JP4125904B2 - Immunostimulators and antitumor agents - Google Patents

Description

［式中、Ｒ¹は−ＣＨＯまたは−ＣＨ₂Ｒ⁴（Ｒ⁴はヒドロキシまたは保護されたヒドロキシ）；Ｒ²およびＲ³は一方が水素原子、他方が水素原子、ヒドロキシ、または保護されたヒドロキシ；またはＲ²とＲ³が一緒になってオキソ］で示される化合物、その光学活性体、もしくはそれらの製薬上許容される塩、もしくはそれらの水和物を有効成分として含有するＧＭ−ＣＳＦ様医薬組成物、に関する。
【０００５】
さらには、以下のＩＩ）〜ＸＩＶ）に関する。
ＩＩ）一般式（Ｉ）：
【化８】

（式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は請求項１と同意義）で示される化合物、その光学活性体、もしくはそれらの製薬上許容される塩、もしくはそれらの水和物を有効成分として含有する免疫賦活剤。
【０００６】
ＩＩＩ）一般式（Ｉ）：
【化９】

（式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は請求項１と同意義）で示される化合物、その光学活性体、もしくはそれらの製薬上許容される塩、もしくはそれらの水和物を有効成分として含有する好中球減少症の治療または予防剤。
【０００７】
ＩＶ）一般式（Ｉ）：
【化１０】

（式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は請求項１と同意義）で示される化合物、その光学活性体、もしくはそれらの製薬上許容される塩、もしくはそれらの水和物を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
【０００８】
Ｖ）腫瘍が造血器腫瘍であるＩＶ）記載の抗腫瘍剤。
ＶＩ）一般式（Ｉ）：
【化１１】

（式中、Ｒ¹は−ＣＨＯまたは−ＣＨ₂Ｒ⁴（Ｒ⁴はヒドロキシまたは保護されたヒドロキシ）；Ｒ²およびＲ³はともに水素原子）で示される化合物、その光学活性体、もしくはそれらの製薬上許容される塩、もしくはそれらの水和物。
【０００９】
ＶＩＩ）式：
【化１２】

で示される化合物、その光学活性体、もしくはそれらの製薬上許容される塩、もしくはそれらの水和物。
ＶＩＩＩ）ＶＩ）またはＶＩＩ）に記載の化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
ＩＸ）ＧＭ−ＣＳＦ様活性を有するＶＩＩＩ）記載の医薬組成物。
Ｘ）ＶＩ）またはＶＩＩ）に記載の化合物を有効成分として含有する免疫賦活剤。
ＸＩ）ＶＩ）またはＶＩＩ）に記載の化合物を有効成分として含有する好中球減少症の治療または予防剤。
ＸＩＩ）ＶＩ）またはＶＩＩ）に記載の化合物を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
ＸＩＩＩ）腫瘍が造血器腫瘍であるＸＩＩ）記載の抗腫瘍剤。
ＸＩＶ）ブロキサミア(Bloxamia)属に属する微生物を培養し、得られた培養物から産生された化合物を分離、精製する工程を包含する請求項ＶＩ）またはＶＩＩ）のいずれかに記載の化合物の製造方法。
【００１０】
本明細書中、「保護されたヒドロキシ」とは、Protective Groups in Organic Synthesis, Theodora W Green (John Wiley & Sons)等に記載された、通常用いられるヒドロキシの保護基で保護されたヒドロキシを意味する。例えば、ｔ−ブチル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、トリチル、メトキシメチル、メトキシエトキシメチル、ベンジルオキシメチル、ｐ−メトキシベンジルオキシメチル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、トリイソプロピルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、メタンスルホニル、アセチル、ピバロイル、ベンゾイル、テトラヒドロピラニル等で保護されたヒドロキシが挙げられる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下に本発明化合物（Ｉ）の製造方法を説明する。製造法としては、微生物の発酵生産物から分離採取する方法（抽出法）、およびそれらを出発原料として化学合成（合成法）する方法が挙げられる。
抽出法においては、本発明化合物（Ｉ）を産生し得る微生物を通常の発酵生産に用いる培地組成、培地条件で培養し、通常の発酵生産物を分離採取する方法により化合物（Ｉ）を単離する。
本発明化合物（Ｉ）を産生し得る微生物としては、ブロキサミア(Bloxamia)属に属する微生物、例えばブロキサミア クレメア(cremea) ＲＦ−１９４５株が例示される。ブロキサミア クレメア ＲＦ−１９４５は以下のような形態学的性状を有していた。
【００１２】
コーンミール寒天平板培地上での生育はやや遅く、コロニーは無色、コロニーの裏面も無色で、色素を産生せず、気中菌糸は認められなかった。
寒天中に埋没した栄養菌糸は無色で表面は平滑、幅は1.0μｍ〜2.0μｍで多細胞からなり、分枝する。分生子柄は培地上の菌糸組織からなる無色のストロマから直立、集合し、濃茶色から黒色で不定形のスポロドキアを形成する。個々の分生子柄は長さ30.0μｍ〜40.0 μｍ、幅2.0μｍ〜2.5μｍの円筒形で多細胞、基部は薄茶色で上方に向かって濃度を増し先端は濃茶色、表面は滑沢である。
分生子形成細胞は分生子柄と一体化し、分生子形成様式は単出芽型である。
内生の分生子は単細胞で、長さ2.5μｍ〜4.0μｍ、幅2.0μｍの短円柱形を呈し、無色で、表面は平滑、スポロドキア上で集合しクリーム状の粘塊となる。
ポテト・デキストロース寒天平板培地上での生育はやや遅く、コロニーは無色、コロニーの裏面も無色で、色素の産生は認められず、植菌寒天片周辺で若干の気中菌糸を形成した。スポロドキアの形成は認められなかった。10.5〜32.0℃の範囲で生育し、生育至適温度は19.0〜29.0℃であった。
テレオモルフはいずれの培地上でも観察されなかった。
以上の所見から、本菌株はブロキサミア属(Bloxamia)に属する不完全菌であると推察し、文献（Pirozynski, K.A., and G. Morgan-Jones. 1968. Notes on Microfungi. III. Trans. Brit. Mycol. Soc. 51:185-206 7904, Nag Raj & Kendrick. 1975. A Monograph of Chalara and Allied Genera. Wilfred Laurier Univ. Press, Waterloo, Canada, B. J. Coppins & D. W. Minter., 1980. A new Hyphomycete from Northumberland. Notes R. B. G. Edinb. 38(2): 363-635, Arambarri, A., M. Cabello, and C. Cazau. 1992. A new hyphomycete from Santiago River. V. Bloxamia cremea. Mycotaxon 43:327-330）に記載されているブロキサミア属の既知種と比較した。その結果、上記の形態学的特徴から、本菌株をブロキサミア クレメア(Bloxamia cremea)と同定した。
【００１３】
尚、本菌株は独立行政法人産業技術総合研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に受託番号「Ｐ−１８７５５」として平成１４年（２００２年）３月８日に寄託されている。
【００１４】
本発明化合物（Ｉ）の生産用培地としては、炭素源、窒素源および無機塩を適当に含有するものであれば合成培地または天然培地のいずれでも好適に用いることができる。必要に応じて、ビタミン類またはその他栄養物質を適宜加えてもよい。
【００１５】
炭素源としては例えば、グルコース、マルトース、フラクトース、シュークロース、デンプン等の糖類、グリセロール、マンニトール等のアルコール類、グリシン、アラニン、アスパラギン等のアミノ酸類、大豆油、オリーブ油等の油脂類等の一般的な炭素源より微生物の資化性を考慮して１種または２種以上を適宜選択して用いればよい。
窒素源としては、大豆粉、コーンスチープリカー、ビーフエキス、ペプトン、酵母エキス、アミノ酸混合物、魚粉等の有機含窒素化合物またはアンモニウム塩、硝酸塩等の無機窒素化合物等が挙げられ、微生物の資化性を考慮して１種または２種以上を適宜選択して用いればよい。無機塩としては、例えば炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸銅、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化コバルト、各種リン酸塩を必要に応じて添加すればよい。
また、消泡剤、例えば植物油、ポリプロピレングリコール等は必要に応じて添加することができる。
【００１６】
培養温度は微生物が発育し、本発明化合物（Ｉ）を生産する範囲で適宜変更できるが、好ましくは１０℃〜３２℃であり、さらに好ましくは２０℃〜２５℃である。初発ｐＨは６〜８付近が好ましく、培養時間は通常数日〜数週間程度であるが、本発明化合物（Ｉ）の生産量が採取可能な量に達した時、好ましくは最高に達したときに培養を終了すればよい。培養法は固層培養、通気攪拌培養等の通常用いられる方法であればいずれも好適に用い得る。
【００１７】
培養物から発酵生産物を分離採取する方法には、濾過、遠心分離、各種イオン交換樹脂やその他の活性吸着やクロマトグラフィー、各種有機溶媒による抽出等を適当に組み合わせた通常の発酵生産物分離精製法を用いることができる。例えば、培養物を、酢酸エチル、ｎ−ブタノール、アセトン、メチルエチルケトン等の有機溶媒で抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーと薄層クロマトグラフィーを組み合わせて分離精製すればよい。
【００１８】
一般式（Ｉ）で表される化合物の合成法としては、上記の方法で得られた抽出物を出発原料にして行うことができる。例えば、下記に示す化合物（Ａ）：
【化１３】

を出発原料にして、アセチルオキシ基の脱保護反応、脱保護反応によりえられヒドロキシ基を有する化合物の保護や酸化反応を行うことにより種々の化合物を合成することができる。
【００１９】
また、一般式（Ｉ）で表される化合物は、特開昭６３−２１５６５０に記載された下記に示す化合物（Ｂ）：
【化１４】

（ＦＲ−９００４７８（ビニグロール））を出発原料として、特開昭６３−２１５６５０等に記載の方法に従って、ヒドロキシ基の保護や酸化反応を行うことによっても合成することができる。特開昭６３−２１５６５０には、式：
【化１５】

_{（式中、 Ph はフェニル、 TBDMS はｔ−ブチルジメチルシリル、および Ac はアセチル）で表される化合物が具体的に記載されている。}
また、J. Org. Chem., 1993, 58, 2349、Synlett., 1996, 625、Synlett., 1996, 1057および219、J. Org. Chem., 1997, 62, 5062等に記載されている方法に従って化合物（Ｂ）を合成することもできる。
【００２０】
ヒドロキシ基の保護および脱保護を行う場合は、Protective Groups in Organic Synthesis, Theodora W Green (John Wiley & Sons)等に記載の方法に従って行うことができる。
１級および２級のヒドロキシ基を有する化合物は、導入するヒドロキシ基の保護基の種類や反応条件等によって、一方のヒドロキシ基のみが保護される場合および両方のヒドロキシ基が保護される場合がある。両方のヒドロキシ基が保護された場合は一方のみを脱保護することもできる。それぞれのヒドロキシ基を異なる保護基で保護することもできる。
【００２１】
ヒドロキシ基をアセチルで保護する場合は、適当な溶媒中、ヒドロキシ基を有する化合物をピリジン等の塩基の存在下、無水酢酸、塩化アセチル等で処理すること等により行うことができる。アセチル基の脱保護は、保護されたヒドロキシ基を有する化合物を、メタノール等の溶媒中で、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基で処理することにより行うことができる。ピバロイル、ベンゾイル等で保護・脱保護する場合も同様に行うことができる。
ヒドロキシ基をシリルで保護する場合は、適当な溶媒中、ヒドロキシ基を有する化合物をイミダゾール、トリエチルアミン等の塩基の存在下、また必要に応じてジメチルアミノピリジンの存在下、ハロゲン化シリルと処理するか、２，６−ルチジン等の塩基の存在下、シリルトリフラートで処理すること等により行うことができる。シリル基の脱保護は、保護されたヒドロキシ基を有する化合物を、テトラヒドロフラン−酢酸−水で処理するか、適当な溶媒中、ｎ−テトラブチルアンモニウムフルオリドで処理すること等により行うことができる。
ヒドロキシ基をベンジルで保護する場合は、適当な溶媒中、ヒドロキシ基を有する化合物をアルコキシド等の塩基の存在下、ハロゲン化ベンジルと処理すること等により行うことができる。ベンジル基の脱保護は水素添加等により行うことができる。ｐ−メトキシベンジル等で保護・脱保護する場合も同様に行うことができる。
酸化反応を行う場合は、ジョーンズ酸化、コリンズ酸化、ＰＣＣ酸化、スワン酸化等、通常用いられる酸化反応を行うことができる。
【００２２】
「本発明化合物」という場合には、製薬上許容される塩、またはその水和物も包含される。例えば、アルカリ金属（リチウム、ナトリウム、カリウム等）、アルカリ土類金属（マグネシウム、カルシウム等）、アンモニウム、有機塩基およびアミノ酸との塩、または無機酸（塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸等）、および有機酸（酢酸、クエン酸、マレイン酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等）との塩が挙げられる。これらの塩は、通常行われる方法によって形成させることができる。水和物を形成する時は、任意の数の水分子と配位していてもよい。
【００２３】
また、本発明化合物は特定の異性体に限定するものではなく、全ての可能な異性体やラセミ体を含むものである。
本発明化合物は後述する実験例の記載の通り、優れたＧＭ−ＣＳＦ様作用、免疫賦活作用、および抗腫瘍作用を示す。好中球減少症、例えば、癌における化学療法による好中球減少症、癌における放射線療法による好中球減少症、骨髄異形成症候群による好中球減少症、再生不良性貧血による好中球減少症、骨髄移植による好中球減少症、腎移植による好中球減少症、免疫抑制療法による好中球減少症等の治療または予防剤として使用しうる。抗腫瘍剤としては、特に、造血器腫瘍、例えば、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、小児白血病、慢性骨髄増殖性疾患（真性多血症、本態性血小板血症、骨髄線維症）、骨髄異形成症候群、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄腫類縁疾患、血球貪食症候群等の治療または予防剤として使用しうる。
本発明化合物を、上記の疾患の治療を目的としてヒトに投与する場合は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、液剤等として経口的に、または注射剤、坐剤、経皮吸収剤、吸入剤等として非経口的に投与することができる。また、本化合物の有効量にその剤型に適した賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤等の医薬用添加剤を必要に応じて混合し、医薬製剤とすることができる。注射剤の場合には、適当な担体と共に滅菌処理を行って製剤とする。
投与量は疾患の状態、投与ルート、患者の年齢、または体重によっても異なるが、成人に経口で投与する場合、通常０．１〜１００mg／kg／日であり、好ましくは１〜２０mg／kg／日である。
【００２４】
以下に実施例および試験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００２５】
【実施例】
実施例１
１）培養法
玄米25g、乾燥オカラ(自家製)3g、グルコース0.5g、イーストエキストラクト（ディフコ社製）0.1g、水道水50mlの組成からなる培地を含む500ml容広口三角フラスコを、121℃、30分間オ−トクレ−ブ滅菌した。ブロキサミア クレメア RF-19445株の寒天平板培養菌を無菌水(4ml)に懸濁した液4mlをこの培地に接種し、23℃、14日間静置培養を行う。
２）抽出法
培養が終了したフラスコに、１本当たり70mlのエタノールを加え、3日間室温抽出し、エタノール抽出液を得た。エタノール抽出液を蒸留水(1L)で希釈後、固相抽出担体(GL-Pak PLS-2,0.5g)にロードし水洗後(10ml)、吸着物をジメチルスルホキシド(4ml)で溶出した。
３）化合物（１）および化合物（２）の分離法
ジメチルスルホキシド溶出液1mlを高速液体クロマトグラフィー［カラム：Symmetry C₁₈,7μm,19ｘ150mm (ウォーターズ社製)．溶出液：A液0.1%ギ酸／水、B液0.1%ギ酸／アセトニトリル(60%A/40%B〜5%A/95%B)のリニアグラジエント(18分)．流速：30ml／分．検出：紫外部210,254nm］に付し、保持時間11.2分付近に検出される化合物（１）と15.2分付近に検出される化合物（２）のピークを分取した。分離操作を4回繰り返し、各ピークを合した後、減圧下濃縮乾燥した。化合物（１）1.2mgと化合物（２）11.8mgの無色ガム状物を得た。
４）化合物（３）から化合物（１）の合成法
化合物（３）22mgにピリジン22μl、無水酢酸15μlを加えコルベン中室温で4時間攪拌した。反応液は減圧下溶媒留去し、オイル状物24mg得た。反応物は高速液体クロマトグラフィー［カラム：Symmetry C₁₈,7μm,7.8ｘ150mm(ウォーターズ社製)．溶出液：60%アセトニトリル／水〜95%アセトニトリル／水のリニアグラジエント(12分)．流速：6ml／分．検出：紫外部210,254nm］に付し、保持時間3.2分付近のピーク(化合物（３，ビニグロール）)7.3mg、保持時間5.5分付近の目的ピーク(化合物（１）)12.9mg、ジアセチル体1.4mgを単離した。上記の天然から単離した化合物（１）と合成品のLC-MS、¹H-NMRを測定し比較同定した。
【００２６】
化合物（１）および化合物（２）の物理的および化学的性質を以下に示す。
化合物（１）
【化１６】

形状：無色ガム状物
[α]_D ²⁴：−81.6±1.6°(c 0.75,CHCl₃)
IR(CHCl₃)cm^-1 ：3604, 3550, 2959, 1733, 1464, 1375, 1147, 1105, 1024, 1004
ESI-MS(m/z)：387(M+Na)⁺, 751(2M+Na) ⁺, 409(M+HCOO)^-, 773(2M+HCOO)^-
1H-NMR(CDCl₃,δ)： 0.90(d, J=6.7Hz, 3H), 0.97(d, J=6.9Hz, 3H), 0.98(d,J=6.7Hz,3H), 0.98(d, J=6.7Hz, 3H), 1.11(m, 1H), 1.15(m, 1H), 1.21(m, 1H), 1.25(m, 1H), 1.34(m, 1H), 1.35(m, 1H), 1.55(m, 1H), 1.60(m, 1H), 1.64(m, 1H), 1.72(s, 1H), 1.73(m, 1H), 1.78(dt, J=12.6, 4.7Hz), 1.97(m, 1H), 2.08(s, 3H), 2.13(m, 1H), 2.27(d, J=5.6Hz, 1H), 2.32(d, J=3.8Hz, 1H), 2.83(d, J=8.3, 1H), 4.05(d, J=8.3Hz, 1H), 4.67(d, J=12.2Hz, 1H), 4.85(d, J=12.2Hz, 1H), 5.90(d, J=5.6Hz, 1H)
¹³C-NMR(CDCl₃, δ)： 15.23(q), 20.50(q), 20.98(q), 21.48(q), 24.82(q), 27.23(t), 28.56(t), 28.78(t), 29.61(t), 33.04(d), 34.56(d), 35.88(d), 40.50(d), 44.26(d), 45.53(d), 51.31(d), 66.60(t), 70.27(d), 75.74(s), 130.28(d), 133.63(s), 171.06(s)
溶解性：メタノール、アセトン、ピリジン、ジメチルスルホキシド、酢酸エチルに可溶、水に難溶。
HPLC：[カラム：Symmetry C₁₈,5μm, 3.9ｘ50mm(ウォーターズ社製)．溶出液：60%アセトニトリル／水〜95%アセトニトリル／水のリニアグラジエント(12分), 流速：1ml／分．検出：紫外部210,254nm] 保持時間：4.52分
【００２７】
化合物（２）
【化１７】

形状：無色ガム状物
[α]_D ²⁴：−42.3±1.1° (c 0.757,CHCl₃)
IR(CHCl₃)cm^-1 ：3597, 2958, 1729, 1463, 1376, 1139, 1097, 1024, 984, 962ESI-MS(m/z)：371(M+Na)⁺, 719(2M+Na)⁺, 393(M+HCOO)^-, 741(2M+HCOO)^-
1H-NMR(CDCl₃,δ)： 0.93(d, J=6.8Hz, 3H), 0.95(d, J=6.7Hz, 3H), 0.97(d, J=6.7Hz, 3H), 1.01(d, J=7.0Hz, 3H), 1.09(m, 1H), 1.32(m, 1H), 1.34(m, 1H), 1.34(m, 2H), 1.48(m, 1H), 1.53(m, 1H), 1.55(m, 1H), 1.63(m, 1H), 1.74(m, 1H), 1.85(m, 1H), 1.87(m, 1H), 2.06(s, 3H), 2.08(m, 1H), 2.12(m, 1H), 2.25(m, 1H), 2.26(m, 1H), 2.59(m, 1H), 4.43(d, J=12.0Hz, 1H), 4.55(d, J=12.0Hz, 1H), 5.77(d, J=5.8Hz, 1H)
¹³C-NMR(CDCl₃,δ)： 15.98(q), 20.30(q), 20.94(q), 21.35(q), 25.76(q), 28.08(t), 28.18(t), 29.36(t), 29.50(t), 30.21(t), 33.58(d), 34.87(d), 35.96(d), 39.84(d), 40.00(d), 45.57(d), 46.04(d), 68.59(t), 75.01(s), 127.61(d), 132.59(s), 170.94(s)
溶解性：メタノール、アセトン、ピリジン、ジメチルスルホキシド、酢酸エチルに可溶、水に難溶。
HPLC：[カラム：Symmetry C₁₈,5μm, 3.9ｘ50mm(ウォーターズ社製)．溶出液：60%アセトニトリル／水〜95%アセトニトリル／水のリニアグラジエント(12分), 流速：1ml／分．検出：紫外部210,254nm] 保持時間：6.55分
【００２８】
化合物（３，ビニグロール）の構造式を以下に示す。
【化１８】

【００２９】
試験例１−１ ヒトGM-CSF依存性細胞株（TF-1細胞）に対する増殖誘導効果
96ウェルマイクロタイタ−プレ−トの各ウェルあたり5x10³個のヒトGM-CSF依存性細胞TF-1細胞を0.1mlの10%牛胎仔血清を含むRPMI1640培地（炭酸水素ナトリウム2mM、ペニシリン50単位/ml、ストレプトマイシン50μg/ml、及び2-メルカプトエタノ−ル5x10^-5Mを添加）に浮遊させ、その各ウェルに化合物（１）、化合物（２）、および化合物（３）をそれぞれ種々の濃度で加えた。各ウェルの最終容量は0.2mlとした。各被験化合物はジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、上記RPMI1640培地にて希釈し、最終濃度10μg/ml以下になるように調製した。96ウェルマクロタイタ−プレ−トに加えた細胞を、湿度100%、二酸化炭素5%、空気95%に保持された培養器内で37℃、72時間培養し、ハ−ベストする6時間前に³H-チミジン(18.5KBq/ウェル)を添加し、細胞をパルスラベルした。培養終了後セルハ−ベスタ−にて細胞を回収し、細胞に取り込まれた放射能の量を測定した。各検体についてtriplicateで行った。結果を表１に示した。
【００３０】
【表１】

表１に示すように、化合物（１）、化合物（２）、および化合物（３）は、ヒトGM-CSF依存性細胞株の増殖を誘導することから、GM-CSF様活性を有する。
【００３１】
試験例１−２ ヒトGM-CSF依存性細胞株（F36P細胞）に対する増殖誘導効果
試験例１−１の反応において、TF-1細胞の代わりにヒトGM-CSF依存性細胞株であるF36-P細胞を用いて化合物（１）の増殖誘導効果を検討した。方法は以下に記すＭＴＴ方法で行った。即ち、96ウェルマイクロタイタ−プレ−トの各ウェルあたり1x10⁴個のF36P細胞を0.1mlの10%牛胎仔血清を含むRPMI1640培地（炭酸水素ナトリウム2mM、ペニシリン50単位/ml、ストレプトマイシン50μg/ml、及び2-メルカプトエタノ−ル5x10^-5Mを添加）に浮遊させ、その各ウェルに化合物（１）を種々の濃度で加えた。各ウェルの最終容量を0.2mlとした。被験化合物は、ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、上記RPMI1640培地にて希釈し、最終濃度10μg/ml以下になるように添加した。96ウェルマクロタイタ−プレ−トに加えた細胞を、湿度100%、二酸化炭素5%、空気95%に保持された培養器内で37℃、3日間培養し、培養終了後、6mg/mlのMTT[3-(4,5-ジメチルチアゾ−ル-2イル)-2,5-ジフエニルテトラゾリウムブロマイド](シグマ製)溶液を25μl各ウェルに加え、37℃にて4時間同一条件下で培養した。培養終了後、生成したホルマザンを、各ウェル50μlずつ20%ドデシルナトリウムスルホン酸(SDS)を加えた0.02N-塩酸溶液を加え、37℃、24時間放置して溶解させた。生細胞数に比例して生成、溶解したホルマザンを570nmのフィルタ−を装着したイムノリ−ダ−(InterMed)で570nmにおける吸光強度(OD)を測定した(ザ ジャ−ナル オブ イムノロジカル メソッド，65巻，55〜63頁，1983年参照)。結果を表２に示した。
【００３２】
【表２】

表２に示すように、化合物（１）は、ヒトGM-CSF依存性細胞株の増殖を誘導することから、GM-CSF様活性を有する。
【００３３】
試験例２ ヒト骨髄由来単核球細胞に対する効果(コロニーアッセイ)
ヒト骨髄細胞由来単核球細胞(BioWhittaker Inc., USA)1x10⁵個をMegaCult-C Serum Free Medium without Cytokine培地(StemCell Technologies Inc., Canada)に添加し、更に化合物（１）、化合物（２）、および化合物（３）を表３に記した濃度になるようにそれぞれ加え、最終0.75mlとして2ウェルチャンバースライドの各ウェルに入れた。それらを湿度100%、二酸化炭素5%、空気95%に保持された培養器内で37℃、8日間培養し、顕微鏡観察により形成されたコロニー（構成細胞数10個以上）を顆粒球、顆粒球／マクロファージ、マクロファージのコロニーとして計数し、それぞれduplicateで行った。結果を表３に示した。
【００３４】
【表３】

表３に示すように、化合物（１）、化合物（２）、および化合物（３）を添加したウェルでは、無添加のコントロール(Medium)に比し明らかなコロニー数の増加が観察できた。特に顆粒球コロニーの増加を認めた。
【００３５】
試験例４ ヒト骨髄由来単核球細胞に対する効果(増殖能)
試験例２と同様の細胞を、96ウェルマイクロタイタ−プレ−トの各ウェルあたり1.3x10⁵個となるように、0.1mlの10%牛胎仔血清を含むRPMI1640培地（炭酸水素ナトリウム2mM、ペニシリン50単位/ml及びストレプトマイシン50μg/mlを添加）に浮遊させた。その各ウェルにリコンビナントヒトGM-CSF(rhGM-CSF)、化合物（１）、および化合物（２）をそれぞれ種々の濃度で加え、各ウェルの最終容量を0.2mlとした。各被験物質はジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、上記培地にて希釈し最終濃度10μg/ml以下になるように添加した。96ウェルマクロタイタ−プレ−トに加えた細胞を、湿度100%、二酸化炭素5%、空気95%に保持された培養器内で37℃、4日間培養し、ハ−ベストする18時間前に³H-チミジン(18.5KBq/ウェル)でパルスラベルした。培養終了後セルハ−ベスタ−にて細胞を回収し、細胞に取り込まれた放射能の量を測定した。実験はtriplicateで行った。結果を表４に示した。
【００３６】
【表４】

表４に示すように、化合物（１）および化合物（２）はコロニー形成能だけでなく骨髄細胞の増殖を促した。
【００３７】
試験例４ マウス骨髄細胞の増殖に対する効果
Balb/Cマウス（8週令、雄性、日本クレア）の大腿骨より骨髄細胞を採取し、ナイロンメッシュを通過させた。得られた細胞を96ウェルマイクロタイタ−プレ−トの各ウェルに4x10⁵個となるように0.1mlの10%牛胎仔血清を含むRPMI1640培地（炭酸水素ナトリウム2mM、ペニシリン50単位/ml及びストレプトマイシン50μg/mlを添加）に浮遊させた。その各ウェルにリコンビナントヒトGM-CSF(rhGM-CSF)、化合物（１）、および化合物（２）を種々の濃度で加え、各ウェルの最終容量を0.2mlとした。各被験物質はそれぞれジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、上記培地にて希釈し、最終濃度10μg/ml以下になるように添加した。細胞を添加した96ウェルマクロタイタ−プレ−トを湿度100%、二酸化炭素5%、空気95%に保持された培養器内で37℃、5日間培養し、ハ−ベストする18時間前に³H-チミジン(18.5KBq/ウェル)でパルスラベルした。培養終了後セルハ−ベスタ−にて細胞を回収し細胞に取り込まれた放射能の量を測定した。結果を表５に示した。
【００３８】
【表５】

表５に示すように、化合物（１）および化合物（２）はマウス骨髄細胞の増殖を有意に誘導した。
【００３９】
試験例５ 抗細胞増殖効果
96ウェルマイクロタイタ−プレ−トの各ウェルに各細胞を表６で示した細胞数となるように0.1mlのスケ−ルで加え、0〜10,000ng/mlとなるように化合物（１）を0.1ml添加した。3日間培養した後、6mg/mlのMTT[3-(4,5-ジメチルチアゾ−ル-2イル)-2,5-ジフエニルテトラゾリウムブロマイド](シグマ製)溶液を25μlずつ各ウェルに加え、37℃にて4時間同一条件下でインキュベートした。生成したホルマザンを、各ウェルあたり50μlの20%ドデシルナトリウムスルホン酸(SDS)−0.02N-塩酸溶液を加え、37℃、24時間放置して溶解させた。生細胞数に比例して生成したホルマザンを570nmのフィルタ−を装着したイムノリ−ダ−(InterMed)で測定した(ザ ジャ−ナル オブ イムノロジカル メソッド，65巻，55〜63頁，1983年参照)。化合物（１）の濃度と吸光強度との相関より50%の細胞増殖阻止濃度(IC₅₀値)を算出した。結果を表６に示した。
【００４０】
【表６】

表６に示すように、化合物（１）は正常羊膜細胞FLには作用が弱く、腫瘍細胞に対して効果を有する。
【００４１】
上記試験例１〜５に示すように、化合物（１）、化合物（２）、および化合物（３）は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子様活性、免疫賦活作用、及び腫瘍細胞増殖抑制作用の生物学的活性を有する。
【００４２】
製剤例
製剤例１
以下の成分を含有する顆粒剤を製造する。

式（Ｉ）で表わされる化合物と乳糖を６０メッシュのふるいに通す。コーンスターチを１２０メッシュのふるいに通す。これらをV型混合機にて混合する。混合末にＨＰＣ−Ｌ（低粘度ヒドロキシプロピルセルロース）水溶液を添加し、練合、造粒（押し出し造粒 孔径０．５〜１ｍｍ）したのち、乾燥する。得られた乾燥顆粒を振動ふるい（１２／６０メッシュ）で櫛過し顆粒剤を得る。
製剤例２
以下の成分を含有するカプセル充填用散剤を製造する。

式（Ｉ）で表わされる化合物、乳糖を６０メッシュのふるいに通す。コーンスターチは１２０メッシュのふるいに通す。これらとステアリン酸マグネシウムをV型混合機にて混合する。１０倍散１００ｍｇを５号硬ゼラチンカプセルに充填する。
【００４３】
製剤例３
以下の成分を含有するカプセル充填用顆粒剤を製造する。

式（Ｉ）で表わされる化合物、乳糖を６０メッシュのふるいに通す。コーンスターチを１２０メッシュのふるいに通す。これらを混合し、混合末にＨＰＣ−Ｌ溶液を添加して練合、造粒、乾燥する。得られた乾燥顆粒を整粒後、その１５０ｍｇを４号硬ゼラチンカプセルに充填する。
製剤例４
以下の成分を含有する錠剤を製造する。

式（Ｉ）で表わされる化合物、乳糖、微結晶セルロース、ＣＭＣ−Ｎａ（カルボキシメチルセルロース ナトリウム塩）を６０メッシュのふるいに通し、混合する。混合末にステアリン酸マグネシウム混合し、製錠用混合末を得る。本混合末を直打し、１５０ｍｇの錠剤を得る。
【発明の効果】
本発明化合物は、ＧＭ−ＣＳＦ様作用、免疫賦活作用、および抗腫瘍作用を有し、好中球減少症の治療または予防剤、免疫賦活剤、抗腫瘍剤（抗造血器腫瘍剤）等として有効に機能し得ることを見出した。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a pharmaceutical composition and a novel compound having GM-CSF (granulocyte macrophage colony stimulating factor) -like action, immunostimulatory action, and antitumor action.
[0002]
[Prior art]
GM-CSF is a kind of colony stimulating factor and acts on granulocyte and macrophage progenitor cells to promote their proliferation and differentiation. That is, a compound having a GM-CSF-like action acts on bone marrow cells and the like to promote neutrophil proliferation and differentiation, and can be used for neutropenia and the like. As a GM-CSF preparation, romultide (Japanese Patent Laid-Open No. 58-172399), which is a muramyl dipeptide derivative, is known.
Other stimulating factors that show neutrophil differentiation and proliferation include G-CSF. As recombinant G-CSF protein preparations, filgrastim (Japanese Patent Publication No. 61-500656), lenograstim (Japanese Patent Laid-Open No. 64-85098). Milimostim (Japanese Patent Laid-Open No. 57-58629) is commercially available. Moreover, SB-247464 (Science (1998), 281 (5374), 257-259)) etc. are known as a low molecular compound which shows G-CSF like action.
JP-A-63-215650 describes that Vinigrol and a Vinigrol derivative have an antiplatelet aggregation action and a blood pressure lowering action. Moreover, it is described in JP-A-5-504130 that biniglol has a tumor necrosis factor (TNF) antagonistic action, and JP-A-7-206668 describes that it is useful as a therapeutic agent for human immunodeficiency virus infection. Furthermore, Japanese Patent Laid-Open No. 11-515020 shows that an anti-inflammatory drug that suppresses the production of cytokines including biniglol and an agent containing an immunosuppressive agent are effective for autoimmune diseases. WO 01/00229 describes that drugs containing COX-II inhibitors are useful for inflammatory diseases. However, there is no description regarding GM-CSF in these documents.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention provides a pharmaceutical composition and a novel compound having GM-CSF-like action, immunostimulatory action, and antitumor action.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have found that compounds isolated from fermentation broth of broxemia cremaa strain RF-1945 belonging to imperfect fungi and derivatives thereof have GM-CSF-like action, immunostimulatory action, and antitumor action. I found out. That is, I) General formula (I):
[Chemical 7]

[Wherein R¹Is —CHO or —CH₂R^Four(R^FourIs hydroxy or protected hydroxy); R²And R^ThreeOne is a hydrogen atom, the other is a hydrogen atom, hydroxy, or protected hydroxy; or R²And R^ThreeAre oxo-], an optically active form thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof, as a GM-CSF-like pharmaceutical composition.
[0005]
Furthermore, it relates to the following II) to XIV).
II) General formula (I):
[Chemical 8]

(Wherein R¹, R²And R^ThreeIs the same meaning as in claim 1), an immunostimulant containing the compound, an optically active form thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof as an active ingredient.
[0006]
III) General formula (I):
[Chemical 9]

(Wherein R¹, R²And R^ThreeIs the same meaning as in claim 1), a therapeutic or prophylactic agent for neutropenia comprising as an active ingredient the compound shown in claim 1, its optically active form, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof. .
[0007]
IV) General formula (I):
Embedded image

(Wherein R¹, R²And R^ThreeIs the same meaning as in claim 1), an optically active form thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof as an active ingredient.
[0008]
V) The antitumor agent according to IV), wherein the tumor is a hematopoietic tumor.
VI) General formula (I):
Embedded image

(Wherein R¹Is —CHO or —CH₂R^Four(R^FourIs hydroxy or protected hydroxy); R²And R^ThreeAre both hydrogen atoms), optically active forms thereof, or pharmaceutically acceptable salts thereof, or hydrates thereof.
[0009]
VII) Formula:
Embedded image

Or an optically active form thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof.
VIII) A pharmaceutical composition comprising a compound according to VI) or VII) as an active ingredient.
IX) A pharmaceutical composition according to VIII) having GM-CSF-like activity.
X) An immunostimulant containing the compound described in VI) or VII) as an active ingredient.
XI) A therapeutic or prophylactic agent for neutropenia comprising the compound described in VI) or VII) as an active ingredient.
XII) An antitumor agent comprising the compound according to VI) or VII) as an active ingredient.
XIII) The antitumor agent according to XII), wherein the tumor is a hematopoietic tumor.
XIV) A method for producing a compound according to any one of claims VI) or VII), comprising a step of culturing a microorganism belonging to the genus Bloxamia, and separating and purifying the compound produced from the obtained culture. .
[0010]
In the present specification, “protected hydroxy” means hydroxy protected with a commonly used hydroxy protecting group described in Protective Groups in Organic Synthesis, Theodora W Green (John Wiley & Sons), etc. . For example, t-butyl, benzyl, p-methoxybenzyl, trityl, methoxymethyl, methoxyethoxymethyl, benzyloxymethyl, p-methoxybenzyloxymethyl, trimethylsilyl, triethylsilyl, t-butyldimethylsilyl, triisopropylsilyl, t- Examples include hydroxy protected with butyldiphenylsilyl, methanesulfonyl, acetyl, pivaloyl, benzoyl, tetrahydropyranyl and the like.
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The production method of the compound (I) of the present invention is described below. Examples of the production method include a method of separating and collecting from a fermentation product of a microorganism (extraction method) and a method of chemically synthesizing (synthesizing) them as starting materials.
In the extraction method, a microorganism capable of producing the compound (I) of the present invention is cultured under the medium composition and medium conditions used for normal fermentation production, and the compound (I) is isolated by a method of separating and collecting the normal fermentation product. To do.
Examples of the microorganism that can produce the compound (I) of the present invention include microorganisms belonging to the genus Bloxamia, for example, the broxemia cremea RF-1945 strain. Broxamia Cremere RF-1945 had the following morphological characteristics.
[0012]
Growth on the corn meal agar plate medium was slightly slow, the colonies were colorless, the back side of the colonies was also colorless, no pigment was produced, and no aerial hyphae were observed.
The vegetative mycelium embedded in agar is colorless, smooth on the surface, has a width of 1.0 μm to 2.0 μm, consists of many cells, and branches. The conidia pattern stands up and gathers from colorless stroma composed of mycelial tissue on the medium, forming a dark brown to black irregular sporodia. The individual conidia handle is 30.0μm to 40.0μm in length and 2.0μm to 2.5μm in width. It is multicellular, the base is light brown, the concentration increases upward, the tip is dark brown, and the surface is smooth. .
The conidia-forming cells are integrated with the conidia pattern, and the conidia formation pattern is a single budding type.
Endogenous conidia are single cells, have a short cylindrical shape with a length of 2.5 μm to 4.0 μm and a width of 2.0 μm, are colorless, have a smooth surface, and gather on a sporodia to form a creamy mucus.
Growth on the potato-dextrose agar plate was slightly slow, the colonies were colorless, the back side of the colonies were colorless, no pigment production was observed, and some aerial hyphae were formed around the inoculated agar pieces. No formation of sporodocia was observed. It grew in the range of 10.5-32.0 ° C, and the optimum temperature for growth was 19.0-29.0 ° C.
Teleomorph was not observed on any medium.
Based on the above findings, this strain is presumed to be an incomplete bacterium belonging to the genus Bloxamia, and the literature (Pirozynski, KA, and G. Morgan-Jones. 1968. Notes on Microfungi. III. Trans. Brit. Mycol Soc. 51: 185-206 7904, Nag Raj & Kendrick. 1975. A Monograph of Chalara and Allied Genera. Wilfred Laurier Univ. Press, Waterloo, Canada, BJ Coppins & DW Minter., 1980. A new Hyphomycete from Northumberland. Notes RBG Edinb. 38 (2): 363-635, Arambarri, A., M. Cabello, and C. Cazau. 1992. A new hyphomycete from Santiago River. V. Bloxamia cremea. Mycotaxon 43: 327-330) Comparison with known species of the genus Broxamia. As a result, this strain was identified as Bloxamia cremea from the above morphological characteristics.
[0013]
This strain was deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture) as a deposit number “P-18755” on March 8, 2002. .
[0014]
As a medium for production of the compound (I) of the present invention, either a synthetic medium or a natural medium can be suitably used as long as it appropriately contains a carbon source, a nitrogen source and an inorganic salt. If necessary, vitamins or other nutrient substances may be added as appropriate.
[0015]
Examples of carbon sources include sugars such as glucose, maltose, fructose, sucrose and starch, alcohols such as glycerol and mannitol, amino acids such as glycine, alanine and asparagine, and fats and oils such as soybean oil and olive oil. One kind or two or more kinds may be appropriately selected and used from various carbon sources in consideration of assimilability of microorganisms.
Examples of nitrogen sources include soybean powder, corn steep liquor, beef extract, peptone, yeast extract, amino acid mixture, organic nitrogen-containing compounds such as fish meal, or inorganic nitrogen compounds such as ammonium salts and nitrates. In consideration, one type or two or more types may be appropriately selected and used. As the inorganic salt, for example, calcium carbonate, sodium chloride, potassium chloride, magnesium sulfate, copper sulfate, manganese chloride, zinc sulfate, cobalt chloride, and various phosphates may be added as necessary.
Antifoaming agents such as vegetable oil and polypropylene glycol can be added as necessary.
[0016]
Although culture | cultivation temperature can be changed suitably in the range which microorganisms grow and produces this invention compound (I), Preferably it is 10 to 32 degreeC, More preferably, it is 20 to 25 degreeC. The initial pH is preferably around 6 to 8, and the culture time is usually several days to several weeks, but when the production amount of the compound (I) of the present invention reaches a collectable amount, preferably when it reaches the maximum. In this case, the culture is terminated. Any culture method can be suitably used as long as it is a commonly used method such as solid layer culture or aeration and agitation culture.
[0017]
Separation and purification of fermented products from the culture includes filtration, centrifugation, various ion exchange resins and other active adsorption and chromatography, extraction with various organic solvents, etc. Can be used. For example, the culture may be extracted with an organic solvent such as ethyl acetate, n-butanol, acetone, methyl ethyl ketone, and separated and purified by combining silica gel column chromatography and thin layer chromatography.
[0018]
As a synthesis method of the compound represented by the general formula (I), the extract obtained by the above method can be used as a starting material. For example, the compound (A) shown below:
Embedded image

As a starting material, various compounds can be synthesized by deprotecting the acetyloxy group and protecting or oxidizing the compound having a hydroxy group obtained by the deprotection reaction.
[0019]
The compound represented by the general formula (I) is a compound (B) shown below described in JP-A No. 63-215650:
Embedded image

It can also be synthesized by using (FR-900478 (vinigrol)) as a starting material and protecting the hydroxy group or carrying out an oxidation reaction according to the method described in JP-A-63-215650. JP 63-215650 discloses a formula:
Embedded image

_{(Where Ph Is phenyl, TBDMS Is t-butyldimethylsilyl, and Ac Are specifically described.}
Further, the methods described in J. Org. Chem., 1993, 58, 2349, Synlett., 1996, 625, Synlett., 1996, 1057 and 219, J. Org. Chem., 1997, 62, 5062, etc. The compound (B) can also be synthesized according to
[0020]
The hydroxy group can be protected and deprotected according to the method described in Protective Groups in Organic Synthesis, Theodora W Green (John Wiley & Sons) and the like.
In the case of a compound having a primary and secondary hydroxy group, only one hydroxy group or both hydroxy groups may be protected depending on the type of protective group of the hydroxy group to be introduced, reaction conditions, etc. . If both hydroxy groups are protected, only one can be deprotected. Each hydroxy group can also be protected with a different protecting group.
[0021]
When the hydroxy group is protected with acetyl, the compound having a hydroxy group can be treated with acetic anhydride, acetyl chloride or the like in the presence of a base such as pyridine in an appropriate solvent. Deprotection of the acetyl group can be carried out by treating a compound having a protected hydroxy group with a base such as sodium hydroxide or potassium hydroxide in a solvent such as methanol. The same can be done for protection / deprotection with pivaloyl, benzoyl or the like.
When protecting the hydroxy group with silyl, is it possible to treat the compound having the hydroxy group with silyl halide in the presence of a base such as imidazole or triethylamine and, if necessary, in the presence of dimethylaminopyridine in an appropriate solvent? , Treatment with silyl triflate in the presence of a base such as 2,6-lutidine. The deprotection of the silyl group can be performed by treating a compound having a protected hydroxy group with tetrahydrofuran-acetic acid-water or with n-tetrabutylammonium fluoride in an appropriate solvent.
When the hydroxy group is protected with benzyl, it can be carried out by treating a compound having a hydroxy group with benzyl halide in the presence of a base such as an alkoxide in an appropriate solvent. The deprotection of the benzyl group can be performed by hydrogenation or the like. The same can be done for protection / deprotection with p-methoxybenzyl or the like.
When performing an oxidation reaction, a commonly used oxidation reaction such as Jones oxidation, Collins oxidation, PCC oxidation, or Swan oxidation can be performed.
[0022]
The term “the compound of the present invention” includes pharmaceutically acceptable salts or hydrates thereof. For example, alkali metals (lithium, sodium, potassium, etc.), alkaline earth metals (magnesium, calcium, etc.), ammonium, salts with organic bases and amino acids, or inorganic acids (hydrochloric acid, hydrobromic acid, phosphoric acid, sulfuric acid, etc.) And salts with organic acids (acetic acid, citric acid, maleic acid, fumaric acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, etc.). These salts can be formed by a conventional method. When forming a hydrate, it may be coordinated with any number of water molecules.
[0023]
The compounds of the present invention are not limited to specific isomers, but include all possible isomers and racemates.
The compound of the present invention exhibits excellent GM-CSF-like action, immunostimulatory action, and antitumor action as described in the experimental examples described later. Neutropenia, eg, neutropenia due to chemotherapy in cancer, neutropenia due to radiation therapy in cancer, neutropenia due to myelodysplastic syndrome, neutropenia due to aplastic anemia It can be used as a therapeutic or prophylactic agent for neutropenia due to bone marrow transplantation, neutropenia due to bone marrow transplantation, neutropenia due to renal transplantation, neutropenia due to immunosuppressive therapy, and the like. Antitumor agents include in particular hematopoietic tumors such as chronic myelogenous leukemia, acute myeloid leukemia, acute lymphocytic leukemia, childhood leukemia, chronic myeloproliferative disorders (polycythemia vera, essential thrombocythemia, bone marrow Fibrosis), myelodysplastic syndrome, malignant lymphoma, multiple myeloma, myeloma-related disease, hemophagocytic syndrome and the like.
When the compound of the present invention is administered to humans for the purpose of treating the above-mentioned diseases, it can be administered orally as a powder, granule, tablet, capsule, pill, liquid, or injection, suppository, or transdermal absorption. It can be administered parenterally as an agent, an inhalant and the like. In addition, excipients, binders, wetting agents, disintegrants, lubricants and other pharmaceutical additives suitable for the dosage form may be mixed with an effective amount of the present compound as necessary to obtain a pharmaceutical preparation. it can. In the case of an injection, it is sterilized with an appropriate carrier to obtain a preparation.
The dose varies depending on the disease state, administration route, patient age, or body weight, but is usually 0.1 to 100 mg / kg / day, preferably 1 to 20 mg / kg / day when orally administered to an adult. Day.
[0024]
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Test Examples, but the present invention is not limited thereto.
[0025]
【Example】
Example 1
1) Culture method
A 500 ml wide-mouthed Erlenmeyer flask containing 25 g of brown rice, 3 g of dried okara (homemade), 0.5 g of glucose, 0.1 g of yeast extract (Difco) 0.1 ml, and 50 ml of tap water is placed at 121 ° C for 30 minutes. -Sterilized. Inoculate this medium with 4 ml of a suspension of agar plate cultures of broxamia cremaa strain RF-19445 in sterile water (4 ml), followed by stationary culture at 23 ° C. for 14 days.
2) Extraction method
70 ml of ethanol was added to each flask after culturing and extracted at room temperature for 3 days to obtain an ethanol extract. The ethanol extract was diluted with distilled water (1 L), loaded onto a solid-phase extraction carrier (GL-Pak PLS-2, 0.5 g), washed with water (10 ml), and the adsorbate was eluted with dimethyl sulfoxide (4 ml).
3) Separation method of compound (1) and compound (2)
1 ml of eluate of dimethyl sulfoxide was subjected to high performance liquid chromatography [Column: Symmetry C₁₈, 7μm, 19x150mm (Waters). Eluent: Linear gradient (18 minutes) of solution A 0.1% formic acid / water, solution B 0.1% formic acid / acetonitrile (60% A / 40% B to 5% A / 95% B). Flow rate: 30 ml / min. Detection: UV region 210,254 nm], and peaks of compound (1) detected at a retention time of 11.2 minutes and compound (2) detected at around 15.2 minutes were separated. The separation operation was repeated 4 times, and the peaks were combined, and then concentrated and dried under reduced pressure. A colorless gum of 1.2 mg of compound (1) and 11.8 mg of compound (2) was obtained.
4) Synthesis method of compound (1) from compound (3)
To 22 mg of compound (3), 22 μl of pyridine and 15 μl of acetic anhydride were added and stirred in Kolben at room temperature for 4 hours. The reaction solution was evaporated under reduced pressure to give 24 mg of an oily product. The reaction product is high performance liquid chromatography [column: Symmetry C₁₈, 7μm, 7.8 × 150mm (Waters). Eluent: 60% acetonitrile / water to 95% acetonitrile / water linear gradient (12 minutes). Flow rate: 6 ml / min. Detection: UV part 210,254 nm], peak (compound (3, vinylol)) with retention time of around 3.2 minutes, target peak (compound (1)) with retention time of around 5.5 minutes (12.9 mg), diacetyl compound (1.4 mg) Was isolated. LC-MS of compound (1) isolated from the above and synthetic product,¹H-NMR was measured for comparative identification.
[0026]
The physical and chemical properties of compound (1) and compound (2) are shown below.
Compound (1)
Embedded image

Shape: colorless gum
[α]_D ^{twenty four}: -81.6 ± 1.6 ° (c 0.75, CHCl_Three)
IR (CHCl_Three)cm^-1: 3604, 3550, 2959, 1733, 1464, 1375, 1147, 1105, 1024, 1004
ESI-MS (m / z): 387 (M + Na)⁺, 751 (2M + Na)⁺, 409 (M + HCOO)^-, 773 (2M + HCOO)^-
1H-NMR (CDCl_Three, δ): 0.90 (d, J = 6.7Hz, 3H), 0.97 (d, J = 6.9Hz, 3H), 0.98 (d, J = 6.7Hz, 3H), 0.98 (d, J = 6.7Hz, 3H ), 1.11 (m, 1H), 1.15 (m, 1H), 1.21 (m, 1H), 1.25 (m, 1H), 1.34 (m, 1H), 1.35 (m, 1H), 1.55 (m, 1H) , 1.60 (m, 1H), 1.64 (m, 1H), 1.72 (s, 1H), 1.73 (m, 1H), 1.78 (dt, J = 12.6, 4.7Hz), 1.97 (m, 1H), 2.08 ( s, 3H), 2.13 (m, 1H), 2.27 (d, J = 5.6Hz, 1H), 2.32 (d, J = 3.8Hz, 1H), 2.83 (d, J = 8.3, 1H), 4.05 (d , J = 8.3Hz, 1H), 4.67 (d, J = 12.2Hz, 1H), 4.85 (d, J = 12.2Hz, 1H), 5.90 (d, J = 5.6Hz, 1H)
¹³C-NMR (CDCl_Three, δ): 15.23 (q), 20.50 (q), 20.98 (q), 21.48 (q), 24.82 (q), 27.23 (t), 28.56 (t), 28.78 (t), 29.61 (t), 33.04 (d), 34.56 (d), 35.88 (d), 40.50 (d), 44.26 (d), 45.53 (d), 51.31 (d), 66.60 (t), 70.27 (d), 75.74 (s), 130.28 (d), 133.63 (s), 171.06 (s)
Solubility: Soluble in methanol, acetone, pyridine, dimethyl sulfoxide, ethyl acetate, hardly soluble in water.
HPLC: [Column: Symmetry C₁₈, 5μm, 3.9x50mm (Waters). Eluent: 60% acetonitrile / water to 95% acetonitrile / water linear gradient (12 minutes), flow rate: 1 ml / min. Detection: UV part 210,254nm] Retention time: 4.52 minutes
[0027]
Compound (2)
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Shape: colorless gum
[α]_D ^{twenty four}: -42.3 ± 1.1 ° (c 0.757, CHCl_Three)
IR (CHCl_Three)cm^-1: 3597, 2958, 1729, 1463, 1376, 1139, 1097, 1024, 984, 962 ESI-MS (m / z): 371 (M + Na)⁺, 719 (2M + Na)⁺, 393 (M + HCOO)^-, 741 (2M + HCOO)^-
1H-NMR (CDCl_Three, δ): 0.93 (d, J = 6.8Hz, 3H), 0.95 (d, J = 6.7Hz, 3H), 0.97 (d, J = 6.7Hz, 3H), 1.01 (d, J = 7.0Hz, 3H ), 1.09 (m, 1H), 1.32 (m, 1H), 1.34 (m, 1H), 1.34 (m, 2H), 1.48 (m, 1H), 1.53 (m, 1H), 1.55 (m, 1H) , 1.63 (m, 1H), 1.74 (m, 1H), 1.85 (m, 1H), 1.87 (m, 1H), 2.06 (s, 3H), 2.08 (m, 1H), 2.12 (m, 1H), 2.25 (m, 1H), 2.26 (m, 1H), 2.59 (m, 1H), 4.43 (d, J = 12.0Hz, 1H), 4.55 (d, J = 12.0Hz, 1H), 5.77 (d, J = 5.8Hz, 1H)
¹³C-NMR (CDCl_Three, δ): 15.98 (q), 20.30 (q), 20.94 (q), 21.35 (q), 25.76 (q), 28.08 (t), 28.18 (t), 29.36 (t), 29.50 (t), 30.21 (t), 33.58 (d), 34.87 (d), 35.96 (d), 39.84 (d), 40.00 (d), 45.57 (d), 46.04 (d), 68.59 (t), 75.01 (s), 127.61 (d), 132.59 (s), 170.94 (s)
Solubility: Soluble in methanol, acetone, pyridine, dimethyl sulfoxide, ethyl acetate, hardly soluble in water.
HPLC: [Column: Symmetry C₁₈, 5μm, 3.9x50mm (Waters). Eluent: 60% acetonitrile / water to 95% acetonitrile / water linear gradient (12 minutes), flow rate: 1 ml / min. Detection: UV part 210,254nm] Retention time: 6.55 minutes
[0028]
The structural formula of the compound (3, vinylogol) is shown below.
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[0029]
Test Example 1-1 Growth-inducing effect on human GM-CSF-dependent cell line (TF-1 cell)
5x10 for each well of a 96-well microtiter plate^ThreeHuman GM-CSF-dependent cells TF-1 cells containing 0.1 ml of 10% fetal calf serum in RPMI 1640 medium (sodium bicarbonate 2 mM, penicillin 50 units / ml, streptomycin 50 μg / ml, and 2-mercaptoethanol) 5x10^-FiveThe compound (1), the compound (2), and the compound (3) were added to each well at various concentrations. The final volume of each well was 0.2 ml. Each test compound was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) and diluted with the above RPMI1640 medium to prepare a final concentration of 10 μg / ml or less. Cells added to a 96-well macrotiter plate are cultured at 37 ° C for 72 hours in an incubator maintained at 100% humidity, 5% carbon dioxide, and 95% air, and 6 hours before harvesting.^ThreeH-thymidine (18.5 KBq / well) was added and the cells were pulse labeled. After completion of the culture, the cells were collected with a cell harvester, and the amount of radioactivity incorporated into the cells was measured. Each specimen was triplicated. The results are shown in Table 1.
[0030]
[Table 1]

As shown in Table 1, Compound (1), Compound (2), and Compound (3) have a GM-CSF-like activity because they induce proliferation of human GM-CSF-dependent cell lines.
[0031]
Test Example 1-2 Growth-inducing effect on human GM-CSF-dependent cell line (F36P cell)
In the reaction of Test Example 1-1, the proliferation-inducing effect of Compound (1) was examined using F36-P cells, which are human GM-CSF-dependent cell lines, instead of TF-1 cells. The method was the MTT method described below. That is, 1x10 for each well of a 96 well microtiter plate^FourRPMI1640 medium containing 0.1 ml of 10% fetal calf serum (2 mM sodium bicarbonate, penicillin 50 units / ml, streptomycin 50 μg / ml, and 2-mercaptoethanol 5 × 10^-FiveM was added), and compound (1) was added to each well at various concentrations. The final volume of each well was 0.2 ml. The test compound was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO), diluted with the above RPMI1640 medium, and added to a final concentration of 10 μg / ml or less. The cells added to the 96-well macrotiter plate were cultured at 37 ° C. for 3 days in an incubator maintained at 100% humidity, 5% carbon dioxide, and 95% air. MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide] (Sigma) solution was added to each well 25 μl and cultured at 37 ° C. for 4 hours under the same conditions. . After completion of the culture, the produced formazan was dissolved in 50 μl of each well by adding 0.02N-hydrochloric acid solution containing 20% dodecyl sodium sulfonic acid (SDS) and allowing to stand at 37 ° C. for 24 hours. Absorbance intensity (OD) at 570 nm was measured for the formazan produced and dissolved in proportion to the number of viable cells with an 570 nm filter (InterMed) (The Journal of Immunological Method, Volume 65). 55-63, see 1983). The results are shown in Table 2.
[0032]
[Table 2]

As shown in Table 2, compound (1) has GM-CSF-like activity because it induces the growth of human GM-CSF-dependent cell lines.
[0033]
Test Example 2 Effect on human bone marrow-derived mononuclear cells (colony assay)
Human bone marrow cell-derived mononuclear cells (BioWhittaker Inc., USA) 1x10^FiveWere added to MegaCult-C Serum Free Medium without Cytokine medium (StemCell Technologies Inc., Canada), and further, Compound (1), Compound (2), and Compound (3) were adjusted to the concentrations shown in Table 3. Each was added to make a final 0.75 ml into each well of a 2-well chamber slide. They are cultured in an incubator maintained at 100% humidity, 5% carbon dioxide, and 95% air for 8 days at 37 ° C. Colonies formed by microscopic observation (more than 10 constituent cells) are granulocytes and granules Spheres / macrophages and macrophage colonies were counted and duplicated. The results are shown in Table 3.
[0034]
[Table 3]

As shown in Table 3, in the wells to which compound (1), compound (2), and compound (3) were added, a clear increase in the number of colonies was observed as compared to the control without addition (Medium). In particular, an increase in granulocyte colonies was observed.
[0035]
Test Example 4 Effect on human bone marrow-derived mononuclear cells (proliferative ability)
Cells similar to those in Test Example 2 were added at 1.3 × 10 6 per well of a 96-well microtiter plate.^FiveThe cells were suspended in RPMI 1640 medium (2 mM sodium bicarbonate, penicillin 50 units / ml and streptomycin 50 μg / ml added) containing 0.1 ml of 10% fetal calf serum. Recombinant human GM-CSF (rhGM-CSF), compound (1), and compound (2) were added to each well at various concentrations to make the final volume of each well 0.2 ml. Each test substance was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO), diluted with the above medium, and added to a final concentration of 10 μg / ml or less. Cells added to a 96-well macrotiter plate are cultured for 4 days at 37 ° C in an incubator maintained at 100% humidity, 5% carbon dioxide, and 95% air, and 18 hours before harvesting.^ThreePulse-labeled with H-thymidine (18.5 KBq / well). After completion of the culture, the cells were collected with a cell harvester, and the amount of radioactivity incorporated into the cells was measured. The experiment was performed in triplicate. The results are shown in Table 4.
[0036]
[Table 4]

As shown in Table 4, Compound (1) and Compound (2) promoted bone marrow cell proliferation as well as colony forming ability.
[0037]
Test Example 4 Effect on mouse bone marrow cell proliferation
Bone marrow cells were collected from the femur of Balb / C mice (8 weeks old, male, Claire Japan) and passed through a nylon mesh. The resulting cells are transferred to each well of a 96 well microtiter plate at 4 × 10^FiveThe cells were suspended in RPMI1640 medium (2 mM sodium bicarbonate, penicillin 50 units / ml and streptomycin 50 μg / ml added) containing 0.1 ml of 10% fetal calf serum. Recombinant human GM-CSF (rhGM-CSF), compound (1), and compound (2) were added to each well at various concentrations to make the final volume of each well 0.2 ml. Each test substance was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO), diluted with the above medium, and added to a final concentration of 10 μg / ml or less. Incubate 96-well macrotiter plate with added cells in an incubator maintained at 100% humidity, 5% carbon dioxide, and 95% air at 37 ° C for 5 days, 18 hours before harvesting^ThreePulse-labeled with H-thymidine (18.5 KBq / well). After completion of the culture, the cells were collected with a cell harvester and the amount of radioactivity incorporated into the cells was measured. The results are shown in Table 5.
[0038]
[Table 5]

As shown in Table 5, Compound (1) and Compound (2) significantly induced proliferation of mouse bone marrow cells.
[0039]
Test Example 5 Anti-cell proliferation effect
Each cell was added to each well of a 96-well microtiter plate at a scale of 0.1 ml so that the number of cells shown in Table 6 was reached, and compound (1) was added to a concentration of 0 to 10,000 ng / ml. 0.1 ml was added. After culturing for 3 days, 25 μl of 6 mg / ml MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide] solution (manufactured by Sigma) was added to each well. Incubation was carried out at the same temperature for 4 hours under the same conditions. The produced formazan was dissolved by adding 50 μl of 20% sodium dodecyl sodium sulfonic acid (SDS) -0.02N-hydrochloric acid solution to each well and allowing to stand at 37 ° C. for 24 hours. Formazan produced in proportion to the number of living cells was measured with an immunoleader (InterMed) equipped with a 570 nm filter (see Journal of Immunological Method, 65, 55-63, 1983) . 50% cell growth inhibitory concentration (IC) from the correlation between the concentration of compound (1) and the light absorption intensity₅₀Value). The results are shown in Table 6.
[0040]
[Table 6]

As shown in Table 6, compound (1) has a weak effect on normal amniotic cells FL and has an effect on tumor cells.
[0041]
As shown in Test Examples 1 to 5, Compound (1), Compound (2), and Compound (3) are biology of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-like activity, immunostimulatory activity, and tumor cell growth inhibitory activity. Active.
[0042]
Formulation example
Formulation Example 1
A granule containing the following ingredients is produced.

The compound of formula (I) and lactose are passed through a 60 mesh sieve. Pass corn starch through a 120 mesh sieve. These are mixed in a V-type mixer. An HPC-L (low-viscosity hydroxypropylcellulose) aqueous solution is added to the mixed powder, kneaded and granulated (extruded granulation, pore diameter 0.5 to 1 mm), and then dried. The obtained dried granules are combed with a vibrating sieve (12/60 mesh) to obtain granules.
Formulation Example 2
A powder for capsule filling containing the following components is produced.

The compound of formula (I), lactose, is passed through a 60 mesh sieve. Corn starch is passed through a 120 mesh screen. These and magnesium stearate are mixed in a V-type mixer. 100 mg of 10 times powder is filled into a No. 5 hard gelatin capsule.
[0043]
Formulation Example 3
A capsule filling granule containing the following ingredients is produced.

The compound of formula (I), lactose, is passed through a 60 mesh sieve. Pass corn starch through a 120 mesh sieve. These are mixed, the HPC-L solution is added to the mixed powder, kneaded, granulated and dried. After the resulting dried granules are sized, 150 mg thereof is filled into a No. 4 hard gelatin capsule.
Formulation Example 4
A tablet containing the following ingredients is produced.

The compound represented by the formula (I), lactose, microcrystalline cellulose, CMC-Na (carboxymethylcellulose sodium salt) is passed through a 60 mesh sieve and mixed. The mixed powder is mixed with magnesium stearate to obtain a mixed powder for tableting. The mixed powder is directly hit to obtain a 150 mg tablet.
【The invention's effect】
The compound of the present invention has a GM-CSF-like action, an immunostimulatory action, and an antitumor action. It has been found that it can function effectively.

Claims (13)

Formula (I):

Wherein R ¹ is —CHO or —CH ₂ R ⁴ (R ⁴ is hydroxy or protected hydroxy); one of R ² and R ³ is a hydrogen atom, the other is a hydrogen atom, hydroxy, or protected hydroxy Or a compound represented by R ² and R ^{3 taken} together with oxo], an optically active form thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof, as an active ingredient. Pharmaceutical composition. Formula (I):

(Wherein R ¹ , R ² and R ³ are as defined in claim 1), an optically active form thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof as an active ingredient Contains immunostimulators. Formula (I):

(Wherein R ¹ , R ² and R ³ are as defined in claim 1), an optically active form thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof as an active ingredient An agent for treating or preventing neutropenia. Formula (I):

(Wherein R ¹ , R ² and R ³ are as defined in claim 1), an optically active form thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof as an active ingredient Antitumor agent to contain.   The antitumor agent according to claim 4, wherein the tumor is a hematopoietic tumor. Formula (I):

(Wherein R ¹ is —CHO or —CH ₂ R ⁴ (R ⁴ is hydroxy or protected hydroxy); R ² and R ³ are both hydrogen atoms), optically active compounds thereof, or their Pharmaceutically acceptable salts or hydrates thereof. formula:

Or an optically active form thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof.   A pharmaceutical composition comprising the compound according to claim 6 or 7 as an active ingredient.   The pharmaceutical composition according to claim 8, which has GM-CSF-like activity.   The immunostimulant which contains the compound of Claim 6 or 7 as an active ingredient.   A therapeutic or prophylactic agent for neutropenia comprising the compound according to claim 6 or 7 as an active ingredient.   An antitumor agent comprising the compound according to claim 6 or 7 as an active ingredient   The antitumor agent according to claim 12, wherein the tumor is a hematopoietic tumor.