JP4104853B2 - 肝機能保護剤または改善剤 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、肝機能保護剤または改善剤、肝機能保護作用または改善作用を有する飲食品または飼料、肝機能保護作用または改善作用を有する飲食品用添加物または飼料用添加物、肝機能保護剤または改善剤のスクリーニング方法、および動物の肝機能保護方法または改善方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肝臓は、３大栄養素である糖質、タンパク質、脂質の代謝調節・貯蔵を行なったり、生体にとって不要な物質を分解・解毒したり等の種々の機能を担っている重要な臓器である。これら機能は、アルコールの過剰摂取、ウイルス感染、乱れた食習慣、ストレス、喫煙等により急性的あるいは慢性的に障害を受けるが、該障害が進行すると、例えば急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化症、アルコール性脂肪肝、Ｂ型ウイルス肝炎、肝臓癌などの疾患となる。
【０００３】
肝細胞がウイルス、アルコールなどで障害を受けると、細胞中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（グルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼともいう。以下ＧＯＴと略記する。）やアラニンアミノトランスフェラーゼ（グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼともいう。以下、ＧＰＴと略記する。）などの酵素が血液中に出てくるため、これらの酵素活性を示す数値が上昇する。従って、血液中のこれらＧＯＴやＧＰＴ活性は、肝臓の機能障害を示す指標として知られている。
【０００４】
肝機能障害の予防または治療に使用される薬剤としては、例えばアシクロビル等の抗ウイルス剤、免疫抑制剤（医学のあゆみ１７１巻１４号９５７〜１１５８、１９９４年、医歯薬出版）、グルタチオン（蛋白質核酸酵素３３巻９号１６２５〜１６３１、１９８８年、共立出版株式会社）等が知られている。また、肝機能の保護・増強・改善に有効とされる飲食品としては、例えばウコン、マリアアザミ、ゴマリグナン、牡蠣エキス、レバーエキスなどが知られている（FOOD Style 21, 2巻12号,１９９８年、食品化学新聞社）。
【０００５】
ユキノシタ科植物のアマチャ（Hydrangea macrophylla Seringe var. Thunbergii Makino）はアジサイの近隣種でヤマアジサイ（Hydrangea macrophylla Seringe var. acuminata）の育種で作り出されたと言われている。甘茶は、アマチャの葉部、枝先を採取して発酵後、乾燥処理して調製される日本特産の生薬として知られている。
【０００６】
この甘茶又は甘茶のエキスは、従来より丸剤などの矯味（甘味）薬、口腔清涼剤の製造原料（日本薬局方解説書第１２改正,D-31-33,1991年、廣川書店)として使われている。食品添加物(甘味料)である甘茶抽出物は、甘茶の葉より水で抽出して得られるもので、形態は液体あるいは濃縮して粉末にしたものであり、甘味成分はフィロヅルシンである（既存添加物と天然香料、食品素材「天然物便覧」第１４版、食品と科学社、1998年）。
【０００７】
甘茶は抗コクシジウム活性、抗カビ活性、抗潰瘍活性、抗アレルギー活性、高コレステロール血症抑制作用、抗歯周病菌作用、抗酸化作用などを有するものとして知られている（第２回くすりと食物シンポジウム講演要旨集、p85、1999年)。また甘茶のエキスが、利胆作用を示すことが知られている(薬学雑誌、114巻6号、401〜413、1994年）。さらに甘茶エキスが、インビトロで肝ミクロソームの脂質過酸化反応の抑制作用を示すことも知られている（Natural Medicines,49(1),84〜87、1995年）。
【０００８】
しかし、甘茶、ユキノシタ等、ユキノシタ科植物が、肝機能保護作用または改善作用を有することは知られていない。
また、肝機能の保護剤または改善剤のスクリーニング方法としては、Ｄ−ガラクトサミン[ジャーナル・オブ・ニュートリション（Journal of Nutrition),129,1361(1999)]やアセトアミノフェン「プラント・メディカ（Planta Medica）,55,417(1989)]あるいは四塩化炭素[ファンダメンタル・アンド・クリニカル・ファルマコロジー（Fundamental & Clinical Pharmacology）,3, 183(1989)]などを投与して血中ＧＰＴおよびＧＯＴの上昇させた齧歯動物を用いる方法が知られている。
【０００９】
一方、血中のＧＰＴおよびＧＯＴ活性を増加させる方法としては、エタノールを投与した後、リポ多糖を投与する方法［ガストロエントロジー（Gastroenterology）, 115, 443 (1998)］が知られている。この方法により、アルコール投与と類似の過程を経て生じる肝障害を短期間で誘導することができるが、これまでこの方法を肝機能の保護剤または改善剤のスクリーニング方法として用いることは知られていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
肝疾患を効果的に予防または治療できる薬剤や、日々摂取することで肝障害を予防または治療できる健康飲食品または動物用飼料の開発が切望されている。本発明の目的は、肝機能保護剤または改善剤、肝機能保護作用または改善作用を有する飲食品または飼料、肝機能保護作用または改善作用を有する飲食品用添加物または飼料用添加物、肝機能保護剤または改善剤のスクリーニング方法、および動物の肝機能保護方法または改善方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の（１）〜（５１）に関する。
（１） ユキノシタ科植物体または該植物体抽出物を有効成分として含有することを特徴とする肝機能保護剤または改善剤。
（２） ユキノシタ科植物がユキノシタ属に属する植物である前記（１）記載の肝機能保護剤または改善剤。
【００１２】
（３） ユキノシタ属に属する植物が、ユキノシタ（Saxifraga stolonifera Meerb.）ある前記（２）記載の肝機能保護剤または改善剤。
（４） ユキノシタ科植物がアジサイ属に属する植物である前記（１）記載の肝機能保護剤または改善剤。
（５） アジサイ属に属する植物が、アマチャ（Hydrangea macrophylla Seringe var.Thunbergii Makino）または甘茶（Hydrangeae Dulcis Folium）である前記（４）記載の肝機能保護剤または改善剤。
【００１３】
（６） ユキノシタ科植物体抽出物が、ユキノシタ科植物体の水性媒体抽出物残さのアルコール抽出物である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の肝機能保護剤または改善剤。
（７） 経口で投与する前記（１）〜（６）のいずれかに記載の肝機能保護剤または改善剤。
【００１４】
（８） 肝機能がアルコールにより影響される機能である前記（１）〜（７）のいずれかに記載の肝機能保護剤または改善剤。
【００１５】
（９） ユキノシタ科植物体または該植物体抽出物を添加してなる飲食品。
（１０） 飲食品が肝機能の保護または改善に用いられるものである前記（９）記載の飲食品
（１１） 肝機能がアルコールにより影響されるものである前記（１０）記載の飲食品。
【００１６】
（１２） ユキノシタ科植物がユキノシタ属に属する植物である前記（９）〜（１１）のいずれかに記載の飲食品。
（１３） ユキノシタ属に属する植物が、ユキノシタ（Saxifraga stolonifera Meerb.）である前記（１２）記載の飲食品。
（１４） ユキノシタ科植物がアジサイ属に属する植物である前記（９）〜（１１）のいずれかに記載の飲食品。
【００１７】
（１５） アジサイ属に属する植物が、アマチャ（Hydrangea macrophylla Seringe var.Thunbergii Makino）または甘茶（Hydrangeae Dulcis Folium）である前記（１４）記載の飲食品。
（１６） ユキノシタ科植物体抽出物が、ユキノシタ科植物体の水性媒体抽出物残さのアルコール抽出物である前記（９）〜（１５）のいずれかに記載の飲食品。
【００１８】
（１７） ユキノシタ科植物体または該植物体抽出物を添加してなる飼料。
（１８） 飼料が肝機能の保護または改善に用いられるものである前記（１７）記載の飼料。
（１９） 肝機能がアルコールにより影響される機能である前記（１８）記載の飼料。
【００１９】
（２０） ユキノシタ科植物がユキノシタ属に属する植物である前記（１７）〜（１９）のいずれかに記載の飼料。
（２１） ユキノシタ属に属する植物が、ユキノシタ（Saxifraga stolonifera Meerb.）である前記（２０）記載の飼料。
（２２） ユキノシタ科植物がアジサイ属に属する植物である前記（１７）〜（１９）のいずれかに記載の飼料。
【００２０】
（２３） アジサイ属に属する植物が、アマチャ（Hydrangea macrophylla Seringe var.Thunbergii Makino）または甘茶（Hydrangeae Dulcis Folium）である前記（２２）記載の飼料。
（２４） ユキノシタ科植物体抽出物が、ユキノシタ科植物体の水性媒体抽出物残さのアルコール抽出物である前記（１７）〜（２３）のいずれかに記載の飼料。
【００２１】
（２５） ユキノシタ科植物体または該植物体抽出物を含有することを特徴とする肝機能保護作用または改善作用を有する飲食品用添加剤。
（２６） 肝機能がアルコールにより影響される機能である前記（２５）記載の飲食品用添加剤。
（２７） ユキノシタ科植物がユキノシタ属に属する植物である前記（２５）または（２６）記載の飲食品用添加剤。
【００２２】
（２８） ユキノシタ属に属する植物が、ユキノシタ（Saxifraga stolonifera Meerb.）である前記（２７）に記載の飲食品用添加剤。
（２９） ユキノシタ科植物がアジサイ属に属する植物である前記（２５）または（２６）記載の飲食品用添加剤。
（３０） アジサイ属に属する植物が、アマチャ（Hydrangea macrophylla Seringe var.Thunbergii Makino）または甘茶（Hydrangeae Dulcis Folium）である前記（２９）記載の飲食品用添加剤。
【００２３】
（３１） ユキノシタ科植物体抽出物が、ユキノシタ科植物体の水性媒体抽出物残さのアルコール抽出物である前記（２５）〜（３０）のいずれかに記載の飲食品用添加剤。
（３２） ユキノシタ科植物体または該植物体抽出物を含有することを特徴とする肝機能保護作用または改善作用を有する飼料用添加剤。
【００２４】
（３３） 肝機能がアルコールにより影響される機能である前記（３２）記載の飼料用添加剤
（３４） ユキノシタ科植物がユキノシタ属に属する植物である前記（３２）または（３３）記載の飼料用添加剤。
（３５） ユキノシタ属に属する植物が、ユキノシタ（Saxifraga stolonifera Meerb.）である前記（３４）記載の飼料用添加剤。
【００２５】
（３６） ユキノシタ科植物がアジサイ属に属する植物である前記（３２）または（３３）記載の飼料用添加剤。
（３７） アジサイ属に属する植物が、アマチャ（Hydrangea macrophylla Seringe var.Thunbergii Makino）または甘茶（Hydrangeae Dulcis Folium）である前記（３６）記載の飼料用添加剤。
【００２６】
（３８） ユキノシタ科植物体抽出物が、ユキノシタ科植物体の水性媒体抽出物残さのアルコール抽出物である前記（３２）〜（３７）のいずれかに記載の飼料用添加物。
【００２７】
（３９） スクリーニングすべき物質を動物に投与することにより、アルコールを投与した後のリポ多糖の投与により上昇する動物の血液中のＧＰＴまたはＧＯＴ値を低下させる物質を評価することを特徴とする肝機能の保護または改善剤のスクリーニング方法。
【００２８】
（４０） 動物がほ乳類である前記（３９）記載の方法。
（４１） リポ多糖が腸内細菌群に属する微生物由来のものである前記（３９）または（４０）のいずれかに記載の方法。
（４２） 肝機能がアルコールにより影響される機能である前記（３９）〜（４１）のいずれかに記載の方法。
【００２９】
（４３） 前記（１）〜（８）のいずれかに記載の肝機能保護剤もしくは改善剤または前記（１７）〜（２４）のいずれかの飼料を動物に給餌することを特徴とする動物の肝機能保護方法または肝機能改善方法。
（４４） 動物が、家畜、家禽、養殖魚である前記（４３）に記載の方法。
【００３０】
（４５） ユキノシタ科植物体または該植物体抽出物を有効成分として含有することを特徴とする肝機能保護または改善用飲食品または飼料。
【００３１】
（４６） ユキノシタ科植物がユキノシタ属に属する植物である前記（４５）記載の肝機能保護または改善用飲食品または飼料。
（４７） ユキノシタ属に属する植物が、ユキノシタ（Saxifraga stolonifera Meerb.）ある前記（４６）記載の肝機能保護または改善用飲食品または飼料。
【００３２】
（４８） ユキノシタ科植物がアジサイ属に属する植物である前記（４５）記載の肝機能保護または改善用飲食品または飼料。
（４９） アジサイ属に属する植物が、アマチャ（Hydrangea macrophylla Seringe var.Thunbergii Makino）または甘茶（Hydrangeae Dulcis Folium）である前記（４８）記載の肝機能保護または改善用飲食品または飼料。
【００３３】
（５０） ユキノシタ科植物体抽出物が、ユキノシタ科植物体の水性媒体抽出物残さのアルコール抽出物である前記（４５）〜（４９）のいずれかに記載の肝機能保護または改善用飲食品または飼料。
（５１） 肝機能がアルコールにより影響される機能である前記（４５）〜（５０）のいずれかに記載の肝機能保護または改善用飲食品または飼料。
【００３４】
【発明の実施の形態】
本発明において、肝機能の保護とは、肝機能を各種障害から保護する作用および肝機能を障害から予防する作用等を含む。肝機能の改善とは、障害を受けた肝臓の機能を回復もしくは治癒させる作用、肝臓の機能を向上もしくは増強させる作用等を含む。
【００３５】
本発明で、ユキノシタ科植物とは、学名サキシフラガセアエ（Saxifragaceae）に属する植物を意味する［牧野新日本植物図鑑（第40版、昭和59年6月10日、北隆館）、原色牧野植物大図鑑（続編）（初版昭和58年5月10日、北隆館）］。ユキノシタ科植物としては、例えばチダケサシ（Astilbe）属、ヤグルマソウ（Rodgersia）属、ユキノシタ（Saxifraga）属、イワユキノシタ（Tanakaea)属、アセリフィラム(Aceriphyllum）属、アラシグサ（Boykinia）属、ネコノメソウ（Chrysosplenium）属、スダヤクシュ（Tiarell）属、チャルメルソウ（Mitella）属、ウメバチソウ（Parnassia）属、バイカウツギ（Philadelphus）属、ウツギ（Deutzia）属、バイカアマチャ（Platycrater）属、アジサイ（Hydrangea）属、イワガラミ（Schizophragma）属、クサアジサイ（Cardiandra）属、ギンバイソウ（Deinanthe)属、ズイナ(Itea）属、スグリ（Ribes）属、キレンゲショウマ（Kirengeshoma）属およびこれら植物から育種された植物品種等があげられ、アジサイ属、ユキノシタ属に属する種およびこれら種から肝機能保護作用または改善作用が増強されるように育種された植物品種が好ましい。
【００３６】
チダケサシ属に属する種としては、例えばチダケサシ（Astilbe microphylla Knoll）、アカショウマ（Astilbe thunbergii Miq.）、トリアシショウマ（Astilbe odontophylla Miq.）、アワモリショウマ（Astilbe japonica Miq.）、ヒトツバショウマ（Astilbe simplicifolia Makino）等があげられる。ヤグルマソウ属に属する種としては、例えばヤグルマソウ（Rodgersia podophylla A. Gray）等があげられる。
【００３７】
ユキノシタ属に属する種としては、例えばユキノシタ（Saxifraga stolonifera Meerb.）、ハルユキノシタ（Saxifraga nipponica Makino）、ダイモンジソウ（Saxifraga fortunei Hook.）、ジンジソウ（Saxifraga cortusaefolia Sieb. et Zucc.）、フキユキノシタ（Saxifraga japonica Boiss.）、クロクモソウ（Saxifraga fusca Maxim）、モミジバセンダイソウ（Saxifraga sendaica Maxim. var. laciniata Nakai）、クモマグサ（Saxifraga merkii Fisch. var. idsuroei Engl.）、クモマユキノシタ（Saxifraga laciniata Nakai et Takeda）、シコタンソウ（Saxifraga bronchialalis L.）、ムカゴユキノシタ（Saxifraga cernua L.）、ヤマハナソウ（Saxifraga sachalinensis Fr. Schm.）等があげられ、ユキノシタが好ましい。
【００３８】
イワユキノシタ属に属する種としては、例えばイワユキノシタ（Tanakaea rad icans Franch. et Sav.）等があげられる。
【００３９】
アセリフィラム属に属する種としては、例えばイワヤツデ（Aceriphyllum rossii Engler）等があげられる。
【００４０】
アラシグサ属に属する種としては、例えばアラシグサ（Boykinia lycoctonifolia Engl.）、ヤハタソウ（Boykinia tellimoides Engl.et Irmsch.）等があげられる。
【００４１】
ネコノメソウ属に属する種としては、例えばネコノメソウ（Chrysosplenium grayanum Maxim.）、ハナネコノメソウ（Chrysosplenium stamineum Franch）、ヤマネコノメソウ（Chrysosplenium japonicum Makino）、ツルネコノメソウ（Chrysosplenium flagelliferum Fr.Schm.）、ミヤマネコノメソウ（Chrysosplenium macrostemon Maxim.）、コガネネコノメソウ（Chrysosplenium sphaerospermum Maxim.）等があげられる。
【００４２】
スダヤクシュ属に属する種としては、例えばズダヤクシュ（Tiarella polyphylla Don）等があげられる。
チャルメルソウ属に属する種としては、例えばチャルメルソウ（Mitella japonica Miq.）、コチャルメルソウ（Mitella pauciflora Rosend.）等があげられる。
【００４３】
ウメバチソウ属に属する種としては、例えばウメバチソウ（Parnassia palustris L.）、ヒメウメバチソウ（Parnassia alpicola Makino）、シラヒゲソウ（Parnassia foliosa Hook.f.et Thoms.var. nummularia Nakai）等があげられる。
【００４４】
バイカウツギ属に属する種としては、例えばバイカウツギ（Philadelphus satsumi Sieb.）等があげられる。
【００４５】
ウツギ属に属する種としては、例えばウツギ（Deutzia crenata Sieb.et Zucc.）、マルバウツギ（Deutzia sieboldiana Maxim.）、ヒメウツギ（Deutzia gracilis Sieb.et. Zucc.）、ウラジロウツギ（Deutzia maximowicziana Makino）、ウメウツギ（Deutzia uniflora Shirai）、アオヒメウツギ（Deutzia gracilis Sieb. et Zucc. var. nagurai Makino）等があげられる。
【００４６】
バイカアマチャ属に属する種としては、例えばバイカアマチャ（Platycrater serrata Makino）等があげられる。
アジサイ属に属する種としては、例えばガクアジサイ（Hydrangea macrophylla Seringe）、アジサイ（Hydrangea macrophylla Seringe var. otaksa Makino）、ベニガク（Hydrangea macrophylla Seringe subsp. serrata Makino var. japonica Makino）、ヤマアジサイ（Hydrangea macrophylla Seringe var. acuminata）、アマチャ（Hydrangea macrophylla Seringe var. Thunbergii Makino ）、甘茶（Hydrangeae Dulcis Folium）、ガクウツギ（Hydrangea scandens Seringe）、コアジサイ（Hydrangea hirta Sieb. et Zucc.）、タマアジサイ（Hydrangea involucrata Sieb.）、ヤハズアジサイ（Hydrangea sikokiana Maxim.）、ノリウツギ（Hydrangea paniculata Sieb.）、ツルデマリ（Hydrangea petiolaris Sieb. et Zucc.）、ヒメアジサイ（Hydrangea macrophylla Seringe subsp. serrata Makino var. amoena Makino）、ホソバコガク（Hydrangea macrophylla Seringe subsp. serrata Makino var. angustata Makino）等があげられ、アマチャまたは甘茶が好ましく、甘茶が特に好ましい。
【００４７】
イワガラミ属に属する種としては、例えばイワガラミ（Schizophragma hydrangeoides Sieb. et Zucc.）等があげられる。
【００４８】
クサアジサイ属に属する種としては、例えばクサアジサイ（Cardiandra alternifolia Sieb. et Zucc.）等があげられる。
【００４９】
ギンバイソウ属に属する種としては、例えばギンバイソウ（Deinanthe bifida Maxim.）等があげられる。
【００５０】
ズイナ属に属する種としては、例えばズイナ（Itea japonica Oliver）等があげられる。
【００５１】
スグリ属に属する種としては、例えばスグリ（Ribes sinanense F. Maekawa）、セイヨウスグリ（Ribes grossularia L.）、エゾスグリ（Ribes latifolium Jancz.）、フサスグリ（Ribes rubrum L.）、コマガタケスグリ（Ribes japonicum Maxim.）、トガスグリ（Ribes sachalinense Nakai）、ヤブサンザシ（Ribes fasciculatum Sieb. et Zucc.）、ザリコミ（Ribes alpinum L. var. japonicum Maxim.）、ヤシャビシャク（Ribes ambiguum Maxim.）等があげられる。
【００５２】
キレンゲショウマ属に属する種としては、例えばキレンゲショウマ（Kirengeshoma palmata Yatabe）等があげられる。
【００５３】
本発明の植物体としては、例えば野生の植物体、栽培により得られる植物体または組織培養等の培養により得られる植物体の、例えば、葉、花、枝、茎、果実、根、種子、培養された細胞もしくは器官、カルス等があげられ、これらをそのままあるいは物理・化学的または生物的に処理して得られる各種処理物等があげられる。
【００５４】
物理・化学的処理方法としては、例えば天日乾燥、風乾、凍結乾燥等の乾燥処理、ブレンダー、ホモジュナイザー、ボールミル等による粉砕処理等があげられ、物理・化学的処理物としては、乾燥処理物、凍結乾燥処理物、粉砕処理物等があげられる。生物的処理方法としては、発酵方法等があげられ、生物的処理物としては発酵処理物があげられる。
【００５５】
植物体抽出物としては、前述の植物体より種々の抽出方法により得られる抽出物があげられる。抽出方法としては、例えば各種溶媒抽出、超臨界流体抽出等があげられる。抽出物は沈降分離、ケーキ濾過、清澄濾過、遠心濾過、遠心沈降、圧搾分離、フィルタープレスなどの各種固液分離方法、各種濃縮方法、各種乾燥方法、造粒もしくは粉末化等の製剤化方法、各種精製方法等で処理してもよい。
【００５６】
精製方法としては例えば溶媒分画法、カラムクロマトグラフ法、再結晶法等があげられる。特に、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学社製）、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）等の各種担体を用いたカラムクロマトグラフィー法が好ましい。
濃縮および乾燥方法としては、凍結乾燥、自然乾燥、熱風乾燥、通風乾燥、送風乾燥、噴霧乾燥、減圧乾燥、天日乾燥、真空乾燥、流動層乾燥、泡沫層乾燥、ドラムドライヤーなどの皮膜乾燥法、超音波乾燥、電磁波乾燥等の乾燥方法、好ましくは噴霧乾燥方法、凍結乾燥方法があげられる。
【００５７】
抽出および抽出物の処理に際しては、例えば抗酸化剤や保存剤等を添加することもできる。
溶媒抽出に用いる溶媒としては、本発明の肝機能保護作用または肝機能改善作用を示す物質を抽出できる溶媒なら何を用いてもよく、例えば水、蒸留水、脱イオン水、無機塩水溶液、緩衝液等の水性媒体、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等の一価アルコール、プロピレングリコール、グリセロールなどの多価アルコール、ヘキサン、トルエン、石油エーテル、ベンゼン、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、１，１，２−トリクロロエテン、ジメチルスルフォキシド、アセトン等の有機溶媒等があげられ、水性媒体、アルコールが好ましい。
【００５８】
緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液等があげられる。無機塩水溶液の無機塩としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等があげられる。
アルコールとしては、一価アルコールが好ましく、一価アルコールとしてはエタノールが好ましい。
【００５９】
これら溶媒は単独または複数混合して用いることができる。混合した溶媒としては、含水アルコールが好ましく、含水一価アルコールがより好ましく、含水エタノールが特に好ましい。含水率としては、７０％以下が好ましく、４０％以下がより好ましい。
溶媒としては、超臨界流体化した二酸化炭素を用いることもできる。
【００６０】
抽出は、例えば植物体１重量部に対し溶媒０．１重量部〜１００００重量部、好ましくは１重量部〜１００重量部用いて行う。抽出温度は特に制限が無いが、０℃〜１００℃が好ましく、２０℃〜９０℃がより好ましい。抽出時間は、特に制限が無いが、１分間〜１週間が好ましく、３０分間〜１日間がより好ましい。特に、ユキノシタ科植物からの抽出方法としては、前述のユキノシタ植物体、前述のユキノシタ植物体の物理・化学的処理物、前述の生物的処理物を水性媒体で抽出した残さをアルコールもしくは含水アルコールで抽出する方法が好ましい。
【００６１】
水性媒体としては、特に制限がないが、水、純水、脱イオン水が好ましい。水性媒体およびアルコールもしくは含水アルコールで抽出するときの抽出温度は特に制限がないが、０℃〜１００℃が好ましく、２０℃〜９０℃がより好ましい。抽出時間は、特に制限が無いが、１分間〜１週間が好ましく、３０分間〜１日間がより好ましい。またユキノシタ植物体としては、乾燥処理または発酵処理されたものを用いるのが好ましい。
【００６２】
抽出に使用する機器としては特に制限が無いが、効率よく抽出するために工夫された容器、攪拌機、還流冷却器、ソックスレー抽出機、ホモジナイザー、振とう機、超音波発生装置等などがあげられる。
本発明の肝機能保護剤または改善剤は、前述の方法で調製したユキノシタ科植物体または該抽出物を含有し、必要に応じて薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体、更に必要に応じて他の治療のための有効成分を含有していてもよい。
【００６３】
本医薬製剤は、ユキノシタ科植物体または該抽出物を必要に応じ担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。
製剤の投与形態は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与または、例えば静脈内、腹膜内もしくは皮下投与などの非経口投与をあげることができる。これらのうち、経口投与が好ましい。
【００６４】
投与する剤形としては、錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、浸剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、液剤、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤、流エキス剤等があげられる。
経口投与に適当な、例えばエキス剤、チンキ剤、流エキス剤などは、ユキノシタ科植物体の、例えば水、エタノール、水とエタノールの混合液など抽出された抽出物をそのまま、または濃縮して調製することができる。
【００６５】
経口投与に適当な、例えばシロップ剤のような液体調製物は、水、蔗糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、パラオキシ安息香酸メチル等のパラオキシ安息香酸誘導体、安息香酸ナトリウム等の保存剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などの担体を使用して製造できる。
【００６６】
また、経口投与に適当な、例えば錠剤、散剤および顆粒剤などは、乳糖、白糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニトール、ソルビトール等の糖類、バレイショ、コムギ、トウモロコシ等の澱粉、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム等の無機物、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末などの植物末などの賦形剤、澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、カルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール、シリコーン油などの滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルメロース、ゼラチン、澱粉のり液などの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造できる。
【００６７】
非経口投与に適当な例えば注射剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体などを用いて注射用の溶液を調製する。
また、これら非経口剤においても、前述の防腐剤、保存剤、界面活性剤等が使用できる。
【００６８】
本発明の、肝機能保護剤または改善剤の投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度により異なるが、特に制限はなく、通常経口の場合、成人一人当りユキノシタ科植物体乾燥重量または該植物体抽出物乾燥重量として、一回当たり０．０１ｍｇ〜５０ｇ、好ましくは０．０５ｍｇ〜１０ｇを一日一回ないし数回投与する。静脈内投与などの非経口投与の場合、成人一人当りユキノシタ科植物体乾燥重量または該植物体抽出物乾燥重量として、１回当たり０．００１ｍｇ〜５０ｇ、好ましくは０．０１ｍｇ〜１０ｇを一日一回ないし数回投与する。また、動物に投与する場合、動物の年齢、種類、症状の性質もしくは重篤度により異なるが、特に制限はなく、体重１Ｋｇ１回当たり、０．１μｇ〜１０ｇ、好ましくは１μｇ〜１ｇを一日一回ないし数回投与する。また、静脈内投与などの非経口投与の場合、体重１Ｋｇ１回当たり０．０１μｇ〜１０ｇ、好ましくは１μｇ〜１ｇを一日一回ないし数回投与する。しかしながら、これら投与量および投与回数に関しては、前述の種々の条件により変動する。
【００６９】
ユキノシタ科植物体または該植物体抽出物を添加してなる肝機能保護作用または改善作用を有する飲食品または飼料としては、飲食品または飼料に本発明のユキノシタ科植物体または該植物体抽出物を添加し、一般の飲食品または飼料の製造方法で製造されたものがあげられる。また、飲食品または飼料は、一般の飲食品または飼料を、例えば成形・造粒方法で加工してもよい。成形・造粒方法としては流動層造粒、攪拌造粒、押し出し造粒、転動造粒、気流造粒、圧縮成形造粒、解砕造粒、噴霧造粒、噴射造粒、などの造粒方法、パンコーティング、流動層コーティング、ドライコーティング、などのコーティング方法、パフドライ、過剰水蒸気法、フォームマット方法、マイクロ波加熱方法などの膨化方法、押出造粒機やエキストルーダーなどの押出方法などがあげられる。
【００７０】
ユキノシタ科植物体または該植物体抽出物を有効成分として含有することを特徴とする肝機能保護または改善用飲食品または飼料としては、ユキノシタ科植物体または該植物体抽出物をそのまま飲食品または飼料として用いることができる。またユキノシタ科植物体または該植物体抽出物を飲食品もしくは飼料またはそれらの原料に添加して得られる飲食品または飼料を用いることができる。
【００７１】
ユキノシタ科植物体または該植物体抽出物を添加する飲食品もしくは飼料またはそれらの原料としては、特に制限が無く、ユキノシタ科植物体または該植物体抽出物を含有しているものでも、ユキノシタ科植物体または該植物体抽出物を実質的に含有していないものでもよい。
ユキノシタ科植物体または該植物体抽出物を含有している飲食品または飼料に、ユキノシタ科植物体または該植物体抽出物を添加することにより、該飲食品または飼料の肝機能保護作用または改善作用を増大させることができる。
【００７２】
飲食品または飼料に添加する本発明のユキノシタ科植物体または該植物体抽出物の添加量としては、飲食品または飼料が肝機能保護作用または改善作用を示す濃度とすることができる量で有れば特に制限はないが、例えばユキノシタ科植物体乾燥重量または該植物体抽出物乾燥重量として、０．００１〜１００％、好ましくは０．０１〜１００％、より好ましくは０．１〜１００％含有するように添加される。
【００７３】
ユキノシタ科植物体または該植物体抽出物を添加する具体的な飲食品としては、例えばユキノシタ科植物体または該植物体抽出物を添加されたジュース類、清涼飲料水、スープ類、茶類、乳酸菌飲料、発酵乳、冷菓、バター、チーズ、ヨーグルト、加工乳、脱脂粉乳等の乳製品、ハム、ソーセージ、ハンバーグ等の畜肉製品、魚肉錬り製品、だし巻き、卵豆腐等の卵製品、クッキー、ゼリー、スナック菓子、チュウーインガム等の菓子類、パン類、麺類、漬け物類、燻製品、干物、佃煮、調味料等があげられる。
【００７４】
飲食品の形態としては、例えば粉末食品、シート状食品、瓶詰め食品、缶詰食品、レトルト食品、カプセル食品、タブレット状食品、流動食品、ドリンク剤等があげられる。
本発明の飲食品は、健康飲食品、機能性飲食品として、肝機能保護または改善のために使用される。
【００７５】
本発明のユキノシタ科植物体または該植物体抽出物を有効成分として含有する肝機能保護作用または改善作用を有する飲食品を摂取する場合、その摂取量は特に制限がないが、成人に対し一日あたりユキノシタ科植物体乾燥重量または該植物体抽出物乾燥重量として、０．１ｇ〜５０ｇ、好ましくは０．５〜１０ｇである。この摂取量を１日〜１年、好ましくは２週間〜３ヶ月、摂取し続ける。但し、この摂取量はあくまでも目安であり、摂取者の症状の程度や年齢、体重等に応じて適宜好適な範囲に調整することができる。
【００７６】
本発明の飼料としては、飼料原料にユキノシタ科植物体または該植物体抽出物を添加して得られる飼料があげられる。
本発明の飼料としては、ほ乳類、鳥類、は虫類、両生類、魚類等の動物に対して、肝機能保護作用または改善作用を有する飼料で有ればいずれでもよく、例えば、イヌ、ネコ、ネズミ等のペット用飼料、ウシ、ブタ等の家畜用飼料、ニワトリ、七面鳥等の家禽用飼料、タイ、ハマチ等の養殖魚用飼料等があげられる。
【００７７】
本発明の飼料は、飼料原料にユキノシタ科植物体または該植物体抽出物を適宜配合して作ることができる。飼料原料としては、穀物類、糟糠類、植物性油かす類、動物性飼料原料、その他の飼料原料、精製品等があげられる。
穀物としては、例えばマイロ、小麦、大麦、えん麦、らい麦、玄米、そば、あわ、きび、ひえ、とうもろこし、大豆等があげられる。
【００７８】
糟糠類としては、例えば米ぬか、脱脂米ぬか、ふすま、末粉、小麦胚芽、麦ぬか、ペレット、トウモロコシぬか、トウモロコシ胚芽等があげられる。
植物性油かす類としては、例えば大豆油かす、きな粉、あまに油かす、綿実油かす、落花生油かす、サフラワー油かす、やし油かす、パーム油かす、ごま油かす、ひまわり油かす、なたね油かす、カポック油かす、からし油かす等があげられる。
【００７９】
動物性飼料原料としては、例えば魚粉（北洋ミール、輸入ミール、ホールミール、沿岸ミール）、フィッシュソルブル、肉粉、肉骨粉、血粉、分解毛、骨粉、家畜用処理副産物、フェザーミール、蚕よう、脱脂粉乳、カゼイン、乾燥ホエー等があげられる。
その他の飼料原料としては、植物茎葉類（アルファルファ、ヘイキューブ、アルファルファリーフミール、ニセアカシア粉末等）、トウモロコシ加工工業副産物（コーングルテン、ミール、コーングルテンフィード、コーンステープリカー等）、でんぷん加工品（でんぷん等）、砂糖、発酵工業産物（酵母、ビールかす、麦芽根、アルコールかす、しょう油かす等）、農産製造副産物（柑橘加工かす、豆腐かす、コーヒーかす、ココアかす等）、その他（キャッサバ、そら豆、グアミール、海藻、オキアミ、スピルリナ、クロレラ、鉱物等）等があげられる。
【００８０】
精製品としては、タンパク質（カゼイン、アルブミン等）、アミノ酸、糖質（スターチ、セルロース、しょ糖、グルコース等）、ミネラル、ビタミン等があげられる。
本発明によるユキノシタ科植物体または該抽出物を有効成分として含有する肝機能保護作用または肝機能改善作用を含有する飼料を動物に摂取させる場合、その摂取量は特に制限がないが、動物の体重１ｋｇあたり、一日あたりユキノシタ科植物体乾燥重量または該植物体抽出物乾燥重量として、０．１ｍｇ〜５０ｇ、好ましくは０．５ｍｇ〜１０ｇである。この摂取量を１日〜１年、好ましくは２週間〜３ヶ月、摂取し続ける。但し、この摂取量はあくまでも目安であり、摂取動物の種類、年齢、体重等に応じて適宜好適な範囲に調整することができる。
【００８１】
ユキノシタ科植物体または該植物体抽出物を有効成分として含有することを特徴とする肝機能保護作用または改善作用を有する飲食品用添加剤または飼料用添加剤は、前述の方法で調製したユキノシタ科植物体または該植物体抽出物を有効成分として含有し、必要に応じて一般に飲食品または飼料に用いられる添加剤、例えば食品添加物表示ハンドブック（日本食品添加物協会、平成９年１月６日発行）に記載されている甘味料、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防かび剤、ガムベース、苦味料、酵素、光沢剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、香料、香辛料抽出物などの添加剤を添加してもよい。また、前述の医薬製剤に例示した担体を添加してもよい。
【００８２】
甘味料としてはアスパルテーム、カンゾウ、ステビア、キシロース、ラカンカ、などがあげられる。
着色料としては、カロチノイド、ウコン色素、フラボノイド、カラメル色素、シコン色素、スピルリナ色素、葉緑素、ムラサキイモ色素、ムラサキヤマイモ色素、シソ色素、ブルーベリー色素などがあげられる。
【００８３】
保存料としては、亜硫酸ナトリウム、安息香酸類、ウド抽出物、エゴノキ抽出物、カワラヨモギ抽出物、ソルビン酸類、プロピオン酸類などがあげられる。
増粘安定剤としては、アラビアガムやキサンタンガムなどのガム類、アルギン酸類、キチン、キトサン、キダチアロエ抽出物、グァーガム、ヒドロキシプロピルセルロース、カゼインナトリウム、コーンスターチ、カルボキシメチルセルロース類、ゼラチン、寒天、デキストリン、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、微小繊維状セルロース、微結晶セルロース、海藻セルロース、ポリアクリル酸ソーダ、ポリリン酸ナトリウム、カラギーナン、酵母細胞壁、コンニャクイモ抽出物、ナタデココ、マンナンなどがあげられる。
【００８４】
酸化防止剤としては、ビタミンＣ、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸カルシウム、エリソルビン酸、オリザノール、カテキン、ケルセチン、クローブ抽出物、酵素処理ルチン、リンゴ抽出物、ゴマ油抽出物、ジブチルヒドロキシトルエン、ウイキョウ抽出物、セイヨウワサビ抽出物、セリ抽出物、チャ抽出物、テンペ抽出物、ドクダミ抽出物、トコトリエノール、トコフェロール類、ナタネ油抽出物、生コーヒー豆抽出物、ヒマワリ種子、フェルラ酸、ブチルヒドロキシアニソール、ブルーベリー葉抽出物、プロポリス抽出物、ヘゴ・イチョウ抽出物、ヘスペレチン、コショウ抽出物、ホウセンカ抽出物、没食子酸、ヤマモモ抽出物、ユーカリ抽出物、ローズマリー抽出物などがあげられる。
【００８５】
発色剤としては亜硝酸ナトリウムなど、漂白剤としては亜硫酸ナトリウムなどがあげられる。
防かび剤としてはオルトフェニルフェノールなどがあげられる。
ガムベースとしては、アセチルリシノール酸メチル、ウルシロウ、エステルガム、エレミ樹脂、オウリキュウリロウ、オゾケライト、オポパナックス樹脂、カウリガム、カルナウバロウ、グアヤク樹脂、グッタカチュウ、グッタハンカン、グッタペルカ、グリセリン脂肪酸エスエル、ゲイロウ、コパオババルサム、コーパル樹脂、ゴム、コメヌカロウ、サトウキビロウ、シェラック、ジェルトン、しょ糖脂肪酸エステル、ソルバ、ソルビタン脂肪酸エステル、タルク、炭酸カルシウム、ダンマル樹脂、チクル、チルテ、ツヌー、低分子ゴム、パラフィンワックス、ファーバルサム、プロピレングリコール脂肪酸エステル、粉末パルプ、粉末モミガラ、ホホバロウ、ポリイソブチレン、ポリブテン、マイクロクリスタルワックス、マスチック、マッサランドバチョコレート、ミツロウ、りん酸カルシウムなどがあげられる。
【００８６】
苦味料としては、イソアルファー苦味酸、カフェイン、カワラタケ抽出物、キナ抽出物、キハダ抽出物、ゲンチアナ抽出物、香辛料抽出物、酵素処理ナリンジン、ジャマイカカッシア抽出物、テオブロミン、ナリンジン、ニガキ抽出物、ニガヨモギ抽出物、ヒキオコシ抽出物、ヒメマツタケ抽出物、ボラペット、メチルチオアデノシン、レイシ抽出物、オリーブ茶、ダイダイ抽出物、ホップ抽出物、ヨモギ抽出物、などがあげられる。
【００８７】
酵素または酵素源としてはアミラーゼ、トリプシン、レンネット、乳酸菌などがあげられる。
光沢剤としてはウルシロウ、モクロウなどがあげられる。
酸味料としてはアジピン酸、イタコン酸、クエン酸類、コハク酸類、酢酸ナトリウム、酒石酸類、二酸化炭素、乳酸、フィチン酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸などがあげられる。
【００８８】
調味料としてはアスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、アラニン、イソロイシン、グリシン、セリン、シスチン、チロシン、ロイシン、プロリンなどのアミノ酸、イノシン酸ナトリウム、ウリジル酸ナトリウム、グアニル酸ナトリウム、シチジル酸ナトリウム、リボヌクレオチドカルシウム、リボヌクレオチドナトリウムなどの核酸、クエン酸、コハク酸などの有機酸、塩化カリウム、塩水湖水低塩ナトリウム液、粗製海水塩化カリウム、ホエイソルト、りん酸三カリウム、りん酸水素ニカリウム、りん酸ニ水素カリウム、りん酸水素ニナトリウム、りん酸ニ水素ナトリウム、りん酸三ナトリウム、クロレラ抽出物などがあげられる。
【００８９】
強化剤としては亜鉛塩類、ビタミンＣ、各種アミノ酸、５−アデニル酸、塩化鉄、ヘスペリジン、各種焼成カルシウム、各種未焼成カルシウム、ジベンゾイルチアミン、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、チアミン塩酸塩、デュナリエラカロチン、トコフェロール、ニコチン酸、ニンジンカロチン、パーム油カロチン、パントテン酸カルシウム、ビタミンＡ、ヒドロキシプロリン、ピロリン酸ニ水素カルシウム、ピロリン酸第一鉄、ピロリン酸第二鉄、フェリチン、ヘム鉄、メナキノン、葉酸、リボフラビンなどがあげられる。
【００９０】
製造用剤としてはアセトンやイオン交換樹脂などの加工助剤、イチジク葉抽出物、イナワラ灰抽出物、カオリン、グリセリン脂肪酸エステル、クワ抽出物、骨灰、シソ抽出物、ショウガ抽出物、各種タンニン、ファフィア色素、ブドウ種子抽出物、エタノールなどがあげられる。
なお、これら各種添加剤は、前述の肝機能保護剤または改善剤、並びに肝機能保護作用または改善作用を有する飲食品または飼料に添加して用いることもできる。
【００９１】
本発明でいう肝機能とは、肝臓の有する機能をすべて意味しており特に制限はない。具体的な肝機能としては、例えば血液貯蔵（循環量の調整等）、血色素の処理（ヘモグロビンの処理排出等）、胆汁の生成、胆汁色素の腸肝循環、血漿タンパク質（急性期タンパク質、アルブミン、血液凝固因子、ステロイド結合タンパク質、他のホルモン結合タンパク質等）の合成等の血液と循環における機能、栄養素とビタミン（グルコースと他の糖類、アミノ酸、脂質もしくは脂肪酸、コレステロール、リポタンパク、脂溶性ビタミン、水溶性ビタミン等）の代謝等の栄養素の代謝機能、種々の物質（毒素、エストロゲンやアンドロステロンなどのステロイド、他のホルモン等）の不活性化等の解毒または分解機能、および免疫機能等［「生理学展望」、原書１９版（平成１２年３月３１日）、「新しい臨床栄養学」改訂第３版(２０００年５月２０日）］があげられる。これら機能はいずれもアルコールにより障害を受けるものである。
【００９２】
次に、スクリーニングすべき物質を動物に投与することにより、アルコールを投与した後のリポ多糖の投与により上昇する動物の血液中のＧＰＴまたはＧＯＴ値を低下させる物質を選択することを特徴とする肝機能保護剤または改善剤のスクリーニング方法について述べる。
スクリーニングに使用する動物としては、アルコールを投与した後、リポ多糖を投与することにより、血中のＧＰＴまたはＧＯＴ値が上昇する動物で有れば特に制限はないが、例えばマウス、ラット、ウサギ、犬、ネコ等のほ乳類があげられる。
【００９３】
スクリーニングすべき物質は、経餌投与、経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等により動物に投与できるが、経餌投与または経口投与が好ましい。スクリーニングすべき物質の投与は、動物に自由投与しても、また一定時間ごとに投与してもよい。例えば飼料にスクリーニングすべき物質を混合し、または飼料とは別に、１時間〜３６０日間、好ましくは１日〜２ヶ月間、さらに好ましくは３日間〜１５日間、１日１回〜３回投与する。
【００９４】
動物へのアルコール投与は、例えば経口投与、静脈内投与等により動物に投与できるが、経口投与が好ましい。アルコールを投与する時期は、動物にスクリーニングすべき物質を投与する前、投与と平行してまたは投与後のいずれでもよいが、スクリーニングすべき物質を投与した後に行うのが好ましい。
投与するアルコールの量は、動物の体重あたり、２〜１０ｇ／ｋｇ、好ましくは３〜５ｇ／ｋｇである。投与はゾンデ等を用いるのが好ましい。アルコールの投与は、例えば、１〜３６０回、好ましくは１〜１０回行うことができる。期間としては、例えば１時間〜３６０日間、好ましくは１日〜２ヶ月間、さらに好ましくは３日間〜１５日間飼育して行うことができる。アルコール投与後、１〜２４時間後、好ましくは３〜９時間後、特に好ましくは６時間後にリポ多糖を動物の体重１ｋｇあたり、０．１５〜１５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは３〜６ｍｇ／ｋｇを静脈注射し、１２〜３６時間後、好ましくは２０〜２８時間後に血中のＧＰＴまたはＧＯＴ値を定量する。スクリーニングすべき物質を与えないときに、アルコールを投与した後のリポ多糖の投与により上昇する動物の血液中のＧＰＴまたはＧＯＴ値と比較し、スクリーニングすべき物質を与えた時のＧＰＴまたはＧＯＴ値を低下させる物質を選択することにより肝機能の保護または改善剤のスクリーニングを行うことができる。
【００９５】
リポ多糖としては、例えばグラム陰性菌から公知の方法で抽出されるものなどがあげられる。グラム陰性菌としては、例えばロドシュードモナス属などの光合成細菌、シュードモナス属細菌、エシェリヒア属、サルモネラ属などの腸内細菌群、ニトロバクター属、チオバシルス属などの化学無機栄養細菌、ナイセリア属等のメタン生成細菌等があげられる。これらのリポ多糖のなかでも、腸内細菌群に属する微生物由来のものが好ましく、エシェリヒア属に属する微生物由来のものが特に好ましい。
【００９６】
本スクリーニング方法により、アルコール性肝障害の予防または治療剤が好適にスクリーニングできる。
ＧＰＴおよびＧＯＴ値の定量方法としては、ＧＰＴまたはＧＯＴ値が定量できれば特に制限がない。ＧＰＴ値の定量は、例えば２−オキソグルタミン酸とアラニンから生成するピルビン酸を定量することにより行うことができる。ピルビン酸の定量は例えば、乳酸デヒドロゲナーゼとＮＡＤＨを共存させピルビン酸の還元にともなう３４０ｎｍの吸光度の減少量を定量することにより行うことができる。
【００９７】
ＧＯＴ値の定量は、例えばアスパラギン酸と２−オキソグルタル酸から生成するオキサロ酢酸を定量することにより行うことができる。オキサロ酢酸の定量は、例えばリンゴ酸デヒドロゲナーとＮＡＤＨを共存させオキサロ酢酸の還元に伴う３４０ｎｍの吸光度の減少量を定量することにより行うことができる。
本発明では、スクリーニングすべき物質を投与しない場合に認められる、アルコールを投与した後のリポ多糖の投与により上昇する動物の血液中のＧＰＴまたはＧＯＴ値を有意に低下させる物質を選択することにより、肝機能の保護・増強・改善剤またはアルコール性肝障害の予防もしくは治療剤が選択できる。
【００９８】
以下実施例に基づいて本発明を詳述する。ただし、下記実施例は本発明を制限するものではない。
【００９９】
なお、下記の実施例に使用した物質は下記のものを使用した。
甘茶粉末（志平商店社製）、ユキノシタ粉末（志平商店社製）、Ｄ−ガラクトサミン（和光純薬工業社製）、コラゲナーゼ（シグマ社製）、アセトアミノフェン（和光純薬工業社製）、ペニシリン（ギブコ社製）、ストレプトマイシン（ギブコ社製）、ＤＭＳＯ（和光純薬工業社製）、インシュリン（和光純薬工業社製）、デキサメタソン（和光純薬工業社製）、ＴＮＦ−α（和光純薬工業社製）、ワイマウスのＭＢ７５２／１（Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓＭＢ７５２／１、ギブコ社製）、ＦＢＳ（ギブコ社製）、パインデックス＃３（松谷化学工業社製）、ピロリン酸第二鉄（国産化学社製）。
【０１００】
【実施例】
実施例１ 甘茶の水エキスの凍結乾燥粉末の製造
乾燥した甘茶の粉末（志平商店社製）１ｋｇを蒸留水１０リットルで２回抽出し（室温、１時間攪拌）、得られた抽出液を濃縮後、凍結乾燥することにより、甘茶の水エキスの凍結乾燥粉末２００ｇを得た。
【０１０１】
実施例２ 甘茶の６０％エタノール水溶液エキスの凍結乾燥粉末の製造
乾燥した甘茶の粉末１ｋｇを６０％エタノール水溶液１０リットルで２回抽出し（室温、１時間攪拌）、得られた抽出液を濃縮後、凍結乾燥することにより、甘茶の６０％エタノール水溶液エキスの凍結乾燥粉末２００ｇを得た。
【０１０２】
実施例３ 甘茶のアセトンエキスの凍結乾燥粉末の製造
乾燥した甘茶の粉末１ｋｇをアセトン１０リットルで２回抽出し（室温、１時間攪拌）、得られた抽出液を濃縮後、凍結乾燥することにより、甘茶のアセトンエキスの凍結乾燥粉末１００ｇを得た。
【０１０３】
実施例４ 甘茶の熱水エキスの凍結乾燥粉末の製造
乾燥した甘茶の粉末１ｋｇを沸騰した蒸留水１０リットルで抽出し（３０分間放置）、得られた抽出液を濃縮後、凍結乾燥することにより甘茶の熱水エキスの凍結乾燥粉末１３０ｇを得た。
【０１０４】
実施例５ 甘茶の水抽出残さエタノールエキスの凍結乾燥粉末の製造
乾燥した甘茶の粉末１ｋｇを蒸留水２０リットルで、１／２００希釈液の３１３ｎｍの吸光度が０．１５になるまで、抽出（４０℃、攪拌）した。濾過により濾液を除去して抽出残さを得た。該残さを６０％エタノール２０リットルで、１／２００希釈液の３１３ｎｍの吸光度が０．２２になるまで、抽出した（４０℃、攪拌）。該抽出液を濃縮後、凍結乾燥することにより、甘茶の水抽出残さエタノールエキスの凍結乾燥粉末７０ｇ（対乾葉収量７％）を得た。
【０１０５】
実施例６ 甘茶の水抽出残さアセトンエキスの凍結乾燥粉末の製造
乾燥した甘茶の粉末１ｋｇを蒸留水２０リットルで、１／２００希釈液の３１３ｎｍの吸光度が０．１５になるまで、抽出（４０℃、攪拌）した。濾過により濾液を除去して抽出残さを得た。該残さをアセトン２０リットルで、１／２００希釈液の３１３ｎｍの吸光度が０．２２になるまで、抽出した（４０℃、攪拌）。該抽出液を濃縮後、凍結乾燥することにより、甘茶の水抽出残さアセトンエキスの凍結乾燥粉末６０ｇ（対乾葉収量６％）を得た。
【０１０６】
実施例７ 実施例１の凍結乾燥粉末３％を含有する飼料の製造
下記組成を有する飼料を各成分を混合することにより製造した。
【０１０７】
スクロース（キシダ化学社製） ２０．０重量％
コーンオイル（ナカライテスク社製） ５．０重量％
重酒石酸コリン（東京化成社工業製） ０．４重量％
コーンスターチ（日澱化学社製） ３７．１重量％
ＡＩＮ−７６ビタミン（オリエンタル酵母社製） １．０重量％
ＡＩＮ−７６ミネラル（オリエンタル酵母社製） ３．５重量％
セルロース（オリエンタル酵母社製） ５．０重量％
カゼイン（和光純薬社工業製） ２５．０重量％
実施例１で製造した粉末 ３．０重量％
【０１０８】
実施例８ 実施例２の凍結乾燥粉末３％を含有する飼料の製造
下記組成を有する飼料を各成分を混合することにより製造した。。
【０１０９】
スクロース（キシダ化学社製） ２０．０重量％
コーンオイル（ナカライテスク社製） ５．０重量％
重酒石酸コリン（東京化成社工業製） ０．４重量％
コーンスターチ（日澱化学社製） ３７．１重量％
ＡＩＮ−７６ビタミン（オリエンタル酵母社製） １．０重量％
ＡＩＮ−７６ミネラル（オリエンタル酵母社製） ３．５重量％
セルロース（オリエンタル酵母社製） ５．０重量％
カゼイン（和光純薬社工業製） ２５．０重量％
実施例２で製造した粉末 ３．０重量％
【０１１０】
実施例９ 実施例４の凍結乾燥粉末３％を含有する飼料の製造
下記組成を有する飼料を各成分を混合することにより製造した。。
【０１１１】
スクロース（キシダ化学社製） ２０．０重量％
コーンオイル（ナカライテスク社製） ５．０重量％
重酒石酸コリン（東京化成社工業製） ０．４重量％
コーンスターチ（日澱化学社製） ３７．１重量％
ＡＩＮ−７６ビタミン（オリエンタル酵母社製） １．０重量％
ＡＩＮ−７６ミネラル（オリエンタル酵母社製） ３．５重量％
セルロース（オリエンタル酵母社製） ５．０重量％
カゼイン（和光純薬社工業製） ２５．０重量％
実施例４で製造した粉末 ３．０重量％
【０１１２】
実施例１０ 実施例５の凍結乾燥粉末１％を含有する飼料の製造
下記組成を有する飼料を各成分を混合することにより製造した。
【０１１３】
スクロース（キシダ化学社製） ２０．０重量％
コーンオイル（ナカライテスク社製） ５．０重量％
重酒石酸コリン（東京化成社工業製） ０．４重量％
コーンスターチ（日澱化学社製） ３９．１重量％
ＡＩＮ−７６ビタミン（オリエンタル酵母社製） １．０重量％
ＡＩＮ−７６ミネラル（オリエンタル酵母社製） ３．５重量％
セルロース（オリエンタル酵母社製） ５．０重量％
カゼイン（和光純薬社工業製） ２５．０重量％
実施例５で製造した粉末 １．０重量％
【０１１４】
比較例１
下記組成を有する飼料を各成分を混合することにより製造した。
【０１１５】
スクロース（キシダ化学社製） ２０．０重量％
コーンオイル（ナカライテスク社製） ５．０重量％
重酒石酸コリン（東京化成社工業製） ０．４重量％
コーンスターチ（日澱化学社製） ４０．１重量％
ＡＩＮ−７６ビタミン（オリエンタル酵母社製） １．０重量％
ＡＩＮ−７６ミネラル（オリエンタル酵母社製） ３．５重量％
セルロース（オリエンタル酵母社製） ５．０重量％
カゼイン（和光純薬社工業製） ２５．０重量％
【０１１６】
実施例１１
実施例１で製造して得られた凍結乾燥粉末５ｇを水５００ｍｌで懸濁した。該懸濁液を疎水性吸着レジン（三菱化学社製、ダイヤイオンＨＰ−２０、ボイドボリューム１００ｍｌ）を充填したカラムに通塔した。ついで２５０ｍｌの３３％メタノールで溶出し、さらに２５０ｍｌの３３％メタノールで溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（３）を得た。該カラムを２５０ｍｌの６６％メタノールで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（４）を得た。さらに、２５０ｍｌの６６％メタノールで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（５）を得た。該カラムを２５０ｍｌの１００％メタノールで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（６）を得た。さらに、２５０ｍｌの１００％メタノールで溶出し、ついで２５０ｍｌの１００％アセトンで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（８）を得た。ついで、２５０ｍｌの１００％アセトンで溶出し溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（９）を得た。
【０１１７】
実施例１２
実施例４で製造して得られた凍結乾燥粉末５ｇを水５００ｍｌで懸濁した。該懸濁液を疎水性吸着レジン（三菱化学社製、ダイヤイオンＨＰ−２０、ボイドボリューム１００ｍｌ）を充填したカラムに通塔した。ついで２５０ｍｌの３３％メタノールで溶出し、さらに２５０ｍｌの３３％メタノールで溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（３）を得た。該カラムを２５０ｍｌの６６％メタノールで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（４）を得た。さらに、２５０ｍｌの６６％メタノールで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（５）を得た。該カラムを２５０ｍｌの１００％メタノールで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（６）を得た。さらに、２５０ｍｌの１００％メタノールで溶出し、ついで２５０ｍｌの１００％アセトンで溶出し溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（８）を得た。ついで、２５０ｍｌの１００％アセトンで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（９）を得た。
【０１１８】
実施例１３
実施例２で製造して得られた凍結乾燥粉末５ｇを水５００ｍｌで懸濁した。該懸濁液を疎水性吸着レジン（三菱化学社製、ダイヤイオンＨＰ−２０、ボイドボリューム１００ｍｌ）を充填したカラムに通塔した。ついで２５０ｍｌの３３％メタノールで溶出し、さらに２５０ｍｌの３３％メタノールで溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（３）を得た。該カラムを２５０ｍｌの６６％メタノールで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（４）を得た。さらに、２５０ｍｌの６６％メタノールで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（５）を得た。該カラムを２５０ｍｌの１００％メタノールで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（６）を得た。さらに、２５０ｍｌの１００％メタノールで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（７）を得た。ついで２５０ｍｌの１００％アセトンで溶出しついで、２５０ｍｌの１００％アセトンで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（９）を得た。
【０１１９】
実施例１４
実施例５で製造して得られた凍結乾燥粉末５ｇを水５００ｍｌで懸濁した。該懸濁液を疎水性吸着レジン（三菱化学社製、ダイヤイオンＨＰ−２０、ボイドボリューム１００ｍｌ）を充填したカラムに通塔した。ついで２５０ｍｌの３３％メタノールで溶出し、さらに２５０ｍｌの３３％メタノールで溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（３）を得た。該カラムを２５０ｍｌの６６％メタノールで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（４）を得た。さらに、２５０ｍｌの６６％メタノールで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（５）を得た。該カラムを２５０ｍｌの１００％メタノールで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（６）を得た。さらに、２５０ｍｌの１００％メタノールで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（７）を得た。ついで２５０ｍｌの１００％アセトンで溶出しついで、２５０ｍｌの１００％アセトンで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（９）を得た。
【０１２０】
実施例１５
実施例３で製造して得られたアセトンエキスの凍結乾燥粉末５ｇを水５００ｍｌで懸濁した。該懸濁液を疎水性吸着レジン（三菱化学社製、ダイヤイオンＨＰ−２０、ボイドボリューム１００ｍｌ）を充填したカラムに通塔した。ついで２５０ｍｌの３３％メタノールで２回洗浄した。ついで２５０ｍｌの６６％メタノールで２回洗浄した。さらに、２５０ｍｌの６６％メタノールで２回洗浄した。ついで２５０ｍｌの１００％メタノールで洗浄した後、２５０ｍｌの１００％アセトンで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（８）を得た。
【０１２１】
実施例１６ 甘茶各種エキスによるＤ−ガラクトサミン誘導ラット肝障害の抑制日本ＳＬＣ社から購入したウイスター（Ｗｉｓｔａｒ）系白色ラット（雄、１５０±２０ｇ）を一定条件下（温度：２４±２℃、湿度：６０±５％、明暗周期：１２時間）で３日間以上順応させた後、実施例７〜１０で製造した飼料（試験群）および比較例１で製造した飼料（対照群）をそれぞれ計１５日間にわたって摂食させた。１４日目に、Ｄ−ガラクトサミン（３５ｍｇ／ｍｌの濃度で生理食塩水に溶解し、ｐＨ７．１に調製したもの）３５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内に投与した。Ｄ−ガラクトサミンを投与してから２２時間後に、ネンブタールによる麻酔下で開腹し採血した。
【０１２２】
この様にして得られた血液を用い、肝機能の指標として、血液中のＧＰＴの活性を、以下の方法で測定した。採取した血液を凝固させた後、遠心分離し、血清を得た。得られた血清を用い、トランスアミナーゼＣII−テストワコー（和光純薬工業社製）を用いて、血清中のＧＰＴを測定した。ＧＰＴ活性は、対照群の値を１００％として、各実施例の飼料（試験群）で得られる値の相対値（％）を計算して求めた。値は平均値±標準誤差で示し、統計学的な有意差検定はＴ−テストによって行った。
【０１２３】
結果を第１表に示す。
【０１２４】
【表１】

【０１２５】
実施例７〜１０の飼料を投与した場合、比較例の飼料を投与した場合に比べ肝機能障害の指標である血清中のＧＰＴ活性は、１４．３％〜４９．８％と低く押さえられ、肝障害が抑制されることが判る。また、実施例１０の飼料は、ＧＰＴ活性が１４．３％となったことから、実施例５で製造した甘茶水抽出残さエタノールエキスに強い肝障害抑制作用が有ることが判る。
【０１２６】
なお、１５日間の摂食期間中、いずれの飼料を与えた場合でも体重増加に違いは認められず、外見上、および行動上の異常も認められなかった。
【０１２７】
実施例１７ 甘茶アセトンエキス分画物によるアセトアミノフェン誘導初代培養肝細胞障害の抑制
コラゲナーゼ灌流法［セグレン（Seglen,P.O.）、メソド・イン・セル・バイオロジー（Methods in Cell Biology），１３，２９（１９７６）］に基づいてラットの肝細胞を分離した。即ち、体重約１３０ｇのオスのＳＤラットを麻酔下で開腹し、３７℃に保温した前灌流液［ハンクの等張液（Hanks' Balanced Salt Solution、ギブコ社製）９．５ｇ、ＨＥＰＥＳ（ナカライテスク社製）２．３８ｇ、ＥＧＴＡ（シグマ社製）０．１９ｇ、ＮａＨＣＯ₃（キシダ化学社製）０．３５ｇを１Ｌの水に溶解し、ｐＨ７．２に調整したもの］を門脈より３０ｍｌ／分の流速で４００ｍｌ灌流した。次に３７℃に保温したコラゲナーゼ溶液［ハンクス液ニッスイ▲１▼（日水製薬社製）９．８ｇ、ＨＥＰＥＳ（ナカライテスク社製）２．３８ｇ、ＮａＨＣＯ₃（キシダ化学社製）０．３５ｇ、ＣａＣｌ₂（キシダ化学社製）０．５６ｇ、トリプシンインヒビター（シグマ社製）０．０２ｇ、コラゲナーゼ（シグマ社製）０．５ｇを１Ｌの水に溶解し、ｐＨ７．５に調整したもの］を２００ｍｌ灌流した。肝臓が消化された後、シャーレ内に回収し、２０ｍｌのＳ−ＭＥＭ培地（ギブコ社製）を加えメスで細切した。次いで１０ｍｌの先太駒込ピペットでピペッティングし、肝細胞を分散させた後、ガーゼ及び細胞濾過器（池本理化工業社製）で肝細胞を濾過し、肝細胞分散液を得た。ここで得られた肝細胞は肝実質細胞以外の非実質細胞、例えば内皮細胞、クッパー細胞、伊東細胞、星細胞などを含んでいるため、遠心分離によって肝実質細胞のみを精製した。具体的には、得られた肝細胞分散液を５０×Ｇで１分間冷却下で低速遠心し底に沈殿した肝実質細胞を回収した。この操作を３回繰り返し純度の高い肝実質細胞を分離回収した。
【０１２８】
分離回収した肝細胞を１．２×１０⁶細胞／ｍｌの濃度になるように、下記基本培地に懸濁し、マトリゲルをコートした６穴（ｗｅｌｌ）プレート上に１．４ｍｌ播種し、以下の培養条件で初代培養した。
培地はウエイマウスのＭＢ７５２／１（Waymouth'sMB752/1）培地（ギブコ社製）に、ウシ血清（ＦＢＳ、１０％）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、インシュリン（１０^-8Ｍ）及びデキサメタゾン（dexamethasone）（１０^-6Ｍ）を添加したもの（以下、基本培地というときもある。）を用いた。
【０１２９】
培養は３７℃、５％ＣＯ₂、９５％大気のＣＯ₂インキュベーターでおこなった。播種終了４時間後に基本培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、新たな基本培地（０．７ｍｌ）を分注して、さらに培養した。
実施例１５で得られた濃縮乾固物（８）をジメチルスルフォキシド（以下、ＤＭＳＯと略記する。）で１０ｍｇ／ｍｌの濃度となるように溶解し、これを上記基本培地で５０倍に希釈し、濃縮乾固物（８）の濃度２００μｇ／ｍｌの試験液を調製した。
【０１３０】
細胞播種２４時間後、各穴（well）に試験液を１４０μｌ添加し（分画物終濃度２０μｇ／ｍｌ）、その１時間後に５０ｍＭアセトアミノフェン（肝障害誘導剤）を５６０μｌ添加した（終濃度２０ｍＭ）（試験区とする）。
また、細胞播種２４時間後、各穴（well）に２％ＤＭＳＯ含有基本培地１４０μｌを添加し、その１時間後に５０ｍＭアセトアミノフェン（肝障害誘導剤）を５６０μｌ添加した（終濃度２０ｍＭ）（第１コントロール区とする）。
【０１３１】
また、細胞播種２４時間後、各穴（well）に２％ＤＭＳＯ含有基本培地１４０μｌを添加し、その１時間後に蒸留水を５６０μｌ添加した（第２コントロール区とする）。
アセトアミノフェンまたは蒸留水添加４８時間後にＭＴＴ［3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide]アッセイによって、各区の細胞数を吸光度により計測した。具体的には、各穴（well）中の基本培地を除き、ＭＴＴ（１０ｍｇ／ｍｌ）を溶解したＰＢＳを１０％含んだＷａｙｍｏｕｔｈ'ｓＭＢ７５２／１培地を１．４ｍｌ分注した。３７℃のＣＯ₂インキュベータ内で１時間インキュベートした後、４．２ｍｌのＤＭＳＯを添加し、烈しく攪拌した後、マイクロプレートリーダー（バイオラド社製、モデル３５５０）において、５７０ｎｍの吸光度をそれぞれ測定した。評価は２連でおこなった。肝細胞障害抑制率は次の式によって計算した。
【０１３２】
【式１】

【０１３３】
結果を第２表に示す。
【０１３４】
【表２】

【０１３５】
第２表に示すように、実施例１５で得た濃縮乾固物（８）はアセトアミノフェンによる肝細胞障害を４２．２％抑制した。
【０１３６】
実施例１８ 甘茶各種エキスの分画物によるＤ−ガラクトサミン誘導初代培養肝細胞障害の抑制
実施例１１および１２で得られた濃縮乾固物（３）、（４）、（５）、（６）、（８）および（９）と、実施例１３および１４で得られた濃縮乾固物（３）、（４）、（５）、（６）および（７）をそれぞれＤＭＳＯで溶解し１０ｍｇ／ｍｌとし、これを基本培地で５０倍に希釈した分画物希釈液（分画物濃度２００μｇ／ｍｌ）を調製した。実施例１７と同様の方法で細胞を播種、初代培養した。播種２時間後に培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、新たな培地（０．７ｍｌ）を分注した後、分画物希釈液を１４０μｌ添加した（分画物終濃度２０μｇ／ｍｌ）。その２時間後に培地に溶解した５０ｍＭＤ−ガラクトサミン（肝障害誘導剤）を５６０μｌ添加した（終濃度２０ｍＭ）（試験区とする）。
【０１３７】
また、細胞播種２時間後、各穴（well）に２％ＤＭＳＯ含有基本培地１４０μｌを添加し、その２時間後に培地に溶解した５０ｍＭＤ−ガラクトサミン（肝障害誘導剤）を５６０μｌ添加した（終濃度２０ｍＭ）（第１コントロール区とする）。
また、細胞播種２時間後、各穴（well）に２％ＤＭＳＯ含有基本培地１４０μｌを添加し、その２時間後に培地を５６０μｌ添加した（第２コントロール区とする）。
【０１３８】
Ｄ−ガラクトサミンまたは培地添加４８時間後にＭＴＴアッセイによって、各区の細胞数を吸光度により計測した。具体的には、各穴（well）中の基本培地を除き、ＭＴＴ（１０ｍｇ／ｍｌ）を溶解したＰＢＳを１０％含んだＷａｙｍｏｕｔｈ'ｓＭＢ７５２／１培地を１．４ｍｌ分注した。３７℃のＣＯ₂インキュベータ内で１時間インキュベートした後、４．２ｍｌのＤＭＳＯを添加し、烈しく攪拌した後、マイクロプレートリーダー（バイオラド社製、モデル３５５０）において、５７０ｎｍの吸光度をそれぞれ測定した。評価は２連でおこなった。肝細胞障害抑制率は前記式１によって計算した。
【０１３９】
結果を第３表に示す。
【０１４０】
【表３】

【０１４１】
第３表が示すように、甘茶の各種エキスの分画物はＤ−ガラクトサミンによる肝細胞障害を３１．８〜９７．４％抑制した。
【０１４２】
実施例１９ 甘茶各種エキスの分画物によるＤ−ガラクトサミン及びＴＮＦ−α併用誘導初代培養肝細胞障害の抑制
実施例１２、１３および１４で得られた、濃縮乾固物（９）をそれぞれＤＭＳＯで溶解し１０ｍｇ／ｍｌとし、これを基本培地で５０倍に希釈し、分画物希釈液（分画物濃度５００μｇ／ｍｌ）を得た。
【０１４３】
実施例１７と同様の方法で細胞を播種、初代培養した。播種２時間後に培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、新たな培地（０．７ｍｌ）を分注した後、分画物希釈液を１４０μｌ添加した（分画物終濃度２０μｇ／ｍｌ）。その２時間後に培地に溶解した２．５ｍＭＤ−ガラクトサミン、２．５ｎｇ／ｍｌＴＮＦ−α混合液（以下、ＧＴ液という。）を５６０μｌを添加した（終濃度：Ｄ−ガラクトサミン１ｍＭ、ＴＮＦ−α１ｎｇ／ｍｌ）（試験区とする）。
【０１４４】
また、細胞播種２時間後、各穴（well）に２％ＤＭＳＯ含有基本培地１４０μｌを添加し、その２時間後にＧＴ液（肝障害誘導剤）を５６０μｌ添加した（終濃度：Ｄ−ガラクトサミン１ｍＭ、ＴＮＦ−α１ｎｇ／ｍｌ）（第１コントロール区とする）。
また、細胞播種２時間後、各穴（well）に２％ＤＭＳＯ含有基本培地１４０μｌを添加し、その２時間後に培地を５６０μｌ添加した（第２コントロール区とする）。
【０１４５】
ＧＴ液または培地添加４８時間後にＭＴＴアッセイによって、各区の細胞数を吸光度により計測した。具体的には、各穴（well）中の基本培地を除き、ＭＴＴ（１０ｍｇ／ｍｌ）を溶解したＰＢＳを１０％含んだＷａｙｍｏｕｔｈ'ｓＭＢ７５２／１培地を１．４ｍｌ分注した。３７℃のＣＯ₂インキュベータ内で１時間インキュベートした後、４．２ｍｌのＤＭＳＯを添加し、烈しく攪拌した後、マイクロプレートリーダー（バイオラド社製、モデル３５５０）において、５７０ｎｍの吸光度をそれぞれ測定した。評価は２連でおこなった。肝細胞障害抑制率は前記の式１によって計算した。
【０１４６】
【表４】

【０１４７】
第４表に示すとおり、甘茶の各種エキスの分画物はＤ−ガラクトサミンとＴＮＦ−αの併用による肝細胞障害を１７．２〜３４．０％抑制した。
【０１４８】
実施例２０
下記組成を有する飼料を各成分を混合することにより製造した。
ＣＥ−２（日本クレア社製） ９９重量％
実施例５で製造した粉体 １重量％
【０１４９】
実施例２１
下記組成を有する飼料を各成分を混合することにより製造した。
【０１５０】
ＣＥ−２（日本クレア社製） ９９重量％
実施例３で製造した粉末 １重量％
【０１５１】
比較例２
下記組成を有する飼料を各成分を混合することにより製造した。
ＣＥ−２（日本クレア社製） ９９重量％
パインデックス＃３（松谷化学社製） １重量％
【０１５２】
実施例２２ 甘茶水抽出残さエタノールエキスによるアルコール・リポポリサッカライド（ＬＰＳ）誘導ラット肝障害の抑制
日本ＳＬＣから購入したＳＤ系白色ラット（雌、２００ｇ程度）を一定条件下（温度：２４±２℃、湿度：６０±５％、明暗周期：１２時間）で３日間以上順応させた後、実施例２０（試験群）または比較例２（対照群）の飼料をそれぞれ計１５日間にわたって摂食させた。１５日間の摂食期間中、いずれの飼料で飼育したラット間に、体重増加、外見および行動上の異常も認められなかった。１４日目に、アルコール４ｇ／ｋｇ（４０v/v％エタノール溶液にしたもの）をゾンデを用いて経口投与した。その後６時間後にＬＰＳ（E. coli由来、シグマ社製）を５ｍｇ／ｍｌの濃度で生理食塩水に溶解したものを５ｍｇ／ｋｇ尾静脈注射投与し、さらに２４時間後に、ネンブタールによる麻酔下で開腹し採血した。試験は各群６匹で行った。
【０１５３】
この様にして得られた血液を用い、肝機能の指標として、血液中のＧＰＴおよびＧＯＴの活性を、以下の方法で測定した。採取した血液を凝固させた後、遠心分離し、血清を得た。得られた血清を用い、富士ドライケムシステム３５００（フジフィルム社製）を用いて、血清中のＧＰＴおよびＧＯＴを測定した。試験群のＧＰＴおよびＧＯＴ活性は、対照群の値を１００％として相対値を計算して求めた。尚、これらの実験結果は平均値±標準誤差で示し、統計学的な有意差検定はＴ−テストによって行った。
【０１５４】
結果を第５表に示す。
【０１５５】
【表５】

【０１５６】
肝機能障害の指標である血清中のＧＰＴまたはＧＯＴ活性は、甘茶エキスを投与した試験群では対照群の１０．８、７．７％と低くなり、肝障害が抑制されたことが確認された。また、有意差検定において、ｐ＜０．０１となり、有意差が認められた。
【０１５７】
実施例２３ 甘茶アセトンエキスによるＤ−ガラクトサミン誘導ラット肝障害の抑制
日本ＳＬＣから購入したＳＤ系白色ラット（雄、１５０±２０ｇ）を一定条件下（温度：２４±２℃、湿度：６０±５％、明暗周期：１２時間）で３日間以上順応させた後、実施例２１で製造した飼料（試験群）および比較例２で製造した飼料（対照群）をそれぞれ４日間摂食させた。その後１８時間絶食させ、Ｄ−ガラクトサミン（４０ｍｇ／ｍｌの濃度で生理食塩水に溶解したもの）４００ｍｇ／ｋｇを腹腔内に投与した。Ｄ−ガラクトサミンを投与してから２２時間後に、ネンブタールによる麻酔下で開腹し採血した。
【０１５８】
この様にして得られた血液を用い、肝機能の指標として、血液中のＧＰＴの活性を、以下の方法で測定した。採取した血液を凝固させた後、遠心分離し、血清を得た。得られた血清を用い、トランスアミナーゼＣII−テストワコー（和光純薬工業社製）を用いて、血清中のＧＰＴを測定した。試験群のＧＰＴ活性は対照群の値を１００として相対値を計算して求めた。値は平均値±標準誤差で示し、統計学的な有意差検定はＴ−テストによって行った。結果を第６表に示す。
【０１５９】
【表６】

【０１６０】
実施例２１の飼料を投与した場合、比較例２の飼料を投与した場合に比べ肝機能障害の指標である血清中のＧＰＴ活性は、５６．４％と低く肝障害が抑制された。
摂食期間中、体重増加、外見および行動上の異常は認められなかった。
【０１６１】
実施例２４ ユキノシタの水エキスの凍結乾燥粉末の製造
乾燥したユキノシタの粉末（志平商店社製）１ｋｇを蒸留水１０リットルで２回抽出し（室温、１時間攪拌）、得られた抽出液を濃縮後、凍結乾燥することにより、ユキノシタの水エキスの凍結乾燥粉末１５０ｇを得た。
【０１６２】
実施例２５ ユキノシタの６０％エタノール水溶液エキスの凍結乾燥粉末の製造乾燥したユキノシタの粉末１ｋｇを６０％エタノール水溶液１０リットルで２回抽出し（室温、１時間攪拌）、得られた抽出液を濃縮後、凍結乾燥することにより、ユキノシタの６０％エタノール水溶液エキスの凍結乾燥粉末１８８ｇを得た。
【０１６３】
実施例２６ ユキノシタのアセトンエキスの凍結乾燥粉末の製造
乾燥したユキノシタの粉末１ｋｇをアセトン１０リットルで２回抽出し（室温、１時間攪拌）、得られた抽出液を濃縮後、凍結乾燥することにより、ユキノシタのアセトンエキスの凍結乾燥粉末１６４ｇを得た。
【０１６４】
実施例２７ ユキノシタの熱水エキスの凍結乾燥粉末の製造
乾燥したユキノシタの粉末１ｋｇを沸騰した蒸留水１０リットルで抽出し（３０分間放置）、得られた抽出液を濃縮後、凍結乾燥することによりユキノシタの熱水エキスの凍結乾燥粉末１００ｇを得た。
【０１６５】
実施例２８
実施例２４で製造して得られた凍結乾燥粉末５ｇを水５００ｍｌで懸濁した。該懸濁液を疎水性吸着レジン（三菱化学社製、ダイヤイオンＨＰ−２０、ボイドボリューム１００ｍｌ）を充填したカラムに通塔した。ついで２５０ｍｌの３３％メタノールで溶出し、さらに２５０ｍｌの３３％メタノールで溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（３）を得た。該カラムを２５０ｍｌの６６％メタノールで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（４）を得た。さらに、２５０ｍｌの６６％メタノールで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（５）を得た。
【０１６６】
実施例２９
実施例２５で製造して得られた凍結乾燥粉末５ｇを水５００ｍｌで懸濁した。該懸濁液を疎水性吸着レジン（三菱化学社製、ダイヤイオンＨＰ−２０、ボイドボリューム１００ｍｌ）を充填したカラムに通塔した。ついで２５０ｍｌの３３％メタノールで溶出し、さらに２５０ｍｌの３３％メタノールで溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（３）を得た。該カラムを２５０ｍｌの６６％メタノールで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（４）を得た。さらに、２５０ｍｌの６６％メタノールで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（５）を得た。該カラムを２５０ｍｌの１００％メタノールで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（６）を得た。
【０１６７】
実施例３０
実施例２６で製造して得られた凍結乾燥粉末５ｇを水５００ｍｌで懸濁した。該懸濁液を疎水性吸着レジン（三菱化学社製、ダイヤイオンＨＰ−２０、ボイドボリューム１００ｍｌ）を充填したカラムに通塔した。ついで２５０ｍｌの３３％メタノールで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（２）を得た。さらに２５０ｍｌの３３％メタノールで溶出し、ついで２５０ｍｌの６６％メタノールで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（４）を得た。
【０１６８】
実施例３１
実施例２７で製造して得られた凍結乾燥粉末５ｇを水５００ｍｌで懸濁した。該懸濁液を疎水性吸着レジン（三菱化学社製、ダイヤイオンＨＰ−２０、ボイドボリューム１００ｍｌ）を充填したカラムに通塔した。ついで２５０ｍｌの３３％メタノールで２回溶出した。該カラムを２５０ｍｌの６６％メタノールで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（４）を得た。さらに、２５０ｍｌの６６％メタノールで溶出し、溶出される液を濃縮・乾燥することにより濃縮乾固物（５）を得た。
【０１６９】
実施例３２
下記組成を有する飼料を各成分を混合することにより製造した。
【０１７０】
ＣＥ−２（日本クレア社製） ９９．０重量％
実施例２４で製造した粉末 １．０重量％
【０１７１】
実施例３３
下記組成を有する飼料を各成分を混合することにより製造した。
ＣＥ−２（日本クレア社製） ９９．０重量％
実施例２５で製造した粉末 １．０重量％
【０１７２】
実施例３４ ユキノシタエキス[ユキノシタの水エキス（実施例２４）及び６０％エタノールエキス（実施例２５）]によるＤ−ガラクトサミン誘導ラット肝障害の抑制
日本ＳＬＣから購入したＳＤ系白色ラット（雄、１５０±２０ｇ）を一定条件下（温度：２４±２℃、湿度：６０±５％、明暗周期：１２時間）で３日間以上順応させた後、実施例３２、実施例３３で製造した飼料（試験群）および比較例２で製造した飼料（対照群）を３日間摂食させた。その後１８時間絶食させ、Ｄ−ガラクトサミン４００ｍｇ／ｋｇ（４０ｍｇ／ｍｌの濃度で生理食塩水に溶解したもの）を腹腔内に投与した。さらに上記飼料を１日間摂取させた後、ネンブタールによる麻酔下で開腹し採血した。
【０１７３】
この様にして得られた血液を用い、肝機能の指標として、血液中のＧＰＴの活性を、以下の方法で測定した。採取した血液を凝固させた後、遠心分離し、血清を得た。得られた血清を用い、トランスアミナーゼＣII−テストワコー（和光純薬工業社製）を用いて、血清中のＧＰＴを測定した。尚、ＧＰＴ活性は対照群の値を１００％として、試験群の値の相対値（％）を計算して求めた。これらの実験結果は平均値±標準誤差で示し、統計学的な有意差検定はＴ−テストによって行った。結果を第７表に示す。
【０１７４】
【表７】

【０１７５】
実施例３２および実施例３３の飼料を投与した場合、比較例２の飼料を投与した場合に比べ、肝機能障害の指標である血清中のＧＰＴ活性はそれぞれ３５．７と２９．９％と低く肝障害が抑制されたことが確認された。有意差検定の結果有意差が認められた。摂食期間中、体重増加、外見上、および行動上の異常は認められなかった。
【０１７６】
実施例３５ ユキノシタのアセトンエキス分画物によるアセトアミノフェン誘導初代培養肝細胞障害の抑制
実施例３０の濃縮乾固物（２）および（４）を用いて、実施例１７と同様に試験した。
結果を第８表に示す。
【０１７７】
【表８】

【０１７８】
表８に示すように、ユキノシタのアセトンエキス分画物はアセトアミノフェンによる肝細胞障害を各々４６．７％、４６．４％抑制した。
【０１７９】
実施例３６ ユキノシタの各種エキス分画物によるＤ−ガラクトサミン誘導初代培養肝細胞障害の抑制
実施例２８、２９、３０および３１の各濃縮乾固物を用いて、実施例１８と同様に試験した。
【０１８０】
結果を第９表に示す。
【０１８１】
【表９】

【０１８２】
第９表に示すように、ユキノシタの各種エキスの分画物はＤ−ガラクトサミンによる肝細胞障害を３６．１〜１１１．１％抑制した。
【０１８３】
実施例３７ ユキノシタの各種エキス分画物によるＤ−ガラクトサミン及びＴＮＦ−α併用誘導初代培養肝細胞障害の抑制
実施例２８、２９および３１で調製した濃縮乾固物を用いて実施例１９と同様に試験した。結果を第１０表に示す
【０１８４】
【表１０】

【０１８５】
第１０表に示すように、ユキノシタの各種エキスの分画物はＤ−ガラクトサミンとＴＮＦ−αによる肝細胞障害を１７．０〜９０．６％抑制した。
【０１８６】
実施例３８ 甘茶水抽出残さエタノールエキス配合剤の製造
下記組成を有する肝機能保護剤または肝機能改善剤を、各成分を混合することにより製造した。
【０１８７】
実施例５で製造した甘茶水抽出残さエタノールエキス ４９ｇ
パインデックス＃３ ４９ｇ
ピロリン酸第２鉄（鉄源） ０．１ｇ
ホスカルＥＦＣ（カルシウム源；日興ファインプロダクツ社製） １ｇ
ビタミンミックス（メルク社製） １ｇ
【０１８８】
実施例３９
実施例３８で製造した肝機能保護剤または改善剤２０ｇを水１８０ｍｌに分散させ、肝機能保護または改善用飲料を製造した。
【０１８９】
実施例４０ 甘茶水抽出残さエタノールエキス配合クッキーの製造
次の配合によりクッキー（３０個分）を定法により製造した。
【０１９０】
薄力粉 １００ｇ
でん粉 ７４ｇ
水 １４ｇ
実施例５で製造した甘茶水抽出残さエタノールエキス ３０ｇ
ベーキングパウダー 小さじ２
塩 小さじ２
卵 １個
バター ８０ｇ
牛乳 大さじ２
実施例４１ 実施例２４の凍結乾燥粉末１％を含有する飼料の製造
下記組成を有する飼料を各成分を混合することにより製造した。
【０１９１】
スクロース（キシダ化学社製） ２０．０重量％
コーンオイル（ナカライテスク社製） ５．０重量％
重酒石酸コリン（東京化成社工業製） ０．４重量％
コーンスターチ（日澱化学社製） ３９．１重量％
ＡＩＮ−７６ビタミン（オリエンタル酵母社製） １．０重量％
ＡＩＮ−７６ミネラル（オリエンタル酵母社製） ３．５重量％
セルロース（オリエンタル酵母社製） ５．０重量％
カゼイン（和光純薬社工業製） ２５．０重量％
実施例２４で製造した粉末 １．０重量％
【０１９２】
実施例４２ 実施例２５の凍結乾燥粉末１％を含有する飼料の製造
下記組成を有する飼料を各成分を混合することにより製造した。
【０１９３】
スクロース（キシダ化学社製） ２０．０重量％
コーンオイル（ナカライテスク社製） ５．０重量％
重酒石酸コリン（東京化成社工業製） ０．４重量％
コーンスターチ（日澱化学社製） ３９．１重量％
ＡＩＮ−７６ビタミン（オリエンタル酵母社製） １．０重量％
ＡＩＮ−７６ミネラル（オリエンタル酵母社製） ３．５重量％
セルロース（オリエンタル酵母社製） ５．０重量％
カゼイン（和光純薬工業社製） ２５．０重量％
実施例２５で製造した粉末 １．０重量％
【０１９４】
【発明の効果】
本発明により、肝機能保護剤または改善剤、肝機能保護作用または改善作用を有する飲食品または飼料、肝機能保護作用または改善作用を有する飲食品用添加物または飼料用添加物および肝機能保護剤または改善剤のスクリーニング方法を提供することができる。

Claims (7)

1. アマチャ（Hydrangea macrophylla Seringe var.Thunbergii Makino）または甘茶（Hydrangeae Dulcis Folium）の植物体または該植物体の水性媒体抽出物残さのアルコールまたは含水アルコール抽出物を有効成分として含有することを特徴とする肝障害抑制剤。
2. 水性媒体が水、蒸留水、脱イオン水、無機塩水溶液または緩衝液である請求項１記載の肝障害抑制剤。
3. アルコールがエタノールである請求項１または２に記載の肝障害抑制剤。
4. 経口で投与する請求項１〜３のいずれかに記載の肝障害抑制剤。
5. 錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、浸剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、液剤、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤または流エキス剤である請求項１〜４のいずれかに記載の肝障害抑制剤。
6. 請求項１〜５のいずれかに記載の肝障害抑制剤を動物に給餌することを特徴とする動物の肝障害抑制方法。
7. 動物が、家畜、家禽または養殖魚である請求項６記載の方法。