JP4097315B2 - 修飾フィターゼ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フィチン酸（ミオイノシトールヘキサキスホスフェート）に作用してこれをミオイノシトールと無機リン酸とに加水分解する酵素で、有益な飼料添加物として知られているフィターゼ（ミオイノシトールヘキサキスホスフェートホスホヒドロラーゼ；EC 3.1.3.8）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
フィターゼは、1907年に最初に米ぬかで記述され[Suzukiら、Bull. Coll. Agr. Tokio Imp. Univ. 7, 495 (1907)]、1911年にコウジカビ属(Aspergillus)のフィターゼが記述された[DoxおよびGolden, J. Biol. Chem. 10, 183〜186 (1911)]。フィターゼは小麦のふすま、植物の種子、動物の腸、および微生物でも見つかっている[HowsenおよびDavix, Enzyme Microb. Technol. 5, 377〜382 (1983)、Lambrechtsら、Biotech. Lett. 14, 61〜66(1992)、ShiehおよびWare, Appl. Microbiol. 16, 1348〜1351 (1968)]。
【０００３】
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger） (フィクウムficuum)由来のフィターゼのクローニングと発現は、フォン・ハーチングスベルツ（Van Hartingsveldt）らにより[Gene, 127, 87-94 (1993)]および欧州特許出願第(EP)420 358号において、アスペルギルス・ニガー・アワモリ変種（Aspergillus niger var. awamori）のフィターゼのクローニングと発現はピディントン（Piddington）らにより[Gene 133, 55〜62 (1993)]において報告されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
特性が改良されたフィターゼのクローニング、発現、および精製は、欧州特許第684 313号に開示されている。しかし、特に活性特性に関してまだフィターゼをさらに改良する必要性がある。従って、本発明は、改良された活性特性を有する修飾フィターゼの生産方法を提供することを課題とする。また、本発明は、上記の方法によって得られる修飾フィターゼを提供することを課題とする。さらに、本発明は、上述のフィターゼをコードするDNA配列を含むDNA配列、該DNA配列を含むベクター、好ましくは発現ベクター、該DNA配列またはベクターにより形質転換された宿主細胞、上述の宿主細胞が適当な培養条件下で培養され、該宿主細胞または培地から当技術分野で周知の方法によりフィターゼが単離される、本発明のフィターゼの調製方法、および本発明のフィターゼを含む食物または飼料組成物を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の修飾フィターゼの生産方法においては、
（１）a) アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のフィターゼの３次元構造を基にして、修飾するフィターゼ、および選択的に、修飾するフィターゼの活性特性よりも好都合な活性特性を有する別のフィターゼの３次元構造を、コンピュータでモデル化する段階、
b) 修飾するフィターゼと、より好都合な活性特性を有するフィターゼとの活性部位の構造を比較し、両方の活性部位において異なるアミノ酸残基を同定する段階、
c) 両方の活性部位が異なる少なくとも１つのアミノ酸をコードするヌクレオチドを変化させることにより、修飾フィターゼをコードするDNA配列を構築する段階、
d) 適当な宿主細胞において発現する能力を有するベクターに該DNA配列を組み込む段階、
e) c)のDNA配列またはd)のベクターにより適当な宿主細胞を形質転換し、該宿主細胞を適当な培養条件下で培養し、当技術分野で公知の方法により、宿主細胞または培地から修飾フィターゼを単離する段階を実行することを特徴とする、改良された活性特性を有する修飾フィターゼの生産方法であることを特徴とする。
【０００６】
また、本発明の方法においては、
（２）修飾するフィターゼが真核生物由来である、（１）記載の方法であることを特徴とする。
【０００７】
また、本発明の方法においては、
（３）修飾するフィターゼが菌類由来である、（１）または（２）記載の方法であることを特徴とする。
【０００８】
また、本発明の方法においては、
（４）修飾するフィターゼがコウジカビ属(Aspergillus)由来である、（１）から（３）のいずれか一項に記載の方法であることを特徴とする。
【０００９】
また、本発明の方法においては、
（５）修飾するフィターゼが、アスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）由来のフィターゼである、（１）から（４）のいずれか一項に記載の方法であることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明の方法においては、
（６）より好都合な活性特性を有するフィターゼが真核生物由来である、（１）から（５）のいずれか一項に記載の方法であることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明の方法においては、
（７）より好都合な活性特性を有するフィターゼが菌類由来である、（１）から（６）のいずれか一項に記載の方法であることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明の方法においては、（８）より好都合な活性特性を有するフィターゼがコウジカビ属(Aspergillus)由来である、（１）から（７）のいずれか一項に記載の方法であることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明の方法においては、
（９）より好都合な活性特性を有するフィターゼがアスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）由来のフィターゼである、（１）から（８）のいずれか一項に記載の方法であることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明の方法においては、
（１０）修飾するフィターゼがアスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）のフィターゼであり、より好都合な活性特性を有するフィターゼがアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のフィターゼである、（１）から（９）のいずれか一項に記載の方法であることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明の方法においては、
（１１）修飾するフィターゼがアスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）のフィターゼであり、より好都合な活性特性を有するフィターゼがアスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）のフィターゼである、（１）から（９）のいずれか一項に記載の方法であることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明の修飾フィターゼにおいては、
（１２）（１）から（１１）のいずれか一項に記載の方法により得られた、または得ることの可能な修飾フィターゼであることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明のフィターゼにおいては、
（１３）活性特性が非修飾フィターゼの活性特性よりも好都合であるように修飾されたフィターゼであることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明のフィターゼにおいては、
（１４）非修飾フィターゼのアミノ酸配列が、１つまたは複数のアミノ酸の欠失、置換、および／または付加により変化していることを特徴とする、（１３）記載のフィターゼであることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明のフィターゼにおいては、
（１５）アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のフィターゼのアミノ酸配列の以下の位置：27、66、71、103、140、141、188、205、234、235、238、274、277、282、340および／または424、好ましくは27、66、140、205、274、277、282および／または340の１つに相同である少なくとも１つの位置に変化が生じている、（１３）または（１４）のいずれか一項に記載のフィターゼであることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明のフィターゼにおいては、
（１６）コウジカビ属(Aspergillus)、好ましくはアスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）のフィターゼである、（１３）から（１５）のいずれか一項に記載のフィターゼであることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明のフィターゼにおいては、
（１７）位置27に変化が生じている、または少なくとも位置27に変化が生じている、（１５）または（１６）のいずれか一項に記載のフィターゼであることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明のフィターゼにおいては、
（１８）位置27のアミノ酸が、
a) Ala、Val、Leu、Ile；または
b) Thrの群の１つから選択されるアミノ酸で置換されている、（１７）記載のフィターゼであることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明のフィターゼにおいては、
（１９）位置27に加えて、位置66でも変化が生じている、（１７）または（１８）記載のフィターゼであることを特徴とする。
【００２４】
また、本発明のフィターゼにおいては、
（２０）位置27に加えて、位置140でも変化が生じている、（１７）または（１８）記載のフィターゼであることを特徴とする。
【００２５】
また、本発明のフィターゼにおいては、
（２１）以下の変異：Q27L、Q27N、Q27T、Q27I、Q27V、Q27A、Q27G、S66D、S140Y、D141G、A205E、Q274L、G277D、G277K、Y282Hおよび／またはN340Sのうちの少なくとも１つを特徴とする、（１３）から（２０）のいずれか一項に記載のフィターゼであることを特徴とする。
【００２６】
また、本発明のDNA配列においては、
（２２）（１２）から（２１）のいずれか一項に記載のフィターゼをコードするDNA配列を含むDNA配列であることを特徴とする。
【００２７】
また、本発明のベクターにおいては、
（２３）（２２）記載のDNA配列を含むベクターであることを特徴とする。
【００２８】
また、本発明のベクターにおいては、
（２４）発現ベクターである、（２３）記載のベクターであることを特徴とする。
【００２９】
また、本発明の宿主細胞においては、
（２５）（２２）記載のDNA配列または（２３）もしくは（２４）記載のベクターにより形質転換された宿主細胞であることを特徴とする。
【００３０】
また、本発明の調製方法においては、
（２６）（２５）記載の宿主細胞が適当な培養条件下で培養され、該宿主細胞または培地から当技術分野で公知の方法によりフィターゼが単離される、（１２）から（２１）のいずれか一項に記載のフィターゼを調製する方法であることを特徴とする。
【００３１】
また、本発明の組成物においては、
（２７）（１２）から（２１）のいずれか一項に記載のフィターゼを含む、食料または飼料組成物であることを特徴とする。
【００３２】
【発明の実施の形態】
本発明は、
i) 以下の段階を実施することを特徴とする、改良された活性特性を有する修飾フィターゼの生産方法を提供する。
【００３３】
a) アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）（フィクウム（ficuum））のフィターゼの3次元構造を基にして、修飾するフィターゼ、および選択的に、修飾するフィターゼの活性特性よりも好都合な活性特性を有する別のフィターゼの3次元構造を、コンピュータでモデル化する段階；
b) 修飾するフィターゼと、より好都合な活性特性を有する別のフィターゼとの活性部位の構造を比較し、両方の活性部位において異なるアミノ酸残基を同定する段階；
c) 両方の活性部位で異なる少なくとも1つのアミノ酸をコードするヌクレオチドを変化させることにより、修飾フィターゼをコードするDNA配列を構築する段階；
d) 適当な宿主細胞において発現する能力を有するベクターに該DNA配列を組み込む段階；
e) c)のDNA配列またはd)のベクターにより適当な宿主細胞を形質転換し、該宿主細胞を適当な増殖条件下で増殖させ、当技術分野で公知の方法により、宿主細胞または培地から修飾フィターゼを単離する段階。
【００３４】
また、本発明は、
ii) i)に説明される方法であって、修飾されるフィターゼが真核生物由来、好ましくは菌類、さらに好ましくは例えばアスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus） のようなコウジカビ属(Aspergillus)由来である方法、または
iii) i)もしくはii)に説明される方法であって、より好都合な活性特性を有するフィターゼが真核生物由来、好ましくは菌類、さらに好ましくは例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）またはアスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus） (アスペルギルス・テレウス cbs 116.46または9A1）のようなコウジカビ属由来である方法、または
iv) i)、ii)、もしくはiii)に説明される方法であって、修飾されるフィターゼがアスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）のフィターゼであり、より好都合な活性特性を有するフィターゼがアスペルギルス・テレウス（Asperigillus terreus）のフィターゼもしくはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のフィターゼである方法、を提供する。
【００３５】
これに関連して、改良された特性を有するフィターゼを生産する別の可能性は、例えばアスペルギルス・フィクウム（Aspergillus Ficuum）のような、同じ生物であるが天然に見つかり任意の既知の寄託機関によって寄託されている異なる株から、フィターゼを単離することである。そのアミノ酸配列は、例えば欧州特許出願第(EP) 684 313号に記載されているような方法によって、対応するDNA配列をクローニングすることにより決定できる。一旦そのような配列が決定されれば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のフィターゼの3次元構造を基にしてそのモデルを作製することができ、両方の配列の活性部位を比較してそのフィターゼが改良された活性特性（実施例8参照）を有するか否かを調べるか、または両方の活性部位の配列を直接比較して本出願に記載されるアッセイにより上昇および／または改良された活性を有するか否かを試験することができる。
【００３６】
さらに、本発明は、上記の方法によって得られる修飾フィターゼを提供する。一般的に、非修飾フィターゼの活性特性よりも好都合な活性特性を有するように修飾されたフィターゼ、具体的には非修飾フィターゼのアミノ酸配列が1つまたは複数の欠失、置換、および／または付加により変更されたフィターゼ、さらに具体的にはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）（図1参照）のフィターゼのアミノ酸配列の以下の位置：27、66、71、103、140、141、188、205、234、235、238、274、277、282、340および／または424、好ましくは27、66、140、205、274、277、282および／または340のうちの１つに相同な少なくとも１つの位置において改変されたフィターゼ、またさらに具体的には真核生物、好ましくは菌類、さらに好ましくはコウジカビ属、最も好ましくはアスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）由来であるフィターゼを提供する。
【００３７】
さらに、本発明は、位置27に変化が生じている、または少なくとも位置27に変化が生じているフィターゼ、好ましくは位置27のアミノ酸が
a) Ala、Val、Leu、Ile；または
b) Thrまたは
c) Asn；
の群のうちの１つから選択されるアミノ酸によって置換されているフィターゼ、ならびに位置27に加えて位置66でもさらに変化が生じているフィターゼ、または位置27に加えて位置140および／もしくは位置274および／もしくは277でも変化が生じているフィターゼを提供する。
【００３８】
また、本発明は、以下の変異：Q27L、Q27N、Q27T、Q27I、Q27V、Q27A、Q27G、S66D、S140Y、D141G、A205E、Q274L、G277D、G277K、Y282Hおよび／またはN340Sのうちの少なくとも1つを特徴とする上述のフィターゼを提供する。
【００３９】
さらに、本発明は、菌類、好ましくはコウジカビ属、最も好ましくはアスペルギルス・ニガー（A. niger）（フィクウム（ficuum））由来のプロテアーゼによる分解に対して抵抗性であるフィターゼ変異蛋白質を提供する。そのような変異蛋白質は、少なくとも以下の位置（アスペルギルス・ニガーのアミノ酸配列の相同位置を指す）、すなわち、好ましくはアスペルギルス・フミガツス（A. fumitatus）のフィターゼの位置130または129と130、または好ましくはアスペルギルス・ニードランス（A. nidulans）のフィターゼのアミノ酸配列の167、168のうちの1つにおいて、野生型に存在するアミノ酸が、プロテアーゼ感受性を変化させることが知られている別のアミノ酸で置き換えられていることを特徴とする。例えば、アスペルギルス・フミガツス（A. fumigatus）の場合には位置130で「S」から「N」、および位置129で「R」から「L」に、アスペルギルス・ニードランス（A. nidulans）の場合には位置167で「K」から「G」、および位置168でRからQに置換されている。該位置は、改良された活性特性を提供する位置と組み合わせることもできる。
【００４０】
これに関連して、「改良された活性特性」とは、非変異フィターゼと比較した変異フィターゼの活性におけるあらゆる種類の改良を意味する。これは、例えば、欧州特許第684 313号などのようにフィターゼの活性を測定するために当技術分野で周知のアッセイまたは本出願の実施例に記載されるアッセイにおけるより高い比活性、好ましくは少なくとも2倍またはより好ましくは少なくとも3〜4倍高い比活性を意味する。さらに、これは当技術分野で周知のアッセイまたは例えば本発明の特定の実施例に記載されるアッセイによって決定される、異なる基質特異性を意味する。これは、当技術分野で周知のアッセイ、または例えば本発明の実施例に記載されるアッセイによって決定される、より好都合な異なるpHにおける最大比活性または広範囲の至適pH（改良されたpHプロフィール）をも意味する。最後に、これは該特性の任意の組み合わせをも意味する。
【００４１】
本発明における「相同」とは、修飾するフィターゼおよびアスペルギルス・ニガーのフィターゼの一次構造、好ましくは二次構造、最も好ましくは三次構造が最も適合することを意味する。どのようにして最大の適合性が得られるかは、本発明の実施例１に詳細に説明されている。図１は、アスペルギルス・ニガー（A. niger）のアミノ酸配列に基づき整列させた、アスペルギルス・フミガツス（A. fumigatus）およびアスペルギルス・テレウス（A. terreus）のフィターゼのアミノ酸配列に関する最大の適合性の例であり、また、アスペルギルス・ニガーの配列は他の配列、例えば上記の配列の位置を言及するときの参照として用いられる。さらに、Q27L変異を有するアスペルギルス・フミガツスの修飾フィターゼは、上記に定義されるように指定した27の位置（実際にはアスペルギルス・フミガツスのアミノ酸配列の位置23である）において、天然に生じるグルタミン（「Q」とは標準UPACの１文字のアミノ酸記号を表す）が、ロイシン（「L」）で置換されていることを意味する。本発明のすべての変異蛋白質は、プロテアーゼ抵抗性変異蛋白質であるか改良された活性特性を有する変異蛋白質であるかにかかわらず、このように表示されている。
【００４２】
さらに、本発明は、上述のフィターゼをコードするDNA配列を含むDNA配列、該DNA配列を含むベクター、好ましくは発現ベクター、該DNA配列またはベクターにより形質転換された宿主細胞、上述の宿主細胞が適当な培養条件下で培養され、該宿主細胞または培地から当技術分野で周知の方法によりフィターゼが単離される、本発明のフィターゼの調製方法、および本発明のフィターゼを含む食物または飼料組成物を提供する。
【００４３】
また、これに関連して、本発明は、本発明の特異的変異を少なくとも１つ有し、標準的条件で本発明の特定の修飾フィターゼのDNA配列にハイブリダイズするDNA配列、または遺伝コードの縮重のためにハイブリダイズはしないが、それがハイブリダイズしないDNA配列によってコードされているものと全く同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDNA配列、または該DNA配列の断片であり元のポリペプチドの活性特性を維持しているDNA配列を提供する。
【００４４】
これに関連して、ハイブリダイゼーションの「標準的条件」とは、当業者が特異的ハイブリダイゼーションシグナルを検出するために一般的に使用し、例えば[サムブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング（Molecular Cloning）」第2版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press） 1989、NY]に記載されているような条件、または当業者に周知で例えば[サムブルック（Sambrook）ら(s.a.)]に記載されている、好ましくはいわゆるストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび非ストリンジェントな洗浄条件、またはより好ましくはいわゆるストリンジェントなハイブリダイゼーションおよびストリンジェントな洗浄条件を意味する。
【００４５】
さらに、本発明は、特異的に記述された本発明のDNAに基づいて設計されたPCRプライマーを用いたいわゆるポリメラーゼ連鎖反応法（「PCR」）によって得られるDNA配列を提供する。このようにして得られたDNA配列は、その設計の由来するフィターゼと少なくとも同一の変異を有し、それと同等の活性特性を有するフィターゼをコードすると理解される。
【００４６】
ポリメラーゼ連鎖反応法（「PCR」）の原理は、例えば[ホワイト（White）ら、Trends in Genetics, 5,185〜189 (1989)]に概説されており、改良法は例えばイニス（Innis）らによって記載されている（PCRプロトコール：方法と応用の手引き（PCR Protocols: A guide to Methods and Applications）、Academic Press, Inc. (1990)）。
【００４７】
本発明のDNA配列は、当技術分野で周知の、フィターゼをコードするゲノムまたはcDNA配列を開始材料として構築できる（配列情報に関しては、例えば欧州特許第684 313号などの上述の参照、または例えばGenbank (Intelligenetics、米国カリフォルニア）、European Bioinformatics Institute (ヒンストンホール、英国ケンブリッジ）、NBRF (ジョージタウン大学メディカルセンター、米国ワシントンDC）、およびVecbase（ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、米国ウィスコンシン州マジソン）のような配列データベース、またはインビトロ変異誘発の方法の図に開示されている配列［例えばSambrookら、「分子クローニング（Molecular Cloning）」、Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York］を参照のこと。最初にハチンソン（Hurchinson）およびエジェル（Edgell） [J. Virol. 8, 181 (1971)]に概説された「部位特異的突然変異誘発法」は、所望のヌクレオチド置換を有する合成オリゴヌクレオチドを、変異を誘発する一本鎖DNA配列の標的領域にアニーリングさせることを含む［総説はSmith, Annu. Rev. Genet. 19, 423 (1985)、改良法はStanssenら、Nucl. Acid Res., 17, 4441〜4454 (1989)の参考文献2〜6を参照］。所定のDNA配列に変異を誘発する可能性で本発明の実施のためにやはり好ましいものは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用する変異誘発である。開始材料とするDNAは、当技術分野で周知であり、例えばサムブルック（Sambrook）ら(Molecular Cloning)に記載されている方法に従い各株から単離することができる。株に関する情報については、例えば欧州特許第684 313または任意の下記の寄託機関を参照のこと。アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）[ATCC 9142]、ミセリオフルトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）[ATCC 48102]、タラロミセス・サーモフィルス（Talaromyces thermophilus）[ATCC 20186]およびアスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）[ATCC 34625]は、ブダペスト条約の規定に従って1997年3月14日にアメリカンタイプカルチャー細胞コレクション（American Type Culture Cell Collection）に各々以下の受諾番号で寄託されている：ATCC 74337、ATCC 74340、ATCC 74338、およびATCC 74339。しかし、本発明に従って変異を誘発するフィターゼをコードするDNAは、例えば図１０〜１２に示されるように合成法により、および例えば欧州特許第747 483に記載されるような周知の方法を用いて既知のDNA配列に基づいて調製することもできる。
【００４８】
一旦本発明の完全なDNA配列が得られれば、これを当技術分野で周知の、例えば[サムブルック（Sambrook）ら(s.a.)]に記載されている方法によってベクターに組み込み、適当な宿主系において、コードされているポリペプチドを過剰発現させることができる。しかし、DNA配列自身を使って本発明の適当な宿主系を形質転換し、コードされるポリペプチドを過剰発現させることができることも当業者には周知である。適当な宿主系の例は、例えばアスペルギルス・ニガー（A. niger）[ATCC 9142]もしくはアスペルギルス・フィクウム（A. ficuum）[NRRL 3135]などのコウジカビ属（Aspergillus）または例えばトリコデルマ・レーゼイ（Trichoderma reesei）などのトリコデルマ（Trichoderma）のような菌類、または例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などの酵母菌、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）などのピヒア属、もしくは例えばハンゼヌラ・ポリモルファ（H. polymorpha） (DSM5215)などのハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）のような酵母である。微生物は例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection） (ATCC)、Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS)、またはDeutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSN)などの寄託機関、または雑誌Industrial Property [(1991) 1, 29〜40]に記載されている他の任意の寄託機関から入手できることは、当業者には周知である。使用できる細菌は、例えば大腸菌、例えば枯草菌のようなバチルス属(Bacillus)、または例えばストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）のようなストレプトミセス属(Streptomyces)である（例えばAnneおよびMallaert、FEMS Microbiol. Letters 114, 121(1993)参照）。使用できる大腸菌は、例えばM15［Villarejoら、J. Bacteriol. 120, 466〜474 (1974)にDZ291として記載］などのK12株、HB101 [ATCC 33694]、またはSG13009[Gottesmanら、J. Bacteriol. 148, 265〜273 (1981)]である。
【００４９】
菌類における発現に使用できるベクターは当技術分野で周知であり、例えば欧州特許第420 358号、またはクレン（Cullen）ら[Bio／Technology 5, 369〜376 (1987)]または[糸状菌の分子工業菌類学、システムおよび応用の手引き（Ward in Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi）, Marcel Dekker, New York(1991)]、アップシェル（Upshall）ら、[Bio／Technology 5, 1301〜1304 (1987)]、グウィン（Gwynne）ら[Bio／Technology 5, 71〜79 (1987)]、プンツ（Punt）ら[J. Biotechnol. 17, 19〜34 (1991)]、および酵母に関してはスリークニシュナ（Sreekrishna）ら[J. Basic Microbiol. 28, 265〜278 (1988), Biochemistry 28, 4117〜4125 (1989)]、ハイツゼルマン（Hitzemann）ら[Nature 293, 717〜722 (1981)]または欧州特許第183 070号、欧州特許第183 071号、欧州特許第248 227号、欧州特許第263 311号に記載されている。大腸菌における発現に使用できる適当なベクターは、例えば[Sambrookら(s.a.)]、またはフライヤー（Fiers） ら、Procd. 8th Int. Biotechnology Symposium [Soc. Franc. de Microbiol., Paris（Durandら編）、680〜697頁 (1988)]またはブヤード（Bujard）ら、Methods in Enzymology、ウ（Wu）およびグロスマン（Grossmann）編、Academic Press, Inc. Vol.155, 416〜433 (1987)およびステューバー（Stuber）ら、Immunological Methods、レフコビッツ（Lefkovits）およびペルニス（Pernis）編、Academic Press, Inc., Vol. IV, 121〜152 (1990)に記載されている。バチルス属における発現に使用できるベクターは当技術分野で周知であり、例えば欧州特許第405 370号、ヤンシュラ（Yansura）およびヘンナー（Henner）の[Procd. Natl. Acad. Sci. USA 81, 439 (1984)、Meth. Enzymol. 185, 199〜228 (1990)]、または欧州特許第207 459号などに記載されている。H. Polymorphaにおける発現に使用できるベクターは当技術分野で周知であり、例えば[ゲリセン（Gellissen）ら、Biotechnology 9, 291〜295 (1991)]などに記載されている。
【００５０】
そのようなベクターは、例えばプロモーターのような調節要素をすでに有しているか、または本発明のDNA配列をそのような要素を含むように操作することができる。使用できる適当なプロモーター要素は当技術分野で周知であり、例えば、 Trichoderma reeseiではcbh1プロモーター［Haarkiら、Biotechnology 7, 596〜600 (1989)］またはpki1プロモーター［Schindlerら、Gene 130, 271〜275 (1993)］、Aspergillus oryzaeではamyプロモーター［Christensenら、Abstr. 19th Lunteren Lectures on Molecular Genetics F23 (1987)、 Christensenら、Biotechnology 6, 1419〜1422 (1988)、Tadaら、Mol. Gen. Genet.229, 301 (1991)］、アスペルギルス・ニガーではglaAプロモーター［Cullenら、Bio／Technology 5, 369〜376 (1987)、Gwynneら、Bio／Technology 5, 713〜719 (1987)、糸状菌の分子工業菌類学、システムおよび応用の手引き（Ward in Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi）、 Marcel Dekker, New York, 83〜106 (1991)］、alcAプロモーター［Gwynneら、 Bio／Technology 5, 718〜719 (1987)］、suc1プロモーター［Boddyら、Curr. Genet. 24, 60〜66 (1993)］、aphAプロモーター［MacRaeら、Gene 71, 339〜348 (1988)、MacRaeら、Gene 132, 193〜198 (1993)］、tpiAプロモーター［McKnightら、Cell 46, 143〜147 (1986)、Upshallら、Bio／Technology 5, 1301〜1304 (1987)］、gpdAプロモーター［Puntら、Gene 69,49〜57 (1988)、Puntら、J. Biotechnol. 17, 19〜37 (1991)］、およびpkiAプロモーター［de Graaffら、Curr. Genet. 22, 21〜27 (1992)］である。酵母での発現に使用できる適当なプロモーター要素は当技術分野で周知であり、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）においてはpho5プロモーター［Vogelら、Mol. Cell. Biol., 2050〜2057 (1989); RudolfおよびHinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 1340〜1344 (1987)］またはgapプロモーター、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）においては例えばaox1プロモーター［Koutzら、Yeast 5, 167〜177(1989); Sreekrishnaら、J. Basic Microbiol. 28, 265〜278 (1988)］またはFMDプロモーター［Hollenbergら、欧州特許出願第0299108号］、またはH. polymorphaではMOXプロモーター［Ledeboerら、Nucleic Acids Res. 13, 3063〜3082 (1985)］である。
【００５１】
従って、本発明のDNA配列を含むベクター、好ましくは細菌または菌類または酵母の宿主において該DNA配列を発現させるためのベクター、およびかかる形質転換された細菌または菌類または酵母の宿主も本発明により提供される。
【００５２】
一旦DNA配列が適当な宿主細胞において適当な培地中で発現されると、コードされているフィターゼは、フィターゼが培地中に分泌される場合には培地から、該フィターゼが細胞内に存在する場合には宿主生物体から、蛋白質精製の技術分野で周知の方法により、または例えば欧州特許第420 358号に記載されているようにして単離することができる。したがって、上述のように形質転換された細菌または宿主細胞を適当な培養条件下で培養し、それからポリペプチドを回収することを特徴とする本発明のポリペプチド調製方法、および該方法によって生産されるポリペプチドまたは本発明のDNA配列にコードされるポリペプチドも、本発明により提供される。
【００５３】
本発明のフィターゼは、例えば[ペン（Pen）ら、Bio／Technology 11, 811〜814 (1994)]または欧州特許第449 375号に記載されている方法にしたがって、好ましくは例えば欧州特許第449376号に記載されているように、種子において植物中で発現させることもできる。
【００５４】
例えば、本発明のフィターゼをコードするDNA配列を、ブラシカ・ナプス（Brassica napus）由来の12S貯蔵蛋白質クルシフェリンをコードする遺伝子由来の調節配列の制御下に置くことができる。その後、この構築物をpMOG23（大腸菌K-12株DH5α中、オランダBaarnのCentraal Bureauvoor Schimmelculturesに受諾番号CBS 102.90として寄託）のようなバイナリーベクターにサブクローニングする。このベクターを無力化したTiプラスミドを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に導入する。この構築物を含む細菌細胞を、タバコまたはアブラナ由来の組織と共培養し、形質転換した植物細胞を抗生物質を含む栄養培地によって選択し、そのような培地上で再生して植物に分化するように誘導する。結果として得られる植物は、DNA構築物を含み発現する種を生産する。または、フィターゼをコードするDNA配列をカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sプロモーター由来の調節配列の制御下に置くことができる。その後、この構築物をバイナリーベクターにサブクローニングする。それから、このベクターを無力化したTiプラスミドを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスに導入する。この構築物を含む細菌細胞を、タバコまたはアブラナ由来の組織と共培養し、形質転換した植物細胞を抗生物質を含む栄養培地によって選択し、そのような培地上で再生して植物に分化するように誘導する。結果として得られる植物は、構成的にDNA構築物を含み発現する。
【００５５】
フィターゼを含む植物体または植物体の一部は、飼料組成物の調製に直接用いたり、または当技術分野で周知の方法によって植物体または植物器官から抽出したりできる。したがって、本発明のフィターゼを植物体または種子のような植物器官で生産する方法、該方法で生産されるフィターゼ、形質転換された植物体および種子自体のような植物器官も、本発明により提供される。
【００５６】
本発明のポリペプチドが一旦得られれば、農業において有用となる特性に関して解析することができ、本技術分野で周知の、例えばシモンズ（Simons）ら、［Br. J. Nutr. 64, 525-540 (1990)］、ショーナー（Schoner）ら［J. Anim. Physiol. a. Anim. Nutr. 66, 248-255 (1991)］、ボグト（Vogt）［Arch. Geflugelk. 56, 93-98 (1992)］、ジョングブロイド（Jongbloed）ら［J. Anim. Sci., 70,1159-1168 (1992)］、パーニー（Perney）ら［Poultry Sci. 72, 2106-2114 (1993)］、ファレル（Farrell）ら［J.Anim. Physiol. a Anim. Nutr. 69, 278-283 (1993)］、ブロツ（Broz）ら［Br. Poultry Sci. 35,273-280 (1994)］およびダンゲルホエフ（Dungelhoef）ら［Animal Feed Sci. Technol. 49, 1-10 (1994)］により記述されている任意のアッセイが使用できる。
【００５７】
一般に、本発明のポリペプチドは、フィチン酸のようなイノシトールポリリン酸をイノシトールと無機リン酸とに変換するための特定の応用分野に限定することなく、使用できる。
【００５８】
さらに本発明のポリペプチドは、組成物の成分が１つまたは複数の本発明のポリペプチドと混合された合成食料または飼料の調製方法に使用できる。したがって、本発明により、1つまたは複数の本発明のポリペプチドを含む合成食料または飼料も提供される。当業者は調製方法を熟知している。さらに該合成食料または飼料には、そうした目的に一般的に使用される当技術分野で公知の添加物または成分が含まれうる。
【００５９】
飼料中に含まれるフィチン酸をイノシトールおよび無機リン酸に変換するために有効な量の飼料組成物を動物に与えることを特徴とする、動物肥料中のフィチン酸量を低下させる方法も本発明により提供される。
【００６０】
【実施例】
実施例１．アスペルギルス・フミガツス（A. fumigatus）およびアスペルギルス・テレウス（A. terreus）cbs116.46フィターゼの相同性モデリング
アスペルギルス・フミガツス [ATCC 13073]（図1参照）およびアスペルギルス・テレウス cbs116.46フィターゼ（図１参照）のアミノ酸配列を、3次元構造がX線結晶解析により決定されているアスペルギルス・ニガー（A. niger）（フィクウム（ficuum））フィターゼ（図1参照）と比較した。結晶学データは図１６〜５７に示されている。
【００６１】
アスペルギルス・ニガー（フィクウム）フィターゼ、 アスペルギルス・フミガツスフィターゼおよびアスペルギルス・テレウス cbs116.46フィターゼのアミノ酸配列を、「PILEUP」プログラム（ウィスコンシンパッケージ用プログラムメニュー、バージョン８、1994年9月、ジェネティクスコンピュータグループ、53711米国ウィスコンシン州マジソン、サイエンスドライブ575）によって計算して整列させた。アスペルギルス・フミガツスフィターゼおよびアスペルギルス・テレウス cbs116.46フィターゼの3次元モデルは、アスペルギルス・ニガー（フィクウム）フィターゼの構造を鋳型として使用し、各々アスペルギルス・フミガツスおよびアスペルギルス・テレウス cbs116.46フィターゼの整列させたアミノ酸配列に従ってアスペルギルス・ニガー（フィクウム）フィターゼのアミノ酸を交換して構築した。モデルの構築とエネルギーの最適化は、Moloc (Gerber, P.およびMuller, K. (1995) Moloc molecular modeling software. J. Comput. Aided Mol. Des. 9, 251〜268)プログラムを用いて行った。新しい挿入／欠失および活性部位から離れたループの位置を除き、C-α位置は固定した。
【００６２】
外部ループでは、モデル化された構造と元の結晶構造との差はわずかしか観察されなかった。さらに、シュードモナス属(Pseudomonas)の細菌のフィターゼおよび、決定されている限りでアスペルギルス・ニガー（フィクウム）フィターゼ（Cosgrove, D.J. (1980) イノシトールリン酸-その化学、生化学および生理学：有機化学の研究、第4章（Inositol phosphates - their chemistry, biochemistry and physiology: studies in organic chemistry, chapter 4） Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam, Oxford, New York；図１）による、フィチン酸（ミオイノシトール-ヘキサキスホスフェート）の分解経路で主に発生する異なる基質を作製し、各フィターゼ構造の活性部位の穴に入れた。これらの基質はすべて、ヒスチジン酸ホスファターゼに関して提唱されている推測上の結合モードの方向(Van Etten, R.L. (1982) Human prostatic acid phosphatase: a histidine phosphatase. Ann. NY Acad. Sci. 390, 27〜50)に合わせた。容易に開裂できるリン酸基は、触媒作用に必須のHis 59の方向に向き、共有結合によりリン酸化酵素中間体を形成する。開裂後にAsp 339によりプロトン付加される基質のリン酸エステル結合は、プロトンの供与体の方向を向く。基質およびこれを取り巻く活性部位の残基の残りの構造部分の構造的緩和は、Molocプログラムを用いてエネルギーの最適化によって行った。
【００６３】
構造モデルに基づいて、活性部位の穴に向かう残基を同定した。これらの位置の半分以上（60％）がこれら３つのフィターゼ間で同一であり、ごく少数の位置のみが保存されていなかった（図１参照）。この観察結果は別の4つのフィターゼ配列(アスペルギルス・ニードランス（A. nidulans）、アスペルギルス・テレウス（A. terreus）9A1、タラロミセス・サーモフィルス（Talaromyces thermophilus）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）)にも当てはまった。
【００６４】
好都合な酵素-基質相互作用を含め、配列の整列と構造情報から得られた結果を組み合わせ、表１に示すような変異分析を行う位置を決定した。
【００６５】
実施例２．プラスミドpUC18-AfumgDNAおよびpUC18-AfumcDNAの構築
下記のすべてのアスペルギルス・フミガツス（A. fumigatus）変異蛋白質の基礎となる構築物である、プラスミドpUC18-AfumgDNAおよびpUC18-AfumcDNAは、以下のようにして構築した。
【００６６】
pUC18-AfumgDNA：「エキスパンド・ハイフィデリティPCRキット(Expand(登録商標) High Fidelity PCR Kit)」（Boehringer Mannheim社、ドイツ、マンハイム）を使用し、プライマー#39および#40（図１０〜１２に示すゲノム配列を元にデザインした）およびλFixIIベクター［Stratagene社、92037米国カリフォルニア州ルゴラ；カタログ番号946055］のアスペルギルス・フミガツス（NIHストック5233）ゲノムライブラリー由来のアスペルギルス・フミガツス [ATCC13073]ゲノムDNAを用いたPCRにより、 アスペルギルス・フミガツスのフィターゼ遺伝子のゲノムDNA配列を得た。
プライマー#39：
プライマー#40
反応液には、各プライマーが10 pmolずつおよび鋳型DNAが200 ng含まれていた。以下のサイクル値で35ラウンドの増幅を行なった：95℃、１分／56℃、１分／72℃、９０秒。PCR増幅したアスペルギルス・フミガツス変異蛋白質遺伝子は、ATG開始コドンのところに、プライマー#39によって導入された新しいBspHI部位を有し、その結果2番目のアミノ酸がバリンからイソロイシンに変化した。さらに、遺伝子のTGA終止コドンの下流に、プライマー#40によってEcoRV部位が作られた。
【００６７】
その後、「シュアクローンキット(sure clone Kit)」（Boehringer Mannheim社 s.a. )を用いて製造元の推奨する方法により、PCR断片（約1450 bp）をpUC18のSmaI部位にクローニングした。この結果得られたプラスミドをpUC18-AfumgDNAと命名した。
【００６８】
pUC18-AfumcDNA：このプラスミドはアスペルギルス・フミガツスフィターゼ遺伝子のイントロン（図１０〜１２の文字の小さな間隙）を持たず、図６３に概説される方法で構築した。簡単に述べると、プライマーFum28およびFum11を用いてエキソン2の5’末端をPCR（以下参照）により増幅し、NcoIおよびEagI（プライマーFum28により導入された新しい制限酵素切断部位）により消化し、プライマーFum26およびFum27を含みエキソン1をコードするリンカーと共に、pUC18-AfumgDNAのXbaIおよびNcoI部位に連結し、これによってプラスミドpUC18-AfumcDNAを得た。
【００６９】
アスペルギルス・フミガツス（A. fumigatus）フィターゼのエキソン2の5’末端を得るためのPCR反応：
2 μl 鋳型：pUC18-AfumgDNA (20 ng)
1 μl dNTP混合物（Boehringer Mannheim社s.a.）
5 μl 10x 緩衝液
1 μl Taqポリメラーゼ（Boehringer Mannheim社s.a.）
1.9 μl Fum11 (=10 pmol)
2 μl Fum28 (=10 pmol)
37.1 μl H2O
以下の温度設定で合計35サイクル実行した：95℃で30 秒／56℃で30秒／72℃で45秒。増幅された断片（約330 bp）を等量のフェノール／クロロフォルム(1:1)で1回抽出した。回収された水相に、0.1倍量の3 M酢酸ナトリウム、pH 4.8および2.5倍量のエタノールを添加した。反応液を12000 gで10分間遠心し、沈殿を20μlのH2Oに再懸濁した。その後、精製された断片をNcoIおよびEagIで消化し、以下のように処理した。
【００７０】
実施例３．アスペルギルス・ニガー（A. niger）における発現のためのアスペルギルス・フミガツス（A. fumigatus）フィターゼ変異蛋白質の構築
アスペルギルス・ニガーで発現するためのすべての変異蛋白質を構築するために、プラスミドpUC18-AfumgDNAを部位特異的突然変異誘発法の鋳型として使用した。変異はStratagene社（米国カリフォルニア州ラホヤ）の「クイックエクスチェンジ部位特異的突然変異誘発キット(quick exchange(登録商標) site-directed mutagenesis kit)」を使用し、製造元のプロトコールに従って、対応するプライマー（図６４〜６７）を用いて導入した。すべての変異は表1AおよびBにまとめられており、T1〜T7およびN1〜N6はそれぞれ、変異蛋白質およびその位置で置換されたアミノ酸の変異を示す。例えばT5は二重変異を有する変異蛋白質を示し、27の位置にQの代わりにL、274の位置にQの代わりにLを有する。変異を導入するために使用したプライマーセット(A〜H）は図６４〜６６に示されている。新しく導入されたアミノ酸は太字で示されており、下付き文字はアスペルギルス・ニガーのアミノ酸配列の番号付けを用いた、成熟したアスペルギルス・フミガツス酵素中の位置を示す。図６８および６９は単独の変異(T1〜T4; N1〜N3)または複数の変異(T5〜T7; N4〜N6)を有する変異蛋白質をコードするプラスミドpgT1〜pgT7およびpgN1〜pgN6の構築方法の概要を示す。所望の変異を有するクローンは、当技術分野で周知のDNA配列分析によって同定した。変異フィターゼは遺伝子の全配列決定によって確認した。
【００７１】
実施例４．サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）における発現のためのアスペルギルス・フミガツス（A. fumigatus）フィターゼの変異蛋白質の作製
各々変異蛋白質T1〜T7およびN1〜N6をコードする、サッカロミセス・セレビシエにおける発現用プラスミドpcT1〜pcT7（図７０）およびpcN1〜pcN6（図７３）の構築は、基本的に実施例3に概説されるようにして行った。変異を導入するための基礎となる構築物としてpUC18-AfumgDNAを使用する代わりに、プラスミドpUC18-AfumcDNAを使用した（図６３）。
【００７２】
変異蛋白質N27、G27、V27、A27、I27およびT27をコードするプラスミドpcDNA-N27、-G27、-V27、-A27、-I27および-T27は以下のようにして構築した。
【００７３】
実施例３に説明されるようにして、プライマーセットI（図６５）を用いて、部位特異的突然変異誘発法によりプラスミドpcT1にAvrIIのサイレント制限酵素切断部位を導入した。その後、アスペルギルス・フミガツスフィターゼ遺伝子断片AvrII／XhoIを所望の変異を有するリンカー断片で置換した（図７２）。各リンカー断片は合成ポリヌクレオチドの各々の対（図６７；センスおよびアンチセンス鎖；各90 ng）を9 μlの蒸留水中で70℃で3分間アニーリングして作製した。
【００７４】
アスペルギルス・フミガツス Q27L-S66Dの二重変異およびアスペルギルス・フミガツス Q27L-S140Y-D141Gの三重変異をコードするプラスミドpcT1-S66DおよびpcT1-S140Y-D141Gの構築は、基本的に実施例3に記載されるようにして実行した。Q27Lをコードする変異を有するプラスミドpcT1は、対応するプライマーセットJおよびKと共に、部位特異的突然変異誘発法の鋳型として使用した（図６４〜６７）。
【００７５】
すべての変異は遺伝子全体のDNA配列分析により確認した。
【００７６】
実施例５．アスペルギルス・ニガー（A. niger）における発現
上記アスペルギルス・フミガツス野生型フィターゼおよび変異蛋白質をコードする遺伝子は、プラスミドpgDNAT1〜pgDNAT7およびpgDNAN1〜pgDNAN6からBspHIおよびEcoRVによって単離し、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼプロモーター(glaA)の下流のNcoI部位およびアスペルギルス・ニードランストリプトファンCターミネーター(trpC)の上流のEcoRV部位（Mullaney, E.J., J.E. Hamer, K.A. Roberti, M.M. Yelton, and W.E. Timberlake. 1985. Primary structure of the trpC gene from Asperigillus nidulans. Mol. Gen.Gent. 199:37〜45）に連結した。この結果得られる発現プラスミドは、さらに選択マーカーとしてアカパンカビ（Neurospora crassa）のオロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyr4)を有していた。図７４は変異蛋白質T1をコードする遺伝子を有する、そうしたプラスミドの例を示す（Van den Hondel, C.A.M.J.J., P.J. Punt, and R.F.M van Gorcom. 1991、糸状菌における異種遺伝子発現（Heterologous gene expression in filamentous fungi）、続・菌類の遺伝子操作（More gene manipulations in fungi）396〜428頁より、Bennett, J.W. and Lasure, L.L.（編）Academic Press Inc., San Diego, CA）。上述の基本的な発現プラスミドは、欧州特許第684 313号の実施例9に説明されるpGLACベクターに基本的に対応する。アスペルギルス・ニガーの形質転換と変異蛋白質の発現は、欧州特許第684 313号に記載されるようにして行った。
【００７７】
上清をAmicon 8400セル（PM30メンブレン）の限外濾過およびウルトラフリー15(ultrafree-15) 遠心フィルター装置（Biomax-30K、Millipore社）によって濃縮した。
【００７８】
濃縮物（通常1.5〜5 ml）を1.5 mlに分割し、10 mM酢酸ナトリウムpH 5.0を溶出緩衝液としてファーストデソルティング(Fast Desalting) HR 10／10カラム（Pharmacia Biotech社）で脱塩した。脱塩したアスペルギルス・フミガツス試料を1.7 ml ポロス(Poros) HS／M陽イオン交換クロマトグラフィーカラム(PerSeptive Biosystems社、米国マサチューセッツ州フラミンガム）に直接かけた。アスペルギルス・テレウス cbs 116.46 [CBS 220.95]フィターゼは、1.7 ml ポロス(Poros) HQ／M陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに直接かけた。両方とも、フィターゼは塩化ナトリウム勾配によって純粋な形で溶出された。
【００７９】
実施例６．サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）における発現
アスペルギルス・フミガツス野生型フィターゼおよび上述の異なる変異蛋白質（図７０〜７３）をコードするイントロンのない遺伝子を、各プラスミドpUC18-AfumcDNA、pcDNAT1〜pcDNAT7およびpcDNAN1〜pcDNAN6からEcoRIおよびEcoRVによって単離し、プラスミドpYES2（Invitrogen社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）のXhoI平滑末端とEcoRI部位の間、またはJanesら(Janes, M., B. Meyhack, W. Zimmermann and A. Hinnen. 1990. The influence of GAP promoter variants on hirudine production, average plasmid copy number and cell growth in Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet. 18: 97〜103)に記述されたようにして、短くしたGAPFL（グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーターおよびPHO5ターミネーターの間にサブクローニングした。例えばINVSc1（Invitrogen社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）などのサッカロミセス・セレビシエ株の形質転換は、Hinnenら(Hinnen, A., J.B. Hicks and G.R. Fink. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929〜1933)に従って行った。GAPFLプロモーターの制御下にフィターゼ遺伝子を有するシングルコロニーを選んで5 ml選択培地（SD-ウラシル）（Shermanら、1986）中で30℃で1日間激しく振盪(250 rpm)して培養した。この予備培養を500 mlのYPD培地（Sheman, J.P., Finck, G.R.およびHicks, J.B. (1986)、酵母遺伝学における実験室コースマニュアル（Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics）、Cold Spring Harbor University Press）に添加し、同じ条件で培養した。4日後に細胞培養液を遠心し（7000 rpm、GS3ローター、15分、5℃）、上清を採集した。GAL1プロモーター（米国カリフォルニア州サンディエゴInvitrogen社製のプラスミドpYES2）の誘導は、製造元の説明書どおりに実行した。変異蛋白質の精製は、実施例5(s.a.)に記載されるとおりである。
【００８０】
実施例７．フィターゼ活性と基質特異性の測定
フィターゼ活性は、0.5％フィチン酸（〜5 mM）、200 mM酢酸ナトリウムpH 5.0を含むアッセイ反応液で測定した。37℃で15分間インキュベートした後、等量の15%トリクロロ酢酸を加えて反応を停止させた。遊離したリン酸イオンは100 μlのアッセイ反応液に900 μl H2Oおよび1 mlの0.6 M H2SO4、2%アスコルビン酸、0.5%モリブデン酸アンモニウムを混合して定量した。リン酸カリウムの標準溶液を基準として使用した。
【００８１】
至適pH曲線の場合には、精製した酵素を10 mM酢酸ナトリウムpH 5.0で希釈した。分注した希釈蛋白質を一連の異なる緩衝液：0.4 Mグリシン／HCl、pH 2.5; 0.4 M酢酸／NaOH、pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5; 0.4 Mイミダゾール／HCl、pH 6.0、6.5; 0.4 M Tris／HCl、pH 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0中の等量の１％フィチン酸(〜10 mM)と混合してインキュベーションを開始した。対照実験では、混合段階によってpHはごくわずかしか変化しないことが示された。インキュベーションは上述のように37℃で15分間行った。
【００８２】
野生型および変異体のアスペルギルス・フミガツスフィターゼの基質特異性を決定するために、アッセイ反応液中のフィチン酸を5 mM濃度の各リン酸化合物で置き換えた。活性試験は上述のように行った。
【００８３】
蛋白質濃度は、既知の蛋白質配列からDNA*ソフトウェア（DNASTAR社、米国ウィスコンシン州マジソン）によって計算した理論的な吸光度を用いて、280 nmにおけるODから計算した。280 nmにおける吸光度1.0 ODは、アスペルギルス・フミガツスフィターゼ0.94 mg／mlおよびアスペルギルス・テレウス cbs116.46フィターゼ0.85 mg／mlに相当する。
【００８４】
アスペルギルス・フミガツス変異体T1 (Q27L)、T5 (Q27L、Q274L)およびT6 (Q27L、Q274L、G277D)のpHプロフィールは、野生型アスペルギルス・フミガツスフィターゼと比較して、劇的に変化していた（図2参照）。すべての変異体は同等なpHプロフィールを示した。アスペルギルス・フミガツスの野生型フィターゼと比較して、pH 5.0において変異蛋白質の比活性が上昇していることを表2に示す。酵素活性はpH 5.0において標準的なアッセイ条件下で測定した。いくつかの個々の測定値（n: アッセイ数）を平均した。
【００８５】
アスペルギルス・フミガツスフィターゼ変異体Q27AのpHプロフィールは、pH範囲ほぼ全体にわたって、アスペルギルス・フミガツス野生型フィターゼのpHプロフィールと類似している（図７５）。野生型フィターゼの比活性がpH 4.0未満のpHで低下しているのに対し、フィターゼ変異体Q27Aの比活性はpH2.9までほぼ一定である。
【００８６】
単一アミノ酸の変更Q27L、Q27I、Q27VまたはQ27Tは、pH範囲全体にわたり、特にpH 5.0と7.5の間で、比活性を著しく上昇させた（図７５）。最大値はpH 6.5で観察される。さらに、変異Q27Tは低いpH (pH 3.0〜5.0)においてフィチン酸に対する最高の比活性を誘導した。
【００８７】
単一変異Q27GまたはQ27Nによっても、pH 2.5と7.0の間で比活性が上昇し、最大値はpH 6.0で見られる（図７５）。pH 3.5未満では比活性は低下する。
【００８８】
すべての単一変異は、アスペルギルス・フミガツス野生型フィターゼの基質特異性と同等の、広い基質特異性を示す（図７６）。変異体の中には、例えばQ27T変異体のp-ニトロフェニルリン酸およびATPに対する活性、またはQ27G変異体のホスホエノールピルビン酸に対する活性のように、選択された基質に対して他の変異体よりも有意に高い比活性を示すものもあった。
【００８９】
図７７に示すように、変異Q27LとS66Dとの組み合わせ、またはS140YおよびD141Gとの組み合わせは、pHプロフィールを低いpHの方に移動させた。単一変異A27Lによって得られた最大比活性は、アミノ酸の置換を追加することでさらに上昇する。
【００９０】
図3に示すように、アスペルギルス・フミガツスフィターゼ変異体T1 (Q27L)は、三重変異体T6 (Q27L、Q274L、G277D)と比較して、基質特異性には差がなかった。
【００９１】
N2を除き、変異蛋白質N1〜6のpHプロフィールは、野生型フィターゼと比較して有意な差を示す（図５９）。変異蛋白質N4のpHプロフィールは低いpH方向に拡大しているが、変異蛋白質N3〜N6のプロフィールは低いpH方向に移動している。変異蛋白質N5とN6は、すでにpH 3.0で最大活性に達する。
【００９２】
変異蛋白質N1〜N6では、ほぼすべての場合において、フィチン酸を除き、試験されたすべての基質に対して比活性がかなり低下している（図５８）。フィチン酸に対する比活性は、野生型フィターゼに比較して変わりがないが、変異蛋白質N3およびN6の活性はあきらかに高い傾向がある（図５８）。
【００９３】
【表１】
A) アスペルギルス・テレウス（A. terreusu）cbs116.46フィターゼ方向への変異
B) アスペルギルス・ニガー（A. niger）（フィクウム（ficuum））フィターゼ方向への変異
【００９４】
【表２】
【００９５】
【表３】
pH 5.0における標準的アッセイ条件下での比活性。平均の標準偏差は10％。
【００９６】
実施例８．
改変された特性を有するフィターゼを入手する別の方法として、および特定の種の中で天然に見られるフィターゼ特性の差異をよりよく理解するために、アスペルギルス・フミガツスフィターゼの天然に生じる変異体を分析した。フィターゼ遺伝子をアスペルギルス・フミガツスの６つの異なる単離株から入手した。2つのアスペルギルス・フミガツス単離株（ATCC 26934およびATCC 34625）由来のフィターゼのアミノ酸配列は、野生型アスペルギルス・フミガツスフィターゼATCC 13073のアミノ酸配列と違いを示さなかった。他の3つの単離株では1つまたは2つのアミノ酸の置換が示されたが、いずれも活性部位には直接影響を与えていなかった。酵素特性は、これらの置換の影響を受けていなかった（データは示さず）。アスペルギルス・フミガツス (ATCC 32239)単離株のフィターゼは、もとの野生型アスペルギルス・フミガツスフィターゼ(ATCC 13073)と比較して、シグナル配列において13箇所の位置において、蛋白質の成熟した部分で51箇所の位置において違いを示した。これらの置換のうちには、活性部位の穴の可変アミノ酸に影響を与えるものもある。この結果、フィチン酸を基質とした比活性の上昇（47 U/mg、標準酵素アッセイ）と、pH7（図８０）以上における酵素活性の損失が観察された。また、この場合、フィチン酸に対する比活性は、他の基質に対する比活性と比較して上昇していた（図８１）。
【００９７】
実施例９．
アスペルギルス・フミガツス [ATCC 13073]フィターゼS130N単独変異、R129L-S130N二重変異およびアスペルギルス・ニードランスフィターゼK167G-R168Q二重変異をコードするプラスミドpc-S130N、pc-R129L-S130N、pc-K167G-R168Qの構築は、基本的に実施例3に記載されるようにして実行した。プラスミドpUC18-AfumcDNAは、対応するプライマーセットL、MおよびN（図６６；図８２）を用いた部位特異的突然変異誘発法の鋳型として用いた。
【００９８】
すべての変異は遺伝子全体のDNA配列分析によって確認した。
【００９９】
実施例１０．
アスペルギルス・ニガー中で発現し濃縮培養上清として4℃で保存すると、アスペルギルス・フミガツス、アスペルギルス・ニードランスのフィターゼは蛋白質分解を受ける傾向を示した。断片のN末端の配列決定により、切断は各々アミノ酸S130-V131およびK167-R168またはR168-A169の間で起こったことが示唆された。アスペルギルス・ニガー・フィターゼの立体構造と比較すると、すべての切断部位は表面に露出したループ構造内にあり、したがってプロテアーゼが近付ける部位であることが分かった。
【０１００】
アスペルギルス・フミガツスフィターゼ（S130N、R129-S130N）およびアスペルギルス・ニードランスフィターゼ（K167G-R168Q）のプロテアーゼ感受性部位に、部位特異的突然変異を導入すると、蛋白質分解に対する感受性がかなり低下した変異蛋白質が生成した。
【０１０１】
アスペルギルス・ニガーにおける発現とは対称的に、ハンゼヌラ・ポリモルファにおいてフィターゼが発現れたときには、蛋白質分解は観察されなかった。
【０１０２】
【発明の効果】
本発明により、改良された活性特性を有する修飾フィターゼの生産方法が提供された。また、本発明により、上記の方法によって得られる修飾フィターゼが提供された。さらに、本発明により、上述のフィターゼをコードするDNA配列を含むDNA配列、該DNA配列を含むベクター、好ましくは発現ベクター、該DNA配列またはベクターにより形質転換された宿主細胞、上述の宿主細胞が適当な培養条件下で培養され、該宿主細胞または培地から当技術分野で周知の方法によりフィターゼが単離される、本発明のフィターゼの調製方法、および本発明のフィターゼを含む食物または飼料組成物が提供された。
【図面の簡単な説明】
【図１】 アスペルギルス・ニガー（フィクウム）、アスペルギルス・テレウス cbs116.46およびアスペルギルス・フミガツス [ATCC 13073]のフィターゼの一次配列を整列させた図である。星印は活性部位内の同一のアミノ酸残基を示し、長方形は活性部位内の異なる残基を示す。
【図２】 至適pH曲線を示す図である。野生型および変異体のアスペルギルス・フミガツスフィターゼの比活性を、インキュベーションのpHに対して表す。黒四角はアスペルギルス・フミガツス野生型のフィターゼ；白三角はアスペルギルス・フミガツス Q27L変異体；黒丸はアスペルギルス・フミガツス Q27L, Q274L変異体；白四角はアスペルギルス・フミガツスQ27L, Q274L, G277D変異体を表す。
【図３】 野生型と変異体のアスペルギルス・フミガツスフィターゼの基質特異性を示す図である。(A)野生型；(B) Q27L単一変異体；(C) Q27L, Q274L, G277D三重変異体。以下の基質を使用した：(1)フィチン酸；(2) p-ニトロフェニルリン酸；(3)フルクトース-1,6-ビスリン酸；(4)フルクトース-6-リン酸；
(5)グルコース-6-リン酸；(6)リボース-5-リン酸；(7)α-グリセロリン酸；(8)β-グリセロリン酸；(9) 3-ホスホグリセリン酸；(10)ホスホエノールピルビン酸；(11) AMP；(12) ADP；(13) ATP。
【図４】 アスペルギルス・ニードランス（A. nidulans）フィターゼの全コード配列（１〜７００）およびコードされるアミノ酸配列（１〜１６３）を示す図である。
【図５】 アスペルギルス・ニードランス（A. nidulans）フィターゼの全コード配列（７０１〜１３５０）およびコードされるアミノ酸配列（１６４〜３８０）を示す図である。
【図６】 アスペルギルス・ニードランス（A. nidulans）フィターゼの全コード配列（１３５１〜１９３１）およびコードされるアミノ酸配列（３８１〜４６３）を示す図である。
【図７】 タラロミセス・サーモフィルス（Talaromyces thermophilus）フィターゼの全コード配列（１〜７５０）およびコードされるアミノ酸配列（１〜１３６）を示す図である。
【図８】 タラロミセス・サーモフィルス（Talaromyces thermophilus）フィターゼの全コード配列（７５１〜１４００）およびコードされるアミノ酸配列（１３７〜３５３）を示す図である。
【図９】 タラロミセス・サーモフィルス（Talaromyces thermophilus）フィターゼの全コード配列（１４０１〜１８４５）およびコードされるアミノ酸配列（３５４〜４６６）を示す図である。
【図１０】 アスペルギルス・フミガツス（A. fumigatus）[ATCC 13073]フィターゼの全コード配列（１〜６００）およびコードされるアミノ酸配列（１〜１６７）を示す図である。
【図１１】 アスペルギルス・フミガツス（A. fumigatus）[ATCC 13073]フィターゼの全コード配列（６０１〜１２５０）およびコードされるアミノ酸配列（１６８〜３８４）を示す図である。
【図１２】 アスペルギルス・フミガツス（A. fumigatus）[ATCC 13073]フィターゼの全コード配列（１２５１〜１５７１）およびコードされるアミノ酸配列（３８５〜４６５）を示す図である。
【図１３】 アスペルギルス・テレウス（A. terreus）CBS 116.46フィターゼの全コード配列（１〜６５０）およびコードされるアミノ酸配列（１〜１７４）を示す図である。
【図１４】 アスペルギルス・テレウス（A. terreus）CBS 116.46フィターゼの全コード配列（６５１〜１２５０）およびコードされるアミノ酸配列（１７５〜３７４）を示す図である。
【図１５】 アスペルギルス・テレウス（A. terreus）CBS 116.46フィターゼの全コード配列（１２５１〜１５６７）およびコードされるアミノ酸配列（３７５〜４６６）を示す図である。
【図１６】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１〜９９）を示す図である。
【図１７】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１００〜１８４）を示す図である。
【図１８】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１８５〜２６９）を示す図である。
【図１９】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（２７０〜３５４）を示す図である。
【図２０】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（３５５〜４３９）を示す図である。
【図２１】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（４４０〜５２４）を示す図である。
【図２２】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（５２５〜６０９）を示す図である。
【図２３】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（６１０〜６９４）を示す図である。
【図２４】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（６９５〜７７９）を示す図である。
【図２５】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（７８０〜８６４）を示す図である。
【図２６】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（８６５〜９４９）を示す図である。
【図２７】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（９５０〜１０３４）を示す図である。
【図２８】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１０３５〜１１１９）を示す図である。
【図２９】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１１２０〜１２０４）を示す図である。
【図３０】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１２０５〜１２８９）を示す図である。
【図３１】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１２９０〜１３７４）を示す図である。
【図３２】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１３７５〜１４５９）を示す図である。
【図３３】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１４６０〜１５４４）を示す図である。
【図３４】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１５４５〜１６２９）を示す図である。
【図３５】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１６３０〜１７１４）を示す図である。
【図３６】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１７１５〜１７９９）を示す図である。
【図３７】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１８００〜１８８４）を示す図である。
【図３８】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１８８５〜１９６９）を示す図である。
【図３９】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１９７０〜２０５４）を示す図である。
【図４０】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（２０５５〜２１３９）を示す図である。
【図４１】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（２１４０〜２２２４）を示す図である。
【図４２】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（２２２５〜２３０９）を示す図である。
【図４３】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（２３１０〜２３９４）を示す図である。
【図４４】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（２３９５〜２４７９）を示す図である。
【図４５】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（２４８０〜２５６４）を示す図である。
【図４６】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（２５６５〜２６４９）を示す図である。
【図４７】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（２６５０〜２７３４）を示す図である。
【図４８】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（２７３５〜２８１９）を示す図である。
【図４９】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（２８２０〜２９０４）を示す図である。
【図５０】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（２９０５〜２９８９）を示す図である。
【図５１】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（２９９０〜３０７４）を示す図である。
【図５２】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（３０７５〜３１５９）を示す図である。
【図５３】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（３１６０〜３２４４）を示す図である。
【図５４】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（３２４５〜３３２９）を示す図である。
【図５５】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（３３３０〜３４１４）を示す図である。
【図５６】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（３４１５〜３４９９）を示す図である。
【図５７】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（３５００〜３５８９）を示す図である。
【図５８】 野生型および変異体のアスペルギルス・フミガツス（A. fumigatus）(N1〜N6)フィターゼの基質特異性を示す図である。基質1〜13 は図3と同じ。
【図５９】 変異体のアスペルギルス・フミガツス (N1〜N6)フィターゼの至適pH曲線を示す図である。すべての活性の値は標準化している（最大活性=1.0）。
【図６０】 アスペルギルス・ニガー (アスペルギルス・フィクウム; NRRL 3135)フィターゼの3次元折り畳みの立体図である。活性部位を丸で示し、触媒作用に必須のアミノ酸残基Arg 58およびHis 59は球と棒で表してある。この図は「MOLSCRIPT」プログラム［Kraulis, P.J., J. Appl. Cryst. 24, 946〜950 (1991)］および「RASTER3D」プログラム［Merritt, E. A.およびMurphy, M.E.P., Acta Cryst.,869〜873 (1994)］を用いて作製した。
【図６１】 (a)と同じ方法を用いた位相学的スケッチを示す図である。5つのジスルフィド結合は、黒いジグザグ線で示し、関与するシステイン残基の配列番号も示してある。β鎖は配列番号A: 48〜58、B: 134〜138、C: 173〜177、D: 332〜337、E: 383〜391、およびF: 398〜403で定義している。αヘリックスは配列番号a: 66〜82、b:88〜95、c:107〜123、d:141〜159、e:193〜197、f:200〜210、g:213〜223、h:231〜246、i:257〜261、j:264〜281、k:290〜305、l:339〜348、m:423〜429、およびn:439〜443と定義してある。β鎖AのC末端の星印は、触媒作用に必須のアミノ酸残基Arg 58およびHis 59の位置を示す。
【図６２】 アスペルギルス・フィクウム (ATCC 13073)のフィターゼの活性部位の立体図で、基質のフィチン酸の推測上の結合様式を示す図である。このモデルでは、結合した結晶水分子が除去され、基質と相互作用するためにLys 68の側鎖のねじれ角がわずかに調節されている以外、蛋白質の原子の位置は固定されている。すべての保存されたアミノ酸残基Arg 58、His 59、Arg 62、Arg 142、His 338およびAsp 339は点線で示されるように、フィチン酸の容易に開裂できる3リン酸基と水素結合を作る。太い点線で示すように、His 59は容易に開裂できるリンに求核性攻撃を行うために好都合な位置にあり、Asp 339は去って行く基にプロトン付加を行う位置にある。
【図６３】 部位特異的突然変異誘発法のための基本プラスミドpUC18-AfumgDNAおよびpUC18-AfumcDNAの構築を示す図である。
【図６４】 部位特異的突然変異誘発法に使用したプライマーセットA〜E。
【図６５】 部位特異的突然変異誘発法に使用したプライマーセットF〜K。
【図６６】 部位特異的突然変異誘発法に使用したプライマーセットL〜N。
【図６７】 部位特異的突然変異誘発法に使用したプライマーセットO〜Tを示す図である。
【図６８】 プラスミドpgDNAT1〜pgDNAT7の構築を示す図である。
【図６９】 プラスミドpgDNAN1〜pgDNAN6の構築を示す図である。
【図７０】 プラスミドpcT1〜pcT7の構築を示す図である。
【図７１】 プラスミドpcT1-AvrII、pcT1-S66DおよびpcT1-S140Y-D141Gの構築を示す図である。
【図７２】 プラスミドpcDNA-N27、-T27、-I27、-V27、-A27、-G27の構築を示す図である。
【図７３】 プラスミドpcN1〜pcN6の構築を示す図である。
【図７４】 アスペルギルス・ニガーにおける変異蛋白質T1の発現用プラスミドpAfum-T1を示す図である。
【図７５】 至適pH曲線を示す図である。野生型および変異体のアスペルギルス・フミガツスフィターゼの比活性を、インキュベーションのpHに対して表す。白三角：アスペルギルス・フミガツス [ATCC 13073]の野生型フィターゼ；白菱形： アスペルギルス・フミガツス Q27Gフィターゼ；黒四角： アスペルギルス・フミガツス Q27Nフィターゼ；黒三角：アスペルギルス・フミガツス Q27Vフィターゼ；白四角： アスペルギルス・フミガツス Q27Aフィターゼ；黒丸： アスペルギルス・フミガツス Q27Iフィターゼ；白丸： アスペルギルス・フミガツス Q27Tフィターゼ；破線： アスペルギルス・フミガツス Q27Lフィターゼ。
【図７６】 野生型と変異体アスペルギルス・フミガツス[ATCC 13073]のフィターゼの基質特異性を示す図である。使用した基質1〜13は図3と同じ。試験された13の基質に対する異なるフィターゼの比活性は、すべて次の順に記載されている（左から右）：アスペルギルス・フミガツス野生型フィターゼ、 アスペルギルス・フミガツス Q27Nフィターゼ、 アスペルギルス・フミガツス Q27Tフィターゼ、 アスペルギルス・フミガツス Q27Lフィターゼ、 アスペルギルス・フミガツス Q27Iフィターゼ、 アスペルギルス・フミガツス Q27Vフィターゼ、 アスペルギルス・フミガツス Q27Aフィターゼ、 アスペルギルス・フミガツス Q27Gフィターゼ。
【図７７】 至適pH曲線を示す図である。野生型および変異体のアスペルギルス・フミガツス [ATCC 13073]フィターゼの比活性を、インキュベーションのpHに対して表す。黒菱形：アスペルギルス・フミガツス野生型フィターゼ；黒四角： アスペルギルス・フミガツス Q27Lフィターゼ；白丸： アスペルギルス・フミガツス Q27L-S66D二重変異体；黒三角： アスペルギルス・フミガツス Q27L-S140Y-D141G三重変異体。
【図７８】 アスペルギルス・フミガツス [ATCC 13073]の異なる単離株におけるフィターゼの天然の変動を示す図である。予測される蛋白質配列をアスペルギルス・フミガツス ATCC 13073株由来のフィターゼの蛋白質配列（１〜３２０）と比較して示す。#13073と異なるアミノ酸のみを示す。
【図７９】 アスペルギルス・フミガツス [ATCC 13073]の異なる単離株におけるフィターゼの天然の変動を示す図である。予測される蛋白質配列をアスペルギルス・フミガツス ATCC 13073株由来のフィターゼの蛋白質配列（３２１〜４７０）と比較して示す。#13073と異なるアミノ酸のみを示す。
【図８０】 ２つの異なるアスペルギルス・フミガツス野性株から単離されたフィターゼのpHに依存する比活性を示す図である。白四角：野生株ATCC 13073；黒丸：株ATCC 32239。
【図８１】 ２つの異なるアスペルギルス・フミガツス野性株から単離されたフィターゼの基質特異性を示す図である。黒：野生株ATCC 13073；白：株ATCC 32239。
【図８２】 プラスミドpc-S130N、pc-R129L-S130N、pc-K167G-R168Qの構築を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、フィチン酸（ミオイノシトールヘキサキスホスフェート）に作用してこれをミオイノシトールと無機リン酸とに加水分解する酵素で、有益な飼料添加物として知られているフィターゼ（ミオイノシトールヘキサキスホスフェートホスホヒドロラーゼ；EC 3.1.3.8）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
フィターゼは、1907年に最初に米ぬかで記述され[Suzukiら、Bull. Coll. Agr. Tokio Imp. Univ. 7, 495 (1907)]、1911年にコウジカビ属(Aspergillus)のフィターゼが記述された[DoxおよびGolden, J. Biol. Chem. 10, 183〜186 (1911)]。フィターゼは小麦のふすま、植物の種子、動物の腸、および微生物でも見つかっている[HowsenおよびDavix, Enzyme Microb. Technol. 5, 377〜382 (1983)、Lambrechtsら、Biotech. Lett. 14, 61〜66(1992)、ShiehおよびWare, Appl. Microbiol. 16, 1348〜1351 (1968)]。
【０００３】
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger） (フィクウムficuum)由来のフィターゼのクローニングと発現は、フォン・ハーチングスベルツ（Van Hartingsveldt）らにより[Gene, 127, 87-94 (1993)]および欧州特許出願第(EP)420 358号において、アスペルギルス・ニガー・アワモリ変種（Aspergillus niger var. awamori）のフィターゼのクローニングと発現はピディントン（Piddington）らにより[Gene 133, 55〜62 (1993)]において報告されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
特性が改良されたフィターゼのクローニング、発現、および精製は、欧州特許第684 313号に開示されている。しかし、特に活性特性に関してまだフィターゼをさらに改良する必要性がある。従って、本発明は、改良された活性特性を有する修飾フィターゼの生産方法を提供することを課題とする。また、本発明は、上記の方法によって得られる修飾フィターゼを提供することを課題とする。さらに、本発明は、上述のフィターゼをコードするDNA配列を含むDNA配列、該DNA配列を含むベクター、好ましくは発現ベクター、該DNA配列またはベクターにより形質転換された宿主細胞、上述の宿主細胞が適当な培養条件下で培養され、該宿主細胞または培地から当技術分野で周知の方法によりフィターゼが単離される、本発明のフィターゼの調製方法、および本発明のフィターゼを含む食物または飼料組成物を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の修飾フィターゼの生産方法においては、
（１）a) アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のフィターゼの３次元構造を基にして、修飾するフィターゼ、および選択的に、修飾するフィターゼの活性特性よりも好都合な活性特性を有する別のフィターゼの３次元構造を、コンピュータでモデル化する段階、
b) 修飾するフィターゼと、より好都合な活性特性を有するフィターゼとの活性部位の構造を比較し、両方の活性部位において異なるアミノ酸残基を同定する段階、
c) 両方の活性部位が異なる少なくとも１つのアミノ酸をコードするヌクレオチドを変化させることにより、修飾フィターゼをコードするDNA配列を構築する段階、
d) 適当な宿主細胞において発現する能力を有するベクターに該DNA配列を組み込む段階、
e) c)のDNA配列またはd)のベクターにより適当な宿主細胞を形質転換し、該宿主細胞を適当な培養条件下で培養し、当技術分野で公知の方法により、宿主細胞または培地から修飾フィターゼを単離する段階を実行することを特徴とする、改良された活性特性を有する修飾フィターゼの生産方法であることを特徴とする。
【０００６】
また、本発明の方法においては、
（２）修飾するフィターゼが真核生物由来である、（１）記載の方法であることを特徴とする。
【０００７】
また、本発明の方法においては、
（３）修飾するフィターゼが菌類由来である、（１）または（２）記載の方法であることを特徴とする。
【０００８】
また、本発明の方法においては、
（４）修飾するフィターゼがコウジカビ属(Aspergillus)由来である、（１）から（３）のいずれか一項に記載の方法であることを特徴とする。
【０００９】
また、本発明の方法においては、
（５）修飾するフィターゼが、アスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）由来のフィターゼである、（１）から（４）のいずれか一項に記載の方法であることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明の方法においては、
（６）より好都合な活性特性を有するフィターゼが真核生物由来である、（１）から（５）のいずれか一項に記載の方法であることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明の方法においては、
（７）より好都合な活性特性を有するフィターゼが菌類由来である、（１）から（６）のいずれか一項に記載の方法であることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明の方法においては、（８）より好都合な活性特性を有するフィターゼがコウジカビ属(Aspergillus)由来である、（１）から（７）のいずれか一項に記載の方法であることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明の方法においては、
（９）より好都合な活性特性を有するフィターゼがアスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）由来のフィターゼである、（１）から（８）のいずれか一項に記載の方法であることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明の方法においては、
（１０）修飾するフィターゼがアスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）のフィターゼであり、より好都合な活性特性を有するフィターゼがアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のフィターゼである、（１）から（９）のいずれか一項に記載の方法であることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明の方法においては、
（１１）修飾するフィターゼがアスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）のフィターゼであり、より好都合な活性特性を有するフィターゼがアスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）のフィターゼである、（１）から（９）のいずれか一項に記載の方法であることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明の修飾フィターゼにおいては、
（１２）（１）から（１１）のいずれか一項に記載の方法により得られた、または得ることの可能な修飾フィターゼであることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明のフィターゼにおいては、
（１３）活性特性が非修飾フィターゼの活性特性よりも好都合であるように修飾されたフィターゼであることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明のフィターゼにおいては、
（１４）非修飾フィターゼのアミノ酸配列が、１つまたは複数のアミノ酸の欠失、置換、および／または付加により変化していることを特徴とする、（１３）記載のフィターゼであることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明のフィターゼにおいては、
（１５）アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のフィターゼのアミノ酸配列の以下の位置：27、66、71、103、140、141、188、205、234、235、238、274、277、282、340および／または424、好ましくは27、66、140、205、274、277、282および／または340の１つに相同である少なくとも１つの位置に変化が生じている、（１３）または（１４）のいずれか一項に記載のフィターゼであることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明のフィターゼにおいては、
（１６）コウジカビ属(Aspergillus)、好ましくはアスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）のフィターゼである、（１３）から（１５）のいずれか一項に記載のフィターゼであることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明のフィターゼにおいては、
（１７）位置27に変化が生じている、または少なくとも位置27に変化が生じている、（１５）または（１６）のいずれか一項に記載のフィターゼであることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明のフィターゼにおいては、
（１８）位置27のアミノ酸が、
a) Ala、Val、Leu、Ile；または
b) Thrの群の１つから選択されるアミノ酸で置換されている、（１７）記載のフィターゼであることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明のフィターゼにおいては、
（１９）位置27に加えて、位置66でも変化が生じている、（１７）または（１８）記載のフィターゼであることを特徴とする。
【００２４】
また、本発明のフィターゼにおいては、
（２０）位置27に加えて、位置140でも変化が生じている、（１７）または（１８）記載のフィターゼであることを特徴とする。
【００２５】
また、本発明のフィターゼにおいては、
（２１）以下の変異：Q27L、Q27N、Q27T、Q27I、Q27V、Q27A、Q27G、S66D、S140Y、D141G、A205E、Q274L、G277D、G277K、Y282Hおよび／またはN340Sのうちの少なくとも１つを特徴とする、（１３）から（２０）のいずれか一項に記載のフィターゼであることを特徴とする。
【００２６】
また、本発明のDNA配列においては、
（２２）（１２）から（２１）のいずれか一項に記載のフィターゼをコードするDNA配列を含むDNA配列であることを特徴とする。
【００２７】
また、本発明のベクターにおいては、
（２３）（２２）記載のDNA配列を含むベクターであることを特徴とする。
【００２８】
また、本発明のベクターにおいては、
（２４）発現ベクターである、（２３）記載のベクターであることを特徴とする。
【００２９】
また、本発明の宿主細胞においては、
（２５）（２２）記載のDNA配列または（２３）もしくは（２４）記載のベクターにより形質転換された宿主細胞であることを特徴とする。
【００３０】
また、本発明の調製方法においては、
（２６）（２５）記載の宿主細胞が適当な培養条件下で培養され、該宿主細胞または培地から当技術分野で公知の方法によりフィターゼが単離される、（１２）から（２１）のいずれか一項に記載のフィターゼを調製する方法であることを特徴とする。
【００３１】
また、本発明の組成物においては、
（２７）（１２）から（２１）のいずれか一項に記載のフィターゼを含む、食料または飼料組成物であることを特徴とする。
【００３２】
【発明の実施の形態】
本発明は、
i) 以下の段階を実施することを特徴とする、改良された活性特性を有する修飾フィターゼの生産方法を提供する。
【００３３】
a) アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）（フィクウム（ficuum））のフィターゼの3次元構造を基にして、修飾するフィターゼ、および選択的に、修飾するフィターゼの活性特性よりも好都合な活性特性を有する別のフィターゼの3次元構造を、コンピュータでモデル化する段階；
b) 修飾するフィターゼと、より好都合な活性特性を有する別のフィターゼとの活性部位の構造を比較し、両方の活性部位において異なるアミノ酸残基を同定する段階；
c) 両方の活性部位で異なる少なくとも1つのアミノ酸をコードするヌクレオチドを変化させることにより、修飾フィターゼをコードするDNA配列を構築する段階；
d) 適当な宿主細胞において発現する能力を有するベクターに該DNA配列を組み込む段階；
e) c)のDNA配列またはd)のベクターにより適当な宿主細胞を形質転換し、該宿主細胞を適当な増殖条件下で増殖させ、当技術分野で公知の方法により、宿主細胞または培地から修飾フィターゼを単離する段階。
【００３４】
また、本発明は、
ii) i)に説明される方法であって、修飾されるフィターゼが真核生物由来、好ましくは菌類、さらに好ましくは例えばアスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus） のようなコウジカビ属(Aspergillus)由来である方法、または
iii) i)もしくはii)に説明される方法であって、より好都合な活性特性を有するフィターゼが真核生物由来、好ましくは菌類、さらに好ましくは例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）またはアスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus） (アスペルギルス・テレウス cbs 116.46または9A1）のようなコウジカビ属由来である方法、または
iv) i)、ii)、もしくはiii)に説明される方法であって、修飾されるフィターゼがアスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）のフィターゼであり、より好都合な活性特性を有するフィターゼがアスペルギルス・テレウス（Asperigillus terreus）のフィターゼもしくはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のフィターゼである方法、を提供する。
【００３５】
これに関連して、改良された特性を有するフィターゼを生産する別の可能性は、例えばアスペルギルス・フィクウム（Aspergillus Ficuum）のような、同じ生物であるが天然に見つかり任意の既知の寄託機関によって寄託されている異なる株から、フィターゼを単離することである。そのアミノ酸配列は、例えば欧州特許出願第(EP) 684 313号に記載されているような方法によって、対応するDNA配列をクローニングすることにより決定できる。一旦そのような配列が決定されれば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のフィターゼの3次元構造を基にしてそのモデルを作製することができ、両方の配列の活性部位を比較してそのフィターゼが改良された活性特性（実施例8参照）を有するか否かを調べるか、または両方の活性部位の配列を直接比較して本出願に記載されるアッセイにより上昇および／または改良された活性を有するか否かを試験することができる。
【００３６】
さらに、本発明は、上記の方法によって得られる修飾フィターゼを提供する。一般的に、非修飾フィターゼの活性特性よりも好都合な活性特性を有するように修飾されたフィターゼ、具体的には非修飾フィターゼのアミノ酸配列が1つまたは複数の欠失、置換、および／または付加により変更されたフィターゼ、さらに具体的にはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）（図1参照）のフィターゼのアミノ酸配列の以下の位置：27、66、71、103、140、141、188、205、234、235、238、274、277、282、340および／または424、好ましくは27、66、140、205、274、277、282および／または340のうちの１つに相同な少なくとも１つの位置において改変されたフィターゼ、またさらに具体的には真核生物、好ましくは菌類、さらに好ましくはコウジカビ属、最も好ましくはアスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）由来であるフィターゼを提供する。
【００３７】
さらに、本発明は、位置27に変化が生じている、または少なくとも位置27に変化が生じているフィターゼ、好ましくは位置27のアミノ酸が
a) Ala、Val、Leu、Ile；または
b) Thrまたは
c) Asn；
の群のうちの１つから選択されるアミノ酸によって置換されているフィターゼ、ならびに位置27に加えて位置66でもさらに変化が生じているフィターゼ、または位置27に加えて位置140および／もしくは位置274および／もしくは277でも変化が生じているフィターゼを提供する。
【００３８】
また、本発明は、以下の変異：Q27L、Q27N、Q27T、Q27I、Q27V、Q27A、Q27G、S66D、S140Y、D141G、A205E、Q274L、G277D、G277K、Y282Hおよび／またはN340Sのうちの少なくとも1つを特徴とする上述のフィターゼを提供する。
【００３９】
さらに、本発明は、菌類、好ましくはコウジカビ属、最も好ましくはアスペルギルス・ニガー（A. niger）（フィクウム（ficuum））由来のプロテアーゼによる分解に対して抵抗性であるフィターゼ変異蛋白質を提供する。そのような変異蛋白質は、少なくとも以下の位置（アスペルギルス・ニガーのアミノ酸配列の相同位置を指す）、すなわち、好ましくはアスペルギルス・フミガツス（A. fumitatus）のフィターゼの位置130または129と130、または好ましくはアスペルギルス・ニードランス（A. nidulans）のフィターゼのアミノ酸配列の167、168のうちの1つにおいて、野生型に存在するアミノ酸が、プロテアーゼ感受性を変化させることが知られている別のアミノ酸で置き換えられていることを特徴とする。例えば、アスペルギルス・フミガツス（A. fumigatus）の場合には位置130で「S」から「N」、および位置129で「R」から「L」に、アスペルギルス・ニードランス（A. nidulans）の場合には位置167で「K」から「G」、および位置168でRからQに置換されている。該位置は、改良された活性特性を提供する位置と組み合わせることもできる。
【００４０】
これに関連して、「改良された活性特性」とは、非変異フィターゼと比較した変異フィターゼの活性におけるあらゆる種類の改良を意味する。これは、例えば、欧州特許第684 313号などのようにフィターゼの活性を測定するために当技術分野で周知のアッセイまたは本出願の実施例に記載されるアッセイにおけるより高い比活性、好ましくは少なくとも2倍またはより好ましくは少なくとも3〜4倍高い比活性を意味する。さらに、これは当技術分野で周知のアッセイまたは例えば本発明の特定の実施例に記載されるアッセイによって決定される、異なる基質特異性を意味する。これは、当技術分野で周知のアッセイ、または例えば本発明の実施例に記載されるアッセイによって決定される、より好都合な異なるpHにおける最大比活性または広範囲の至適pH（改良されたpHプロフィール）をも意味する。最後に、これは該特性の任意の組み合わせをも意味する。
【００４１】
本発明における「相同」とは、修飾するフィターゼおよびアスペルギルス・ニガーのフィターゼの一次構造、好ましくは二次構造、最も好ましくは三次構造が最も適合することを意味する。どのようにして最大の適合性が得られるかは、本発明の実施例１に詳細に説明されている。図１は、アスペルギルス・ニガー（A. niger）のアミノ酸配列に基づき整列させた、アスペルギルス・フミガツス（A. fumigatus）およびアスペルギルス・テレウス（A. terreus）のフィターゼのアミノ酸配列に関する最大の適合性の例であり、また、アスペルギルス・ニガーの配列は他の配列、例えば上記の配列の位置を言及するときの参照として用いられる。さらに、Q27L変異を有するアスペルギルス・フミガツスの修飾フィターゼは、上記に定義されるように指定した27の位置（実際にはアスペルギルス・フミガツスのアミノ酸配列の位置23である）において、天然に生じるグルタミン（「Q」とは標準UPACの１文字のアミノ酸記号を表す）が、ロイシン（「L」）で置換されていることを意味する。本発明のすべての変異蛋白質は、プロテアーゼ抵抗性変異蛋白質であるか改良された活性特性を有する変異蛋白質であるかにかかわらず、このように表示されている。
【００４２】
さらに、本発明は、上述のフィターゼをコードするDNA配列を含むDNA配列、該DNA配列を含むベクター、好ましくは発現ベクター、該DNA配列またはベクターにより形質転換された宿主細胞、上述の宿主細胞が適当な培養条件下で培養され、該宿主細胞または培地から当技術分野で周知の方法によりフィターゼが単離される、本発明のフィターゼの調製方法、および本発明のフィターゼを含む食物または飼料組成物を提供する。
【００４３】
また、これに関連して、本発明は、本発明の特異的変異を少なくとも１つ有し、標準的条件で本発明の特定の修飾フィターゼのDNA配列にハイブリダイズするDNA配列、または遺伝コードの縮重のためにハイブリダイズはしないが、それがハイブリダイズしないDNA配列によってコードされているものと全く同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDNA配列、または該DNA配列の断片であり元のポリペプチドの活性特性を維持しているDNA配列を提供する。
【００４４】
これに関連して、ハイブリダイゼーションの「標準的条件」とは、当業者が特異的ハイブリダイゼーションシグナルを検出するために一般的に使用し、例えば[サムブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング（Molecular Cloning）」第2版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press） 1989、NY]に記載されているような条件、または当業者に周知で例えば[サムブルック（Sambrook）ら(s.a.)]に記載されている、好ましくはいわゆるストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび非ストリンジェントな洗浄条件、またはより好ましくはいわゆるストリンジェントなハイブリダイゼーションおよびストリンジェントな洗浄条件を意味する。
【００４５】
さらに、本発明は、特異的に記述された本発明のDNAに基づいて設計されたPCRプライマーを用いたいわゆるポリメラーゼ連鎖反応法（「PCR」）によって得られるDNA配列を提供する。このようにして得られたDNA配列は、その設計の由来するフィターゼと少なくとも同一の変異を有し、それと同等の活性特性を有するフィターゼをコードすると理解される。
【００４６】
ポリメラーゼ連鎖反応法（「PCR」）の原理は、例えば[ホワイト（White）ら、Trends in Genetics, 5,185〜189 (1989)]に概説されており、改良法は例えばイニス（Innis）らによって記載されている（PCRプロトコール：方法と応用の手引き（PCR Protocols: A guide to Methods and Applications）、Academic Press, Inc. (1990)）。
【００４７】
本発明のDNA配列は、当技術分野で周知の、フィターゼをコードするゲノムまたはcDNA配列を開始材料として構築できる（配列情報に関しては、例えば欧州特許第684 313号などの上述の参照、または例えばGenbank (Intelligenetics、米国カリフォルニア）、European Bioinformatics Institute (ヒンストンホール、英国ケンブリッジ）、NBRF (ジョージタウン大学メディカルセンター、米国ワシントンDC）、およびVecbase（ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、米国ウィスコンシン州マジソン）のような配列データベース、またはインビトロ変異誘発の方法の図に開示されている配列［例えばSambrookら、「分子クローニング（Molecular Cloning）」、Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York］を参照のこと。最初にハチンソン（Hurchinson）およびエジェル（Edgell） [J. Virol. 8, 181 (1971)]に概説された「部位特異的突然変異誘発法」は、所望のヌクレオチド置換を有する合成オリゴヌクレオチドを、変異を誘発する一本鎖DNA配列の標的領域にアニーリングさせることを含む［総説はSmith, Annu. Rev. Genet. 19, 423 (1985)、改良法はStanssenら、Nucl. Acid Res., 17, 4441〜4454 (1989)の参考文献2〜6を参照］。所定のDNA配列に変異を誘発する可能性で本発明の実施のためにやはり好ましいものは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用する変異誘発である。開始材料とするDNAは、当技術分野で周知であり、例えばサムブルック（Sambrook）ら(Molecular Cloning)に記載されている方法に従い各株から単離することができる。株に関する情報については、例えば欧州特許第684 313または任意の下記の寄託機関を参照のこと。アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）[ATCC 9142]、ミセリオフルトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）[ATCC 48102]、タラロミセス・サーモフィルス（Talaromyces thermophilus）[ATCC 20186]およびアスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）[ATCC 34625]は、ブダペスト条約の規定に従って1997年3月14日にアメリカンタイプカルチャー細胞コレクション（American Type Culture Cell Collection）に各々以下の受諾番号で寄託されている：ATCC 74337、ATCC 74340、ATCC 74338、およびATCC 74339。しかし、本発明に従って変異を誘発するフィターゼをコードするDNAは、例えば図１０〜１２に示されるように合成法により、および例えば欧州特許第747 483に記載されるような周知の方法を用いて既知のDNA配列に基づいて調製することもできる。
【００４８】
一旦本発明の完全なDNA配列が得られれば、これを当技術分野で周知の、例えば[サムブルック（Sambrook）ら(s.a.)]に記載されている方法によってベクターに組み込み、適当な宿主系において、コードされているポリペプチドを過剰発現させることができる。しかし、DNA配列自身を使って本発明の適当な宿主系を形質転換し、コードされるポリペプチドを過剰発現させることができることも当業者には周知である。適当な宿主系の例は、例えばアスペルギルス・ニガー（A. niger）[ATCC 9142]もしくはアスペルギルス・フィクウム（A. ficuum）[NRRL 3135]などのコウジカビ属（Aspergillus）または例えばトリコデルマ・レーゼイ（Trichoderma reesei）などのトリコデルマ（Trichoderma）のような菌類、または例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などの酵母菌、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）などのピヒア属、もしくは例えばハンゼヌラ・ポリモルファ（H. polymorpha） (DSM5215)などのハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）のような酵母である。微生物は例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection） (ATCC)、Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS)、またはDeutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSN)などの寄託機関、または雑誌Industrial Property [(1991) 1, 29〜40]に記載されている他の任意の寄託機関から入手できることは、当業者には周知である。使用できる細菌は、例えば大腸菌、例えば枯草菌のようなバチルス属(Bacillus)、または例えばストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）のようなストレプトミセス属(Streptomyces)である（例えばAnneおよびMallaert、FEMS Microbiol. Letters 114, 121(1993)参照）。使用できる大腸菌は、例えばM15［Villarejoら、J. Bacteriol. 120, 466〜474 (1974)にDZ291として記載］などのK12株、HB101 [ATCC 33694]、またはSG13009[Gottesmanら、J. Bacteriol. 148, 265〜273 (1981)]である。
【００４９】
菌類における発現に使用できるベクターは当技術分野で周知であり、例えば欧州特許第420 358号、またはクレン（Cullen）ら[Bio／Technology 5, 369〜376 (1987)]または[糸状菌の分子工業菌類学、システムおよび応用の手引き（Ward in Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi）, Marcel Dekker, New York(1991)]、アップシェル（Upshall）ら、[Bio／Technology 5, 1301〜1304 (1987)]、グウィン（Gwynne）ら[Bio／Technology 5, 71〜79 (1987)]、プンツ（Punt）ら[J. Biotechnol. 17, 19〜34 (1991)]、および酵母に関してはスリークニシュナ（Sreekrishna）ら[J. Basic Microbiol. 28, 265〜278 (1988), Biochemistry 28, 4117〜4125 (1989)]、ハイツゼルマン（Hitzemann）ら[Nature 293, 717〜722 (1981)]または欧州特許第183 070号、欧州特許第183 071号、欧州特許第248 227号、欧州特許第263 311号に記載されている。大腸菌における発現に使用できる適当なベクターは、例えば[Sambrookら(s.a.)]、またはフライヤー（Fiers） ら、Procd. 8th Int. Biotechnology Symposium [Soc. Franc. de Microbiol., Paris（Durandら編）、680〜697頁 (1988)]またはブヤード（Bujard）ら、Methods in Enzymology、ウ（Wu）およびグロスマン（Grossmann）編、Academic Press, Inc. Vol.155, 416〜433 (1987)およびステューバー（Stuber）ら、Immunological Methods、レフコビッツ（Lefkovits）およびペルニス（Pernis）編、Academic Press, Inc., Vol. IV, 121〜152 (1990)に記載されている。バチルス属における発現に使用できるベクターは当技術分野で周知であり、例えば欧州特許第405 370号、ヤンシュラ（Yansura）およびヘンナー（Henner）の[Procd. Natl. Acad. Sci. USA 81, 439 (1984)、Meth. Enzymol. 185, 199〜228 (1990)]、または欧州特許第207 459号などに記載されている。H. Polymorphaにおける発現に使用できるベクターは当技術分野で周知であり、例えば[ゲリセン（Gellissen）ら、Biotechnology 9, 291〜295 (1991)]などに記載されている。
【００５０】
そのようなベクターは、例えばプロモーターのような調節要素をすでに有しているか、または本発明のDNA配列をそのような要素を含むように操作することができる。使用できる適当なプロモーター要素は当技術分野で周知であり、例えば、 Trichoderma reeseiではcbh1プロモーター［Haarkiら、Biotechnology 7, 596〜600 (1989)］またはpki1プロモーター［Schindlerら、Gene 130, 271〜275 (1993)］、Aspergillus oryzaeではamyプロモーター［Christensenら、Abstr. 19th Lunteren Lectures on Molecular Genetics F23 (1987)、 Christensenら、Biotechnology 6, 1419〜1422 (1988)、Tadaら、Mol. Gen. Genet.229, 301 (1991)］、アスペルギルス・ニガーではglaAプロモーター［Cullenら、Bio／Technology 5, 369〜376 (1987)、Gwynneら、Bio／Technology 5, 713〜719 (1987)、糸状菌の分子工業菌類学、システムおよび応用の手引き（Ward in Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi）、 Marcel Dekker, New York, 83〜106 (1991)］、alcAプロモーター［Gwynneら、 Bio／Technology 5, 718〜719 (1987)］、suc1プロモーター［Boddyら、Curr. Genet. 24, 60〜66 (1993)］、aphAプロモーター［MacRaeら、Gene 71, 339〜348 (1988)、MacRaeら、Gene 132, 193〜198 (1993)］、tpiAプロモーター［McKnightら、Cell 46, 143〜147 (1986)、Upshallら、Bio／Technology 5, 1301〜1304 (1987)］、gpdAプロモーター［Puntら、Gene 69,49〜57 (1988)、Puntら、J. Biotechnol. 17, 19〜37 (1991)］、およびpkiAプロモーター［de Graaffら、Curr. Genet. 22, 21〜27 (1992)］である。酵母での発現に使用できる適当なプロモーター要素は当技術分野で周知であり、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）においてはpho5プロモーター［Vogelら、Mol. Cell. Biol., 2050〜2057 (1989); RudolfおよびHinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 1340〜1344 (1987)］またはgapプロモーター、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）においては例えばaox1プロモーター［Koutzら、Yeast 5, 167〜177(1989); Sreekrishnaら、J. Basic Microbiol. 28, 265〜278 (1988)］またはFMDプロモーター［Hollenbergら、欧州特許出願第0299108号］、またはH. polymorphaではMOXプロモーター［Ledeboerら、Nucleic Acids Res. 13, 3063〜3082 (1985)］である。
【００５１】
従って、本発明のDNA配列を含むベクター、好ましくは細菌または菌類または酵母の宿主において該DNA配列を発現させるためのベクター、およびかかる形質転換された細菌または菌類または酵母の宿主も本発明により提供される。
【００５２】
一旦DNA配列が適当な宿主細胞において適当な培地中で発現されると、コードされているフィターゼは、フィターゼが培地中に分泌される場合には培地から、該フィターゼが細胞内に存在する場合には宿主生物体から、蛋白質精製の技術分野で周知の方法により、または例えば欧州特許第420 358号に記載されているようにして単離することができる。したがって、上述のように形質転換された細菌または宿主細胞を適当な培養条件下で培養し、それからポリペプチドを回収することを特徴とする本発明のポリペプチド調製方法、および該方法によって生産されるポリペプチドまたは本発明のDNA配列にコードされるポリペプチドも、本発明により提供される。
【００５３】
本発明のフィターゼは、例えば[ペン（Pen）ら、Bio／Technology 11, 811〜814 (1994)]または欧州特許第449 375号に記載されている方法にしたがって、好ましくは例えば欧州特許第449376号に記載されているように、種子において植物中で発現させることもできる。
【００５４】
例えば、本発明のフィターゼをコードするDNA配列を、ブラシカ・ナプス（Brassica napus）由来の12S貯蔵蛋白質クルシフェリンをコードする遺伝子由来の調節配列の制御下に置くことができる。その後、この構築物をpMOG23（大腸菌K-12株DH5α中、オランダBaarnのCentraal Bureauvoor Schimmelculturesに受諾番号CBS 102.90として寄託）のようなバイナリーベクターにサブクローニングする。このベクターを無力化したTiプラスミドを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に導入する。この構築物を含む細菌細胞を、タバコまたはアブラナ由来の組織と共培養し、形質転換した植物細胞を抗生物質を含む栄養培地によって選択し、そのような培地上で再生して植物に分化するように誘導する。結果として得られる植物は、DNA構築物を含み発現する種を生産する。または、フィターゼをコードするDNA配列をカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sプロモーター由来の調節配列の制御下に置くことができる。その後、この構築物をバイナリーベクターにサブクローニングする。それから、このベクターを無力化したTiプラスミドを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスに導入する。この構築物を含む細菌細胞を、タバコまたはアブラナ由来の組織と共培養し、形質転換した植物細胞を抗生物質を含む栄養培地によって選択し、そのような培地上で再生して植物に分化するように誘導する。結果として得られる植物は、構成的にDNA構築物を含み発現する。
【００５５】
フィターゼを含む植物体または植物体の一部は、飼料組成物の調製に直接用いたり、または当技術分野で周知の方法によって植物体または植物器官から抽出したりできる。したがって、本発明のフィターゼを植物体または種子のような植物器官で生産する方法、該方法で生産されるフィターゼ、形質転換された植物体および種子自体のような植物器官も、本発明により提供される。
【００５６】
本発明のポリペプチドが一旦得られれば、農業において有用となる特性に関して解析することができ、本技術分野で周知の、例えばシモンズ（Simons）ら、［Br. J. Nutr. 64, 525-540 (1990)］、ショーナー（Schoner）ら［J. Anim. Physiol. a. Anim. Nutr. 66, 248-255 (1991)］、ボグト（Vogt）［Arch. Geflugelk. 56, 93-98 (1992)］、ジョングブロイド（Jongbloed）ら［J. Anim. Sci., 70,1159-1168 (1992)］、パーニー（Perney）ら［Poultry Sci. 72, 2106-2114 (1993)］、ファレル（Farrell）ら［J.Anim. Physiol. a Anim. Nutr. 69, 278-283 (1993)］、ブロツ（Broz）ら［Br. Poultry Sci. 35,273-280 (1994)］およびダンゲルホエフ（Dungelhoef）ら［Animal Feed Sci. Technol. 49, 1-10 (1994)］により記述されている任意のアッセイが使用できる。
【００５７】
一般に、本発明のポリペプチドは、フィチン酸のようなイノシトールポリリン酸をイノシトールと無機リン酸とに変換するための特定の応用分野に限定することなく、使用できる。
【００５８】
さらに本発明のポリペプチドは、組成物の成分が１つまたは複数の本発明のポリペプチドと混合された合成食料または飼料の調製方法に使用できる。したがって、本発明により、1つまたは複数の本発明のポリペプチドを含む合成食料または飼料も提供される。当業者は調製方法を熟知している。さらに該合成食料または飼料には、そうした目的に一般的に使用される当技術分野で公知の添加物または成分が含まれうる。
【００５９】
飼料中に含まれるフィチン酸をイノシトールおよび無機リン酸に変換するために有効な量の飼料組成物を動物に与えることを特徴とする、動物肥料中のフィチン酸量を低下させる方法も本発明により提供される。
【００６０】
【実施例】
実施例１．アスペルギルス・フミガツス（A. fumigatus）およびアスペルギルス・テレウス（A. terreus）cbs116.46フィターゼの相同性モデリング
アスペルギルス・フミガツス [ATCC 13073]（図1参照）およびアスペルギルス・テレウス cbs116.46フィターゼ（図１参照）のアミノ酸配列を、3次元構造がX線結晶解析により決定されているアスペルギルス・ニガー（A. niger）（フィクウム（ficuum））フィターゼ（図1参照）と比較した。結晶学データは図１６〜５７に示されている。
【００６１】
アスペルギルス・ニガー（フィクウム）フィターゼ、 アスペルギルス・フミガツスフィターゼおよびアスペルギルス・テレウス cbs116.46フィターゼのアミノ酸配列を、「PILEUP」プログラム（ウィスコンシンパッケージ用プログラムメニュー、バージョン８、1994年9月、ジェネティクスコンピュータグループ、53711米国ウィスコンシン州マジソン、サイエンスドライブ575）によって計算して整列させた。アスペルギルス・フミガツスフィターゼおよびアスペルギルス・テレウス cbs116.46フィターゼの3次元モデルは、アスペルギルス・ニガー（フィクウム）フィターゼの構造を鋳型として使用し、各々アスペルギルス・フミガツスおよびアスペルギルス・テレウス cbs116.46フィターゼの整列させたアミノ酸配列に従ってアスペルギルス・ニガー（フィクウム）フィターゼのアミノ酸を交換して構築した。モデルの構築とエネルギーの最適化は、Moloc (Gerber, P.およびMuller, K. (1995) Moloc molecular modeling software. J. Comput. Aided Mol. Des. 9, 251〜268)プログラムを用いて行った。新しい挿入／欠失および活性部位から離れたループの位置を除き、C-α位置は固定した。
【００６２】
外部ループでは、モデル化された構造と元の結晶構造との差はわずかしか観察されなかった。さらに、シュードモナス属(Pseudomonas)の細菌のフィターゼおよび、決定されている限りでアスペルギルス・ニガー（フィクウム）フィターゼ（Cosgrove, D.J. (1980) イノシトールリン酸-その化学、生化学および生理学：有機化学の研究、第4章（Inositol phosphates - their chemistry, biochemistry and physiology: studies in organic chemistry, chapter 4） Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam, Oxford, New York；図１）による、フィチン酸（ミオイノシトール-ヘキサキスホスフェート）の分解経路で主に発生する異なる基質を作製し、各フィターゼ構造の活性部位の穴に入れた。これらの基質はすべて、ヒスチジン酸ホスファターゼに関して提唱されている推測上の結合モードの方向(Van Etten, R.L. (1982) Human prostatic acid phosphatase: a histidine phosphatase. Ann. NY Acad. Sci. 390, 27〜50)に合わせた。容易に開裂できるリン酸基は、触媒作用に必須のHis 59の方向に向き、共有結合によりリン酸化酵素中間体を形成する。開裂後にAsp 339によりプロトン付加される基質のリン酸エステル結合は、プロトンの供与体の方向を向く。基質およびこれを取り巻く活性部位の残基の残りの構造部分の構造的緩和は、Molocプログラムを用いてエネルギーの最適化によって行った。
【００６３】
構造モデルに基づいて、活性部位の穴に向かう残基を同定した。これらの位置の半分以上（60％）がこれら３つのフィターゼ間で同一であり、ごく少数の位置のみが保存されていなかった（図１参照）。この観察結果は別の4つのフィターゼ配列(アスペルギルス・ニードランス（A. nidulans）、アスペルギルス・テレウス（A. terreus）9A1、タラロミセス・サーモフィルス（Talaromyces thermophilus）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）)にも当てはまった。
【００６４】
好都合な酵素-基質相互作用を含め、配列の整列と構造情報から得られた結果を組み合わせ、表１に示すような変異分析を行う位置を決定した。
【００６５】
実施例２．プラスミドpUC18-AfumgDNAおよびpUC18-AfumcDNAの構築
下記のすべてのアスペルギルス・フミガツス（A. fumigatus）変異蛋白質の基礎となる構築物である、プラスミドpUC18-AfumgDNAおよびpUC18-AfumcDNAは、以下のようにして構築した。
【００６６】
pUC18-AfumgDNA：「エキスパンド・ハイフィデリティPCRキット(Expand(登録商標) High Fidelity PCR Kit)」（Boehringer Mannheim社、ドイツ、マンハイム）を使用し、プライマー#39および#40（図１０〜１２に示すゲノム配列を元にデザインした）およびλFixIIベクター［Stratagene社、92037米国カリフォルニア州ルゴラ；カタログ番号946055］のアスペルギルス・フミガツス（NIHストック5233）ゲノムライブラリー由来のアスペルギルス・フミガツス [ATCC13073]ゲノムDNAを用いたPCRにより、 アスペルギルス・フミガツスのフィターゼ遺伝子のゲノムDNA配列を得た。
プライマー#39：
【００６７】
その後、「シュアクローンキット(sure clone Kit)」（Boehringer Mannheim社 s.a. )を用いて製造元の推奨する方法により、PCR断片（約1450 bp）をpUC18のSmaI部位にクローニングした。この結果得られたプラスミドをpUC18-AfumgDNAと命名した。
【００６８】
pUC18-AfumcDNA：このプラスミドはアスペルギルス・フミガツスフィターゼ遺伝子のイントロン（図１０〜１２の文字の小さな間隙）を持たず、図６３に概説される方法で構築した。簡単に述べると、プライマーFum28およびFum11を用いてエキソン2の5’末端をPCR（以下参照）により増幅し、NcoIおよびEagI（プライマーFum28により導入された新しい制限酵素切断部位）により消化し、プライマーFum26およびFum27を含みエキソン1をコードするリンカーと共に、pUC18-AfumgDNAのXbaIおよびNcoI部位に連結し、これによってプラスミドpUC18-AfumcDNAを得た。
アスペルギルス・フミガツス（A. fumigatus）フィターゼのエキソン2の5’末端を得るためのPCR反応：
2 μl 鋳型：pUC18-AfumgDNA (20 ng)
1 μl dNTP混合物（Boehringer Mannheim社s.a.）
5 μl 10x 緩衝液
1 μl Taqポリメラーゼ（Boehringer Mannheim社s.a.）
1.9 μl Fum11 (=10 pmol)
2 μl Fum28 (=10 pmol)
37.1 μl H2O
以下の温度設定で合計35サイクル実行した：95℃で30 秒／56℃で30秒／72℃で45秒。増幅された断片（約330 bp）を等量のフェノール／クロロフォルム(1:1)で1回抽出した。回収された水相に、0.1倍量の3 M酢酸ナトリウム、pH 4.8および2.5倍量のエタノールを添加した。反応液を12000 gで10分間遠心し、沈殿を20μlのH2Oに再懸濁した。その後、精製された断片をNcoIおよびEagIで消化し、以下のように処理した。
【００７０】
実施例３．アスペルギルス・ニガー（A. niger）における発現のためのアスペルギルス・フミガツス（A. fumigatus）フィターゼ変異蛋白質の構築
アスペルギルス・ニガーで発現するためのすべての変異蛋白質を構築するために、プラスミドpUC18-AfumgDNAを部位特異的突然変異誘発法の鋳型として使用した。変異はStratagene社（米国カリフォルニア州ラホヤ）の「クイックエクスチェンジ部位特異的突然変異誘発キット(quick exchange(登録商標) site-directed mutagenesis kit)」を使用し、製造元のプロトコールに従って、対応するプライマー（図６４〜６７）を用いて導入した。すべての変異は表1AおよびBにまとめられており、T1〜T7およびN1〜N6はそれぞれ、変異蛋白質およびその位置で置換されたアミノ酸の変異を示す。例えばT5は二重変異を有する変異蛋白質を示し、27の位置にQの代わりにL、274の位置にQの代わりにLを有する。変異を導入するために使用したプライマーセット(A〜H）は図６４〜６６に示されている。新しく導入されたアミノ酸は太字で示されており、下付き文字はアスペルギルス・ニガーのアミノ酸配列の番号付けを用いた、成熟したアスペルギルス・フミガツス酵素中の位置を示す。図６８および６９は単独の変異(T1〜T4; N1〜N3)または複数の変異(T5〜T7; N4〜N6)を有する変異蛋白質をコードするプラスミドpgT1〜pgT7およびpgN1〜pgN6の構築方法の概要を示す。所望の変異を有するクローンは、当技術分野で周知のDNA配列分析によって同定した。変異フィターゼは遺伝子の全配列決定によって確認した。
【００７１】
実施例４．サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）における発現のためのアスペルギルス・フミガツス（A. fumigatus）フィターゼの変異蛋白質の作製
各々変異蛋白質T1〜T7およびN1〜N6をコードする、サッカロミセス・セレビシエにおける発現用プラスミドpcT1〜pcT7（図７０）およびpcN1〜pcN6（図７３）の構築は、基本的に実施例3に概説されるようにして行った。変異を導入するための基礎となる構築物としてpUC18-AfumgDNAを使用する代わりに、プラスミドpUC18-AfumcDNAを使用した（図６３）。
【００７２】
変異蛋白質N27、G27、V27、A27、I27およびT27をコードするプラスミドpcDNA-N27、-G27、-V27、-A27、-I27および-T27は以下のようにして構築した。
【００７３】
実施例３に説明されるようにして、プライマーセットI（図６５）を用いて、部位特異的突然変異誘発法によりプラスミドpcT1にAvrIIのサイレント制限酵素切断部位を導入した。その後、アスペルギルス・フミガツスフィターゼ遺伝子断片AvrII／XhoIを所望の変異を有するリンカー断片で置換した（図７２）。各リンカー断片は合成ポリヌクレオチドの各々の対（図６７；センスおよびアンチセンス鎖；各90 ng）を9 μlの蒸留水中で70℃で3分間アニーリングして作製した。
【００７４】
アスペルギルス・フミガツス Q27L-S66Dの二重変異およびアスペルギルス・フミガツス Q27L-S140Y-D141Gの三重変異をコードするプラスミドpcT1-S66DおよびpcT1-S140Y-D141Gの構築は、基本的に実施例3に記載されるようにして実行した。Q27Lをコードする変異を有するプラスミドpcT1は、対応するプライマーセットJおよびKと共に、部位特異的突然変異誘発法の鋳型として使用した（図６４〜６７）。
【００７５】
すべての変異は遺伝子全体のDNA配列分析により確認した。
【００７６】
実施例５．アスペルギルス・ニガー（A. niger）における発現
上記アスペルギルス・フミガツス野生型フィターゼおよび変異蛋白質をコードする遺伝子は、プラスミドpgDNAT1〜pgDNAT7およびpgDNAN1〜pgDNAN6からBspHIおよびEcoRVによって単離し、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼプロモーター(glaA)の下流のNcoI部位およびアスペルギルス・ニードランストリプトファンCターミネーター(trpC)の上流のEcoRV部位（Mullaney, E.J., J.E. Hamer, K.A. Roberti, M.M. Yelton, and W.E. Timberlake. 1985. Primary structure of the trpC gene from Asperigillus nidulans. Mol. Gen.Gent. 199:37〜45）に連結した。この結果得られる発現プラスミドは、さらに選択マーカーとしてアカパンカビ（Neurospora crassa）のオロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyr4)を有していた。図７４は変異蛋白質T1をコードする遺伝子を有する、そうしたプラスミドの例を示す（Van den Hondel, C.A.M.J.J., P.J. Punt, and R.F.M van Gorcom. 1991、糸状菌における異種遺伝子発現（Heterologous gene expression in filamentous fungi）、続・菌類の遺伝子操作（More gene manipulations in fungi）396〜428頁より、Bennett, J.W. and Lasure, L.L.（編）Academic Press Inc., San Diego, CA）。上述の基本的な発現プラスミドは、欧州特許第684 313号の実施例9に説明されるpGLACベクターに基本的に対応する。アスペルギルス・ニガーの形質転換と変異蛋白質の発現は、欧州特許第684 313号に記載されるようにして行った。
【００７７】
上清をAmicon 8400セル（PM30メンブレン）の限外濾過およびウルトラフリー15(ultrafree-15) 遠心フィルター装置（Biomax-30K、Millipore社）によって濃縮した。
【００７８】
濃縮物（通常1.5〜5 ml）を1.5 mlに分割し、10 mM酢酸ナトリウムpH 5.0を溶出緩衝液としてファーストデソルティング(Fast Desalting) HR 10／10カラム（Pharmacia Biotech社）で脱塩した。脱塩したアスペルギルス・フミガツス試料を1.7 ml ポロス(Poros) HS／M陽イオン交換クロマトグラフィーカラム(PerSeptive Biosystems社、米国マサチューセッツ州フラミンガム）に直接かけた。アスペルギルス・テレウス cbs 116.46 [CBS 220.95]フィターゼは、1.7 ml ポロス(Poros) HQ／M陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに直接かけた。両方とも、フィターゼは塩化ナトリウム勾配によって純粋な形で溶出された。
【００７９】
実施例６．サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）における発現
アスペルギルス・フミガツス野生型フィターゼおよび上述の異なる変異蛋白質（図７０〜７３）をコードするイントロンのない遺伝子を、各プラスミドpUC18-AfumcDNA、pcDNAT1〜pcDNAT7およびpcDNAN1〜pcDNAN6からEcoRIおよびEcoRVによって単離し、プラスミドpYES2（Invitrogen社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）のXhoI平滑末端とEcoRI部位の間、またはJanesら(Janes, M., B. Meyhack, W. Zimmermann and A. Hinnen. 1990. The influence of GAP promoter variants on hirudine production, average plasmid copy number and cell growth in Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet. 18: 97〜103)に記述されたようにして、短くしたGAPFL（グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーターおよびPHO5ターミネーターの間にサブクローニングした。例えばINVSc1（Invitrogen社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）などのサッカロミセス・セレビシエ株の形質転換は、Hinnenら(Hinnen, A., J.B. Hicks and G.R. Fink. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929〜1933)に従って行った。GAPFLプロモーターの制御下にフィターゼ遺伝子を有するシングルコロニーを選んで5 ml選択培地（SD-ウラシル）（Shermanら、1986）中で30℃で1日間激しく振盪(250 rpm)して培養した。この予備培養を500 mlのYPD培地（Sheman, J.P., Finck, G.R.およびHicks, J.B. (1986)、酵母遺伝学における実験室コースマニュアル（Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics）、Cold Spring Harbor University Press）に添加し、同じ条件で培養した。4日後に細胞培養液を遠心し（7000 rpm、GS3ローター、15分、5℃）、上清を採集した。GAL1プロモーター（米国カリフォルニア州サンディエゴInvitrogen社製のプラスミドpYES2）の誘導は、製造元の説明書どおりに実行した。変異蛋白質の精製は、実施例5(s.a.)に記載されるとおりである。
【００８０】
実施例７．フィターゼ活性と基質特異性の測定
フィターゼ活性は、0.5％フィチン酸（〜5 mM）、200 mM酢酸ナトリウムpH 5.0を含むアッセイ反応液で測定した。37℃で15分間インキュベートした後、等量の15%トリクロロ酢酸を加えて反応を停止させた。遊離したリン酸イオンは100 μlのアッセイ反応液に900 μl H2Oおよび1 mlの0.6 M H2SO4、2%アスコルビン酸、0.5%モリブデン酸アンモニウムを混合して定量した。リン酸カリウムの標準溶液を基準として使用した。
【００８１】
至適pH曲線の場合には、精製した酵素を10 mM酢酸ナトリウムpH 5.0で希釈した。分注した希釈蛋白質を一連の異なる緩衝液：0.4 Mグリシン／HCl、pH 2.5; 0.4 M酢酸／NaOH、pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5; 0.4 Mイミダゾール／HCl、pH 6.0、6.5; 0.4 M Tris／HCl、pH 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0中の等量の１％フィチン酸(〜10 mM)と混合してインキュベーションを開始した。対照実験では、混合段階によってpHはごくわずかしか変化しないことが示された。インキュベーションは上述のように37℃で15分間行った。
【００８２】
野生型および変異体のアスペルギルス・フミガツスフィターゼの基質特異性を決定するために、アッセイ反応液中のフィチン酸を5 mM濃度の各リン酸化合物で置き換えた。活性試験は上述のように行った。
【００８３】
蛋白質濃度は、既知の蛋白質配列からDNA*ソフトウェア（DNASTAR社、米国ウィスコンシン州マジソン）によって計算した理論的な吸光度を用いて、280 nmにおけるODから計算した。280 nmにおける吸光度1.0 ODは、アスペルギルス・フミガツスフィターゼ0.94 mg／mlおよびアスペルギルス・テレウス cbs116.46フィターゼ0.85 mg／mlに相当する。
【００８４】
アスペルギルス・フミガツス変異体T1 (Q27L)、T5 (Q27L、Q274L)およびT6 (Q27L、Q274L、G277D)のpHプロフィールは、野生型アスペルギルス・フミガツスフィターゼと比較して、劇的に変化していた（図2参照）。すべての変異体は同等なpHプロフィールを示した。アスペルギルス・フミガツスの野生型フィターゼと比較して、pH 5.0において変異蛋白質の比活性が上昇していることを表2に示す。酵素活性はpH 5.0において標準的なアッセイ条件下で測定した。いくつかの個々の測定値（n: アッセイ数）を平均した。
【００８５】
アスペルギルス・フミガツスフィターゼ変異体Q27AのpHプロフィールは、pH範囲ほぼ全体にわたって、アスペルギルス・フミガツス野生型フィターゼのpHプロフィールと類似している（図７５）。野生型フィターゼの比活性がpH 4.0未満のpHで低下しているのに対し、フィターゼ変異体Q27Aの比活性はpH2.9までほぼ一定である。
【００８６】
単一アミノ酸の変更Q27L、Q27I、Q27VまたはQ27Tは、pH範囲全体にわたり、特にpH 5.0と7.5の間で、比活性を著しく上昇させた（図７５）。最大値はpH 6.5で観察される。さらに、変異Q27Tは低いpH (pH 3.0〜5.0)においてフィチン酸に対する最高の比活性を誘導した。
【００８７】
単一変異Q27GまたはQ27Nによっても、pH 2.5と7.0の間で比活性が上昇し、最大値はpH 6.0で見られる（図７５）。pH 3.5未満では比活性は低下する。
【００８８】
すべての単一変異は、アスペルギルス・フミガツス野生型フィターゼの基質特異性と同等の、広い基質特異性を示す（図７６）。変異体の中には、例えばQ27T変異体のp-ニトロフェニルリン酸およびATPに対する活性、またはQ27G変異体のホスホエノールピルビン酸に対する活性のように、選択された基質に対して他の変異体よりも有意に高い比活性を示すものもあった。
【００８９】
図７７に示すように、変異Q27LとS66Dとの組み合わせ、またはS140YおよびD141Gとの組み合わせは、pHプロフィールを低いpHの方に移動させた。単一変異A27Lによって得られた最大比活性は、アミノ酸の置換を追加することでさらに上昇する。
【００９０】
図3に示すように、アスペルギルス・フミガツスフィターゼ変異体T1 (Q27L)は、三重変異体T6 (Q27L、Q274L、G277D)と比較して、基質特異性には差がなかった。
【００９１】
N2を除き、変異蛋白質N1〜6のpHプロフィールは、野生型フィターゼと比較して有意な差を示す（図５９）。変異蛋白質N4のpHプロフィールは低いpH方向に拡大しているが、変異蛋白質N3〜N6のプロフィールは低いpH方向に移動している。変異蛋白質N5とN6は、すでにpH 3.0で最大活性に達する。
【００９２】
変異蛋白質N1〜N6では、ほぼすべての場合において、フィチン酸を除き、試験されたすべての基質に対して比活性がかなり低下している（図５８）。フィチン酸に対する比活性は、野生型フィターゼに比較して変わりがないが、変異蛋白質N3およびN6の活性はあきらかに高い傾向がある（図５８）。
【００９３】
【表１】
A) アスペルギルス・テレウス（A. terreusu）cbs116.46フィターゼ方向への変異
【表２】
【表３】
pH 5.0における標準的アッセイ条件下での比活性。平均の標準偏差は10％。
実施例８．
改変された特性を有するフィターゼを入手する別の方法として、および特定の種の中で天然に見られるフィターゼ特性の差異をよりよく理解するために、アスペルギルス・フミガツスフィターゼの天然に生じる変異体を分析した。フィターゼ遺伝子をアスペルギルス・フミガツスの６つの異なる単離株から入手した。2つのアスペルギルス・フミガツス単離株（ATCC 26934およびATCC 34625）由来のフィターゼのアミノ酸配列は、野生型アスペルギルス・フミガツスフィターゼATCC 13073のアミノ酸配列と違いを示さなかった。他の3つの単離株では1つまたは2つのアミノ酸の置換が示されたが、いずれも活性部位には直接影響を与えていなかった。酵素特性は、これらの置換の影響を受けていなかった（データは示さず）。アスペルギルス・フミガツス (ATCC 32239)単離株のフィターゼは、もとの野生型アスペルギルス・フミガツスフィターゼ(ATCC 13073)と比較して、シグナル配列において13箇所の位置において、蛋白質の成熟した部分で51箇所の位置において違いを示した。これらの置換のうちには、活性部位の穴の可変アミノ酸に影響を与えるものもある。この結果、フィチン酸を基質とした比活性の上昇（47 U/mg、標準酵素アッセイ）と、pH7（図８０）以上における酵素活性の損失が観察された。また、この場合、フィチン酸に対する比活性は、他の基質に対する比活性と比較して上昇していた（図８１）。
【００９７】
実施例９．
アスペルギルス・フミガツス [ATCC 13073]フィターゼS130N単独変異、R129L-S130N二重変異およびアスペルギルス・ニードランスフィターゼK167G-R168Q二重変異をコードするプラスミドpc-S130N、pc-R129L-S130N、pc-K167G-R168Qの構築は、基本的に実施例3に記載されるようにして実行した。プラスミドpUC18-AfumcDNAは、対応するプライマーセットL、MおよびN（図６６；図８２）を用いた部位特異的突然変異誘発法の鋳型として用いた。
【００９８】
すべての変異は遺伝子全体のDNA配列分析によって確認した。
【００９９】
実施例１０．
アスペルギルス・ニガー中で発現し濃縮培養上清として4℃で保存すると、アスペルギルス・フミガツス、アスペルギルス・ニードランスのフィターゼは蛋白質分解を受ける傾向を示した。断片のN末端の配列決定により、切断は各々アミノ酸S130-V131およびK167-R168またはR168-A169の間で起こったことが示唆された。アスペルギルス・ニガー・フィターゼの立体構造と比較すると、すべての切断部位は表面に露出したループ構造内にあり、したがってプロテアーゼが近付ける部位であることが分かった。
【０１００】
アスペルギルス・フミガツスフィターゼ（S130N、R129-S130N）およびアスペルギルス・ニードランスフィターゼ（K167G-R168Q）のプロテアーゼ感受性部位に、部位特異的突然変異を導入すると、蛋白質分解に対する感受性がかなり低下した変異蛋白質が生成した。
【０１０１】
アスペルギルス・ニガーにおける発現とは対称的に、ハンゼヌラ・ポリモルファにおいてフィターゼが発現れたときには、蛋白質分解は観察されなかった。
【０１０２】
【発明の効果】
本発明により、改良された活性特性を有する修飾フィターゼの生産方法が提供された。また、本発明により、上記の方法によって得られる修飾フィターゼが提供された。さらに、本発明により、上述のフィターゼをコードするDNA配列を含むDNA配列、該DNA配列を含むベクター、好ましくは発現ベクター、該DNA配列またはベクターにより形質転換された宿主細胞、上述の宿主細胞が適当な培養条件下で培養され、該宿主細胞または培地から当技術分野で周知の方法によりフィターゼが単離される、本発明のフィターゼの調製方法、および本発明のフィターゼを含む食物または飼料組成物が提供された。
【図面の簡単な説明】
【図１】 アスペルギルス・ニガー（フィクウム）、アスペルギルス・テレウス cbs116.46およびアスペルギルス・フミガツス [ATCC 13073]のフィターゼの一次配列を整列させた図である。星印は活性部位内の同一のアミノ酸残基を示し、長方形は活性部位内の異なる残基を示す。
【図２】 至適pH曲線を示す図である。野生型および変異体のアスペルギルス・フミガツスフィターゼの比活性を、インキュベーションのpHに対して表す。黒四角はアスペルギルス・フミガツス野生型のフィターゼ；白三角はアスペルギルス・フミガツス Q27L変異体；黒丸はアスペルギルス・フミガツス Q27L, Q274L変異体；白四角はアスペルギルス・フミガツスQ27L, Q274L, G277D変異体を表す。
【図３】 野生型と変異体のアスペルギルス・フミガツスフィターゼの基質特異性を示す図である。(A)野生型；(B) Q27L単一変異体；(C) Q27L, Q274L, G277D三重変異体。以下の基質を使用した：(1)フィチン酸；(2) p-ニトロフェニルリン酸；(3)フルクトース-1,6-ビスリン酸；(4)フルクトース-6-リン酸；
(5)グルコース-6-リン酸；(6)リボース-5-リン酸；(7)α-グリセロリン酸；(8)β-グリセロリン酸；(9) 3-ホスホグリセリン酸；(10)ホスホエノールピルビン酸；(11) AMP；(12) ADP；(13) ATP。
【図４】 アスペルギルス・ニードランス（A. nidulans）フィターゼの全コード配列（１〜７００）およびコードされるアミノ酸配列（１〜１６３）を示す図である。
【図５】 アスペルギルス・ニードランス（A. nidulans）フィターゼの全コード配列（７０１〜１３５０）およびコードされるアミノ酸配列（１６４〜３８０）を示す図である。
【図６】 アスペルギルス・ニードランス（A. nidulans）フィターゼの全コード配列（１３５１〜１９３１）およびコードされるアミノ酸配列（３８１〜４６３）を示す図である。
【図７】 タラロミセス・サーモフィルス（Talaromyces thermophilus）フィターゼの全コード配列（１〜７５０）およびコードされるアミノ酸配列（１〜１３６）を示す図である。
【図８】 タラロミセス・サーモフィルス（Talaromyces thermophilus）フィターゼの全コード配列（７５１〜１４００）およびコードされるアミノ酸配列（１３７〜３５３）を示す図である。
【図９】 タラロミセス・サーモフィルス（Talaromyces thermophilus）フィターゼの全コード配列（１４０１〜１８４５）およびコードされるアミノ酸配列（３５４〜４６６）を示す図である。
【図１０】 アスペルギルス・フミガツス（A. fumigatus）[ATCC 13073]フィターゼの全コード配列（１〜６００）およびコードされるアミノ酸配列（１〜１６７）を示す図である。
【図１１】 アスペルギルス・フミガツス（A. fumigatus）[ATCC 13073]フィターゼの全コード配列（６０１〜１２５０）およびコードされるアミノ酸配列（１６８〜３８４）を示す図である。
【図１２】 アスペルギルス・フミガツス（A. fumigatus）[ATCC 13073]フィターゼの全コード配列（１２５１〜１５７１）およびコードされるアミノ酸配列（３８５〜４６５）を示す図である。
【図１３】 アスペルギルス・テレウス（A. terreus）CBS 116.46フィターゼの全コード配列（１〜６５０）およびコードされるアミノ酸配列（１〜１７４）を示す図である。
【図１４】 アスペルギルス・テレウス（A. terreus）CBS 116.46フィターゼの全コード配列（６５１〜１２５０）およびコードされるアミノ酸配列（１７５〜３７４）を示す図である。
【図１５】 アスペルギルス・テレウス（A. terreus）CBS 116.46フィターゼの全コード配列（１２５１〜１５６７）およびコードされるアミノ酸配列（３７５〜４６６）を示す図である。
【図１６】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１〜９９）を示す図である。
【図１７】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１００〜１８４）を示す図である。
【図１８】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１８５〜２６９）を示す図である。
【図１９】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（２７０〜３５４）を示す図である。
【図２０】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（３５５〜４３９）を示す図である。
【図２１】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（４４０〜５２４）を示す図である。
【図２２】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（５２５〜６０９）を示す図である。
【図２３】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（６１０〜６９４）を示す図である。
【図２４】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（６９５〜７７９）を示す図である。
【図２５】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（７８０〜８６４）を示す図である。
【図２６】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（８６５〜９４９）を示す図である。
【図２７】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（９５０〜１０３４）を示す図である。
【図２８】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１０３５〜１１１９）を示す図である。
【図２９】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１１２０〜１２０４）を示す図である。
【図３０】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１２０５〜１２８９）を示す図である。
【図３１】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１２９０〜１３７４）を示す図である。
【図３２】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１３７５〜１４５９）を示す図である。
【図３３】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１４６０〜１５４４）を示す図である。
【図３４】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１５４５〜１６２９）を示す図である。
【図３５】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１６３０〜１７１４）を示す図である。
【図３６】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１７１５〜１７９９）を示す図である。
【図３７】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１８００〜１８８４）を示す図である。
【図３８】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１８８５〜１９６９）を示す図である。
【図３９】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（１９７０〜２０５４）を示す図である。
【図４０】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（２０５５〜２１３９）を示す図である。
【図４１】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（２１４０〜２２２４）を示す図である。
【図４２】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（２２２５〜２３０９）を示す図である。
【図４３】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（２３１０〜２３９４）を示す図である。
【図４４】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（２３９５〜２４７９）を示す図である。
【図４５】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（２４８０〜２５６４）を示す図である。
【図４６】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（２５６５〜２６４９）を示す図である。
【図４７】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（２６５０〜２７３４）を示す図である。
【図４８】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（２７３５〜２８１９）を示す図である。
【図４９】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（２８２０〜２９０４）を示す図である。
【図５０】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（２９０５〜２９８９）を示す図である。
【図５１】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（２９９０〜３０７４）を示す図である。
【図５２】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（３０７５〜３１５９）を示す図である。
【図５３】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（３１６０〜３２４４）を示す図である。
【図５４】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（３２４５〜３３２９）を示す図である。
【図５５】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（３３３０〜３４１４）を示す図である。
【図５６】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（３４１５〜３４９９）を示す図である。
【図５７】 アスペルギルス・ニガー（A. niger）フィターゼの構造の結晶学データ（３５００〜３５８９）を示す図である。
【図５８】 野生型および変異体のアスペルギルス・フミガツス（A. fumigatus）(N1〜N6)フィターゼの基質特異性を示す図である。基質1〜13 は図3と同じ。
【図５９】 変異体のアスペルギルス・フミガツス (N1〜N6)フィターゼの至適pH曲線を示す図である。すべての活性の値は標準化している（最大活性=1.0）。
【図６０】 アスペルギルス・ニガー (アスペルギルス・フィクウム; NRRL 3135)フィターゼの3次元折り畳みの立体図である。活性部位を丸で示し、触媒作用に必須のアミノ酸残基Arg 58およびHis 59は球と棒で表してある。この図は「MOLSCRIPT」プログラム［Kraulis, P.J., J. Appl. Cryst. 24, 946〜950 (1991)］および「RASTER3D」プログラム［Merritt, E. A.およびMurphy, M.E.P., Acta Cryst.,869〜873 (1994)］を用いて作製した。
【図６１】 (a)と同じ方法を用いた位相学的スケッチを示す図である。5つのジスルフィド結合は、黒いジグザグ線で示し、関与するシステイン残基の配列番号も示してある。β鎖は配列番号A: 48〜58、B: 134〜138、C: 173〜177、D: 332〜337、E: 383〜391、およびF: 398〜403で定義している。αヘリックスは配列番号a: 66〜82、b:88〜95、c:107〜123、d:141〜159、e:193〜197、f:200〜210、g:213〜223、h:231〜246、i:257〜261、j:264〜281、k:290〜305、l:339〜348、m:423〜429、およびn:439〜443と定義してある。β鎖AのC末端の星印は、触媒作用に必須のアミノ酸残基Arg 58およびHis 59の位置を示す。
【図６２】 アスペルギルス・フィクウム (ATCC 13073)のフィターゼの活性部位の立体図で、基質のフィチン酸の推測上の結合様式を示す図である。このモデルでは、結合した結晶水分子が除去され、基質と相互作用するためにLys 68の側鎖のねじれ角がわずかに調節されている以外、蛋白質の原子の位置は固定されている。すべての保存されたアミノ酸残基Arg 58、His 59、Arg 62、Arg 142、His 338およびAsp 339は点線で示されるように、フィチン酸の容易に開裂できる3リン酸基と水素結合を作る。太い点線で示すように、His 59は容易に開裂できるリンに求核性攻撃を行うために好都合な位置にあり、Asp 339は去って行く基にプロトン付加を行う位置にある。
【図６３】 部位特異的突然変異誘発法のための基本プラスミドpUC18-AfumgDNAおよびpUC18-AfumcDNAの構築を示す図である。
【図６４】 部位特異的突然変異誘発法に使用したプライマーセットA〜E。
【図６５】 部位特異的突然変異誘発法に使用したプライマーセットF〜K。
【図６６】 部位特異的突然変異誘発法に使用したプライマーセットL〜N。
【図６７】 部位特異的突然変異誘発法に使用したプライマーセットO〜Tを示す図である。
【図６８】 プラスミドpgDNAT1〜pgDNAT7の構築を示す図である。
【図６９】 プラスミドpgDNAN1〜pgDNAN6の構築を示す図である。
【図７０】 プラスミドpcT1〜pcT7の構築を示す図である。
【図７１】 プラスミドpcT1-AvrII、pcT1-S66DおよびpcT1-S140Y-D141Gの構築を示す図である。
【図７２】 プラスミドpcDNA-N27、-T27、-I27、-V27、-A27、-G27の構築を示す図である。
【図７３】 プラスミドpcN1〜pcN6の構築を示す図である。
【図７４】 アスペルギルス・ニガーにおける変異蛋白質T1の発現用プラスミドpAfum-T1を示す図である。
【図７５】 至適pH曲線を示す図である。野生型および変異体のアスペルギルス・フミガツスフィターゼの比活性を、インキュベーションのpHに対して表す。白三角：アスペルギルス・フミガツス [ATCC 13073]の野生型フィターゼ；白菱形： アスペルギルス・フミガツス Q27Gフィターゼ；黒四角： アスペルギルス・フミガツス Q27Nフィターゼ；黒三角：アスペルギルス・フミガツス Q27Vフィターゼ；白四角： アスペルギルス・フミガツス Q27Aフィターゼ；黒丸： アスペルギルス・フミガツス Q27Iフィターゼ；白丸： アスペルギルス・フミガツス Q27Tフィターゼ；破線： アスペルギルス・フミガツス Q27Lフィターゼ。
【図７６】 野生型と変異体アスペルギルス・フミガツス[ATCC 13073]のフィターゼの基質特異性を示す図である。使用した基質1〜13は図3と同じ。試験された13の基質に対する異なるフィターゼの比活性は、すべて次の順に記載されている（左から右）：アスペルギルス・フミガツス野生型フィターゼ、 アスペルギルス・フミガツス Q27Nフィターゼ、 アスペルギルス・フミガツス Q27Tフィターゼ、 アスペルギルス・フミガツス Q27Lフィターゼ、 アスペルギルス・フミガツス Q27Iフィターゼ、 アスペルギルス・フミガツス Q27Vフィターゼ、 アスペルギルス・フミガツス Q27Aフィターゼ、 アスペルギルス・フミガツス Q27Gフィターゼ。
【図７７】 至適pH曲線を示す図である。野生型および変異体のアスペルギルス・フミガツス [ATCC 13073]フィターゼの比活性を、インキュベーションのpHに対して表す。黒菱形：アスペルギルス・フミガツス野生型フィターゼ；黒四角： アスペルギルス・フミガツス Q27Lフィターゼ；白丸： アスペルギルス・フミガツス Q27L-S66D二重変異体；黒三角： アスペルギルス・フミガツス Q27L-S140Y-D141G三重変異体。
【図７８】 アスペルギルス・フミガツス [ATCC 13073]の異なる単離株におけるフィターゼの天然の変動を示す図である。予測される蛋白質配列をアスペルギルス・フミガツス ATCC 13073株由来のフィターゼの蛋白質配列（１〜３２０）と比較して示す。#13073と異なるアミノ酸のみを示す。
【図７９】 アスペルギルス・フミガツス [ATCC 13073]の異なる単離株におけるフィターゼの天然の変動を示す図である。予測される蛋白質配列をアスペルギルス・フミガツス ATCC 13073株由来のフィターゼの蛋白質配列（３２１〜４７０）と比較して示す。#13073と異なるアミノ酸のみを示す。
【図８０】 ２つの異なるアスペルギルス・フミガツス野性株から単離されたフィターゼのpHに依存する比活性を示す図である。白四角：野生株ATCC 13073；黒丸：株ATCC 32239。
【図８１】 ２つの異なるアスペルギルス・フミガツス野性株から単離されたフィターゼの基質特異性を示す図である。黒：野生株ATCC 13073；白：株ATCC 32239。
【図８２】 プラスミドpc-S130N、pc-R129L-S130N、pc-K167G-R168Qの構築を示す図である。
Claims (8)
- 図１に示されるアミノ酸配列からなるアスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）のフィターゼの第２３番目のアミノ酸が、Ala、Val、Leu、Ile、Thr、Asn及びGlyからなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸に置換されている、修飾フィターゼ。
- 図１に示されるアミノ酸配列からなるアスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）のフィターゼの修飾フィターゼであって、
Q23L、Q23N、Q23T、Q23I、Q23V、Q23A、Q23G、Q23L-S62D、Q23L-S136Y-D137G、Q23L-Q269LまたはQ23L-Q269L-G272Dのうちの少なくとも１つの変異があることを特徴とする、修飾フィターゼ。 - 請求項１または２に記載の修飾フィターゼをコードするDNA配列を含むDNA。
- 請求項３に記載のDNAを含むベクター。
- 発現ベクターである、請求項４に記載のベクター。
- 請求項３に記載のDNAまたは請求項４若しくは５に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
- 請求項６に記載の宿主細胞が適当な培養条件下で培養され、該宿主細胞または培地から修飾フィターゼが単離される、請求項１または２に記載の修飾フィターゼを調製する方法。
- 請求項１または２に記載の修飾フィターゼを含む、食料または飼料組成物。
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