地を作製した。
【００３４】
０．２μｍのポリサルホン製滅菌済フィルターで濾過滅菌した希土類元素を含まない希釈肉汁培地５ｍｌに斜面培地より３−１株を一白金耳接種して、３０℃で２４時間振盪培養することによって前培養を行った。このようにして得られた前培養液１００μｌを、上記したように予め別に調製しておいた各希土類元素含有液体培地５ｍｌに入れ、３０℃で１０日間振盪培養することによって本培養を行い、所定時間培養した後の培養液中に含まれる各希土類元素濃度を測定し、初濃度に対する減少率を算出した。なお、各希土類元素の濃度の測定方法は、使用する希土類元素が異なる以外は作用において記載されたイッテルビウム濃度の測定方法と同様であるが、６５５ｎｍの波長における感度が元素ごとに異なるために、標準曲線を各元素ごとに作成した。
【００３５】
また、比較対照として、大腸菌(E. coli) ＪＭ１０９株を各種希土類元素含有培地で培養して、各希土類元素濃度の減少率を求めた。
【００３６】
本発明の３−１株を用いた結果を図２に示し、比較として大腸菌(E. coli) ＪＭ１０９株を用いた結果を図３に示す。その結果、図２に示されるように、３−１株は極めて高い選択性を示した。すなわち、イッテルビウムのみが唯一５０％以上の減少率を示したのみである他は、ランタン及びネオジムが３０％程度の減少率でそれ以外の元素は１０〜２０％の低い減少率であるあるいは全く減少していないものさえ確認された。また、大腸菌(E. coli) ＪＭ１０９株を用いた図３の結果との比較から、イットリウム、セリウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリウム、ホルミウム及びルテチウムの濃度の減少率は誤差の範囲である可能性が高いことが示唆される。
【００３７】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によるメチロバクテリウム属(Methylobacterium)に属する微生物は、希土類元素、特に重希土類であるイッテルビウムを効率よく集積できる新規な微生物である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の微生物による希土類元素集積能を説明するための培養時間に対する培養液中のイッテルビウム（Ｙｂ）濃度の変化、および培養液の濁度及びｐＨの変化を示すものである。
【図２】図２は、本発明の微生物の各種希土類元素に対する選択性を示す図である。
【図３】図３は、大腸菌ＪＭ１０９株の各種希土類元素に対する選択性を示す図である。

Claims

受託番号がＦＥＲＭＰ−１５２１１号である、希土類元素を集積しうるメチロバクテリウムフジサワエンス。
希土類元素のうち特にイッテルビウムを効率よく集積する、請求項１に記載のメチロバクテリウムフジサワエンス。