JP4112972B2 - Ｂ型肝炎ウイルスのｓ−表面抗原に対するモノクローナル抗体の可変領域及びこれをコードする遺伝子 - Google Patents
Ｂ型肝炎ウイルスのｓ−表面抗原に対するモノクローナル抗体の可変領域及びこれをコードする遺伝子 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
技術分野
本発明は、B型肝炎ウイルスのS-表面抗原に対するモノクローナル抗体の可変領域及びこれをコードする遺伝子、この遺伝子を含む組換えベクター、ならびにこの組換えベクターから得られる形質転換体に関する。
【０００２】
背景技術
B型肝炎ウイルス（以下「HBV」と称する）はデーン粒子として知られている42nmの球状粒子であって、外殻は多量のB型肝炎表面抗原を含んでおり、180個のB型肝炎コア蛋白質よりなる内部のヌクレオカプシドを取り囲んでいる。このヌクレオカプシドは、HBVゲノム、重合酵素などを含んでいる（Summersら、Proc. Nat. Acad. Sci, 72, 4579, 1975; Pierre Tiollaisら、Science, 213, 406-411, 1981）。
【０００３】
HBVゲノム内において、HBV表面抗原のコード領域は3つのORF（オープンリーディングフレーム）開始部位を含有しており、これらはいずれも同じS-ドメインを産生する共通の終止コドンを有している。したがって、HBV表面抗原は、（1）S-ドメインのみを含む小型HBV表面抗原（以下「S-表面抗原」と称する）、（2）S-ドメイン及びPre-S2として知られているさらに別の55アミノ酸ドメインを含む中型HBV表面抗原（以下「M-表面抗原」）、ならびに（3）S-ドメイン、Pre-S2ドメイン、及びPre-S1ドメインを含む大型HBV表面抗原（以下「L-表面抗原」）の3つの種類に分類される。これらの発現された表面抗原のうちS-表面抗原は約80％以上を占める。
【０００４】
S-表面抗原のサブタイプは、抗体認識の特性に従って分類された。すべての表面抗原において発現された抗原性ドメインは「a」決定基、そして他の4つのサブタイプは「d」もしくは「y」及び「w」もしくは「r」決定基である。「d」決定基は、第122番目の残基がリジンであるのに対し、「y」決定基はアルギニンである。同様に「w」決定基は、第160番目の残基がリジンであるのに対し、「r」決定基はアルギニンである(Kennedy R.C.ら、J. Immunol. 130, 385, 1983)。従って、血清タイプはadr、adw、ayr、及びaywなどの4つのサブタイプに分類される(Petersonら、J. Biol. Chem. 257, 10414, 1982; Lars O. Marniusら、Intervirology, 38, 24-34, 1995)。
【０００５】
前記S-表面抗原は、肝細胞に特異的に結合でき（Leendersら、Hepatology, 12, 141, 1990; Irina Ionescu-Matiuら、J. Med. Virology, 6, 175-178, 1980; Swan N.T.ら、Gastroenterology 80, 260-264, 1981; Swan N.T.ら、Gastroenterology, 85, 466-468, 1983;Marie,L.M.ら、Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 7708-7712, 1984）、ヒト肝血漿膜には、S-表面抗原に特異的に結合するアポリポ蛋白質H、エンドネクシンII（endonexin II）などの標的タンパク質が含まれることが同定されている（Mehdi H.ら、J. Virol., 68, 2415, 1994.; Hertogs K.ら、Virology, 197, 265, 1993）。
【０００６】
一方、有用な治療学的モノクローナル抗体を開発するに当たって、マウスから得られたモノクローナル抗体をヒトに適用する場合に免疫反応を引き起こす恐れがあるため、ヒト化された抗体が好ましい。
【０００７】
近年、大韓民国特許第1999−8650号公報において、HBVの3種の表面抗原（S-表面抗原、M-表面抗原、及びL-表面抗原）のうちL-表面抗原にのみ存在するPre-S1エピトープを認識するモノクローナル抗体の可変領域、それをコードする遺伝子、およびこれを用いたヒト化抗体が開示された。しかし、L-表面抗原は、発現する表面抗原の1〜2％に過ぎないため、L-表面抗原は治療学的な目的だけでなく診断のための抗−HBV抗体開発の標的としては不適当である。
【０００８】
発明の開示
したがって、本発明の主たる目的は、S-表面抗原、特にHBV表面抗原の全てに共通して存在する「a」決定基を特異的に認識するモノクローナル抗体の可変領域をコードする遺伝子を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、前記遺伝子を含む組換えベクターを提供することである。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、前記組換えベクターを用いて得られる形質転換体を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、前記モノクローナル抗体の可変領域を提供することである。
【００１２】
本発明の一局面にしたがい、HBV S-表面抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体の可変領域をコードする遺伝子が提供される。
【００１３】
本発明者らは、HBV韓国人患者に最も頻繁に見られる「adr」決定基タイプのS-表面抗原（インターナショナルエンザイム社、米国）をマウスに免疫し、免疫マウスから得られた脾臓細胞を骨髄腫細胞（SP2O-Ag14、ATCC CRL-1581）と融合して多数のハイブリッド細胞を製造し、次いでクローニングおよび選択の手順により、最終的に多数のモノクローナル抗体を得た。本発明者らは、得られた多数のモノクローナル抗体のうち「a」決定基に特異的に結合するモノクローナル抗体を選別し、「a」決定基に特異的に結合するだけではなく、その結合力に極めて優れた別個のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系（A9-11-5）を得た。
【００１４】
本発明者らは、前記ハイブリドーマ細胞系から全RNAを単離して軽鎖及び重鎖のcDNAを合成し、最終的に配列番号:5のヌクレオチド配列を含む約440bpの軽鎖cDNA遺伝子及び配列番号:6のヌクレオチド配列を含む約460bpの重鎖cDNA遺伝子を得た。
【００１５】
前記モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖からCDR（相補性決定領域）残基を検出した。その結果、軽鎖のCDR残基は23〜36位、52〜58位、及び91〜98位に存在することが同定され、各々の配列はそれぞれ配列番号:9、10、及び11のペプチドを表す。さらに、重鎖のCDR残基は31〜35位、50〜65位、及び98〜103位に存在することが見出され、各々の配列はそれぞれ配列番号:12、13、及び14のペプチドを表す。
【００１６】
したがって、本発明は、B型肝炎ウイルスのS-表面抗原に対するモノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードするcDNAであって、軽鎖可変領域が配列番号:9、10、及び11のペプチドを含むcDNAを含む。また、本発明は、前記軽鎖可変領域が配列番号:7のアミノ酸配列を有するcDNAを含み、好ましくは、配列番号:5のヌクレオチド配列を含むcDNAを含む。
【００１７】
また、本発明は、B型肝炎ウイルスのS-表面抗原に対するモノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするcDNAであって、重鎖可変領域が配列番号:12、13、及び14のペプチドを含むcDNAを含む。さらに、本発明は、前記重鎖可変領域が配列番号:8のアミノ酸配列を有するcDNAを含み、好ましくは配列番号:6のヌクレオチド配列を含むcDNAを含む。
【００１８】
前記モノクローナル抗体の軽鎖または重鎖可変領域をコードするcDNAは、例えば、pCRII（インビトロジェン社、米国）などのプラスミドベクターに挿入して組換えベクターを製造することができる。したがって、本発明は、前記軽鎖可変領域をコードするcDNAを含む組換えベクターpCRA9Lv及び前記重鎖可変領域をコードするcDNAを含む組換えベクターpCRA9Hvを含む。
【００１９】
さらに、前記組換えベクターpCRA9Lvおよび／またはpCRA9Hvで大腸菌などの微生物を形質転換させて形質転換体を得ることができる。従って、本発明は、前記組換えベクターpCRA9LvまたはpCRA9Hvでそれぞれ形質転換された大腸菌形質転換体DH5α／YRC-pCRA9Lv（寄託番号：KCTC 1011BP）または大腸菌形質転換体DH5α／YRC-pCRA9Hv（寄託番号：KCTC 1010BP）を含む。
【００２０】
公知の方法（J.Sambrookら、Molecular cloning, Vol.1, 1.25-1.28）を用いて前記形質転換体から組換えベクターを回収することができる。例えば、溶液1（50mM グルコース、25mM トリス塩酸、および10mM EDTA）で形質転換体の細胞膜を弱化させた後、溶液2（0.2N NaOHおよび1% SDS）で細胞膜を破壊し、蛋白質及び染色体を変性させることができる。溶液3（5M 酢酸カリウムおよび酢酸）を用いて組換えベクターを除いた他の成分を凝集させた後、遠心分離する。得られた組換えベクター層をエタノールを用いて沈殿させ、組換えベクターを回収することができる。
【００２１】
本発明は、配列番号:9、10、及び11のペプチドを含む軽鎖と配列番号:12、13、及び14のペプチドを含む重鎖とからなるモノクローナル抗体可変領域を含む。さらに、前記軽鎖可変領域が配列番号:7のアミノ酸配列を有し、重鎖可変領域が配列番号:8のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体可変領域が好ましい。
【００２２】
S-表面抗原に直接的に結合するCDR領域（すなわち、軽鎖の場合配列番号:9、10、及び11のペプチドをコードする遺伝子；重鎖の場合配列番号:12、13、14のペプチドをコードする遺伝子）をヒト抗体遺伝子に融合させるか、または本発明に係るモノクローナル抗体の可変領域をコードする遺伝子をヒト抗体の可変領域に置き換えることにより、前記本発明に係るモノクローナル抗体の可変領域をコードするcDNA遺伝子から、HBVに対するヒト化モノクローナル抗体を得ることができる。
【００２３】
前述したように、本発明に係るモノクローナル抗体の可変領域をコードする遺伝子は、HBVのS-表面抗原、特に、HBV表面抗原において発現比率が最も高い「a」決定基の認識に特に有効である。したがって、adr、adw、ayr、及びaywなど各種のタイプのHBV表面抗原に広範に適用し得るモノクローナル抗体を製造するため、HBVを中和および／または除去するために、本発明に係る遺伝子を用いることができる。
【００２４】
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例を通じてさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００２５】
実施例 1 ．細胞系（ A9-11-5 ）からの RNA の単離及びその cDNA の合成
1×108個のA9-11-5細胞を4Mグアニジニウムチオシアネート溶液10mlに加えて細胞を破壊し、酸性フェノール溶液8mlを加えた。前記混合物を10,000rpmにて10分間遠心分離してRNAを抽出した。抽出されたRNA 5μgに、オリゴd(T)0.5ng、RNA分解酵素阻害剤0.5unit、およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（M-MLV）100unitを加え、37℃で1時間反応させてcDNAを合成した。
【００２６】
合成されたcDNA 2μgを鋳型として、軽鎖の場合配列番号:1及び2のDNAオリゴマーをプライマーとして用い、重鎖の場合配列番号:3及び4のDNAオリゴマーをプライマーとして用いて、AmpliTaq重合酵素（パーキンエルマーバイオシステム社、米国）を使用してポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行った。PCRの第1の段階において、94℃で1分30秒間、55℃で2分間、72℃で3分間の反応条件下で30回反応を繰り返し行い、第2の段階では94℃で1分30秒間、55℃で2分間、72℃で10分間の反応条件下で1回行った。
【００２７】
増幅されたPCR産物に対して1.5％アガロースゲル電気泳動を行った。0.5μg／ml濃度のエチジウムブロマイド溶液100mlで20分間染色した後、100bpの標準DNAラダー（ライフテクノロジー社、米国）を基準として重鎖の場合約460bp、軽鎖の場合約440bpの位置に増幅された遺伝子産物が確認された。
【００２８】
実施例 2 ． cDNA のクローニング
実施例1において1.5％アガロースゲル電気泳動を行った後に透析膜（スペクトル社、米国）を用いて回収した440bp遺伝子断片（軽鎖遺伝子断片）にフェノール200μl及びクロロホルム200μlを加えて不純物を除去し、エタノール2.5mlを加えて遺伝子断片を精製した。精製された遺伝子断片をpCRIIベクター（インビトロジェン社、米国）にサブクローニングした後、大腸菌DH5α（ライフテクノロジー社、米国）を形質転換させて（Cohen,S.N.ら、Proc. Nat. Acad. Sci. 69, 2110, 1972）形質転換体を得た。得られた形質転換体を100μg／mlのアンピシリンが含有されたLB培地において一晩培養し処理してプラスミドを得た。続いて、制限酵素EcoRΙ（バイオラブ社、米国）でプラスミドを切断して前記の440bpの遺伝子断片が挿入されたクローンLv-1、Lv-4、及びLv-7を得た。
【００２９】
460bpの遺伝子断片（重鎖遺伝子断片）に対しても同じ工程を行って組換えベクターを得、組換えベクターで大腸菌DH5α（ライフテクノロジー社、米国）を形質転換させて形質転換体を得た。得られた形質転換体を100μg／mlのアンピシリンが含有されたLB培地において一晩培養した後処理してプラスミドを回収した。続いて、制限酵素EcoRΙ（バイオラブ社、米国）でプラスミドを切断して前記460bpの遺伝子断片が挿入されたクローンHv-1、Hv-4、及びHv-7を得た。
【００３０】
前記のクローンから得られた各プラスミド溶液100μg／mlにポリエチレングリコール溶液（20％ポリエチレングリコールおよび2.5M NaCl）60μlを加えて遠心分離した。得られた沈殿物に蒸溜水100μlを加え、フェノール溶液50μlを加えて2回抽出し、200μlのエタノールを用いてプラスミドを精製した。
【００３１】
2μgの精製プラスミドを含む溶液50μlに2N水酸化ナトリウム5μl及び10mM EDTA 10μlを加えた。次いでその混合液を37℃で30分間反応させた。反応混合液にM13プライマー及びT7プライマーをそれぞれ1pmolずつ加えて65℃で2分間反応させた後、室温まで温度が下がるように放置した。DNAシーケナーゼバージョンIIキット（DNA sequenase version II kit、ユナイテッドステーツバイオケミカル社、米国）を用いて各クローンのヌクレオチド配列を解析した。
【００３２】
その結果、軽鎖の3種のクローン（Lv-1、Lv-4、及びLv-7）のヌクレオチド配列は同一であった。これらのクローンから得られたプラスミドベクターをpCRA9Lvと名づけた。さらに、pCRA9Lvプラスミドベクターによる形質転換体を大腸菌DH5α／YRC-pCRA9Lvと名づけ、2000年5月16日付けで韓国生命工学研究所（Korea Research Institute of Biosci. & Biotech）のKCTC（Korean Collection for Type Cultures）に当初寄託し（KCTC 18021P）、その後2001年5月16日にブダペスト条約の下に寄託した（KCTC 1011BP）。
【００３３】
さらに、3種の重鎖のクローン（Hv-1、Hv-4、及びHv-7）のヌクレオチド配列が同一であった。これらのクローンから得られたプラスミドベクターをpCRA9Hvと名づけた。pCRA9Hvプラスミドベクターによる形質転換体を大腸菌DH5α／YRC-pCRA9Hvと名づけ、2000年5月16日付けで生命工学研究所のKCTCに当初寄託し（KCTC 18020P）、その後2001年5月16日にブダペスト条約の下に寄託した（KCTC 1010BP）。
【００３４】
実施例 3 ． cDNA のヌクレオチド配列解析
A9-11-5細胞系から得られたモノクローナル抗体の可変領域に対するアミノ酸配列の解析（Harris.L.ら、Protein Sci. 4. 306-310, 1995.;Kabat.E.A.ら、Sequence of proteins of immunological interest.第5版、1991; Williams A.Fら、Annu.Rev.Immunol. 6, 381-406, 1988）の結果、重鎖はI(B)サブグループに属し、軽鎖はラムダ1系列（λ1）であることが明らかになった。
【００３５】
可変領域のうち、抗原を認識するCDR残基は、重鎖の場合31〜35位（CDR1）、50〜65位（CDR2）、および98〜103位（CDR3）であり、軽鎖の場合23〜36位（CDR1）、52〜58位（CDR2）、および91〜98位（CDR3）であった。
【００３６】
実施例 4. ハイブリードマ細胞系 A9-11-5 から得られたモノクローナル抗体の結合親和性
A9-11-5細胞系から得られた2.0×10-11Mのモノクローナル抗体に、B型肝炎ウイルスのS-表面抗原（インターナショナルエンザイム社、米国）を様々な濃度（1.0×10-6〜1.0×10-12M）で加え、その混合物を室温で3時間反応させた。
【００３７】
各々の混合液100μlを、前記のS-表面抗原が0.1μgずつ予め結合された96ウェルイムロンプレート（immulon plate、ダイナテック社、米国）加えて、混合液を37℃で2時間インキュベートした後に上清を除去した。0.5％のカゼイン-PBS溶液200μlを各ウェルに加えて37℃で1時間さらにインキュベートした。西洋ワサビ過酸化分解酵素（horseradish peroxidase）が結合されたヤギ抗マウスポリクローナル抗体（シグマ社、米国）を1,000倍希釈した溶液100μlを加え、その吸光度をELISAリーダー（ダイナテック社、米国）を用いて測定した。
【００３８】
A9-11-5細胞系から得られたモノクローナル抗体は、1.84 × 10 9 M -1 と高い結合親和性を示した。ここで、結合親和性とは、モノクローナル抗体の結合を50％阻害する抗原濃度の逆数（Friguet B.ら、J. of Immunological Method, 77, 305-319, 1985）を意味する。
【００３９】
本発明を特定の態様に関して記述したが、本発明は当業者により様々な変更及び変形が可能であり、それらも特許請求の範囲において規定される本発明の範囲内に含まれることを理解されたい。
【００４０】
【００４１】
技術分野
本発明は、B型肝炎ウイルスのS-表面抗原に対するモノクローナル抗体の可変領域及びこれをコードする遺伝子、この遺伝子を含む組換えベクター、ならびにこの組換えベクターから得られる形質転換体に関する。
【０００２】
背景技術
B型肝炎ウイルス（以下「HBV」と称する）はデーン粒子として知られている42nmの球状粒子であって、外殻は多量のB型肝炎表面抗原を含んでおり、180個のB型肝炎コア蛋白質よりなる内部のヌクレオカプシドを取り囲んでいる。このヌクレオカプシドは、HBVゲノム、重合酵素などを含んでいる（Summersら、Proc. Nat. Acad. Sci, 72, 4579, 1975; Pierre Tiollaisら、Science, 213, 406-411, 1981）。
【０００３】
HBVゲノム内において、HBV表面抗原のコード領域は3つのORF（オープンリーディングフレーム）開始部位を含有しており、これらはいずれも同じS-ドメインを産生する共通の終止コドンを有している。したがって、HBV表面抗原は、（1）S-ドメインのみを含む小型HBV表面抗原（以下「S-表面抗原」と称する）、（2）S-ドメイン及びPre-S2として知られているさらに別の55アミノ酸ドメインを含む中型HBV表面抗原（以下「M-表面抗原」）、ならびに（3）S-ドメイン、Pre-S2ドメイン、及びPre-S1ドメインを含む大型HBV表面抗原（以下「L-表面抗原」）の3つの種類に分類される。これらの発現された表面抗原のうちS-表面抗原は約80％以上を占める。
【０００４】
S-表面抗原のサブタイプは、抗体認識の特性に従って分類された。すべての表面抗原において発現された抗原性ドメインは「a」決定基、そして他の4つのサブタイプは「d」もしくは「y」及び「w」もしくは「r」決定基である。「d」決定基は、第122番目の残基がリジンであるのに対し、「y」決定基はアルギニンである。同様に「w」決定基は、第160番目の残基がリジンであるのに対し、「r」決定基はアルギニンである(Kennedy R.C.ら、J. Immunol. 130, 385, 1983)。従って、血清タイプはadr、adw、ayr、及びaywなどの4つのサブタイプに分類される(Petersonら、J. Biol. Chem. 257, 10414, 1982; Lars O. Marniusら、Intervirology, 38, 24-34, 1995)。
【０００５】
前記S-表面抗原は、肝細胞に特異的に結合でき（Leendersら、Hepatology, 12, 141, 1990; Irina Ionescu-Matiuら、J. Med. Virology, 6, 175-178, 1980; Swan N.T.ら、Gastroenterology 80, 260-264, 1981; Swan N.T.ら、Gastroenterology, 85, 466-468, 1983;Marie,L.M.ら、Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 7708-7712, 1984）、ヒト肝血漿膜には、S-表面抗原に特異的に結合するアポリポ蛋白質H、エンドネクシンII（endonexin II）などの標的タンパク質が含まれることが同定されている（Mehdi H.ら、J. Virol., 68, 2415, 1994.; Hertogs K.ら、Virology, 197, 265, 1993）。
【０００６】
一方、有用な治療学的モノクローナル抗体を開発するに当たって、マウスから得られたモノクローナル抗体をヒトに適用する場合に免疫反応を引き起こす恐れがあるため、ヒト化された抗体が好ましい。
【０００７】
近年、大韓民国特許第1999−8650号公報において、HBVの3種の表面抗原（S-表面抗原、M-表面抗原、及びL-表面抗原）のうちL-表面抗原にのみ存在するPre-S1エピトープを認識するモノクローナル抗体の可変領域、それをコードする遺伝子、およびこれを用いたヒト化抗体が開示された。しかし、L-表面抗原は、発現する表面抗原の1〜2％に過ぎないため、L-表面抗原は治療学的な目的だけでなく診断のための抗−HBV抗体開発の標的としては不適当である。
【０００８】
発明の開示
したがって、本発明の主たる目的は、S-表面抗原、特にHBV表面抗原の全てに共通して存在する「a」決定基を特異的に認識するモノクローナル抗体の可変領域をコードする遺伝子を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、前記遺伝子を含む組換えベクターを提供することである。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、前記組換えベクターを用いて得られる形質転換体を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、前記モノクローナル抗体の可変領域を提供することである。
【００１２】
本発明の一局面にしたがい、HBV S-表面抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体の可変領域をコードする遺伝子が提供される。
【００１３】
本発明者らは、HBV韓国人患者に最も頻繁に見られる「adr」決定基タイプのS-表面抗原（インターナショナルエンザイム社、米国）をマウスに免疫し、免疫マウスから得られた脾臓細胞を骨髄腫細胞（SP2O-Ag14、ATCC CRL-1581）と融合して多数のハイブリッド細胞を製造し、次いでクローニングおよび選択の手順により、最終的に多数のモノクローナル抗体を得た。本発明者らは、得られた多数のモノクローナル抗体のうち「a」決定基に特異的に結合するモノクローナル抗体を選別し、「a」決定基に特異的に結合するだけではなく、その結合力に極めて優れた別個のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系（A9-11-5）を得た。
【００１４】
本発明者らは、前記ハイブリドーマ細胞系から全RNAを単離して軽鎖及び重鎖のcDNAを合成し、最終的に配列番号:5のヌクレオチド配列を含む約440bpの軽鎖cDNA遺伝子及び配列番号:6のヌクレオチド配列を含む約460bpの重鎖cDNA遺伝子を得た。
【００１５】
前記モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖からCDR（相補性決定領域）残基を検出した。その結果、軽鎖のCDR残基は23〜36位、52〜58位、及び91〜98位に存在することが同定され、各々の配列はそれぞれ配列番号:9、10、及び11のペプチドを表す。さらに、重鎖のCDR残基は31〜35位、50〜65位、及び98〜103位に存在することが見出され、各々の配列はそれぞれ配列番号:12、13、及び14のペプチドを表す。
【００１６】
したがって、本発明は、B型肝炎ウイルスのS-表面抗原に対するモノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードするcDNAであって、軽鎖可変領域が配列番号:9、10、及び11のペプチドを含むcDNAを含む。また、本発明は、前記軽鎖可変領域が配列番号:7のアミノ酸配列を有するcDNAを含み、好ましくは、配列番号:5のヌクレオチド配列を含むcDNAを含む。
【００１７】
また、本発明は、B型肝炎ウイルスのS-表面抗原に対するモノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするcDNAであって、重鎖可変領域が配列番号:12、13、及び14のペプチドを含むcDNAを含む。さらに、本発明は、前記重鎖可変領域が配列番号:8のアミノ酸配列を有するcDNAを含み、好ましくは配列番号:6のヌクレオチド配列を含むcDNAを含む。
【００１８】
前記モノクローナル抗体の軽鎖または重鎖可変領域をコードするcDNAは、例えば、pCRII（インビトロジェン社、米国）などのプラスミドベクターに挿入して組換えベクターを製造することができる。したがって、本発明は、前記軽鎖可変領域をコードするcDNAを含む組換えベクターpCRA9Lv及び前記重鎖可変領域をコードするcDNAを含む組換えベクターpCRA9Hvを含む。
【００１９】
さらに、前記組換えベクターpCRA9Lvおよび／またはpCRA9Hvで大腸菌などの微生物を形質転換させて形質転換体を得ることができる。従って、本発明は、前記組換えベクターpCRA9LvまたはpCRA9Hvでそれぞれ形質転換された大腸菌形質転換体DH5α／YRC-pCRA9Lv（寄託番号：KCTC 1011BP）または大腸菌形質転換体DH5α／YRC-pCRA9Hv（寄託番号：KCTC 1010BP）を含む。
【００２０】
公知の方法（J.Sambrookら、Molecular cloning, Vol.1, 1.25-1.28）を用いて前記形質転換体から組換えベクターを回収することができる。例えば、溶液1（50mM グルコース、25mM トリス塩酸、および10mM EDTA）で形質転換体の細胞膜を弱化させた後、溶液2（0.2N NaOHおよび1% SDS）で細胞膜を破壊し、蛋白質及び染色体を変性させることができる。溶液3（5M 酢酸カリウムおよび酢酸）を用いて組換えベクターを除いた他の成分を凝集させた後、遠心分離する。得られた組換えベクター層をエタノールを用いて沈殿させ、組換えベクターを回収することができる。
【００２１】
本発明は、配列番号:9、10、及び11のペプチドを含む軽鎖と配列番号:12、13、及び14のペプチドを含む重鎖とからなるモノクローナル抗体可変領域を含む。さらに、前記軽鎖可変領域が配列番号:7のアミノ酸配列を有し、重鎖可変領域が配列番号:8のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体可変領域が好ましい。
【００２２】
S-表面抗原に直接的に結合するCDR領域（すなわち、軽鎖の場合配列番号:9、10、及び11のペプチドをコードする遺伝子；重鎖の場合配列番号:12、13、14のペプチドをコードする遺伝子）をヒト抗体遺伝子に融合させるか、または本発明に係るモノクローナル抗体の可変領域をコードする遺伝子をヒト抗体の可変領域に置き換えることにより、前記本発明に係るモノクローナル抗体の可変領域をコードするcDNA遺伝子から、HBVに対するヒト化モノクローナル抗体を得ることができる。
【００２３】
前述したように、本発明に係るモノクローナル抗体の可変領域をコードする遺伝子は、HBVのS-表面抗原、特に、HBV表面抗原において発現比率が最も高い「a」決定基の認識に特に有効である。したがって、adr、adw、ayr、及びaywなど各種のタイプのHBV表面抗原に広範に適用し得るモノクローナル抗体を製造するため、HBVを中和および／または除去するために、本発明に係る遺伝子を用いることができる。
【００２４】
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例を通じてさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００２５】
実施例 1 ．細胞系（ A9-11-5 ）からの RNA の単離及びその cDNA の合成
1×108個のA9-11-5細胞を4Mグアニジニウムチオシアネート溶液10mlに加えて細胞を破壊し、酸性フェノール溶液8mlを加えた。前記混合物を10,000rpmにて10分間遠心分離してRNAを抽出した。抽出されたRNA 5μgに、オリゴd(T)0.5ng、RNA分解酵素阻害剤0.5unit、およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（M-MLV）100unitを加え、37℃で1時間反応させてcDNAを合成した。
【００２６】
合成されたcDNA 2μgを鋳型として、軽鎖の場合配列番号:1及び2のDNAオリゴマーをプライマーとして用い、重鎖の場合配列番号:3及び4のDNAオリゴマーをプライマーとして用いて、AmpliTaq重合酵素（パーキンエルマーバイオシステム社、米国）を使用してポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行った。PCRの第1の段階において、94℃で1分30秒間、55℃で2分間、72℃で3分間の反応条件下で30回反応を繰り返し行い、第2の段階では94℃で1分30秒間、55℃で2分間、72℃で10分間の反応条件下で1回行った。
【００２７】
増幅されたPCR産物に対して1.5％アガロースゲル電気泳動を行った。0.5μg／ml濃度のエチジウムブロマイド溶液100mlで20分間染色した後、100bpの標準DNAラダー（ライフテクノロジー社、米国）を基準として重鎖の場合約460bp、軽鎖の場合約440bpの位置に増幅された遺伝子産物が確認された。
【００２８】
実施例 2 ． cDNA のクローニング
実施例1において1.5％アガロースゲル電気泳動を行った後に透析膜（スペクトル社、米国）を用いて回収した440bp遺伝子断片（軽鎖遺伝子断片）にフェノール200μl及びクロロホルム200μlを加えて不純物を除去し、エタノール2.5mlを加えて遺伝子断片を精製した。精製された遺伝子断片をpCRIIベクター（インビトロジェン社、米国）にサブクローニングした後、大腸菌DH5α（ライフテクノロジー社、米国）を形質転換させて（Cohen,S.N.ら、Proc. Nat. Acad. Sci. 69, 2110, 1972）形質転換体を得た。得られた形質転換体を100μg／mlのアンピシリンが含有されたLB培地において一晩培養し処理してプラスミドを得た。続いて、制限酵素EcoRΙ（バイオラブ社、米国）でプラスミドを切断して前記の440bpの遺伝子断片が挿入されたクローンLv-1、Lv-4、及びLv-7を得た。
【００２９】
460bpの遺伝子断片（重鎖遺伝子断片）に対しても同じ工程を行って組換えベクターを得、組換えベクターで大腸菌DH5α（ライフテクノロジー社、米国）を形質転換させて形質転換体を得た。得られた形質転換体を100μg／mlのアンピシリンが含有されたLB培地において一晩培養した後処理してプラスミドを回収した。続いて、制限酵素EcoRΙ（バイオラブ社、米国）でプラスミドを切断して前記460bpの遺伝子断片が挿入されたクローンHv-1、Hv-4、及びHv-7を得た。
【００３０】
前記のクローンから得られた各プラスミド溶液100μg／mlにポリエチレングリコール溶液（20％ポリエチレングリコールおよび2.5M NaCl）60μlを加えて遠心分離した。得られた沈殿物に蒸溜水100μlを加え、フェノール溶液50μlを加えて2回抽出し、200μlのエタノールを用いてプラスミドを精製した。
【００３１】
2μgの精製プラスミドを含む溶液50μlに2N水酸化ナトリウム5μl及び10mM EDTA 10μlを加えた。次いでその混合液を37℃で30分間反応させた。反応混合液にM13プライマー及びT7プライマーをそれぞれ1pmolずつ加えて65℃で2分間反応させた後、室温まで温度が下がるように放置した。DNAシーケナーゼバージョンIIキット（DNA sequenase version II kit、ユナイテッドステーツバイオケミカル社、米国）を用いて各クローンのヌクレオチド配列を解析した。
【００３２】
その結果、軽鎖の3種のクローン（Lv-1、Lv-4、及びLv-7）のヌクレオチド配列は同一であった。これらのクローンから得られたプラスミドベクターをpCRA9Lvと名づけた。さらに、pCRA9Lvプラスミドベクターによる形質転換体を大腸菌DH5α／YRC-pCRA9Lvと名づけ、2000年5月16日付けで韓国生命工学研究所（Korea Research Institute of Biosci. & Biotech）のKCTC（Korean Collection for Type Cultures）に当初寄託し（KCTC 18021P）、その後2001年5月16日にブダペスト条約の下に寄託した（KCTC 1011BP）。
【００３３】
さらに、3種の重鎖のクローン（Hv-1、Hv-4、及びHv-7）のヌクレオチド配列が同一であった。これらのクローンから得られたプラスミドベクターをpCRA9Hvと名づけた。pCRA9Hvプラスミドベクターによる形質転換体を大腸菌DH5α／YRC-pCRA9Hvと名づけ、2000年5月16日付けで生命工学研究所のKCTCに当初寄託し（KCTC 18020P）、その後2001年5月16日にブダペスト条約の下に寄託した（KCTC 1010BP）。
【００３４】
実施例 3 ． cDNA のヌクレオチド配列解析
A9-11-5細胞系から得られたモノクローナル抗体の可変領域に対するアミノ酸配列の解析（Harris.L.ら、Protein Sci. 4. 306-310, 1995.;Kabat.E.A.ら、Sequence of proteins of immunological interest.第5版、1991; Williams A.Fら、Annu.Rev.Immunol. 6, 381-406, 1988）の結果、重鎖はI(B)サブグループに属し、軽鎖はラムダ1系列（λ1）であることが明らかになった。
【００３５】
可変領域のうち、抗原を認識するCDR残基は、重鎖の場合31〜35位（CDR1）、50〜65位（CDR2）、および98〜103位（CDR3）であり、軽鎖の場合23〜36位（CDR1）、52〜58位（CDR2）、および91〜98位（CDR3）であった。
【００３６】
実施例 4. ハイブリードマ細胞系 A9-11-5 から得られたモノクローナル抗体の結合親和性
A9-11-5細胞系から得られた2.0×10-11Mのモノクローナル抗体に、B型肝炎ウイルスのS-表面抗原（インターナショナルエンザイム社、米国）を様々な濃度（1.0×10-6〜1.0×10-12M）で加え、その混合物を室温で3時間反応させた。
【００３７】
各々の混合液100μlを、前記のS-表面抗原が0.1μgずつ予め結合された96ウェルイムロンプレート（immulon plate、ダイナテック社、米国）加えて、混合液を37℃で2時間インキュベートした後に上清を除去した。0.5％のカゼイン-PBS溶液200μlを各ウェルに加えて37℃で1時間さらにインキュベートした。西洋ワサビ過酸化分解酵素（horseradish peroxidase）が結合されたヤギ抗マウスポリクローナル抗体（シグマ社、米国）を1,000倍希釈した溶液100μlを加え、その吸光度をELISAリーダー（ダイナテック社、米国）を用いて測定した。
【００３８】
A9-11-5細胞系から得られたモノクローナル抗体は、1.84 × 10 9 M -1 と高い結合親和性を示した。ここで、結合親和性とは、モノクローナル抗体の結合を50％阻害する抗原濃度の逆数（Friguet B.ら、J. of Immunological Method, 77, 305-319, 1985）を意味する。
【００３９】
本発明を特定の態様に関して記述したが、本発明は当業者により様々な変更及び変形が可能であり、それらも特許請求の範囲において規定される本発明の範囲内に含まれることを理解されたい。
【００４０】
Claims (12)
- B型肝炎ウイルスのS-表面抗原に対するモノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードするcDNAであって、該軽鎖可変領域の CDR1 、 2 、 3 がそれぞれ配列番号： 9 、 10 、及び 11 に示されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである軽鎖可変領域をコードするcDNA。
- 軽鎖可変領域が配列番号:7のアミノ酸配列を有する請求項1記載のcDNA。
- 配列番号:5のヌクレオチド配列を含む請求項2記載のcDNA。
- B型肝炎ウイルスのS-表面抗原に対するモノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするcDNAであって、該重鎖可変領域の CDR1 、 2 、 3 がそれぞれ配列番号： 12 、 13 、及び 14 に示されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである軽鎖可変領域をコードするcDNA。
- 重鎖可変領域が配列番号:8のアミノ酸配列を有する請求項4記載のcDNA。
- 配列番号:6のヌクレオチド配列を含む請求項5記載のcDNA。
- 請求項1記載のcDNAを含む組換えベクター。
- 請求項4記載のcDNAを含む組換えベクター。
- 請求項7記載の組換えベクターで形質転換された大腸菌形質転換体DH5α／YRC-pCRA9Lv（KCTC 1011BP）。
- 請求項8記載の組換えベクターで形質転換された大腸菌形質転換体DH5α／YRC-pCRA9Hv（KCTC 1010BP）。
- B 型肝炎ウィルスの S- 表面抗原に対するモノクローナル抗体の可変領域であって、 CDR1 、 2 、 3 がそれぞれ配列番号： 9 、 10 、及び 11 に示されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである軽鎖可変領域と、 CDR1 、 2 、 3 がそれぞれ配列番号： 12 、 13 、及び 14 に示されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体の可変領域。
- 軽鎖の可変領域が配列番号:7のアミノ酸配列を有し、重鎖の可変領域が配列番号:8のアミノ酸配列を有する、請求項11記載のモノクローナル抗体の可変領域。
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