JP4109336B2

JP4109336B2 - Production method of sugars

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Publication number: JP4109336B2
Application number: JP12899097A
Authority: JP
Inventors: 浩一小川; 信之中村
Original assignee: Nihon Shokuhin Kako Co Ltd
Current assignee: Nihon Shokuhin Kako Co Ltd
Priority date: 1997-05-19
Filing date: 1997-05-19
Publication date: 2008-07-02
Anticipated expiration: 2017-05-19
Also published as: JPH10316697A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はα-アミラーゼ活性測定用基質として有用なガラクトシル-マルトオリゴ糖及びその誘導体の製造方法に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、従来法に比べてより簡便な精製方法を利用して、高純度のガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいはその誘導体を製造することができる方法に関する。特に、反応混合液中の出発原料や副生成物であるラクトース（乳糖）や重合度２以上のβ-1,4-ガラクトオリゴ糖を酵素の加水分解作用により選択的に分解することで精製をより容易にする、工業的に有用な製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトの体液、例えば血液、尿等に含まれるα-アミラーゼ活性を測定し、臨床診断に応用することが広く行われている。本発明者らは、α-アミラーゼの活性測定の際に、共役酵素（α-グルコシダーゼあるいはグルコアミラーゼ等）の加水分解作用を受けない安定で鋭敏な基質として、マルトオリゴ糖（グルコース重合度４〜７）あるいはその誘導体の非還元末端グルコース残基にガラクトシル基が結合した誘導体を開発した［特開平３−２６４５９６号］。この公報には、これらの誘導体の製造方法、及びそれを用いるアミラーゼ活性測定法も開示されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記公報に記載されたガラクトシル−マルトオリゴ糖あるいはその誘導体の製造方法は、原料としてマルトオリゴ糖あるいはその誘導体とラクトースあるいはβ-1,4-ガラクトオリゴ糖の混合物を緩衝液中に溶解し、β-ガラクトシダーゼを作用させてβ-1,4-ガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいはその誘導体を製造するものである。しかし、その反応終了液中に含まれる、目的とするガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいはその誘導体の量は、約10%(w/w)程度である。残りは、主に、原料由来のラクトースや転移反応生成物であるガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースまたはガラクトシル-ガラクトシル-マルトオリゴ糖等である。
【０００４】
一方、ガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいはその誘導体がα-アミラーゼ基質として用いられる際には９８％以上という高純度を要求される。そのため、ゲル濾過精製法を用いて高純度品を製造する必要がある。ゲル濾過精製法は、一般的にマルトオリゴ糖あるいはその誘導体の高純度品を得る場合に用いられる方法であり、分離能力は高いが、処理可能量が少なく、ゲル自体の価格が高い等の欠点を有している。
特に、上記公報に記載の製造方法においては、出発物質のマルトオリゴ糖あるいはその誘導体及び目的物質であるガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいはその誘導体の高純度品を得るためには、ゲル濾過精製が二回以上必要である。さらに、反応終了液中のガラクトシル−マルトオリゴ糖含量が低いため、工業的規模でガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいはその誘導体の高純度品を製造する場合、生産量が制限され、高価にならざるを得なかった。
【０００５】
そこで本発明の目的は、ガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいはその誘導体をゲル濾過精製法を用いることなし、またはゲル濾過精製法とその他の簡便な精製方法とを組み合わせて精製することを可能にできる方法、及びこの方法を利用した高純度のガラクトシル-マルトオリゴ糖及びその誘導体の製造方法を提供することにある。
【０００６】
さらに本発明は、上記目的達成のため、反応終了液中に含まれる副生成物または原料物質を、目的生成物を実質的に分解することなく酵素的に分解して低分子化することで、ゲル濾過精製法以外のより簡便で効率の良い精製方法を利用して、またはゲル濾過精製法とそれ以外のより簡便で効率の良い精製方法とを組み合わせて、高純度のガラクトシル-マルトオリゴ糖及びその誘導体の製造方法を提供することが可能な方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記目的を達成するために鋭意研究を重ねた。その結果、β-1,4-ガラクトシル-マルトオリゴ糖及びその誘導体を分解せず、かつ原料として用いられるラクトースや副生物であるガラクトシル−オリゴ糖類等の不純物のみを加水分解する酵素群を見出し、さらにこれらの酵素で加水分解して低分子化した糖類をゲル濾過精製法以外の精製法で分離して目的物であるβ-1,4-ガラクトシル-マルトオリゴ糖及びその誘導体を精製することができることを見いだして本発明を完成した。
【０００８】
本発明のガラクトシル-マルトオリゴ糖またはガラクトシル-マルトオリゴ糖誘導体の製造方法は、ガラクトシル-マルトオリゴ糖またはガラクトシル-マルトオリゴ糖誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物Ａとラクトース、ガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトース及びガラクトシル-ガラクトシル-マルトオリゴ糖からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物Ｂとを含む混合物に、化合物Ｂを優先的に加水分解する酵素を作用させて化合物Ｂを低分子化し、次いで、低分子化した化合物Ｂと化合物Ａとを分離することを特徴とする方法である［請求項１］。
【０００９】
さらに本発明は、ガラクトシル−マルトオリゴ糖またはガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物Ａとラクトースとを含む混合物に、ラクトースを優先的に加水分解するβ−ガラクトシダーゼを作用させてラクトースを低分子化することを特徴とするラクトースの低分子化方法に関する［請求項１１］。また、本発明は、上記方法により得られた低分子化したラクトースと化合物Ａとを含む混合物から低分子化したラクトースを分離することを特徴とするガラクトシル−マルトオリゴ糖またはガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製造方法に関する［請求項１３］。
【００１０】
加えて本発明は、ガラクトシル−マルトオリゴ糖またはガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物Ａとガラクトシル−ラクトース、ガラクトシル−ガラクトシル−ラクトース及びガラクトシル−ガラクトシル−マルトオリゴ糖からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物Ｃとを含む混合物に、化合物Ｃを優先的に加水分解するβ−ガラクタナーゼを作用させて化合物Ｃを低分子化することを特徴とするガラクトシル−オリゴ糖誘導体の低分子化方法に関する［請求項１５］。また、本発明は、上記方法により得られた低分子化した化合物Ｃと化合物Ａとを含む混合物から低分子化した化合物Ｃを分離することを特徴とするガラクトシル−マルトオリゴ糖またはガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製造方法に関する［請求項１７］。
【００１１】
【発明の実施の形態】
請求項１に記載の製造方法
請求項１に記載の製造方法では、ガラクトシル-マルトオリゴ糖またはガラクトシル-マルトオリゴ糖誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物Ａとラクトース、ガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトース及びガラクトシル-ガラクトシル-マルトオリゴ糖からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物Ｂとを含む混合物に、化合物Ｂを優先的に加水分解する酵素を作用させて化合物Ｂを低分子化する。
【００１２】
ここで、化合物Ｂを優先的に加水分解する酵素としては、β-ガラクタナーゼ及びβ-ガラクトシダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素を例示することができる。但し、本発明ではこれらの酵素以外の酵素であっても、目的物質を実質的に分解することなく、出発原料及び副生成物を分解し得る酵素であればいずれも使用可能である。
【００１３】
β-ガラクタナーゼはガラクトース重合体を加水分解する酵素であり、一般的に入手可能である。本発明には目的物質であるβ-1,4-ガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいはその誘導体を分解せずにガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースまたは２個以上のガラクトース残基が非還元末端側に結合したマルトオリゴ糖あるいはその誘導体を分解する酵素が必要である。そのようなβ-ガラクタナーゼとしては、例えば、β-1,4-ガラクタナーゼを挙げることができる。β-1,4-ガラクタナーゼとしては、例えば、Bacillus subtilis起源のもの（J.M.Labavitchら，J. Biol.Chem.,251,5904-5910）、Penicillium citrinum起源のもの（澱粉科学，第３６巻, P131-140,1989年）、Aspergillus pulverulent起源の酵素製剤「ペクチナーゼＧアマノ」（天野製薬製）Aspergillus niger起源の酵素製剤「ペクチネックス」（ノボノルディスクバイオインダストリー製）等のβ-1,4-ガラクタナーゼが挙げられる。
【００１４】
これらの酵素群については文献等ではガラクトースの重合体からなる高分子やガラクトース残基からなるガラクトオリゴ糖の加水分解の記述はみられるが、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトオリゴ糖を加水分解することができることは本発明で初めて見いだされた。
【００１５】
β-ガラクトシダーゼは、各種β-ガラクトシドを加水分解してガラクトースを遊離する酵素として知られているが、２種類のβ-ガラクトシダーゼに大別される。第一の群は、ラクトース分解能を有し、かつガラクトシル-マルトオリゴ糖またはガラクトシル-マルトオリゴ糖誘導体に対して難分解性のβ-ガラクトシダーゼである。第２の群のβ-ガラクトシダーゼは、ガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいはその誘導体を生成させる転移活性の強いβ-ガラクトシダーゼである。
【００１６】
第１の群のガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいはその誘導体には作用せずにラクトースを加水分解するβ-ガラクトシダーゼとしては、クリベロマイセス由来のβ-ガラクトシダーゼを挙げることができる。そのようなβ-ガラクトシダーゼとして、例えば、クリベロマイセス・フラギルス（Kluyvermyces fragilis）起源の酵素製剤「ラクトザイム」（ノボノルディスクバイオインダストリー製）、クリベロマイセス・ラクティス（Kluyvermyces lactis）起源の酵素製剤「ＧＯＤＯ−ＹＮＬ」（合同酒精）等が挙げられる。
【００１７】
第２の群のβ-ガラクトシダーゼは、具体的には特開平３-２６４５９６号に述べたようにバチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）起源の酵素製剤「Biolacta」（大和化成製）、アスペルギルス・オリゾエ（Aspergillus oryzoe）起源の酵素製剤「Lactase Fアマノ」（天野製薬製）、同じく「Lactase Y-AO」（ヤクルト）あるいは特開昭６２-１３０６９５記載のクリプトコッカス（Criptococcus）属起源のものが挙げられる。ガラクトース残基を主にβ-1,4-結合でマルトオリゴ糖あるいはその誘導体の非還元末端グルコース残基に転移し得るバチルス属あるいはクリプトコッカス属由来の酵素が使用可能であるが、バチルス属由来の酵素の方が温度安定性が高いので好ましい。
【００１８】
上記化合物Ａと化合物Ｂとを含む混合物は、例えば、特開平３-２６４５９６号に記載されているようなβ-ガラクトシル残基を有する糖（代表的にはマルトース）とマルトオリゴ糖またはマルトオリゴ糖誘導体の混合物にβ-ガラクトシダーゼを作用させるで生成させた反応生成物であることができる。
【００１９】
ここで、「β-ガラクトシル残基を有する糖」は、重合度２以上のβ-1,4-ガラクトオリゴ糖またはラクトースであることができる。「マルトオリゴ糖」は、グルコースの重合度が２〜７のマルトオリゴ糖またはこれらの混合物であることができる。「マルトオリゴ糖誘導体」は、グルコースの重合度が２〜７のマルトオリゴ糖またはその混合物の還元性末端にαまたはβ-結合で無置換または置換フェニル基を有するマルトオリゴ糖誘導体であることができる。置換フェニル基は、p-ニトロフェニル基または2-クロロ-4-ニトロフェニル基であることができる。「マルトオリゴ糖誘導体」の具体例として、例えば、p-ニトロフェニルα−マルトペンタオシドや2-クロロ-4-ニトロフェニルβ−マルトテオラオシド等を挙げることができる。
【００２０】
また、β-ガラクトシダーゼは、ガラクトース残基を、主としてβ-1,4-ガラクトシド結合でマルトオリゴ糖またはマルトオリゴ糖誘導体の非還元性末端グルコース残基に転移し得る酵素であり、前述の第２の群に分類されるβ-ガラクトシダーゼである。
【００２１】
化合物Ａとしては、具体的には、以下の一般式（１）で表されるガラクトシル−マルトオリゴ糖を挙げることができる。
【００２２】
【化１】

【００２３】
式中、Ｘ１及びＸ２の少なくとも一方はガラクトシル基であり、他方は水素原子であり、Ｒは水素原子または置換若しくは無置換のフェニル基を示し、ｎは２〜５の整数を示す。
【００２４】
また、化合物Ｂの内、ラクトースは、上記で説明した反応原料として使用される糖である。さらに、化合物Ｂには、ラクトース以外の反応原料として使用される重合度２以上のβ-1,4-ガラクトオリゴ糖が含まれていてもよい。そのようなβ-1,4-ガラクトオリゴ糖としては、例えば、メリビオース、ラフィノース、スタキオース、ガラクタン等が含まれる。また、ガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトオリゴ糖は、上記反応の副生物である。これらガラクトシル-ラクトース等の反応副生物は、大半がβ-1,4-体があるが、少量のβ-1,6-体も含まれる。
【００２５】
本発明の方法では、上記酵素群からなる酵素を少なくとも１種類選択し、ガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいはその誘導体を含む上記反応液に作用させることにより、不純物として含まれるラクトースやガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースまたはガラクトシル-ガラクトシル-マルトオリゴ糖等を加水分解させて、グルコースやガラクトースにまで低分子化する事ができる。尚、この酵素反応の条件（温度、ｐＨ、時間等）は、使用する酵素の種類と低分子化される糖の種類や量を勘案して適宜決定することができる。
【００２６】
次いで、低分子化した化合物Ｂと化合物Ａとを分離する。低分子化した化合物Ｂは、主にグルコースやガラクトースであり、オリゴ糖である化合物Ａとの分離は、例えば、逆浸透膜法により行うことができる。オリゴ糖と単糖類との分離は、逆浸透膜および／または強酸性カチオン交換樹脂分画法を用いれば大量にかつ簡便に行うことができる。また、一般にゲル濾過精製では分子量の大きさによる分離モードであるため、単糖とオリゴ糖とでは分離が容易になるので、上記分離をゲル濾過精製法により行うこともできる。また、逆浸透膜法および／または強酸性カチオン交換樹脂分画法で精製した糖をさらにゲル濾過精製することもできる。これにより、目的物質の含量が向上した糖についてゲル濾過精製を行えるため、生産性の大幅な向上が可能である。
尚、逆浸透膜法、強酸性カチオン交換樹脂分画法及びゲル濾過以外の方法も、分子量により物質を分離する方法であれば同様に使用することができる。
【００２７】
請求項１１に記載の方法
本発明は、ガラクトシル−マルトオリゴ糖またはガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物Ａとラクトースとを含む混合物に、ラクトースを優先的に加水分解するβ−ガラクトシダーゼを作用させてラクトースを低分子化することを特徴とするラクトースの低分子化方法を包含する。
【００２８】
この方法における化合物Ａは、上記請求項１に記載の製造方法で説明したものと同様のものである。また、β-ガラクトシダーゼは、ラクトース分解能を有し、かつガラクトシル-マルトオリゴ糖またはガラクトシル-マルトオリゴ糖誘導体に対して難分解性のβ-ガラクトシダーゼであることができ、上記請求項１に記載の製造方法で説明したものと同様のものである。また、酵素反応の条件（温度、ｐＨ、時間等）は、使用する酵素の種類と低分子化される糖の種類や量を勘案して適宜決定することができる。
【００２９】
請求項１３に記載の方法
上記の方法により得られた低分子化したラクトースと化合物Ａとを含む混合物から低分子化したラクトースを分離することでガラクトシル−マルトオリゴ糖またはガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体を製造することができる。低分子化したラクトースは、グルコースとガラクトースであり、オリゴ糖である化合物Ａとの分離は、上記請求項１に記載の製造方法と同様に、例えば、逆浸透膜法、強酸性カチオン交換樹脂分画法、ゲル濾過法等により行うことができる。
【００３０】
請求項１５に記載の方法
本発明は、ガラクトシル−マルトオリゴ糖またはガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物Ａとガラクトシル−ラクトース、ガラクトシル−ガラクトシル−ラクトース及びガラクトシル−ガラクトシル−マルトオリゴ糖からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物Ｃとを含む混合物に、化合物Ｃを優先的に加水分解するβ−ガラクタナーゼを作用させて化合物Ｃを低分子化することを特徴とするガラクトシル−オリゴ糖誘導体の低分子化方法も包含する。
【００３１】
ここで、化合物Ａは上記請求項１に記載の製造方法で説明したものと同様のものである。また、化合物Ｃは、上記化合物Ｂからマルトースを除いたものである。β-ガラクタナーゼは、β-1,4-ガラクタナーゼであることができ、上記請求項１に記載の製造方法で説明したものと同様のものである。酵素反応の条件（温度、ｐＨ、時間等）は、使用するβ-ガラクタナーゼの種類と低分子化される糖の種類や量を勘案して適宜決定することができる。
【００３２】
請求項１７に記載の製造方法
上記の方法により得られた低分子化した化合物Ｃと化合物Ａとを含む混合物から低分子化した化合物Ｃを分離することにより、ガラクトシル−マルトオリゴ糖またはガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体を製造することができる。低分子化した化合物Ｃは、主にグルコースとガラクトースであり、オリゴ糖である化合物Ａとの分離は、上記請求項１に記載の製造方法と同様に、例えば、逆浸透膜法、強酸性カチオン交換樹脂分画法、ゲル濾過法等により行うことができる。
【００３３】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに説明する。
下記の実施例における糖組成は試料を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析し、ピーク面積より算出した。ＨＰＬＣ条件，カラム；Shodex RS-pak DC-613 ( 6 I.D.mm×150mm），溶離液；アセトニトリル／水＝70/30(v/v)，流速；0.9 ml/min，カラム温度；室温，検出器；ＲＩモニターまたはＵＶ検出器（310nm）。
また酵素活性測定法は以下のようにして行った。
【００３４】
β - ガラクトシダーゼ活性測定
0.5mlの0.5%(w/v)p-ニトロフェニル β-ガラクトシドと25mMリン酸緩衝液(pH6.5)0.45mlを混合し、35℃で5分間プレインキュベイションした。適当濃度に希釈した酵素液0.05mlを添加して35℃、10分間反応させた後、反応液1mlに0.2M炭酸ナトリウム2mlを添加し405nmの吸光度を測定した。pNP量は検量係数設定用4-ニトロフェノール(和光純薬工業製)を用いて検量線を求めた。なお上記条件で1分間に1μmolのpNPを遊離する酵素量を1Uとした。
【００３５】
β - ガラクタナーゼ活性測定
0.5mlの1.0%大豆アラビノガラクタンと50mMの酢酸緩衝液(pH4.5)0.45mlを混合し、35℃で5分間プレインキュベイションした。適当濃度に希釈した酵素液0.05mlを添加して35℃、10分間反応させた後、反応液1mlにDNS試薬1ml添加し、10分間煮沸後、冷却し、蒸留水5mlを添加後、510nmの吸光度を測定した。遊離した還元糖量はガラクトースを用いて検量線を求めた。なお上記条件で1分間に1μmolの還元糖を遊離する酵素量を1Uとした。
【００３６】
実施例１各種酵素剤の選択
ラクトース19.85g(58.0mmol)及びマルトテトラオース38.7g(58.0 mmol)を100mlの50mMリン酸緩衝液中(pH7.0)に分散させ、β-ガラクトシダーゼ製剤「Biolacta」（5.4 U/mg,大和化成製, Bacillus circulans起源）を200 U添加し40℃で5時間反応させて、目的とするβ-1,4-ガラクトシル−マルトテトラオースを生成させた。ついで5%塩酸溶液で反応液のpH 3.5にした後、5分間煮沸し、酵素を失活させた。本反応液の糖組成を上記ＨＰＬＣにより分析したところ、β-1,4-ガラクトシル-マルトテトラオースは10.5%、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトテトラオースは3.2%、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースは7.0%、ガラクトシル-ラクトースは2.1%、マルトテトラオースは30.5%、ラクトースは24.8%、グルコースは11.5%、ガラクトースは3.7%でその他オリゴ糖は7.7%であった。
【００３７】
上記反応失活液を10倍に希釈した溶液10mlに、各種酵素剤をそれぞれ50 U添加し、24時間，40℃で反応させた糖組成をＨＰＬＣにより分析した結果を表１．に示した。
また次に表１の結果から本発明の目的に合致したβ-ガラクトシダーゼ「ラクトザイム」「ＧＯＤＯ−ＹＮＬ」およびβ-1,4-ガラクタナーゼ「ペクチナーゼＧアマノ」「ペクチネックス」を選択し、β-1,4-ガラクタナーゼ及びβ-ガラクトシダーゼ2種類の酵素剤を順次作用させた場合の加水分解について検討した。上記反応失活液を10倍に希釈した溶液10mlに、まずβ-1,4-ガラクタナーゼ剤をそれぞれ50 U添加し、24時間，40℃で反応させた後、酵素を煮沸失活させた。次いでβ-ガラクトシダーゼをそれぞれ50 U添加し、24時間，40℃で反応させた糖組成をＨＰＬＣにより分析した結果を表２に示した。
【００３８】
【表１】

【００３９】
【表２】

【００４０】
実施例２ p- ニトロフェニルβ - ガラクトシル - α - マルトオリゴシドに対する加水分解
マルトテトラオースの代わりにp-ニトロフェニルα-マルトシド（Ｇ２Ｐ以下同様），Ｇ３Ｐ，Ｇ４Ｐ，Ｇ５Ｐ，Ｇ６Ｐ，Ｇ７Ｐをそれぞれ用い実施例１記載と同様の条件で反応を行い、各β-1,4-ガラクトシル-ＧｎＰを含む反応混合液を得た。本反応液に上記と同様の条件でそれぞれβ-ガラクトシダーゼ「ラクトザイム」「ＧＯＤＯ−ＹＮＬ」およびβ-1,4-ガラクタナーゼ「ペクチナーゼＧアマノ」「ペクチネックス」を添加し、糖組成を分析した結果を表３に示した。なお本表ではガラクトシル-ガラクトシル-ＧｎＰ、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ラクトースに対する分解は表１と同様であったので省略し、各β-1,4-ガラクトシル-ＧｎＰに対する分解のみを記した。
【００４１】
【表３】

【００４２】
実施例３ 2- クロロ -4- ニトロフェニルβ - ガラクトシル - β - マルトオリゴシドに対する加水分解
マルトテトラオースの代わりに2-クロロ-4-ニトロフェニルβ-マルトシド（Ｇ２Ｃ以下同様），Ｇ３Ｃ，Ｇ４Ｃ，Ｇ５Ｃ，Ｇ６Ｃ，Ｇ７Ｃをそれぞれ用い実施例１記載と同様の条件で反応を行い、各β-1,4-ガラクトシル-ＧｎＣを含む反応混合液を得た。本反応液に上記と同様の条件でそれぞれβ-ガラクトシダーゼ「ラクトザイム」「ＧＯＤＯ−ＹＮＬ」およびβ-1,4-ガラクタナーゼ「ペクチナーゼＧアマノ」「ペクチネックス」を添加し、糖組成を分析した結果を表３に示した。なお本表ではガラクトシル-ガラクトシル-ＧｎＣ、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ラクトースに対する分解は表１と同様であったので省略し、各β-1,4-ガラクトシル-ＧｎＣに対する分解のみを記した。
【００４３】
【表４】

【００４４】
実施例４ β -1,4- ガラクトシル - マルトトリオースの調製
ラクトース2.0kg(5.8mol)及びマルトトリオース2.9kg(5.8mol)を10リットルの50mMリン酸緩衝液中（pH 7.0）に分散させ、β-ガラクトシダーゼ製剤「Biolacta」（5.4 U/mg,大和化成製）を20,000 U添加し40℃で5時間反応させ、目的とするβ-1,4-ガラクトシル-マルトトリオースを生成させた。次に5%塩酸溶液で反応液のpHを3.5にした後、5分間煮沸し、上記酵素を失活させた。本液の糖組成をＨＰＬＣにより分析したところ、β-1,4-ガラクトシル-マルトトリオースは10.1%、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトトリオースは2.8%、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースは7.2%、ガラクトシル-ラクトースは2.0%、マルトトリオースは29.8%、ラクトースは25.4%、グルコースは12.0%、ガラクトースは3.4%でその他オリゴ糖は7.3%であった。
【００４５】
本反応失活液を10倍に希釈した溶液をpH 5.0に調整し、反応液中に含まれるマルトテリオースを分解するために、Rhizopus nives起源グルコアミラーゼ（生化学工業製）を50,000 Uおよびガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースまたはガラクトシル-ガラクトシル-マルトトリオースを分解するためにBacillus subtilis起源β-1,4-ガラクタナーゼ（日本食品化工製）を200,000 U添加し、40℃で24時間で反応させた。反応終了は5%塩酸溶液で反応液のpHを3.5にした後、5分間煮沸し、上記酵素を失活させた。
次に本反応失活液のpHを6.5に調整し、原料の残りのラクトースを分解させるために、「ラクトザイム」（ Kluyvermyces fragilis起源）を100,000 U添加し、40℃で24時間反応させた。反応終了は5%塩酸溶液で反応液のpHを3.5にした後、5分間煮沸し、上記酵素を失活させた。本液の糖組成をＨＰＬＣにより分析したところ、β-1,4-ガラクトシル-マルトトリオースは9.9%、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトトリオースは1.2%、グルコースが59%、ガラクトースが25%で、ラクトースとガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースを含めたその他のオリゴ糖は4.9%であった。
【００４６】
上記酵素反応液6リットル（40%,w/v，固形物として2.4kg）を強酸性カチオン交換樹脂Dowex XFS-43278(ダウケミカル社製)を充填したカラム(26cm,I.D.×267cm）を用い、カラム温度；65℃、流速；1500ml/min、検出器：ＲＩモニターで精製した。その結果、精製液の糖組成は、β-1,4-ガラクトシル-マルトトリオースは62.3%、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトトリオースは6.1%、グルコースが2.3%、ガラクトースが2.5%で、ラクトースとガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースを含めたその他のオリゴ糖は26.8%であった。本操作により目的とするβ-1,4-ガラクトシル-マルトトリオースの純度は最初の反応終了液の含量に比較して6.3倍に向上した。
本液250ml（40%,w/v，固形物として100g）をToyopeal HW-40S（トーソー製）を充填したカラム（13cm,I.D×95cm）を用い、カラム温度；65℃、流速；5ml/min、検出器：ＲＩモニターでゲル濾過により精製し、純度98.5%のβ-ガラクトシル-マルトトリオース48.5g（固形物）を得た。
【００４７】
実施例５ β -1,4- ガラクトシル - マルテトラオースの調製
ラクトース2.0kg(5.8mol)及びマルテトラオース3.9kg(5.8mol)を10lの50mMリン酸緩衝液中（pH 7.0）に分散させ、β-ガラクトシダーゼ製剤「Biolacta」（5.4 U/mg,大和化成製）を20 KU添加し40℃で5時間反応させ、目的とするβ-1,4-ガラクトシル-マルトトリオースを生成させた。次に5%塩酸溶液で反応液のpHを3.5にした後、5分間煮沸し、上記酵素を失活させた。本反応液の糖組成を上記ＨＰＬＣにより分析したところ、β-1,4-ガラクトシル-マルトテトラオースは10.5%、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトテトラオースは3.2%、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースは7.0%、ガラクトシル-ラクトースは2.1%、マルトテトラオースは30.5%、ラクトースは24.8%、グルコースは11.5%、ガラクトースは3.7%でその他オリゴ糖は7.7%であった。
【００４８】
本反応失活液を10倍に希釈した溶液をpH 5.0に調整し、反応原料の残りのマルトテリオースを分解するために、Rhizopus nives起源グルコアミラーゼ（生化学工業製）を50,000 Uおよびガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースまたはガラクトシル-ガラクトシル-マルトテトラオースを分解するためにAspergillus pulverulent起源の酵素製剤「ペクチナーゼＧアマノ」（天野製薬製）を200,000 U添加し、30℃で24時間で反応させた。反応終了は5%塩酸溶液で反応液のpHを3.5にした後、5分間煮沸し、上記酵素を失活させた。
【００４９】
次に本反応失活液のpHを6.5に調整し、原料の残りのラクトースを分解させるために、クリベロマイセス・ラクティス（Kluyvermyces lactis）起源の酵素製剤「ＧＯＤＯ−ＹＮＬ」（合同酒精）を100,000 U添加し、40℃で24時間反応させた。反応終了は5%塩酸溶液で反応液のpHを3.5にした後、5分間煮沸し、上記酵素を失活させた。本液の糖組成をＨＰＬＣにより分析したところ、β-1,4-ガラクトシル-マルテトラオースは10.2%、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトトリオースは1.5%、グルコースが62%、ガラクトースが22%で、ラクトースとガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースを含めたその他のオリゴ糖は4.3%であった。
【００５０】
上記酵素反応液を逆浸透膜モジュール（ＤＫ４０４０ＣＤＡ，デサリネイション社製）を用いて圧力20 kgf/cm²で10時間処理したところ、本液の糖組成は、β-1,4-ガラクトシル-マルトテトラオースは57.4%、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトテトラオースは5.3%、グルコースが8.8%、ガラクトースが5.5%で、ラクトースとガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースを含めたその他のオリゴ糖は27.5%であった。
【００５１】
本操作により目的とするβ-1,4-ガラクトシル-マルトトテラオースは最初の反応終了液の含量に比較して５．５倍に向上した。本液250ml（40%,w/v，固形物として100g）をToyopeal HW-40S（トーソー製）を充填したカラム（13cm,I.D×95cm）を用い、カラム温度；65℃、流速；5ml/min、検出器：ＲＩモニターでゲル濾過により精製し、純度98.5%のβ-ガラクトシル-マルトテトラオース49.5g（固形物）を得た。
【００５２】
実施例６ p- ニトロフェニル β - ガラクトシル - α - マルトペンタオシドの調製ラクトース20g及びp-ニトロフェニル α-マルトペンタオシド（Ｇ５Ｐ）10gを100mlの50mMリン酸緩衝液（pH7.0）中に分散させ、β-ガラクトシダーゼ製剤「Biolacta」（5.4 U/mg,大和化成製）を200 U添加し40℃で5時間反応させ、目的とするp-ニトロフェニルβ-1,4-ガラクトシル-α-マルトペンタオシド（Ｇａｌ-Ｇ５Ｐ）を生成させた。次に5%塩酸溶液で反応液のpHを3.5にした後、5分間煮沸し、上記酵素を失活させた。本液の糖組成をＵＶ検出器（310nm）を備えたＨＰＬＣにより分析したところ、Ｇａｌ-Ｇ５Ｐは15.0%、p-ニトロフェニルβ-ガラクトシル-ガラクトシル-α-マルトペンタオシド（Ｇａｌ-Ｇａｌ-Ｇ５Ｐ）は5.5%であった。またこの場合はガラクトシル-ガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ラクトース、ラクトース等の中性糖はゲル濾過精製時にｐＮＰ誘導体と大きく分離するため、分解する必要はなかった。
【００５３】
本反応失活液を10倍に希釈した溶液をpH 3.5に調整し、Ｇａｌ-Ｇａｌ-Ｇ５Ｐを分解するために酵素製剤「ペクチネックス」（ノボノルディスクバイオインダストリー製）を200 U添加し、40℃で24時間で反応させた。反応終了は5%塩酸溶液で反応液のpHを3.5にした後、5分間煮沸し、上記酵素を失活させた。本液の糖組成をＵＶ検出器（310nm）を備えたＨＰＬＣにより分析したところ、Ｇａｌ-Ｇ５Ｐは14.5%、Ｇａｌ-Ｇａｌ-Ｇ５Ｐは0.5%であった。本液はゲル濾過精製カラム（実施例４，５記載と同様）によりＧａｌ-Ｇ５Ｐ含量98%以上の純度まで精製が可能であった。本ガラクタナーゼ処理を行わない場合は、同様の精製法を試みたところ、Ｇａｌ-Ｇ５ＰとＧａｌ-Ｇａｌ-Ｇ５Ｐの分離が困難なため、Ｇａｌ-Ｇ５Ｐ含量は92%までしか向上しなかった。
【００５４】
【発明の効果】
本発明によれば、ガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいはその誘導体をゲル濾過精製法を用いることなしに、またはゲル濾過精製法とその他の簡便な精製方法とを組み合わせて精製することを可能にできる方法、及びこの方法を利用した高純度のガラクトシル-マルトオリゴ糖及びその誘導体の製造方法を提供するができる。
さらに本発明によれば、反応終了液中に含まれる副生成物または原料物質を、目的生成物を実質的に分解することなく酵素的に分解して低分子化することで、ゲル濾過精製法以外のより簡便で効率の良い精製方法である逆浸透膜法を利用して、またはゲル濾過精製法と逆浸透膜法とを組み合わせて、高純度のガラクトシル-マルトオリゴ糖及びその誘導体の製造方法を提供することができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing a galactosyl-malto-oligosaccharide and a derivative thereof useful as a substrate for measuring α-amylase activity. More specifically, the present invention relates to a method capable of producing a high-purity galactosyl-maltooligosaccharide or a derivative thereof using a simpler purification method than the conventional method. In particular, the starting material and by-product lactose (lactose) in the reaction mixture and β-1,4-galactooligosaccharides with a polymerization degree of 2 or more are selectively decomposed by the hydrolysis action of the enzyme for further purification. It relates to an industrially useful production method that facilitates.
[0002]
[Prior art]
It has been widely used to measure α-amylase activity contained in human body fluids such as blood and urine and apply it to clinical diagnosis. When measuring the activity of α-amylase, the present inventors have used maltooligosaccharides (degree of glucose polymerization of 4 to 7) as a stable and sensitive substrate that is not subject to hydrolysis of a conjugated enzyme (α-glucosidase or glucoamylase). ) Or a derivative in which a galactosyl group is bonded to the non-reducing terminal glucose residue of the derivative [JP-A-3-264596]. This publication also discloses a method for producing these derivatives and a method for measuring amylase activity using the derivatives.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
In the method for producing a galactosyl-maltooligosaccharide or derivative thereof described in the above publication, a mixture of malto-oligosaccharide or derivative thereof and lactose or β-1,4-galactooligosaccharide as a raw material is dissolved in a buffer solution, and β-galactosidase is obtained. By acting, β-1,4-galactosyl-maltooligosaccharide or a derivative thereof is produced. However, the amount of the target galactosyl-malto-oligosaccharide or derivative thereof contained in the reaction completion solution is about 10% (w / w). The remainder is mainly lactose derived from the raw material and the transfer reaction product galactosyl-lactose, galactosyl-galactosyl-lactose or galactosyl-galactosyl-maltooligosaccharide.
[0004]
On the other hand, when galactosyl-maltooligosaccharide or a derivative thereof is used as an α-amylase substrate, a high purity of 98% or more is required. Therefore, it is necessary to produce a high-purity product using a gel filtration purification method. The gel filtration purification method is generally used when obtaining a high-purity product of maltooligosaccharide or a derivative thereof, and has a high separation ability, but has a disadvantage such as a small amount that can be processed and a high price of the gel itself. Have.
In particular, in the production method described in the above publication, gel filtration purification is required twice or more to obtain a high-purity product of the starting material maltooligosaccharide or derivative thereof and the target material galactosyl-maltooligosaccharide or derivative thereof. It is. Furthermore, since the galactosyl-malto-oligosaccharide content in the reaction-terminated liquid is low, when producing a high-purity product of galactosyl-malto-oligosaccharide or a derivative thereof on an industrial scale, the production amount is limited and it has to be expensive. .
[0005]
Therefore, an object of the present invention is to provide a method capable of purifying galactosyl-maltooligosaccharide or a derivative thereof without using a gel filtration purification method, or by combining the gel filtration purification method with another simple purification method, and An object of the present invention is to provide a method for producing high-purity galactosyl-maltooligosaccharides and derivatives thereof using this method.
[0006]
Furthermore, in order to achieve the above object, the present invention reduces the molecular weight of the by-product or raw material contained in the reaction end solution by enzymatic decomposition without substantially decomposing the target product, High-purity galactosyl-malto-oligosaccharide and its purification method using a simpler and more efficient purification method other than gel filtration purification method or a combination of gel filtration purification method and other simpler and more efficient purification method It is an object to provide a method capable of providing a method for producing a derivative.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The inventors of the present invention have made extensive studies in order to achieve the above object. As a result, they have found an enzyme group that does not decompose β-1,4-galactosyl-maltooligosaccharide and its derivatives and hydrolyzes only impurities such as lactose used as a raw material and galactosyl-oligosaccharide as a by-product, It is possible to purify the target β-1,4-galactosyl-maltooligosaccharide and its derivatives by separating the saccharide hydrolyzed with these enzymes and reducing the molecular weight by a purification method other than gel filtration purification method. As a result, the present invention has been completed.
[0008]
The method for producing galactosyl-maltooligosaccharide or galactosyl-maltooligosaccharide derivative of the present invention comprises at least one compound A selected from the group consisting of galactosyl-maltooligosaccharide or galactosyl-maltooligosaccharide derivative and lactose, galactosyl-lactose, galactosyl-galactosyl -A compound containing at least one compound B selected from the group consisting of lactose and galactosyl-galactosyl-maltooligosaccharide is allowed to act on an enzyme that preferentially hydrolyzes compound B to reduce the molecular weight of compound B; A method characterized in that the compound B and the compound A having a reduced molecular weight are separated [claim 1].
[0009]
Furthermore, the present invention allows β-galactosidase that preferentially hydrolyzes lactose to act on a mixture containing at least one compound A selected from the group consisting of galactosyl-malto-oligosaccharides or galactosyl-malto-oligosaccharide derivatives and lactose. The present invention relates to a method for lowering the molecular weight of lactose, characterized by lowering the molecular weight of lactose.11]. The present invention also provides a method for producing a galactosyl-malto-oligosaccharide or a galactosyl-malto-oligosaccharide derivative characterized in that the low-molecular-weight lactose is separated from a mixture containing the low-molecular-weight lactose obtained by the above method and Compound A. [Method of claim]13].
[0010]
In addition, the present invention is selected from the group consisting of at least one compound A selected from the group consisting of galactosyl-malto-oligosaccharides or galactosyl-malto-oligosaccharide derivatives and galactosyl-lactose, galactosyl-galactosyl-lactose and galactosyl-galactosyl-malto-oligosaccharide A low molecular weight galactosyl-oligosaccharide derivative characterized in that β-galactanase that preferentially hydrolyzes compound C is allowed to act on a mixture containing at least one kind of compound C to reduce the molecular weight of compound C [Claims]15]. Further, the present invention provides a galactosyl-malto-oligosaccharide or galactosyl-malto-oligosaccharide derivative characterized in that the low-molecular compound C is separated from a mixture comprising the low-molecular compound C obtained by the above method and the compound A. [Claims]17].
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The manufacturing method according to claim 1.
In the production method according to claim 1, at least one compound A selected from the group consisting of galactosyl-malto-oligosaccharides or galactosyl-malto-oligosaccharide derivatives and lactose, galactosyl-lactose, galactosyl-galactosyl-lactose and galactosyl-galactosyl-malto-oligo An enzyme that preferentially hydrolyzes compound B is allowed to act on a mixture containing at least one compound B selected from the group consisting of sugars to reduce the molecular weight of compound B.
[0012]
Here, examples of the enzyme that preferentially hydrolyzes compound B include at least one enzyme selected from the group consisting of β-galactanase and β-galactosidase. However, in the present invention, any enzyme other than these enzymes can be used as long as it can decompose the starting material and the by-product without substantially degrading the target substance.
[0013]
β-galactanase is an enzyme that hydrolyzes galactose polymers and is generally available. In the present invention, galactosyl-lactose, galactosyl-galactosyl-lactose or two or more galactose residues are bonded to the non-reducing end without degrading the target β-1,4-galactosyl-maltooligosaccharide or its derivative. An enzyme that degrades the maltooligosaccharide or its derivative is required. Examples of such β-galactanase include β-1,4-galactanase. Examples of β-1,4-galactanase include those derived from Bacillus subtilis (JM Labavitch et al., J. Biol. Chem., 251,5904-5910) and those derived from Penicillium citrinum (Starch Science, Vol. 36, P131-140, 1989), Aspergillus pulverulent-derived enzyme preparation “Pectinase G Amano” (Amano Pharmaceutical) Aspergillus niger-derived enzyme preparation “Pectinex” (Novo Nordisk Bio Industry) β-1,4-galacta Examples include nucleases.
[0014]
Regarding these enzyme groups, there is a description of hydrolysis of galactose oligosaccharides composed of galactose polymers or galactose residues in the literature, but it is not possible to hydrolyze galactosyl-galactosyl-maltooligosaccharides. Found for the first time in the invention.
[0015]
β-galactosidase is known as an enzyme that hydrolyzes various β-galactosides to release galactose, and is roughly classified into two types of β-galactosidase. The first group is β-galactosidase which has lactose resolution and is hardly degradable to galactosyl-malto-oligosaccharides or galactosyl-malto-oligosaccharide derivatives. The second group of β-galactosidases are β-galactosidases with strong transfer activity that produce galactosyl-maltooligosaccharides or derivatives thereof.
[0016]
Examples of β-galactosidase that hydrolyzes lactose without acting on the first group of galactosyl-malto-oligosaccharides or derivatives thereof include β-galactosidase derived from Kriveromyces. As such β-galactosidase, for example, an enzyme preparation “Lactozyme” (manufactured by Novo Nordisk Bioindustry) derived from Kluyvermyces fragilis, an enzyme preparation “GODO-YNL” derived from Kluyvermyces lactis ( Joint sake spirit) and the like.
[0017]
Specifically, the second group of β-galactosidase is, as described in JP-A-3-264596, an enzyme preparation “Biolacta” (manufactured by Daiwa Kasei), Aspergillus oryzae ( Aspergillus oryzoe) enzyme preparation “Lactase F Amano” (manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), “Lactase Y-AO” (Yakult) or those of the genus Cryptococcus described in JP-A-62-130695. Enzymes from the genus Bacillus or Cryptococcus that can transfer galactose residues to the non-reducing terminal glucose residues of maltooligosaccharides or their derivatives mainly by β-1,4-linkage can be used, but enzymes from the genus Bacillus Is preferred because of its high temperature stability.
[0018]
A mixture containing the compound A and the compound B is, for example, a sugar having a β-galactosyl residue (typically maltose) and malto-oligosaccharide or malto-oligosaccharide derivative as described in JP-A-3-264596. It can be a reaction product produced by allowing β-galactosidase to act on the mixture.
[0019]
Here, the “sugar having a β-galactosyl residue” can be β-1,4-galactooligosaccharide or lactose having a polymerization degree of 2 or more. The “maltooligosaccharide” can be a maltooligosaccharide having a degree of polymerization of glucose of 2 to 7, or a mixture thereof. The “maltooligosaccharide derivative” may be a maltooligosaccharide derivative having an α- or β-bonded unsubstituted or substituted phenyl group at the reducing end of a maltooligosaccharide having a polymerization degree of glucose of 2 to 7 or a mixture thereof. The substituted phenyl group can be a p-nitrophenyl group or a 2-chloro-4-nitrophenyl group. Specific examples of the “maltooligosaccharide derivative” include p-nitrophenyl α-maltopentaoside and 2-chloro-4-nitrophenyl β-maltotheolaoside.
[0020]
Β-galactosidase is an enzyme capable of transferring a galactose residue to a non-reducing terminal glucose residue of a maltooligosaccharide or a maltooligosaccharide derivative mainly through a β-1,4-galactoside bond. Β-galactosidase classified as:
[0021]
Specific examples of compound A include galactosyl-maltooligosaccharides represented by the following general formula (1).
[0022]
[Chemical 1]

[0023]
In the formula, at least one of X1 and X2 is a galactosyl group, the other is a hydrogen atom, R represents a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted phenyl group, and n represents an integer of 2 to 5.
[0024]
In addition, among the compounds B, lactose is a sugar used as the reaction raw material explained above. Further, the compound B may contain β-1,4-galactooligosaccharide having a polymerization degree of 2 or more used as a reaction raw material other than lactose. Examples of such β-1,4-galactooligosaccharide include melibiose, raffinose, stachyose, galactan and the like. Galactosyl-lactose, galactosyl-galactosyl-lactose, galactosyl-galactosyl-maltooligosaccharide are by-products of the above reaction. Most of these reaction by-products such as galactosyl-lactose are in β-1,4-form, but a small amount of β-1,6-form is also included.
[0025]
In the method of the present invention, at least one enzyme selected from the above enzyme group is selected and allowed to act on the reaction solution containing galactosyl-malto-oligosaccharide or a derivative thereof, whereby lactose, galactosyl-lactose, or galactosyl-galactosyl contained as impurities. -Lactose or galactosyl-galactosyl-malto-oligosaccharide can be hydrolyzed to reduce the molecular weight to glucose or galactose. The enzyme reaction conditions (temperature, pH, time, etc.) can be appropriately determined in consideration of the type of enzyme used and the type and amount of sugar to be reduced in molecular weight.
[0026]
Next, the compound B and the compound A having a reduced molecular weight are separated. The low molecular weight compound B is mainly glucose or galactose, and can be separated from the compound A, which is an oligosaccharide, by, for example, a reverse osmosis membrane method. Separation of oligosaccharides and monosaccharides can be easily carried out in large quantities using a reverse osmosis membrane and / or a strongly acidic cation exchange resin fractionation method. In general, gel filtration purification is a separation mode based on the size of the molecular weight, so that the separation can be facilitated between monosaccharides and oligosaccharides. Therefore, the separation can also be performed by gel filtration purification. Further, the saccharide purified by the reverse osmosis membrane method and / or the strongly acidic cation exchange resin fractionation method can be further purified by gel filtration. Thereby, since the gel filtration purification can be performed on the sugar having an improved content of the target substance, the productivity can be significantly improved.
In addition, methods other than the reverse osmosis membrane method, the strongly acidic cation exchange resin fractionation method, and the gel filtration can be used in the same manner as long as they are methods for separating substances based on molecular weight.
[0027]
The method of claim 11.
The present invention allows lactose to act on a mixture containing at least one compound A selected from the group consisting of galactosyl-maltooligosaccharides or galactosyl-maltooligosaccharide derivatives and lactose by preferentially hydrolyzing lactose. A method for lowering the molecular weight of lactose, which comprises lowering the molecular weight.
[0028]
Compound A in this method is the same as that described in the production method according to claim 1. The β-galactosidase can be a β-galactosidase having a lactose-degrading property and hardly degradable with respect to a galactosyl-malto-oligosaccharide or a galactosyl-malto-oligosaccharide derivative. It is the same as described. The enzyme reaction conditions (temperature, pH, time, etc.) can be appropriately determined in consideration of the type of enzyme used and the type and amount of sugar to be reduced in molecular weight.
[0029]
The method of claim 13.
A galactosyl-maltooligosaccharide or a galactosyl-maltooligosaccharide derivative can be produced by separating the reduced molecular weight lactose from the mixture containing the reduced molecular weight lactose and compound A obtained by the above method. The low molecular weight lactose is glucose and galactose, and the separation from the oligosaccharide compound A can be performed by, for example, reverse osmosis membrane method, strong acid cation exchange resin component, as in the production method of claim 1. It can be performed by a drawing method, a gel filtration method or the like.
[0030]
The method of claim 15.
The present invention provides at least one compound A selected from the group consisting of galactosyl-malto-oligosaccharides or galactosyl-malto-oligosaccharide derivatives and at least selected from the group consisting of galactosyl-lactose, galactosyl-galactosyl-lactose and galactosyl-galactosyl-malto-oligosaccharide A method for reducing the molecular weight of a galactosyl-oligosaccharide derivative, characterized by causing a β-galactanase that preferentially hydrolyzes compound C to act on a mixture containing one compound C to lower the molecular weight of compound C Is also included.
[0031]
Here, the compound A is the same as that described in the production method of the first aspect. Compound C is obtained by removing maltose from Compound B. The β-galactanase can be β-1,4-galactanase and is the same as that described in the production method according to claim 1. The conditions for the enzyme reaction (temperature, pH, time, etc.) can be appropriately determined in consideration of the type of β-galactanase used and the type and amount of sugar to be reduced in molecular weight.
[0032]
The manufacturing method according to claim 17.
A galactosyl-maltooligosaccharide or a galactosyl-maltooligosaccharide derivative can be produced by separating the compound C having a reduced molecular weight from the mixture containing the compound C having a reduced molecular weight and the compound A obtained by the above method. The compound C having a reduced molecular weight is mainly glucose and galactose, and the separation from the compound A which is an oligosaccharide can be performed by, for example, the reverse osmosis membrane method, the strongly acidic cation, and the like. An exchange resin fractionation method, a gel filtration method, or the like can be used.
[0033]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be further described by examples.
The sugar composition in the following examples was calculated from the peak area by analyzing the sample by high performance liquid chromatography (HPLC). HPLC conditions, column: Shodex RS-pak DC-613 (6 IDmm × 150mm), eluent: acetonitrile / water = 70/30 (v / v), flow rate: 0.9 ml / min, column temperature; room temperature, detector An RI monitor or UV detector (310 nm).
The enzyme activity was measured as follows.
[0034]
β - Galactosidase activity measurement
0.5 ml of 0.5% (w / v) p-nitrophenyl β-galactoside and 0.45 ml of 25 mM phosphate buffer (pH 6.5) were mixed and preincubated at 35 ° C. for 5 minutes. After adding 0.05 ml of an enzyme solution diluted to an appropriate concentration and reacting at 35 ° C. for 10 minutes, 2 ml of 0.2 M sodium carbonate was added to 1 ml of the reaction solution, and the absorbance at 405 nm was measured. The amount of pNP was determined by a calibration curve using 4-nitrophenol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) for setting a calibration coefficient. The amount of enzyme that liberates 1 μmol of pNP per minute under the above conditions was 1 U.
[0035]
β - Galactanase activity measurement
0.5 ml of 1.0% soybean arabinogalactan and 0.45 ml of 50 mM acetate buffer (pH 4.5) were mixed and pre-incubated at 35 ° C. for 5 minutes. After adding 0.05 ml of enzyme solution diluted to an appropriate concentration and reacting at 35 ° C. for 10 minutes, adding 1 ml of DNS reagent to 1 ml of reaction solution, boiling for 10 minutes, cooling, adding 5 ml of distilled water, Absorbance was measured. A calibration curve was obtained for the amount of reducing sugar released using galactose. The amount of enzyme that liberates 1 μmol of reducing sugar per minute under the above conditions was 1 U.
[0036]
Example 1 Selection of various enzyme agents
19.85 g (58.0 mmol) of lactose and 38.7 g (58.0 mmol) of maltotetraose were dispersed in 100 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), and β-galactosidase preparation “Biolacta” (5.4 U / mg, Daiwa Kasei) 200 U (manufactured by Bacillus circulans) was added and reacted at 40 ° C. for 5 hours to produce the desired β-1,4-galactosyl-maltotetraose. Subsequently, the pH of the reaction solution was adjusted to 3.5 with a 5% hydrochloric acid solution and then boiled for 5 minutes to deactivate the enzyme. The sugar composition of this reaction solution was analyzed by the above HPLC, β-1,4-galactosyl-maltotetraose was 10.5%, galactosyl-galactosyl-maltotetraose was 3.2%, galactosyl-galactosyl-lactose was 7.0%, galactosyl -Lactose was 2.1%, maltotetraose was 30.5%, lactose was 24.8%, glucose was 11.5%, galactose was 3.7%, and other oligosaccharides were 7.7%.
[0037]
Table 1 shows the results of HPLC analysis of the sugar composition obtained by adding 50 U of each enzyme agent to 10 ml of the above-mentioned reaction quenching solution diluted 10 times and reacting at 40 ° C. for 24 hours. It was shown to.
Further, from the results shown in Table 1, β-galactosidase “Lactozyme” “GODO-YNL” and β-1,4-galactanase “Pectinase G Amano” “Pectinex” meeting the purpose of the present invention are selected, and β-1 Then, hydrolysis was examined in the case where two kinds of enzyme agents, 4-galactanase and β-galactosidase, were allowed to act sequentially. First, 50 U each of β-1,4-galactanase agent was added to 10 ml of the above-mentioned reaction quenching solution diluted 10-fold, reacted at 40 ° C. for 24 hours, and then the enzyme was inactivated by boiling. . Next, Table 2 shows the results of HPLC analysis of the sugar composition obtained by adding 50 U of β-galactosidase and reacting at 40 ° C. for 24 hours.
[0038]
[Table 1]

[0039]
[Table 2]

[0040]
Example 2 p- Nitrophenyl β - Galactosyl - α - Hydrolysis to maltooligoside
In place of maltotetraose, p-nitrophenyl α-maltoside (G2P and the like), G3P, G4P, G5P, G6P and G7P were used, respectively, and the reaction was carried out under the same conditions as described in Example 1, and each β-1,4 A reaction mixture containing -galactosyl-GnP was obtained. Β-galactosidase “Lactozyme” “GODO-YNL” and β-1,4-galactanase “Pectinase G Amano” “Pectynex” were added to this reaction solution under the same conditions as above, and the results of analyzing the sugar composition were obtained. It is shown in Table 3. In this table, degradation to galactosyl-galactosyl-GnP, galactosyl-galactosyl-lactose, and galactosyl-lactose was omitted because it was the same as in Table 1, and only degradation for each β-1,4-galactosyl-GnP was shown.
[0041]
[Table 3]

[0042]
Example 3 2- Chloro -Four- Nitrophenyl β - Galactosyl - β - Hydrolysis to maltooligoside
In place of maltotetraose, 2-chloro-4-nitrophenyl β-maltoside (G2C and below), G3C, G4C, G5C, G6C, and G7C were used and reacted under the same conditions as described in Example 1, and each β A reaction mixture containing -1,4-galactosyl-GnC was obtained. Β-galactosidase “Lactozyme” “GODO-YNL” and β-1,4-galactanase “Pectinase G Amano” “Pectynex” were added to this reaction solution under the same conditions as above, and the results of analyzing the sugar composition were obtained. It is shown in Table 3. In this table, the degradation for galactosyl-galactosyl-GnC, galactosyl-galactosyl-lactose, and galactosyl-lactose was the same as in Table 1, and was omitted, and only the degradation for each β-1,4-galactosyl-GnC was shown.
[0043]
[Table 4]

[0044]
Example 4 β -1,4- Galactosyl - Preparation of maltotriose
Lactose 2.0 kg (5.8 mol) and maltotriose 2.9 kg (5.8 mol) were dispersed in 10 liters of 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), and β-galactosidase preparation “Biolacta” (5.4 U / mg, Daiwa Kasei) 20,000 U was added and reacted at 40 ° C. for 5 hours to produce the desired β-1,4-galactosyl-maltotriose. Next, the pH of the reaction solution was adjusted to 3.5 with a 5% hydrochloric acid solution and then boiled for 5 minutes to deactivate the enzyme. The sugar composition of this solution was analyzed by HPLC. Β-1,4-galactosyl-maltotriose was 10.1%, galactosyl-galactosyl-maltotriose was 2.8%, galactosyl-galactosyl-lactose was 7.2%, galactosyl-lactose 2.0%, maltotriose 29.8%, lactose 25.4%, glucose 12.0%, galactose 3.4% and other oligosaccharides 7.3%.
[0045]
In order to adjust the solution diluted 10-fold of this reaction quenching solution to pH 5.0 and decompose maltoteriose contained in the reaction solution, 50,000 U and galactosyl of Rhizopus nives origin glucoamylase (manufactured by Seikagaku Corporation) are used. -200,000 U of Bacillus subtilis origin β-1,4-galactanase (manufactured by Nippon Shokuhin Kako) was added to decompose lactose, galactosyl-galactosyl-lactose or galactosyl-galactosyl-maltotriose at 40 ° C for 24 hours Reacted. After completion of the reaction, the pH of the reaction solution was adjusted to 3.5 with a 5% hydrochloric acid solution and then boiled for 5 minutes to deactivate the enzyme.
Next, the pH of this reaction quenching solution was adjusted to 6.5, and 100,000 U of “lactozyme” (from Kluyvermyces fragilis) was added and reacted at 40 ° C. for 24 hours in order to decompose the remaining lactose of the raw material. After completion of the reaction, the pH of the reaction solution was adjusted to 3.5 with a 5% hydrochloric acid solution and then boiled for 5 minutes to deactivate the enzyme. When the sugar composition of this solution was analyzed by HPLC, β-1,4-galactosyl-maltotriose was 9.9%, galactosyl-galactosyl-maltotriose was 1.2%, glucose was 59%, galactose was 25%, lactose And 4.9% of other oligosaccharides including galactosyl-lactose and galactosyl-galactosyl-lactose.
[0046]
Using a column (26 cm, ID × 267 cm) packed with 6 liters of the enzyme reaction solution (40%, w / v, 2.4 kg as a solid) and a strongly acidic cation exchange resin Dowex XFS-43278 (manufactured by Dow Chemical), Column temperature: 65 ° C., flow rate: 1500 ml / min, detector: purified by RI monitor. As a result, the sugar composition of the purified liquid was β-1,4-galactosyl-maltotriose 62.3%, galactosyl-galactosyl-maltotriose 6.1%, glucose 2.3%, galactose 2.5%, lactose and galactosyl -Other oligosaccharides including lactose and galactosyl-galactosyl-lactose accounted for 26.8%. By this operation, the purity of the intended β-1,4-galactosyl-maltotriose was improved 6.3 times compared with the content of the first reaction finished solution.
Using a column (13 cm, ID × 95 cm) packed with Toyopeal HW-40S (Tosoh) filled with 250 ml of this solution (40%, w / v, 100 g as a solid), column temperature: 65 ° C., flow rate: 5 ml / min Detector: Purified by gel filtration with an RI monitor to obtain 48.5 g (solid matter) of β-galactosyl-maltotriose having a purity of 98.5%.
[0047]
Example 5 β -1,4- Galactosyl - Preparation of maltetraose
Lactose 2.0 kg (5.8 mol) and maltetraose 3.9 kg (5.8 mol) are dispersed in 10 l of 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), β-galactosidase preparation “Biolacta” (5.4 U / mg, manufactured by Daiwa Kasei) ) And 20 KU were added and reacted at 40 ° C. for 5 hours to produce the desired β-1,4-galactosyl-maltotriose. Next, the pH of the reaction solution was adjusted to 3.5 with a 5% hydrochloric acid solution and then boiled for 5 minutes to deactivate the enzyme. The sugar composition of this reaction solution was analyzed by the above HPLC, β-1,4-galactosyl-maltotetraose was 10.5%, galactosyl-galactosyl-maltotetraose was 3.2%, galactosyl-galactosyl-lactose was 7.0%, galactosyl -Lactose was 2.1%, maltotetraose was 30.5%, lactose was 24.8%, glucose was 11.5%, galactose was 3.7%, and other oligosaccharides were 7.7%.
[0048]
A solution obtained by diluting the reaction quenching solution 10 times to pH 5.0 is adjusted to pH 5.0, and Rhizopus nives origin glucoamylase (manufactured by Seikagaku Corporation) is dissolved in 50,000 U and galactosyl- In order to degrade lactose, galactosyl-galactosyl-lactose or galactosyl-galactosyl-maltotetraose, 200,000 U of an enzyme preparation “Pectinase G Amano” (manufactured by Amano Pharmaceutical) from Aspergillus pulverulent was added and reacted at 30 ° C. for 24 hours. It was. After completion of the reaction, the pH of the reaction solution was adjusted to 3.5 with a 5% hydrochloric acid solution and then boiled for 5 minutes to deactivate the enzyme.
[0049]
Next, in order to adjust the pH of the reaction quenching solution to 6.5 and decompose the remaining lactose of the raw material, add 100,000 U of the enzyme preparation “GODO-YNL” (joint spirit) from Kluyvermyces lactis. And reacted at 40 ° C. for 24 hours. After completion of the reaction, the pH of the reaction solution was adjusted to 3.5 with a 5% hydrochloric acid solution and then boiled for 5 minutes to deactivate the enzyme. The sugar composition of this solution was analyzed by HPLC. Β-1,4-galactosyl-maltetraose was 10.2%, galactosyl-galactosyl-maltotriose was 1.5%, glucose was 62%, galactose was 22%, lactose And 4.3% of other oligosaccharides including galactosyl-lactose and galactosyl-galactosyl-lactose.
[0050]
Using the reverse osmosis membrane module (DK4040CDA, manufactured by Desalination), the enzyme reaction solution was pressured at 20 kgf / cm.²The sugar composition of this liquid was 57.4% for β-1,4-galactosyl-maltotetraose, 5.3% for galactosyl-galactosyl-maltotetraose, 8.8% for glucose, and 5.5% for galactose. Other oligosaccharides including lactose and galactosyl-lactose and galactosyl-galactosyl-lactose accounted for 27.5%.
[0051]
By this operation, the intended β-1,4-galactosyl-maltototeraose was improved by a factor of 5.5 compared to the content of the initial reaction solution. Using a column (13 cm, ID × 95 cm) packed with Toyopeal HW-40S (manufactured by Tosoh) with 250 ml of this solution (40%, w / v, 100 g as a solid), column temperature: 65 ° C., flow rate: 5 ml / min Detector: Purified by gel filtration with RI monitor to obtain 49.5 g (solid matter) of β-galactosyl-maltotetraose with a purity of 98.5%.
[0052]
Example 6 p- Nitrophenyl β - Galactosyl - α - Preparation of maltopentaosideLactose (20 g) and p-nitrophenyl α-maltopentaoside (G5P) (10 g) were dispersed in 100 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), and β-galactosidase preparation “Biolacta” (5.4 U / mg, Daiwa Kasei) 200 U) was added and reacted at 40 ° C. for 5 hours to produce the desired p-nitrophenyl β-1,4-galactosyl-α-maltopentaoside (Gal-G5P). Next, the pH of the reaction solution was adjusted to 3.5 with a 5% hydrochloric acid solution and then boiled for 5 minutes to deactivate the enzyme. When the sugar composition of this solution was analyzed by HPLC equipped with a UV detector (310 nm), Gal-G5P was 15.0%, p-nitrophenyl β-galactosyl-galactosyl-α-maltopentaoside (Gal-Gal-G5P ) Was 5.5%. In this case, neutral sugars such as galactosyl-galactosyl-lactose, galactosyl-lactose, lactose and the like were largely separated from the pNP derivative during gel filtration purification, and thus did not need to be decomposed.
[0053]
A solution obtained by diluting the reaction quenching solution 10 times was adjusted to pH 3.5, and 200 U of an enzyme preparation “Pectinex” (manufactured by Novo Nordisk Bio Industry) was added to decompose Gal-Gal-G5P at 40 ° C. For 24 hours. After completion of the reaction, the pH of the reaction solution was adjusted to 3.5 with a 5% hydrochloric acid solution and then boiled for 5 minutes to deactivate the enzyme. When the sugar composition of this liquid was analyzed by HPLC equipped with a UV detector (310 nm), it was 14.5% for Gal-G5P and 0.5% for Gal-Gal-G5P. This solution could be purified to a purity of Gal-G5P content of 98% or more using a gel filtration purification column (same as described in Examples 4 and 5). When this galactanase treatment was not performed, the same purification method was attempted. As a result, it was difficult to separate Gal-G5P and Gal-Gal-G5P, and the Gal-G5P content was improved only to 92%.
[0054]
【The invention's effect】
According to the present invention, a method capable of purifying a galactosyl-maltooligosaccharide or a derivative thereof without using a gel filtration purification method or by combining the gel filtration purification method with another simple purification method, and A method for producing high-purity galactosyl-malto-oligosaccharides and derivatives thereof using this method can be provided.
Further, according to the present invention, the by-product or the raw material contained in the reaction completion liquid is enzymatically decomposed to reduce the molecular weight without substantially decomposing the target product, thereby obtaining a gel filtration purification method. A method for producing high-purity galactosyl-malto-oligosaccharides and their derivatives using the reverse osmosis membrane method, which is a simpler and more efficient purification method other than the above, or by combining the gel filtration purification method and the reverse osmosis membrane method. Can be provided.

Claims

At least one compound A selected from the group consisting of galactosyl-malto-oligosaccharide or galactosyl-malto-oligosaccharide derivative and at least one selected from the group consisting of lactose, galactosyl-lactose, galactosyl-galactosyl-lactose and galactosyl-galactosyl-malto-oligosaccharide The compound B is reduced in molecular weight by allowing at least one enzyme selected from the group consisting of β-galactanase and β-galactosidase, which preferentially hydrolyzes the compound B, to act on the mixture containing A method for producing a galactosyl-malto-oligosaccharide or a galactosyl-malto-oligosaccharide derivative, characterized in that the low molecular weight compound B and the compound A are separated.

The process according to claim 1 beta-galactanase is a beta-1,4 galactanase.

The production method according to claim 1 , wherein the β-galactosidase is a β-galactosidase that has lactose resolution and is hardly degradable with respect to a galactosyl-maltooligosaccharide or a galactosyl-maltooligosaccharide derivative.

The production method according to any one of claims 1 to 3 , wherein the low molecular weight compound B and the compound A are separated by a reverse osmosis membrane method and / or a strong acidic cation exchange resin fractionation method.

Mixture comprising Compound A and Compound B is, in any one of claims 1 to 4 which is produced by the action of β- galactosidase in a mixture of sugar and maltooligosaccharides or maltooligosaccharide derivatives with β- galactosyl residues The manufacturing method as described.

The production method according to claim 5 , wherein the sugar having a β-galactosyl residue is β-1,4-galactooligosaccharide or lactose having a polymerization degree of 2 or more.

The production method according to claim 5 , wherein the maltooligosaccharide is a maltooligosaccharide having a polymerization degree of glucose of 2 to 7, or a mixture thereof.

6. The process according to claim 5 , wherein the maltooligosaccharide derivative is a maltooligosaccharide derivative having an α- or β-bonded unsubstituted or substituted phenyl group at the reducing end of a maltooligosaccharide having a polymerization degree of glucose of 2 to 7 or a mixture thereof. .

The method according to claim 8 , wherein the substituted phenyl group is a p-nitrophenyl group or a 2-chloro-4-nitrophenyl group.

The production method according to claim 5 , wherein the β-galactosidase is an enzyme capable of transferring a galactose residue to a non-reducing terminal glucose residue of a maltooligosaccharide or a maltooligosaccharide derivative mainly through a β-1,4-galactoside bond.

Low molecular weight lactose by acting β-galactosidase preferentially hydrolyzing lactose on a mixture containing at least one compound A selected from the group consisting of galactosyl-maltooligosaccharide or galactosyl-maltooligosaccharide derivative and lactose And a method for reducing the molecular weight of lactose.

The production method according to claim 11 , wherein the β-galactosidase is a β-galactosidase that has lactose resolution and is hardly degradable with respect to a galactosyl-maltooligosaccharide or a galactosyl-maltooligosaccharide derivative.

A galactosyl-malto-oligosaccharide or a galactosyl-malto-oligosaccharide derivative characterized in that the reduced molecular weight lactose obtained by the method according to claim 11 or 12 is separated from a mixture containing the reduced molecular weight lactose and compound A. Production method.

The production method according to claim 13 , wherein the low molecular weight lactose and Compound A are separated by a reverse osmosis membrane method and / or a strong acidic cation exchange resin fractionation method.

At least one compound A selected from the group consisting of galactosyl-malto-oligosaccharides or galactosyl-malto-oligosaccharide derivatives and at least one compound selected from the group consisting of galactosyl-lactose, galactosyl-galactosyl-lactose and galactosyl-galactosyl-malto-oligosaccharides A method for reducing the molecular weight of a galactosyl-oligosaccharide derivative, comprising subjecting a mixture containing C to a β-galactanase that preferentially hydrolyzes the compound C to reduce the molecular weight of the compound C.

The production method according to claim 15 , wherein the β-galactanase is β-1,4-galactanase.

A galactosyl-malto-oligosaccharide or a galactosyl-malto-oligosaccharide, characterized in that the reduced-molecular compound C is separated from a mixture comprising the reduced-molecular compound C and the compound A obtained by the method according to claim 15 or 16. A method for producing a derivative.

The production method according to claim 17 , wherein the low molecular weight lactose and the compound A are separated by a reverse osmosis membrane method and / or a strongly acidic cation exchange resin fractionation method.