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JP4128030B2 - Novel ligand and its DNA - Google Patents
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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＧＰＲ７等と結合する能力を有するペプチド、そのＤＮＡおよびそれらの用途、およびウシ由来のＧＰＲ７並びにＧＰＲ８、それらのＤＮＡおよびそれらの用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体のホメオスタシスの維持、生殖、個体の発達、代謝、成長、神経系、循環器系、免疫系、消化器系、代謝系の調節、感覚受容などの重要な機能調節は、様々なホルモンや神経伝達物質のような内在性因子あるいは光や匂いなどの感覚刺激をこれらに対して生体が備えている細胞膜に存在する特異的な受容体を介して細胞が受容し、それに応じた反応をすることによって行われている。このような機能調節によるホルモンや神経伝達物質の受容体の多くはguanine nucleotide-binding protein（以下、Ｇ蛋白質と略称する場合がある）と共役しており、このＧ蛋白質の活性化によって細胞内にシグナルを伝達して様々な機能を発現させることを特徴とする。また、これらの受容体タンパク質は共通して７個の膜貫通領域を有する。これらのことからこうした受容体はＧ蛋白質共役型受容体あるいは７回膜貫通型受容体と総称される。このように生体機能の調節には様々なホルモンや神経伝達物質およびそれに対する受容体蛋白質が存在して相互作用し、重要な役割を果たしていることがわかっているが、未知の作用物質（ホルモンや神経伝達物質など）およびそれに対する受容体が存在するかどうかについてはいまだ不明なことが多い。
近年、ヒトゲノムＤＮＡあるいは各種ヒト組織由来のｃＤＮＡのランダムな配列決定による配列情報の蓄積および遺伝子解析技術の急速な進歩によってヒトの遺伝子が加速度的に解明されてきている。それにともない、機能未知の蛋白をコードすると予想される多くの遺伝子の存在が明らかになっている。Ｇ蛋白質共役型受容体は、7個の膜貫通領域を有するのみでなくその核酸あるいはアミノ酸に多くの共通配列が存在するためそのような蛋白の中から明確にＧ蛋白質共役型受容体として区分することができる。一方でこうした構造の類似性を利用したポリメラーゼ・チェーン・リアクション（Polymerase Chain Reaction：以下、ＰＣＲと略称する）法によってもこうしたＧ蛋白質共役型受容体遺伝子が得られている。このようにしてこれまでに得られたＧ蛋白質共役型受容体のうちには既知の受容体との構造の相同性が高いサブタイプであって容易にそのリガンドを予測することが可能な場合もあるが、ほとんどの場合その内在性リガンドは予測不能であり、これらの受容体は対応するリガンドが見いだされていない。このことからこれらの受容体はオーファン受容体と呼ばれている。このようなオーファン受容体の未同定の内生リガンドは、リガンドが知られていなかったために十分な解析がなされていなかった生物現象に関与している可能性がある。そして、このようなリガンドが重要な生理作用や病態と関連している場合には、その受容体作動薬あるいは拮抗薬の開発が革新的な医薬品の創製に結びつくことが期待される（Stadel, J. et al.、TiPS、18巻、430-437頁、1997年、Marchese, A. et al.、TiPS、20巻、370-375頁、1999年、Civelli, O. et al.、Brain Res.、848巻、63-65頁、1999年、Howard, A. D. et al.、TiPS、22巻、132-140頁、2001年）。
最近、幾つかのグループによってこうしたオーファン受容体のリガンド探索の試みがなされ、新たな生理活性ペプチドであるリガンドの単離・構造決定が報告されている。ReinsheidらおよびMeunierらは独立に、動物細胞にオーファンＧ蛋白質共役型受容体ＬＣ１３２あるいはＯＲＬ１をコードするｃＤＮＡを導入して受容体を発現させ、その応答を指標としてorphanin FQあるいはnociceptinとそれぞれ名付けられた同一の新規ペプチドをブタ脳あるいはラット脳の抽出物より単離し、配列を決定した（Reinsheid, R. K. et al.、Science、270巻、792-794頁、1995年、Meunier, J.-C. et al.、Nature、377巻、532-535頁、1995年）。このペプチドは痛覚に関与していることが報告されたが、さらに、受容体のノックアウトマウスの研究により記憶に関与していることが明らかにされた（Manabe, T. et al.、Nature、394巻、577-581頁、1998年）。
その後これまでにＰｒＲＰ（prolactin releasing peptide）、orexin、apelin、ghrelinおよびＧＡＬＰ（galanin-like peptide）などの新規ペプチドがオーファンＧ蛋白質共役型受容体のリガンドとして単離された（Hinuma, S. et al.、Nature、393巻、272-276頁、1998年、Sakurai, T. et al.、Cell、92巻、573-585頁、1998年、Tatemoto, K. et al.、Bichem. Biophys. Res. Commun.、251巻、471-476頁、1998年、Kojima, M. et al.、Nature、402巻、656-660頁、1999年、Ohtaki, T. et al.、J. Biol. Chem.、274巻、37041-37045頁、1999年）。一方、これまで明らかでなかった生理活性ペプチドの受容体が解明された例もある。腸管収縮に関与するmotilinの受容体がＧＰＲ３８であることが明らかにされた（Feighner, S. D. et al.、Science、284巻、2184-2188頁、1999年）ほか、ＳＬＣ−１がＭＣＨの受容体として同定され（Chambers, J. et al.、Nature、400巻、261-265頁、1999年、Saito, Y. et al.、Nature、400巻、265-269頁、1999年、Shimomura, Y. et al.、Biochem. Biophys. Res. Commun.、261巻、622-626頁、1999年、Lembo, P. M. C. et al.、Nature Cell Biol.、1巻、267-271頁、1999年、Bachner, D. et al.、FEBS Lett.、457巻、522-524頁、1999年）、また、ＧＰＲ１４（ＳＥＮＲ）がurotensin IIの受容体であることが報告された（Ames, R. S. et al.、Nature、401巻、282-286頁、1999年、Mori, M. et al.、Biochem. Biophys. Res. Commun.、265巻、123-129頁、1999年、Nothacker, H.-P. et al.、Nature Cell Biol.、1巻、383-385頁、1999年、Liu, Q. et al.、Biochem. Biophys. Res. Commun.、266巻、174-178頁、1999年）。さらに、最近、神経ペプチドであるneuromedin U、neuropeptide FFの受容体が明らかにされたほか、これらのペプチド以外にもcysteinyl leukotriene類、sphingosine-1-phosphate、lysophosphatidic acid、sphingosylphosphorylcholine、UDP-glucoseなど低分子の生理活性脂質あるいは核酸誘導体がオーファン受容体のリガンドとして同定された（Howard, A. D. et al.、TiPS、22巻、132-140頁、2001年）。ＭＣＨはそのノックアウトマウスが羸痩のphenotypeを示すことから肥満に関与することが示されていたが（Shimada, M. et al.、Nature、396巻、670-674頁、1998年）、その受容体が明らかにされたことにより抗肥満薬としての可能性を有する受容体拮抗薬の探索が可能となった。また、urotensin IIはサルに静脈内投与することによって心虚血を惹起することから心循環系に強力な作用を示すことも報告されている（Ames, R. S. et al.、Nature、401巻、282-286頁、1999年）。このように、オーファン受容体およびそのリガンドは新たな生理作用に関与する場合が多く、その解明は新たな医薬品開発に結びつくことが期待される。しかし、オーファン受容体のリガンド探索においては多くの困難さが伴うことが知られている。例えば、細胞に発現させたオーファン受容体がリガンドに応答した後にいかなる二次情報伝達系が作動するかは一般に不明であり、様々な応答系について検討する必要がある。また、リガンドの存在する組織は容易には予想されないため種々の組織抽出物を用意しなければならない。さらに、リガンドがペプチドである場合、受容体を刺激するのに必要なリガンド量はごく低濃度で十分であるためにこのようなリガンドの生体内の存在量は極微量であることが多いことに加え、ペプチドは蛋白分解酵素によって消化されて活性を失ったり、非特異的吸着によって精製過程において回収が悪かったりするために、生体より抽出して構造決定に必要な量を単離することは通常極めて困難である。これらの問題によって、これまでに数多くのオーファン受容体の存在が明らかにされながらそのリガンドが明らかにされた受容体はごく一部に過ぎない。
Ｇ蛋白質共役型受容体として報告されているものの一つにＧＰＲ７（配列番号：４９、O’Dowd, B. F. et al., Genomics、28巻、84-91頁、1995年）がある。ＧＰＲ７はソマトスタチン受容体（SSTR3）およびオピオイド受容体（δ、κおよびμ）と低いホモロジーがある。また、ＧＰＲ７は、ＧＰＲ８（配列番号：６６、O’Dowd, B. F. et al., Genomics、28巻、84-91頁、1995年）とアミノ酸レベルで６４％程度の相同性が認められるものである。このO’Dowd, B. F. et al.には、ＧＰＲ７の膜画分に[3H]bremazocineが結合し、この結合がμオピオイド受容体選択的リガンドであるβ−funaltrexamine、[D-Pro4]morphiceptin、β−エンドルフィン、κオピオイド受容体選択的リガンドであるＵ５０，４８８、δオピオイド受容体選択的リガンドであるnaltrindoleにより阻害されることが報告されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＧＰＲ７等に結合する能力を有する新規ペプチド、そのＤＮＡ、該ペプチドとＧＰＲ７等とを用いる医薬のスクリーニング方法などを提供する。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者たちは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヒト全脳、マウス全脳およびラット全脳からＧＰＲ７と結合する能力を有する新規なペプチド（ＧＰＲ７リガンド）をコードするＤＮＡを取得することに成功し、ＧＰＲ７リガンドが食欲（摂食）増進作用を示すことを見出した。さらに、ウシ視床下部からＧＰＲ７およびＧＰＲ８をそれぞれコードするＤＮＡを取得することに成功した。本発明者たちは、これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）Ｎ末端アミノ酸残基がブロモ化されていてもよい配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（２）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする上記（１）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（３）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：６６で表わされるアミノ酸配列を有する上記（１）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（４）Ｎ末端のトリプトファン残基が６−ブロモ化されている、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：６６で表わされるアミノ酸配列を有する上記（１）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（５）Ｎ末端アミノ酸残基がブロモ化されていてもよい配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（６）配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする上記（５）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（７）配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６または配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列を有する上記（５）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（８）Ｎ末端のトリプトファン残基が６−ブロモ化されている、配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列を有する上記（５）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（９）Ｎ末端のトリプトファン残基が６−ブロモ化されている、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６または配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列を有する上記（５）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（１０）Ｎ末端アミノ酸残基がブロモ化されていてもよい配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（１１）配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする上記（１０）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（１２）配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：６８または配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列を有する上記（１０）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（１３）Ｎ末端アミノ酸残基がブロモ化されていてもよい配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（１４）配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする上記（１３）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（１５）配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５または配列番号：７０で表わされるアミノ酸配列を有する上記（１３）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（１６）Ｎ末端アミノ酸残基がブロモ化されていてもよい配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（１７）配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする上記（１６）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（１８）配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８または配列番号：７１で表わされるアミノ酸配列を有する上記（１７）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（１９）配列番号：４９または配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩と結合する能力を有している上記（１）〜（１８）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（２０）配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩と結合する能力を有している上記（１）〜（１８）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（２１）配列番号：８４または配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩と結合する能力を有している上記（１）〜（１８）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（２２）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチドの部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（２３）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチドの前駆体ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（２４）配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする上記（２３）記載の前駆体ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（２５）配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１または配列番号：７２で表わされるアミノ酸配列を有する上記（２４）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（２６）配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする上記（２３）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（２７）配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４または配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列を有する上記（２６）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（２８）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（２９）配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８または配列番号：７９で表わされる塩基配列を有する上記（２８）記載のポリヌクレオチド、
（３０）上記（２２）記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（３１）上記（２３）記載の前駆体ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（３２）配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：８０または配列番号：８１で表わされる塩基配列を有する上記（３１）記載のポリヌクレオチド、
（３３）ＤＮＡである上記（２８）〜（３２）記載のポリヌクレオチド、
（３４）上記（２８）〜（３３）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
（３５）上記（３４）記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体、
（３６）上記（３５）記載の形質転換体を培養し、上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチドまたはその前駆体ペプチドを生成せしめることを特徴とする上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチドもしくはその前駆体ペプチドまたはその塩の製造法、
（３７）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチドもしくはその前駆体ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体、
（３８）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩の活性を不活性化する中和抗体である上記（３７）記載の抗体、
（３９）上記（３７）記載の抗体を含有してなる医薬、
（４０）肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤である上記（３９）記載の医薬、
（４１）上記（３７）記載の抗体を含有してなる診断薬、
（４２）拒食症、肥満症または摂食亢進症の診断薬である上記（４１）記載の診断薬、
（４３）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる医薬、
（４４）拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤である上記（４３）記載の医薬、
（４５）上記（２８）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（４６）拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤である上記（４５）記載の医薬、
（４７）上記（２８）記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬、
（４８）拒食症、肥満症または摂食亢進症の診断薬である上記（４７）記載の診断薬、
（４９）上記（２８）記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、
（５０）上記（４９）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（５１）肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤である上記（５０）記載の医薬、
（５２）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（５３）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（５４）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（５５）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩とを含有することを特徴とする上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（５６）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩とを含有することを特徴とする上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（５７）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩とを含有することを特徴とする上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（５８）上記（５２）記載のスクリーニング方法または上記（５５）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
（５９）上記（５３）記載のスクリーニング方法または上記（５６）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
（６０）上記（５４）記載のスクリーニング方法または上記（５７）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
（６１）アゴニストである上記（５８）〜（６０）記載の化合物またはその塩、
（６２）アンタゴニストである上記（５８）〜（６０）記載の化合物またはその塩、
（６３）上記（５８）〜（６０）のいずれかに記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（６４）上記（６１）記載のアゴニストを含有してなる拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤、
（６５）上記（６２）記載のアンタゴニストを含有してなる肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤、
（６６）上記（５２）記載のスクリーニング方法または上記（５５）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる抗肥満薬、
（６７）上記（５３）記載のスクリーニング方法または上記（５６）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる抗肥満薬、
（６８）上記（５４）記載のスクリーニング方法または上記（５７）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる抗肥満薬、
（６９）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチドまたはその前駆体ペプチドをコードするＤＮＡを用いることを特徴とする上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチドまたはその前駆体ペプチドの発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（７０）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチドまたはその前駆体ペプチドをコードするＤＮＡを含有することを特徴とする上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチドまたはその前駆体ペプチドの発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（７１）上記（６９）記載のスクリーニング方法または上記（７０）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチドまたはその前駆体ペプチドの発現量を変化させる化合物またはその塩、
（７２）発現量を増加させる化合物またはその塩である上記（７１）記載の化合物またはその塩、
（７３）発現量を減少させる化合物またはその塩である上記（７１）記載の化合物またはその塩、
（７４）上記（７１）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（７５）上記（７２）記載の化合物またはその塩を含有してなる拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤、
（７６）上記（７３）記載の化合物またはその塩を含有してなる肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤、
（７７）哺乳動物に対して、上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、上記（２８）記載のポリヌクレオチド、上記（６１）記載のアゴニスト、または上記（７２）記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする拒食症の予防・治療方法、
（７８）哺乳動物に対して、上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、上記（２８）記載のポリヌクレオチド、上記（６１）記載のアゴニスト、または上記（７２）記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする食欲増進方法、
（７９）哺乳動物に対して、上記（３７）記載の抗体、上記（４９）記載のポリヌクレオチド、上記（６２）記載のアンタゴニスト、または上記（７３）記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする肥満症または摂食亢進症の予防・治療方法、
（８０）配列番号：８６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質またはその塩、
（８１）配列番号：８６で表されるアミノ酸配列を含有する上記（８０）記載のタンパク質またはその塩、
（８２）上記（８０）記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
（８３）上記（８０）記載のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（８４）ＤＮＡである上記（８３）記載のポリヌクレオチド、
（８５）配列番号：８７で表される塩基配列を含有する上記（８４）記載のポリヌクレオチド、
（８６）上記（８３）記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
（８７）上記（８６）記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体、
（８８）上記（８７）記載の形質転換体を培養し、上記（８０）記載のタンパク質またはその部分ペプチドを生成せしめることを特徴とする上記（８０）記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の製造法、
（８９）上記（８０）記載のタンパク質もしくは上記（８２）記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬、
（９０）上記（８３）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（９１）拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤である上記（９０）記載の医薬、
（９２）上記（８３）記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬、
（９３）拒食症、肥満症または摂食亢進症の診断薬である上記（９２）記載の診断薬、
（９４）上記（８０）記載のタンパク質もしくは上記（８２）記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（９５）上記（８０）記載のタンパク質のシグナル伝達を不活性化する中和抗体である上記（９４）記載の抗体、
（９６）上記（９４）記載の抗体を含有してなる医薬、
（９７）肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤である上記（９６）記載の医薬、
（９８）上記（９４）記載の抗体を含有してなる診断薬、
（９９）拒食症、肥満症または摂食亢進症の診断薬である上記（９９）記載の診断薬、
（１００）上記（８３）記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、
（１０１）上記（１００）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（１０２）肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤である上記（１０１）記載の医薬、
（１０３）配列番号：８８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質またはその塩、
（１０４）配列番号：８８で表されるアミノ酸配列を含有する上記（１０３）記載のタンパク質またはその塩、
（１０５）上記（１０３）記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
（１０６）上記（１０３）記載のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（１０７）ＤＮＡである上記（１０６）記載のポリヌクレオチド、
（１０８）配列番号：８９で表される塩基配列を含有する上記（１０７）記載のポリヌクレオチド、
（１０９）上記（１０８）記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
（１１０）上記（１０９）記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体、
（１１１）上記（１１０）記載の形質転換体を培養し、上記（１０３）記載のタンパク質またはその部分ペプチドを生成せしめることを特徴とする上記（１０３）記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の製造法、
（１１２）上記（１０３）記載のタンパク質もしくは上記（１０５）記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬、
（１１３）上記（１０６）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（１１４）拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤である上記（１１３）記載の医薬、
（１１５）上記（１０６）記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬、
（１１６）拒食症、肥満症または摂食亢進症の診断薬である上記（１１５）記載の診断薬、
（１１７）上記（１０３）記載のタンパク質もしくは上記（１０５）記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（１１８）上記（１０３）記載のタンパク質のシグナル伝達を不活性化する中和抗体である上記（１１７）記載の抗体、
（１１９）上記（１１７）記載の抗体を含有してなる医薬、
（１２０）肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤である上記（１１９）記載の医薬、
（１２１）上記（１１７）記載の抗体を含有してなる診断薬、
（１２２）拒食症、肥満症または摂食亢進症の診断薬である上記（１２１）記載の診断薬、
（１２３）上記（１０６）記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、
（１２４）上記（１２３）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（１２５）肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤である上記（１２４）記載の医薬、
（１２６）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１２７）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１２８）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩とを含有することを特徴とする上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（１２９）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩とを含有することを特徴とする上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（１３０）上記（１２６）記載のスクリーニング方法または上記（１２８）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
（１３１）上記（１２７）記載のスクリーニング方法または上記（１２９）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
（１３２）アゴニストである上記（１３０）または（１３１）記載の化合物またはその塩、
（１３３）アンタゴニストである上記（１３０）または（１３１）記載の化合物またはその塩、
（１３４）上記（１３０）または（１３１）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（１３５）上記（１３２）記載のアゴニストを含有してなる拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤、
（１３６）上記（１３３）記載のアンタゴニストを含有してなる肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤、
（１３７）配列番号：８６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質をコードするＤＮＡを用いることを特徴とする、配列番号：８６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１３８）配列番号：８６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質をコードするＤＮＡを含有することを特徴とする、配列番号：８６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（１３９）上記（１３７）記載のスクリーニング方法または上記（１３８）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：８６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質の発現量を変化させる化合物またはその塩、
（１４０）発現量を増加させる化合物またはその塩である上記（１３９）記載の化合物またはその塩、
（１４１）発現量を減少させる化合物またはその塩である上記（１３９）記載の化合物またはその塩、
（１４２）上記（１３９）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（１４３）上記（１４０）記載の化合物またはその塩を含有してなる拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤、
（１４４）上記（１４１）記載の化合物またはその塩を含有してなる肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤、
（１４５）配列番号：８８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質をコードするＤＮＡを用いることを特徴とする、配列番号：８８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１４６）配列番号：８８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質をコードするＤＮＡを含有することを特徴とする、配列番号：８８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（１４７）上記（１４５）記載のスクリーニング方法または上記（１４６）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：８８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質の発現量を変化させる化合物またはその塩、
（１４８）発現量を増加させる化合物またはその塩である上記（１４７）記載の化合物またはその塩、
（１４９）発現量を減少させる化合物またはその塩である上記（１４７）記載の化合物またはその塩、
（１５０）上記（１４７）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（１５１）上記（１４８）記載の化合物またはその塩を含有してなる拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤、
（１５２）上記（１４９）記載の化合物またはその塩を含有してなる肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤、
（１５３）哺乳動物に対して、上記（８０）記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、上記（８３）記載のポリヌクレオチド、上記（１０３）記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、上記（１０６）記載のポリヌクレオチド、上記（１３２）記載のアゴニスト、上記（１４０）記載の化合物またはその塩、または上記（１４８）記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする拒食症の予防・治療方法、
（１５４）哺乳動物に対して、上記（８０）記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、上記（８３）記載のポリヌクレオチド、上記（１０３）記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、上記（１０６）記載のポリヌクレオチド、上記（１３２）記載のアゴニスト、上記（１４０）記載の化合物またはその塩、または上記（１４８）記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする食欲増進方法、
（１５５）哺乳動物に対して、上記（９４）記載の抗体、上記（１００）記載のポリヌクレオチド、上記（１１７）記載の抗体、上記（１２３）記載のポリヌクレオチド、上記（１３３）記載のアンタゴニスト、上記（１４１）記載の化合物またはその塩、または上記（１４９）記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする肥満症または摂食亢進症の予防・治療方法、
（１５６）外来性の上記（２８）記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（１５７）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１５６）記載の動物、
（１５８）外来性の上記（２８）記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクター、
（１５９）上記（２８）記載のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（１６０）該ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化された上記（１５９）記載の胚幹細胞、
（１６１）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１５９）記載の胚幹細胞、
（１６２）上記（２８）記載のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（１６３）該ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が上記（２８）記載のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる上記（１６２）記載の非ヒト哺乳動物、
（１６４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１６２）記載の非ヒト哺乳動物、
（１６５）上記（１６３）記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする上記（２８）記載のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１６６）外来性の上記（８３）記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（１６７）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１６６）記載の動物、
（１６８）外来性の上記（８３）記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクター、
（１６９）上記（８３）記載のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（１７０）該ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化された上記（１６９）記載の胚幹細胞、
（１７１）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１６９）記載の胚幹細胞、
（１７２）上記（８３）記載のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（１７３）該ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が上記（８３）記載のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる上記（１７２）記載の非ヒト哺乳動物、
（１７４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１７２）記載の非ヒト哺乳動物、
（１７５）上記（１７３）記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする上記（８３）記載のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１７６）外来性の上記（１０６）記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（１７７）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１７６）記載の動物、
（１７８）外来性の上記（１０６）記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクター、
（１７９）上記（１０６）記載のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（１８０）該ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化された上記（１７９）記載の胚幹細胞、
（１８１）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１７９）記載の胚幹細胞、
（１８２）上記（１０６）記載のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（１８３）該ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が上記（１０６）記載のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる上記（１８２）記載の非ヒト哺乳動物、
（１８４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１８２）記載の非ヒト哺乳動物、
（１８５）上記（１８３）記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする上記（１０６）記載のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１８６）拒食症の予防・治療剤を製造するための、上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、上記（２８）記載のポリヌクレオチド、上記（６１）記載のアゴニスト、または上記（７２）記載の化合物またはその塩の使用、
（１８７）食欲増進剤を製造するための、上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、上記（２８）記載のポリヌクレオチド、上記（６１）記載のアゴニスト、または上記（７２）記載の化合物またはその塩の使用、
（１８８）肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤を製造するための、上記（３７）記載の抗体、上記（４９）記載のポリヌクレオチド、上記（６２）記載のアンタゴニスト、または上記（７３）記載の化合物またはその塩の使用、
（１８９）拒食症の予防・治療剤を製造するための、上記（８０）記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、上記（８３）記載のポリヌクレオチド、上記（１０３）記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、上記（１０６）記載のポリヌクレオチド、上記（１３２）記載のアゴニスト、上記（１４０）記載の化合物またはその塩、または上記（１４８）記載の化合物またはその塩の使用、
（１９０）食欲増進剤を製造するための、上記（８０）記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、上記（８３）記載のポリヌクレオチド、上記（１０３）記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、上記（１０６）記載のポリヌクレオチド、上記（１３２）記載のアゴニスト、上記（１４０）記載の化合物またはその塩、または上記（１４８）記載の化合物またはその塩の使用、および
（１９１）肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤を製造するための、上記（９４）記載の抗体、上記（１００）記載のポリヌクレオチド、上記（１１７）記載の抗体、上記（１２３）記載のポリヌクレオチド、上記（１３３）記載のアンタゴニスト、上記（１４１）記載の化合物またはその塩、または上記（１４９）記載の化合物またはその塩の使用を提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７、配列番号：１３または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチド（以下、本発明のペプチドと略記する場合がある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、網膜細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）に由来するペプチドであってもよく、合成ペプチドであってもよい。
【０００７】
配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７、配列番号：１３または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好ましい。
配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好ましい。
配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：７で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好ましい。
配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好ましい。配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好ましい。実質的に同質の活性としては、例えば、本発明のペプチドが有する活性（例えば、後述の疾患の予防・治療活性、ＧＰＲ７との結合活性、ＧＰＲ７発現細胞に対する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性等））などがあげられる。
実質的に同質とは、それらの活性が性質的に（例、生理化学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。
【０００８】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列の具体例としては、
（ｉ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列、
（ii）配列番号：２で表わされるアミノ酸配列、
（iii）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列、
（iv）配列番号：６６で表わされるアミノ酸配列、
（v）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：６６で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（vi）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：６６で表わされるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(vii)配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：６６で表わされるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
(viii)配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：６６で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ix）上記(v)〜(viii)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
【０００９】
配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列の具体例としては、
（ｉ）配列番号：４で表わされるアミノ酸配列、
（ii）配列番号：５で表わされるアミノ酸配列、
（iii）配列番号：６で表わされるアミノ酸配列、
（iv）配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列、
（v）配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６または配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（vi）配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６または配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(vii)配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６または配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
(viii)配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６または配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ix）上記(v)〜(viii)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
【００１０】
配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列の具体例としては、
（ｉ）配列番号：７で表わされるアミノ酸配列、
（ii）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列、
（iii）配列番号：９で表わされるアミノ酸配列、
（iv）配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列、
（ｖ）配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列、
（vi）配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列、
（vii）配列番号：６８で表わされるアミノ酸配列、
（viii）配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列、
（ix）配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：６８または配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（x）配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：６８または配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(xi)配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：６８または配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
(xii) 配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：６８または配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（xiii）上記(ix)〜(xii)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
【００１１】
配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列の具体例としては、
（ｉ）配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列、
（ii）配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列、
（iii）配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列、
（iv）配列番号：７０で表わされるアミノ酸配列、
（v）配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５または配列番号：７０で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（vi）配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５または配列番号：７０で表わされるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(vii)配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５または配列番号：７０で表わされるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
(viii)配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５または配列番号：７０で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ix）上記(v)〜(viii)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
【００１２】
配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列の具体例としては、
（ｉ）配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列、
（ii）配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列、
（iii）配列番号：１８で表わされるアミノ酸配列、
（iv）配列番号：７１で表わされるアミノ酸配列、
（v）配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８または配列番号：７１で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（vi）配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８または配列番号：７１で表わされるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(vii)配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８または配列番号：７１で表わされるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
(viii)配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８または配列番号：７１で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ix）上記(v)〜(viii)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
【００１３】
本発明のペプチドの具体例としては、例えば、
〔ペプチドＡ〕
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するヒト型ペプチド、
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有するマウス型ペプチド、
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するラット型ペプチド、
配列番号：６６で表わされるアミノ酸配列を有するウシ型ペプチド、
〔ペプチドＢ〕
配列番号：４で表わされるアミノ酸配列を有するヒト型ペプチド、
配列番号：５で表わされるアミノ酸配列を有するマウス型ペプチド、
配列番号：６で表わされるアミノ酸配列を有するラット型ペプチド、
配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列を有するウシ型ペプチド、
〔ペプチドＣ〕
配列番号：７で表わされるアミノ酸配列を有するヒト型ペプチドまたはそのアミド体、
配列番号：９で表わされるアミノ酸配列を有するマウス型ペプチドまたはそのアミド体、
配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列を有するラット型ペプチドまたはそのアミド体、
配列番号：６８で表わされるアミノ酸配列を有するウシ型ペプチドまたはそのアミド体、
〔ペプチドＤ〕
配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を有するヒト型ペプチド、
配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列を有するマウス型ペプチド、
配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列を有するラット型ペプチド、
配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列を有するウシ型ペプチド、
〔ペプチドＥ〕
配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列を有するヒト型ペプチド、
配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列を有するマウス型ペプチド、
配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列を有するラット型ペプチド、
配列番号：７０で表わされるアミノ酸配列を有するウシ型ペプチド、
〔ペプチドＦ〕
配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列を有するヒト型ペプチド、
配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列を有するマウス型ペプチド、
配列番号：１８で表わされるアミノ酸配列を有するラット型ペプチド、
配列番号：７１で表わされるアミノ酸配列を有するウシ型ペプチドなどが挙げられる。
【００１４】
本発明の部分ペプチドとしては、前記した本発明のペプチドの部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、通常、アミノ酸が５個以上、好ましくは１０個以上からなるペプチドが好ましく、さらには、本発明のペプチドと同様の活性を有するものが好ましい。
【００１５】
本発明のペプチドの前駆体ペプチドとしては、前記した本発明のペプチドを含むポリペプチドであり、適当なペプチダーゼ等で切断することによって、本発明のペプチドを製造し得るものである。
具体的には、配列番号：１９または配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質などが用いられる。配列番号：１９または配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、網膜細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）に由来する蛋白質であってもよく、合成蛋白質であってもよい。
【００１６】
配列番号：１９または配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１９または配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
特に、配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、
(i) 配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列（ヒト型）、
(ii) 配列番号：２０で表わされるアミノ酸配列（マウス型）、
(iii) 配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列（ラット型）、
(iv) 配列番号：７２で表わされるアミノ酸配列（ウシ型）、
(v) 配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１または配列番号：７２で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(vi) 配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１または配列番号：７２で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(vii) 配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１または配列番号：７２で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
(viii) 配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１または配列番号：７２で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(ix) 上記(v)〜(viii)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
【００１７】
配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、
(i) 配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列（ヒト型）、
(ii) 配列番号：２３で表わされるアミノ酸配列（マウス型）、
(iii) 配列番号：２４で表わされるアミノ酸配列（ラット型）、
(iv) 配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列（ウシ型）、
(v) 配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４または配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(vi) 配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４または配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(vii) 配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
(viii) 配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４または配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(ix) 上記(v)〜(viii)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
【００１８】
配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を有するヒト型前駆体ペプチドＧは、配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列を有するヒト型前駆体ペプチドＨから分泌シグナル配列を除いたものである。
配列番号：２０で表わされるアミノ酸配列を有するマウス型前駆体ペプチドＧは、配列番号：２３で表わされるアミノ酸配列を有するマスウ型前駆体ペプチドＨから分泌シグナル配列を除いたものである。
配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列を有するラット型前駆体ペプチドＧは、配列番号：２４で表わされるアミノ酸配列を有するラット型前駆体ペプチドＨから分泌シグナル配列を除いたものである。
配列番号：７２で表わされるアミノ酸配列を有するラット型前駆体ペプチドＧは、配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列を有するラット型前駆体ペプチドＨから分泌シグナル配列を除いたものである。
本発明の前駆体ペプチドは、本発明のペプチドと同様の活性を有していてもよい。
【００１９】
配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質（ヒトＧＰＲ７）、配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質（ラットＴＧＲ２６）、配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質（ヒトＧＰＲ８）、配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質（ウシＧＰＲ７）または配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質（ウシＧＰＲ８）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、網膜細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）に由来する蛋白質であってもよく、合成蛋白質であってもよい。
【００２０】
配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
特に、配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、上記のアミノ酸配列の他、
(i) 配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iii) 配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
(iv) 配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(v) 上記(i)〜(iv)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
特に、配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、上記のアミノ酸配列の他、
(i) 配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iii) 配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
(iv) 配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(v) 上記(i)〜(iv)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
特に、配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、上記のアミノ酸配列の他、
(i) 配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iii) 配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
(iv) 配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(v) 上記(i)〜(iv)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
特に、配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、上記のアミノ酸配列の他、
(i) 配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iii) 配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
(iv) 配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(v) 上記(i)〜(iv)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
特に、配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、上記のアミノ酸配列の他、
(i) 配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iii) 配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
(iv) 配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(v) 上記(i)〜(iv)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
ヒトＧＰＲ７、ラットＴＧＲ２６、ヒトＧＰＲ８、ウシＧＰＲ７またはウシＧＰＲ８（以下、合わせてＧＰＲ７と略記する）の部分ペプチドとしては、後述の医薬等のスクリーニング方法に用いることのできる部分ペプチドであれば、いかなるものであっていてもよいが、好ましくは、本発明のペプチドに対する結合能を有する部分ペプチド、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含有する部分ペプチド等が用いられる。
【００２１】
本発明のペプチド、その部分ペプチドまたはその前駆体ペプチド、特に本発明のペプチドには、Ｎ末端アミノ酸残基がブロモ化されたものも含まれる。Ｎ末端アミノ酸残基としては、トリプトファン残基（Ｔｒｐ）などが好ましい。
具体的には、Ｎ末端のトリプトファン残基（Ｔｒｐ）がブロモ化された配列番号：１〜配列番号：１２、配列番号：１９〜配列番号：２１、配列番号：６６〜配列番号：６９および配列番号：７２から選ばれる配列番号で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドなどが用いられ、なかでもＮ末端のトリプトファン残基（Ｔｒｐ）がブロモ化された配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：６６または配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドが好ましく用いられる。ブロモ化の位置は特に限定されないが、トリプトファン残基（Ｔｒｐ）の６位が好ましい。
より具体的には、Ｎ末端のトリプトファン残基（Ｔｒｐ）が６−ブロモ化されている、配列番号：１〜配列番号：１２、配列番号：１９〜配列番号：２１、配列番号：６６〜配列番号：６９および配列番号：７２から選ばれる配列番号で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドが好ましく用いられ、なかでもＮ末端のトリプトファン残基（Ｔｒｐ）が６−ブロモ化されている、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：６６または配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドが好ましく用いられる。
本発明のペプチド、その部分ペプチドまたはその前駆体ペプチド（以下、本発明のペプチドと略記する場合がある）、ＧＰＲ７またはその部分ペプチド（以下、ＧＰＲ７と略記する場合がある）は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のペプチドまたはＧＰＲ７には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
【００２２】
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。以下、塩も含めて、本発明のペプチドまたはＧＰＲ７と称する。
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のペプチドの精製方法によって製造することもできるし、後述するペプチドをコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００２３】
本発明のペプチドもしくはＧＰＲ７またはそれらのアミド体の合成には、通常市販のペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などをあげることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の本発明のペプチド、ＧＰＲ７またはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００２４】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmocなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００２５】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
【００２６】
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したペプチドとを製造し、この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ペプチドを得ることができる。この粗ペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の本発明のペプチドまたはＧＰＲ７のアミド体を得ることができる。
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、本発明のペプチドまたはＧＰＲ７のアミド体と同様にして、所望の本発明のペプチドまたはＧＰＲ７のエステル体を得ることができる。
【００２７】
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７の部分ペプチドは、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいはＧＰＲ７の部分ペプチドについては、ＧＰＲ７を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のペプチド、ＧＰＲ７の部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の▲１▼〜▲５▼に記載された方法があげられる。
▲１▼M. Bodanszky およびM.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
▲２▼SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
▲３▼泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
▲４▼矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、205、(1977年)
▲５▼矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のペプチド、ＧＰＲ７またはその部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる本発明のペプチド、ＧＰＲ７の部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００２８】
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７をコードするポリヌクレオチドとしては、上記した本発明のペプチドまたはＧＰＲ７をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、本発明のペプチドまたはＧＰＲ７をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７をコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」１５（７）、１９９７記載の方法またはそれに準じた方法により、本発明のペプチドまたはＧＰＲ７のｍＲＮＡを定量することができる。
【００２９】
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７をコードするＤＮＡとしては、前述した本発明のペプチドまたはＧＰＲ７をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
【００３０】
本発明のペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば配列番号：２５〜配列番号：４２および配列番号：７４〜配列番号：７９のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：２５〜配列番号：４２および配列番号：７４〜配列番号：７９のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、それぞれ配列番号：２５〜配列番号：４２および配列番号：７４〜配列番号：７９のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
【００３１】
より具体的には、
(i) 配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト型ペプチドＡをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(ii) 配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス型ペプチドＡをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(iii) 配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するラット型ペプチドＡをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２７で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(iv) 配列番号：４で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト型ペプチドＢをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(ｖ) 配列番号：５で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス型ペプチドＢをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(vi) 配列番号：６で表わされるアミノ酸配列を含有するラット型ペプチドＢをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(vii) 配列番号：７で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト型ペプチドＣをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(viii) 配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト型ペプチドＤをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(ix) 配列番号：９で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス型ペプチドＣをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３３で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(ｘ) 配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス型ペプチドＤをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xi) 配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列を含有するラット型ペプチドＣをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xii) 配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列を含有するラット型ペプチドＤをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xiii) 配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト型ペプチドＥをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３７で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xiv) 配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス型ペプチドＥをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xv) 配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列を含有するラット型ペプチドＥをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xvi) 配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト型ペプチドＦをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xvii) 配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス型ペプチドＦをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xviii) 配列番号：１８で表わされるアミノ酸配列を含有するラット型ペプチドＦをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xix) 配列番号：６６で表わされるアミノ酸配列を含有するウシ型ペプチドＡをコードするＤＮＡとしては、配列番号：７４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xx) 配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列を含有するウシ型ペプチドＢをコードするＤＮＡとしては、配列番号：７５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxi) 配列番号：６８で表わされるアミノ酸配列を含有するウシ型ペプチドＣをコードするＤＮＡとしては、配列番号：７６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxii) 配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列を含有するウシ型ペプチドＤをコードするＤＮＡとしては、配列番号：７７で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxiii) 配列番号：７０で表わされるアミノ酸配列を含有するウシ型ペプチドＥをコードするＤＮＡとしては、配列番号：７８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxvi) 配列番号：７１で表わされるアミノ酸配列を含有するウシ型ペプチドＦをコードするＤＮＡとしては、配列番号：７９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００３２】
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２５〜配列番号：４２および配列番号：７４〜配列番号：７９のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：２５〜配列番号：４２および配列番号：７４〜配列番号：７９のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２５〜配列番号：４２および配列番号：７４〜配列番号：７９のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
本発明の前駆体ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば配列番号：４３または配列番号：４６で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明の前駆体と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：４３または配列番号：４６で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、それぞれ配列番号：４３または配列番号：４６のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
より具体的には、
(i) 配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＧをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４３で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(ii) 配列番号：２０で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＧをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(iii) 配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列を含有するラット型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＧをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(iv) 配列番号：７２で表わされるアミノ酸配列を含有するウシ型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＧをコードするＤＮＡとしては、配列番号：８０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(v) 配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(vi) 配列番号：２３で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４７で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(vii) 配列番号：２４で表わされるアミノ酸配列を含有するラット型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(viii) 配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列を含有するウシ型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするＤＮＡとしては、配列番号：８１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００３３】
本発明のペプチドまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列の一部、または該ＤＮＡと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡを包含するだけではなく、ＲＮＡをも包含する意味で用いられる。
本発明に従えば、本発明のペプチド遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定された本発明のペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうしたポリヌクレオチド（核酸）は、本発明のペプチド遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいは本発明のペプチド関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明のペプチド遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明のペプチド関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明のペプチド関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明のペプチド遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（蛋白質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（蛋白質）のアミノ酸を通常指している。本発明のペプチド遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ペプチド翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳開始コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、本発明のペプチド遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
【００３４】
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係は、対象物とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、「アンチセンス」であるということができる。アンチセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００３５】
本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、例えば J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった粗水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発明のペプチドの生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
【００３６】
ヒトＧＰＲ７をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：５０で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ７と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：５０で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、それぞれ配列番号：５０で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ラットＴＧＲ２６をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：６０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：６０で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列を有するラットＴＧＲ２６と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：６０で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、それぞれ配列番号：６０で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ヒトＧＰＲ８をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：８５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：８５で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：６６で表わされるアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ８と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：８５で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、それぞれ配列番号：８５で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ウシＧＰＲ７をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：８７で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：８７で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列を有するウシＧＰＲ７と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：８７で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、それぞれ配列番号：８７で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ウシＧＰＲ８をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：８９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：８９で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列を有するウシＧＰＲ８と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：８９で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、それぞれ配列番号：８９で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列を含有するヒトＧＰＲ７をコードするＤＮＡとしては、配列番号：５０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列を含有するラットＴＧＲ２６をコードするＤＮＡとしては、配列番号：６０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列を含有するヒトＧＰＲ８をコードするＤＮＡとしては、配列番号：８５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列を含有するウシＧＰＲ７をコードするＤＮＡとしては、配列番号：８７で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列を含有するウシＧＰＲ８をコードするＤＮＡとしては、配列番号：８９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００３７】
ＧＰＲ７の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述したＧＰＲ７の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ヒトＧＰＲ７の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：５０で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、ヒトＧＰＲ７と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：５０で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ラットＴＧＲ２６の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：６０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：６０で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、ラットＴＧＲ２６と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：６０で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ヒトＧＰＲ８の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述したヒトＧＰＲ８の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ヒトＧＰＲ８の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：８５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：８５で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、ヒトＧＰＲ８と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：８５で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ウシＧＰＲ７の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述したウシＧＰＲ７の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ウシＧＰＲ７の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：８７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：８７で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、ウシＧＰＲ７と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：８７で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ウシＧＰＲ８の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述したウシＧＰＲ８の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ウシＧＰＲ８の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：８９で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：８９で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、ウシＧＰＲ８と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：８９で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
【００３８】
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７をコードするＤＮＡは、自体公知の方法で標識化されていてもよく、具体的にはアイソトープラベル化されたもの、蛍光標識されたもの（例えば、フルオレセインなどによる蛍光標識）、ビオチン化されたものまたは酵素標識されたものなどがあげられる。
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のペプチドまたはＧＰＲ７の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて自体公知のＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のペプチドまたはＧＰＲ７の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００３９】
ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のペプチドまたはＧＰＲ７をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＩＶ・ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどがあげられる。
【００４０】
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のペプチドのＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoＡ・シグナル配列、OmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
【００４１】
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology），１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが用いられる。
【００４２】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７（ＣＯＳ７），Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７５巻，１９２９(１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００４３】
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology, 6, 47-55(1988)）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことができる。このようにして、ペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
【００４４】
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），８１巻，５３３０（１９８４）〕があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of the American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外などに本発明のペプチドｍａｔａｈａＧＰＲ７を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のペプチドまたはＧＰＲ７を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
【００４５】
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により本発明のペプチドまたはＧＰＲ７の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にペプチドが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明のペプチドまたはＧＰＲ７の精製は、自体公知の分離・精製法を適宜組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られる本発明のペプチドまたはＧＰＲ７が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生する本発明のペプチドまたはＧＰＲ７を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
【００４６】
本発明のペプチドに対する抗体（以下、単に本発明の抗体と称する場合がある）は、本発明のペプチドに対する抗体を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のペプチドに対する抗体は、本発明のペプチドを抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
【００４７】
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のペプチドは、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化ペプチドと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどがあげられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞があげられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、ペプチド（蛋白質）抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したペプチドを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００４８】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００４９】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（ペプチド抗原）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のペプチドに対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００５０】
本発明のペプチドをコードするＤＮＡ（以下、これらのＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する場合がある）に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡ（以下、これらのＤＮＡをアンチセンスＤＮＡと略記する場合がある）としては、本発明のＤＮＡに相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などがあげられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発明のペプチドのＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
以下に、▲１▼本発明のペプチド、▲２▼本発明のＤＮＡ、▲３▼本発明の抗体、および▲４▼アンチセンスＤＮＡの用途を説明する。
【００５１】
（１）本発明のペプチドが関与する各種疾病の治療・予防剤
本発明のペプチドは後述の実施例６に示すとおり、ＧＰＲ７発現細胞の細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性等）を有し、ＧＰＲ７の内因性リガンドである。また、本発明のペプチドは後述の実施例１４に示すとおり、食欲（摂食）増進作用を有している。さらに、本発明のペプチドは、神経調節物質もしくは神経内分泌物質として作用したり、記憶や学習、あるいはストレスの調節に関与していると考えられる。
従って、本発明のペプチドまたは本発明のＤＮＡに異常があったり、欠損している場合、またはＧＰＲ７またはＧＰＲ７をコードするＤＮＡに異常があったり、欠損している場合には、例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（II型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）の種々の疾病が発症する可能性が高い。
従って、本発明のペプチド、本発明のＤＮＡは、例えば、上記の種々の疾病（特に拒食症）の治療・予防剤などの医薬（特に、食欲（摂食）増進剤等）として使用することができる。
【００５２】
本発明のペプチドおよび本発明のＤＮＡは、例えば、生体内において本発明のペプチドが減少あるいは欠損している患者がいる場合に、（イ）本発明のＤＮＡを該患者に投与し、生体内で本発明のペプチドを発現させることによって、（ロ）細胞に本発明のＤＮＡを挿入し、本発明のペプチドを発現させた後に、該細胞を患者に移植することによって、または（ハ）本発明のペプチドを該患者に投与することなどによって、該患者における本発明のペプチドの役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
本発明のＤＮＡを上記の治療・予防剤として使用する場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは温血動物に投与することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
本発明のペプチドを上記の治療・予防剤として使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
本発明のペプチドは、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のペプチドを生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
【００５３】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
本発明のＤＮＡが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）に対して投与することができる。
【００５４】
本発明のペプチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、拒食症の治療目的で本発明のペプチドを経口投与する場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき該ペプチドを約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該ペプチドの１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、拒食症の治療目的で本発明のペプチドを注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該ペプチドを約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００５５】
（２）疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
（２−１）スクリーニング方法Ａ
本発明のペプチドはＧＰＲ７のリガンドとしての機能などを有するため、本発明のペプチドの機能を促進する化合物またはその塩は、例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（II型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）の疾病の治療・予防剤など（特に食欲（摂食）増進剤等）の医薬として使用できる。
一方、本発明のペプチドの機能を阻害する化合物またはその塩は、例えば、肥満症［例、悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満 (exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obesity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalamic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesity)、中心性肥満(central obesity)など］、摂食亢進症(hyperphagia)などの安全で低毒性な予防・治療剤、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常などの安全で低毒性な予防・治療剤（プロラクチン産生抑制剤）、好ましくは肥満症、摂食亢進症などの安全で低毒性な予防・治療剤として有用である。
該スクリーニングは、本発明のペプチドを用いるか、または組換え型本発明のペプチドの発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによって、本発明のペプチドとＧＰＲ７との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの活性を促進または阻害する化合物）（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩をスクリーニングすることができる。このような化合物には、本発明のペプチドのＧＰＲ７を介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性など）を有する化合物（即ちＧＰＲ７アゴニスト）と該細胞刺激活性を有しない化合物（即ちＧＰＲ７アンタゴニスト）などが含まれる。「リガンドとの結合性を変化させる」とは、リガンドとの結合を阻害する場合とリガンドとの結合を促進する場合の両方を包含するものである。
【００５６】
すなわち、本発明は、
本発明のペプチドを用いることを特徴とする本発明のペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、具体的には、
（ｉ）ＧＰＲ７またはその部分ペプチド（以下、これらを単にＧＰＲ７と略称する）に、本発明のペプチドを接触させた場合と（ii）ＧＰＲ７に、本発明のペプチドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする本発明のペプチドとＧＰＲ７の結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法においては、（i）ＧＰＲ７に、本発明のペプチドを接触させた場合と（ii）ＧＰＲ７に、本発明のペプチドおよび試験化合物を接触させた場合における、例えばＧＰＲ７に対するリガンドの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較する。
【００５７】
本発明のスクリーニング方法は具体的には、
▲１▼標識した本発明のペプチドを、ＧＰＲ７に接触させた場合と、標識した本発明のペプチドおよび試験化合物をＧＰＲ７に接触させた場合における、標識した本発明のペプチドのＧＰＲ７に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のペプチドとＧＰＲ７との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法、
▲２▼標識した本発明のペプチドを、ＧＰＲ７を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識した本発明のペプチドおよび試験化合物をＧＰＲ７を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識した本発明のペプチドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のペプチドとＧＰＲ７との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法、
▲３▼標識した本発明のペプチドを、ＧＰＲ７をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧＰＲ７に接触させた場合と、標識した本発明のペプチドおよび試験化合物をＧＰＲ７をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧＰＲ７に接触させた場合における、標識した本発明のペプチドのＧＰＲ７に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のペプチドとＧＰＲ７との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法、
【００５８】
▲４▼ＧＰＲ７を活性化する化合物（例えば、本発明のペプチド）をＧＰＲ７を含有する細胞に接触させた場合と、ＧＰＲ７を活性化する化合物および試験化合物をＧＰＲ７を含有する細胞に接触させた場合における、ＧＰＲ７を介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とする本発明のペプチドとＧＰＲ７との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法、および
▲５▼ＧＰＲ７を活性化する化合物（例えば、本発明のペプチドなど）をＧＰＲ７をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧＰＲ７に接触させた場合と、ＧＰＲ７を活性化する化合物および試験化合物を、ＧＰＲ７をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧＰＲ７に接触させた場合における、ＧＰＲ７を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とする本発明のペプチドとＧＰＲ７との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法などである。
【００５９】
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いるＧＰＲ７としては、本発明のペプチドをリガンドとして認識するものであれば何れのものであってもよいが、ヒトや温血動物の臓器の膜画分などが好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたＧＰＲ７などが適している。ＧＰＲ７は前述の方法に従って製造することができる。
本発明のスクリーニング方法において、ＧＰＲ７を含有する細胞あるいは該細胞膜画分などを用いる場合、後述の調製法に従えばよい。
ＧＰＲ７を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行うことができる。
ＧＰＲ７を含有する細胞としては、ＧＰＲ７を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、前述の大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。また、ＧＰＲ７を発現した宿主細胞は、前述の本発明のペプチドを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体の製造方法と同様の方法などがあげられる。
膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＧＰＲ７と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該ＧＰＲ７を含有する細胞や膜画分中のＧＰＲ７の量は、１細胞当たり１０３〜１０８分子であるのが好ましく、１０５〜１０７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【００６０】
本発明のペプチドとＧＰＲ７との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの活性を促進または阻害する化合物）をスクリーニングする前記の▲１▼〜▲３▼を実施するためには、適当なＧＰＲ７画分と、標識した本発明のペプチドなどが用いられる。ＧＰＲ７画分としては、天然型のＧＰＲ７画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型ＧＰＲ７画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識したリガンドとしては、標識したリガンド、標識したリガンドアナログ化合物などが用いられる。例えば〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで標識されたリガンドなどを利用することができる。このうち好ましくは、〔１２５Ｉ〕で標識されたリガンドである。
具体的には、本発明のペプチドとＧＰＲ７との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行うには、まずＧＰＲ７を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレセプターとの結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０ＴＭ（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるＧＰＲ７や本発明のペプチドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０．０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識した本発明のペプチドを添加し、同時に１０−１０〜１０−７Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の本発明のペプチドを加えた反応チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、望ましくは４℃から３７℃で２０分から２４時間、望ましくは３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント(Ｂ０）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ０−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００６１】
本発明のペプチドとＧＰＲ７との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの活性を促進または阻害する化合物）をスクリーニングする前記の▲４▼〜▲５▼の方法を実施するためには、ＧＰＲ７を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性または抑制する活性など）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、ＧＰＲ７を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当なＧＰＲ７を発現した細胞が必要である。ＧＰＲ７を発現した細胞としては、前述のＧＰＲ７発現細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられる。
【００６２】
本発明のペプチドとＧＰＲ７との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング用キットは、ＧＰＲ７またはその塩、ＧＰＲ７の部分ペプチドまたはその塩、ＧＰＲ７を含有する細胞、あるいはＧＰＲ７を含有する細胞の膜画分、および本発明のペプチドを含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
▲１▼測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
▲２▼ＧＲＰ７標品
ＧＰＲ７を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０５個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
▲３▼標識リガンド
〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで標識した本発明のペプチドを適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
▲４▼リガンド標準液
本発明のペプチドを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
【００６３】
２．測定法
▲１▼１２穴組織培養用プレートにて培養したＧＰＲ７を発現させた細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
▲２▼１０−３〜１０−１０Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識した本発明のペプチドを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに１０−３Ｍの本発明のペプチドを５μｌ加えておく。
▲３▼反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識された本発明のペプチドを０.２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
▲４▼液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。
〔数１〕
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ０−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Percent Maximum Binding
Ｂ ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量）
Ｂ０ ：最大結合量
【００６４】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、本発明のペプチドとＧＰＲ７との結合を変化させる（結合を阻害あるいは促進する）化合物（本発明のペプチドの活性を促進または阻害する化合物）であり、具体的にはＧＰＲ７を介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩（いわゆるＧＰＲ７アゴニスト）、あるいは該刺激活性を有しない化合物（いわゆるＧＰＲ７アンタゴニスト）である。該化合物としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。上記ＧＰＲ７アゴニストであるかアンタゴニストであるかの具体的な評価方法は以下の（ｉ）または（ii）に従えばよい。
（ｉ）前記▲１▼〜▲３▼のスクリーニング方法で示されるバインディング・アッセイを行い、本発明のペプチドとＧＰＲ７との結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）化合物を得た後、該化合物が上記したＧＰＲ７を介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はＧＰＲ７アゴニストであり、該活性を有しない化合物またはその塩はＧＰＲ７アンタゴニストである。
（ii）(a)試験化合物をＧＰＲ７を含有する細胞に接触させ、上記ＧＰＲ７を介した細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はＧＰＲ７アゴニストである。
(b) ＧＰＲ７を活性化する化合物（例えば、本発明のペプチドまたはＧＰＲ７アゴニストなど）をＧＰＲ７を含有する細胞に接触させた場合と、ＧＰＲ７を活性化する化合物および試験化合物をＧＰＲ７を含有する細胞に接触させた場合における、ＧＰＲ７を介した細胞刺激活性を測定し、比較する。ＧＰＲ７を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩はＧＰＲ７アンタゴニストである。
【００６５】
該ＧＰＲ７アゴニストは、ＧＰＲ７に対する本発明のペプチドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、本発明のペプチドと同様に安全で低毒性な医薬（例えば、拒食症の予防・治療薬、食欲（摂食）増進剤，下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕の予防・治療薬等）として有用である。
逆に、ＧＰＲ７アンタゴニストは、ＧＰＲ７に対する本発明のペプチドが有する生理活性を抑制することができるので、肥満症［例、悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満 (exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obesity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalamic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesity)、中心性肥満(central obesity)など］、摂食亢進症(hyperphagia) などの安全で低毒性な予防・治療剤、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常などの安全で低毒性な予防・治療剤（プロラクチン産生抑制剤）、好ましくは肥満症、摂食亢進症などの安全で低毒性な予防・治療剤として有用である。
【００６６】
本発明のスクリーニング方法Ａまたはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物であり、本発明のペプチドの機能を促進または阻害する化合物である。
該化合物の塩としては、前記した本発明のペプチドの塩と同様のものが用いられる。
【００６７】
本発明のスクリーニング方法Ａまたはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の治療・予防剤として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、前記した本発明のペプチドを含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、拒食症治療の目的でＧＰＲ７アゴニストを経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ当たり）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、拒食症治療の目的でＧＰＲ７アゴニストを注射剤の形で通常成人（６０ｋｇ当たり）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
また、例えば、肥満症治療の目的でＧＰＲ７アンタゴニストを経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ当たり）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、肥満症治療の目的でＧＰＲ７アンタゴニストを注射剤の形で通常成人（６０ｋｇ当たり）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００６８】
（２−２）スクリーニング方法Ｂ
次に、ＧＰＲ７リガンドの発現量を調節する化合物のスクリーニング方法について説明する。
本発明のスクリーニング方法Ｂは、具体的には、（ｉ）ＧＰＲ７リガンドを発現し得る細胞または組織を、試験化合物の存在下および非存在下で培養した場合における、それぞれのＧＰＲ７リガンドの発現量またはＧＰＲ７リガンドをコードするｍＲＮＡ量を測定し、比較することを特徴とするＧＰＲ７リガンドの発現量を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニング方法である。
ＧＰＲ７リガンドを発現し得る細胞または組織としては、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル等）の細胞（例えば、神経細胞、内分泌細胞、神経内分泌細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、肝細胞、脾細胞、メサンギウム細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、樹状細胞）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞等）、もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、唾液腺、末梢血、前立腺、睾丸（精巣）、卵巣、胎盤、子宮、骨、軟骨、関節、骨格筋等を用いても良い。その際、株化細胞、初代培養系を用いてもよい。また、前記したＧＰＲ７リガンドをコードするＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換された形質変換体を使用してもよい。
ＧＰＲ７リガンドを発現し得る細胞の培養方法は、前記した形質変換体の培養法と同様である。
試験化合物としては、前記の試験化合物の他、ＤＮＡライブラリーなどを用いることができる。
【００６９】
ＧＰＲ７リガンドの発現量は抗体などを用いて免疫化学的方法などの公知の方法により測定することもできるし、ＧＰＲ７リガンドをコードするｍＲＮＡをノザンハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲやＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法を用いて、公知の方法により測定することもできる。
ｍＲＮＡの発現量の比較をハイブリダイゼーション法によって行うには、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法等に従って行なうことができる。
具体的には、ＧＰＲ７リガンドをコードするｍＲＮＡの量の測定は、公知の方法に従って細胞から抽出したＲＮＡと、ＧＰＲ７リガンドをコードするＤＮＡもしくはその一部または本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドとを接触させ、ＧＰＲ７リガンドをコードするＤＮＡもしくはその一部または本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドと結合したｍＲＮＡの量を測定することによって行われる。ＧＰＲ７リガンドをコードするＤＮＡもしくはその一部または本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドを、例えば放射性同位元素、色素などで標識することによって、ＧＰＲ７リガンドをコードするＤＮＡもしくはその一部または本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドに結合したｍＲＮＡの量が容易に測定できる。放射性同位元素としては、例えば32Ｐ、3Ｈなどが用いられ、色素としては、例えばfluorescein、ＦＡＭ（PE Biosystems社製）、ＪＯＥ（PE Biosystems社製）、ＴＡＭＲＡ（PE Biosystems社製）、ＲＯＸ（PE Biosystems社製）、Ｃｙ５（Amersham社製）、Ｃｙ３（Amersham社製）などの蛍光色素が用いられる。また、ｍＲＮＡの量は、細胞から抽出したＲＮＡを逆転写酵素によってｃＤＮＡに変換した後、ＧＰＲ７リガンドをコードするＤＮＡもしくはその一部または本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲによって、増幅されるｃＤＮＡの量を測定することによって行うことができる。
このように、ＧＰＲ７リガンドをコードするｍＲＮＡの量を増加させる試験化合物を、ＧＰＲ７リガンドの発現量を増加させる活性を有する化合物として選択することができ、また、ＧＰＲ７リガンドをコードするｍＲＮＡの量を減少させる試験化合物をＧＰＲ７リガンドの発現量を減少させる活性を有する化合物として選択することができる。
【００７０】
さらに、本発明は、
（ii）ＧＰＲ７リガンドをコードする遺伝子のプロモーター領域またはエンハンサー領域の下流にレポーター遺伝子を連結した組換えＤＮＡで形質転換した形質転換体を試験化合物の存在下および非存在下で培養した場合における、それぞれのレポーター活性を測定し、比較することを特徴とする当該プロモーター活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法を提供する。
レポーター遺伝子としては、例えば、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ルシフェラーゼ、成長因子、β-グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、Green fluorescent protein (GFP)、β-ラクタマーゼなどが用いられる。
レポーター遺伝子産物（例、ｍＲＮＡ、タンパク質）の量を公知の方法を用いて測定することによって、レポーター遺伝子産物の量を増加させる試験化合物を本発明のＧＰＲ７リガンドのプロモーターもしくはエンハンサーの活性を制御（特に促進）する作用を有する化合物、すなわちＧＰＲ７リガンドの発現量を増加させる活性を有する化合物として選択できる。逆に、レポーター遺伝子産物の量を減少させる試験化合物をＧＰＲ７リガンドのプロモーターもしくはエンハンサーの活性を制御（特に阻害）する作用を有する化合物、すなわちＧＰＲ７リガンドの発現量を減少させる活性を有する化合物として選択することができる。
試験化合物としては、前記と同様のものが使用される。
形質転換体の培養は、前記の形質転換体と同様にして行うことができる。
レポーター遺伝子のベクター構築やアッセイ法は公知の技術に従うことができる（例えば、Molecular Biotechnology 13, 29-43, 1999）。
【００７１】
ＧＰＲ７リガンドの発現量を増加させる活性を有する化合物は、安全で低毒性な医薬（例えば、拒食症の予防・治療薬、食欲（摂食）増進剤，下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕の予防・治療薬等）として有用である。
ＧＰＲ７リガンドの発現量を減少させる活性を有する化合物は、肥満症［例、悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満 (exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obesity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalamic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesity)、中心性肥満(central obesity)など］、摂食亢進症(hyperphagia) などの安全で低毒性な予防・治療剤、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常などの安全で低毒性な予防・治療剤（プロラクチン産生抑制剤）、好ましくは肥満症、摂食亢進症などの安全で低毒性な予防・治療剤として有用である。
本発明のスクリーニング方法Ｂまたはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物であり、本発明のペプチドの機能を促進または阻害する化合物である。
該化合物の塩としては、前記した本発明のペプチドの塩と同様のものが用いられる。
【００７２】
本発明のスクリーニング方法Ｂまたはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の治療・予防剤として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、前記した本発明のペプチドを含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、拒食症治療の目的でＧＰＲ７リガンドの発現量を増加させる化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ当たり）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、拒食症治療の目的でＧＰＲ７リガンドの発現量を増加させる化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇ当たり）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
また、例えば、肥満症治療の目的でＧＰＲ７リガンドの発現量を減少させる化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ当たり）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、肥満症治療の目的でＧＰＲ７リガンドの発現量を減少させる化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇ当たり）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００７３】
（３）本発明のペプチドの定量
本発明の抗体は、本発明のペプチドを特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のペプチドの定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のペプチドとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のペプチドの割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のペプチドの定量法、および
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のペプチドの定量法を提供する。
【００７４】
上記（ii）の定量法においては、一方の抗体が本発明のペプチドのＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のペプチドのＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、本発明のペプチドに対するモノクローナル抗体を用いて本発明のペプチドの定量を行うことができるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')２、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のペプチドの定量法は、 特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、ペプチド量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
【００７５】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常ペプチドあるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のペプチド量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
【００７６】
本発明のサンドイッチ法による本発明のペプチドの測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のペプチドの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のペプチドのＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のペプチドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D : Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E : Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のペプチドを感度良く定量することができる。
【００７７】
さらには、本発明の抗体を用いて本発明のペプチドの濃度を定量することによって、本発明のペプチドの濃度の減少が検出された場合、例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（II型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）の疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。また、本発明のペプチドの濃度の増加が検出された場合には、例えば、肥満症［例、悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満 (exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obesity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalamic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesity)、中心性肥満(central obesity)など］、摂食亢進症(hyperphagia)、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常（特に肥満症等）などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のペプチドを検出するために使用することができる。また、本発明のペプチドを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のペプチドの検出、被検細胞内における本発明のペプチドの挙動の分析などのために使用することができる。
【００７８】
（４）遺伝子診断剤
本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）における本発明のペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションによりｍＲＮＡの発現低下が検出された場合は、 例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（II型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、ノーザンハイブリダイゼーションによりｍＲＮＡの発現過多が検出された場合は、例えば、肥満症［例、悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満 (exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obesity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalamic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesity)、中心性肥満(central obesity)など］、摂食亢進症(hyperphagia) 、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常（特に肥満症等）などである可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
【００７９】
（５）アンチセンスＤＮＡを含有する医薬
本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑制することができるアンチセンスＤＮＡは、例えば、肥満症［例、悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満 (exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obesity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalamic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesity)、中心性肥満(central obesity)など］、摂食亢進症(hyperphagia) 、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常（特に肥満症等）などの予防・治療薬として使用することができる。
【００８０】
例えば、該アンチセンスＤＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【００８１】
（６）本発明の抗体を含有する医薬
本発明のペプチドの活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、例えば、肥満症［例、悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満 (exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obesity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalamic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesity)、中心性肥満(central obesity)など］、摂食亢進症(hyperphagia) 、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常（特に肥満症等）などの予防・治療薬などの医薬として使用することができる。
【００８２】
本発明の抗体を含有する上記疾患の治療・予防剤は、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の肥満症患者の治療・予防のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０.０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０.１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
【００８３】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（５０mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【００８４】
（７）ＤＮＡ転移動物
本発明は、外来性の本発明のペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１)記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
【００８５】
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のペプチドを発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のペプチドの機能を抑制するペプチドを発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
【００８６】
本発明のペプチドの発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、▲１▼ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、▲２▼各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。
【００８７】
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のペプチドの翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なペプチドの翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
【００８８】
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のペプチドの機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のペプチドの機能亢進症や、本発明のペプチドが関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のペプチドの増加症状を有することから、本発明のペプチドに関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
【００８９】
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のペプチドの機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のペプチドの機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のペプチドの機能不活性型不応症における本発明の異常ペプチドによる正常ペプチドの機能阻害（dominant negative作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のペプチドの増加症状を有することから、本発明のペプチドまたはの機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
▲１▼組織培養のための細胞源としての使用、
▲２▼本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたペプチド組織を分析することによる、本発明のペプチドにより特異的に発現あるいは活性化するペプチドとの関連性についての解析、
▲３▼ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
▲４▼上記▲３▼記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
▲５▼本発明の変異ペプチドを単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のペプチドの機能不活性型不応症などを含む、本発明のペプチドに関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のペプチドに関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のペプチド産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のペプチドおよびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のペプチドの機能不活性型不応症を含む、本発明のペプチドに関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のペプチドが関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
【００９０】
（８）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第（１）項記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である第（１）項記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）項記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである第（４）項記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである第（８）項記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）第（７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のペプチドの活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のペプチドの発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
【００９１】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 EvansとKaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
【００９２】
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−０.５％トリプシン／０.１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のペプチドまたは本発明のレセプター蛋白質の細胞生物学的検討において有用である。
【００９３】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のペプチドのヘテロ発現不全個体であり、本発明のペプチドまたは本発明のレセプター蛋白質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のペプチドまたは本発明のレセプター蛋白質のホモ発現不全個体を得ることができる。
【００９４】
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のペプチドにより誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のペプチドの生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【００９５】
（８ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【００９６】
例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（II型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）に対して治療・予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に糖負荷処置を行ない、糖負荷処置前または処置後に試験化合物を投与し、該動物の摂食量、血糖値および体重変化などを経時的に測定する。
【００９７】
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の摂食量等が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上上昇した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のペプチドの欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のペプチドを含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の拒食症患者においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の拒食症患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００９８】
（８ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のペプチドをコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のペプチドの発現する組織で、本発明のペプチドの代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のペプチドの動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のペプチド欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【００９９】
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のペプチドの発現を促進し、該ペプチドの機能を促進することができるので、例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（II型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）の疾病に対する安全で低毒性な治療・予防剤（特に、食欲（摂食）増進剤）などの医薬として有用である。
また、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のペプチドの発現を阻害し、該ペプチドの機能を阻害することができるので、例えば、肥満症［例、悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満 (exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obesity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalamic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesity)、中心性肥満(central obesity)など］、摂食亢進症(hyperphagia)、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常などの予防・治療剤（プロラクチン産生抑制剤）などの予防・治療剤、好ましくは肥満症、摂食亢進症などの予防・治療剤などの医薬として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【０１００】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のペプチドまたはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の拒食症患者においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の拒食症患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の肥満症患者においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の肥満症患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のペプチドのプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのペプチドを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のペプチドそのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
【０１０１】
さらに、本発明のウシＧＲＰ７、ウシＧＰＲ８（以下、ウシＧＰＲ７／８と略記する）の用途について説明する。
本発明のウシＧＰＲ７／８に対する抗体（以下、単にウシＧＰＲ７／８抗体と称する場合がある）は、本発明のウシＧＰＲ７／８に対する抗体を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明の抗体は、本発明のウシＧＰＲ７／８を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。具体的には、前記した本発明のペプチドに対する抗体と同様に製造することができる。
【０１０２】
本発明のウシＧＰＲ７／８をコードするＤＮＡ（以下、ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡと略記する場合がある）に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡ（以下、ウシＧＰＲ７／８アンチセンスＤＮＡと略記する場合がある）としては、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。
本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などがあげられる。特に、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発明のウシＧＰＲ７／８のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
以下に、▲１▼本発明のウシＧＰＲ７／８、▲２▼本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ、▲３▼本発明のウシＧＰＲ７／８抗体、および▲４▼ウシＧＰＲ７／８アンチセンスＤＮＡの用途を説明する。
【０１０３】
（１）本発明のウシＧＰＲ７／８が関与する各種疾病の治療・予防剤
本発明のウシＧＰＲ７／８は後述の実施例２５に示すとおり、本発明のペプチドに対する受容体である。
従って、本発明のウシＧＰＲ７／８または本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに異常があったり、欠損している場合には、例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（II型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）の種々の疾病が発症する可能性が高い。
従って、本発明のウシＧＰＲ７／８、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡは、例えば、上記の種々の疾病（特に拒食症）の治療・予防剤などの医薬（特に、食欲（摂食）増進剤等）として使用することができる。
【０１０４】
本発明のウシＧＰＲ７／８および本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡは、例えば、生体内において本発明のウシＧＰＲ７／８が減少あるいは欠損している患者がいる場合に、（イ）本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡを該患者に投与し、生体内で本発明のウシＧＰＲ７／８を発現させることによって、（ロ）細胞に本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡを挿入し、本発明のウシＧＰＲ７／８を発現させた後に、該細胞を患者に移植することによって、または（ハ）本発明のウシＧＰＲ７／８を該患者に投与することなどによって、該患者における本発明のウシＧＰＲ７／８の役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
本発明のウシＧＰＲ７／８またはウシＧＰＲ７／８ＤＮＡを上記の治療・予防剤として使用する場合は、前記した本発明のペプチドまたは本発明のＤＮＡを含有する医薬と同様に製造し、使用することができる。
【０１０５】
（２）疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
（２−１）スクリーニング方法Ａ
本発明のウシＧＰＲ７／８と本発明のペプチドとの結合を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法は前記したとおりである。
（２−２）スクリーニング方法Ｂ
次に、ウシＧＰＲ７／８の発現量を調節する化合物のスクリーニング方法について説明する。
本発明のスクリーニング方法Ｂは、具体的には、（ｉ）ウシＧＰＲ７／８を発現し得る細胞または組織を、試験化合物の存在下および非存在下で培養した場合における、それぞれのウシＧＰＲ７／８の発現量またはウシＧＰＲ７／８をコードするｍＲＮＡ量を測定し、比較することを特徴とするウシＧＰＲ７／８の発現量を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニング方法である。
ウシＧＰＲ７／８を発現し得る細胞または組織としては、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル等）の細胞（例えば、神経細胞、内分泌細胞、神経内分泌細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、肝細胞、脾細胞、メサンギウム細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、樹状細胞）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞等）、もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、唾液腺、末梢血、前立腺、睾丸（精巣）、卵巣、胎盤、子宮、骨、軟骨、関節、骨格筋等を用いても良い。その際、株化細胞、初代培養系を用いてもよい。また、前記したウシＧＰＲ７／８をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換された形質変換体を使用してもよい。
ウシＧＰＲ７／８を発現し得る細胞の培養方法は、前記した形質変換体の培養法と同様である。
試験化合物としては、前記の試験化合物の他、ＤＮＡライブラリーなどを用いることができる。
【０１０６】
ウシＧＰＲ７／８の発現量は抗体などを用いて免疫化学的方法などの公知の方法により測定することもできるし、ウシＧＰＲ７／８をコードするｍＲＮＡをノザンハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲやＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法を用いて、公知の方法により測定することもできる。
ｍＲＮＡの発現量の比較をハイブリダイゼーション法によって行うには、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法等に従って行なうことができる。
具体的には、ウシＧＰＲ７／８をコードするｍＲＮＡの量の測定は、公知の方法に従って細胞から抽出したＲＮＡと、ウシＧＰＲ７／８をコードするＤＮＡもしくはその一部または本発明のウシＧＰＲ７／８アンチセンス・ポリヌクレオチドとを接触させ、ウシＧＰＲ７／８をコードするＤＮＡもしくはその一部または本発明のウシＧＰＲ７／８アンチセンス・ポリヌクレオチドと結合したｍＲＮＡの量を測定することによって行われる。ウシＧＰＲ７／８をコードするＤＮＡもしくはその一部または本発明のウシＧＰＲ７／８アンチセンス・ポリヌクレオチドを、例えば放射性同位元素、色素などで標識することによって、ウシＧＰＲ７／８をコードするＤＮＡもしくはその一部または本発明のウシＧＰＲ７／８アンチセンス・ポリヌクレオチドに結合したｍＲＮＡの量が容易に測定できる。放射性同位元素としては、例えば32Ｐ、3Ｈなどが用いられ、色素としては、例えばfluorescein、ＦＡＭ（PE Biosystems社製）、ＪＯＥ（PE Biosystems社製）、ＴＡＭＲＡ（PE Biosystems社製）、ＲＯＸ（PE Biosystems社製）、Ｃｙ５（Amersham社製）、Ｃｙ３（Amersham社製）などの蛍光色素が用いられる。
また、ｍＲＮＡの量は、細胞から抽出したＲＮＡを逆転写酵素によってｃＤＮＡに変換した後、ウシＧＰＲ７／８をコードするＤＮＡもしくはその一部または本発明のウシＧＰＲ７／８アンチセンス・ポリヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲによって、増幅されるｃＤＮＡの量を測定することによって行うことができる。
このように、ウシＧＰＲ７／８をコードするｍＲＮＡの量を増加させる試験化合物を、ウシＧＰＲ７／８の発現量を増加させる活性を有する化合物として選択することができ、また、ウシＧＰＲ７／８をコードするｍＲＮＡの量を減少させる試験化合物をウシＧＰＲ７／８の発現量を減少させる活性を有する化合物として選択することができる。
【０１０７】
さらに、本発明は、
（ii）ウシＧＰＲ７／８をコードする遺伝子のプロモーター領域またはエンハンサー領域の下流にレポーター遺伝子を連結した組換えＤＮＡで形質転換した形質転換体を試験化合物の存在下および非存在下で培養した場合における、それぞれのレポーター活性を測定し、比較することを特徴とする当該プロモーター活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法を提供する。
レポーター遺伝子としては、例えば、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ルシフェラーゼ、成長因子、β-グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、Green fluorescent protein (GFP)、β-ラクタマーゼなどが用いられる。レポーター遺伝子産物（例、ｍＲＮＡ、タンパク質）の量を公知の方法を用いて測定することによって、レポーター遺伝子産物の量を増加させる試験化合物を本発明のウシＧＰＲ７／８のプロモーターもしくはエンハンサーの活性を制御（特に促進）する作用を有する化合物、すなわちウシＧＰＲ７／８の発現量を増加させる活性を有する化合物として選択できる。逆に、レポーター遺伝子産物の量を減少させる試験化合物をウシＧＰＲ７／８のプロモーターもしくはエンハンサーの活性を制御（特に阻害）する作用を有する化合物、すなわちウシＧＰＲ７／８の発現量を減少させる活性を有する化合物として選択することができる。
試験化合物としては、前記と同様のものが使用される。
形質転換体の培養は、前記の形質転換体と同様にして行うことができる。
レポーター遺伝子のベクター構築やアッセイ法は公知の技術に従うことができる（例えば、Molecular Biotechnology 13, 29-43, 1999）。
【０１０８】
ウシＧＰＲ７／８の発現量を増加させる活性を有する化合物は、安全で低毒性な医薬（例えば、拒食症の予防・治療薬、食欲（摂食）増進剤，下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕の予防・治療薬等）として有用である。
ウシＧＰＲ７／８の発現量を減少させる活性を有する化合物は、肥満症［例、悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満 (exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obesity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalamic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesity)、中心性肥満(central obesity)など］、摂食亢進症(hyperphagia) などの安全で低毒性な予防・治療剤、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常などの安全で低毒性な予防・治療剤（プロラクチン産生抑制剤）、好ましくは肥満症、摂食亢進症などの安全で低毒性な予防・治療剤として有用である。
本発明のスクリーニング方法Ｂまたはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物であり、本発明のペプチドの機能を促進または阻害する化合物である。
該化合物の塩としては、前記した本発明のペプチドの塩と同様のものが用いられる。
本発明のスクリーニング方法Ｂまたはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の治療・予防剤として使用する場合、前記した本発明のペプチドの発現量を変化させる化合物またはその塩を含有する医薬と同様に製造し、使用することができる。
【０１０９】
（３）本発明のウシＧＰＲ７／８の定量
本発明の抗体は、本発明のウシＧＰＲ７／８を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のウシＧＰＲ７／８の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明のウシＧＰＲ７／８抗体と、被検液および標識化された本発明のウシＧＰＲ７／８とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のウシＧＰＲ７／８の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のウシＧＰＲ７／８の定量法、および
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のウシＧＰＲ７／８の定量法を提供する。
【０１１０】
上記（ii）の定量法においては、一方の抗体が本発明のウシＧＰＲ７／８のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のウシＧＰＲ７／８のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、本発明のウシＧＰＲ７／８に対するモノクローナル抗体を用いて本発明のウシＧＰＲ７／８の定量を行うことができるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')２、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明のウシＧＰＲ７／８抗体を用いる本発明のウシＧＰＲ７／８の定量法は、 特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、ペプチド量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
【０１１１】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常ペプチドあるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のウシＧＰＲ７／８モノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のウシＧＰＲ７／８モノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のウシＧＰＲ７／８量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
【０１１２】
本発明のサンドイッチ法による本発明のウシＧＰＲ７／８の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のウシＧＰＲ７／８モノクローナル抗体は、本発明のウシＧＰＲ７／８の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のウシＧＰＲ７／８のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のウシＧＰＲ７／８抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のウシＧＰＲ７／８の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D : Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E : Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、本発明のウシＧＰＲ７／８抗体を用いることによって、本発明のウシＧＰＲ７／８を感度良く定量することができる。
【０１１３】
さらには、本発明のウシＧＰＲ７／８抗体を用いて本発明のウシＧＰＲ７／８の濃度を定量することによって、本発明のウシＧＰＲ７／８の濃度の減少が検出された場合、例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（II型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）の疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明のウシＧＰＲ７／８の濃度の増加が検出された場合には、例えば、肥満症［例、悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満 (exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obesity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalamic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesity)、中心性肥満(central obesity)など］、摂食亢進症(hyperphagia)、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常（特に肥満症等）などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明のウシＧＰＲ７／８抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のウシＧＰＲ７／８を検出するために使用することができる。また、本発明のウシＧＰＲ７／８を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のウシＧＰＲ７／８の検出、被検細胞内における本発明のウシＧＰＲ７／８の挙動の分析などのために使用することができる。
【０１１４】
（４）遺伝子診断剤
本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）における本発明のウシＧＰＲ７／８をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションによりｍＲＮＡの発現低下が検出された場合は、例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（II型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、ノーザンハイブリダイゼーションによりｍＲＮＡの発現過多が検出された場合は、例えば、肥満症［例、悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満 (exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obesity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalamic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesity)、中心性肥満(central obesity)など］、摂食亢進症(hyperphagia) 、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常（特に肥満症等）などである可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
【０１１５】
（５）ウシＧＰＲ７／８アンチセンスＤＮＡを含有する医薬
本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑制することができるアンチセンスＤＮＡは、例えば、肥満症［例、悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満 (exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obesity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalamic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesity)、中心性肥満(central obesity)など］、摂食亢進症(hyperphagia) 、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常（特に肥満症等）などの予防・治療薬として使用することができる。
例えば、該アンチセンスＤＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【０１１６】
（６）本発明のウシＧＰＲ７／８抗体を含有する医薬
本発明のウシＧＰＲ７／８の活性を中和する作用を有する本発明のウシＧＰＲ７／８抗体は、例えば、肥満症［例、悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満 (exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obesity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalamic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesity)、中心性肥満(central obesity)など］、摂食亢進症(hyperphagia) 、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常（特に肥満症等）などの予防・治療薬などの医薬として使用することができる。
本発明のウシＧＰＲ７／８抗体を含有する上記疾患の治療・予防剤は、前記した本発明のペプチドに対する抗体を含有する医薬と同様に製造し、使用することができる。
【０１１７】
（７）ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ転移動物
本発明は、外来性の本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ（以下、本発明の外来性ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１)記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ転移動物は、前記した本発明のＤＮＡ転移動物と同様に作製することができる。
本発明の正常ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のウシＧＰＲ７／８の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のウシＧＰＲ７／８の機能亢進症や、本発明のウシＧＰＲ７／８が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のウシＧＰＲ７／８の増加症状を有することから、本発明のウシＧＰＲ７／８に関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の異常ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のウシＧＰＲ７／８の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のウシＧＰＲ７／８の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
【０１１８】
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ高発現動物は、本発明のウシＧＰＲ７／８の機能不活性型不応症における本発明の異常ウシＧＰＲ７／８による正常ウシＧＰＲ７／８の機能阻害（dominant negative作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のウシＧＰＲ７／８の増加症状を有することから、本発明のウシＧＰＲ７／８またはの機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
▲１▼組織培養のための細胞源としての使用、
▲２▼本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたペプチド組織を分析することによる、本発明のウシＧＰＲ７／８により特異的に発現あるいは活性化するペプチドとの関連性についての解析、
▲３▼ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
▲４▼上記▲３▼記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
▲５▼本発明の変異ウシＧＰＲ７／８を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のウシＧＰＲ７／８の機能不活性型不応症などを含む、本発明のウシＧＰＲ７／８に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のウシＧＰＲ７／８に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のウシＧＰＲ７／８産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のウシＧＰＲ７／８およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のウシＧＰＲ７／８の機能不活性型不応症を含む、本発明のウシＧＰＲ７／８に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のウシＧＰＲ７／８が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
【０１１９】
（８）ウシＧＰＲ７／８ノックアウト動物
本発明は、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第（１）項記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である第（１）項記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）項記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである第（４）項記載の胚幹細胞、
（６）本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである第（８）項記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）第（７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、前記した本発明の非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物と同様に作製することができる。
本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のウシＧＰＲ７／８により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のウシＧＰＲ７／８の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【０１２０】
（８ａ）本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【０１２１】
例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（II型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）に対して治療・予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に糖負荷処置を行ない、糖負荷処置前または処置後に試験化合物を投与し、該動物の摂食量、血糖値および体重変化などを経時的に測定する。
【０１２２】
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の摂食量等が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上上昇した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のウシＧＰＲ７／８の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のペプチドを含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の拒食症患者においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の拒食症患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０１２３】
（８ｂ）本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニング方法
本発明は、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のウシＧＰＲ７／８をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のウシＧＰＲ７／８の発現する組織で、本発明のペプチドの代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のウシＧＰＲ７／８の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のウシＧＰＲ７／８欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【０１２４】
本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のウシＧＰＲ７／８の発現を促進し、該ウシＧＰＲ７／８の機能を促進することができるので、例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（II型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）の疾病に対する安全で低毒性な治療・予防剤（特に、食欲（摂食）増進剤）などの医薬として有用である。
また、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のウシＧＰＲ７／８の発現を阻害し、該ウシＧＰＲ７／８の機能を阻害することができるので、例えば、肥満症［例、悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満 (exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obesity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalamic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesity)、中心性肥満(central obesity)など］、摂食亢進症(hyperphagia)、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常などの予防・治療剤（プロラクチン産生抑制剤）などの予防・治療剤、好ましくは肥満症、摂食亢進症などの予防・治療剤などの医薬として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【０１２５】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のペプチドまたはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の拒食症患者においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の拒食症患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、例えば、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の肥満症患者においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の肥満症患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のウシＧＰＲ７／８のプロモーター領域を含有するウシＧＰＲ７／８ＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのペプチドを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のウシＧＰＲ７／８そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
【０１２６】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
Ｉ ：イノシン
Ｒ ：アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）
Ｙ ：チミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ）
Ｍ ：アデニン（Ａ）またはシトシン（Ｃ）
Ｋ ：グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｓ ：グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）
Ｗ ：アデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ）
Ｂ ：グアニン（Ｇ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｄ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｖ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）
Ｎ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）もしくはチミン（Ｔ）または不明もしくは他の塩基
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＢＨＡ ：ベンズヒドリルアミン
ｐＭＢＨＡ ：ｐ−メチルベンズヒドリルアミン
Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル
Ｂｚｌ ：ベンジル
Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル
Ｂｏｃ ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＣＭ ：ジクロロメタン
ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＤＣＣ ：Ｎ,Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸
ＤＩＥＡ ：ジイソプロピルエチルアミン
【０１２７】
Ｇｌｙ又はＧ ：グリシン
Ａｌａ又はＡ ：アラニン
Ｖａｌ又はＶ ：バリン
Ｌｅｕ又はＬ ：ロイシン
Ｉｌｅ又はＩ ：イソロイシン
Ｓｅｒ又はＳ ：セリン
Ｔｈｒ又はＴ ：スレオニン
Ｃｙｓ又はＣ ：システイン
Ｍｅｔ又はＭ ：メチオニン
Ｇｌｕ又はＥ ：グルタミン酸
Ａｓｐ又はＤ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ又はＫ ：リジン
Ａｒｇ又はＲ ：アルギニン
Ｈｉｓ又はＨ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ又はＦ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ又はＹ ：チロシン
Ｔｒｐ又はＷ ：トリプトファン
Ｐｒｏ又はＰ ：プロリン
Ａｓｎ又はＮ ：アスパラギン
Ｇｌｎ又はＱ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
Ｔｙｒ（Ｉ） ：３−ヨードチロシン
ＤＭＦ ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
Ｔｒｔ ：トリチル
Ｐｂｆ ：2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル
Ｃｌｔ ：２−クロロトリチル
Ｂｕｔ ：ｔ−ブチル
Ｍｅｔ（Ｏ） ：メチオニンスルフォキシド
【０１２８】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ヒト型ＧＰＲ７リガンドＡのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
マウス型ＧＰＲ７リガンドＡのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕
ラット型ＧＰＲ７リガンドＡのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
ヒト型ＧＰＲ７リガンドＢのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５〕
マウス型ＧＰＲ７リガンドＢのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６〕
ラット型ＧＰＲ７リガンドＢのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７〕
ヒト型ＧＰＲ７リガンドＣのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８〕
ヒト型ＧＰＲ７リガンドＤのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９〕
マウス型ＧＰＲ７リガンドＣのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０〕
マウス型ＧＰＲ７リガンドＤのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１１〕
ラット型ＧＰＲ７リガンドＣのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１２〕
ラット型ＧＰＲ７リガンドＤのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１３〕
ヒト型ＧＰＲ７リガンドＥのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１４〕
マウス型ＧＰＲ７リガンドＥのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１５〕
ラット型ＧＰＲ７リガンドＥのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１６〕
ヒト型ＧＰＲ７リガンドＦのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１７〕
マウス型ＧＰＲ７リガンドＦのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１８〕
ラット型ＧＰＲ７リガンドＦのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１９〕
分泌シグナルを含まないヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｇのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２０〕
分泌シグナルを含まないマウス型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｇのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２１〕
分泌シグナルを含まないラット型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｇのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２２〕
分泌シグナルを含むヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２３〕
分泌シグナルを含むマウス型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２４〕
分泌シグナルを含むラット型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２５〕
ヒト型ＧＰＲ７リガンドＡをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２６〕
マウス型ＧＰＲ７リガンドＡをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２７〕
ラット型ＧＰＲ７リガンドＡをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２８〕
ヒト型ＧＰＲ７リガンドＢをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２９〕
マウス型ＧＰＲ７リガンドＢをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３０〕
ラット型ＧＰＲ７リガンドＢをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３１〕
ヒト型ＧＰＲ７リガンドＣをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３２〕
ヒト型ＧＰＲ７リガンドＤをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３３〕
マウス型ＧＰＲ７リガンドＣをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３４〕
マウス型ＧＰＲ７リガンドＤをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３５〕
ラット型ＧＰＲ７リガンドＣをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３６〕
ラット型ＧＰＲ７リガンドＤをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３７〕
ヒト型ＧＰＲ７リガンドＥをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３８〕
マウス型ＧＰＲ７リガンドＥをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３９〕
ラット型ＧＰＲ７リガンドＥをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４０〕
ヒト型ＧＰＲ７リガンドＦをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４１〕
マウス型ＧＰＲ７リガンドＦをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４２〕
ラット型ＧＰＲ７リガンドＦをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４３〕
分泌シグナルを含まないヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＧをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４４〕
分泌シグナルを含まないマウス型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＧをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４５〕
分泌シグナルを含まないラット型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＧをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４６〕
分泌シグナルを含むヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４７〕
分泌シグナルを含むマウス型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４８〕
分泌シグナルを含むラット型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４９〕
ヒトＧＰＲ７のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５０〕
ヒトＧＰＲ７をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５１〕
実施例１でヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：５２〕
実施例１でヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：５３〕
実施例２でマウス型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：５４〕
実施例２でマウス型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：５５〕
実施例３でラット型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：５６〕
実施例３でラット型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：５７〕
参考例１で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：５８〕
参考例１で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：５９〕
ラットＴＧＲ２６のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６０〕
ラットＴＧＲ２６をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：６１〕
参考例３におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：６２〕
参考例３におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー２の塩基配列を示す。
〔配列番号：６３〕
実施例９で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：６４〕
実施例９で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：６５〕
実施例９で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：６６〕
ウシ型ＧＰＲ７リガンドＡのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６７〕
ウシ型ＧＰＲ７リガンドＢのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６８〕
ウシ型ＧＰＲ７リガンドＣのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６９〕
ウシ型ＧＰＲ７リガンドＤのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７０〕
ウシ型ＧＰＲ７リガンドＥのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７１〕
ウシ型ＧＰＲ７リガンドＦのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７２〕
分泌シグナルを含まないウシ型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｇのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７３〕
分泌シグナルを含むウシ型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７４〕
ウシ型ＧＰＲ７リガンドＡをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７５〕
ウシ型ＧＰＲ７リガンドＢをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７６〕
ウシ型ＧＰＲ７リガンドＣをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７７〕
ウシ型ＧＰＲ７リガンドＤをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７８〕
ウシ型ＧＰＲ７リガンドＥをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７９〕
ウシ型ＧＰＲ７リガンドＦをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８０〕
分泌シグナルを含まないウシ型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＧをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８１〕
分泌シグナルを含むウシ型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８２〕
実施例１２で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：８３〕
実施例１２で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：８４〕
ヒトＧＰＲ８のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８５〕
ヒトＧＰＲ８をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８６〕
ウシＧＰＲ７のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８７〕
ウシＧＰＲ７をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８８〕
ウシＧＰＲ８のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８９〕
ウシＧＰＲ８をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：９０〕
実施例１６で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：９１〕
実施例１６で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：９２〕
実施例１６で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：９３〕
実施例１７で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：９４〕
実施例１７で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：９５〕
実施例１７で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：９６〕
実施例１８で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：９７〕
実施例１８で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：９８〕
実施例１９で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：９９〕
実施例１９で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１００〕
ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２３）のアミノ酸配列を示す。
【０１２９】
後述の実施例１で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＡｈＧＰＲ７−１は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＡｈＧＰＲ７Ｌ−１として２００１年６月２７日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６４０として、２００１年６月１９日から大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ１６６４４として寄託されている。
後述の実施例２で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＡｍＧＰＲ７−１は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＡｍＧＰＲ７Ｌ−１として２００１年６月２７日から独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６４１として、２００１年６月１９日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６６５６として寄託されている。
後述の実施例３で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＡｒＧＰＲ７−１は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＡｒＧＰＲ７Ｌ−１として２００１年６月２７日から独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６４２として、２００１年６月１９日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６６５７として寄託されている。
後述の実施例１２で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＡｂＧＰＲ７Ｌ−１は、２００１年１２月１７日から独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８２９として、２００１年１２月６日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６７３６として寄託されている。
後述の実施例１８で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＡｂＧＰＲ７は、２００２年５月２４日から独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８０５０として寄託されている。
後述の実施例１９で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＡｂＧＰＲ８は、２００２年５月２４日から独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８０５１として寄託されている。
後述の参考例３で得られた形質転換体 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ／ｐＡＫ−ｒＧＰＲ７は、２０００年１０月３１日から大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５、財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ １６４９６として、２０００年１１月１３日から日本国茨城県つくば市東１−１−３、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−７３６５としてそれぞれ寄託されている。
【０１３０】
【実施例】
以下に参考例および実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
参考例１ ヒト染色体DNAを用いたPCR法によるヒトGPR7 DNAの増幅
ヒト染色体DNAを鋳型として、２種の合成プライマー（配列番号：５７および配列番号：５８）を用いたPCR法によるDNA増幅を行なった。合成プライマーは受容体蛋白に翻訳される領域の遺伝子が増幅されるように構築したが、その際に遺伝子の5’側に制限酵素Cla Iの認識する塩基配列が付加され、3’側に制限酵素Spe Iの認識する塩基配列が付加されるように、5’側および3’側にそれぞれの制限酵素の認識配列を付加した。反応液の組成は、ヒト染色体DNA（タカラ）0.5μg、合成DNAプライマー各1μM、0.8 mM dNTPs、1 mM MgCl2、KODポリメラーゼ（トーヨーボー）1μlおよび酵素に付属のバッファーで、総反応量は50μlとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（タカラ）を用い、94℃・60秒の加熱の後、98℃・15秒、65℃・2秒、74℃・30秒のサイクルを35回繰り返した。増幅産物の確認は、0.8%アガロースゲル電気泳動の後、エチジウムブロマイド染色によって行なった。
【０１３１】
参考例２ PCR産物のプラスミドベクターへのサブクローニングおよび挿入DNA部分の塩基配列の解読による増幅DNA配列の確認
参考例１で行なったPCR反応液を0.8%の低融点アガロースゲル電気泳動により分離し、バンドの部分をかみそりで切り出した後、細片化、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿の操作を行なってDNAを回収した。pCR-ScriptTM Amp SK(+)クローニングキット（ストラタジーン）の処方に従い、回収したDNAをプラスミドベクターpCR-Script Amp SK(+)へサブクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) DH5αcompetent cell（トーヨーボー）に導入して形質転換した後、DNA挿入断片を持つクローンをアンピシリン、IPTGおよびX-galを含むLB寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体E. coli DH5α/GPR7を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドDNAを調整した。調整したDNAの一部に対して制限酵素Cla IおよびSpe Iによる切断を行ない、挿入されている受容体DNA断片の大きさを確認した。塩基配列の決定のための反応はDyeDeoxyTerminator Cycle Sequence Kit (Applied Biosystems社)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した（配列番号：５０）。配列番号：５０で表わされる塩基配列を有するDNAを保持するpCR-Script Amp SK(+)プラスミドを、pCR-ScriptヒトGPR7と命名した。配列番号：５０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡがコードするヒトGPR7のアミノ酸配列を配列番号：４９に示した。ここで配列を決定したヒトGPR7のDNA配列はO’Dowdらの報告（O’Dowd, B. F. et al.、Genomics、28巻、84-91頁、1995年）にあるDNA配列とは２塩基が異なっていた。これらは配列番号：５０の893番目および894番目に当たり、O’Dowdらの報告ではそれぞれCおよびGであるが、本参考例ではGおよびCであった。これにより、翻訳されるアミノ酸配列において配列番号：４９の296番目のアミノ酸が、O’Dowdらの報告のThrが本実施例ではSerとなる。
【０１３２】
参考例３ ラット全脳由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定
ラット全脳ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型とし、ヒトＧＰＲ８をコードするＤＮＡの塩基配列を元に設計した２個のプライマー、プライマー１（配列番号：６１）およびプライマー２（配列番号：６２）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は、上記ｃＤＮＡを１０分の１量鋳型として使用し、 Ａｄｖａｎｔａｇｅ−２ ｃＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）１／５０量、プライマー３ ０．２μＭ、プライマー２ ０．２μＭ 、ｄＮＴＰｓ ２００μＭ、および酵素に添付のバッファーを加え、２５μｌの液量とした。ＰＣＲ反応は、▲１▼９４℃・２分の後、▲２▼９４℃・２０秒、７２℃・２分のサイクルを3回、▲３▼９４℃・２０秒、６６℃・２０秒、６８℃・２分のサイクルを３回、▲４▼９４℃・２０秒、６０℃・２０秒、６８℃・２分のサイクルを３６回繰り返し、最後に６８℃・７分の伸長反応を行った。該ＰＣＲ反応後の反応産物を、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の処方に従い、プラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へサブクローニングした。これを大腸菌ＤＨ５αに導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で、ｃＤＮＡを持つクローンを選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：６０）を得た。このＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列番号：５９）を含有する新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をＴＧＲ２６と命名した。
配列番号：５９で表されるアミノ酸配列は、既知のヒトＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質であるＧＰＲ７〔 ゲノミクス（Genomics），２８巻，８４−９１頁，１９９５年〕 との間に８４．８％の相同性を有していた。
ＴＧＲ２６をコードするＤＮＡを挿入したプラスミドを有する前述した形質転換体から１クローンを選択し、アンピシリンを含むＬＢ培地で振とう培養し、プラスミドを得た。これを制限酵素ＣｌａＩおよびＳｐｅＩで処理し、ＴＧＲ２６をコードするインサート部分を切り出した。同様に制限酵素ＣｌａＩおよびＳｐｅＩで処理したｐＡＫＫＯ−１．１１ＨおよびＬｉｇａｔｉｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ１０Ｂにエレクトロポーレーション法にて導入した。得られたクローンについては、有する発現細胞構築用プラスミドの構造を、制限酵素処理および配列解析で確認したうえ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ／ｐＡＫ−ｒＧＰＲ７と命名した。
【０１３３】
参考例４ ＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞の作製
参考例３に記載の発現プラスミドｐＡＫ−ｒＧＰＲ７で形質転換したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α（トーヨーボー）を培養後、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてｐＡＫ−ｒＧＰＲ７プラスミドＤＮＡを調製した。これをＣｅｌｌＰｈｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて、添付のプロトコールに従ってＣＨＯ ｄｈｆｒ−細胞に導入した。５μｇのＤＮＡをリン酸カルシウムとの共沈懸濁液とし、４８時間前に３ｘ１０５個のＣＨＯ ｄｈｆｒ−細胞を播種した直径６ｃｍシャーレ２枚に添加した。１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭα培地で１日間培養した後、継代し、選択培地である１０％透析ウシ胎児血清を含む核酸不含ＭＥＭα培地で培養した。選択培地中に増殖してくるＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞である形質転換細胞のコロニー４４クローンを選択した。
【０１３４】
実施例１ ヒト全脳cDNAからのPCR法によるGPR7リガンド前駆体遺伝子の取得と発現プラスミドの構築
クローンテック社より購入したヒト全脳cDNAを鋳型として、以下の２種類の合成DNAを用いて、PCR による増幅を行った。
GSF1: 5’-GTCGACATGGCCCGGTCCGCGACACTGGCGGCC-3’（配列番号：５１）
GSR2: 5’-GCTAGCAGCGGTGCCAGGAGAGGTCCGGGCTCA-3’（配列番号：５２）
PCRの反応液はcDNA溶液1 μl、0.5 μl GSF1（10 μM）、0. 5 μl GSR2（10 μM）、2.5 μl添付の10 x 反応液、2.5 μl dNTP（10 mM）、0.5 μl KlenTaq（クローンテック）、17.5 μl大塚蒸留水を加えて合計25 μlにした。反応液を、ThermalCycler9600を用いてPCR反応にかけた。PCRの条件は95 ℃2 分の変性の後、98 ℃10 秒、60 ℃20 秒、72 ℃20秒のサイクルを35回繰り返した。PCR産物の一部を用いて電気泳動で約400 bpのPCR産物の増幅を確認した後、PCR産物をQuiagen PCR purification Kitを用いて精製し、直接配列決定を行ったところ図１で示す配列がえられた。図１のDNA配列から予測されるアミノ酸配列は図２に示すものであった。次に、ゲルから回収したPCR産物をTAクローニングキット（Invitrogen社）を用いて大腸菌JM109にサブクローニングし、大腸菌JM109/pTAhGPR7-1を取得した。サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミドpTAhGPR7-1をプラスミド抽出機（クラボウ社）を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、その配列が図１と同じヒト型GPR7リガンド cDNAであることを確認した。次にそのプラスミドから制限酵素Sal1ＩおよびNheＩによって消化後約0.4kbのヒト型GPR7リガンドcDNA断片を得た。さらに、動物細胞用の発現ベクターであるpAKKO-111Hはマルチクローニングサイト部分の制限酵素サイトSalＩおよびNheＩによって消化後、電気泳動を行い、ベクター部分を回収した。以上の操作によって調製したヒト型GPR7リガンドcDNA断片および発現ベクターをライゲーションによって連結し、大腸菌JM109を形質転換してE.coli JM109/pAK-S64を得た。
形質転換体E.coli JM109/pAK-S64を培養し、プラスミドpAK-S64のDNAを大量に調製した。
【０１３５】
実施例２ マウス全脳cDNAからのPCR法によるGPR7リガンド前駆体遺伝子の取得マウス全脳cDNAを鋳型として、以下の２種類の合成DNAを用いて、PCR による増幅を行った。
MFSAL1: 5’-GTCGACAGCTCCATGGCCCGGTGTAGGACGCTG-3’（配列番号：５３）
MRNHE1: 5’-GCTAGCTCAGGTGCTCTGGCAATCAGTCTCGTG-3’（配列番号：５４）
PCRの反応液はcDNA溶液1 μl、0.5 μl MFSAL1（10 μM）、0. 5 μl MRNHE1（10 μM）、2.5 μl添付の10 x 反応液、2.5 μl dNTP（10 mM）、0.5 μl KlenTaq（クローンテック）、17.5 μl大塚蒸留水を加えて合計25 μlにした。反応液を、ThermalCycler9600を用いてPCR反応にかけた。PCRの条件は95 ℃2 分の変性の後、98 ℃10 秒、60 ℃20 秒、72 ℃20秒のサイクルを35回繰り返した。PCR産物の一部を用いて電気泳動で約400 bpのPCR産物の増幅を確認した後、PCR産物をQuiagen PCR purification Kitを用いて精製し、直接配列決定を行ったところ図３で示す配列がえられた。図３のDNA配列から予測されるアミノ酸配列は図４に示すものであった。次に、ゲルから回収したPCR産物をTAクローニングキット（Invitrogen社）を用いて大腸菌JM109にサブクローニングし、大腸菌JM109/pTAmGPR7-1を取得した。サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミドpTAmGPR7-1をプラスミド抽出機（クラボウ社）を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、その配列が図３と同じマウス型GPR7リガンド cDNAであることを確認した。
【０１３６】
実施例３ ラット全脳cDNAからのPCR法によるGPR7リガンド前駆体遺伝子の取得ラット全脳cDNAを鋳型として、以下の２種類の合成DNAを用いて、PCR による増幅を行った。
RF: 5’-CACGGCTCCATGGTCCGGTGTAGGACG-3’（配列番号：５５）
RR: 5’-CAGCGTCGAGGTTTGGGTTGGGGTTCA-3’（配列番号：５６）
PCRの反応液はcDNA溶液1 μl、0.5 μl RF（10 μM）、0. 5 μl RR（10 μM）、2.5 μl添付の10 x 反応液、2.5 μl dNTP（10 mM）、0.5 μl KlenTaq（クローンテック）、17.5 μl大塚蒸留水を加えて合計25 μlにした。反応液を、ThermalCycler9600を用いてPCR反応にかけた。PCRの条件は95 ℃2 分の変性の後、98 ℃10 秒、60 ℃20 秒、72 ℃20秒のサイクルを35回繰り返した。PCR産物の一部を用いて電気泳動で約400 bpのPCR産物の増幅を確認した後、PCR産物をQuiagen PCR purification Kitを用いて精製し、直接配列決定を行ったところ図５で示す配列がえられた。図５のDNA配列から予測されるアミノ酸配列は図６に示すものであった。
次に、ゲルから回収したPCR産物をTAクローニングキット（Invitrogen社）を用いて大腸菌JM109にサブクローニングし、大腸菌JM109/pTArGPR7-1を取得した。サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミドpTArGPR7-1をプラスミド抽出機（クラボウ社）を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、その配列が図５と同じラット型GPR7リガンド cDNAであることを確認した。
【０１３７】
実施例４ GPR7発現プラスミドおよびレポータープラスミドのチャイニーズハムスターオバリー（CHO）細胞での一過的な発現
参考例２で得たヒト型GPR7 DNAを、自体公知の方法により動物細胞用発現プラスミドｐＡＫＫＯ-111Ｈに挿入したプラスミドを用いて大腸菌JM109を形質転換した。得られたコロニーを単離・培養後、QUIAGEN Plasmid Maxi Kit（キアゲン社）を用いてＧＰＲ7発現プラスミドDNAの調製を行なった。また、cAMPレスポンスエレメント（CRE）の下流にレポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子が連結されたpCRE-Luc（クロンテック社）のプラスミドDNAを同様の方法で調製した。
GPR7発現プラスミドおよびpCRE-Lucは受容体遺伝子を挿入していない発現ベクターを導入したCHO細胞に一過性に発現させた。CHO細胞は96-ウェルプレート（コーニングコースター社）に40,000 細胞/ウェル、培養液量100μlで播種し、37℃で一晩培養した。プレート上での培養にはDMEM（Dulbecco’s modified Eagle’s medium, GibcoBRL社）に10%のウシ胎児血清のみを添加した培地を用いた。各プラスミドは240ng/μlの濃度に希釈し、GPR7の発現プラスミド9 μlとpCRE-Luc 1 μlの割合で240 μlのOpti-MEM-I（GibcoBRL社）に添加した。これを、同じく240 μlのOpti-MEM-Iに10 μlのリポフェクトアミン2000（GibcoBRL社）を添加したものと等量混合して、リポフェクトアミン2000に添付のマニュアル記載の方法に従ってリポソームとプラスミドDNAの複合体を形成させた。これを25μl/wellずつCHO細胞の培養液に添加し、その4時間後に培養液をアッセイバッファー（0.1%のウシ血清アルブミンを添加したDMEM）に交換して無血清化し、37℃で一晩培養した。
【０１３８】
実施例５ リガンド遺伝子のCHO細胞での発現
実施例１で作製したヒト型リガンドｃDNAを挿入した動物細胞用発現プラスミドpAK-S64を実施例４と同様の方法でCHO細胞に一過性に発現させた。ただし細胞は6-ウェルプレート（ファルコン社）に600,000細胞/ウェルで播種し、一晩培養の後、リガンド遺伝子プラスミドを導入した。240ng/μlの濃度に希釈したプラスミドを10 μlと240 μlのOpti-MEM-Iに添加し、これを、同じく240 μlのOpti-MEM-Iに10 μlのリポフェクトアミン2000を添加したものと等量混合して、リポフェクトアミン2000に添付のマニュアル記載の方法に従ってリポソームとプラスミドDNAの複合体を形成させた。これを500μl/ウェルずつCHO細胞の培養液に添加し、その4時間後に培養液をアッセイバッファーに交換し、無血清化をおこなった。培地交換の１８時間後に各ウェルの培地を回収しリガンドペプチドを含むＣＨＯ細胞培養上清を得た。
【０１３９】
実施例６ Ｓ６４発現細胞上清によるＧＰＲ７を一過性に発現させたＣＨＯ細胞でのルシフェラーゼ活性の抑制の検出
実施例４の方法に従いＧＰＲ７を一過性に発現させたＣＨＯ細胞の培養液に、実施例５で調製したpAK-S64発現培養上清および終濃度2 μMとなるようにホルスコリンを添加した。またリガンド遺伝子を挿入していない空の発現ベクター(ｐAKKO-111H)を実施例５の方法で一過性に発現させたCHO細胞の培養上清も同様に添加した。その際発現上清はアッセイバッファーにて２倍、４倍、８倍、１６倍に希釈した。上清を添加してから4時間37℃でインキュベーションを行ない、受容体を介したリガンドのアゴニスト活性によって惹起される細胞内シグナル伝達に由来するレポーター（ルシフェラーゼ）遺伝子の転写・翻訳の促進あるいは抑制を誘導した。インキュベーション終了後に各ウェルのアッセイバッファーを除去し、PicaGene LT2.0 （東洋インキ社）発光基質を50 μlずつ加えた。細胞が溶解し、基質と充分に混合した後、各ウェルのレポーター遺伝子の発現誘導量に由来する発光量をプレートリーダー（ARVOsxマルチラベルカウンター、PerkinElmer社）を用いて測定した。その結果、ｐAK-S64の培養上清を添加した際にのみレポーター遺伝子の発現抑制がルシフェラーゼ活性の低下として検出された(図８)。さらに、この抑制の程度はｐAK-S64の培養上清の濃度依存的であった。このことはpAK-S64に挿入されたプラスミドによって発現した産物が、GPR7を介した細胞内のシグナルを伝達した、すなわちGPR7のリガンドとして作用したことを示している。
【０１４０】
実施例７ Ｓ６４発現細胞上清によるＴＧＲ２６を一過性に発現させたＣＨＯ細胞でのルシフェラーゼ活性の抑制の検出
参考例３で得たＴＧＲ２６ ＤＮＡを、自体公知の方法により動物細胞用発現プラスミドｐＡＫＫＯ−１１１Ｈに挿入したプラスミドを用いて、実施例４と同様の方法でＴＧＲ２６発現プラスミドＤＮＡの調製を行なった。これをやはり実施例４に示した方法でＣＨＯ細胞にルシフェラーゼ遺伝子とともに一過性に発現させた。この細胞に、実施例５で調製したｐＡＫ−Ｓ６４発現培養上清、空の発現ベクターのみを発現させた細胞の培養上清および終濃度２μＭとなるようにホルスコリンを添加し、実施例６と同様の方法でリガンド活性の検出を試みた。その結果ｐＡＫ−Ｓ６４の上清は、ホルスコリンによって上昇したルシフェラーゼ活性を濃度依存的に低下させた（図９）。
【０１４１】
実施例８ Ｓ６４発現細胞上清によるＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞のｃＡＭＰ産生量の抑制
実施例４にて作製したＧＰＲ７発現用プラスミドを用いて自体公知の方法によりＧＰＲ７の安定的な発現ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−ＧＰＲ７を作製した。ＣＨＯ−ＧＰＲ７あるいは受容体遺伝子を導入していないｍｏｃｋ ＣＨＯ細胞を２００００ｃｅｌｌｓ／ウェルの濃度で９６ウェルプレート（ベクトンデッキンソン）に播種し、３７℃ ５％ＣＯ２で１晩培養したものをアッセイに使用した。サンプルバッファーはダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ、ギブコ）に０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ）および０．２ｍＭ ＩＢＭＸ（シグマ）を添加したものを用いた。細胞をサンプルバッファーで２回洗浄し、３７℃ ５％ＣＯ２で３０分間プレインキュベーションした後、さらに細胞を２回洗浄し、サンプルを添加して３７℃ ５％ＣＯ２で３０分間インキュベーションした。サンプルはサンプルバッファーのみ（無処理）、ｃＡＭＰ産生の上昇を促す試薬であるホルスコリン（和光純薬工業）１μＭ、実施例５においてｐＡＫ−Ｓ６４を一過性に発現させて得たＣＨＯ細胞の培養上清とホルスコリンを同時に添加したもの（Ｓ６４上清）、およびｐＡＫＫＯ−１１１Ｈを発現させたＣＨＯ細胞の培養上清（ｐＡＫＫＯ上清）とホルスコリンを同時に添加したものの４種類であった。サンプルとのインキュベーションの後、細胞内のｃＡＭＰ産生量はｃＡＭＰ Ｓｃｒｅｅｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）を用いて測定した。その結果、Ｓ６４上清を添加することによりＣＨＯ−ＧＰＲ７特異的に細胞内ｃＡＭＰ産生量の抑制反応が認められ（図１０）、ｍｏｃｋＣＨＯ細胞では細胞内ｃＡＭＰ産生量の抑制反応が認められなかった（図１１）。
【０１４２】
実施例９ ＲＴ−ＰＣＲによるＧＰＲ７リガンドｍＲＮＡのラットにおける組織分布の検討
Ｗｉｓｔａｒラットより各種臓器を摘出し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社）、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡをｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）により、それぞれのマニュアルにしたがって調製した。得られたｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ １μｇをＤｎａｓｅＩ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｇｒａｄｅ， ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）処理後、１６０ｎｇ分をＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて、マニュアルに従い４２℃でｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡはｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ換算で４ｎｇ／μｌの溶液とし、以後のＲＴ−ＰＣＲの鋳型として用いた。 ＲＴ−ＰＣＲはＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｐｒｉｓｍ ７７００（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、増幅と検出のためのプライマーとして５’−ＣＴＧＴＣＧＡＧＴＴＴＣＣＡＣＡＧＧＴＴＣＣ−３’（配列番号：６３）， ５’−ＴＴＧＣＧＣＡＧＡＧＧＴＡＣＧＧＴＴＣＣ−３’（配列番号：６４） およびＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅとして５’−（Ｆａｍ）−ＣＧＴＧＣＣＡＡＧＡＡＡＣＧＣＧＴＧＡＣＣＴＴＧＴＴ−（Ｔａｍｒａ）−３’（配列番号：６５）を使用した。ＲＴ−ＰＣＲ反応液はＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１２．５μｌに、それぞれ１００μＭのプライマー溶液を０．０５μｌ、５μＭのＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅを０．５μｌ、および上記で調製したｃＤＮＡ溶液を０．５μｌ加え、蒸留水で総反応液量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は５０℃ ２分、９５℃ １０分の後、９５℃ １５秒、６０℃ １分のサイクルを４０回繰り返した。得られたラット各種組織におけるＧＰＲ７リガンドのｍＲＮＡ発現量はｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ １ｎｇあたりのコピー数として算出した（図１２）。
【０１４３】
実施例１０ ウシ視床下部からの内因性GPR7リガンドの精製
ヒトＧＰＲ７リガンド前駆体ｍＲＮＡは視床下部、脊髄で多く発現していることが認められたため、内因性ＧＰＲ７リガンドの精製を、ウシ視床下部を出発材料として、ヒト型ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞を用い、細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性（cAMP-Screen System(ABI)を用いて測定）を指標にして行った。
まず、凍結保存されたウシ視床下部１．０ｋｇをミリＱ水中で煮沸し、冷却後酢酸を１Ｍとなるように加え、ポリトロンでホモジナイズした。一晩撹拌した後、遠心にて上清を得た。上清にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を０．０５％となるように加え、Ｃ１８カラム(Prep C18 125Å; Waters)にアプライした。カラムに結合したペプチドを０．５％ＴＦＡを含む１０、４０、６０％アセトニトリルでステップワイズに溶出した。４０％アセトニトリル画分に二倍量の２０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．７）で希釈し、イオン交換カラム HiPrep CM-Sepharose FF (Pharmacia)にアプライした。イオン交換カラムに結合したペプチド１０％アセトニトリルを含む２０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．７）中の０〜０．５Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配で溶出した。もっとも多く活性物質が含まれていたＮａＣｌ画分（０．３〜０．３５Ｍ）に２倍量の冷アセトンを加え、遠心にて沈殿を除き上清をエバポレ−トにて濃縮した。濃縮された上清に０．１％となるようＴＦＡを加え、逆相ＨＰＬＣカラム RESOURCE RPC (Pharmacia) にてさらなる分離を行った。RESOURCE RPCの分離は２０〜３０％アセトニトリルの濃度勾配で行い、主たる活性は、およそ２２％アセトニトリルで溶出された。この活性画分に３倍量の冷アセトンを加え、遠心にて沈殿を除き上清をエバポレートにて濃縮した。濃縮された上清に０．１％となるようＴＦＡを加え、逆相ＨＰＬＣカラム Vydac C18 218TP5415 (Vydac) にてさらなる分離を行った。Vydac C18 218TP5415の分離は２０〜３０％アセトニトリルの濃度勾配で行い、主たる活性は、およそ２５％アセトニトリルで溶出された。この活性画分を１０％アセトニトリルを含む２０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．７）中での０．３〜０．５Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配を用いた陽イオン交換カラム TSK-gel CM-2SW(ト−ソ−)で分離したところ、主たる活性は、およそ０．５Ｍ ＮａＣｌで溶出された。活性を含むCM-2SWカラムの画分に０．１％となるようＴＦＡを加え、１６−２４％アセトニトリルの濃度勾配を用いた逆相カラム μRPC C2/C18 SC2.1/10で最終精製し、活性と一致する単一のピ−クを得た(図１３)。
【０１４４】
実施例１１ 最終精製標品のＮ末端アミノ酸配列分析およびマススペクトルによる分子量測定
実施例１０で得られた最終精製標品を、約半量をＮ末端アミノ酸をプロティンシ−クエンサ−(model 491cLC; Applied Biosystems)で分析、残り半量をESIMS(Thermoquest)で分析した。
Ｎ末端配列分析の結果、２サイクル目から２５サイクル目までウシＧＰＲ７リガンド前駆体の２６位から４９位に相当する配列を読むことができた（図１４）。サイクル１は同定できなかった（ｘ）ことから、翻訳後修飾を受けているものと推定された。２サイクル目以降は、明瞭に上記の配列と同定された。
ＥＳＩＭＳ測定（図１５上）では、フルマススキャンモードでの測定から３２４１．５の値を得た。マススペクトルから算出された分子量とＭＳ／ＭＳスペクトルの解析結果（図１５下）から、Ｎ末端２残基の何れかが翻訳後修飾を受けているものと推定した。Ｎ末端配列分析結果を考え合わせて、１位Ｔｒｐが修飾されているものと推定した。
ズームスキャンモードで測定した３価の分子イオンの同位体プロファイル（図１６）を考え合わせて、本物質は２９残基ＧＰＲ７リガンドで、１位トリプトファン残基がブロモ化されていると推定した。
この推定を確認するため、DL-5-bromotryptophan（Aldrich）、DL-6-bromotryptophan（Biosynth）からPTHスタンダードを作成して分析した。DL-5-bromotryptophanまたはDL-6-bromotryptophan 200nmolを、ethanol:triethyamine:DW:phenylisothiocyanate(sigma)＝7:1:1:1 20ulを加え室温で２０分反応し、乾燥後ＴＦＡ ５０ｕｌを加えて５０℃１０分反応し、乾燥後２Ｎ ＨＣｌ：ｍｅｔｈａｎｏｌ＝１：１を５０ｕｌ加えて５０℃１０分反応し、逆相ＨＰＬＣにて精製して、5-bromotryptophanまたは6-bromotryptophanのPTH誘導体を得た。最終物の確認はプロテインシーケンサーにて行った（図１７および図１８）。これらのＰＴＨ誘導体を２０アミノ酸ＰＴＨスタンダード（ＡＢＩ）に混合し、これらが分離するプロトコルを作成し（表１および表２）、内因性ウシＧＰＲ７リガンドを分析したところ、１位アミノ酸はPTH-6-bromotryptophanのピークと一致した(図１９)。
これらの分析結果より、ウシ視床下部からの最終精製標品はウシＧＰＲ７リガンド前駆体の２５位Ｔｒｐから５３位Ａｌａに相当する２９アミノ酸（配列番号：６７）からなるペプチドで、１位Ｔｒｐは翻訳後修飾で６−ブロモ化されていることが判明した。
【０１４５】
【表１】

Figure 0004128030
表１は、通常のペプチド用メソッド(Pulsed-Liquid cLC)とブロモトリプトファン用メソッド（BrTrp-liquid cLC）の、サイクルとグラディエントの比較を示す。
【０１４６】
【表２】
Figure 0004128030
表２は、491cLC protein sequencer (ABI) の通常のペプチド用(Normal 1 cLC)とブロモトリプトファン分析用に作成した(Normal for BrW cLC, BrTrp cLC) グラディエントの比較を示す。
【０１４７】
Ｎ末端配列分析は、491cLC protein sequencer (ABI)で、通常のペプチド分析用メソッド(Normal １cLC)をbromotryptophan分析用に改良(BrTrp-liquid cLC)したものを用いて行った。上記の条件以外は、メーカーのマニュアルに従った。改良したグラディエント(BrTrp cLC)を用いると、Br付加位置の異なる5-/6-bromotryptophanを判別することが可能である。
改良したメソッド、BrTrp-liquid cLCを用いて分析すると、ブランク、スタンダード及び2サイクル目までのみ5-/6-bromotryptophan分析用グラディエント(BrTrp cLC)が適応され、3サイクル目以降は異なるグラディエント(Normal for BrW cLC)が適応される。
【０１４８】
実施例１２ ウシ視床下部cDNAからのPCR法によるウシ型GPR7リガンド前駆体遺伝子の取得
ウシ視床下部cDNAを鋳型として、以下の２種類の合成DNAを用いて、PCR による増幅を行った。
BF1: 5’-CCCATGGCCGGGCCCGCGATGCTGGTCGCC-3’ （配列番号：８２）
BR1: 5’-TCACTTGCGACAGTCCGAGGCGCTGAGCGA-3’ ’ （配列番号：８３）
PCRの反応液はcDNA溶液1 μl、0.5 μl BF1（10 μM）、0. 5 μl BF2（10 μM）、2.5 μl添付の10 x 反応液、2.5 μl dNTP（10 mM）、0.5 μl KlenTaq（クローンテック）、17.5 μl大塚蒸留水を加えて合計25 μlにした。反応液を、ThermalCycler9600を用いてPCR反応にかけた。PCRの条件は95 ℃2 分の変性の後、98 ℃10 秒、60 ℃20 秒、72 ℃20秒のサイクルを35回繰り返した。PCR産物の一部を用いて電気泳動で約400 bpのPCR産物の増幅を確認した後、PCR産物をQuiagen PCR purification Kitを用いて精製し、直接配列決定を行ったところ図２０で示す配列がえられた。図２０のDNA配列から予測されるアミノ酸配列は図２１に示すものであった。次に、ゲルから回収したPCR産物をTAクローニングキット（Invitrogen社）を用いて大腸菌JM109にサブクローニングし、大腸菌JM109/pTAbGPR7L-1を取得した。サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミドpTAbGPR7L-1をプラスミド抽出機（クラボウ社）を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、その配列がウシ型GPR7リガンド cDNAであることを確認した。
【０１４９】
実施例１３ ＧＰＲ７リガンドの合成
ＧＰＲ７リガンド（ＧＰＲ７Ｌ）およびＧＰＲ８リガンド（ＧＰＲ８Ｌ）は、ABI 433ペプチド合成機にて、Fmoc/DCC/HOBtプロトコルで合成した。DL-6-Bromotryptophan(Biosynth)は、Boc- DL-6-bromotryptophan-OMeとした後キラル分割して、それぞれをペプチド合成に用いた。
（１）DTrp(6Br)1-humanＧＰＲ７Ｌ(29)（配列番号：４で表されるアミノ酸配列のＮ末端Ｄ−トリプトファンの６位がブロモ化されたもの）：
(D-Trp(6Br)-Tyr-Lys-Pro-Ala-Ala-Gly-His-Ser-Ser-Tyr-Ser-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro-Tyr-Ala)、
（２）LTrp(6Br)1-humanＧＰＲ７Ｌ(29)（配列番号：４で表されるアミノ酸配列のＮ末端Ｌ−トリプトファンの６位がブロモ化されたもの）：
(Trp(6Br)-Tyr-Lys-Pro-Ala-Ala-Gly-His-Ser-Ser-Tyr-Ser-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro-Tyr-Ala)、
（３）Trp1-humanＧＰＲ７Ｌ(29)（配列番号：４）：
(Trp-Tyr-Lys-Pro-Ala-Ala-Gly-His-Ser-Ser-Tyr-Ser-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro-Tyr-Ala) 、
（４）Trp1-humanＧＰＲ７Ｌ(23)（配列番号：１）：
(Trp-Tyr-Lys-Pro-Ala-Ala-Gly-His-Ser-Ser-Tyr-Ser-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Gly-Leu) 、
（５）DTrp(6Br)1-bovineＧＰＲ７Ｌ(29)（配列番号：６７で表されるアミノ酸配列のＮ末端Ｄ−トリプトファンの６位がブロモ化されたもの）：
(D-Trp(6Br)-Tyr-Lys-Pro-Thr-Ala-Gly-Gln-Gly-Tyr-Tyr-Ser-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Gly-Phe-His-Arg-Ser-Pro-Tyr-Ala) 、
（６）LTrp(6Br)1-bovineＧＰＲ７Ｌ(29)（配列番号：６７で表されるアミノ酸配列のＮ末端Ｌ−トリプトファンの６位がブロモ化されたもの）：
(Trp(6Br)-Tyr-Lys-Pro-Thr-Ala-Gly-Gln-Gly-Tyr-Tyr-Ser-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Gly-Phe-His-Arg-Ser-Pro-Tyr-Ala) 、
（７）Trp1-bovineＧＰＲ７Ｌ(29)（配列番号：６７）：
(Trp-Tyr-Lys-Pro-Thr-Ala-Gly-Gln-Gly-Tyr-Tyr-Ser-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Gly-Phe-His-Arg-Ser-Pro-Tyr-Ala) 、
（８）Trp1-ratＧＰＲ７Ｌ(29)（配列番号：６）：
(Trp-Tyr-Lys-Pro-Ala-Ala-Gly-Ser-HisI-His-Tyr-Ser-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Ser-Phe-His-Arg-Phe-Pro-Ser-Thr)、
（９）Trp1-ratＧＰＲ７Ｌ(24)（配列番号：３）：
(Trp-Tyr-Lys-Pro-Ala-Ala-Gly-Ser-His-His-Tyr-Ser-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Ser-Phe-His)
（１０）Trp1-humanＧＰＲ８Ｌ(23)（配列番号：１００）：
(Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu)（ＷＯ０１／９８４９４号）
【０１５０】
実施例１４ ＧＰＲ７リガンドのラット側脳室内投与による摂食量に及ぼす影響ＧＰＲ７リガンド(ＧＰＲ７Ｌ)のラット側脳室内投与による摂餌量に及ぼす影響を検討した。ラットは、照明時間を8時から20時、室温25℃において飼育した。成熟Wistar系雄性ラット（手術時体重300〜320ｇ）をペントバルビタール50 mg/kgの腹腔内投与にて麻酔し、ラット脳定位固定装置に固定した。切歯用バーはインターオーラルラインから3.3 mm低くした。頭蓋骨を露出し、側脳室にガイドカニューレＡＧ-8（内径0.4 mm、外径0.5 mm、エイコム社）を埋め込むために歯科用ドリルを用いて骨に穴を開けた。また、その周囲3箇所にアンカービスを埋めた。ステンレス製ガイドカニューレ、ＡＧ−８を、その先端が側脳室の上部に位置するように挿入した。定位座標は、PaxinosとWatson(1998)のアトラスに従い、ブレグマより、ＡＰ： -0.8 mm、Ｌ：1.5 mm、Ｈ：-4.5mmとした。ガイドカニューレは歯科用セメントおよびアンカービスで頭蓋骨に固定した。ガイドカニューレにはステンレス製ダミーカニューレ、ＡＤ-8（外径 0.35 mm、エイコム社）を挿入し、キャプナット（エイコム社）で固定した。術後、ラットは個別のケージで飼育した。
ガイドカニューレを埋め込んでから約1週間飼育して術後の回復を待ち、ラットの頭蓋骨に装着したキャップナットとダミーカニューレを取り外し、代わりにテフロン（登録商標）チューブ（長さ50 cm、内径0.1 mm、外径0.35 mm、エイコム社）につないだステンレス製マイクロインジェクションカニューレAMI-9（内径0.17 mm、外径0.35 mm、エイコム社）を挿入した。マイクロインジェクションカニューレの長さは、その先端1 mmがガイドカニューレから露出するように調節しておいた。テフロン（登録商標）チューブの一方をマイクロシリンジポンプにつなぎ、滅菌蒸留水（大塚製薬）、実施例１３で合成したブロム化されていないＧＰＲ７Ｌ（Trp1-bovineＧＰＲ７Ｌ(29)、配列番号：６７）を溶解させた蒸留水を5μl/分の流速で計10μl(10 nmol/rat)を側脳室に注入した。注入終了後2分待ってからマイクロインジェクションカニューレを取り外し、再びダミーカニューレをキャップナットで固定した。注入は、19時から20時の間に行いその後の摂餌量を摂餌量測定措置Feed-Scale（コロンバス社）を用いて経時的に測定した。図２２に示すごとくブロム化されていないＧＰＲ７Ｌ投与群は対象群に比し、投与2時間後より有意な摂餌量の増加が認められた。
【０１５１】
実施例１５ ウシ内因性ＧＰＲ７リガンドのＦＴＭＳ測定
ウシ内因性ＧＰＲ７Ｌを、ApexII(ブルカーダルトニクス)にてESIFTMS分析した（図２３上）。図２３の中図に[M+5H]5+イオンの拡大図、下図に1Br付加ウシＧＰＲ７Ｌの[M+5H]5+イオンの同位体理論プロファイルを示す。同位体プロファイル、マス値共によく一致したことで、修飾物はBrと同定された。
【０１５２】
実施例１６ ＲＴ−ＰＣＲによるＧＰＲ７リガンドｍＲＮＡのヒトにおける組織分布の検討
ｍＲＮＡの発現量は実施例９と同様の方法で行った。ただし鋳型となるｃＤＮＡには、ヒト各種組織由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（クロンテック社）から以下の方法で合成したものを使用した。ＲＮＡ１μｇからランダムプライマー、逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用い、添付のマニュアルに従って４２℃で反応を行い、反応終了後にエタノール沈殿して１００μｌに溶解した。発現量の定量も実施例9と同様にＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｐｒｉｓｍ ７７００を用いて行った。ただし増幅と検出のためのプライマーとして5’-CGCTCCCAGCCCTACAGA-3’（配列番号：９０），5’-TCGCCTTGCACTGGTAGGTC-3’（配列番号：９１）およびＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅとして5’-(Fam)AGCCTCGCTGTGTGCGTCCAGGAC-(Tamra)-3’（配列番号：９２）を使用した。
得られたヒト各種組織におけるＧＰＲ７のｍＲＮＡ発現量はｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ １ｎｇあたりのコピー数として算出した（図２４）。
【０１５３】
実施例１７ ＲＴ−ＰＣＲによるラット型ＧＰＲ７（ラットＴＧＲ２６）ｍＲＮＡの組織分布の検討
ｍＲＮＡの発現量は実施例９と同様の方法で行った。実施例９で使用したラット各種臓器由来のｃＤＮＡを用いて、ラットＧＰＲ７ｍＲＮＡの発現量を求めた。ただし増幅と検出のためのプライマーとして５’−TGCGTGCTATCCAGCTAGACAG−３’（配列番号：９３）， ５’−AGAGGAGGCACACAGCCAGAAT−３’（配列番号：９４） およびＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅとして５’−（Ｆａｍ）CGTGCCAAGAAACGCGTGACCTTGTT−（Ｔａｍｒａ）−３’（配列番号：９５）を使用した。
得られたラット各種組織におけるＧＰＲ７のｍＲＮＡ発現量はｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ １ｎｇあたりのコピー数として算出した（図２５）。
【０１５４】
実施例１８ ウシ視床下部cDNAからのPCR法によるウシ型ＧＰＲ７遺伝子の取得ウシ視床下部ｃＤＮＡを鋳型として、以下の２種類の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。
BGPR7F: 5’-GTCGACCGAGTGTCTGTCCTCGCCAGGATG-3’ （配列番号：９６）
BGPR7R: 5’-GCTAGCTCCTTGTTATCGGGCTCAGGAGGTGGT-3’ （配列番号：９７）
PCRの反応液はcDNA溶液1 microl、0.5 microl BGPR7F（10 microM）、0. 5 microl BGPR7R（10 microM）、2.5 microl添付の10 x 反応液、2.5 microl dNTP（10 mM）、0.5 microl KlenTaq（クローンテック）、17.5 microl大塚蒸留水を加えて合計25 microlにした。反応液を、ThermalCycler9600を用いてPCR反応にかけた。PCRの条件は95 ℃2 分の変性の後、98 ℃10 秒、60 ℃20 秒、72 ℃60秒のサイクルを40回繰り返した。PCR産物の一部を用いて電気泳動で約1000 bpのPCR産物の増幅を確認した後、PCR産物をQuiagen PCR purification Kit（キアゲン社）を用いて精製し、直接配列決定を行ったところ図２６で示す配列がえられた。図２６のDNA配列から予測されるアミノ酸配列は図２７に示すものであった。次に、ゲルから回収したPCR産物をTAクローニングキット（インビトローゲン社）を用いて大腸菌JM109にサブクローニングし、大腸菌JM109/pTAbGPR7を取得した。サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミドpTAbGPR7をプラスミド抽出機（クラボウ社）を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、その配列がウシ型ＧＰＲ７受容体 ｃＤＮＡであることを確認した。
【０１５５】
実施例１９ ウシ視床下部ｃＤＮＡからのＰＣＲ法によるウシ型ＧＰＲ８遺伝子の取得
ウシ視床下部ｃＤＮＡを鋳型として、以下の２種類の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ による増幅を行った。
BGPR8F: 5’-GTCGACCATGATGGAGGCCACTGGGCTGGAAGG-3’ （配列番号：９８）
BGPR8R: 5’-GCTAGCTTATGCCCCCTGGCACCGACATGCGGT-3’ （配列番号：９９）
PCRの反応は実施例１８と同様の方法で行った。得られたＰＣＲ産物をQuiagen PCR purification Kitを用いて精製し、直接配列決定を行ったところ図２８で示す配列がえられた。図２８のDNA配列から予測されるアミノ酸配列は図２９に示すものであった。次に、ゲルから回収したＰＣＲ産物をＴＡクローニングキットを用いて大腸菌JM109にサブクローニングし、大腸菌JM109/pTAbGPR8を取得した。サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミドpTAbGPR8をプラスミド抽出機を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、その配列がウシ型ＧＰＲ８ｃＤＮＡであることを確認した。
【０１５６】
実施例２０ ヒト型ＧＰＲ７リガンド発現CHO細胞の培養上清からのＧＰＲ７リガンドの精製
実施例５で構築したヒト型ＧＰＲ７リガンド発現CHO細胞の培養上清を2L集め、-80℃にて保存した。培養上清は、解凍後湯せんにてボイルし、さらに遠心して上清を得た。上清にトリフルオロ酢酸(TFA)を0.05%となるように加え、C18カラム(Prep C18 125Å; ウォーターズ社)にアプライした。カラムに結合したペプチドを0.5%TFAを含む10、40、60%アセトニトリルでステップワイズに溶出した。40%アセトニトリル画分を三倍量の20mM酢酸アンモニウム(pH4.7)で希釈し、イオン交換カラム HiPrep CM-Sepharose FF (ファルマシア社)にアプライした。イオン交換カラムに結合したペプチド10%アセトニトリルを含む20mM酢酸アンモニウム(pH4.7)中の0M~0.5M NaClの濃度勾配で溶出した。各フラクションの一部をSep-Pak plus C18 Cartridge(ウォーターズ社)を用いた脱塩後、ヒト型GPR7発現CHO細胞に特異的な細胞内cAMP産生抑制活性を測定した。ヒト型GPR7発現CHO細胞に特異的活性が見出されたCM-Sepharoseフラクションに0.1%となるようTFAを加え、逆相HPLCカラム RESOURCE RPC (ファルマシア社) にて、さらなる分離を行った。RESOURCE RPCの分離は15-30％アセトニトリルの濃度勾配で行い、主たるヒト型GPR7発現CHO細胞に特異的な細胞内cAMP産生抑制活性は、およそ22%アセトニトリルで溶出された。この活性画分を10%アセトニトリルを含む20mM酢酸アンモニウム(pH4.7)中での0.2-0.5M NaClの濃度勾配を用いた陽イオン交換カラム TSK gel CM-SW(ト−ソ−社)で分離したところ、主たる細胞内cAMP産生抑制活性は、およそ0.3M NaClで溶出された。このCM-2SWカラムの画分に0.1%となるようTFAを加え、15-22%アセトニトリルの濃度勾配を用いた逆相カラム μRPC C2/C18 SC2.1/10で最終精製した結果、単一のピ−クが得られ、これはヒト型GPR7発現CHO細胞に特異的な細胞内cAMP産生抑制活性と一致した（図３０）。
この最終精製標品のＮ末端アミノ酸をプロティンシ−クエンサ−(model 492; アプライドバイオシステムス社)で分析したところ、図３１に示すアミノ酸配列が得られた。
また、ESI-MS (サーモクエスト社)を用いて、最終精製標品の分子量を測定したところ、2505.6の値を得た(図３２)。
これらの分析結果より、最終精製標品は前駆体の Trp25からArg48までに相当する24アミノ酸からなるペプチドであることが判明した。
【０１５７】
実施例２１ ヒト型ＧＰＲ７リガンドのヨード標識体の作製
ｈＧＰＲ７Ｌ−２３（配列番号：１） (0.1mM又は1mM) 20μl、ラクトペルオキシダーゼ(シグマ社、10μg/mLに0.1M HEPES-NaOH pH7.0を用いて調製) 20μｌ、Idoine-125（アマシャム社製、IMS-30、74MBq）20μｌ、0.005% 過酸化水素(和光純薬社製) 20μｌ を混合、室温で20分から30分静置した後、0.1% TFA 600μｌを添加して逆相HPLCにて分離、2つの標識体のピークを1mL DMSOを入れたチューブで分取した。直ちに氷上に保管し、一部を1/100希釈してγ-カウンターで放射活性を測定し、残りの標品は分注して-30℃にて保存した。
【０１５８】
実施例２２ ヒト型ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分の調製
ヒト型GPR7発現CHO細胞を培養したフラスコを5mM EDTA/PBSで洗浄、5mM EDTA/PBSで細胞を剥がし、遠心して細胞を回収、25mLの 膜画分調製用緩バッファー（50mM Tris-HCl, pH7.5、 5mM EDTA、 0.1% ウシ血清アルブミン（シグマ社製）、0.5mM PMSF（和光純薬社製）、 20μｇ/mL leupeptin(ペプチド研究所製)、 0.1μg/mL pepstatinA（ペプチド研究所製）、 4μg/mL E-64（ペプチド研究所製））に懸濁、ポリトロンを用い氷上でホモジナイズした（12,000rpm、15秒×3回）。これを、高速冷却遠心機にて4℃、1,000g、10分遠心し、上清を回収した。沈殿に25mLの膜画分調製用緩衝バッファーを加え、同様の操作で上清を回収した。これら上清をまとめ、セルストレーナーにかけた後、超遠心機用チューブに分注し、4℃、100,000g、1時間遠心した。ペレットを回収し、少量の膜画分調製用バッファーに懸濁し、テフロン（登録商標）ホモジナイザーを用いて懸濁した後、一部を用いて蛋白量を測定し、残りを分注して-80℃にて保存した。
【０１５９】
実施例２３ ヒト型ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いたスキャッチャード解析
ヒト型GPR7発現CHO細胞膜画分、[Tyr(125I)11]-hGPR7L-23（配列番号：１）を用いてスキャッチャード解析を行った。アッセイ用バッファー（50mM Tris-HCl, pH7.5、 5mM EDTA、 0.1% ウシ血清アルブミン（シグマ社製）、0.5mM PMSF（和光純薬社製）、 20μｇ/mL leupeptin(ペプチド研究所製)、 0.1μg/mL pepstatinA（ペプチド研究所製）、 4μg/mL E-64（ペプチド研究所製））にて、膜画分を終濃度1μg/wellとなるよう希釈、標識体を終濃度400pM、200pM、100pM、50pM、25pM、10pMとなるよう希釈した。ポリプロピレン製96穴プレートを用いて、アッセイバッファーのみ（トータル）と終濃度2μＭのhGPR7L-23(NSB)各50μｌを分注、各wellに標識体溶液25μｌを添加して攪拌後膜画分希釈液25μｌを混合・攪拌して、室温で1.5時間インキュベート、96穴プレート用セルハーベスターを用いて、洗浄用バッファー（50mM Tris-HCl, pH7.5）で予め湿らせたフィルターユニット(GF/C、ポリエチレンイミン処理)に吸着、5回洗浄用緩衝液で洗浄した後、充分に乾燥させた。インプットとして、標識体希釈液を直接フィルターユニット(GF/C、ポリエチレンイミン処理)に添加し、乾燥させた。これらに液体シンチレーターを50μｌ分注し、トップカウント（パッカード）で放射活性を測定し、3連でデータを解析し(図３３)、Bmax=1.28pmol/mg protein、Kd=35.5pMの値を得た。
【０１６０】
実施例２４ ヒト型ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞に対する各種ペプチドの結合阻害実験
アッセイ用バッファーを用いて、ヒト型GPR7発現CHO細胞の膜画分を終濃度1μg/well、hGPR7L-23ヨード標識体（配列番号：１）を終濃度100pMとなるよう希釈した。表３に示したペプチドは、10-2M又は10-3Mのストック溶液を、終濃度が10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11Mとなるようアッセイ用バッファーで希釈した。NBSとして終濃度10-5MのhGPR7L-23を調製した。ポリプロピレン製96穴プレートを用いて、調製した試料溶液、NSB、トータルとしてアッセイバファーを50μｌ分注し、ヨード標識体希釈液25μｌを添加して攪拌後、ヒト型GPR7発現CHO細胞膜画分溶液25μｌを分注して攪拌、室温1時間半インキュベートした。これを、96穴プレート用セルハーベスターを用いて、洗浄用バッファー（50mM Tris-HCl, pH7.5）で予め湿らせたフィルターユニットに吸着、６回洗浄用緩衝液で洗浄した後、充分に乾燥させた。液体シンチレーターを50μｌ分注てトップカウント（パッカード社）で放射活性を測定し、3連でデータを解析した。ヒト型GPR7発現CHO細胞膜画分に対する各種ペプチドの結合阻害実験結果を表３にIC50値を示す。
【表３】
Figure 0004128030
【０１６１】
実施例２５ ＧＰＲ７およびＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に対する各種ペプチドのアゴニスト活性の比較
ヒト型GPR7、ウシ型GPR8、ヒト型GPR8、ウシ型GPR8、ラット型GPR7を発現させたCHO細胞に対する、各種GPR7リガンドに関連したペプチドの、細胞内cAMP産生抑制活性を調べた。各受容体発現細胞を、96穴プレートに4×104個／wellで継代し、37℃、5%CO2 95%airで一日培養した。アッセイ用バッファーとして、Hanks’ Balanced Salt Solution（ギブコ社）に、20mM HEPES pH7.4、0.1% ウシ血清アルブミン、0.2mM 3-isobutyl-1-methylxanthine(シグマ社)を加えたものを調製した。一晩培養したプレートは、まず、アッセイ用バッファー150μlで二回洗浄後、アッセイ用バッファー150μlに交換して、30分、37℃、100% airで培養した。試料希釈用バッファーとしてアッセイ用バッファーに4μM フォルスコリンを添加したものを作成、これを用い表 に示したペプチドのストック溶液(10-2M又は10-3M)を希釈して、終濃度10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10Mとなるよう試料溶液を調製した。アッセイ用バッファーで30分培養したプレートを取り出し、アッセイ用バッファーで2回洗浄後、アッセイバッファーを50μｌ、次に試料溶液50μｌを添加した。一つの試料につき、測定は３連で行った。また、basal level測定用に同量のアッセイ用バッファー、maximum level測定用にフォルスコリンを加えたバッファーを添加した。プレートを、30分、37℃、100% airで培養し、細胞内cAMP量を、cAMP-ScreenTM System(ABI社)を用い、本キットのプロトコールに従い測定した。Maximam levelのcAMP量と各サンプルを添加した時のcAMP量の差を算出して、フォルスコリンによるcAMP産生促進量に対する百分率を算出し、これをcAMPの産生の抑制率とした。表４に各試料のIC50値を示す。
【表４】
Figure 0004128030
【０１６２】
実施例９ ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法によるＧＰＲ７リガンドｍＲＮＡのラット脳における発現分布の検討
Ｗｉｓｔａｒラットをネンブタール麻酔下で開腹し、左心室から０．９％食塩水を２５０ｍｌ潅流し、続いて４％パラホルムアルデヒド溶液を２５０ｍｌ潅流した。取り出した脳を同溶液中に４時間４℃で浸漬したのち、２０％スクロース溶液に置換し，４℃で３日間浸漬し、解析に供する脳のサンプルを得た。
ＧＰＲ７リガンドアンチセンス、センスプローブは以下の方法で調製した。
まず、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋（ストラタジーン社）に自体公知の方法でラット型ＧＰＲ７リガンドｃＤＮＡを挿入した。このプラスミドをＢａｍＨＩもしくはＸｂａＩを用いて制限酵素処理し、失活させた後に、それぞれ０．５２μｇ／ｍｌ、０．４７μｇ／ｍｌとなるようにＴＥに溶かした。ＢａｍＨＩ処理したものを２μｌ、Ｔ３ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ロッシュ社）４０Ｕ、ｓｕｐｐｌｉｅｄ １０Ｘ ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ、ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ロッシュ社）２０Ｕ、ＤＩＧ ＲＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｍｉｘ，１０Ｘ（ロッシュ社）２μｌ、最終容量が２０μｌとなるように水を加え、３７℃、２時間反応させた。０．２Ｍ ＥＤＴＡを２μｌ加えて反応を止めた後にエタノール沈殿により生成したリボプローブを回収し、アンチセンスプローブとした。また、ＸｂａＩ処理したものを２μｌ、Ｔ３ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ロッシュ社）４０Ｕ、ｓｕｐｐｌｉｅｄ １０Ｘ ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ、ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ロッシュ社）２０Ｕ、ＤＩＧ ＲＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｍｉｘ，１０Ｘ（ロッシュ社）２μｌ、最終容量が２０μｌとなるように水を加え、３７℃、２時間反応させた。０．２Ｍ ＥＤＴＡを２μｌ加えて反応を止めた後にエタノール沈殿により生成したリボプローブを回収し、センスプローブとした。それぞれの濃度を測定し、アンチセンスプローブ濃度が０．２９μｇ／ｍｌ、センスプローブ濃度が０．２７μｇ／ｍｌとなるようにＲＮａｓｅ フリーの水に溶かした。
In situハイブリダイゼーションは以下の方法で行った。上記で調製した脳試料をクライオスタットＣＭ３０５０(ライカ社)を用いて２５ミクロンの厚さに前額断で調製した。生成した切片を１０ｍｌの４ＸＳＳＣにて５分間、2回洗浄した後に、１０ｍｌのＰＫ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）中にプロテネースＫ（シグマ社）が最終濃度２．５ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃、１０分反応させる。１０ｍｌの４ＸＳＳＣにて５分間、2回洗浄した洗う。１０ｍｌのアセチレーションバッファー（ｐＨ７．５、１００ｍＭ トリエタノールアミン）に０．２５％となるように無水酢酸を加え、室温で１０分反応させた。１０ｍｌの４ＸＳＳＣにて５分洗う。この操作を２回行った後に、ハイブリバッファー（ｐＨ７．４、６０％ ホルムアミド、 １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２００μｇ／ｍｌ イーストｔ−ＲＮＡ、１Ｘ デンハルト，１０％ デキストラン硫酸、６００ｍＭ ＮａＣｌ、０．２５％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）１ｍｌ中にアンチセンス及びセンスプローブが０．２μｇ／ｍｌとなるように加えた溶液に切片を加え、５５℃、１３時間ハイブリさせた。１０ｍｌ洗浄バッファー（２ＸＳＳＣ、５０％ホルムアミド）で５５℃、１５分間、2回洗浄した。ＲＮａｓｅバッファー（ｐＨ８．０、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＣｌ）にＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ社）が２．５μｇ／ｍｌとなるように加え、切片を移し、３７℃、３０分間反応させた。１０ｍｌ洗浄バッファーで５５℃、１５分間洗った。この操作を２回繰り返した後に、０．４ＸＳＳＣで５５℃、１５分間洗った。ブロッキング溶液（ロッシュ社）０．１ｇを１０ｍｌのバッファー Ａ（ｐＨ７．５、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に溶かしたものに切片を移し、室温で１時間反応させる。０．１％ トライトン Ｘ−１００を含む１ｍｌのバッファー Ａにアンチ−ジゴキシゲニン−ＡＰ、Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（ロッシュ社）を０．７５Ｕ加えたものに切片を移し、４℃で１６時間反応させた。その後１０ｍｌのバッファー Ａで室温、１５分間洗った。この操作を２回繰り返した後、１０ｍｌのバッファー Ｂ（ｐＨ９．５、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２）で室温１５分間洗った。１０ｍｌのバッファー Ｂに４０μｌのＮＢＴ溶液（ロッシュ社）及び３５μｌのＸ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ溶液を加え、切片を移し、発色反応を行った。室温で２４時間反応させた後に５０ｍｌのＴＥに移す。切片をＭＡＳコートスライドガラス(松浪ガラス)に貼り付け、風乾させた後に、封入剤（５０％グリセロール、５％ゼラチン）にてカバーグラスを貼り付ける。アンチセンスプローブにて特異的に発色していたのは視床下部の内側視索前野、外側視索前野、視床下部外側野、海馬の海馬錐体細胞CA1-CA3領域、また中脳の中脳水道腹側部などであった。これらの領域ではセンスプローブによる発色は検出されなかった。
【０１６３】
【発明の効果】
本発明のペプチドおよびそのＤＮＡ、本発明のウシＧＰＲ７およびそのＤＮＡ、および本発明のウシＧＰＲ８およびそのＤＮＡは、例えば、拒食症の予防・治療薬、食欲（摂食）増進剤などとして有用である。
さらに、本発明のペプチド等はＧＰＲ７アゴニストやアンタゴニストのスクリーニング等にも有用である。
【０１６４】
【配列表】
Figure 0004128030
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【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨのＤＮＡ配列を示す。
【図２】ヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈのアミノ酸配列を示す。
【図３】マウス型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨのＤＮＡ配列を示す。
【図４】マウス型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈのアミノ酸配列を示す。
【図５】ラット型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨのＤＮＡ配列を示す。
【図６】ラット型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈのアミノ酸配列を示す。
【図７】ヒト型、ラット型およびマウス型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈの比較図を示す。一致するアミノ酸はボックスで囲む。また矢印は分泌シグナルの予想される切断部位を示す。
【図８】リガンド発現ベクターｐＡＫ−Ｓ６４および空の発現ベクター（ｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ）を発現させたＣＨＯ細胞の培養上清を、ＧＰＲ７ｃＤＮＡを挿入した発現プラスミドを一過性に発現させたＣＨＯ細胞の培地にホルスコリン（ＦＳＫ）とともに添加し、リガンド刺激によるルシフェラーゼ活性の抑制を検出した結果を示す。
【図９】Ｓ６４を一過性に発現させたＣＨＯ細胞の培養上清を、ＴＧＲ２６を一過性に発現させたＣＨＯ細胞の培地にＦＳＫと共に添加した際のルシフェラーゼ活性の抑制を検出した結果を示す。
【図１０】Ｓ６４の一過性発現細胞上清によるＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞特異的なｃＡＭＰ産生量の抑制反応を調べた結果を示す。
【図１１】Ｓ６４の一過性発現細胞上清によるｍｏｃｋＣＨＯのｃＡＭＰ産生量の抑制反応を調べた結果を示す。
【図１２】ＧＰＲ７リガンドｍＲＮＡのラットにおける組織分布およびその発現量をＲＴ−ＰＣＲ法によって求めた結果を示す。
【図１３】ウシ視床下部からの内因性GPR7リガンドの最終精製のクロマトパターンを示す。最終精製段階の μRPC C2/C18 SC 2.1/10 のクロマトパタ−ンと各フラクションをヒトGPR7発現CHO細胞に反応させ、cAMP-Screen System(ABI)を用いて測定したcAMP産生量を示す。クロマトのチャートは215nmの吸光度とアセトニトリルの溶出濃度を示す。
【図１４】ウシ視床下部より精製した内因性GPR7リガンドのＮ末端配列分析結果を示す。
【図１５】ウシ視床下部より精製した内因性ＧＰＲ７リガンドのＥＳＩＭＳスペクトル（上）とＭＳ／ＭＳスペクトル（下）を示す。
【図１６】３価分子イオンのズームスキャンスペクトルを示す。
【図１７】PTH-5-bromotryptophan(5BrW)およびPTH-6-bromotryptophan (6BrW)を20アミノ酸PTHスタンダード（＊で示したピーク）分析と混合してスタンダード分析し、スタンダード５BrWが未知試料５BrWとピークが重なることを確認した結果を示す。
【図１８】PTH-5-bromotryptophan(5BrW)およびPTH-6-bromotryptophan (6BrW)を20アミノ酸PTHスタンダード（＊で示したピーク）分析と混合してスタンダード分析し、スタンダード６BrWが未知試料である６BrWとピークが重なることを確認した結果を示す。
【図１９】ウシ視床下部から精製したＧＰＲ７ＬのＮ末端配列分析結果を示す。スタンダード分析と２サイクル目までのクロマトグラムサイクル１のアミノ酸は、6-bromotryptophanのピークと一致している。
【図２０】ウシ型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨのＤＮＡ配列を示す。
【図２１】ウシ型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈのアミノ酸配列を示す。
【図２２】ブロム化されていないＧＰＲ７Ｌまたは蒸留水をラット側脳室内に投与後２時間ごとの摂餌量の経時的変動を示す。図中のＶｅｈｉｃｌｅは蒸留水を、またｂＧＰＲ７Ｌ（Ｂｒ−）はブロム化されていないウシ型ＧＰＲ７リガンドを示す。
【図２３】内因性ＧＰＲ７リガンドのFTMSスペクトルを示す。
【図２４】ＧＰＲ７リガンドｍＲＮＡのヒトにおける組織分布および発現量をＲＴ−ＰＣＲ法によって求めた結果を示す。
【図２５】ラット型ＧＰＲ７（ラットＴＧＲ２６）ｍＲＮＡの組織分布および発現量をＲＴ−ＰＣＲ法によって求めた結果を示す。
【図２６】ウシ型ＧＰＲ７のｃＤＮＡ配列を示す。
【図２７】ウシ型ＧＰＲ７のアミノ酸配列を示す。
【図２８】ウシ型ＧＰＲ８のｃＤＮＡ配列を示す。
【図２９】ウシ型ＧＰＲ８アミノ酸配列を示す。
【図３０】ヒト型ＧＰＲ７リガンド発現CHO細胞の培養上清からのヒト型ＧＰＲ７リガンドの最終精製結果を示す。最終精製段階のμRPC C2/C18 SC 2.1/10 のクロマトパタ−ンと各フラクションをヒト型GPR7発現CHO細胞反応させて得られた特異的な細胞内cAMP産生抑制活性を示す。クロマトのチャ−トは215nmの吸光度とアセトニトリルの溶出濃度を示す。
【図３１】ヒト型ＧＰＲ７リガンド発現CHO細胞の培養上清から精製したＧＰＲ７リガンドのN末端配列分析結果を示す。
【図３２】ヒト型ＧＰＲ７リガンド発現CHO細胞の培養上清から精製したＧＰＲ７リガンドのESI-MSスペクトルを示す。
【図３３】ヒト型ＧＰＲ７発現CHO細胞膜画分を用いたスキャッチャード解析の結果を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to peptides having the ability to bind to GPR7 and the like, their DNAs and their uses, and GPR7 and GPR8 derived from cattle, their DNAs and their uses.
[0002]
[Prior art]
Maintenance of vital homeostasis, reproduction, individual development, metabolism, growth, nervous system, circulatory system, immune system, digestive system, metabolic system regulation, sensory reception, etc. The cells receive endogenous factors such as transmitter substances or sensory stimuli such as light and smell through specific receptors present on the cell membrane of the living body, and react accordingly. Has been done by. Many receptors for hormones and neurotransmitters by such functional regulation are conjugated to guanine nucleotide-binding protein (hereinafter sometimes abbreviated as G protein). It is characterized by transmitting signals and expressing various functions. These receptor proteins have 7 transmembrane regions in common. For these reasons, such receptors are collectively referred to as G protein-coupled receptors or 7-transmembrane receptors. Thus, it is known that various hormones and neurotransmitters and their receptor proteins exist and interact to play an important role in the regulation of biological functions. It is still unclear whether there is a neurotransmitter) and a receptor for it.
In recent years, human genes have been rapidly elucidated by the accumulation of sequence information by random sequencing of human genomic DNA or cDNA derived from various human tissues and rapid progress in gene analysis technology. Along with this, the existence of many genes that are expected to encode proteins of unknown function has been revealed. G protein-coupled receptors not only have seven transmembrane domains but also have many common sequences in their nucleic acids or amino acids, so they are clearly classified as G protein-coupled receptors from such proteins. be able to. On the other hand, such a G protein-coupled receptor gene has also been obtained by a polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as PCR) method utilizing the similarity in structure. Among the G protein-coupled receptors obtained thus far, there are cases where the subtype has a high structural homology with known receptors and the ligand can be easily predicted. In most cases, the endogenous ligand is unpredictable, and no corresponding ligand has been found for these receptors. For this reason, these receptors are called orphan receptors. Such an unidentified endogenous ligand of the orphan receptor may be involved in biological phenomena that have not been fully analyzed because the ligand was not known. And when such a ligand is associated with an important physiological action or pathology, the development of its receptor agonist or antagonist is expected to lead to the creation of innovative drugs (Stadel, J et al., TiPS, 18, 430-437, 1997, Marchese, A. et al., TiPS, 20, 370-375, 1999, Civelli, O. et al., Brain Res. 848, 63-65, 1999, Howard, AD et al., TiPS, 22, 132-140, 2001).
Recently, several groups have attempted to search for ligands for such orphan receptors, and isolation and structure determination of ligands, which are new bioactive peptides, have been reported. Reinsheid et al. And Meunier et al. Are independently named orphanin FQ or nociceptin by introducing cDNA encoding the orphan G protein-coupled receptor LC132 or ORL1 into animal cells and using the response as an index. The same novel peptides were isolated from porcine or rat brain extracts and sequenced (Reinsheid, RK et al., Science, 270, 792-794, 1995, Meunier, J.-C. et al., Nature, 377, 532-535, 1995). Although this peptide was reported to be involved in pain sensation, further studies in receptor knockout mice revealed that it was involved in memory (Manabe, T. et al., Nature, 394 Volume 577-581, 1998).
Since then, novel peptides such as PrRP (prolactin releasing peptide), orexin, apelin, ghrelin, and GALP (galanin-like peptide) have been isolated as ligands for orphan G protein-coupled receptors (Hinuma, S. et al. al., Nature, 393, 272-276, 1998, Sakurai, T. et al., Cell, 92, 573-585, 1998, Tatemoto, K. et al., Bichem. Biophys. Res. Commun., 251, 471-476, 1998, Kojima, M. et al., Nature, 402, 656-660, 1999, Ohtaki, T. et al., J. Biol. Chem. 274, 37041-37045, 1999). On the other hand, there has been an example in which a receptor for a physiologically active peptide that has not been clarified so far has been elucidated. It has been clarified that the receptor of motilin involved in intestinal contraction is GPR38 (Feighner, SD et al., Science, 284, 2184-2188, 1999), and SLC-1 is a receptor for MCH (Chambers, J. et al., Nature, 400, 261-265, 1999, Saito, Y. et al., Nature, 400, 265-269, 1999, Shimomura, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 261, 622-626, 1999, Lembo, PMC et al., Nature Cell Biol., 1, 267-271, 1999, Bachner, D et al., FEBS Lett., 457, 522-524, 1999) and GPR14 (SENR) was reported to be a receptor for urotensin II (Ames, RS et al., Nature, 401, 282-286, 1999, Mori, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 265, 123-129, 1999, Nothacker, H.-P. et al., (Nature Cell Biol., 1, 383-385, 1999, Liu, Q. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 266, 174-178, 1999) Recently, receptors for neuropeptide U, neuropeptide FF, which are neuropeptides, have been clarified. Have been identified as ligands for orphan receptors (Howard, AD et al., TiPS, 22, 132-140, 2001). MCH has been shown to be involved in obesity because its knockout mice exhibit phenotype of sputum (Shimada, M. et al., Nature, 396, 670-674, 1998), but its receptor As a result, it became possible to search for receptor antagonists that have potential as anti-obesity agents. It has also been reported that urotensin II exerts a strong action on the cardiovascular system because it induces cardiac ischemia by intravenous administration to monkeys (Ames, RS et al., Nature, 401, 282-2). 286, 1999). Thus, orphan receptors and their ligands are often involved in new physiological actions, and their elucidation is expected to lead to new drug development. However, it is known that many difficulties are involved in ligand search for orphan receptors. For example, it is generally unknown what secondary signal transduction system is activated after an orphan receptor expressed in a cell responds to a ligand, and various response systems need to be examined. In addition, since a tissue in which a ligand exists is not easily predicted, various tissue extracts must be prepared. In addition, when the ligand is a peptide, the amount of ligand necessary to stimulate the receptor is sufficient at very low concentrations, so that the abundance of such a ligand in vivo is often very small. In addition, since peptides are digested by proteolytic enzymes and lose their activity, or they are poorly recovered in the purification process due to nonspecific adsorption, it is usual to extract from the living body and isolate the amount necessary for structure determination It is extremely difficult. Due to these problems, only a small number of receptors have been revealed so far, although the existence of numerous orphan receptors has been revealed.
One of the reported G protein-coupled receptors is GPR7 (SEQ ID NO: 49, O'Dowd, BF et al., Genomics, 28, 84-91, 1995). GPR7 has low homology with somatostatin receptor (SSTR3) and opioid receptors (δ, κ and μ). GPR7 has a homology of about 64% at the amino acid level with GPR8 (SEQ ID NO: 66, O'Dowd, BF et al., Genomics, 28, 84-91, 1995). . In this O'Dowd, BF et al., The membrane fraction of GPR7 [ Three H] bremazocine binds, and this bond is β-funaltrexamine, [D-Pro Four It has been reported to be inhibited by morphiceptin, β-endorphin, U50,488, a κ opioid receptor selective ligand, and naltrindole, a δ opioid receptor selective ligand.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention provides a novel peptide having the ability to bind to GPR7 and the like, its DNA, a method for screening a drug using the peptide and GPR7 and the like.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors encode a novel peptide (GPR7 ligand) having the ability to bind to GPR7 from the whole human brain, mouse whole brain and rat whole brain. The inventors succeeded in obtaining DNA and found that GPR7 ligand exhibits an appetite (feeding) enhancing action. Furthermore, DNAs encoding GPR7 and GPR8, respectively, were successfully obtained from the bovine hypothalamus. As a result of further studies based on these findings, the present inventors have completed the present invention.
[0005]
That is, the present invention
(1) A peptide comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein the N-terminal amino acid residue may be brominated, its amide, or its Ester or salt thereof,
(2) The peptide according to (1) above, which contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, its amide, its ester or its salt,
(3) The peptide of the above (1) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 66, its amide, its ester or its salt,
(4) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 66, wherein the N-terminal tryptophan residue is 6-brominated, A peptide, its amide, or its ester or its salt,
(5) A peptide comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in which the N-terminal amino acid residue may be brominated, its amide, or its Ester or salt thereof,
(6) The peptide according to (5) above, which contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, its amide, its ester or its salt,
(7) The peptide according to the above (5) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 67, its amide, its ester or its salt,
(8) The peptide according to (5) above, having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 67, an amide, or an ester or a salt thereof, wherein the N-terminal tryptophan residue is 6-brominated
(9) The N-terminal tryptophan residue is 6-brominated and has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 67 as described in (5) above A peptide, its amide, or its ester or its salt,
(10) A peptide comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 in which the N-terminal amino acid residue may be brominated, its amide, or its Ester or salt thereof,
(11) The peptide according to (10) above, comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, its amide, its ester or its salt,
(12) SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 68 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 69 (10) The peptide according to (10), an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof,
(13) A peptide comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, in which the N-terminal amino acid residue may be brominated, its amide, or its Ester or salt thereof,
(14) The peptide according to (13) above, comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, its amide, its ester or its salt,
(15) The peptide according to the above (13) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 70, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof,
(16) A peptide comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 in which the N-terminal amino acid residue may be brominated, its amide, or its Ester or salt thereof,
(17) The peptide according to (16) above, comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, its amide, its ester or its salt,
(18) The peptide according to the above (17) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 71, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof,
(19) The above (1) to (18) having the ability to bind to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 86 or a salt thereof ) The peptide described above, its amide, or its ester or its salt,
(20) The peptide according to the above (1) to (18), which has an ability to bind to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 59 or a salt thereof, Its amide, or its ester or its salt,
(21) The above (1) to (18) having the ability to bind to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 84 or SEQ ID NO: 88 or a salt thereof. ) The peptide described above, its amide, or its ester or its salt,
(22) a partial peptide of the peptide according to any one of (1) to (21) above, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof,
(23) A precursor peptide of the peptide according to any one of (1) to (21) above, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof,
(24) The precursor peptide according to (23) above, comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, its amide, its ester or its salt,
(25) The peptide according to the above (24) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 72, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof,
(26) The peptide according to (23) above, comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, its amide, its ester or its salt,
(27) The peptide according to the above (26) having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 73, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof,
(28) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding the peptide according to any one of (1) to (21) above,
(29) SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: : 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: : The polynucleotide according to (28) above, which has the base sequence represented by SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, or SEQ ID NO: 79,
(30) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding the partial peptide according to (22) above,
(31) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding the precursor peptide according to (23),
(32) The above having the base sequence represented by SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 80, or SEQ ID NO: 81 (31) the polynucleotide according to
(33) The polynucleotide according to (28) to (32), which is DNA,
(34) A recombinant vector containing the polynucleotide according to any one of (28) to (33) above,
(35) A transformant transformed with the recombinant vector according to (34) above,
(36) The transformant according to (35) above is cultured, and the peptide according to any one of (1) to (21) above, a partial peptide thereof or a precursor peptide thereof is produced ( A method for producing the peptide according to any one of 1) to (21), a partial peptide thereof, a precursor peptide thereof, or a salt thereof,
(37) The antibody according to any one of (1) to (21) above, a partial peptide thereof or a precursor peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof, or a salt thereof,
(38) The above-mentioned (37), which is a neutralizing antibody that inactivates the activity of the peptide according to any one of (1) to (21), a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof antibody,
(39) A medicament comprising the antibody according to (37) above,
(40) The medicament according to the above (39), which is a prophylactic / therapeutic agent for obesity or hyperphagia
(41) A diagnostic agent comprising the antibody according to (37) above,
(42) The diagnostic agent according to (41) above, which is a diagnostic agent for anorexia nervosa, obesity or hyperphagia
(43) A pharmaceutical comprising the peptide according to any one of (1) to (21) above, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof,
(44) The medicament according to the above (43), which is an agent for preventing / treating anorexia or an appetite enhancer,
(45) A medicament comprising the polynucleotide according to (28) above,
(46) The medicament according to the above (45), which is a preventive / therapeutic agent for anorexia nervosa or an appetite enhancer,
(47) A diagnostic agent comprising the polynucleotide according to (28) above,
(48) The diagnostic agent according to the above (47), which is a diagnostic agent for anorexia, obesity or hyperphagia
(49) a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the polynucleotide of (28) or a part thereof,
(50) A medicament comprising the polynucleotide according to (49) above,
(51) The medicament according to (50) above, which is a prophylactic / therapeutic agent for obesity or hyperphagia
(52) The peptide according to any one of the above (1) to (21), a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof, the same as or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 A peptide, its partial peptide, its amide, its ester or its salt or its salt according to any one of the above (1) to (21), wherein a protein containing an amino acid sequence or a salt thereof is used, and SEQ ID NO: 49 A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by
(53) The peptide according to any one of (1) to (21) above, the partial peptide, the amide, the ester or the salt thereof, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 59 are the same or substantially the same The peptide according to any one of the above (1) to (21), a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof and SEQ ID NO: 59, wherein a protein containing an amino acid sequence or a salt thereof is used. A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by
(54) The peptide according to any one of the above (1) to (21), a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof, and the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 84 The peptide according to any one of the above (1) to (21), a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof and SEQ ID NO: 84, wherein a protein containing an amino acid sequence or a salt thereof is used. A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by
(55) The peptide according to any one of (1) to (21) above, the partial peptide thereof, the amide thereof, the ester thereof or the salt thereof, the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 A peptide according to any one of the above (1) to (21), a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof, and a sequence number thereof, which comprises a protein containing an amino acid sequence or a salt thereof. A kit for screening a compound or a salt thereof that alters the binding property to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 49 or a salt thereof,
(56) The peptide according to any one of (1) to (21), a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof, the same as or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 59 A peptide according to any one of the above (1) to (21), a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof, and a sequence number thereof, which comprises a protein containing an amino acid sequence or a salt thereof. : A kit for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by 59 or a salt thereof,
(57) The peptide according to any one of (1) to (21) above, the partial peptide thereof, the amide thereof, the ester thereof or the salt thereof, the same as or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 84 A peptide according to any one of the above (1) to (21), a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof, and a sequence number thereof, which comprises a protein containing an amino acid sequence or a salt thereof. : A kit for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by 84 or a salt thereof,
(58) The peptide according to any one of the above (1) to (21), its partial peptide, its amide, which can be obtained using the screening method according to (52) or the screening kit according to (55) Or a compound or a salt thereof that changes the binding property to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 or a salt thereof, or a salt thereof,
(59) The peptide according to any one of the above (1) to (21), its partial peptide, its amide, which can be obtained using the screening method according to (53) or the screening kit according to (56) Or a compound or a salt thereof that changes the binding property to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 59 or a salt thereof, or a salt thereof,
(60) The peptide according to any one of (1) to (21), the partial peptide, the amide thereof, which can be obtained using the screening method according to (54) or the screening kit according to (57). Or a compound or a salt thereof that changes the binding property to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 84 or a salt thereof, or a salt thereof,
(61) The compound or a salt thereof according to the above (58) to (60), which is an agonist,
(62) The compound or a salt thereof according to the above (58) to (60), which is an antagonist,
(63) A medicament comprising the compound or salt thereof according to any of (58) to (60) above,
(64) A preventive / therapeutic agent for anorexia or an appetite enhancer comprising the agonist according to (61) above,
(65) A prophylactic / therapeutic agent for obesity or hyperphagia comprising the antagonist according to (62) above,
(66) An anti-obesity drug obtainable using the screening method according to (52) or the screening kit according to (55),
(67) an anti-obesity drug obtainable using the screening method according to (53) or the screening kit according to (56),
(68) An anti-obesity drug obtainable using the screening method according to (54) or the screening kit according to (57),
(69) The DNA according to any one of (1) to (21) above, wherein the peptide encoding the peptide according to any one of (1) to (21), a partial peptide thereof or a precursor peptide thereof is used. A method for screening a compound or a salt thereof that changes the expression level of the peptide described above, a partial peptide thereof or a precursor peptide thereof,
(70) Any of the above (1) to (21), characterized in that it contains a DNA encoding the peptide according to any one of (1) to (21) above, a partial peptide thereof or a precursor peptide thereof. A kit for screening a compound or a salt thereof that changes the expression level of the peptide according to claim 1, its partial peptide or its precursor peptide,
(71) The peptide according to any one of (1) to (21), a partial peptide thereof or a precursor thereof, which can be obtained using the screening method according to (69) above or the screening kit according to (70) above. A compound or a salt thereof that changes the expression level of a body peptide,
(72) The compound or salt thereof according to the above (71), which is a compound or a salt thereof that increases the expression level,
(73) The compound or salt thereof according to the above (71), which is a compound or a salt thereof that decreases the expression level,
(74) A medicament comprising the compound according to (71) or a salt thereof,
(75) A prophylactic / therapeutic agent for anorexia or an appetite enhancer comprising the compound according to (72) or a salt thereof,
(76) A prophylactic / therapeutic agent for obesity or hyperphagia comprising the compound of the above (73) or a salt thereof,
(77) A mammal according to any one of (1) to (21) above, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof, a polynucleotide according to (28) above, 61) a method for preventing or treating anorexia, comprising administering an effective amount of the agonist according to 61) or the compound or salt thereof according to (72) above,
(78) A mammal according to any one of (1) to (21) above, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof, a polynucleotide according to (28) above, 61) An appetite enhancing method comprising administering an effective amount of the agonist according to 61) or the compound or salt thereof according to (72) above,
(79) An effective amount of the antibody described in (37) above, the polynucleotide described in (49) above, the antagonist described in (62) above, or the compound or salt thereof described in (73) above is administered to a mammal A method for preventing or treating obesity or hyperphagia,
(80) a protein comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 86 or a salt thereof,
(81) the protein of the above (80) or a salt thereof, comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 86;
(82) The partial peptide of the protein according to (80) or a salt thereof,
(83) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding the protein or a partial peptide thereof according to (80),
(84) The polynucleotide according to (83), which is DNA,
(85) The polynucleotide according to (84) above, comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 87,
(86) A recombinant vector containing the polynucleotide according to (83) above,
(87) A transformant transformed with the recombinant vector according to (86) above,
(88) The transformant according to (87) above is cultured to produce the protein according to (80) above or a partial peptide thereof, wherein the protein, partial peptide or salt thereof according to (80) above is produced Manufacturing method,
(89) A pharmaceutical comprising the protein according to (80) or the partial peptide according to (82) or a salt thereof,
(90) A medicament comprising the polynucleotide according to (83) above,
(91) The medicament according to the above (90), which is a preventive / therapeutic agent for anorexia nervosa or an appetite enhancer,
(92) a diagnostic agent comprising the polynucleotide according to (83) above,
(93) The diagnostic agent according to (92) above, which is a diagnostic agent for anorexia nervosa, obesity or hyperphagia
(94) An antibody against the protein according to (80) or the partial peptide according to (82) or a salt thereof,
(95) The antibody according to (94), which is a neutralizing antibody that inactivates signal transduction of the protein according to (80),
(96) A medicament comprising the antibody according to (94) above,
(97) The medicament according to the above (96), which is a prophylactic / therapeutic agent for obesity or hyperphagia
(98) a diagnostic agent comprising the antibody according to (94) above,
(99) The diagnostic agent according to the above (99), which is a diagnostic agent for anorexia nervosa, obesity or hyperphagia
(100) a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the polynucleotide of (83) above or a part thereof,
(101) A medicament comprising the polynucleotide according to (100) above,
(102) The medicament according to the above (101), which is a prophylactic / therapeutic agent for obesity or hyperphagia
(103) a protein or a salt thereof comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 88,
(104) The protein or salt thereof according to (103), which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 88,
(105) the partial peptide of the protein according to (103) or a salt thereof,
(106) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding the protein according to (103) or a partial peptide thereof,
(107) The polynucleotide according to (106), which is DNA,
(108) The polynucleotide according to (107) above, which comprises the base sequence represented by SEQ ID NO: 89,
(109) a recombinant vector containing the polynucleotide according to (108) above,
(110) A transformant transformed with the recombinant vector according to (109) above,
(111) The transformant according to (110) above is cultured to produce the protein according to (103) or a partial peptide thereof, wherein the protein, partial peptide or salt thereof according to (103) Manufacturing method,
(112) A pharmaceutical comprising the protein according to (103) or the partial peptide according to (105) or a salt thereof,
(113) A medicament comprising the polynucleotide according to (106) above,
(114) The medicament according to the above (113), which is a preventive / therapeutic agent for anorexia nervosa or an appetite enhancer,
(115) a diagnostic agent comprising the polynucleotide according to (106) above,
(116) The diagnostic agent according to the above (115), which is a diagnostic agent for anorexia, obesity or hyperphagia
(117) An antibody against the protein according to (103) or the partial peptide according to (105) or a salt thereof,
(118) The antibody according to (117), which is a neutralizing antibody that inactivates signal transduction of the protein according to (103),
(119) A medicament comprising the antibody according to (117) above,
(120) The medicament according to the above (119), which is a prophylactic / therapeutic agent for obesity or hyperphagia
(121) a diagnostic agent comprising the antibody according to (117) above,
(122) The diagnostic agent according to (121) above, which is a diagnostic agent for anorexia nervosa, obesity or hyperphagia
(123) a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the polynucleotide of (106) or a part thereof,
(124) A pharmaceutical comprising the polynucleotide according to (123) above,
(125) The medicament according to the above (124), which is a prophylactic / therapeutic agent for obesity or hyperphagia
(126) The peptide according to any one of the above (1) to (21), a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof, the same as or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 86 The peptide according to any one of the above (1) to (21), a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof and SEQ ID NO: 86, wherein a protein containing an amino acid sequence or a salt thereof is used. A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by
(127) The same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 88 as the peptide according to any one of (1) to (21), a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof The peptide according to any one of the above (1) to (21), a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof and SEQ ID NO: 88, wherein a protein containing an amino acid sequence or a salt thereof is used. A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by
(128) The peptide according to any one of (1) to (21) above, the partial peptide, the amide, the ester thereof, or the salt thereof, the same as or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 86 A peptide according to any one of the above (1) to (21), a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof, and a sequence number thereof, which comprises a protein containing an amino acid sequence or a salt thereof. : A kit for screening a compound or a salt thereof that alters the binding property to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 86 or a salt thereof,
(129) The peptide according to any one of (1) to (21), a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof, the same as or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 88 A peptide according to any one of the above (1) to (21), a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof, and a sequence number thereof, which comprises a protein containing an amino acid sequence or a salt thereof. A kit for screening a compound or a salt thereof that alters the binding property to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by 88 or a salt thereof,
(130) The peptide according to any one of the above (1) to (21), its partial peptide, its amide, which can be obtained using the screening method according to (126) or the screening kit according to (128) Or a compound or salt thereof that changes the binding property to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 86 as the ester or salt thereof, or a salt thereof,
(131) The peptide according to any one of (1) to (21), its partial peptide, its amide, which can be obtained using the screening method according to (127) above or the screening kit according to (129) above Or a compound or a salt thereof that changes the binding property to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 88 or a salt thereof, or a salt thereof,
(132) The compound or a salt thereof according to (130) or (131), which is an agonist,
(133) The compound or a salt thereof according to (130) or (131), which is an antagonist,
(134) A medicament comprising the compound according to (130) or (131) or a salt thereof,
(135) A preventive or therapeutic agent for anorexia or an appetite enhancer comprising the agonist according to (132) above,
(136) A prophylactic / therapeutic agent for obesity or hyperphagia, comprising the antagonist according to (133) above,
(137) A DNA encoding a protein characterized by comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 86, which is represented by SEQ ID NO: 86 A method for screening a compound or a salt thereof that changes the expression level of a protein, characterized by containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence
(138) A DNA encoding a protein characterized by containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 86; A kit for screening a compound or a salt thereof that changes the expression level of a protein, characterized by containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented,
(139) Contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 86, which can be obtained using the screening method described in (137) or the screening kit described in (138). A compound that changes the expression level of a protein or a salt thereof,
(140) The compound or salt thereof according to (139), which is a compound or a salt thereof that increases the expression level,
(141) The compound or a salt thereof according to (139), which is a compound or a salt thereof that decreases the expression level,
(142) A medicament comprising the compound of the above (139) or a salt thereof,
(143) A prophylactic / therapeutic agent for anorexia or an appetite enhancer comprising the compound according to (140) or a salt thereof,
(144) A prophylactic / therapeutic agent for obesity or hyperphagia comprising the compound of the above (141) or a salt thereof,
(145) A DNA encoding a protein characterized by containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 88, which is represented by SEQ ID NO: 88 A method for screening a compound or a salt thereof that changes the expression level of a protein, characterized by containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence
(146) A DNA encoding a protein characterized by comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 88, wherein SEQ ID NO: 88 A kit for screening a compound or a salt thereof that changes the expression level of a protein, characterized by containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented,
(147) containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 88, which can be obtained using the screening method described in (145) or the screening kit described in (146) A compound that changes the expression level of a protein or a salt thereof,
(148) The compound or salt thereof according to (147), which is a compound or a salt thereof that increases the expression level,
(149) The compound or salt thereof according to (147), which is a compound or a salt thereof that decreases the expression level,
(150) A medicament comprising the compound of the above (147) or a salt thereof,
(151) A prophylactic / therapeutic agent for anorexia or an appetite enhancer comprising the compound according to (148) or a salt thereof,
(152) A prophylactic / therapeutic agent for obesity or hyperphagia comprising the compound of the above (149) or a salt thereof,
(153) The mammal, the protein according to (80), a partial peptide or a salt thereof, the polynucleotide according to (83), the protein according to (103), a partial peptide or a salt thereof, 106) an anorexia characterized by administering an effective amount of the polynucleotide of (106), the agonist of (132), the compound of (140) or a salt thereof, or the compound of (148) or a salt thereof. Prevention and treatment methods,
(154) The mammal, the protein according to (80), a partial peptide or salt thereof, the polynucleotide according to (83), the protein according to (103), the partial peptide or salt thereof, 106) an appetite increase characterized by administering an effective amount of the polynucleotide described in (106), the agonist described in (132), the compound described in (140) or a salt thereof, or the compound described in (148) or a salt thereof. Method,
(155) For mammals, the antibody described in (94) above, the polynucleotide described in (100) above, the antibody described in (117) above, the polynucleotide described in (123) above, and the antagonist described in (133) above A method for preventing or treating obesity or hyperphagia, which comprises administering an effective amount of the compound or salt thereof described in (141) or the compound or salt thereof described in (149),
(156) a non-human mammal having an exogenous DNA according to (28) or a mutant DNA thereof,
(157) the animal according to (156) above, wherein the non-human mammal is a rodent;
(158) A recombinant vector containing the exogenous DNA according to (28) or a mutant DNA thereof and capable of being expressed in a mammal,
(159) a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA according to (28) is inactivated,
(160) The embryonic stem cell according to (159), wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene,
(161) The embryonic stem cell according to (159), wherein the non-human mammal is a rodent,
(162) the non-human mammal deficient in DNA expression, wherein the DNA according to (28) is inactivated,
(163) the non-human mammal according to (162), wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene, and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA according to (28),
(164) The non-human mammal according to (162) above, wherein the non-human mammal is a rodent,
(165) A test compound administered to the animal of (163) above and detecting the expression of a reporter gene, wherein the compound or salt thereof promotes or inhibits promoter activity against the DNA of (28) Screening method,
(166) a non-human mammal having an exogenous DNA according to (83) or a mutant DNA thereof,
(167) the animal according to (166) above, wherein the non-human mammal is a rodent;
(168) a recombinant vector containing the exogenous DNA according to (83) or a mutant DNA thereof and capable of being expressed in a mammal,
(169) a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA according to (83) is inactivated,
(170) The embryonic stem cell according to (169), wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene,
(171) The embryonic stem cell according to (169) above, wherein the non-human mammal is a rodent,
(172) The non-human mammal deficient in DNA expression, wherein the DNA according to (83) is inactivated,
(173) The non-human mammal according to (172), wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene, and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA according to (83).
(174) The non-human mammal according to the above (172), wherein the non-human mammal is a rodent,
(175) A test compound administered to the animal described in (173) above and detecting the expression of a reporter gene, wherein the compound or salt thereof promotes or inhibits promoter activity against the DNA described in (83) Screening method,
(176) a non-human mammal having an exogenous DNA according to (106) or a mutant DNA thereof,
(177) the animal according to (176) above, wherein the non-human mammal is a rodent;
(178) A recombinant vector containing the exogenous DNA according to (106) or a mutant DNA thereof and capable of being expressed in a mammal,
(179) A non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA according to (106) is inactivated,
(180) The embryonic stem cell according to (179), wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene,
(181) The embryonic stem cell according to (179), wherein the non-human mammal is a rodent,
(182) the non-human mammal deficient in DNA expression, wherein the DNA according to (106) is inactivated,
(183) the non-human mammal according to (182), wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene, and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA according to (106).
(184) The non-human mammal according to the above (182), wherein the non-human mammal is a rodent.
(185) A test compound administered to the animal described in (183) above and detecting the expression of a reporter gene, wherein the compound or salt thereof promotes or inhibits promoter activity against the DNA described in (106) Screening method,
(186) The peptide according to any one of the above (1) to (21), a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof, for producing a prophylactic / therapeutic agent for anorexia nervosa, (28) Use of the polynucleotide described in the above, the agonist described in (61) above, or the compound or salt thereof described in (72) above,
(187) The peptide according to any one of (1) to (21), the partial peptide, the amide, the ester or the salt thereof, or the polynucleotide according to (28) for producing an appetite enhancer. Use of the agonist according to (61) above, or the compound or salt thereof according to (72) above,
(188) The antibody according to (37) above, the polynucleotide according to (49) above, the antagonist according to (62) above, or the above (73) for producing a prophylactic / therapeutic agent for obesity or hyperphagia ) Use of the compound or salt thereof described
(189) The protein according to (80), a partial peptide or a salt thereof, the polynucleotide according to (83), the protein according to (103), or a portion thereof for producing a prophylactic / therapeutic agent for anorexia nervosa Use of a peptide or a salt thereof, a polynucleotide described in (106) above, an agonist described in (132) above, a compound or salt thereof described in (140) above, or a compound or salt thereof described in (148) above,
(190) The protein according to (80) above, the partial peptide or salt thereof, the polynucleotide according to (83) above, the protein according to (103) above, the partial peptide or salt thereof for producing an appetite enhancer. Use of the polynucleotide of (106) above, the agonist of (132), the compound of (140) or salt thereof, or the compound of (148) or salt thereof, and
(191) The antibody according to (94), the polynucleotide according to (100), the antibody according to (117), the above (123), for producing an agent for preventing or treating obesity or hyperphagia Use of the polynucleotide described above, the antagonist described in (133) above, the compound described in (141) above or a salt thereof, or the compound described in (149) above or a salt thereof.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
A peptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 16 (hereinafter referred to as the present invention) May be abbreviated as a peptide of human or warm-blooded animals (eg, guinea pigs, rats, mice, chickens, rabbits, pigs, sheep, cows, monkeys, etc.) (eg, retinal cells, hepatocytes, spleen) Cells, nerve cells, glial cells, pancreatic β cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, Bone cells, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or precursor cells of these cells, stem cells, cancer cells, etc.) or any tissue in which these cells exist, such as the brain, each part of the brain (eg, retina, olfactory bulb) , Amygdala, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum), spinal cord, pituitary gland, stomach, pancreas, kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, Lung, gastrointestinal tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessel, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, prostate, testis, ovary, placenta, uterus, bone, joint, skeletal muscle, etc., or blood cell lineage cells Or its cultured cells (for example, MEL, M1, CTLL-2, HT-2, WEHI-3, HL-60, JOSK-1, K562, ML-1, MOLT-3, MOLT-4, MOLT-10, CCRF -CEM, TA LL-1, Jurkat, CCRT-HSB-2, KE-37, SKW-3, HUT-78, HUT-102, H9, U937, THP-1, HEL, JK-1, CMK, KO-812, MEG- 01 or the like, or a synthetic peptide.
[0007]
The amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 16 is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Examples include amino acid sequences having homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably about 95% or more.
Examples of the peptide having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, A peptide having substantially the same activity as that of the peptide having the amino acid sequence represented by 1 is preferable.
Examples of the peptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 include an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, : Peptides having substantially the same quality of activity as the peptides having the amino acid sequence represented by 4 are preferred.
Examples of the peptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 include an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, : Peptides having substantially the same quality of activity as the peptides having the amino acid sequence represented by 7 are preferred.
Examples of the peptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 include, for example, an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, : Peptides having substantially the same quality of activity as the peptides having the amino acid sequence represented by 13 are preferred. Examples of the peptide having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 include an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, : Peptides having substantially the same quality of activity as the peptides having the amino acid sequence represented by 16 are preferred. The substantially equivalent activity includes, for example, the activity of the peptide of the present invention (for example, prevention / treatment activity of diseases described later, binding activity with GPR7, cell stimulation activity against GPR7 expressing cells (for example, arachidonic acid release, Acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, activity to promote GTPγS binding activity, etc.)) Etc.
Substantially homogeneous indicates that their activities are qualitatively (eg, physiochemically or pharmacologically) homogeneous.
[0008]
Specific examples of the amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include
(I) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(Ii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
(Iii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3,
(Iv) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 66,
(V) 1 to 5 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 66 Preferably, an amino acid sequence in which one amino acid is deleted,
(Vi) 1 to 5 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, more preferably 1) to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 66 Is an amino acid sequence to which one amino acid is added,
(vii) 1 to 5 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, more preferably 1 to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 66 Is an amino acid sequence in which one amino acid is inserted,
(viii) 1 to 5 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 66 Preferably, one amino acid sequence substituted with another amino acid,
(Ix) Amino acid sequences obtained by combining the above (v) to (viii).
[0009]
Specific examples of the amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 include
(I) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4,
(Ii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5,
(Iii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6,
(Iv) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 67,
(V) 1 to 5 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 67 Preferably, an amino acid sequence in which one amino acid is deleted,
(Vi) 1 to 5 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, more preferably 1 to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 67) Is an amino acid sequence to which one amino acid is added,
(vii) 1 to 5 amino acids represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 67 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, more preferably Is an amino acid sequence in which one amino acid is inserted,
(viii) 1 to 5 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 67 Preferably, one amino acid sequence substituted with another amino acid,
(Ix) Amino acid sequences obtained by combining the above (v) to (viii).
[0010]
Specific examples of the amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 include
(I) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7,
(Ii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8,
(Iii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9;
(Iv) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10;
(V) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11,
(Vi) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12,
(Vii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 68,
(Viii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 69,
(Ix) SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 68 or 1 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 69 An amino acid sequence in which ˜5 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, more preferably 1) amino acids are deleted;
(X) 1 to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 68 or SEQ ID NO: 69 An amino acid sequence to which 5 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, more preferably 1) amino acids are added,
(xi) SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 68 or 1 to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 69 An amino acid sequence in which 5 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, more preferably 1) amino acids are inserted,
(xii) SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 68 or 1 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 69 An amino acid sequence in which -5 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, more preferably 1) amino acids are substituted with other amino acids,
(Xiii) Amino acid sequences obtained by combining the above (ix) to (xii).
[0011]
Specific examples of the amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 include
(I) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13;
(Ii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14;
(Iii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15;
(Iv) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 70,
(V) 1 to 5 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 70 Preferably, an amino acid sequence in which one amino acid is deleted,
(Vi) 1 to 5 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, more preferably 1 to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 70) Is an amino acid sequence to which one amino acid is added,
(vii) 1 to 5 amino acids represented by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 70 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, more preferably Is an amino acid sequence in which one amino acid is inserted,
(viii) 1 to 5 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 70 Preferably, one amino acid sequence substituted with another amino acid,
(Ix) Amino acid sequences obtained by combining the above (v) to (viii).
[0012]
Specific examples of the amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 include
(I) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16;
(Ii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17,
(Iii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18,
(Iv) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 71,
(V) 1 to 5 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 71 Preferably, an amino acid sequence in which one amino acid is deleted,
(Vi) 1 to 5 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, more preferably 1) to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 71 Is an amino acid sequence to which one amino acid is added,
(vii) 1 to 5 amino acids represented by SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 71 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, more preferably Is an amino acid sequence in which one amino acid is inserted,
(viii) 1 to 5 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 71 Preferably, one amino acid sequence substituted with another amino acid,
(Ix) Amino acid sequences obtained by combining the above (v) to (viii).
[0013]
Specific examples of the peptide of the present invention include, for example,
[Peptide A]
A human-type peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
A mouse-type peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
A rat-type peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3,
A bovine peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 66;
[Peptide B]
A human-type peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4,
A mouse-type peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5,
A rat-type peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6,
A bovine peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 67;
[Peptide C]
A human peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, or an amide thereof,
A mouse peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, or an amide thereof,
A rat-type peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, or an amide thereof,
A bovine peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 68 or an amide thereof,
[Peptide D]
A human-type peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8,
A mouse peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10;
A rat peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12,
A bovine peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 69;
[Peptide E]
A human peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13;
A mouse-type peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14;
A rat-type peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15;
A bovine peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 70,
[Peptide F]
A human peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16;
A mouse-type peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17;
A rat-type peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18,
Examples thereof include a bovine peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 71.
[0014]
The partial peptide of the present invention may be any peptide as long as it is a partial peptide of the above-described peptide of the present invention, but is usually preferably a peptide consisting of 5 or more amino acids, preferably 10 or more. Preferably have the same activity as the peptide of the present invention.
[0015]
The precursor peptide of the peptide of the present invention is a polypeptide containing the peptide of the present invention described above, and the peptide of the present invention can be produced by cleaving with an appropriate peptidase or the like.
Specifically, a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 22 is used. A protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 22 is used for humans and warm-blooded animals (for example, guinea pigs, rats, mice, chickens, rabbits, pigs, sheep). , Bovine, monkey, etc.) cells (eg, retinal cells, hepatocytes, spleen cells, neurons, glial cells, pancreatic β cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts Cells, fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, Synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or precursor cells, stem cells or cancer cells of these cells) Or any tissue in which these cells exist, such as the brain, brain regions (eg, retina, olfactory bulb, amygdala, basal basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum), spinal cord, Pituitary, stomach, pancreas, kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, gastrointestinal tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessel, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral Blood, prostate, testicle, ovary, placenta, uterus, bone, joint, skeletal muscle, etc., or blood cell line or cultured cells thereof (for example, MEL, M1, CTLL-2, HT-2, WEHI-3, HL- 60, JOSK-1, K562, ML-1, MOLT-3, MOLT-4, MOLT-10, CCRF-CEM, TALL-1, Jurkat, CCRT-HSB-2, KE-37, SKW-3, HUT- 78, HUT-102 , H9, U937, THP-1, HEL, JK-1, CMK, KO-812, MEG-01, etc.) or a synthetic protein.
[0016]
The amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 22 is about 70% or more, preferably about 80%, of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 22. More preferred examples include amino acid sequences having about 90% or more homology.
In particular, as an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19,
(i) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 (human type),
(ii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 (mouse type),
(iii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 (rat type),
(iv) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 72 (bovine type),
(v) 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 72 Preferably, an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are deleted,
(vi) 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1) to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 72 Is an amino acid sequence to which 1 to 3 amino acids are added,
(vii) 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1) to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 72 Is an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are inserted,
(viii) 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 72 Preferably, an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are substituted with other amino acids,
(ix) Amino acid sequences obtained by combining the above (v) to (viii).
[0017]
As an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22,
(i) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 (human type),
(ii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 (mouse type),
(iii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24 (rat type),
(iv) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73 (bovine type),
(v) 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 73 Preferably, an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are deleted,
(vi) 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1) to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 73 Is an amino acid sequence to which 1 to 3 amino acids are added,
(vii) 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 Amino acid sequence in which amino acids are inserted,
(viii) 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 73 Preferably, an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are substituted with other amino acids,
(ix) Amino acid sequences obtained by combining the above (v) to (viii).
[0018]
The human precursor peptide G having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 is obtained by removing the secretory signal sequence from the human precursor peptide H having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22.
The mouse precursor peptide G having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 is obtained by removing the secretory signal sequence from the masto precursor peptide H having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23.
Rat type precursor peptide G having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 is obtained by removing the secretory signal sequence from rat type precursor peptide H having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24.
The rat type precursor peptide G having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 72 is obtained by removing the secretory signal sequence from the rat type precursor peptide H having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73.
The precursor peptide of the present invention may have the same activity as the peptide of the present invention.
[0019]
A protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 (human GPR7), a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 59 ( Rat TGR26), a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 84 (human GPR8), and the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 86 Protein (bovine GPR7) or a protein having the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 88 (bovine GPR8) as humans or warm-blooded animals (eg, guinea pigs, rats, mice, Chicken, rabbit, pig, sheep, cow, monkey, etc.) For example, retinal cells, hepatocytes, spleen cells, neurons, glial cells, pancreatic β cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat Cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells , Osteoblasts, osteoclasts, breast cells, hepatocytes or stromal cells, or precursor cells of these cells, stem cells, cancer cells, etc.) or any tissue in which these cells are present, for example, the brain, each part of the brain (Eg, retina, olfactory bulb, amygdala, basal cerebral sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum), spinal cord, pituitary gland, stomach, pancreas, kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, Adrenal gland, skin Skin, muscle, lung, gastrointestinal tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessel, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, prostate, testis, ovary, placenta, uterus, bone, joint, skeletal muscle, etc., or Hemocyte cells or cultured cells thereof (for example, MEL, M1, CTLL-2, HT-2, WEHI-3, HL-60, JOSK-1, K562, ML-1, MOLT-3, MOLT-4, MOLT) -10, CCRF-CEM, TALL-1, Jurkat, CCRT-HSB-2, KE-37, SKW-3, HUT-78, HUT-102, H9, U937, THP-1, HEL, JK-1, CMK , KO-812, MEG-01, etc.) or a synthetic protein.
[0020]
The amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49. Examples include homologous amino acid sequences.
In particular, as the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49, in addition to the above amino acid sequence,
(i) An amino acid from which 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 have been deleted Array,
(ii) an amino acid sequence obtained by adding 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49;
(iii) An amino acid sequence in which 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids are inserted into the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 ,
(iv) 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 are other amino acids. A substituted amino acid sequence,
(v) Amino acid sequences obtained by combining the above (i) to (iv).
The amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 59 is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 59. Examples include homologous amino acid sequences.
In particular, as the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 59, in addition to the above amino acid sequence,
(i) An amino acid from which 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 59 have been deleted Array,
(ii) an amino acid sequence obtained by adding 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 59;
(iii) An amino acid sequence in which 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids are inserted into the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 59 ,
(iv) 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 59 are other amino acids. A substituted amino acid sequence,
(v) Amino acid sequences obtained by combining the above (i) to (iv).
The amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 84 is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 84. Examples include homologous amino acid sequences.
In particular, as the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 84, in addition to the above amino acid sequence,
(i) An amino acid from which 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 84 have been deleted Array,
(ii) an amino acid sequence obtained by adding 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 84;
(iii) An amino acid sequence in which 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids are inserted into the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 84 ,
(iv) 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 84 are other amino acids. A substituted amino acid sequence,
(v) Amino acid sequences obtained by combining the above (i) to (iv).
The amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 86 is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 86. More preferred is an amino acid sequence having a homology of about 95% or more.
In particular, as an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 86, in addition to the above amino acid sequence,
(i) An amino acid from which 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 86 have been deleted Array,
(ii) an amino acid sequence obtained by adding 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 86;
(iii) An amino acid sequence in which 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids are inserted into the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 86 ,
(iv) 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 86 are other amino acids. A substituted amino acid sequence,
(v) Amino acid sequences obtained by combining the above (i) to (iv).
The amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 88 is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 88. More preferred is an amino acid sequence having a homology of about 95% or more.
In particular, as the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 88, in addition to the above amino acid sequence,
(i) An amino acid from which 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids have been deleted from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 88 Array,
(ii) an amino acid sequence in which 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids are added to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 88;
(iii) An amino acid sequence in which 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids are inserted into the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 88 ,
(iv) 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 88 are other amino acids. A substituted amino acid sequence,
(v) Amino acid sequences obtained by combining the above (i) to (iv).
The partial peptide of human GPR7, rat TGR26, human GPR8, bovine GPR7, or bovine GPR8 (hereinafter abbreviated as GPR7 together) can be any peptide as long as it can be used in a screening method for pharmaceuticals described below. However, it is preferable to use a partial peptide having binding ability to the peptide of the present invention, a partial peptide containing an amino acid sequence corresponding to the extracellular region, and the like.
[0021]
The peptide of the present invention, its partial peptide or its precursor peptide, particularly the peptide of the present invention, includes those in which the N-terminal amino acid residue is brominated. The N-terminal amino acid residue is preferably tryptophan residue (Trp).
Specifically, SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 66 to SEQ ID NO: 69 and sequences in which the N-terminal tryptophan residue (Trp) is brominated A peptide containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 72 selected from No. 72 is used, among which SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: N-terminal tryptophan residue (Trp) is brominated : 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 66, or a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 67 is preferably used. The position of bromination is not particularly limited, but the 6th position of tryptophan residue (Trp) is preferable.
More specifically, the N-terminal tryptophan residue (Trp) is 6-brominated, SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 66 to sequence A peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 69 selected from SEQ ID NO: 69 and SEQ ID NO: 72 is preferably used, in particular, the N-terminal tryptophan residue (Trp) is 6-brominated. A peptide containing the amino acid sequence represented by 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 66 or SEQ ID NO: 67 is preferably used.
The peptide of the present invention, its partial peptide or its precursor peptide (hereinafter sometimes abbreviated as the peptide of the present invention), GPR7 or its partial peptide (hereinafter sometimes abbreviated as GPR7), The left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (carboxyl terminus).
In the peptide of the present invention or GPR7, the C-terminus is carboxyl group (—COOH), carboxylate (—COO − ), Amide (-CONH 2 ) Or ester (—COOR).
Here, R in the ester is, for example, C such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl. 1-6 Alkyl groups such as C, such as cyclopentyl, cyclohexyl, etc. 3-8 A cycloalkyl group such as phenyl, α-naphthyl and the like 6-12 Aryl groups such as phenyl-C such as benzyl, phenethyl and the like 1-2 Alkyl groups or α-naphthyl-C such as α-naphthylmethyl 1-2 C such as alkyl group 7-14 In addition to the aralkyl group, a pivaloyloxymethyl group that is widely used as an oral ester is used.
When the peptide of the present invention or GPR7 has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the peptide of the present invention. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
Furthermore, in the peptide of the present invention or GPR7, the amino group of the N-terminal amino acid residue (eg, methionine residue) is a protecting group (for example, a C-form such as formyl group, acetyl group, etc.). 1-6 C such as alkanoyl 1-6 A group protected by an acyl group, an N-terminal glutamine residue produced by cleavage in vivo, pyroglutamine oxidized, a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule (eg, —OH, —SH) , Amino group, imidazole group, indole group, guanidino group, etc.) are suitable protecting groups (for example, C such as formyl group, acetyl group, etc.) 1-6 C such as alkanoyl group 1-6 Examples thereof include those protected with an acyl group or the like, or complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound.
[0022]
As the peptide of the present invention or a salt of GPR7, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid, organic acid) or base (eg, alkali metal salt) is used, and particularly physiologically acceptable. The acid addition salts are preferred. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like. Hereinafter, including salts, it is referred to as the peptide of the present invention or GPR7.
The peptide of the present invention or GPR7 can be produced from the above-mentioned human or warm-blooded animal cells or tissues by a known purification method of the peptide, or a transformant transformed with a DNA encoding the peptide described later. Can also be produced by culturing. Moreover, it can also manufacture according to the below-mentioned peptide synthesis method.
When producing from human or mammalian tissue or cells, the human or mammalian tissue or cells are homogenized and then extracted with acid, etc., and the extract is subjected to chromatography such as reverse phase chromatography or ion exchange chromatography. Can be purified and isolated.
[0023]
For the synthesis of the peptide of the present invention or GPR7 or their amides, commercially available resins for peptide synthesis can be used. Examples of such resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethyl. Phenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin, etc. it can. Using such a resin, an amino acid having an α-amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target peptide according to various condensation methods known per se. At the end of the reaction, the peptide is excised from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed, and further, intramolecular disulfide bond forming reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target peptide of the present invention, GPR7 or their amides. .
For the above-mentioned condensation of protected amino acids, various activating reagents that can be used for peptide synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable. As the carbodiimide, DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide and the like are used. For activation by these, a protected amino acid is added directly to the resin together with a racemization inhibitor (for example, HOBt, HOBt), or the protected amino acid is activated in advance as a symmetric acid anhydride, HOBt ester or HOBt ester. It can later be added to the resin.
The solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the peptide condensation reaction. For example, acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol, dimethyl sulfoxide, etc. Examples include sulfoxides, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, and appropriate mixtures thereof. The reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for peptide bond formation reaction, and is usually appropriately selected from the range of about -20 ° C to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in an excess of 1.5 to 4 times. As a result of a test using the ninhydrin reaction, if the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When sufficient condensation is not obtained even if the reaction is repeated, acetylation of the unreacted amino acid with acetic anhydride or acetylimidazole can prevent the subsequent reaction from being affected.
[0024]
Examples of the protective group for the amino group of the raw material include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, and trifluoroacetyl. , Phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like.
The carboxyl group is, for example, alkyl esterified (eg, linear, branched or cyclic alkyl ester such as methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc. ), Aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarbonylhydrazide, t-butoxy It can be protected by carbonyl hydrazation, trityl hydrazation or the like.
The hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification. Examples of the group suitable for esterification include, for example, lower (C 1-6) Aroyl groups such as alkanoyl group and benzoyl group, groups derived from carbonic acid such as benzyloxycarbonyl group and ethoxycarbonyl group are used. Examples of the group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
Examples of the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bzl, Cl 2 -Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, t-butyl and the like are used.
As the imidazole protecting group for histidine, for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
[0025]
Examples of the activated carboxyl group of the raw material include a corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol, And esters thereof with cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, HOBt) and the like. As the activated amino group of the raw material, for example, a corresponding phosphoric acid amide is used.
Examples of the method for removing (eliminating) the protecting group include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, trifluoro. Acid treatment with romethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, and the like are also used. The elimination reaction by the acid treatment is generally performed at a temperature of about −20 ° C. to 40 ° C. In the acid treatment, for example, anisole, phenol, thioanisole, metacresol, paracresol, dimethyl sulfide, 1,4 Addition of a cation scavenger such as -butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, etc. is effective. The 2,4-dinitrophenyl group used as the imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as the indole protecting group of tryptophan is the above 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane. In addition to deprotection by acid treatment in the presence of dithiol or the like, it can also be removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia or the like.
The protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw material, the protection group, the removal of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, etc. can be appropriately selected from known groups or known means.
[0026]
As another method for obtaining the peptide of the present invention or the amide form of GPR7, for example, first, the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid is amidated and protected, and then the peptide chain is extended to the desired chain length on the amino group side. After that, the peptide except for the protecting group of the α-amino group at the N-terminal of the peptide chain and the peptide from which only the protecting group of the carboxyl group at the C-terminal was removed were prepared, and both peptides were mixed as described above. Condensation in a solvent. The details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected peptide obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above method to obtain the desired crude peptide. This crude peptide can be purified using various known purification means, and the desired fraction of the present invention or GPR7 amide can be obtained by lyophilizing the main fraction.
In order to obtain the peptide of the present invention or the ester of GPR7, for example, the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid is condensed with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then the same as the peptide of the present invention or the amide of GPR7. Thus, a desired peptide of the present invention or an ester of GPR7 can be obtained.
[0027]
The peptide of the present invention or a partial peptide of GPR7 can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or a partial peptide of GPR7 can be produced by cleaving GPR7 with an appropriate peptidase. As a peptide synthesis method, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, the peptide of the present invention, a partial peptide that can constitute a partial peptide of GPR7, or an amino acid and the remaining part are condensed, and when the product has a protecting group, the target peptide is produced by removing the protecting group. be able to. Examples of known condensation methods and protecting group removal include the methods described in (1) to (5) below.
(1) M. Bodanszky and MA Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
(2) Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)
(3) Nobuo Izumiya et al., Basics and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975)
(4) Haruaki Yajima and Shunpei Sugawara, Biochemistry Experiment Course 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977)
▲ 5 ▼ Supervision by Yajima Haruaki, Development of follow-up medicines, Volume 14, Peptide synthesis, Hirokawa Shoten
In addition, after the reaction, the peptide of the present invention, GPR7 or a partial peptide thereof can be purified and isolated by combining ordinary purification methods such as solvent extraction / distillation / column chromatography / liquid chromatography / recrystallization. When the peptide of the present invention obtained by the above method, the partial peptide of GPR7 is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, It can be converted into a free form or other salt by a known method or a method analogous thereto.
[0028]
The polynucleotide encoding the peptide of the present invention or GPR7 may be any as long as it contains the above-described peptide of the present invention or the base sequence (DNA or RNA, preferably DNA) encoding GPR7. . The polynucleotide is RNA such as DNA or mRNA encoding the peptide of the present invention or GPR7, and may be double-stranded or single-stranded. In the case of a double strand, it may be a double-stranded DNA, a double-stranded RNA, or a DNA: RNA hybrid. In the case of a single strand, it may be a sense strand (ie, a coding strand) or an antisense strand (ie, a non-coding strand).
Using the peptide of the present invention or a polynucleotide encoding GPR7, for example, the peptide of the present invention or the method according to the method described in “New PCR and its application” 15 (7), 1997 or a method similar thereto can be used. GPR7 mRNA can be quantified.
[0029]
The DNA encoding the peptide of the present invention or GPR7 may be any DNA as long as it contains the aforementioned base sequence encoding the peptide of the present invention or GPR7. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells / tissues described above, cDNA library derived from the cells / tissues described above, and synthetic DNA may be used.
The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Moreover, it can also be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells / tissues described above.
[0030]
Examples of the DNA encoding the peptide of the present invention include a nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NO: 25 to SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 74 to SEQ ID NO: 79 under highly stringent conditions. Any DNA may be used as long as it has a base sequence to hybridize and encodes a peptide having substantially the same activity as the peptide of the present invention.
Examples of DNA capable of hybridizing under high stringency conditions with the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NO: 25 to SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 74 to SEQ ID NO: 79 are, for example, SEQ ID NO: : About 25% to SEQ ID NO: 42 and about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and the nucleotide sequence represented by any of SEQ ID NO: 74 to SEQ ID NO: 79 Preferably, DNA containing a base sequence having a homology of about 95% or more is used.
Hybridization can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). . Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual. More preferably, it can be carried out according to highly stringent conditions.
The highly stringent conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C., preferably about 60 to 65 ° C. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable.
[0031]
More specifically,
(i) As the DNA encoding the human type peptide A containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 25 is used,
(ii) As the DNA encoding mouse peptide A containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 26, etc. is used.
(iii) As the DNA encoding rat peptide A containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 27 is used,
(iv) As the DNA encoding the human type peptide B containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 28 is used,
(v) As a DNA encoding mouse peptide B containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 29 is used.
(vi) As a DNA encoding rat peptide B containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 30 is used,
(vii) As the DNA encoding the human peptide C containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 31 is used.
(viii) As the DNA encoding the human type peptide D containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 32 is used,
(ix) As the DNA encoding the mouse peptide C containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 33 is used.
(x) As a DNA encoding the mouse peptide D containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 34, etc. is used.
(xi) As a DNA encoding the rat peptide C containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 35, etc. is used.
(xii) As a DNA encoding the rat peptide D containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 36 is used,
(xiii) As the DNA encoding the human type peptide E containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 37 is used.
(xiv) As the DNA encoding mouse peptide E containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 38, etc. is used.
(xv) As a DNA encoding rat peptide E containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 39 is used,
(xvi) As a DNA encoding the human peptide F containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 40, etc. is used.
(xvii) As the DNA encoding mouse peptide F containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 41, etc. is used.
(xviii) As the DNA encoding rat peptide F containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 42, etc. is used.
(xix) As the DNA encoding bovine peptide A containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 66, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 74 is used,
(xx) As the DNA encoding bovine peptide B containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 67, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 75 is used.
(xxi) As the DNA encoding bovine peptide C containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 68, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 76 is used,
(xxii) As DNA encoding bovine peptide D containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 69, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 77 is used,
(xxiii) As the DNA encoding bovine peptide E containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 70, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 78 is used,
(xxvi) As the DNA encoding the bovine peptide F containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 71, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 79 is used.
[0032]
The DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA as long as it contains the base sequence encoding the partial peptide of the present invention described above. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells / tissues described above, cDNA library derived from the cells / tissues described above, and synthetic DNA may be used.
Examples of the DNA encoding the partial peptide of the present invention include a partial base of DNA having the base sequence represented by any one of SEQ ID NO: 25 to SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 74 to SEQ ID NO: 79. A DNA having a sequence, or a base sequence that hybridizes with a base sequence represented by any one of SEQ ID NO: 25 to SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 74 to SEQ ID NO: 79 under highly stringent conditions And a DNA having a partial base sequence of a DNA encoding a peptide having substantially the same activity as the peptide of the present invention.
A DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NO: 25 to SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 74 to SEQ ID NO: 79 has the same significance as described above.
The hybridization method and highly stringent conditions are the same as described above.
The DNA encoding the precursor peptide of the present invention has, for example, a base sequence that hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 46 under highly stringent conditions. The precursor of the present invention Any DNA may be used as long as it encodes a peptide having substantially the same quality of activity as the above.
Examples of DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 43 or 46 under high stringency conditions are represented by SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 46, respectively. For example, DNA containing a base sequence having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and still more preferably about 95% or more with the base sequence is used.
The hybridization method and highly stringent conditions are the same as described above.
More specifically,
(i) As a DNA encoding the human GPR7 ligand precursor G containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 43 is used,
(ii) As a DNA encoding the mouse GPR7 ligand precursor G containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 44 is used,
(iii) As the DNA encoding the rat GPR7 ligand precursor G containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 45 is used.
(iv) As the DNA encoding the bovine GPR7 ligand precursor G containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 72, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 80 is used.
(v) As the DNA encoding the human GPR7 ligand precursor H containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 46 is used.
(vi) As a DNA encoding the mouse GPR7 ligand precursor H containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 47 is used.
(vii) As the DNA encoding the rat GPR7 ligand precursor H containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 48 is used,
(viii) As the DNA encoding the bovine GPR7 ligand precursor H containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 81 is used.
[0033]
The polynucleotide comprising a part of the base sequence of the DNA encoding the peptide of the present invention or a partial peptide thereof, or a part of the base sequence complementary to the DNA, is a DNA encoding the partial peptide of the present invention. As well as RNA.
According to the present invention, a nucleotide sequence of a DNA encoding a peptide of the present invention that has been cloned or determined from an antisense polynucleotide (nucleic acid) capable of inhibiting the replication or expression of the peptide gene of the present invention. Design and synthesize based on information. Such a polynucleotide (nucleic acid) can hybridize with the RNA of the peptide gene of the present invention, inhibit the synthesis or function of the RNA, or through interaction with the peptide-related RNA of the present invention. Thus, the expression of the peptide gene of the present invention can be regulated and controlled. The polynucleotide complementary to the selected sequence of the peptide-related RNA of the present invention and the polynucleotide capable of specifically hybridizing with the peptide-related RNA of the present invention are the peptide gene of the present invention in vivo and in vitro. It is useful for regulating / controlling the expression of and for the treatment or diagnosis of diseases. The term “corresponding” means homologous to or complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes. “Corresponding” between a nucleotide, nucleotide sequence or nucleic acid and peptide (protein) usually refers to the amino acid of the peptide (protein) in the instruction derived from the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement. . 5 ′ end hairpin loop, 5 ′ end 6-base pair repeat, 5 ′ end untranslated region, peptide translation initiation codon, protein coding region, ORF translation initiation codon, 3 ′ end untranslated region of the peptide gene of the present invention, The 3 ′ terminal palindromic region and the 3 ′ terminal hairpin loop can be selected as preferred target regions, but any region within the peptide gene of the present invention can be selected as the target.
[0034]
The relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide complementary to at least a part of the target region can be said to be “antisense”. Antisense polynucleotides are polydeoxynucleotides containing 2-deoxy-D-ribose, polydeoxynucleotides containing D-ribose, and other types of polysides that are N-glycosides of purine or pyrimidine bases. Nucleotides or other polymers with non-nucleotide backbones (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special linkages, provided that the polymer is found in DNA or RNA And a nucleotide having a configuration allowing base attachment). They can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and also DNA: RNA hybrids, and unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides), and more publicly known Modified, such as those with labels known in the art, capped, methylated, one or more natural nucleotides replaced with analogs, intramolecular nucleotides Modified, such as those having uncharged bonds (eg, methylphosphonates, phosphotriesters, phosphoramidates, carbamates, etc.), charged bonds or sulfur-containing bonds (eg, phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.) ), For example, proteins (nucleases, nuclease inhibitors, and toxins) , Antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) and sugars (eg, monosaccharides), etc., side chain groups, intercurrent compounds (eg, acridine, psoralen, etc.), chelates Compounds containing compounds (for example, metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc.), those containing alkylating agents, those having modified bonds (eg, α-anomeric nucleic acids, etc.) It may be. Here, the “nucleoside”, “nucleotide” and “nucleic acid” may include not only purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, for example, one or more hydroxyl groups are replaced by halogens, aliphatic groups, etc., or functional groups such as ethers, amines, etc. It may have been converted.
[0035]
The antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is RNA, DNA, or modified nucleic acid (RNA, DNA). Specific examples of the modified nucleic acid include, but are not limited to, nucleic acid sulfur derivatives and thiophosphate derivatives, and those resistant to degradation of polynucleoside amides and oligonucleoside amides. The antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to increase the cell permeability of the antisense nucleic acid, to increase the affinity for the target sense strand, and to be antitoxic if toxic Make sense nucleic acids less toxic.
Thus, many modifications are known in the art, such as J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp. 247, 1992; Vol. 8, pp. 395, 1992; ST Crooke et al. Ed ., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993, etc.
The antisense nucleic acid of the present invention may be altered or contain modified sugars, bases and bonds, provided in special forms such as liposomes, microspheres, applied by gene therapy, It can be given in an added form. In this way, the additional form includes polycationic substances such as polylysine that acts to neutralize the charge of the phosphate group skeleton, lipids that enhance interaction with cell membranes and increase nucleic acid uptake ( For example, phospholipid, cholesterol, etc.) may be used. Preferred lipids to be added include cholesterol and derivatives thereof (for example, cholesteryl chloroformate, cholic acid, etc.). These can be attached to the 3 ′ end or 5 ′ end of the nucleic acid and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond. Examples of the other group include a cap group specifically arranged at the 3 ′ end or 5 ′ end of a nucleic acid, which prevents degradation by a nuclease such as exonuclease or RNase. Such capping groups include, but are not limited to, hydroxyl protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
The inhibitory activity of antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the peptide of the present invention. The nucleic acid can be applied to cells by various methods known per se.
[0036]
Examples of the DNA encoding human GPR7 include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 50, or a base sequence that hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 50 under highly stringent conditions. Any DNA may be used as long as it encodes a protein having substantially the same quality of activity as human GPR7 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49.
Examples of DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 50 under highly stringent conditions include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, respectively, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 50. Preferably, DNA containing a base sequence having a homology of about 90% or more, more preferably about 95% or more is used.
The DNA encoding rat TGR26 has, for example, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 60, or a base sequence that hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 60 under highly stringent conditions. Any DNA may be used as long as it encodes a protein having substantially the same quality of activity as rat TGR26 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 59.
Examples of the DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 60 under highly stringent conditions include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, respectively, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 60. Preferably, DNA containing a base sequence having a homology of about 90% or more, more preferably about 95% or more is used.
Examples of the DNA encoding human GPR8 include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 85, or a base sequence that hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 85 under highly stringent conditions. Any DNA may be used as long as it encodes a protein having substantially the same quality of activity as human GPR8 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 66.
Examples of DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 85 under highly stringent conditions include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, respectively, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 85. Preferably, DNA containing a base sequence having a homology of about 90% or more, more preferably about 95% or more is used.
The DNA encoding bovine GPR7 has, for example, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 87, or a base sequence that hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 87 under highly stringent conditions. Any DNA may be used as long as it encodes a protein having substantially the same quality of activity as bovine GPR7 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 86.
Examples of DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 87 under highly stringent conditions include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, respectively, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 87. Preferably, DNA containing a base sequence having a homology of about 90% or more, more preferably about 95% or more is used.
Examples of DNA encoding bovine GPR8 include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 89, or a base sequence that hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 89 under highly stringent conditions. Any DNA may be used as long as it encodes a protein having substantially the same activity as bovine GPR8 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 88.
The DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 89 under highly stringent conditions is, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, respectively, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 89. Preferably, DNA containing a base sequence having a homology of about 90% or more, more preferably about 95% or more is used.
Hybridization can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). . Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual. More preferably, it can be carried out according to highly stringent conditions.
The highly stringent conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C., preferably about 60 to 65 ° C. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable.
More specifically, as the DNA encoding human GPR7 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 50 is used. As DNA encoding rat TGR26 containing the amino acid sequence shown, DNA containing the base sequence shown by SEQ ID NO: 60 is used, and coding for human GPR8 containing the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 84 As the DNA to be used, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 85 is used, and the DNA encoding bovine GPR7 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 86 is represented by SEQ ID NO: 87. DNA containing the nucleotide sequence is used, and the amino acid represented by SEQ ID NO: 88 is used. The DNA encoding bovine GPR8 containing acid sequence, SEQ ID NO: DNA containing the base sequence represented by 89 is used.
[0037]
The DNA encoding the partial peptide of GPR7 may be any DNA as long as it contains the base sequence encoding the partial peptide of GPR7 described above. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells / tissues described above, cDNA library derived from the cells / tissues described above, and synthetic DNA may be used.
Examples of DNA encoding a partial peptide of human GPR7 include DNA having a partial base sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 50, or highly stringent conditions with the base sequence represented by SEQ ID NO: 50 A DNA having a partial base sequence of a DNA having a base sequence that hybridizes underneath and encoding a peptide having substantially the same quality of activity as human GPR7 is used. DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 50 has the same significance as described above.
Examples of DNA encoding the partial peptide of rat TGR26 include DNA having a partial base sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 60, or highly stringent conditions with the base sequence represented by SEQ ID NO: 60 A DNA having a base sequence that hybridizes underneath and having a partial base sequence of a DNA encoding a peptide having substantially the same quality of activity as rat TGR26 is used.
The DNA capable of hybridizing with the base sequence represented by SEQ ID NO: 60 has the same significance as described above.
The DNA encoding the partial peptide of human GPR8 may be any DNA as long as it contains the base sequence encoding the partial peptide of human GPR8. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells / tissues described above, cDNA library derived from the cells / tissues described above, and synthetic DNA may be used.
Examples of DNA encoding a partial peptide of human GPR8 include DNA having a partial base sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 85, or highly stringent conditions with the base sequence represented by SEQ ID NO: 85 A DNA having a base sequence that hybridizes underneath and having a partial base sequence of a DNA encoding a peptide having substantially the same quality of activity as human GPR8 is used. The DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 85 has the same significance as described above.
The DNA encoding the partial peptide of bovine GPR7 may be any DNA as long as it contains the base sequence encoding the partial peptide of bovine GPR7. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells / tissues described above, cDNA library derived from the cells / tissues described above, and synthetic DNA may be used.
Examples of the DNA encoding the partial peptide of bovine GPR7 include DNA having a partial base sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 87, or highly stringent conditions with the base sequence represented by SEQ ID NO: 87 A DNA having a base sequence that hybridizes underneath and having a partial base sequence of a DNA encoding a peptide having substantially the same quality of activity as bovine GPR7 is used. DNA that can hybridize to the base sequence represented by SEQ ID NO: 87 has the same significance as described above.
The DNA encoding the partial peptide of bovine GPR8 may be any DNA as long as it contains the base sequence encoding the partial peptide of bovine GPR8. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells / tissues described above, cDNA library derived from the cells / tissues described above, and synthetic DNA may be used.
Examples of DNA encoding a partial peptide of bovine GPR8 include DNA having a partial base sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 89, or highly stringent conditions with the base sequence represented by SEQ ID NO: 89 A DNA having a base sequence that hybridizes underneath and having a partial base sequence of a DNA that encodes a peptide having substantially the same quality of activity as bovine GPR8 is used. The DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 89 has the same significance as described above.
The hybridization method and highly stringent conditions are the same as described above.
[0038]
The peptide of the present invention or DNA encoding GPR7 may be labeled by a method known per se, specifically, isotope-labeled or fluorescently labeled (for example, fluorescent labeling with fluorescein, etc.) And biotinylated or enzyme-labeled ones.
As a means for cloning the DNA of the present invention or the DNA completely encoding GPR7, it is amplified by a PCR method known per se using a synthetic DNA primer having a partial base sequence of the peptide of the present invention or GPR7, or an appropriate method. The DNA incorporated into the vector can be selected by hybridization with the peptide of the present invention or a DNA fragment encoding a part or the entire region of GPR7 or labeled with a synthetic DNA. The hybridization method can be performed according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989), for example. Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual.
[0039]
DNA base sequence conversion can be performed by a known kit such as Mutan. TM -super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.) or the like can be performed according to a method known per se such as ODA-LA PCR method, Gapped duplex method, Kunkel method or the like, or a method analogous thereto.
The DNA encoding the cloned peptide can be used as it is depending on the purpose, or digested with a restriction enzyme or added with a linker, if desired. The DNA may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ end side, and may have TAA, TGA, or TAG as a translation termination codon on the 3 ′ end side. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
The peptide or GPR7 expression vector of the present invention is, for example, (a) excising the target DNA fragment from the DNA encoding the peptide or GPR7 of the present invention, and (b) extracting the DNA fragment from the promoter in an appropriate expression vector. It can manufacture by connecting downstream.
Examples of vectors include E. coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), λ phage, and the like. In addition to animal viruses such as bacteriophage, retrovirus, vaccinia virus and baculovirus, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo and the like are used.
The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host used for gene expression. For example, when animal cells are used as the host, SRα promoter, SV40 promoter, HIV / LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
[0040]
Of these, it is preferable to use a CMV (cytomegalovirus) promoter, SRα promoter, or the like. When the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, λPL promoter, lpp promoter, T7 promoter, etc., and when the host is Bacillus, SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter, etc. When the host is yeast, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc. are preferable. When the host is an insect cell, polyhedrin promoter, P10 promoter and the like are preferable. In addition to the above, an expression vector containing an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40ori) and the like is used as desired. it can. Examples of selection markers include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistance gene (hereinafter Amp). r A neomycin resistance gene (hereinafter Neo) r G418 resistance) and the like. In particular, when a dhfr gene-deficient Chinese hamster cell is used and the dhfr gene is used as a selection marker, the target gene can also be selected by a medium not containing thymidine.
If necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the peptide of the present invention. When the host is Escherichia, the PhoA signal sequence, OmpA, signal sequence, etc., and when the host is Bacillus, the α-amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc. In some cases, MFα • signal sequence, SUC2 • signal sequence, etc., when the host is an animal cell, insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule / signal sequence, etc. can be used.
A transformant can be produced using a vector containing the DNA encoding the peptide of the present invention thus constructed.
As the host, for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
[0041]
Specific examples of the genus Escherichia include, for example, Escherichia coli K12 • DH1 [Procedures of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology (Journal of Molecular Biology). Molecular Biology), 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], etc. Is used.
Examples of Bacillus bacteria include, for example, Bacillus subtilis MI114 [Gen, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984). )] Etc. are used.
Examples of yeast include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R. − NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia pastoris KM71, and the like.
[0042]
As insect cells, for example, when the virus is AcNPV, larvae-derived cell lines (Spodoptera frugiperda cells; Sf cells), MG1 cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, High Five derived from eggs of Trichoplusia ni TM Cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used. When the virus is BmNPV, sputum-derived cell lines (Bombyx mori N cells; BmN cells) and the like are used. Examples of the Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL 1711), Sf21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)).
As insects, for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
Examples of animal cells include monkey cell COS-7 (COS7), Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dhfr gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter referred to as CHO (dhfr). − Abbreviated cells), mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, and the like.
To transform Escherichia, for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 1972), Gene, Vol. 17, 107 (1982), and the like.
Transformation of Bacillus can be performed according to the method described in, for example, Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
To transform yeast, for example, Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991), Processings of the National Academy of Sciences of -The method can be carried out according to the method described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978).
[0043]
Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
In order to transform animal cells, for example, Cell Engineering Supplement 8 New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52, 456 (1973). In this way, a transformant transformed with an expression vector containing DNA encoding the peptide can be obtained.
When culturing a transformant whose host is an Escherichia bacterium or Bacillus genus, a liquid medium is suitable as a medium used for the culture, and a carbon source necessary for the growth of the transformant, Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are contained. Examples of the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose. Examples of the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean cake, and potato extract. Examples of the inorganic or organic substance and inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride. In addition, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5-8.
As a medium for culturing Escherichia, for example, M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics] 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]. In order to make the promoter work efficiently here, a drug such as 3β-indolylacrylic acid can be added.
[0044]
When the host is an Escherichia bacterium, the culture is usually carried out at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
When the host is Bacillus, the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
When cultivating a transformant whose host is yeast, examples of the medium include a Burkholder minimum medium [Bostian, KL et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of Science. The USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), vol. 77, 4505 (1980)] and SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al., Proceedings of the National -Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 81, 5330 (1984)]. The pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. The culture is usually performed at about 20 ° C. to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
When cultivating a transformant whose host is an insect cell or insect, 10% bovine serum or the like immobilized to Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195,788 (1962)) is added as a medium. What added the thing suitably is used. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. The culture is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
When cultivating a transformant whose host is an animal cell, examples of the medium include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, Vol. 122, 501 (1952)], DMEM medium. [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association 199, 519 (1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, Vol. 73, 1 (1950)] is used. The pH is preferably about 6-8. The culture is usually performed at about 30 ° C. to 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
As described above, the peptide matahGPR7 of the present invention can be generated inside the cell, the cell membrane, or extracellularly of the transformant.
Separation and purification of the peptide of the present invention or GPR7 from the culture can be performed, for example, by the following method.
[0045]
When extracting the peptide or GPR7 of the present invention from cultured cells or cells, after culturing, the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasound, lysozyme and / or freezing. A method of obtaining a peptide of the present invention or a crude extract of GPR7 by centrifugation or filtration after disrupting cells or cells by thawing or the like is appropriately used. Protein denaturants such as urea and guanidine hydrochloride in the buffer, Triton X-100 TM A surfactant such as may be contained. When the peptide is secreted into the culture solution, after completion of the culture, the cells or cells are separated from the supernatant by a method known per se, and the supernatant is collected.
Purification of the peptide of the present invention or GPR7 contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be performed by appropriately combining known separation / purification methods. These known separation and purification methods include mainly molecular weights such as methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Using difference in charge, method using difference in charge such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, and difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography A method using a difference in isoelectric point, such as a method, isoelectric focusing method, or the like is used.
When the peptide of the present invention or GPR7 thus obtained is obtained in a free form, it can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely when it is obtained as a salt, it is known per se. It can be converted into a free form or other salt by a method or a method analogous thereto.
The peptide of the present invention or GPR7 produced by the recombinant can be arbitrarily modified or partially removed by applying an appropriate protein modifying enzyme before or after purification. Examples of the protein modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like.
[0046]
The antibody against the peptide of the present invention (hereinafter sometimes simply referred to as the antibody of the present invention) may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it can recognize an antibody against the peptide of the present invention.
An antibody against the peptide of the present invention can be produced according to a method for producing an antibody or antiserum known per se, using the peptide of the present invention as an antigen.
[0047]
[Production of monoclonal antibodies]
(A) Preparation of monoclonal antibody-producing cells
The peptide of the present invention is administered to a warm-blooded animal per se, together with a carrier and a diluent, at a site where antibody production is possible by administration. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of the warm-blooded animal used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats and chickens, and mice and rats are preferably used.
When producing monoclonal antibody-producing cells, select an individual with a recognized antibody titer from a warm-blooded animal immunized with an antigen, such as a mouse, and collect the spleen or lymph nodes 2 to 5 days after the final immunization. Monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared by fusing the antibody-producing cells to be fused with allogeneic or xenogeneic myeloma cells. The antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled peptide described below with an antiserum and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody. The fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)]. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus. Preferably, PEG is used.
Examples of myeloma cells include warm-blooded animal myeloma cells such as NS-1, P3U1, SP2 / 0, AP-1, and P3U1 is preferably used. The preferred ratio of the number of antibody-producing cells (spleen cells) to be used and the number of myeloma cells is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is added at a concentration of about 10 to 80%. Cell fusion can be efficiently carried out by incubating at 20 to 40 ° C., preferably 30 to 37 ° C. for 1 to 10 minutes. Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, the hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) on which a peptide (protein) antigen is adsorbed directly or together with a carrier. A method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or an enzyme (if the cell used for cell fusion is a mouse, an anti-mouse immunoglobulin antibody is used) or protein A And a method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase adsorbed with an anti-immunoglobulin antibody or protein A, adding a peptide labeled with a radioactive substance or an enzyme, etc. .
The selection of the monoclonal antibody can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). As a selection and breeding medium, any medium may be used as long as the hybridoma can grow. For example, RPMI 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal bovine serum, GIT medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 1-10% fetal bovine serum, or serum-free for hybridoma culture A culture medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) etc. can be used. The culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. The culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 to 2 weeks. Culturing can usually be performed under 5% carbon dioxide gas. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the antibody titer in the above antiserum.
[0048]
(B) Purification of monoclonal antibody
Separation and purification of the monoclonal antibody can be performed by a method known per se, for example, an immunoglobulin separation and purification method (eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)). Absorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, specific purification method in which only the antibody is collected with an antigen-binding solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G, and the binding is dissociated to obtain the antibody. Can do.
[0049]
[Preparation of polyclonal antibody]
The polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, an immune antigen (peptide antigen) itself or a complex of it and a carrier protein is prepared, and a warm-blooded animal is immunized in the same manner as the above-described monoclonal antibody production method. The product can be produced by collecting and purifying the antibody.
Regarding the complex of immunizing antigen and carrier protein used to immunize warm-blooded animals, the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten are such that the antibody is effective against hapten immunized by crosslinking to carrier. As long as it can, what kind of thing may be bridge | crosslinked by what ratio, For example, about 0.1-20, Preferably about 1 with respect to hapten 1 with respect to hapten 1 by weight ratio of bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, hemocyanin etc. A method of coupling at a rate of ˜5 is used.
In addition, various condensing agents can be used for coupling of the hapten and the carrier, but active ester reagents containing glutaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, thiol group, and dithiobilidyl group are used.
The condensation product is administered to a warm-blooded animal by itself, together with a carrier and a diluent, at a site where antibody production is possible. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. Administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total.
Polyclonal antibodies can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood of warm-blooded animals immunized by the above method.
The polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the antibody titer in the antiserum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-described monoclonal antibody separation and purification.
[0050]
An antisense DNA having a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to a DNA encoding the peptide of the present invention (hereinafter, these DNAs may be abbreviated as the DNA of the present invention). DNA may be abbreviated as antisense DNA), which has a base sequence complementary to or substantially complementary to the DNA of the present invention and has an action capable of suppressing the expression of the DNA. Any antisense DNA can be used.
The base sequence substantially complementary to the DNA of the present invention is, for example, about 70 of the total base sequence or partial base sequence of the base sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention). % Or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more of a base sequence having homology. In particular, of the total base sequence of the complementary strand of the DNA of the present invention, about 70% or more of the complementary strand of the base sequence encoding the N-terminal site of the peptide of the present invention (for example, the base sequence near the start codon, etc.), Antisense DNA having a homology of preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is suitable. These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer.
The uses of (1) the peptide of the present invention, (2) the DNA of the present invention, (3) the antibody of the present invention, and (4) the antisense DNA will be described below.
[0051]
(1) Therapeutic / preventive agent for various diseases involving the peptide of the present invention
As shown in Example 6 described later, the peptide of the present invention has cell stimulating activity of GPR7-expressing cells (for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, activity to promote GTPγS binding activity, etc.) And is an endogenous ligand of GPR7. In addition, the peptide of the present invention has an appetite (feeding) enhancing action as shown in Example 14 described later. Furthermore, it is considered that the peptide of the present invention acts as a neuromodulator or neuroendocrine substance, and is involved in memory, learning, or stress regulation.
Accordingly, when the peptide of the present invention or the DNA of the present invention is abnormal or defective, or when GPR7 or DNA encoding GPR7 is abnormal or defective, for example, anorexia, High blood pressure, autoimmune disease, heart failure, cataract, glaucoma, acute bacterial meningitis, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, acute viral encephalitis, adult respiratory distress syndrome, alcoholic hepatitis, Alzheimer's disease, asthma, arteriosclerosis, atopic dermatitis , Bacterial pneumonia, bladder cancer, fracture, breast cancer, bulimia, bulimia, burn healing, cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic pancreatitis, cirrhosis, colon cancer (colon / rectal) Cancer), Crohn's disease, dementia, diabetic complications, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, gastritis, Helicobacter pylori infection, liver All, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis, herpes simplex virus infection, varicella-zoster virus infection, Hodgkin's disease, AIDS infection, human papillomavirus infection, hypercalcemia, hypercholesterolemia , Hyperglyceridemia, hyperlipidemia, infection, influenza infection, insulin-dependent diabetes mellitus (type I), invasive staphylococcal infection, malignant melanoma, cancer metastasis, multiple myeloma, allergic Rhinitis, nephritis, non-Hodgkin's lymphoma, non-insulin dependent diabetes mellitus (type II), non-small cell lung cancer, organ transplantation, osteoarthritis, osteomalacia, osteopenia, osteoporosis, ovarian cancer, bone Pechet's disease Ulcer, peripheral vascular disease, prostate cancer, reflux esophagitis, renal failure, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, severe systemic fungal infection, small cell lung Cancer, spinal cord injury, gastric cancer, systemic lupus erythematosus, transient ischemic attack, tuberculosis, valvular disease, vascular / multiple infarct dementia, wound healing, insomnia, arthritis, pituitary hormone secretion failure [eg, prolactin secretion Various diseases such as insufficiency (eg, ovarian dysfunction, seminal vesicle growth failure, menopause, hypothyroidism), urine, uremia, or neurodegenerative diseases (especially anorexia) Is expensive.
Therefore, the peptide of the present invention and the DNA of the present invention can be used, for example, as a medicament (especially an appetite (feeding) enhancer etc.) such as a therapeutic / preventive agent for the above-mentioned various diseases (especially anorexia). it can.
[0052]
The peptide of the present invention and the DNA of the present invention can be used, for example, when there is a patient in which the peptide of the present invention is reduced or deficient in a living body. By expressing the peptide of the present invention, (b) by inserting the DNA of the present invention into a cell and expressing the peptide of the present invention, and then transplanting the cell into a patient, or (c) By administering the peptide to the patient, the role of the peptide of the present invention in the patient can be fully or normally exerted.
When the DNA of the present invention is used as the above therapeutic / prophylactic agent, the DNA is inserted alone or into a suitable vector such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector, etc. It can be administered to humans or warm-blooded animals. The DNA of the present invention can be formulated as it is or with a physiologically recognized carrier such as an adjuvant for promoting intake, and can be administered by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
When the peptide of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, it is preferable to use a product purified to at least 90%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and further preferably 99% or more. preferable.
The peptide of the present invention is sterilized, for example, orally as a tablet, capsule, elixir, microcapsule, etc., with sugar coating as necessary, or with water or other pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally in the form of injections such as solutions or suspensions. For example, the peptides of the invention may be admixed in a unit dosage form as required by the accepted pharmaceutical practice, along with physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. Can be manufactured by. The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose within the indicated range can be obtained.
[0053]
Additives that can be mixed into tablets, capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth and gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid and the like. Leavening agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavorings such as peppermint, red oil and cherry. When the dispensing unit form is a capsule, a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practice such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like.
Examples of aqueous solutions for injection include isotonic solutions (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) containing physiological saline, glucose and other adjuvants, and appropriate solubilizing agents. For example, alcohol (for example, ethanol etc.), polyalcohol (for example, propylene glycol, polyethylene glycol etc.), nonionic surfactant (for example, polysorbate 80) TM , HCO-50, etc.). Examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol or the like as a solubilizing agent. In addition, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), You may mix | blend with preservatives (for example, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidant, etc. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
A vector into which the DNA of the present invention has been inserted is formulated in the same manner as described above and is usually used parenterally.
The preparations thus obtained are safe and have low toxicity, so that, for example, humans or warm-blooded animals (eg rats, mice, guinea pigs, rabbits, birds, sheep, pigs, cows, horses, cats, dogs, monkeys) , Etc.).
[0054]
The dose of the peptide of the present invention varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc. For example, when the peptide of the present invention is administered orally for the purpose of treating anorexia, it is generally an adult (as 60 kg). In this case, the peptide is administered at about 0.1 mg to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. When administered parenterally, the single dose of the peptide varies depending on the administration subject, the target disease, etc. For example, for the purpose of treating anorexia, the peptide of the present invention is administered in the form of an injection (body weight 60 kg). The peptide is administered by injecting about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the peptide into the affected area per day. Is convenient. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
[0055]
(2) Screening of drug candidate compounds for disease
(2-1) Screening method A
Since the peptide of the present invention has a function as a ligand of GPR7 and the like, a compound or a salt thereof that promotes the function of the peptide of the present invention includes, for example, anorexia, hypertension, autoimmune disease, heart failure, cataract, glaucoma, acute bacteria Meningitis, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, acute viral encephalitis, adult respiratory distress syndrome, alcoholic hepatitis, Alzheimer's disease, asthma, arteriosclerosis, atopic dermatitis, bacterial pneumonia, bladder cancer, fracture, breast cancer, bulimia , Bulimia, burn healing, cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic pancreatitis, cirrhosis, colon cancer (colon / rectal cancer), Crohn's disease, dementia, diabetic complications, Diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, gastritis, Helicobacter pylori infection, liver failure, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis, simple Rupes virus infection, varicella-zoster virus infection, Hodgkin's disease, AIDS infection, human papillomavirus infection, hypercalcemia, hypercholesterolemia, hyperglycemia, hyperlipidemia, infection, influenza infection , Insulin-dependent diabetes mellitus (type I), invasive staphylococcal infection, malignant melanoma, cancer metastasis, multiple myeloma, allergic rhinitis, nephritis, non-Hodgkin's lymphoma, insulin-independent diabetes (type II) ), Non-small cell lung cancer, organ transplantation, osteoarthritis, osteomalacia, osteopenia, osteoporosis, ovarian cancer, bone Pechet disease, peptic ulcer, peripheral vascular disease, prostate cancer, reflux esophagitis, renal failure Rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, severe systemic fungal infection, small cell lung cancer, spinal cord injury, gastric cancer, systemic lupus erythematosus, Transient cerebral ischemic attack, tuberculosis, valvular heart disease, vascular / multiple infarct dementia, wound healing, insomnia, arthritis, pituitary hormone secretion deficiency [eg, prolactin secretion deficiency (eg, ovarian hypofunction, seminal vesicle) Developmental disorders, climacteric disorders, hypothyroidism, etc.)], urine, uremia, or neurodegenerative diseases (especially anorexia), etc. (especially appetite (feeding) enhancers) It can be used as a medicine.
On the other hand, a compound that inhibits the function of the peptide of the present invention or a salt thereof can be used, for example, for obesity [eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulinar obesity] Hyperplasmic obesity, hypophyseal adiposity, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity, symptomatic Obesity (symptomatic obesity), childhood obesity (infantile obesity), upper body obesity, dietary obesity, hypogonadal obesity, systemic mastocytosis Safe obesity (simple obesity, central obesity, etc.), safe and low toxicity preventive / therapeutic agents such as hyperphagia, pituitary gland tumor, diencephalon tumor, menstrual abnormalities, self Immune disease, prolactin Safe, such as breast cancer, infertility, impotence, amenorrhea, milk leakage, acromegaly, Chiari Frommer syndrome, Argonz del Castillo syndrome, Forbes Albright syndrome, lymphoma, Sheehan syndrome, spermatogenesis It is useful as a low-toxic preventive / therapeutic agent (prolactin production inhibitor), preferably a safe and low-toxic prophylactic / therapeutic agent such as obesity and hyperphagia.
The screening uses the peptide of the present invention or constructs an expression system for the recombinant peptide of the present invention and uses a receptor binding assay system using the expression system, whereby the peptide of the present invention and GPR7 are used. A compound that changes the binding property (a compound that promotes or inhibits the activity of the peptide of the present invention) (for example, a peptide, protein, non-peptidic compound, synthetic compound, fermentation product, etc.) or a salt thereof can be screened. Such compounds include GPR7-mediated cell stimulating activity (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, activity to promote GTPγS binding activity, etc.) A compound having a cell stimulating activity (that is, a GPR7 antagonist), and the like. “Changing the binding property to the ligand” includes both the case where the binding with the ligand is inhibited and the case where the binding with the ligand is promoted.
[0056]
That is, the present invention
A method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the peptide of the present invention, characterized by using the peptide of the present invention, specifically,
(I) a case where GPR7 or a partial peptide thereof (hereinafter simply referred to as GPR7) is contacted with a peptide of the present invention, and (ii) a case where GPR7 is contacted with the peptide of the present invention and a test compound A method for screening a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and GPR7 (a compound that promotes or inhibits the activity of the peptide of the present invention) or a salt thereof is provided. In the screening method of the present invention, for example, binding of a ligand to GPR7 when (i) GPR7 is contacted with the peptide of the present invention and (ii) GPR7 is contacted with the peptide of the present invention and a test compound. Measure and compare amounts, cell stimulating activities, etc.
[0057]
Specifically, the screening method of the present invention includes:
(1) Measure the binding amount of the labeled peptide of the present invention to GPR7 when the labeled peptide of the present invention is contacted with GPR7 and when the labeled peptide of the present invention and a test compound are contacted with GPR7 A method for screening a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and GPR7 (compound that promotes or inhibits the activity of the peptide of the present invention) or a salt thereof,
(2) When the labeled peptide of the present invention is brought into contact with a cell containing GPR7 or a membrane fraction of the cell, and the labeled peptide of the present invention and the test compound are contained in a cell containing GPR7 or the membrane of the cell. The amount of binding of the labeled peptide of the present invention to the cell or the membrane fraction when contacted with the fraction is measured and compared, and the binding property of the peptide of the present invention and GPR7 is changed. A screening method for a compound (a compound that promotes or inhibits the activity of the peptide of the present invention) or a salt thereof,
(3) When the labeled peptide of the present invention was brought into contact with GPR7 expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding GPR7, and the labeled peptide of the present invention and the test compound It is characterized by measuring and comparing the binding amount of the labeled peptide of the present invention to GPR7 when it is brought into contact with GPR7 expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding GPR7. A method for screening a compound that alters the binding property between the peptide of the present invention and GPR7 (a compound that promotes or inhibits the activity of the peptide of the present invention) or a salt thereof,
[0058]
(4) When a compound that activates GPR7 (for example, the peptide of the present invention) is brought into contact with cells containing GPR7, and when a compound that activates GPR7 and a test compound are brought into contact with cells containing GPR7 GPR7-mediated cell stimulating activity (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Activity that inhibits release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, GTPγS binding activity, etc. Activity and the like, and a method for screening a compound that alters the binding property between the peptide of the present invention and GPR7 (a compound that promotes or inhibits the activity of the peptide of the present invention) or a salt thereof,
(5) When a compound that activates GPR7 (for example, the peptide of the present invention) is contacted with GPR7 expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding GPR7, GPR7-mediated cell stimulating activity (eg, arachidonic acid release) when the activating compound and test compound are contacted with GPR7 expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding GPR7. , Acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Activity that inhibits release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, GTPγS binding activity, etc. Activity and the like, and a method for screening a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and GPR7 (a compound that promotes or inhibits the activity of the peptide of the present invention) or a salt thereof. is there.
[0059]
A specific description of the screening method of the present invention will be given below.
First, GPR7 used in the screening method of the present invention may be any GPR7 as long as it recognizes the peptide of the present invention as a ligand, but is preferably a membrane fraction of a human or warm-blooded animal organ. It is. However, since human-derived organs are particularly difficult to obtain, GPR7 and the like that are expressed in large quantities using recombinants are suitable for use in screening. GPR7 can be manufactured according to the method described above.
In the screening method of the present invention, when cells containing GPR7 or the cell membrane fraction are used, the preparation method described below may be followed.
When cells containing GPR7 are used, the cells may be fixed with glutaraldehyde, formalin or the like. The immobilization method can be performed according to a method known per se.
The cell containing GPR7 refers to a host cell that expresses GPR7, and examples of the host cell include the aforementioned E. coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cell, animal cell and the like. Examples of the host cell expressing GPR7 include the same method as the method for producing a transformant transformed with the above-described expression vector containing the peptide of the present invention.
The membrane fraction refers to a fraction containing a large amount of cell membrane obtained by a method known per se after disrupting cells. Cell disruption methods include crushing cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, disrupting with a Waring blender or polytron (manufactured by Kinematica), disrupting with ultrasonic waves, or pressurizing with a French press, etc. Crushing. For fractionation of the cell membrane, a fractionation method using centrifugal force such as a fractional centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (usually about 1 minute to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15000 rpm to 30000 rpm) for usually 30 minutes to 2 hours. The precipitate is used as a membrane fraction. The membrane fraction is rich in expressed GPR7 and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
The amount of GPR7 in the GPR7-containing cells and membrane fraction is 10 per cell. 3 -10 8 Preferably it is a molecule. 5 -10 7 It is preferably a molecule. In addition, the higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, making it possible not only to construct a highly sensitive screening system, but also to measure a large amount of samples in the same lot. .
[0060]
In order to carry out the above (1) to (3) for screening for a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and GPR7 (a compound that promotes or inhibits the activity of the peptide of the present invention), an appropriate GPR7 The fraction and the labeled peptide of the present invention are used. As the GPR7 fraction, a natural GPR7 fraction or a recombinant GPR7 fraction having an activity equivalent to that is desirable. Here, the equivalent activity indicates an equivalent ligand binding activity and the like. As the labeled ligand, a labeled ligand, a labeled ligand analog compound and the like are used. For example [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 A ligand labeled with S] or the like can be used. Of these, preferably [ 125 I] -labeled ligand.
Specifically, in order to screen for a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and GPR7, first, a cell containing GPR7 or a membrane fraction of the cell is suspended in a buffer suitable for screening. Prepare the receptor preparation. The buffer may be any buffer that does not inhibit the binding between the ligand and the receptor, such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) and a Tris-HCl buffer. In addition, for the purpose of reducing non-specific binding, CHAPS, Tween-80 TM (Kao-Atlas), surfactants such as digitonin and deoxycholate can also be added to the buffer. Furthermore, protease inhibitors such as PMSF, leupeptin, E-64 (manufactured by Peptide Institute) and pepstatin can be added for the purpose of suppressing degradation of GPR7 and the peptide of the present invention by protease. A fixed amount (5000 cpm to 500000 cpm) of the labeled peptide of the present invention was added to 0.01 ml to 10 ml of the receptor solution, -10 -10 -7 M test compound is allowed to coexist. In order to know the amount of non-specific binding (NSB), a reaction tube to which a large excess of unlabeled peptide of the present invention is added is also prepared. The reaction is carried out at 0 ° C. to 50 ° C., preferably 4 ° C. to 37 ° C. for 20 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 3 hours. After the reaction, the solution is filtered with a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and then the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured with a liquid scintillation counter or a γ-counter. Count when there is no antagonist (B 0 ) Minus non-specific binding (NSB) (B 0 When -NSB) is defined as 100%, a test compound with a specific binding amount (B-NSB) of, for example, 50% or less can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
[0061]
In order to carry out the above-mentioned methods (4) to (5) for screening a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and GPR7 (a compound that promotes or inhibits the activity of the peptide of the present invention), GPR7 Cell-stimulating activity through the cell (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Activity that inhibits release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, GTPγS binding activity, etc. Activity etc.) can be measured using a known method or a commercially available measurement kit. Specifically, first, cells containing GPR7 are cultured in a multiwell plate or the like. Before screening, replace with fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compound, etc. and incubate for a certain period of time, then extract cells or collect supernatant and generate The product is quantified according to the respective method. When the production of a substance (for example, arachidonic acid, etc.) used as an index of cell stimulating activity is difficult to assay with a degrading enzyme contained in cells, an assay may be performed by adding an inhibitor to the degrading enzyme. Further, the activity such as cAMP production suppression can be detected as a production inhibitory action on cells whose basic production amount has been increased with forskolin or the like.
In order to perform screening by measuring cell stimulating activity, cells expressing appropriate GPR7 are required. As the cells expressing GPR7, the aforementioned GPR7-expressing cell line and the like are desirable.
Examples of the test compound include peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.
[0062]
A screening kit for a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and GPR7 (a compound that promotes or inhibits the activity of the peptide of the present invention) or a salt thereof includes GPR7 or a salt thereof, a partial peptide of GPR7 or a salt thereof, A cell containing GPR7 or a membrane fraction of cells containing GPR7 and the peptide of the present invention.
Examples of the screening kit of the present invention include the following.
1. Screening reagents
(1) Measurement buffer and washing buffer
Hanks' Balanced Salt Solution (Gibco) plus 0.05% bovine serum albumin (Sigma).
The solution may be sterilized by filtration through a 0.45 μm filter and stored at 4 ° C. or may be prepared at the time of use.
(2) GRP7 standard
CHO cells expressing GPR7 were placed in a 12-well plate at 5 × 10 5 Passed by piece / hole, 37 ° C, 5% CO 2 Cultivated at 95% air for 2 days.
(3) Labeled ligand
[ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 The peptide of the present invention labeled with S] or the like dissolved in an appropriate solvent or buffer is stored at 4 ° C. or −20 ° C., and diluted to 1 μM with a measuring buffer at the time of use.
(4) Ligand standard solution
The peptide of the present invention is dissolved to 1 mM in PBS containing 0.1% bovine serum albumin (manufactured by Sigma) and stored at -20 ° C.
[0063]
2. Measurement method
{Circle around (1)} GPR7-expressing cells cultured in a 12-well tissue culture plate are washed twice with 1 ml of measurement buffer, and then 490 μl of measurement buffer is added to each well.
▲ 2 ▼ 10 -3 -10 -10 After 5 μl of the test compound solution of M is added, 5 μl of the labeled peptide of the present invention is added and reacted at room temperature for 1 hour. To determine the amount of non-specific binding, 10 instead of the test compound -3 5 μl of M peptide of the invention is added.
(3) Remove the reaction solution and wash 3 times with 1 ml of washing buffer. The labeled peptide of the present invention bound to the cells is dissolved in 0.2N NaOH-1% SDS and mixed with 4 ml of liquid scintillator A (manufactured by Wako Pure Chemical Industries).
{Circle around (4)} Radioactivity is measured using a liquid scintillation counter (manufactured by Beckman), and Percent Maximum Binding (PMB) is determined by the following equation [Formula 1].
[Equation 1]
PMB = [(B-NSB) / (B 0 -NSB)] × 100
PMB: Percent Maximum Binding
B: Value when the sample is added
NSB: Non-specific binding
B 0 : Maximum binding amount
[0064]
A compound obtained by using the screening method or screening kit of the present invention or a salt thereof is a compound that changes (inhibits or promotes binding) between the peptide of the present invention and GPR7 (promotes the activity of the peptide of the present invention) Or a compound that inhibits cells, specifically, a compound having cell stimulating activity via GPR7 or a salt thereof (so-called GPR7 agonist), or a compound not having such stimulating activity (so-called GPR7 antagonist). Examples of the compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds. The specific evaluation method of whether it is the GPR7 agonist or antagonist may be according to the following (i) or (ii).
(I) After performing the binding assay shown by the screening method of (1) to (3) above to obtain a compound that changes the binding property of the peptide of the present invention and GPR7 (particularly, inhibits binding), It is determined whether or not the compound has a cell stimulating activity via GPR7. A compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is a GPR7 agonist, and a compound having no such activity or a salt thereof is a GPR7 antagonist.
(Ii) (a) A test compound is brought into contact with cells containing GPR7, and the cell stimulating activity via GPR7 is measured. A compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is a GPR7 agonist.
(b) When a compound that activates GPR7 (for example, a peptide of the present invention or a GPR7 agonist) is contacted with a cell containing GPR7, and a compound that activates GPR7 and a test compound are added to the cell that contains GPR7. The cell stimulation activity via GPR7 when contacted is measured and compared. A compound or a salt thereof that can reduce the cell stimulating activity of a compound that activates GPR7 is a GPR7 antagonist.
[0065]
Since the GPR7 agonist has the same action as the physiological activity of the peptide of the present invention against GPR7, it is a safe and low-toxic drug (for example, a prophylactic / therapeutic agent for anorexia, Useful as an appetite (feeding) enhancer, pituitary hormone secretion deficiency [eg, prolactin secretion deficiency (eg, ovarian hypofunction, seminal vesicle development failure, menopause, hypothyroidism, etc.)] It is.
Conversely, GPR7 antagonists can suppress the physiological activity of the peptides of the present invention against GPR7, so that obesity [eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulinicity] Obesity (hyperinsulinar obesity), hyperplasmic obesity, hypophyseal adiposity, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity (hypothyroid obesity) hypothalamic obesity, symptomatic obesity, infantile obesity, upper body obesity, dietary obesity, hypogonadal obesity, systemic obesity Systemic mastocytosis, simple obesity, central obesity, etc.], safe and low-toxic prophylactic / therapeutic agents such as hyperphagia, pituitary gland tumor, brain Tumors, menstrual abnormalities, autoimmune diseases, prolactinoma, infertility, impotence, amenorrhea, milk leakage, acromegaly, Chiari Frommer syndrome, Argonz del Castillo syndrome, Forbes Albright syndrome, lymphoma, Sheehan syndrome It is useful as a safe and low-toxic preventive / therapeutic agent (prolactin production inhibitor) such as spermatogenesis abnormality, preferably as a safe and low-toxic preventive / therapeutic agent such as obesity and hyperphagia.
[0066]
The compound or salt thereof obtained using the screening method A or screening kit of the present invention is, for example, a peptide, protein, non-peptide compound, synthetic compound, fermentation product, cell extract, plant extract, animal tissue extract It is a compound selected from liquid, plasma and the like, and is a compound that promotes or inhibits the function of the peptide of the present invention.
As the salt of the compound, the same salts as those of the peptide of the present invention described above can be used.
[0067]
When the compound obtained by using the screening method A or the screening kit of the present invention is used as the above therapeutic / prophylactic agent, it can be carried out according to conventional means. For example, it can be made into a tablet, a capsule, an elixir, a microcapsule, a sterile solution, a suspension and the like in the same manner as the pharmaceutical containing the peptide of the present invention.
Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, for example, humans or warm-blooded animals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, birds, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc. ).
The dose of the compound or its salt varies depending on its action, target disease, administration subject, administration route, etc. For example, when a GPR7 agonist is administered orally for the purpose of anorexia remedy, Per 60 kg), the compound is administered at about 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg per day. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc. For example, for the purpose of anorexia treatment, a GPR7 agonist is usually used in the form of an injection for adults (per 60 kg). It is convenient to administer about 0.1 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound per day by intravenous injection. . In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
In addition, for example, when a GPR7 antagonist is orally administered for the purpose of treating obesity, generally, in an adult (per 60 kg body weight), the compound is about 0.1-100 mg, preferably about 1.0- 50 mg, more preferably about 1.0-20 mg is administered. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc. For example, for the purpose of obesity treatment, a GPR7 antagonist is usually used in the form of an injection for adults (per 60 kg). It is convenient to administer about 0.1 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound per day by intravenous injection. . In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
[0068]
(2-2) Screening method B
Next, a method for screening a compound that regulates the expression level of GPR7 ligand will be described.
Specifically, the screening method B of the present invention specifically comprises (i) the expression level of each GPR7 ligand when cells or tissues capable of expressing the GPR7 ligand are cultured in the presence and absence of the test compound, or A screening method for a compound or a salt thereof that increases or decreases the expression level of a GPR7 ligand, comprising measuring and comparing the amount of mRNA encoding a GPR7 ligand.
Examples of cells or tissues that can express GPR7 ligand include cells of humans and warm-blooded animals (eg, guinea pigs, rats, mice, chickens, rabbits, pigs, sheep, cows, monkeys, etc.) (eg, nerve cells, endocrine cells, Neuroendocrine cells, glial cells, pancreatic β cells, bone marrow cells, hepatocytes, spleen cells, mesangial cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, Macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes, dendritic cells), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts Cells, osteoclasts, mammary cells, or stromal cells, or precursor cells of these cells, stem cells, cancer cells, etc.) or any tissue in which these cells are present, for example, the brain, each of the brain Position (eg, olfactory bulb, amygdala, basal cerebral sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum), spinal cord, pituitary gland, stomach, pancreas, kidney, liver, gonad, thyroid gland, gallbladder, bone marrow, adrenal gland , Skin, muscle, lung, gastrointestinal tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessel, heart, thymus, spleen, salivary gland, peripheral blood, prostate, testicle (testis), ovary, placenta, uterus, bone, cartilage, joint, skeleton A streak or the like may be used. In that case, a cell line or a primary culture system may be used. Moreover, you may use the transformant transformed with the recombinant vector containing DNA which codes the above-mentioned GPR7 ligand.
The method for culturing cells capable of expressing GPR7 ligand is the same as the method for culturing transformants described above.
As a test compound, a DNA library or the like can be used in addition to the above-described test compound.
[0069]
The expression level of the GPR7 ligand can be measured by a known method such as an immunochemical method using an antibody or the like, or mRNA encoding the GPR7 ligand can be measured by using a Northern hybridization method, RT-PCR or TaqMan PCR method. It can also be measured by a known method.
In order to compare the expression levels of mRNA by a hybridization method, a known method or a method similar thereto, for example, Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) Can be carried out according to the method described in the above.
Specifically, the amount of mRNA encoding GPR7 ligand is measured by contacting RNA extracted from cells according to a known method and DNA encoding GPR7 ligand or a part thereof or the antisense polynucleotide of the present invention. And measuring the amount of mRNA bound to the GPR7 ligand-encoding DNA or a part thereof or the antisense polynucleotide of the present invention. A DNA encoding a GPR7 ligand or a part thereof or an antisense polynucleotide of the present invention is labeled with, for example, a radioisotope, a dye, etc. -The amount of mRNA bound to the polynucleotide can be easily measured. Examples of radioisotopes include 32 P, Three H and the like are used. Examples of the dye include fluorescein, FAM (PE Biosystems), JOE (PE Biosystems), TAMRA (PE Biosystems), ROX (PE Biosystems), and Cy5 (Amersham). ), Fluorescent dyes such as Cy3 (Amersham) are used. The amount of mRNA is amplified by PCR using RNA extracted from cells after conversion to cDNA with reverse transcriptase and then using DNA encoding GPR7 ligand or a part thereof or the antisense polynucleotide of the present invention as a primer. This can be done by measuring the amount of cDNA produced.
Thus, a test compound that increases the amount of GPR7 ligand-encoding mRNA can be selected as a compound that has the activity of increasing the expression level of GPR7 ligand, and the amount of mRNA that encodes GPR7 ligand is decreased. The test compound to be used can be selected as a compound having an activity of decreasing the expression level of GPR7 ligand.
[0070]
Furthermore, the present invention provides
(Ii) When transformants transformed with a recombinant DNA in which a reporter gene is linked downstream of a promoter region or an enhancer region of a gene encoding GPR7 ligand are cultured in the presence and absence of a test compound, The present invention provides a screening method for a compound that promotes or inhibits the promoter activity, which comprises measuring and comparing the reporter activity of the promoter.
As the reporter gene, for example, lacZ (β-galactosidase gene), chloramphenicol acetyltransferase (CAT), luciferase, growth factor, β-glucuronidase, alkaline phosphatase, green fluorescent protein (GFP), β-lactamase, etc. are used. It is done.
By measuring the amount of the reporter gene product (eg, mRNA, protein) using a known method, a test compound that increases the amount of the reporter gene product controls the activity of the promoter or enhancer of the GPR7 ligand of the present invention (particularly, (Promoting), that is, a compound having an activity of increasing the expression level of GPR7 ligand. Conversely, a test compound that decreases the amount of the reporter gene product is selected as a compound having an action of controlling (particularly inhibiting) the activity of the promoter or enhancer of GPR7 ligand, that is, a compound having an activity of decreasing the expression level of GPR7 ligand. be able to.
As the test compound, the same compounds as described above are used.
The transformant can be cultured in the same manner as the transformant.
The vector construction and assay method of the reporter gene can be performed according to known techniques (for example, Molecular Biotechnology 13, 29-43, 1999).
[0071]
A compound having an activity to increase the expression level of GPR7 ligand is a safe and low-toxic drug (for example, anorexia prophylaxis / treatment agent, appetite (feeding) enhancer, pituitary hormone secretion failure [eg, prolactin secretion failure) (For example, ovarian hypofunction, seminal vesicle growth failure, menopause, hypothyroidism, etc.)]).
Compounds having the activity of reducing the expression level of GPR7 ligand are obesity [eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulinar obesity, hyperplasmic obesity (hyperplasmic obesity), hypophyseal adiposity, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity, symptomatic obesity ), Childhood obesity (infantile obesity), upper body obesity, dietary obesity, hypogonadal obesity, systemic mastocytosis, simple obesity ( simple obesity), central obesity, etc.], safe and low-toxic preventive / therapeutic agents such as hyperphagia, pituitary gland tumors, diencephalon tumors, menstrual abnormalities, autoimmune diseases, prolactinoma, Bad Safe and low-toxic prophylaxis such as symptom, impotence, amenorrhea, milk leakage, acromegaly, Chiari Frommer syndrome, Argonz del Castillo syndrome, Forbes Albright syndrome, lymphoma, Sheehan syndrome, spermatogenesis -It is useful as a therapeutic agent (prolactin production inhibitor), preferably a safe and low-toxic preventive / therapeutic agent for obesity, hyperphagia and the like.
The compound or salt thereof obtained using the screening method B or screening kit of the present invention is, for example, a peptide, protein, non-peptide compound, synthetic compound, fermentation product, cell extract, plant extract, animal tissue extraction It is a compound selected from liquid, plasma and the like, and is a compound that promotes or inhibits the function of the peptide of the present invention.
As the salt of the compound, the same salts as those of the peptide of the present invention described above can be used.
[0072]
When the compound obtained using the screening method B or screening kit of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, it can be carried out according to conventional means. For example, it can be made into a tablet, a capsule, an elixir, a microcapsule, a sterile solution, a suspension and the like in the same manner as the pharmaceutical containing the peptide of the present invention.
Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, for example, humans or warm-blooded animals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, birds, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc. ).
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, administration subject, administration route, etc. For example, when a compound that increases the expression level of GPR7 ligand is orally administered for the purpose of anorexia remedy In general, for adults (per 60 kg body weight), the compound is administered at about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc. For example, for the purpose of anorexia treatment, a compound that increases the expression level of GPR7 ligand is used in the form of an injection. In general, when administered to an adult (per 60 kg), about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound per day is intravenously injected. It is convenient to administer. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
In addition, for example, when orally administering a compound that decreases the expression level of GPR7 ligand for the purpose of treating obesity, generally in an adult (per 60 kg body weight), about 0.1 to 100 mg of the compound per day, Preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg is administered. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc. For example, a compound that decreases the expression level of GPR7 ligand for the purpose of obesity treatment is in the form of an injection. In general, when administered to an adult (per 60 kg), about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound per day is intravenously injected. It is convenient to administer. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
[0073]
(3) Quantification of the peptide of the present invention
Since the antibody of the present invention can specifically recognize the peptide of the present invention, it can be used for quantification of the peptide of the present invention in a test solution, particularly quantification by a sandwich immunoassay.
That is, the present invention
(I) The antibody of the present invention is competitively reacted with a test solution and the labeled peptide of the present invention, and the ratio of the labeled peptide of the present invention bound to the antibody is measured. A method for quantifying the peptide of the present invention in a test solution, and
(Ii) The test solution and the antibody of the present invention insolubilized on the carrier and the labeled another antibody of the present invention are reacted simultaneously or successively, and then the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier is measured. The method for quantifying the peptide of the present invention in a test solution is provided.
[0074]
In the above quantification method (ii), it is desirable that one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal part of the peptide of the present invention and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal part of the peptide of the present invention.
In addition to quantification of the peptide of the present invention using a monoclonal antibody against the peptide of the present invention, detection by tissue staining or the like can also be performed. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or F (ab ′) of the antibody molecule. 2 , Fab ′, or Fab fractions may be used.
The method for quantifying the peptide of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and an antibody, antigen or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (eg, amount of peptide) in the solution to be measured is not limited. Any measurement method may be used as long as it is a measurement method in which the amount is detected by chemical or physical means and calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephrometry, competition method, immunometric method and sandwich method are preferably used, but the sandwich method described later is particularly preferable in view of sensitivity and specificity.
[0075]
As a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, or the like is used. Examples of radioisotopes include [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C] and the like are used. As the enzyme, a stable enzyme having a large specific activity is preferable. For example, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used. As the fluorescent substance, for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used. As the luminescent substance, for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like are used. Furthermore, a biotin-avidin system can also be used for binding of an antibody or antigen and a labeling agent.
For insolubilization of an antigen or antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond that is usually used to insolubilize or immobilize a peptide or an enzyme may be used. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, or glass.
In the sandwich method, the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further labeled with another monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction), and then on the insolubilized carrier. By measuring the activity of the labeling agent, the amount of the peptide of the present invention in the test solution can be quantified. The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, or may be performed simultaneously or at different times. The labeling agent and the insolubilizing method can be the same as those described above. In the immunoassay by the sandwich method, the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity. May be.
[0076]
In the method for measuring the peptide of the present invention by the sandwich method of the present invention, the monoclonal antibody of the present invention used for the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different site to which the peptide of the present invention binds. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably the antibody used in the primary reaction when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal part of the peptide of the present invention, for example. For example, an antibody that recognizes the N end other than the C end is used.
The monoclonal antibody of the present invention can be used in measurement systems other than the sandwich method, for example, competitive method, immunometric method, nephrometry, and the like.
In the competitive method, the antigen in the test solution and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated. (B / F separation), the amount of labeling of either B or F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified. In this reaction method, a soluble antibody is used as an antibody, B / F separation is performed using polyethylene glycol, a liquid phase method using a second antibody against the antibody, and a solid-phased antibody is used as the first antibody, or As the first antibody, a soluble one is used, and a solid phase method using a solid phase antibody as the second antibody is used.
In the immunometric method, the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated, or the antigen in the test solution is separated. Are reacted with an excess amount of labeled antibody, and then a solid phased antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the labeled amount of any phase is measured to quantify the amount of antigen in the test solution.
In nephrometry, the amount of insoluble precipitate produced as a result of the antigen-antibody reaction in a gel or solution is measured. Laser nephrometry using laser scattering is preferably used even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of precipitate is obtained.
In applying these individual immunological measurement methods to the quantification method of the present invention, special conditions, operations and the like are not required to be set. What is necessary is just to construct | assemble the measurement system of the peptide of this invention, adding the usual technical consideration of those skilled in the art to the usual conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, it is possible to refer to reviews, books and the like.
For example, Hiroshi Irie “Radioimmunoassay” (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie “Sequential Radioimmunoassay” (published in Kodansha, 1979), “Enzyme Immunoassay” edited by Eiji Ishikawa et al. 53)), edited by Eiji Ishikawa et al. "Enzyme Immunoassay" (2nd edition) (Medical Shoin, published in 1982), edited by Eiji Ishikawa et al. "Enzyme Immunoassay" (3rd edition) (Medical Shoin, Showa) 62), “Methods in ENZYMOLOGY” Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), Id. Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), Id. Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), Id. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), ibid.Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibid.Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies) )) (Academic Press Issue) and the like can be referred to.
As described above, the peptide of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
[0077]
Furthermore, when a decrease in the concentration of the peptide of the present invention is detected by quantifying the concentration of the peptide of the present invention using the antibody of the present invention, for example, anorexia, hypertension, autoimmune disease, heart failure, cataract , Glaucoma, acute bacterial meningitis, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, acute viral encephalitis, adult respiratory distress syndrome, alcoholic hepatitis, Alzheimer's disease, asthma, arteriosclerosis, atopic dermatitis, bacterial pneumonia, bladder cancer, fracture Breast cancer, bulimia, bulimia, burn healing, cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic pancreatitis, cirrhosis, colon cancer (colon / rectal cancer), Crohn's disease, dementia, Diabetic complications, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, gastritis, Helicobacter pylori infection, liver failure, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis, single Herpesvirus infection, varicella-zoster virus infection, Hodgkin's disease, AIDS infection, human papillomavirus infection, hypercalcemia, hypercholesterolemia, hyperglycemia, hyperlipidemia, infection, influenza infection , Insulin-dependent diabetes mellitus (type I), invasive staphylococcal infection, malignant melanoma, cancer metastasis, multiple myeloma, allergic rhinitis, nephritis, non-Hodgkin's lymphoma, insulin-independent diabetes (type II) ), Non-small cell lung cancer, organ transplantation, osteoarthritis, osteomalacia, osteopenia, osteoporosis, ovarian cancer, bone Pechet disease, peptic ulcer, peripheral vascular disease, prostate cancer, reflux esophagitis, renal failure , Rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, severe systemic fungal infection, small cell lung cancer, spinal cord injury, gastric cancer, systemic lupus erythematosus , Transient cerebral ischemic attack, tuberculosis, valvular heart disease, vascular / multiple infarct dementia, wound healing, insomnia, arthritis, pituitary hormone secretion deficiency [eg, prolactin deficiency (eg, ovarian hypofunction, sperm Sac growth failure, climacteric disorder, hypothyroidism, etc.)), urine, uremia, or neurodegenerative diseases (especially anorexia), or can be diagnosed as having a high possibility of suffering in the future . When an increase in the concentration of the peptide of the present invention is detected, for example, obesity [eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulinar obesity (hyperinsulinar obesity) ), Hyperplasmic obesity, hypophyseal adiposity, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity, symptoms Symptomatic obesity, infantile obesity, upper body obesity, dietary obesity, hypogonadal obesity, systemic mastocytosis ), Simple obesity, central obesity, etc.], hyperphagia, pituitary gland tumor, diencephalon tumor, menstrual abnormality, autoimmune disease, prolactinoma, infertility, impotence, Amenorrhea Illness such as milk leakage, acromegaly, Chiari Frommer syndrome, Argonz del Castillo syndrome, Forbes Albright syndrome, lymphoma, Sheehan syndrome, spermatogenesis (especially obesity, etc.) It is possible to diagnose that there is a high possibility of doing.
The antibody of the present invention can be used for detecting the peptide of the present invention present in a subject such as a body fluid or tissue. In addition, for the production of an antibody column used for purifying the peptide of the present invention, detection of the peptide of the present invention in each fraction during purification, analysis of the behavior of the peptide of the present invention in a test cell, etc. Can be used.
[0078]
(4) Gene diagnostic agent
The DNA of the present invention can be used, for example, in humans or warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, rabbits, birds, sheep, pigs, cows, horses, cats, dogs, monkeys, etc.) by using them as probes. Since abnormality (gene abnormality) of DNA or mRNA encoding the peptide of the present invention can be detected, for example, damage, mutation or expression decrease of the DNA or mRNA, increase or excessive expression of the DNA or mRNA, etc. It is useful as a genetic diagnostic agent. The above gene diagnosis using the DNA of the present invention includes, for example, known Northern hybridization and PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Processings of. The National Academy of Sciences of USA (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America), Vol. 86, 2766-2770 (1989)).
For example, if decreased mRNA expression is detected by Northern hybridization, for example, anorexia, hypertension, autoimmune disease, heart failure, cataract, glaucoma, acute bacterial meningitis, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, acute viral encephalitis , Adult respiratory distress syndrome, alcoholic hepatitis, Alzheimer's disease, asthma, arteriosclerosis, atopic dermatitis, bacterial pneumonia, bladder cancer, fracture, breast cancer, bulimia, bulimia, burn healing, cervical cancer, Chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic pancreatitis, cirrhosis, colon cancer (colon / rectal cancer), Crohn's disease, dementia, diabetic complications, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy , Gastritis, Helicobacter pylori infection, liver failure, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis, herpes simplex virus infection, varicella zoster Irs infection, Hodgkin disease, AIDS infection, human papillomavirus infection, hypercalcemia, hypercholesterolemia, hyperglyceridemia, hyperlipidemia, infection, influenza infection, insulin-dependent diabetes mellitus (type I) ), Invasive staphylococcal infection, malignant melanoma, cancer metastasis, multiple myeloma, allergic rhinitis, nephritis, non-Hodgkin's lymphoma, non-insulin dependent diabetes mellitus (type II), non-small cell lung cancer, organ Transplantation, osteoarthritis, osteomalacia, osteopenia, osteoporosis, ovarian cancer, bone Pechet disease, peptic ulcer, peripheral vascular disease, prostate cancer, reflux esophagitis, renal failure, rheumatoid arthritis, schizophrenia, Sepsis, septic shock, severe systemic fungal infection, small cell lung cancer, spinal cord injury, gastric cancer, systemic lupus erythematosus, transient ischemic attack, tuberculosis, valvular heart disease, blood Sexual / multiple infarct dementia, wound healing, insomnia, arthritis, pituitary hormone secretion insufficiency [eg, prolactin secretion insufficiency (eg, ovarian hypofunction, seminal vesicle development, climacteric disorder, hypothyroidism, etc.)], manure It can be diagnosed that there is a high possibility of having uremia, neurodegenerative disease, etc. (especially anorexia nervosa etc.) or a possibility of suffering in the future.
In addition, when excessive expression of mRNA is detected by Northern hybridization, for example, obesity [eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulinar obesity] , Hyperplasmic obesity, hypophyseal adiposity, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity, symptomatic Obesity (symptomatic obesity), childhood obesity (infantile obesity), upper body obesity, dietary obesity, hypogonadal obesity, systemic mastocytosis , Simple obesity, central obesity, etc.], hyperphagia, pituitary gland tumor, diencephalon tumor, menstrual abnormalities, autoimmune disease, prolactinoma, infertility , Impotence, amenorrhea, milk leakage, acromegaly, Chiari Frommer syndrome, Argonz del Castillo syndrome, Forbes Albright syndrome, lymphoma, Sheehan syndrome, spermatogenesis (especially obesity, etc.) It can be diagnosed as likely or likely to be affected in the future.
[0079]
(5) Medicine containing antisense DNA
An antisense DNA that can complementarily bind to the DNA of the present invention and suppress the expression of the DNA is, for example, obesity [eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, Hyperinsulinar obesity, hyperplasmic obesity, hypophyseal adiposity, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity Hypobaric obesity, symptomatic obesity, infantile obesity, upper body obesity, dietary obesity, hypogonadal obesity, Systemic mastocytosis, simple obesity, central obesity, etc.], hyperphagia, pituitary gland tumor, diencephalon tumor, menstrual abnormality, autoimmune disease , Prolactin Mammary, infertility, impotence, amenorrhea, milk leakage, acromegaly, Chiari Frommer syndrome, Argonz del Castillo syndrome, Forbes Albright syndrome, lymphoma, Sheehan syndrome, spermatogenesis (especially obesity, etc.) ) And the like.
[0080]
For example, when the antisense DNA is used, the antisense DNA can be carried out according to conventional means after being inserted alone or into a suitable vector such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector, or the like. The antisense DNA can be formulated as it is or with a physiologically recognized carrier such as an adjuvant for promoting intake, and can be administered by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
Furthermore, the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence and expression status of the DNA of the present invention in tissues and cells.
[0081]
(6) Medicament containing the antibody of the present invention
The antibody of the present invention having the action of neutralizing the activity of the peptide of the present invention is, for example, obesity [eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulinarism (hyperinsulinar obesity), hyperplasmic obesity, hypophyseal adiposity, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity, Symptomatic obesity, infantile obesity, upper body obesity, dietary obesity, hypogonadal obesity, systemic mastocytosis mastocytosis), simple obesity, central obesity, etc.], hyperphagia, pituitary gland tumor, diencephalon tumor, menstrual abnormality, autoimmune disease, prolactinoma, infertility, impotence ,Nothing Preventive and therapeutic drugs for menstrual disease, milk leakage, acromegaly, Chiari-Flommel syndrome, Argonz del Castillo syndrome, Forbes-Albright syndrome, lymphoma, Sheehan syndrome, spermatogenesis abnormalities (especially obesity, etc.) It can be used as a pharmaceutical.
[0082]
The therapeutic / prophylactic agent for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention can be used as a liquid or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form as a human or mammal (eg, rat, rabbit, sheep, pig, cow, cat, Dogs, monkeys, etc.) orally or parenterally. The dose varies depending on the administration subject, target disease, symptom, administration route, etc., for example, when used for the treatment and prevention of adult obese patients, the antibody of the present invention is used as a single dose, Usually about 0.01 to 20 mg / kg body weight, preferably about 0.1 to 10 mg / kg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mg / kg body weight, about 1 to 5 times a day, preferably 1 day a day. It is convenient to administer about 3 times by intravenous injection. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent amount can be administered. If symptoms are particularly severe, the dose may be increased according to the symptoms.
The antibody of the present invention can be administered per se or as an appropriate pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition used for the administration comprises the above or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient. Such compositions are provided as dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
That is, for example, compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules). Syrups, emulsions, suspensions and the like. Such a composition is produced by a method known per se, and contains a carrier, diluent or excipient usually used in the pharmaceutical field. For example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
[0083]
As a composition for parenteral administration, for example, an injection, a suppository and the like are used, and the injection is a dosage form such as an intravenous injection, a subcutaneous injection, an intradermal injection, an intramuscular injection, or an infusion. Is included. Such an injection is prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above-described antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injections. As an aqueous solution for injection, for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants are used, and appropriate solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants [eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)] and the like may be used in combination. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule. A suppository used for rectal administration is prepared by mixing the above-described antibody or a salt thereof with a normal suppository base.
The above oral or parenteral pharmaceutical compositions are conveniently prepared in dosage unit form to suit the dosage of the active ingredient. Examples of dosage forms of such dosage units include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 5 to 500 mg, especially 5 to 100 mg for injections, for each dosage unit dosage form. Other dosage forms preferably contain 10 to 250 mg of the above antibody.
Each of the above-described compositions may contain other active ingredients as long as they do not cause an unfavorable interaction by blending with the antibody.
[0084]
(7) DNA transfer animals
The present invention includes a DNA encoding a foreign peptide of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention). A human mammal is provided.
That is, the present invention
(1) a non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof,
(2) the animal according to (1), wherein the non-human mammal is a rodent;
(3) The animal according to (2), wherein the rodent is a mouse or a rat, and
(4) Provided is a recombinant vector containing the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof and capable of being expressed in mammals.
A non-human mammal having an exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof (hereinafter abbreviated as a DNA-transferred animal of the present invention) can be used for embryos including unfertilized eggs, fertilized eggs, spermatozoa and primordial cells thereof. Preferably, at the stage of embryonic development in non-human mammal development (more preferably at the single cell or fertilized egg cell stage and generally prior to the 8-cell stage), the calcium phosphate method, electric pulse method, lipofection method, aggregation method, It can be produced by transferring the target DNA by the microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method or the like. Further, by the DNA transfer method, the target exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, living organs, tissue cells, etc., and can be used for cell culture, tissue culture, etc. The DNA-transferred animal of the present invention can also be produced by fusing the above-mentioned embryo cells with a cell fusion method known per se.
Examples of non-human mammals include cows, pigs, sheep, goats, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats and the like. Among them, rodents, especially mice (for example, C57BL / 6 strain, DBA2 strain, etc. as pure strains) are relatively short in terms of ontogeny and biological cycle from the viewpoint of creating a disease animal model system, and are easy to reproduce. As a system, B6C3F 1 System, BDF 1 System, B6D2F 1 Strain, BALB / c strain, ICR strain, etc.) or rat (for example, Wistar, SD, etc.) is preferred.
Examples of the “mammal” in the recombinant vector that can be expressed in the mammal include humans and the like in addition to the above non-human mammals.
[0085]
The exogenous DNA of the present invention is not the DNA of the present invention inherently possessed by a non-human mammal but the DNA of the present invention once isolated and extracted from the mammal.
Examples of the mutant DNA of the present invention include those in which a mutation (for example, mutation or the like) has occurred in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, addition of a base, deletion, substitution to another base, etc. The resulting DNA is used, and abnormal DNA is also included.
The abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal peptide of the present invention. For example, a DNA that expresses a peptide that suppresses the function of the normal peptide of the present invention is used.
The exogenous DNA of the present invention may be derived from mammals of the same or different species as the target animal. In transferring the DNA of the present invention to a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a DNA construct bound downstream of a promoter that can be expressed in animal cells. For example, when transferring the human DNA of the present invention, expression of DNA derived from various mammals (for example, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) having the DNA of the present invention having high homology with the human DNA of the present invention. The DNA of the present invention is highly expressed by microinjecting a DNA construct (eg, a vector, etc.) in which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters into a fertilized egg of a target mammal, such as a mouse fertilized egg. DNA transfer mammals can be created.
[0086]
Examples of the expression vector of the peptide of the present invention include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, bacteriophages such as λ phage, retroviruses such as Moloney leukemia virus, animal viruses such as vaccinia virus and baculovirus. Etc. are used. Of these, plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis or plasmids derived from yeast are preferably used.
Examples of promoters that regulate the above DNA expression include: (1) promoters of DNA derived from viruses (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moloney leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.); ▼ Promoters derived from various mammals (human, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.), such as albumin, insulin II, uroplakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acidity Protein, glutathione S-transferase, platelet-derived growth factor β, keratin K1, K10 and K14, collagen type I and type II, cyclic AMP-dependent protein kinase βI subunit, dystro Fin, tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor tyrosine kinase (generally abbreviated as Tie2), sodium potassium adenosine 3 kinase (Na, K-ATPase), neurofilament light chain, metallothionein I and IIA, metalloproteinase 1 tissue inhibitor, MHC class I antigen (H-2L), H-ras, renin, dopamine β-hydroxylase, thyroid peroxidase (TPO), peptide chain elongation factor 1α (EF-1α), β actin , Α and β myosin heavy chain, myosin light chain 1 and 2, myelin basic protein, thyroglobulin, Thy-1, immunoglobulin, heavy chain variable region (VNP), serum amyloid P component, myoglobin, troponin C, smooth muscle α Ak Down, pre-pro-enkephalin A, such as a promoter, such as vasopressin is used. Among these, a cytomegalovirus promoter capable of being highly expressed throughout the body, a human peptide chain elongation factor 1α (EF-1α) promoter, human and chicken β-actin promoters, and the like are preferable.
The vector preferably has a sequence (generally called a terminator) that terminates transcription of the target messenger RNA in a DNA-transferred mammal. For example, the sequence of each DNA derived from viruses and various mammals The SV40 terminator of simian virus or the like is preferably used.
[0087]
In addition, the splicing signal of each DNA, enhancer region, part of intron of eukaryotic DNA, etc. 5 ′ upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or the translation region for the purpose of further expressing the target foreign DNA It is also possible to connect it 3 'downstream of the target.
The normal translation region of the peptide of the present invention includes liver, kidney, thyroid cell, fibroblast-derived DNA derived from humans or various mammals (eg, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.) and commercially available DNA. As a raw material, complementary DNA prepared by a known method as a whole or a part of genomic DNA or from RNA derived from liver, kidney, thyroid cells, or fibroblasts can be obtained. In addition, exogenous abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating a normal peptide translation region obtained from the cells or tissues described above by a point mutagenesis method.
The translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a metastasized animal by an ordinary DNA engineering technique in which it is linked downstream of the promoter and optionally upstream of the transcription termination site.
Transfer of the foreign DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the subject mammal. The presence of the exogenous DNA of the present invention in the embryo cells of the produced animal after the DNA transfer indicates that all the progeny of the produced animal retain the exogenous DNA of the present invention in all the germ cells and somatic cells. means. The offspring of this type of animal that has inherited the foreign DNA of the present invention has the foreign DNA of the present invention in all germ cells and somatic cells.
The non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred can be subcultured in a normal breeding environment as the DNA-bearing animal after confirming that the exogenous DNA is stably retained by mating. .
The transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be excessively present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. Excessive exogenous DNA of the present invention is present in the germ cells of the produced animal after DNA transfer. This means that all the offspring of the produced animal have the exogenous DNA of the present invention in all the germ cells and somatic cells. Means. The offspring of this type of animal that has inherited the foreign DNA of the present invention has an excess of the foreign DNA of the present invention in all germ cells and somatic cells.
By obtaining a homozygous animal having the introduced DNA in both homologous chromosomes and mating the male and female animals, all the offspring can be bred and passaged so as to have the DNA in excess.
[0088]
The non-human mammal having the normal DNA of the present invention has a high expression of the normal DNA of the present invention, and ultimately promotes the function of the endogenous normal DNA, thereby finally causing hyperfunction of the peptide of the present invention. It can develop and can be used as a disease model animal. For example, the normal DNA-transferred animal of the present invention can be used to elucidate the mechanism of hyperfunction of the peptide of the present invention and the diseases associated with the peptide of the present invention and to examine methods for treating these diseases. Is possible.
Further, since the mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released peptide of the present invention, it can be used in screening tests for therapeutic agents for diseases related to the peptide of the present invention. is there.
On the other hand, the non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as the DNA-bearing animal after confirming that the exogenous DNA is stably retained by mating. Furthermore, the target foreign DNA can be incorporated into the aforementioned plasmid and used as a raw material. A DNA construct with a promoter can be prepared by a normal DNA engineering technique. The abnormal DNA transfer of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the abnormal DNA of the present invention in the embryo cell of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all the germ cells and somatic cells. The offspring of this type of animal that has inherited the foreign DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. By obtaining a homozygous animal having the introduced DNA in both homologous chromosomes and mating the male and female animals, all the offspring can be bred and passaged so as to have the DNA.
[0089]
The non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention has a high expression of the abnormal DNA of the present invention, and finally inhibits the function of the endogenous normal DNA, thereby finally inactivating the functional inactive form of the peptide of the present invention. It may become refractory and can be used as a model animal for the disease state. For example, by using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the functional inactive refractory of the peptide of the present invention and to examine a method for treating this disease.
Further, as a specific applicability, the abnormal DNA high-expressing animal of the present invention exhibits the function inhibition (dominant negative action) of the normal peptide by the abnormal peptide of the present invention in the functional inactive refractory of the peptide of the present invention. It becomes a model to be solved.
In addition, since the mammal to which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released peptide of the present invention, it is also used in a therapeutic drug screening test for the peptide of the present invention or a functionally inactive refractory of the peptide. Is possible.
Further, as other applicability of the above-mentioned two kinds of DNA transfer animals of the present invention, for example,
(1) Use as a cell source for tissue culture,
(2) Peptides specifically expressed or activated by the peptide of the present invention by directly analyzing DNA or RNA in the tissue of the DNA-transferred animal of the present invention or by analyzing peptide tissue expressed by the DNA Analysis of the relationship with
(3) Cell of tissue having DNA is cultured by a standard tissue culture technique, and using these, research on the function of cells from tissue generally difficult to cultivate,
(4) Screening for drugs that enhance cell function by using the cells described in (3) above, and
(5) Isolation and purification of the mutant peptide of the present invention and production of an antibody thereof can be considered.
Furthermore, using the DNA-transferred animal of the present invention, clinical symptoms of diseases related to the peptide of the present invention, including functional inactive refractories of the peptide of the present invention, can be examined, and the peptide of the present invention More detailed pathological findings in each organ of the disease model related to the disease can be obtained, and it is possible to contribute to the development of a new treatment method and further to the study and treatment of secondary diseases caused by the disease.
Moreover, each organ can be taken out from the DNA-transferred animal of the present invention, and after minced, it is possible to obtain free DNA-transferred cells, culture them, or systematize the cultured cells with a proteolytic enzyme such as trypsin. . Furthermore, the peptide-producing cells of the present invention can be identified, their relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or their signal transduction mechanisms can be investigated, and their abnormalities can be investigated. It becomes an effective research material for.
Furthermore, in order to develop therapeutic agents for diseases related to the peptide of the present invention, including the functionally inactive refractory of the peptide of the present invention, using the DNA-transferred animal of the present invention, the above-described test method and quantification are performed. It is possible to provide an effective and rapid screening method for a therapeutic agent for the disease using a method or the like. Moreover, it is possible to examine and develop a DNA therapy for a disease associated with the peptide of the present invention using the DNA-transferred animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention.
[0090]
(8) Knockout animals
The present invention provides a non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated and the DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention.
That is, the present invention
(1) a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated,
(2) The embryonic stem cell according to (1), wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, β-galactosidase gene derived from E. coli),
(3) The embryonic stem cell according to (1), which is neomycin resistant,
(4) The embryonic stem cell according to item (1), wherein the non-human mammal is a rodent.
(5) The embryonic stem cell according to (4), wherein the rodent is a mouse,
(6) the DNA expression-deficient non-human mammal in which the DNA of the present invention is inactivated,
(7) The DNA can be inactivated by introducing a reporter gene (eg, β-galactosidase gene derived from E. coli), and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention (6) The non-human mammal according to Item,
(8) The non-human mammal according to (6), wherein the non-human mammal is a rodent.
(9) The non-human mammal according to item (8), wherein the rodent is a mouse, and
(10) A screening method for a compound or a salt thereof that promotes or inhibits promoter activity against the DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to the animal according to item (7) and detecting the expression of a reporter gene I will provide a.
The non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated refers to suppressing the DNA expression ability by artificially adding mutation to the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, or By substantially losing the activity of the peptide of the present invention encoded by the DNA, the DNA has substantially no ability to express the peptide of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the knockout DNA of the present invention). ) Non-human mammal embryonic stem cells (hereinafter abbreviated as ES cells).
As the non-human mammal, the same ones as described above are used.
As a method for artificially adding a mutation to the DNA of the present invention, for example, a part or all of the DNA sequence can be deleted and another DNA can be inserted or replaced by a genetic engineering technique. With these mutations, for example, the knockout DNA of the present invention may be prepared by shifting the reading frame of codons or destroying the function of the promoter or exon.
[0091]
Specific examples of non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention is inactivated (hereinafter abbreviated as the DNA inactivated ES cell of the present invention or the knockout ES cell of the present invention) A DNA of the present invention possessed by a non-human mammal is isolated, and a neomycin resistance gene, a drug resistance gene typified by a hygromycin resistance gene, or lacZ (β-galactosidase gene), cat (chloramphenicol acetyl) Inserting a reporter gene typified by a transferase gene) or the like, or inserting a DNA sequence (for example, a polyA addition signal) that terminates the transcription of the gene into an intron between exons, By preventing the synthesis of complete messenger RNA As a result, a DNA strand having a DNA sequence constructed so as to disrupt the gene (hereinafter abbreviated as a targeting vector) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination, and the obtained ES cell Southern hybridization analysis using the DNA sequence of the present invention or the vicinity thereof as a probe, or PCR method using the DNA sequence of the targeting vector and the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention used for the preparation of the targeting vector as primers And can be obtained by selecting the knockout ES cell of the present invention.
In addition, as the original ES cell for inactivating the DNA of the present invention by homologous recombination method, for example, those already established as described above may be used, or according to the known Evans and Kaufma method. It may be newly established. For example, in the case of mouse ES cells, currently 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is unclear, an alternative purely immunologically genetic background For example, for the purpose of obtaining ES cells with clear clarification, for example, B57 improved by reducing the number of eggs collected in C57BL / 6 mice and C57BL / 6 by crossing with DBA / 2 1 Mouse (F of C57BL / 6 and DBA / 2 1 ) Can be used well. BDF 1 In addition to the advantage that the number of eggs collected is high and the eggs are strong, the mouse has C57BL / 6 mice as a background. Therefore, when ES cells obtained using these mice are used to produce pathological model mice, C57BL / 6 mice can be advantageously used in that the genetic background can be changed to C57BL / 6 mice by backcrossing.
In addition, when establishing ES cells, blastocysts on the 3.5th day after fertilization are generally used, but in addition to this, many blastocysts can be efficiently obtained by collecting 8-cell embryos and culturing them to blastocysts. Early embryos can be obtained.
Although both male and female ES cells may be used, male ES cells are usually more convenient for producing germline chimeras. In addition, it is desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce troublesome culture work.
[0092]
One example of a method for determining the sex of an ES cell is a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR. Using this method, it has traditionally been about 10 times for karyotype analysis. 6 In contrast to the number of cells required, the number of ES cells of about 1 colony (about 50) is sufficient, so the primary selection of ES cells in the early stage of culture can be performed by male / female discrimination. Yes, the early labor of the culture can be greatly reduced by enabling the selection of male cells at an early stage.
The secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method. The number of chromosomes of the obtained ES cell is preferably 100% of the normal number. However, if it is difficult due to physical operations at the time of establishment, the gene of the ES cell is knocked out, and then normal cells (for example, chromosomes in mice) It is desirable to clone again into cells where the number is 2n = 40.
The embryonic stem cell line obtained in this way is usually very proliferative, but it tends to lose its ontogenic ability, so it needs to be subcultured carefully. For example, in a carbon dioxide incubator in the presence of LIF (1-10000 U / ml) on a suitable feeder cell such as STO fibroblast (preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen, 5% Culturing is carried out by a method such as culturing at about 37 ° C. with carbon dioxide gas, 90% air, and at the time of passage, for example, a trypsin / EDTA solution (usually 0.001-0.5% trypsin / 0.1-5 mM EDTA, Preferably, the cells are converted into single cells by treatment with about 0.1% trypsin / 1 mM EDTA, and seeded on newly prepared feeder cells. Such passage is usually carried out every 1-3 days. At this time, it is desirable to observe the cells, and when morphologically abnormal cells are found, the cultured cells should be discarded.
ES cells can be differentiated into various types of cells such as parietal muscle, visceral muscle, and myocardium by monolayer culture to high density or suspension culture until a cell conglomerate is formed under appropriate conditions. [MJ Evans and MH Kaufman, Nature 292, 154, 1981; GR Martin Proceedings of National Academy of Sciences USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 78, 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journal of Embrology and Experimental Morphology, 87, 27, 1985], ES cells of the present invention. The DNA expression-deficient cells of the present invention obtained by differentiation are useful in cell biology of the peptide of the present invention or the receptor protein of the present invention in vitro.
[0093]
The DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention can be distinguished from normal animals by measuring the mRNA level of the animal using a known method and comparing the expression level indirectly.
As the non-human mammal, the same ones as described above are used.
The DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention is a DNA in which, for example, a targeting vector prepared as described above is introduced into mouse embryonic stem cells or mouse egg cells, and the DNA of the targeting vector of the present invention is inactivated by the introduction. The DNA of the present invention can be knocked out by homologous recombination in which the sequence replaces the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by gene homologous recombination.
A cell in which the DNA of the present invention is knocked out is obtained by analyzing the DNA sequence of the Southern hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence of or near the DNA of the present invention as a probe and the mouse used for the targeting vector of the present invention. It can be determined by analysis by a PCR method using a DNA sequence in a neighboring region other than DNA as a primer. When a non-human mammalian embryonic stem cell is used, a cell line in which the DNA of the present invention is inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cell is placed at a suitable time, for example, an 8-cell non-human mammal. It is injected into animal embryos or blastocysts, and the produced chimeric embryos are transplanted into the uterus of the non-human mammal that is pseudopregnant. The produced animal is a chimeric animal composed of both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially mutated DNA locus of the present invention. When some of the germ cells of the chimeric animal have the mutated DNA locus of the present invention, all tissues are artificially mutated from the population obtained by mating such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting an individual composed of the added cells having the DNA locus of the present invention, for example, by determining the coat color. The individual thus obtained is usually an individual with deficient hetero-expression of the peptide of the present invention, and the individual of the present invention with a hetero-expression deficient individual of the peptide or receptor protein of the present invention is crossed. Individuals with deficient homo-expression of the peptide of the invention or the receptor protein of the invention can be obtained.
[0094]
When using an egg cell, for example, a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into the chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into the nucleus of the egg cell by a microinjection method. Compared to mammals, it can be obtained by selecting those having a mutation at the DNA locus of the present invention by gene homologous recombination.
Thus, an individual in which the DNA of the present invention is knocked out can be reared in a normal breeding environment after confirming that the animal individual obtained by mating has also been knocked out.
In addition, germline acquisition and retention may be followed in accordance with conventional methods. That is, a homozygous animal having the inactivated DNA in both homologous chromosomes can be obtained by mating male and female animals possessed by the inactivated DNA. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in a state where there are one normal individual and a plurality of homozygous animals. By crossing male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and passaged.
The non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated is very useful for producing the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention.
In addition, since the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the peptide of the present invention, it is a model for diseases caused by inactivation of the biological activity of the peptide of the present invention. Therefore, it is useful for investigating the causes of these diseases and examining treatment methods.
[0095]
(8a) Screening method for compounds having therapeutic / preventive effects on diseases caused by deficiency or damage of the DNA of the present invention
The DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention can be used for screening a compound having a therapeutic / preventive effect on a disease caused by the deficiency or damage of the DNA of the present invention.
That is, the present invention is caused by the deficiency or damage of the DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention and observing and measuring changes in the animal. Provided is a screening method for a compound having a therapeutic / preventive effect on a disease or a salt thereof.
Examples of the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method include those described above.
Examples of the test compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc. These compounds are novel compounds. It may be a known compound.
Specifically, the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is treated with a test compound, compared with an untreated control animal, and tested using changes in each organ, tissue, disease symptom, etc. of the animal as an index. The therapeutic / prophylactic effect of the compound can be tested.
As a method for treating a test animal with a test compound, for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like. The dosage of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
[0096]
For example, anorexia, hypertension, autoimmune disease, heart failure, cataract, glaucoma, acute bacterial meningitis, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, acute viral encephalitis, adult respiratory distress syndrome, alcoholic hepatitis, Alzheimer's disease, asthma, arteriosclerosis , Atopic dermatitis, bacterial pneumonia, bladder cancer, fracture, breast cancer, bulimia, bulimia, burn healing, cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic pancreatitis, cirrhosis, colon Cancer (colon / rectal cancer), Crohn's disease, dementia, diabetic complications, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, gastritis, Helicobacter pylori infection, liver failure, hepatitis A, B Hepatitis C, hepatitis C, hepatitis, herpes simplex virus infection, varicella-zoster virus infection, Hodgkin's disease, AIDS infection, human papillomavirus infection, high calcium Disease, hypercholesterolemia, hyperglyceridemia, hyperlipidemia, infection, influenza infection, insulin-dependent diabetes mellitus (type I), invasive staphylococcal infection, malignant melanoma, cancer metastasis, multiple occurrence Myeloma, allergic rhinitis, nephritis, non-Hodgkin's lymphoma, non-insulin dependent diabetes mellitus (type II), non-small cell lung cancer, organ transplantation, osteoarthritis, osteomalacia, osteopenia, osteoporosis, ovarian cancer, Bone Pechet disease, peptic ulcer, peripheral vascular disease, prostate cancer, reflux esophagitis, renal failure, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, severe systemic fungal infection, small cell lung cancer, spinal cord injury, Gastric cancer, systemic lupus erythematosus, transient ischemic attack, tuberculosis, valvular disease, vascular / multiple infarct dementia, wound healing, insomnia, arthritis, pituitary hormone secretion deficiency [eg, prolacti Treatment / preventive effects on hyposecretion (eg, hypoovarian function, seminal vesicle development, menopause, hypothyroidism, etc.), urine, uremia, or neurodegenerative diseases (especially anorexia) In the case of screening for a compound having a glucose tolerance treatment, the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is subjected to a glucose tolerance treatment, and a test compound is administered before or after the glucose tolerance treatment, and the amount of food intake, blood glucose level, body weight change, etc. Is measured over time.
[0097]
In the screening method, when a test compound is administered to a test animal, the test compound is added when the food intake etc. of the test animal is increased by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more. It can be selected as a compound having a therapeutic / prophylactic effect on the above-mentioned diseases.
The compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and has a therapeutic / prophylactic effect on a disease caused by a deficiency or damage of the peptide of the present invention. It can be used as a medicine such as a safe and low-toxic therapeutic / prophylactic agent. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used as well.
The compound obtained by the screening method may form a salt. Examples of the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkali metals, etc.). And the like, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferred. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, And salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.
A medicament containing the compound obtained by the screening method or a salt thereof can be produced in the same manner as the aforementioned medicament containing the peptide of the present invention.
Since the preparation thus obtained is safe and low toxic, it can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
Although the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc., for example, when the compound is administered orally, generally in an anorexic patient (with a body weight of 60 kg) The compound is administered at about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc., but for example, the compound is usually administered to an anorexic patient (as 60 kg) in the form of an injection. In this case, it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound per day by intravenous injection. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
[0098]
(8b) Screening method for compounds that promote or inhibit the activity of the promoter for the DNA of the present invention
The present invention provides a compound that promotes or inhibits the activity of a promoter for the DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention and detecting the expression of a reporter gene, or a compound thereof A salt screening method is provided.
In the above screening method, the DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention is inactivated by introducing a reporter gene among the above-mentioned DNA expression-deficient non-human mammals of the present invention, A gene capable of expressing the reporter gene under the control of a promoter for the DNA of the present invention is used.
Examples of the test compound are the same as described above.
As the reporter gene, the same ones as described above are used, and a β-galactosidase gene (lacZ), a soluble alkaline phosphatase gene, a luciferase gene, or the like is preferable.
In non-human mammals with deficient DNA expression of the present invention in which the DNA of the present invention is replaced with a reporter gene, the reporter gene exists under the control of the promoter for the DNA of the present invention, so the expression of the substance encoded by the reporter gene is traced. By doing so, the activity of the promoter can be detected.
For example, when a part of the DNA region encoding the peptide of the present invention is substituted with the β-galactosidase gene (lacZ) derived from Escherichia coli, the tissue of the present invention expresses in place of the peptide of the present invention. Β-galactosidase is expressed. Therefore, for example, by staining with a reagent that is a substrate for β-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside (X-gal), the present invention can be easily performed. It is possible to observe the expression state of the peptide in vivo. Specifically, the peptide-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with glutaraldehyde, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-gal at room temperature or around 37 ° C. Then, after reacting for about 30 minutes to 1 hour, the tissue specimen is washed with a 1 mM EDTA / PBS solution to stop the β-galactosidase reaction and observe the coloration. Moreover, you may detect mRNA which codes lacZ according to a conventional method.
The compound obtained by using the screening method or a salt thereof is a compound selected from the above-described test compounds, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity for the DNA of the present invention.
The compound obtained by the screening method may form a salt. Examples of the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids) and bases (eg, organic acids). In particular, physiologically acceptable acid addition salts are preferred. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, And salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.
[0099]
Since the compound or its salt that promotes the promoter activity for the DNA of the present invention can promote the expression of the peptide of the present invention and promote the function of the peptide, for example, anorexia, hypertension, autoimmune disease, heart failure Cataract, glaucoma, acute bacterial meningitis, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, acute viral encephalitis, adult respiratory distress syndrome, alcoholic hepatitis, Alzheimer's disease, asthma, arteriosclerosis, atopic dermatitis, bacterial pneumonia, bladder cancer , Fracture, breast cancer, bulimia, bulimia, burn healing, cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic pancreatitis, cirrhosis, colon cancer (colon / rectal cancer), Crohn's disease, Dementia, diabetic complications, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, gastritis, Helicobacter pylori infection, liver failure, hepatitis A, type B Inflammation, hepatitis C, hepatitis, herpes simplex virus infection, varicella-zoster virus infection, Hodgkin's disease, AIDS infection, human papillomavirus infection, hypercalcemia, hypercholesterolemia, hyperglyceridemia, high fat , Infection, influenza infection, insulin-dependent diabetes mellitus (type I), invasive staphylococcal infection, malignant melanoma, cancer metastasis, multiple myeloma, allergic rhinitis, nephritis, non-Hodgkin's lymphoma , Non-insulin dependent diabetes mellitus (type II), non-small cell lung cancer, organ transplantation, osteoarthritis, osteomalacia, osteopenia, osteoporosis, ovarian cancer, bone Pechet disease, peptic ulcer, peripheral vascular disease, prostate Cancer, reflux esophagitis, renal failure, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, severe systemic fungal infection, small cell lung cancer, spinal cord injury, gastric cancer , Systemic lupus erythematosus, transient ischemic attack, tuberculosis, valvular heart disease, vascular / multiple infarct dementia, wound healing, insomnia, arthritis, pituitary hormone secretion deficiency [eg, prolactin deficiency (eg, ovarian function) Hypoxia, seminal vesicle growth failure, climacteric disorder, hypothyroidism, etc.)), urine, uremia, or neurodegenerative diseases (especially anorexia), etc. It is useful as a medicine such as an appetite (feeding) enhancer).
In addition, since the compound or its salt that inhibits the promoter activity against the DNA of the present invention can inhibit the expression of the peptide of the present invention and inhibit the function of the peptide, for example, obesity [eg, malignant mast cell Malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulinar obesity, hyperplasmic obesity, hypophyseal adiposity, hypoplasmic obesity ), Hypothyroid obesity, hypothalamic obesity, symptomatic obesity, infantile obesity, upper body obesity, dietary obesity ( alimentary obesity, hypogonadal obesity, systemic mastocytosis, simple obesity, central obesity, etc.], hyperphagia, Pituitary gland tumor, diencephalon tumor, menstrual abnormality, autoimmune disease, prolactinoma, infertility, impotence, amenorrhea, milk leakage, acromegaly, Chiari Frommer syndrome, Argonz del Castillo syndrome, Forbes Albright It is useful as a prophylactic / therapeutic agent such as a preventive / therapeutic agent (prolactin production inhibitor) for syndrome, lymphoma, Sheehan's syndrome, spermatogenesis, etc., preferably as a prophylactic / therapeutic agent for obesity, hyperphagia, etc. is there.
Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used as well.
[0100]
The medicament containing the compound obtained by the screening method or a salt thereof can be produced in the same manner as the aforementioned medicament containing the peptide of the present invention or a salt thereof.
Since the preparation thus obtained is safe and low toxic, it can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc. For example, when a compound that promotes the promoter activity against the DNA of the present invention is orally administered, generally the adult (body weight) In anorexic patients (as 60 kg), the compound is administered at about 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg per day. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc. For example, the compound that promotes the promoter activity against the DNA of the present invention is usually administered in the form of an injection (in adults) When administered to anorexic patients (as 60 kg), about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound per day is intravenously injected. It is convenient to administer. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
On the other hand, for example, when a compound that inhibits the promoter activity against the DNA of the present invention is orally administered, generally in an adult (with a body weight of 60 kg) obese patients, about 0.1 to 100 mg of the compound per day, Preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg is administered. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, the target disease, etc. For example, a compound that inhibits the promoter activity against the DNA of the present invention is usually administered in the form of an injection (in adults) When administered to an obese patient (as 60 kg), about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound per day is intravenously injected. It is convenient to administer. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
Thus, the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is extremely useful in screening for compounds or salts thereof that promote or inhibit the activity of the promoter for the DNA of the present invention. It can greatly contribute to the investigation of the causes of various diseases caused or the development of preventive / therapeutic drugs.
In addition, using DNA containing the promoter region of the peptide of the present invention, genes encoding various proteins are ligated downstream thereof, and this is injected into an egg cell of an animal to produce a so-called transgenic animal (gene transgenic animal). Once prepared, the peptide can be specifically synthesized and its action in the living body can be examined. Furthermore, if a suitable reporter gene is bound to the above promoter part and a cell line in which it is expressed is established, a low molecular weight compound capable of specifically promoting or suppressing the ability of the peptide of the present invention to be produced in the body. Can be used as a search system.
[0101]
Furthermore, the use of bovine GRP7 and bovine GPR8 (hereinafter abbreviated as bovine GPR7 / 8) of the present invention will be described.
As long as the antibody against bovine GPR7 / 8 of the present invention (hereinafter sometimes simply referred to as bovine GPR7 / 8 antibody) is an antibody that can recognize the antibody against bovine GPR7 / 8 of the present invention, polyclonal antibodies and monoclonal antibodies Either may be sufficient. The antibody of the present invention can be produced using bovine GPR7 / 8 of the present invention as an antigen according to a method for producing an antibody or antiserum known per se. Specifically, it can be produced in the same manner as the antibody against the peptide of the present invention described above.
[0102]
An antisense DNA having a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to DNA encoding bovine GPR7 / 8 of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as bovine GPR7 / 8 DNA) (hereinafter referred to as bovine GPR7 / 8 is sometimes abbreviated as “antisense DNA”, and has a base sequence complementary to or substantially complementary to the bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention, and has the action of suppressing the expression of the DNA. Any antisense DNA can be used.
The base sequence substantially complementary to the bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention is, for example, the entire base sequence of the base sequence complementary to the bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention) or Examples thereof include base sequences having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more with a partial base sequence. In particular, of the entire base sequence of the complementary strand of the bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention, the complementary strand of the base sequence of the portion encoding the N-terminal site of the bovine GPR7 / 8 of the present invention (eg, the base sequence near the start codon). Antisense DNA having about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is suitable. These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer.
(1) Bovine GPR7 / 8 of the present invention, (2) Bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention, (3) Bovine GPR7 / 8 antibody of the present invention, and (4) Bovine GPR7 / 8 antisense DNA Will be explained.
[0103]
(1) Therapeutic / preventive agent for various diseases involving bovine GPR7 / 8 of the present invention
Bovine GPR7 / 8 of the present invention is a receptor for the peptide of the present invention as shown in Example 25 described later.
Accordingly, when the bovine GPR7 / 8 of the present invention or the bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention is abnormal or deficient, for example, anorexia, hypertension, autoimmune disease, heart failure, cataract, glaucoma, acute bacteria Meningitis, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, acute viral encephalitis, adult respiratory distress syndrome, alcoholic hepatitis, Alzheimer's disease, asthma, arteriosclerosis, atopic dermatitis, bacterial pneumonia, bladder cancer, fracture, breast cancer, bulimia , Bulimia, burn healing, cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic pancreatitis, cirrhosis, colon cancer (colon / rectal cancer), Crohn's disease, dementia, diabetic complications, Diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, gastritis, Helicobacter pylori infection, liver failure, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis, herpes simplex Infection, varicella-zoster virus infection, Hodgkin's disease, AIDS infection, human papillomavirus infection, hypercalcemia, hypercholesterolemia, hyperglyceridemia, hyperlipidemia, infection, influenza infection, Insulin-dependent diabetes mellitus (type I), invasive staphylococcal infection, malignant melanoma, cancer metastasis, multiple myeloma, allergic rhinitis, nephritis, non-Hodgkin's lymphoma, non-insulin-dependent diabetes mellitus (type II) , Non-small cell lung cancer, organ transplantation, osteoarthritis, osteomalacia, osteopenia, osteoporosis, ovarian cancer, bone Pechet disease, peptic ulcer, peripheral vascular disease, prostate cancer, reflux esophagitis, renal failure, Rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, severe systemic fungal infection, small cell lung cancer, spinal cord injury, gastric cancer, systemic lupus erythematosus, transient cerebral ischemia Seizures, tuberculosis, valvular heart disease, vascular / multiple infarct dementia, wound healing, insomnia, arthritis, pituitary hormone secretion deficiency [eg, prolactin deficiency (eg, hypoovarian hypofunction, seminal vesicular growth failure, climacteric disorder, It is highly possible that various diseases such as hypothyroidism, etc.), urine, uremia, or neurodegenerative diseases (especially anorexia) may develop.
Therefore, the bovine GPR7 / 8 of the present invention and the bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention are, for example, pharmaceuticals (especially appetite (feeding) enhancers) and the like such as the therapeutic / preventive agents for various diseases described above (especially anorexia). ) Can be used.
[0104]
The bovine GPR7 / 8 of the present invention and the bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention can be used, for example, when there is a patient in which the bovine GPR7 / 8 of the present invention is reduced or deficient in vivo. / 8 DNA is administered to the patient and the bovine GPR7 / 8 of the present invention is expressed in vivo, and (b) the bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention is inserted into the cell to express the bovine GPR7 / 8 of the present invention. The role of the bovine GPR7 / 8 of the present invention in the patient is fully achieved, for example, by transplanting the cells into the patient or (c) administering the bovine GPR7 / 8 of the present invention to the patient. Or it can be exhibited normally.
When the bovine GPR7 / 8 or bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention is used as the above therapeutic / preventive agent, it can be produced and used in the same manner as the above-mentioned pharmaceutical containing the peptide of the present invention or the DNA of the present invention. it can.
[0105]
(2) Screening of drug candidate compounds for disease
(2-1) Screening method A
The screening method for the compound or its salt that changes the binding between the bovine GPR7 / 8 of the present invention and the peptide of the present invention is as described above.
(2-2) Screening method B
Next, a method for screening a compound that regulates the expression level of bovine GPR7 / 8 will be described.
Specifically, the screening method B of the present invention includes (i) each bovine GPR7 / 8 when cells or tissues capable of expressing bovine GPR7 / 8 are cultured in the presence and absence of the test compound. Is a method for screening a compound or a salt thereof that increases or decreases the expression level of bovine GPR7 / 8, which comprises measuring and comparing the expression level of bovine GPR7 / 8.
Examples of cells or tissues that can express bovine GPR7 / 8 include cells of humans and warm-blooded animals (eg, guinea pigs, rats, mice, chickens, rabbits, pigs, sheep, cows, monkeys, etc.) (eg, nerve cells, endocrine secretions). Cells, neuroendocrine cells, glial cells, pancreatic beta cells, bone marrow cells, hepatocytes, spleen cells, mesangial cells, epidermis cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells ( Eg macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes, dendritic cells), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, Osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, or stromal cells, or precursor cells of these cells, stem cells, cancer cells, etc.) or any tissue in which these cells are present, for example, the brain, each of the brain Position (eg, olfactory bulb, amygdala, basal cerebral sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum), spinal cord, pituitary gland, stomach, pancreas, kidney, liver, gonad, thyroid gland, gallbladder, bone marrow, adrenal gland , Skin, muscle, lung, gastrointestinal tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessel, heart, thymus, spleen, salivary gland, peripheral blood, prostate, testicle (testis), ovary, placenta, uterus, bone, cartilage, joint, skeleton A streak or the like may be used. In that case, a cell line or a primary culture system may be used. Moreover, you may use the transformant transformed with the recombinant vector containing DNA which codes the above-mentioned bovine GPR7 / 8.
The method for culturing cells capable of expressing bovine GPR7 / 8 is the same as the method for culturing transformants described above.
As a test compound, a DNA library or the like can be used in addition to the above-described test compound.
[0106]
The expression level of bovine GPR7 / 8 can be measured by a known method such as an immunochemical method using an antibody or the like. MRNA encoding bovine GPR7 / 8 can be measured by Northern hybridization, RT-PCR or TaqMan PCR. It can also measure by a well-known method using a method.
In order to compare the expression levels of mRNA by a hybridization method, a known method or a method similar thereto, for example, Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) Can be carried out according to the method described in the above.
Specifically, the amount of mRNA encoding bovine GPR7 / 8 is determined by measuring RNA extracted from cells according to a known method, DNA encoding bovine GPR7 / 8 or a part thereof, or bovine GPR7 / 8 of the present invention. This is carried out by contacting with an antisense polynucleotide and measuring the amount of mRNA bound to the DNA encoding bovine GPR7 / 8 or a part thereof or the bovine GPR7 / 8 antisense polynucleotide of the present invention. A DNA encoding bovine GPR7 / 8 or a part thereof or a bovine GPR7 / 8 antisense polynucleotide of the present invention is labeled with, for example, a radioisotope, a dye, etc. The amount of mRNA bound to a part or the bovine GPR7 / 8 antisense polynucleotide of the present invention can be easily measured. Examples of radioisotopes include 32 P, Three H and the like are used. Examples of the dye include fluorescein, FAM (PE Biosystems), JOE (PE Biosystems), TAMRA (PE Biosystems), ROX (PE Biosystems), and Cy5 (Amersham). ), Fluorescent dyes such as Cy3 (Amersham) are used.
The amount of mRNA is determined by converting RNA extracted from cells into cDNA by reverse transcriptase, and then using DNA encoding bovine GPR7 / 8 or a part thereof or bovine GPR7 / 8 antisense polynucleotide of the present invention as a primer. Can be performed by measuring the amount of cDNA amplified by PCR used as
Thus, a test compound that increases the amount of mRNA encoding bovine GPR7 / 8 can be selected as a compound having an activity to increase the expression level of bovine GPR7 / 8, and also encodes bovine GPR7 / 8. A test compound that reduces the amount of mRNA to be expressed can be selected as a compound having an activity of reducing the expression level of bovine GPR7 / 8.
[0107]
Furthermore, the present invention provides
(Ii) When a transformant transformed with a recombinant DNA in which a reporter gene is linked downstream of the promoter region or enhancer region of a gene encoding bovine GPR7 / 8 is cultured in the presence or absence of a test compound The present invention provides a method for screening a compound that promotes or inhibits the promoter activity, characterized by measuring and comparing the respective reporter activities.
As the reporter gene, for example, lacZ (β-galactosidase gene), chloramphenicol acetyltransferase (CAT), luciferase, growth factor, β-glucuronidase, alkaline phosphatase, green fluorescent protein (GFP), β-lactamase, etc. are used. It is done. By measuring the amount of the reporter gene product (eg, mRNA, protein) using a known method, the test compound that increases the amount of the reporter gene product controls the activity of the bovine GPR7 / 8 promoter or enhancer of the present invention. It can be selected as a compound having an action of (especially promoting), that is, a compound having an activity of increasing the expression level of bovine GPR7 / 8. Conversely, a test compound that decreases the amount of the reporter gene product has an activity of controlling (particularly inhibiting) the activity of the promoter or enhancer of bovine GPR7 / 8, that is, has an activity of reducing the expression level of bovine GPR7 / 8. It can be selected as a compound.
As the test compound, the same compounds as described above are used.
The transformant can be cultured in the same manner as the transformant.
The vector construction and assay method of the reporter gene can be performed according to known techniques (for example, Molecular Biotechnology 13, 29-43, 1999).
[0108]
A compound having an activity to increase the expression level of bovine GPR7 / 8 is a safe and low toxic pharmaceutical (for example, anorexia prophylaxis / treatment agent, appetite (feeding) enhancer, pituitary hormone secretion failure [eg, prolactin] It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for secretory insufficiency (eg, ovarian hypofunction, seminal vesicle growth failure, menopause, hypothyroidism, etc.)].
Compounds having activity to reduce the expression level of bovine GPR7 / 8 are obesity [eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulinar obesity, hyperplasma Obesity (hyperplasmic obesity), hypophyseal adiposity, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity, symptomatic obesity ( symptomatic obesity, infantile obesity, upper body obesity, dietary obesity, hypogonadal obesity, systemic mastocytosis, simpleness Obesity (simple obesity, central obesity, etc.), safe and low-toxic prophylactic / therapeutic agents such as hyperphagia, pituitary gland tumors, diencephalon tumors, menstrual abnormalities, autoimmune diseases, Prolactinoma, no Safe and low-toxic prophylaxis such as symptom, impotence, amenorrhea, milk leakage, acromegaly, Chiari Frommer syndrome, Argonz del Castillo syndrome, Forbes Albright syndrome, lymphoma, Sheehan syndrome, spermatogenesis -It is useful as a therapeutic agent (prolactin production inhibitor), preferably a safe and low-toxic preventive / therapeutic agent for obesity, hyperphagia and the like.
The compound or salt thereof obtained using the screening method B or screening kit of the present invention is, for example, a peptide, protein, non-peptide compound, synthetic compound, fermentation product, cell extract, plant extract, animal tissue extraction It is a compound selected from liquid, plasma and the like, and is a compound that promotes or inhibits the function of the peptide of the present invention.
As the salt of the compound, the same salts as those of the peptide of the present invention described above can be used.
When the compound obtained using the screening method B or screening kit of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, it is the same as the above-mentioned pharmaceutical containing a compound or its salt that changes the expression level of the peptide of the present invention. Can be manufactured and used.
[0109]
(3) Determination of bovine GPR7 / 8 of the present invention
Since the antibody of the present invention can specifically recognize the bovine GPR7 / 8 of the present invention, it is used for quantification of the bovine GPR7 / 8 of the present invention in a test solution, in particular, quantification by sandwich immunoassay. be able to.
That is, the present invention
(I) The bovine GPR7 / 8 antibody of the present invention is competitively reacted with the test solution and the labeled bovine GPR7 / 8 of the present invention, and the labeled bovine GPR7 of the present invention bound to the antibody A method for quantifying bovine GPR7 / 8 of the present invention in a test solution, characterized in that a ratio of / 8 is measured, and
(Ii) The test solution and the antibody of the present invention insolubilized on the carrier and the labeled another antibody of the present invention are reacted simultaneously or successively, and then the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier is measured. The method for quantifying bovine GPR7 / 8 of the present invention in a test solution is provided.
[0110]
In the quantification method of (ii) above, one antibody is an antibody that recognizes the N-terminus of bovine GPR7 / 8 of the present invention, and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminus of bovine GPR7 / 8 of the present invention. It is desirable that
In addition, the bovine GPR7 / 8 of the present invention can be quantified using the monoclonal antibody against the bovine GPR7 / 8 of the present invention, and detection by tissue staining or the like can also be performed. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or F (ab ′) of the antibody molecule. 2 , Fab ′, or Fab fractions may be used.
The quantification method of bovine GPR7 / 8 of the present invention using the bovine GPR7 / 8 antibody of the present invention is not particularly limited, and an antibody or antigen corresponding to the amount of antigen (for example, peptide amount) in the solution to be measured Alternatively, any measurement method can be used as long as it is a measurement method in which the amount of antibody-antigen complex is detected by chemical or physical means and calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. It may be used. For example, nephrometry, competition method, immunometric method and sandwich method are preferably used, but the sandwich method described later is particularly preferable in view of sensitivity and specificity.
[0111]
As a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, or the like is used. Examples of radioisotopes include [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C] and the like are used. As the enzyme, a stable enzyme having a large specific activity is preferable. For example, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used. As the fluorescent substance, for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used. As the luminescent substance, for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like are used. Furthermore, a biotin-avidin system can also be used for binding of an antibody or antigen and a labeling agent.
For insolubilization of an antigen or antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond that is usually used to insolubilize or immobilize a peptide or an enzyme may be used. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, or glass.
In the sandwich method, the test solution is reacted with the insolubilized bovine GPR7 / 8 monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further labeled with another bovine GPR7 / 8 monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction). Then, the amount of the bovine GPR7 / 8 of the present invention in the test solution can be quantified by measuring the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier. The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, or may be performed simultaneously or at different times. The labeling agent and the insolubilizing method can be the same as those described above. In the immunoassay by the sandwich method, the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity. May be.
[0112]
In the method for measuring bovine GPR7 / 8 of the present invention by the sandwich method of the present invention, the bovine GPR7 / 8 monoclonal antibody of the present invention used for the primary reaction and the secondary reaction binds to the bovine GPR7 / 8 of the present invention. Antibodies with different sites are preferably used. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminus of bovine GPR7 / 8 of the present invention, the antibody used in the primary reaction is Preferably, antibodies other than the C end, for example, the N end are recognized.
The bovine GPR7 / 8 antibody of the present invention can be used in measurement systems other than the sandwich method, for example, competitive method, immunometric method, nephrometry and the like.
In the competitive method, the antigen in the test solution and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated. (B / F separation), the amount of labeling of either B or F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified. In this reaction method, a soluble antibody is used as an antibody, B / F separation is performed using polyethylene glycol, a liquid phase method using a second antibody against the antibody, and a solid-phased antibody is used as the first antibody, or As the first antibody, a soluble one is used, and a solid phase method using a solid phase antibody as the second antibody is used.
In the immunometric method, the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated, or the antigen in the test solution is separated. Are reacted with an excess amount of labeled antibody, and then a solid phased antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the labeled amount of any phase is measured to quantify the amount of antigen in the test solution.
In nephrometry, the amount of insoluble precipitate produced as a result of the antigen-antibody reaction in a gel or solution is measured. Laser nephrometry using laser scattering is preferably used even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of precipitate is obtained.
In applying these individual immunological measurement methods to the quantification method of the present invention, special conditions, operations and the like are not required to be set. What is necessary is just to construct | assemble the measurement system of the bovine GPR7 / 8 of this invention, adding the usual technical consideration of those skilled in the art to the usual conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, it is possible to refer to reviews, books and the like.
For example, Hiroshi Irie “Radioimmunoassay” (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie “Sequential Radioimmunoassay” (published in Kodansha, 1979), “Enzyme Immunoassay” edited by Eiji Ishikawa et al. 53)), edited by Eiji Ishikawa et al. "Enzyme Immunoassay" (2nd edition) (Medical Shoin, published in 1982), edited by Eiji Ishikawa et al. "Enzyme Immunoassay" (3rd edition) (Medical Shoin, Showa) 62), “Methods in ENZYMOLOGY” Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), Id. Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), Id. Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), Id. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), ibid.Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibid.Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies) )) (Academic Press Issue) and the like can be referred to.
As described above, the bovine GPR7 / 8 antibody of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the bovine GPR7 / 8 antibody of the present invention.
[0113]
Furthermore, when a decrease in the concentration of bovine GPR7 / 8 of the present invention is detected by quantifying the concentration of bovine GPR7 / 8 of the present invention using the bovine GPR7 / 8 antibody of the present invention, for example, anorexia , Hypertension, autoimmune disease, heart failure, cataract, glaucoma, acute bacterial meningitis, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, acute viral encephalitis, adult respiratory distress syndrome, alcoholic hepatitis, Alzheimer's disease, asthma, arteriosclerosis, atopic skin Inflammation, bacterial pneumonia, bladder cancer, fracture, breast cancer, bulimia, bulimia, burn healing, cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic pancreatitis, cirrhosis, colon cancer (colon / Rectal cancer), Crohn's disease, dementia, diabetic complications, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, gastritis, Helicobacter pylori infection, liver failure, type A liver , Hepatitis B, hepatitis C, hepatitis, herpes simplex virus infection, varicella-zoster virus infection, Hodgkin's disease, AIDS infection, human papillomavirus infection, hypercalcemia, hypercholesterolemia, hyperglyceridemia , Hyperlipidemia, infection, influenza infection, insulin-dependent diabetes mellitus (type I), invasive staphylococcal infection, malignant melanoma, cancer metastasis, multiple myeloma, allergic rhinitis, nephritis, non Hodgkin's lymphoma, non-insulin-dependent diabetes mellitus (type II), non-small cell lung cancer, organ transplantation, osteoarthritis, osteomalacia, osteopenia, osteoporosis, ovarian cancer, bone Pechet disease, peptic ulcer, peripheral vascular disease , Prostate cancer, reflux esophagitis, renal failure, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, severe systemic fungal infection, small cell lung cancer, spinal cord injury , Gastric cancer, systemic lupus erythematosus, transient ischemic attack, tuberculosis, valvular heart disease, vascular / multiple infarct dementia, wound healing, insomnia, arthritis, pituitary hormone secretion failure [eg, prolactin secretion failure (eg, Ovarian dysfunction, seminal vesicle development failure, menopause, hypothyroidism, etc.)), manure, uremia, or neurodegenerative diseases (especially anorexia), or likely to suffer in the future Can be diagnosed.
When an increase in the concentration of bovine GPR7 / 8 of the present invention is detected, for example, obesity [eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulin obesity (hyperinsulinar obesity), hyperplasmic obesity, hypophyseal adiposity, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity ), Symptomatic obesity, infantile obesity, upper body obesity, dietary obesity, hypogonadal obesity, systemic mastocytosis (systemic mastocytosis), simple obesity, central obesity, etc.], hyperphagia, pituitary gland tumor, diencephalon tumor, menstrual abnormalities, autoimmune disease, prolactinoma, infertility , Impotence, Diseases such as amenorrhea, milk leakage, acromegaly, Chiari Frommer syndrome, Argonz del Castillo syndrome, Forbes Albright syndrome, lymphoma, Sheehan syndrome, spermatogenesis (especially obesity, etc.) Or it can be diagnosed that there is a high possibility of suffering in the future.
Further, the bovine GPR7 / 8 antibody of the present invention can be used for detecting the bovine GPR7 / 8 of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue. In addition, production of an antibody column used for purifying the bovine GPR7 / 8 of the present invention, detection of the bovine GPR7 / 8 of the present invention in each fraction during purification, bovine GPR7 / of the present invention in the test cells 8 can be used for analysis of behavior.
[0114]
(4) Gene diagnostic agent
The bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention can be used, for example, by using it as a probe in humans or warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, rabbits, birds, sheep, pigs, cows, horses, cats, dogs, monkeys, Etc.), it is possible to detect abnormalities (gene abnormalities) in the DNA or mRNA encoding the bovine GPR7 / 8 of the present invention. It is useful as a genetic diagnostic agent for increasing or overexpression.
The above-described genetic diagnosis using the bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention includes, for example, known Northern hybridization and PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Proc.・ Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, 2766-2770 (1989)) Can do.
For example, when decreased mRNA expression is detected by Northern hybridization, for example, anorexia, hypertension, autoimmune disease, heart failure, cataract, glaucoma, acute bacterial meningitis, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, acute viral encephalitis , Adult respiratory distress syndrome, alcoholic hepatitis, Alzheimer's disease, asthma, arteriosclerosis, atopic dermatitis, bacterial pneumonia, bladder cancer, fracture, breast cancer, bulimia, bulimia, burn healing, cervical cancer, Chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic pancreatitis, cirrhosis, colon cancer (colon / rectal cancer), Crohn's disease, dementia, diabetic complications, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy , Gastritis, Helicobacter pylori infection, liver failure, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis, herpes simplex virus infection, varicella zoster Luz infection, Hodgkin's disease, AIDS infection, human papillomavirus infection, hypercalcemia, hypercholesterolemia, hyperglyceridemia, hyperlipidemia, infection, influenza infection, insulin-dependent diabetes mellitus (type I) ), Invasive staphylococcal infection, malignant melanoma, cancer metastasis, multiple myeloma, allergic rhinitis, nephritis, non-Hodgkin's lymphoma, non-insulin dependent diabetes mellitus (type II), non-small cell lung cancer, organ Transplantation, osteoarthritis, osteomalacia, osteopenia, osteoporosis, ovarian cancer, bone Pechet disease, peptic ulcer, peripheral vascular disease, prostate cancer, reflux esophagitis, renal failure, rheumatoid arthritis, schizophrenia, Sepsis, septic shock, severe systemic fungal infection, small cell lung cancer, spinal cord injury, gastric cancer, systemic lupus erythematosus, transient ischemic attack, tuberculosis, valvular heart disease, blood vessel Sexual / multiple infarct dementia, wound healing, insomnia, arthritis, pituitary hormone secretion insufficiency [eg, prolactin secretion insufficiency (eg, ovarian hypofunction, seminal vesicle development, climacteric disorder, hypothyroidism, etc.)], manure It can be diagnosed that there is a high possibility of having uremia, neurodegenerative disease, etc. (especially anorexia nervosa, etc.) or a high possibility of suffering in the future.
In addition, when excessive expression of mRNA is detected by Northern hybridization, for example, obesity [eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulinar obesity] , Hyperplasmic obesity, hypophyseal adiposity, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity, symptomatic Obesity (symptomatic obesity), childhood obesity (infantile obesity), upper body obesity, dietary obesity, hypogonadal obesity, systemic mastocytosis , Simple obesity, central obesity, etc.], hyperphagia, pituitary gland tumor, diencephalon tumor, menstrual abnormalities, autoimmune disease, prolactinoma, infertility , Impotence, amenorrhea, milk leakage, acromegaly, Chiari Frommer syndrome, Argonz del Castillo syndrome, Forbes Albright syndrome, lymphoma, Sheehan syndrome, spermatogenesis (especially obesity, etc.) It can be diagnosed as likely or likely to be affected in the future.
[0115]
(5) Medicine containing bovine GPR7 / 8 antisense DNA
An antisense DNA that can complementarily bind to the bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention and suppress the expression of the DNA is, for example, obesity [eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity (exogenous obesity), hyperinsulinar obesity, hyperplasmic obesity, hypophyseal adiposity, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity Hypothalamic obesity, symptomatic obesity, infantile obesity, upper body obesity, dietary obesity, hypogonadal obesity obesity), systemic mastocytosis, simple obesity, central obesity, etc.], hyperphagia, pituitary gland tumors, diencephalon tumors, menstrual abnormalities, Autoimmune disease , Prolactinoma, infertility, impotence, amenorrhea, milk leakage, acromegaly, Chiari Frommer syndrome, Argonz del Castillo syndrome, Forbes Albright syndrome, lymphoma, Sheehan syndrome, spermatogenesis (especially obesity) Etc.) and the like.
For example, when the antisense DNA is used, the antisense DNA can be carried out according to conventional means after being inserted alone or into a suitable vector such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector, or the like. The antisense DNA can be formulated as it is or with a physiologically recognized carrier such as an adjuvant for promoting intake, and can be administered by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
Furthermore, the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence and expression of the bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention in tissues and cells.
[0116]
(6) A medicament containing the bovine GPR7 / 8 antibody of the present invention
The bovine GPR7 / 8 antibody of the present invention having the action of neutralizing the activity of bovine GPR7 / 8 of the present invention can be used, for example, for obesity [eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, Hyperinsulinar obesity, hyperplasmic obesity, hypophyseal adiposity, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity Hypobaric obesity, symptomatic obesity, infantile obesity, upper body obesity, dietary obesity, hypogonadal obesity, Systemic mastocytosis, simple obesity, central obesity, etc.], hyperphagia, pituitary gland tumor, diencephalon tumor, menstrual abnormality, autoimmune disease , Prolactinoma, Pregnancy, impotence, amenorrhea, milk leakage, acromegaly, Chiari Frommer syndrome, Argonz del Castillo syndrome, Forbes Albright syndrome, lymphoma, Sheehan syndrome, spermatogenic abnormalities (especially obesity, etc.) It can be used as a medicine such as a prophylactic / therapeutic agent.
The therapeutic / preventive agent for the above-mentioned disease containing the bovine GPR7 / 8 antibody of the present invention can be produced and used in the same manner as the pharmaceutical containing the antibody against the peptide of the present invention described above.
[0117]
(7) Bovine GPR7 / 8 DNA transfer animal
The present invention may be abbreviated as exogenous bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention (hereinafter abbreviated as exogenous bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention) or its mutant DNA (exogenous mutant bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention). A non-human mammal having
That is, the present invention
(1) a non-human mammal having the exogenous bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention or a mutant DNA thereof,
(2) the animal according to (1), wherein the non-human mammal is a rodent;
(3) The animal according to (2), wherein the rodent is a mouse or a rat, and
(4) The present invention provides a recombinant vector that contains the exogenous bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention or a mutant DNA thereof and can be expressed in mammals.
The bovine GPR7 / 8 DNA transfer animal of the present invention can be prepared in the same manner as the above-described DNA transfer animal of the present invention.
The non-human mammal having the normal bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention has a high expression of the normal bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention, and finally promotes the function of the endogenous normal bovine GPR7 / 8 DNA. The hyperfunction of bovine GPR7 / 8 of the present invention may develop and can be used as a disease state model animal. For example, using the normal bovine GPR7 / 8 DNA-transferred animal of the present invention, elucidation of the pathological mechanism of the bovine GPR7 / 8 hyperfunction of the present invention and the diseases associated with the bovine GPR7 / 8 of the present invention and these diseases It is possible to examine the treatment method.
Further, since the mammal to which the exogenous normal bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released bovine GPR7 / 8 of the present invention, the treatment for the diseases related to the bovine GPR7 / 8 of the present invention is carried out. It can also be used for drug screening tests.
On the other hand, in the non-human mammal having the abnormal bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention, the abnormal bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention is highly expressed, and the final function is achieved by inhibiting the function of the endogenous normal bovine GPR7 / 8 DNA. In particular, the bovine GPR7 / 8 function-inactive refractory disease of the present invention may occur, and can be used as a disease state model animal. For example, by using the abnormal bovine GPR7 / 8 DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the functional inactive refractory disease of the bovine GPR7 / 8 of the present invention and to examine a method for treating this disease. is there.
[0118]
Further, as a specific applicability, the abnormal bovine GPR7 / 8 DNA highly expressing animal of the present invention is a normal bovine due to the abnormal bovine GPR7 / 8 of the present invention in the functional inactive refractory of the bovine GPR7 / 8 of the present invention. It becomes a model to elucidate the function inhibition (dominant negative action) of GPR7 / 8.
Further, since the mammal to which the foreign abnormal bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released bovine GPR7 / 8 of the present invention, the functional inactive form of the bovine GPR7 / 8 or the present invention It can also be used in therapeutic drug screening tests for responsiveness.
In addition, as other applicability of the above two kinds of bovine GPR7 / 8 DNA transfer animals of the present invention, for example,
(1) Use as a cell source for tissue culture,
(2) More specifically by the bovine GPR7 / 8 of the present invention by directly analyzing DNA or RNA in the tissue of the bovine GPR7 / 8 DNA-transferred animal of the present invention or by analyzing the peptide tissue expressed by the DNA. Analysis of the relationship with the expressed or activated peptide,
(3) Cell of tissue having DNA is cultured by a standard tissue culture technique, and using these, research on the function of cells from tissue generally difficult to cultivate,
(4) Screening for drugs that enhance cell function by using the cells described in (3) above, and
(5) Isolation and purification of the mutant bovine GPR7 / 8 of the present invention and production of antibodies thereof are conceivable.
Further, using the bovine GPR7 / 8 DNA-transferred animal of the present invention, the clinical symptoms of diseases related to the bovine GPR7 / 8 of the present invention, including the functional inactive refractory of the bovine GPR7 / 8 of the present invention, are examined. In addition, more detailed pathological findings in each organ of the disease model related to the bovine GPR7 / 8 of the present invention can be obtained, development of a new treatment method, and further study of secondary diseases caused by the disease And can contribute to treatment.
Further, each organ is taken out from the bovine GPR7 / 8 DNA-transferred animal of the present invention, and after minced, free DNA transfer cells can be obtained, cultured or systematized by using a protease such as trypsin. Is possible. Furthermore, the bovine GPR7 / 8 producing cells of the present invention can be identified, their relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or the signal transduction mechanism in them can be investigated, and their abnormalities can be investigated. 8 and an effective research material for elucidating its action.
Furthermore, using the bovine GPR7 / 8 DNA-transferred animal of the present invention, development of therapeutic agents for diseases related to bovine GPR7 / 8 of the present invention, including functional inactive refractory of bovine GPR7 / 8 of the present invention, is carried out. Therefore, it is possible to provide an effective and rapid screening method for the therapeutic agent for the disease by using the above-described test method and quantitative method. In addition, using the bovine GPR7 / 8 DNA-transferred animal of the present invention or the exogenous bovine GPR7 / 8 DNA expression vector of the present invention, it is possible to examine and develop a DNA therapy for diseases associated with the bovine GPR7 / 8 of the present invention. It is.
[0119]
(8) Bovine GPR7 / 8 knockout animal
The present invention provides a non-human mammal embryonic stem cell in which the bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention is inactivated and the non-human mammal deficient in the expression of bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention.
That is, the present invention
(1) a non-human mammalian embryonic stem cell in which the bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention is inactivated,
(2) The embryonic stem cell according to (1), wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, β-galactosidase gene derived from E. coli),
(3) The embryonic stem cell according to (1), which is neomycin resistant,
(4) The embryonic stem cell according to item (1), wherein the non-human mammal is a rodent.
(5) The embryonic stem cell according to (4), wherein the rodent is a mouse,
(6) The DNA expression deficient non-human mammal in which the bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention is inactivated,
(7) The DNA can be inactivated by introducing a reporter gene (eg, β-galactosidase gene derived from E. coli), and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention (6) The non-human mammal according to Item,
(8) The non-human mammal according to (6), wherein the non-human mammal is a rodent.
(9) The non-human mammal according to item (8), wherein the rodent is a mouse, and
(10) A compound or a salt thereof that promotes or inhibits promoter activity for bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention, comprising administering a test compound to the animal according to item (7) and detecting the expression of a reporter gene A screening method is provided.
The non-human mammal embryonic stem cell in which the bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention is inactivated and the non-human mammal deficient in DNA expression in which the bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention is inactivated are the non-human mammal of the present invention described above. It can be prepared in the same manner as mammalian embryonic stem cells and non-human mammals deficient in DNA expression of the present invention.
The non-human mammal embryonic stem cell in which the bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention is inactivated is very useful in producing the non-human mammal deficient in the expression of bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention.
Moreover, since the non-human mammal deficient in bovine GPR7 / 8 DNA expression of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the bovine GPR7 / 8 of the present invention, the biological activity of the bovine GPR7 / 8 of the present invention is impaired. Since it can be a model of diseases caused by activation, it is useful for investigating the causes of these diseases and examining treatment methods.
[0120]
(8a) Screening method for compounds having therapeutic / preventive effects on diseases caused by deficiency or damage of bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention
The non-human mammal deficient in the expression of bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention can be used for screening for compounds having a therapeutic / preventive effect on diseases caused by deficiency or damage of the bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention.
That is, the present invention provides a deficiency in the bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention, comprising administering a test compound to the non-human mammal deficient in bovine GPR7 / 8 DNA expression of the present invention and observing and measuring changes in the animal. Provided is a screening method for a compound having a therapeutic / preventive effect on a disease caused by injury or damage, or a salt thereof.
Examples of the non-human mammal deficient in bovine GPR7 / 8 DNA expression of the present invention used in the screening method include those described above.
Examples of the test compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc. These compounds are novel compounds. It may be a known compound.
Specifically, the bovine GPR7 / 8 DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention is treated with a test compound, and compared with an untreated control animal, changes in the organs, tissues, disease symptoms, etc. of the animal are observed. The therapeutic / prophylactic effect of the test compound can be tested as an index.
As a method for treating a test animal with a test compound, for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like. The dosage of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
[0121]
For example, anorexia, hypertension, autoimmune disease, heart failure, cataract, glaucoma, acute bacterial meningitis, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, acute viral encephalitis, adult respiratory distress syndrome, alcoholic hepatitis, Alzheimer's disease, asthma, arteriosclerosis , Atopic dermatitis, bacterial pneumonia, bladder cancer, fracture, breast cancer, bulimia, bulimia, burn healing, cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic pancreatitis, cirrhosis, colon Cancer (colon / rectal cancer), Crohn's disease, dementia, diabetic complications, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, gastritis, Helicobacter pylori infection, liver failure, hepatitis A, B Hepatitis C, hepatitis C, hepatitis, herpes simplex virus infection, varicella-zoster virus infection, Hodgkin's disease, AIDS infection, human papillomavirus infection, high calcium Disease, hypercholesterolemia, hyperglyceridemia, hyperlipidemia, infection, influenza infection, insulin-dependent diabetes mellitus (type I), invasive staphylococcal infection, malignant melanoma, cancer metastasis, multiple occurrence Myeloma, allergic rhinitis, nephritis, non-Hodgkin's lymphoma, non-insulin dependent diabetes mellitus (type II), non-small cell lung cancer, organ transplantation, osteoarthritis, osteomalacia, osteopenia, osteoporosis, ovarian cancer, Bone Pechet disease, peptic ulcer, peripheral vascular disease, prostate cancer, reflux esophagitis, renal failure, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, severe systemic fungal infection, small cell lung cancer, spinal cord injury, Gastric cancer, systemic lupus erythematosus, transient ischemic attack, tuberculosis, valvular disease, vascular / multiple infarct dementia, wound healing, insomnia, arthritis, pituitary hormone secretion deficiency [eg, prolacti Treatment / preventive effects on hyposecretion (eg, hypoovarian function, seminal vesicle development, menopause, hypothyroidism, etc.), urine, uremia, or neurodegenerative diseases (especially anorexia) Is screened for non-human mammals deficient in the expression of bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention, the test compound is administered before or after the glucose tolerance treatment, and the food intake, blood glucose level and Changes in weight, etc. are measured over time.
[0122]
In the screening method, when a test compound is administered to a test animal, the test compound is added when the food intake etc. of the test animal is increased by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more. It can be selected as a compound having a therapeutic / prophylactic effect on the above-mentioned diseases.
The compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and has a therapeutic / prophylactic effect on diseases caused by deficiency or damage of bovine GPR7 / 8 of the present invention. It can be used as a medicine such as a safe and low toxic therapeutic / preventive agent for the disease. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used as well.
The compound obtained by the screening method may form a salt. Examples of the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkali metals, etc.). And the like, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferred. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, And salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.
A medicament containing the compound obtained by the screening method or a salt thereof can be produced in the same manner as the aforementioned medicament containing the peptide of the present invention.
Since the preparation thus obtained is safe and low toxic, it can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
Although the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc., for example, when the compound is administered orally, generally in an anorexic patient (with a body weight of 60 kg) The compound is administered at about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc., but for example, the compound is usually administered to an anorexic patient (as 60 kg) in the form of an injection. In this case, it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound per day by intravenous injection. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
[0123]
(8b) Method for screening a compound that promotes or inhibits the activity of a promoter for bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention
The present invention promotes the activity of a promoter for the bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention, comprising administering a test compound to a non-human mammal deficient in bovine GPR7 / 8 DNA expression of the present invention and detecting the expression of a reporter gene Alternatively, a method of screening for an inhibitory compound or a salt thereof is provided.
In the above screening method, the bovine GPR7 / 8 DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention includes the above-described bovine GPR7 / 8 DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention, wherein the bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention has a reporter gene. Those that are inactivated by introduction and capable of expressing the reporter gene under the control of the promoter for the bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention are used.
Examples of the test compound are the same as described above.
As the reporter gene, the same ones as described above are used, and a β-galactosidase gene (lacZ), a soluble alkaline phosphatase gene, a luciferase gene, or the like is preferable.
In non-human mammals with deficient expression of bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention in which the bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention is replaced with a reporter gene, the reporter gene is present under the control of the promoter for bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention. By tracing the expression of the substance encoded by the gene, the activity of the promoter can be detected.
For example, when a part of the DNA region encoding the bovine GPR7 / 8 of the present invention is replaced with the β-galactosidase gene (lacZ) derived from E. coli, it is originally a tissue expressing the bovine GPR7 / 8 of the present invention. Β-galactosidase is expressed instead of the peptide of the present invention. Therefore, for example, by staining with a reagent that is a substrate of β-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside (X-gal), the present invention can be easily performed. The expression state of bovine GPR7 / 8 in animals can be observed. Specifically, the bovine GPR7 / 8-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof was fixed with glutaraldehyde, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-gal at room temperature or After reacting at around 37 ° C. for about 30 minutes to 1 hour, the tissue specimen is washed with a 1 mM EDTA / PBS solution to stop the β-galactosidase reaction and observe the coloration. Moreover, you may detect mRNA which codes lacZ according to a conventional method.
The compound obtained by using the screening method or a salt thereof is a compound selected from the test compounds described above, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity for the bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention.
The compound obtained by the screening method may form a salt. Examples of the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids) and bases (eg, organic acids). In particular, physiologically acceptable acid addition salts are preferred. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, And salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.
[0124]
The compound or its salt that promotes the promoter activity for bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention can promote the expression of bovine GPR7 / 8 of the present invention and promote the function of the bovine GPR7 / 8. Disease, hypertension, autoimmune disease, heart failure, cataract, glaucoma, acute bacterial meningitis, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, acute viral encephalitis, adult respiratory distress syndrome, alcoholic hepatitis, Alzheimer's disease, asthma, arteriosclerosis, atopic Dermatitis, bacterial pneumonia, bladder cancer, fracture, breast cancer, bulimia, bulimia, burn healing, cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic pancreatitis, cirrhosis, colon cancer (colon) / Rectal cancer), Crohn's disease, dementia, diabetic complications, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, gastritis, Helicobacter piro Infection, liver failure, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis, herpes simplex virus infection, varicella-zoster virus infection, Hodgkin's disease, AIDS infection, human papillomavirus infection, hypercalcemia, Hypercholesterolemia, hyperglyceridemia, hyperlipidemia, infection, influenza infection, insulin-dependent diabetes mellitus (type I), invasive staphylococcal infection, malignant melanoma, cancer metastasis, multiple bone marrow , Allergic rhinitis, nephritis, non-Hodgkin's lymphoma, non-insulin-dependent diabetes mellitus (type II), non-small cell lung cancer, organ transplantation, osteoarthritis, osteomalacia, osteopenia, osteoporosis, ovarian cancer, bone pechet Disease, peptic ulcer, peripheral vascular disease, prostate cancer, reflux esophagitis, renal failure, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, severe systemic fungal infection , Small cell lung cancer, spinal cord injury, gastric cancer, systemic lupus erythematosus, transient ischemic attack, tuberculosis, valvular disease, vascular / multiple infarct dementia, wound healing, insomnia, arthritis, pituitary hormone secretion failure [Example , Prolactin secretion failure (eg, ovarian hypofunction, seminal vesicle development failure, menopause, hypothyroidism, etc.), manure, uremia, or neurodegenerative diseases (especially anorexia) It is useful as a medicine such as a toxic therapeutic / preventive agent (particularly an appetite (feeding) enhancer).
Further, the compound or its salt that inhibits the promoter activity for bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention can inhibit the expression of bovine GPR7 / 8 of the present invention and inhibit the function of the bovine GPR7 / 8. , Obesity (eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulinar obesity, hyperplasmic obesity, hypophyseal adiposity) Hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity, symptomatic obesity, childhood obesity, upper body obesity body obesity), dietary obesity, hypogonadal obesity, systemic mastocytosis, simple obesity, central obesity sity), etc.], hyperphagia, pituitary gland tumors, diencephalon tumors, menstrual abnormalities, autoimmune diseases, prolactinoma, infertility, impotence, amenorrhea, milk leakage, acromegaly, Chiari Frommer Preventive / therapeutic agents (prolactin production inhibitors) such as Syndrome, Argonz del Castillo Syndrome, Forbes Albright Syndrome, Lymphoma, Sheehan Syndrome, Spermatogenesis Abnormality, preferably obesity, increased feeding It is useful as a medicine for prophylactic / therapeutic agents for diseases.
Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used as well.
[0125]
The medicament containing the compound obtained by the screening method or a salt thereof can be produced in the same manner as the aforementioned medicament containing the peptide of the present invention or a salt thereof.
Since the preparation thus obtained is safe and low toxic, it can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc. For example, when a compound that promotes the promoter activity for bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention is orally administered, In an anorexic patient who is adult (with a body weight of 60 kg), the compound is administered at about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc. For example, the compound that promotes the promoter activity for bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention is in the form of an injection. When administered to an anorexic patient, usually an adult (as 60 kg), about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound per day is administered. Conveniently administered by intravenous injection. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
On the other hand, for example, when a compound that inhibits the promoter activity against bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention is orally administered, generally in an adult (with a body weight of 60 kg) obese patients, the compound is about 0.1 per day. -100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc. For example, the compound that inhibits the promoter activity against bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention is in the form of an injection. In general, when administered to an adult (as 60 kg) obese patient, the compound is about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. Conveniently administered by intravenous injection. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
Thus, the bovine GPR7 / 8 DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention is extremely useful for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter for bovine GPR7 / 8 DNA of the present invention. The invention can greatly contribute to the investigation of the causes of various diseases caused by the bovine GPR7 / 8 DNA expression deficiency of the invention or the development of preventive / therapeutic agents.
Moreover, using bovine GPR7 / 8 DNA containing the promoter region of bovine GPR7 / 8 of the present invention, genes encoding various proteins are ligated downstream thereof, and this is injected into an egg cell of an animal so-called transgenic animal. If a (transgenic animal) is prepared, the peptide can be specifically synthesized and its action in the living body can be examined. Furthermore, if an appropriate reporter gene is bound to the above promoter portion and a cell line capable of expressing it is established, it has the action of specifically promoting or suppressing the production capacity of bovine GPR7 / 8 itself of the present invention. It can be used as a search system for low molecular weight compounds.
[0126]
In the present specification and drawings, bases, amino acids, and the like are represented by abbreviations based on abbreviations by IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or conventional abbreviations in the field, examples of which are described below. In addition, when there are optical isomers with respect to amino acids, L form is shown unless otherwise specified.
DNA: Deoxyribonucleic acid
cDNA: complementary deoxyribonucleic acid
A: Adenine
T: Thymine
G: Guanine
C: cytosine
I: Inosine
R: adenine (A) or guanine (G)
Y: Thymine (T) or cytosine (C)
M: adenine (A) or cytosine (C)
K: Guanine (G) or thymine (T)
S: Guanine (G) or cytosine (C)
W: adenine (A) or thymine (T)
B: Guanine (G), guanine (G) or thymine (T)
D: adenine (A), guanine (G) or thymine (T)
V: adenine (A), guanine (G) or cytosine (C)
N: adenine (A), guanine (G), cytosine (C) or thymine (T) or unknown or other base
RNA: Ribonucleic acid
mRNA: Messenger ribonucleic acid
dATP: Deoxyadenosine triphosphate
dTTP: Deoxythymidine triphosphate
dGTP: Deoxyguanosine triphosphate
dCTP: Deoxycytidine triphosphate
ATP: Adenosine triphosphate
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid
SDS: sodium dodecyl sulfate
BHA: Benzhydrylamine
pMBHA: p-methylbenzhydrylamine
Tos: p-toluenesulfonyl
Bzl: benzyl
Bom: benzyloxymethyl
Boc: t-butyloxycarbonyl
DCM: dichloromethane
HOBt: 1-hydroxybenztriazole
DCC: N, N′-dicyclohexylcarbodiimide
TFA: trifluoroacetic acid
DIEA: Diisopropylethylamine
[0127]
Gly or G: Glycine
Ala or A: Alanine
Val or V: Valine
Leu or L: Leucine
Ile or I: isoleucine
Ser or S: Serine
Thr or T: Threonine
Cys or C: cysteine
Met or M: methionine
Glu or E: Glutamic acid
Asp or D: Aspartic acid
Lys or K: lysine
Arg or R: Arginine
His or H: histidine
Phe or F: phenylalanine
Tyr or Y: tyrosine
Trp or W: Tryptophan
Pro or P: proline
Asn or N: Asparagine
Gln or Q: glutamine
pGlu: pyroglutamic acid
Tyr (I): 3-iodotyrosine
DMF: N, N-dimethylformamide
Fmoc: N-9-fluorenylmethoxycarbonyl
Trt: Trityl
Pbf: 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl
Clt: 2-chlorotrityl
Bu t : T-butyl
Met (O): Methionine sulfoxide
[0128]
The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
[SEQ ID NO: 1]
1 shows the amino acid sequence of human GPR7 ligand A.
[SEQ ID NO: 2]
1 shows the amino acid sequence of mouse GPR7 ligand A.
[SEQ ID NO: 3]
1 shows the amino acid sequence of rat GPR7 ligand A.
[SEQ ID NO: 4]
1 shows the amino acid sequence of human GPR7 ligand B.
[SEQ ID NO: 5]
1 shows the amino acid sequence of mouse GPR7 ligand B.
[SEQ ID NO: 6]
1 shows the amino acid sequence of rat GPR7 ligand B.
[SEQ ID NO: 7]
1 shows the amino acid sequence of human GPR7 ligand C.
[SEQ ID NO: 8]
1 shows the amino acid sequence of human GPR7 ligand D.
[SEQ ID NO: 9]
1 shows the amino acid sequence of mouse GPR7 ligand C.
[SEQ ID NO: 10]
1 shows the amino acid sequence of mouse GPR7 ligand D.
[SEQ ID NO: 11]
1 shows the amino acid sequence of rat GPR7 ligand C.
[SEQ ID NO: 12]
1 shows the amino acid sequence of rat GPR7 ligand D.
[SEQ ID NO: 13]
1 shows the amino acid sequence of human GPR7 ligand E.
[SEQ ID NO: 14]
1 shows the amino acid sequence of mouse GPR7 ligand E.
[SEQ ID NO: 15]
The amino acid sequence of rat type GPR7 ligand E is shown.
[SEQ ID NO: 16]
1 shows the amino acid sequence of human GPR7 ligand F.
[SEQ ID NO: 17]
1 shows the amino acid sequence of mouse GPR7 ligand F.
[SEQ ID NO: 18]
1 shows the amino acid sequence of rat GPR7 ligand F.
[SEQ ID NO: 19]
1 shows the amino acid sequence of human GPR7 ligand precursor G that does not contain a secretion signal.
[SEQ ID NO: 20]
The amino acid sequence of mouse-type GPR7 ligand precursor G that does not contain a secretion signal is shown.
[SEQ ID NO: 21]
The amino acid sequence of rat GPR7 ligand precursor G that does not contain a secretion signal is shown.
[SEQ ID NO: 22]
The amino acid sequence of human GPR7 ligand precursor H containing a secretion signal is shown.
[SEQ ID NO: 23]
The amino acid sequence of mouse-type GPR7 ligand precursor H containing a secretion signal is shown.
[SEQ ID NO: 24]
The amino acid sequence of rat GPR7 ligand precursor H containing a secretion signal is shown.
[SEQ ID NO: 25]
1 shows the base sequence of DNA encoding human GPR7 ligand A.
[SEQ ID NO: 26]
1 shows the base sequence of DNA encoding mouse GPR7 ligand A.
[SEQ ID NO: 27]
1 shows the base sequence of DNA encoding rat GPR7 ligand A.
[SEQ ID NO: 28]
This shows the base sequence of DNA encoding human GPR7 ligand B.
[SEQ ID NO: 29]
1 shows the base sequence of DNA encoding mouse GPR7 ligand B.
[SEQ ID NO: 30]
1 shows the nucleotide sequence of DNA encoding rat GPR7 ligand B.
[SEQ ID NO: 31]
This shows the base sequence of DNA encoding human GPR7 ligand C.
[SEQ ID NO: 32]
The nucleotide sequence of DNA encoding human GPR7 ligand D is shown.
[SEQ ID NO: 33]
1 shows the base sequence of DNA encoding mouse GPR7 ligand C.
[SEQ ID NO: 34]
1 shows the base sequence of DNA encoding mouse GPR7 ligand D.
[SEQ ID NO: 35]
1 shows the base sequence of DNA encoding rat GPR7 ligand C.
[SEQ ID NO: 36]
1 shows the base sequence of DNA encoding rat GPR7 ligand D.
[SEQ ID NO: 37]
1 shows the base sequence of DNA encoding human GPR7 ligand E.
[SEQ ID NO: 38]
The nucleotide sequence of DNA encoding mouse GPR7 ligand E is shown.
[SEQ ID NO: 39]
1 shows the base sequence of DNA encoding rat GPR7 ligand E.
[SEQ ID NO: 40]
1 shows the base sequence of DNA encoding human GPR7 ligand F.
[SEQ ID NO: 41]
1 shows the base sequence of DNA encoding mouse GPR7 ligand F.
[SEQ ID NO: 42]
1 shows the base sequence of DNA encoding rat GPR7 ligand F.
[SEQ ID NO: 43]
2 shows the base sequence of DNA encoding human GPR7 ligand precursor G that does not contain a secretion signal.
[SEQ ID NO: 44]
1 shows the base sequence of DNA encoding mouse GPR7 ligand precursor G that does not contain a secretion signal.
[SEQ ID NO: 45]
The base sequence of DNA which codes rat type | mold GPR7 ligand precursor G which does not contain a secretion signal is shown.
[SEQ ID NO: 46]
The base sequence of DNA which codes the human type | mold GPR7 ligand precursor H containing a secretion signal is shown.
[SEQ ID NO: 47]
The base sequence of DNA which codes the mouse | mouth type | mold GPR7 ligand precursor H containing a secretion signal is shown.
[SEQ ID NO: 48]
The base sequence of DNA which codes rat type | mold GPR7 ligand precursor H containing a secretion signal is shown.
[SEQ ID NO: 49]
The amino acid sequence of human GPR7 is shown.
[SEQ ID NO: 50]
The base sequence of DNA containing DNA encoding human GPR7 is shown.
[SEQ ID NO: 51]
The synthetic DNA used for the screening of cDNA which codes human type | mold GPR7 ligand precursor H in Example 1 is shown.
[SEQ ID NO: 52]
The synthetic DNA used for the screening of cDNA which codes human type | mold GPR7 ligand precursor H in Example 1 is shown.
[SEQ ID NO: 53]
The synthetic DNA used for the screening of cDNA which codes mouse-type GPR7 ligand precursor H in Example 2 is shown.
[SEQ ID NO: 54]
The synthetic DNA used for the screening of cDNA which codes mouse-type GPR7 ligand precursor H in Example 2 is shown.
[SEQ ID NO: 55]
The synthetic DNA used for the screening of cDNA which codes rat type | mold GPR7 ligand precursor H in Example 3 is shown.
[SEQ ID NO: 56]
The synthetic DNA used for the screening of cDNA which codes rat type | mold GPR7 ligand precursor H in Example 3 is shown.
[SEQ ID NO: 57]
The base sequence of the primer used in Reference Example 1 is shown.
[SEQ ID NO: 58]
The base sequence of the primer used in Reference Example 1 is shown.
[SEQ ID NO: 59]
The amino acid sequence of rat TGR26 is shown.
[SEQ ID NO: 60]
This shows the base sequence of DNA encoding rat TGR26.
[SEQ ID NO: 61]
The base sequence of the primer 1 used by PCR reaction in the reference example 3 is shown.
[SEQ ID NO: 62]
The base sequence of primer 2 used in the PCR reaction in Reference Example 3 is shown.
[SEQ ID NO: 63]
The base sequence of the primer used in Example 9 is shown.
[SEQ ID NO: 64]
The base sequence of the primer used in Example 9 is shown.
[SEQ ID NO: 65]
The base sequence of the primer used in Example 9 is shown.
[SEQ ID NO: 66]
The amino acid sequence of bovine GPR7 ligand A is shown.
[SEQ ID NO: 67]
The amino acid sequence of bovine GPR7 ligand B is shown.
[SEQ ID NO: 68]
1 shows the amino acid sequence of bovine GPR7 ligand C.
[SEQ ID NO: 69]
The amino acid sequence of bovine GPR7 ligand D is shown.
[SEQ ID NO: 70]
The amino acid sequence of bovine GPR7 ligand E is shown.
[SEQ ID NO: 71]
The amino acid sequence of bovine GPR7 ligand F is shown.
[SEQ ID NO: 72]
2 shows the amino acid sequence of bovine GPR7 ligand precursor G that does not contain a secretion signal.
[SEQ ID NO: 73]
The amino acid sequence of bovine GPR7 ligand precursor H containing a secretion signal is shown.
[SEQ ID NO: 74]
1 shows the base sequence of DNA encoding bovine GPR7 ligand A.
[SEQ ID NO: 75]
1 shows the base sequence of DNA encoding bovine GPR7 ligand B.
[SEQ ID NO: 76]
2 shows the base sequence of DNA encoding bovine GPR7 ligand C.
[SEQ ID NO: 77]
1 shows the base sequence of DNA encoding bovine GPR7 ligand D.
[SEQ ID NO: 78]
The base sequence of DNA encoding bovine GPR7 ligand E is shown.
[SEQ ID NO: 79]
The base sequence of DNA encoding bovine GPR7 ligand F is shown.
[SEQ ID NO: 80]
1 shows the base sequence of DNA encoding bovine GPR7 ligand precursor G that does not contain a secretion signal.
[SEQ ID NO: 81]
2 shows the base sequence of DNA encoding bovine GPR7 ligand precursor H containing a secretion signal.
[SEQ ID NO: 82]
The base sequence of the primer used in Example 12 is shown.
[SEQ ID NO: 83]
The base sequence of the primer used in Example 12 is shown.
[SEQ ID NO: 84]
The amino acid sequence of human GPR8 is shown.
[SEQ ID NO: 85]
The base sequence of DNA containing DNA encoding human GPR8 is shown.
[SEQ ID NO: 86]
The amino acid sequence of bovine GPR7 is shown.
[SEQ ID NO: 87]
The base sequence of DNA containing DNA encoding bovine GPR7 is shown.
[SEQ ID NO: 88]
The amino acid sequence of bovine GPR8 is shown.
[SEQ ID NO: 89]
The base sequence of DNA containing DNA encoding bovine GPR8 is shown.
[SEQ ID NO: 90]
The base sequence of the primer used in Example 16 is shown.
[SEQ ID NO: 91]
The base sequence of the primer used in Example 16 is shown.
[SEQ ID NO: 92]
The base sequence of the primer used in Example 16 is shown.
[SEQ ID NO: 93]
The base sequence of the primer used in Example 17 is shown.
[SEQ ID NO: 94]
The base sequence of the primer used in Example 17 is shown.
[SEQ ID NO: 95]
The base sequence of the primer used in Example 17 is shown.
[SEQ ID NO: 96]
The base sequence of the primer used in Example 18 is shown.
[SEQ ID NO: 97]
The base sequence of the primer used in Example 18 is shown.
[SEQ ID NO: 98]
The base sequence of the primer used in Example 19 is shown.
[SEQ ID NO: 99]
The base sequence of the primer used in Example 19 is shown.
[SEQ ID NO: 100]
1 shows the amino acid sequence of human GPR8 ligand (1-23).
[0129]
The transformant Escherichia coli JM109 / pTAhGPR7-1 obtained in Example 1, which will be described later, is Escherichia coli JM109 / pTAhGPR7L-1 from June 27, 2001, 1st Central, 1st Street, 1st Street, Tsukuba City, Ibaraki Pref. No. 305-8666), National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary, Deposit No. FERM BP-7640 from June 19, 2001 2-17-85 Juzahoncho, Yodogawa-ku, Osaka, Osaka No. 532-8686) is deposited as the deposit number IFO16644 at the Fermentation Research Institute (IFO).
The transformant Escherichia coli JM109 / pTAmGPR7-1 obtained in Example 2 described later has been deposited with Escherichia coli JM109 / pTAmGPR7L-1 at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology since June 27, 2001. It has been deposited under the deposit number IFO 16656 with the foundation Fermentation Research Institute (IFO) from June 19, 2001 under the number FERM BP-7641.
The transformant Escherichia coli JM109 / pTARGPR7-1 obtained in Example 3 described later was deposited with Escherichia coli JM109 / pTAGPR7L-1 on June 27, 2001 at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Deposit number IFO 16657 has been deposited with the Foundation Fermentation Research Institute (IFO) since June 19, 2001 as number FERM BP-7642.
The transformant Escherichia coli JM109 / pTAbGPR7L-1 obtained in Example 12, which will be described later, was registered with the Patent Organism Depositary of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as a deposit number FERM BP-7829 from December 17, 2001. Since December 6, 2000, it has been deposited with the Foundation Fermentation Research Institute (IFO) under the deposit number IFO 16736.
The transformant Escherichia coli JM109 / pTAbGPR7 obtained in Example 18 described later has been deposited under the deposit number FERM BP-8050 at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology since May 24, 2002. .
The transformant Escherichia coli JM109 / pTAbGPR8 obtained in Example 19, which will be described later, has been deposited under the deposit number FERM BP-8051 at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology since May 24, 2002. .
The transformant Escherichia coli DH10B / pAK-rGPR7 obtained in Reference Example 3 described below was obtained from October 31, 2000, 2-17-85 Juzahoncho, Yodogawa-ku, Osaka, Osaka, Japan, from October 31, 2000. The research institute (IFO) under the accession number IFO 16496, from November 13, 2000, 1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan, and the accession number FERM to the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology (NIBH), Ministry of International Trade and Industry It is deposited as BP-7365.
[0130]
【Example】
The following reference examples and examples illustrate the present invention in more detail, but these do not limit the scope of the present invention.
Reference Example 1 Amplification of human GPR7 DNA by PCR using human chromosomal DNA
DNA amplification was performed by PCR using human chromosomal DNA as a template and two synthetic primers (SEQ ID NO: 57 and SEQ ID NO: 58). The synthetic primer was constructed so that the gene in the region translated into the receptor protein was amplified. At that time, the base sequence recognized by the restriction enzyme Cla I was added to the 5 'side of the gene, and the 3' side was restricted. Each restriction enzyme recognition sequence was added to the 5 ′ side and the 3 ′ side so that the base sequence recognized by the enzyme Spe I was added. The composition of the reaction solution is human chromosomal DNA (Takara) 0.5 μg, synthetic DNA primer 1 μM each, 0.8 mM dNTPs, 1 mM MgCl 2 The total reaction volume was 50 μl with 1 μl of KOD polymerase (Toyobo) and the buffer attached to the enzyme. A cycle for amplification was performed using a thermal cycler (Takara). After heating at 94 ° C for 60 seconds, a cycle of 98 ° C for 15 seconds, 65 ° C for 2 seconds, and 74 ° C for 30 seconds was repeated 35 times. The amplification product was confirmed by ethidium bromide staining after 0.8% agarose gel electrophoresis.
[0131]
Reference Example 2 Confirmation of amplified DNA sequence by subcloning PCR product into plasmid vector and decoding base sequence of inserted DNA
The PCR reaction solution performed in Reference Example 1 was separated by 0.8% low-melting point agarose gel electrophoresis, and the band part was cut out with a razor, followed by stripping, phenol extraction, phenol / chloroform extraction, and ethanol precipitation. The DNA was collected. pCR-Script TM The recovered DNA was subcloned into the plasmid vector pCR-Script Amp SK (+) in accordance with the Amp SK (+) cloning kit (Stratagene). This was introduced into Escherichia coli DH5α competent cell (Toyobo), transformed, and then a clone with a DNA insert was selected on LB agar medium containing ampicillin, IPTG and X-gal, and a white clone Only sterilized toothpicks were used for isolation, and transformant E. coli DH5α / GPR7 was obtained. Individual clones were cultured overnight in LB medium containing ampicillin, and plasmid DNA was prepared using QIAwell 8 Plasmid Kit (Qiagen). A part of the prepared DNA was cleaved with restriction enzymes Cla I and Spe I, and the size of the inserted receptor DNA fragment was confirmed. The reaction for determining the base sequence was performed using DyeDeoxyTerminator Cycle Sequence Kit (Applied Biosystems) and decoded using a fluorescent automatic sequencer (SEQ ID NO: 50). The pCR-Script Amp SK (+) plasmid carrying the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 50 was named pCR-Script human GPR7. The amino acid sequence of human GPR7 encoded by the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 50 is shown in SEQ ID NO: 49. The DNA sequence of human GPR7 determined here is 2 bases from the DNA sequence described in O'Dowd et al. (O'Dowd, BF et al., Genomics, 28, 84-91, 1995). It was different. These correspond to positions 893 and 894 of SEQ ID NO: 50, which are C and G in the report of O'Dowd et al., But G and C in this reference example. As a result, the 296th amino acid of SEQ ID NO: 49 in the translated amino acid sequence is Ser in the present example, and Thr reported by O'Dowd et al.
[0132]
Reference Example 3 Cloning and nucleotide sequence determination of cDNA encoding G protein-coupled receptor protein derived from rat whole brain
Using two primers, primer 1 (SEQ ID NO: 61) and primer 2 (SEQ ID NO: 62) designed based on the base sequence of DNA encoding human GPR8 using rat whole brain cDNA (CLONTECH) as a template PCR reaction was performed. The composition of the reaction solution in the reaction was that the above cDNA was used as a one-tenth amount template, Advantage-2 cDNA Polymerase Mix (CLONTECH) 1/50 amount, Primer 3 0.2 μM, Primer 2 0.2 μM, dNTPs 200 μM and the buffer attached to the enzyme were added to make a volume of 25 μl. The PCR reaction is as follows: (1) 94 ° C, 2 minutes, (2) 94 ° C, 20 seconds, 72 ° C, 2 minutes, 3 cycles, (3) 94 ° C, 20 seconds, 66 ° C, 20 seconds, 3 cycles of 68 ° C for 2 minutes, (4) 94 ° C for 20 seconds, 60 ° C for 20 seconds, and 68 ° C for 2 minutes are repeated 36 times, and finally an extension reaction is performed for 68 ° C for 7 minutes. It was. The reaction product after the PCR reaction was subcloned into the plasmid vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) according to the TA cloning kit (Invitrogen). This was introduced into Escherichia coli DH5α, and a clone having cDNA was selected in an LB agar medium containing ampicillin. As a result of analyzing the sequence of each clone, a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 60) of cDNA encoding a novel G protein-coupled receptor protein was obtained. A novel G protein-coupled receptor protein containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 59) encoded by the base sequence of this DNA was named TGR26.
The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 59 is 84.8% between GPR7 [Genomics, 28, 84-91, 1995], which is a known human G protein coupled receptor protein. It had homology.
One clone was selected from the above-mentioned transformant having a plasmid into which a DNA encoding TGR26 was inserted, and cultured with shaking in an LB medium containing ampicillin to obtain a plasmid. This was treated with restriction enzymes ClaI and SpeI, and the insert portion encoding TGR26 was cut out. Similarly, ligation was performed using pAKKO-1.11H and Ligation Express Kit (CLONTECH) treated with restriction enzymes ClaI and SpeI, and introduced into E. coli DH10B by electroporation. About the obtained clone, after confirming the structure of the plasmid for constructing an expression cell by restriction enzyme treatment and sequence analysis, it was named Escherichia coli DH10B / pAK-rGPR7.
[0133]
Reference Example 4 Preparation of TGR26-expressing CHO cells
Escherichia coli DH5α (Toyobo) transformed with the expression plasmid pAK-rGPR7 described in Reference Example 3 was cultured, and then pAK-rGPR7 plasmid DNA was prepared using Plasmid Midi Kit (Qiagen). Using CellPhect Transfection Kit (Amersham Pharmacia Biotech) according to the attached protocol, CHO dhfr − Introduced into cells. 5 μg of DNA was made into a coprecipitation suspension with calcium phosphate and 3 × 10 4 48 hours before 5 CHO dhfr − It added to two 6 cm diameter petri dishes which seed | inoculated the cell. After culturing in a MEMα medium containing 10% fetal bovine serum for 1 day, the cells were subcultured and cultured in a nucleic acid-free MEMα medium containing 10% dialyzed fetal bovine serum as a selective medium. Forty-four colonies of transformed cells that were TGR26-expressing CHO cells growing in the selection medium were selected.
[0134]
Example 1 Acquisition of GPR7 ligand precursor gene from human whole brain cDNA by PCR and construction of expression plasmid
Using human whole brain cDNA purchased from Clontech as a template, PCR amplification was performed using the following two synthetic DNAs.
GSF1: 5'-GTCGACATGGCCCGGTCCGCGACACTGGCGGCC-3 '(SEQ ID NO: 51)
GSR2: 5'-GCTAGCAGCGGTGCCAGGAGAGGTCCGGGCTCA-3 '(SEQ ID NO: 52)
PCR reaction solution is 1 μl of cDNA solution, 0.5 μl GSF1 (10 μM), 0.5 μl GSR2 (10 μM), 2.5 μl of 10 x reaction solution, 2.5 μl dNTP (10 mM), 0.5 μl KlenTaq (clone Tech), 17.5 μl Otsuka distilled water was added to make a total of 25 μl. The reaction solution was subjected to PCR reaction using ThermalCycler 9600. PCR conditions were as follows: denaturation at 95 ° C for 2 minutes, followed by 35 cycles of 98 ° C for 10 seconds, 60 ° C for 20 seconds, and 72 ° C for 20 seconds. After confirming amplification of a PCR product of about 400 bp by electrophoresis using a part of the PCR product, the PCR product was purified using the Quiagen PCR purification Kit and directly sequenced. As a result, the sequence shown in FIG. I was able to. The amino acid sequence predicted from the DNA sequence of FIG. 1 was as shown in FIG. Next, the PCR product recovered from the gel was subcloned into E. coli JM109 using a TA cloning kit (Invitrogen) to obtain E. coli JM109 / pTAhGPR7-1. Plasmid pTAhGPR7-1 is extracted from the E. coli obtained by subcloning using a plasmid extractor (Kurabo), the base sequence of the inserted fragment is determined, and the sequence is the same human GPR7 ligand cDNA as in FIG. confirmed. Next, a human GPR7 ligand cDNA fragment of about 0.4 kb was obtained from the plasmid after digestion with restriction enzymes Sal1I and NheI. Furthermore, pAKKO-111H, which is an expression vector for animal cells, was digested with restriction enzyme sites SalI and NheI in the multicloning site portion, followed by electrophoresis, and the vector portion was recovered. The human GPR7 ligand cDNA fragment and expression vector prepared by the above operations were ligated by ligation, and E. coli JM109 was transformed to obtain E. coli JM109 / pAK-S64.
Transformant E. coli JM109 / pAK-S64 was cultured to prepare a large amount of plasmid pAK-S64 DNA.
[0135]
Example 2 Acquisition of GPR7 Ligand Precursor Gene from Mouse Whole Brain cDNA by PCR Using the mouse whole brain cDNA as a template, the following two types of synthetic DNA were used for amplification by PCR.
MFSAL1: 5'-GTCGACAGCTCCATGGCCCGGTGTAGGACGCTG-3 '(SEQ ID NO: 53)
MRNHE1: 5'-GCTAGCTCAGGTGCTCTGGCAATCAGTCTCGTG-3 '(SEQ ID NO: 54)
PCR reaction solution is 1 μl of cDNA solution, 0.5 μl MFSAL1 (10 μM), 0.5 μl MRNHE1 (10 μM), 2.5 μl attached 10 x reaction solution, 2.5 μl dNTP (10 mM), 0.5 μl KlenTaq (clone Tech), 17.5 μl Otsuka distilled water was added to make a total of 25 μl. The reaction solution was subjected to PCR reaction using ThermalCycler 9600. PCR conditions were as follows: denaturation at 95 ° C for 2 minutes, followed by 35 cycles of 98 ° C for 10 seconds, 60 ° C for 20 seconds, and 72 ° C for 20 seconds. After confirming amplification of a PCR product of about 400 bp by electrophoresis using a part of the PCR product, the PCR product was purified using the Quiagen PCR purification Kit and directly sequenced. As a result, the sequence shown in FIG. I was able to. The amino acid sequence predicted from the DNA sequence of FIG. 3 was as shown in FIG. Next, the PCR product recovered from the gel was subcloned into E. coli JM109 using a TA cloning kit (Invitrogen) to obtain E. coli JM109 / pTAmGPR7-1. Plasmid pTAmGPR7-1 is extracted from the E. coli obtained by subcloning using a plasmid extractor (Kurabo), the base sequence of the inserted fragment is determined, and the sequence is the same mouse GPR7 ligand cDNA as in FIG. confirmed.
[0136]
Example 3 Acquisition of GPR7 Ligand Precursor Gene from Rat Whole Brain cDNA by PCR Method Using rat whole brain cDNA as a template, PCR amplification was performed using the following two synthetic DNAs.
RF: 5'-CACGGCTCCATGGTCCGGTGTAGGACG-3 '(SEQ ID NO: 55)
RR: 5'-CAGCGTCGAGGTTTGGGTTGGGGTTCA-3 '(SEQ ID NO: 56)
PCR reaction solution is 1 μl of cDNA solution, 0.5 μl RF (10 μM), 0.5 μl RR (10 μM), 2.5 μl of 10 x reaction solution, 2.5 μl dNTP (10 mM), 0.5 μl KlenTaq (clone Tech), 17.5 μl Otsuka distilled water was added to make a total of 25 μl. The reaction solution was subjected to PCR reaction using ThermalCycler 9600. PCR conditions were as follows: denaturation at 95 ° C for 2 minutes, followed by 35 cycles of 98 ° C for 10 seconds, 60 ° C for 20 seconds, 72 ° C for 20 seconds. After confirming amplification of a PCR product of about 400 bp by electrophoresis using a part of the PCR product, the PCR product was purified using a Quiagen PCR purification Kit and directly sequenced. As a result, the sequence shown in FIG. I was able to. The amino acid sequence predicted from the DNA sequence of FIG. 5 was as shown in FIG.
Next, the PCR product recovered from the gel was subcloned into E. coli JM109 using a TA cloning kit (Invitrogen) to obtain E. coli JM109 / pTArGPR7-1. Plasmid pTArGPR7-1 was extracted from the E. coli obtained by subcloning using a plasmid extractor (Kurabo), the nucleotide sequence of the inserted fragment was determined, and the sequence was the same rat GPR7 ligand cDNA as in FIG. confirmed.
[0137]
Example 4 Transient Expression of GPR7 Expression Plasmid and Reporter Plasmid in Chinese Hamster Overy (CHO) Cells
Escherichia coli JM109 was transformed with a plasmid obtained by inserting the human GPR7 DNA obtained in Reference Example 2 into an animal cell expression plasmid pAKKO-111H by a method known per se. After the obtained colonies were isolated and cultured, GPR7 expression plasmid DNA was prepared using QUIAGEN Plasmid Maxi Kit (Qiagen). Moreover, plasmid DNA of pCRE-Luc (Clontech) in which a luciferase gene was linked as a reporter downstream of the cAMP response element (CRE) was prepared in the same manner.
The GPR7 expression plasmid and pCRE-Luc were transiently expressed in CHO cells into which an expression vector having no receptor gene inserted was introduced. CHO cells were seeded in a 96-well plate (Corning Coaster) at 40,000 cells / well and a culture volume of 100 μl, and cultured at 37 ° C. overnight. For the culture on the plate, a medium in which only 10% fetal bovine serum was added to DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco BRL) was used. Each plasmid was diluted to a concentration of 240 ng / μl and added to 240 μl of Opti-MEM-I (GibcoBRL) at a ratio of 9 μl of GPR7 expression plasmid and 1 μl of pCRE-Luc. Equally mixed with 240 μl of Opti-MEM-I and 10 μl of Lipofectamine 2000 (GibcoBRL), and mixed with liposome and plasmid according to the method described in the manual attached to Lipofectamine 2000. A DNA complex was formed. This was added to the CHO cell culture medium at a rate of 25 μl / well. After 4 hours, the culture medium was replaced with assay buffer (DMEM supplemented with 0.1% bovine serum albumin) to make it serum-free, and cultured overnight at 37 ° C. did.
[0138]
Example 5 Ligand gene expression in CHO cells
The animal cell expression plasmid pAK-S64 inserted with the human type ligand cDNA prepared in Example 1 was transiently expressed in CHO cells in the same manner as in Example 4. However, the cells were seeded in 6-well plates (Falcon) at 600,000 cells / well, and after overnight culture, the ligand gene plasmid was introduced. The plasmid diluted to a concentration of 240 ng / μl was added to 10 μl and 240 μl Opti-MEM-I, which was also added to 240 μl Opti-MEM-I plus 10 μl Lipofectamine 2000. Equal amounts were mixed to form a liposome-plasmid DNA complex according to the method described in the manual attached to Lipofectamine 2000. 500 μl / well of this was added to the CHO cell culture medium, and after 4 hours, the culture medium was replaced with assay buffer to make serum-free. The medium in each well was collected 18 hours after the medium exchange to obtain a CHO cell culture supernatant containing the ligand peptide.
[0139]
Example 6 Detection of suppression of luciferase activity in CHO cells in which GPR7 was transiently expressed using S64-expressing cell supernatant
Forskolin was added to the culture medium of CHO cells in which GPR7 was transiently expressed according to the method of Example 4 and the pAK-S64 expression culture supernatant prepared in Example 5 and a final concentration of 2 μM. The culture supernatant of CHO cells in which an empty expression vector (pAKKO-111H) into which no ligand gene was inserted was transiently expressed by the method of Example 5 was also added in the same manner. At that time, the expression supernatant was diluted 2 times, 4 times, 8 times and 16 times with the assay buffer. Incubate at 37 ° C for 4 hours after adding the supernatant to promote or suppress transcription / translation of the reporter (luciferase) gene derived from intracellular signal transduction induced by the agonist activity of the ligand via the receptor. Induced. After completion of the incubation, the assay buffer in each well was removed, and 50 μl of PicaGene LT2.0 (Toyo Ink) luminescent substrate was added. After the cells were lysed and thoroughly mixed with the substrate, the amount of luminescence derived from the expression induction amount of the reporter gene in each well was measured using a plate reader (ARVOsx multilabel counter, PerkinElmer). As a result, suppression of reporter gene expression was detected as a decrease in luciferase activity only when the culture supernatant of pAK-S64 was added (FIG. 8). Furthermore, the degree of this suppression was dependent on the concentration of the culture supernatant of pAK-S64. This indicates that the product expressed by the plasmid inserted into pAK-S64 transduced intracellular signals via GPR7, that is, acted as a ligand for GPR7.
[0140]
Example 7 Detection of suppression of luciferase activity in CHO cells in which TGR26 was transiently expressed using S64-expressing cell supernatant
A TGR26 expression plasmid DNA was prepared in the same manner as in Example 4 using a plasmid in which the TGR26 DNA obtained in Reference Example 3 was inserted into an animal cell expression plasmid pAKKO-111H by a method known per se. This was also expressed transiently together with the luciferase gene in CHO cells by the method shown in Example 4. To this cell, the pAK-S64 expression culture supernatant prepared in Example 5, the culture supernatant of a cell expressing only an empty expression vector, and forskolin were added to a final concentration of 2 μM, and the same as in Example 6. Attempts were made to detect ligand activity by this method. As a result, the supernatant of pAK-S64 reduced the luciferase activity increased by forskolin in a concentration-dependent manner (FIG. 9).
[0141]
Example 8 Suppression of cAMP production in GPR7-expressing CHO cells by S64-expressing cell supernatant
Using the GPR7 expression plasmid prepared in Example 4, a GPR7 stable expression CHO cell, CHO-GPR7, was prepared by a method known per se. Mock CHO cells into which CHO-GPR7 or the receptor gene has not been introduced are seeded in a 96-well plate (Becton Dickinson) at a concentration of 20000 cells / well, and 37 ° C., 5% CO 2. 2 The overnight culture was used for the assay. The sample buffer used was Dulbecco's modified medium (DMEM, Gibco) supplemented with 0.1% bovine serum albumin (Sigma) and 0.2 mM IBMX (Sigma). Wash cells twice with sample buffer, 37 ° C 5% CO 2 After 30 minutes preincubation at 37 ° C, the cells were further washed twice and samples added to 37 ° C 5% CO 2 For 30 minutes. Sample was sample buffer only (no treatment), 1 μM forskolin (Wako Pure Chemical Industries) which is a reagent for promoting the increase of cAMP production, and culture of CHO cells obtained by transiently expressing pAK-S64 in Example 5 There were 4 types, namely, those in which Kiyoshi and forskolin were added at the same time (S64 supernatant), and those in which culture supernatant of CHO cells expressing pAKKO-111H (pAKKO supernatant) and forskolin were added at the same time. After incubation with the sample, the amount of intracellular cAMP production was measured using a cAMP Screen System (ABI). As a result, by adding the S64 supernatant, an inhibition reaction of intracellular cAMP production was specifically observed in CHO-GPR7 (FIG. 10), and no inhibition reaction of intracellular cAMP production was observed in mockCHO cells ( FIG. 11).
[0142]
Example 9 Examination of tissue distribution of GPR7 ligand mRNA in rats by RT-PCR
Various organs were removed from Wistar rats, and total RNA was extracted from Isogen (Nippon Gene), poly (A). + RNA was prepared by mRNA purification kit (Pharmacia) according to each manual. Obtained poly (A) + After 1 μg of RNA was treated with DnaseI (Amplification Grade, GIBCO BRL), 160 ng was synthesized with RNA PCR Kit (Takara) at 42 ° C. according to the manual. The synthesized cDNA is poly (A). + A solution of 4 ng / μl in terms of RNA was used as a template for subsequent RT-PCR. RT-PCR uses Sequence Detection System Prism 7700 (PE Biosystems), 5′-CTGTCGAGGTTCCACAGGTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 63), 5′-TTGCCGCAGAGTCGGTCCGTGTGTCGGTCCGTGTCCGTGT 64) and 5 ′-(Fam) -CGTGCCCAAGAAACGCGTGACCCTTGTT- (Tamra) -3 ′ (SEQ ID NO: 65) was used as TaqMan probe. The RT-PCR reaction solution was 12.5 μl of TaqMan Universal PCR Master Mix (PE Biosystems), 0.05 μl of 100 μM primer solution, 0.5 μl of 5 μM TaqMan probe, and 0.5 μl of the cDNA solution prepared above. 5 μl was added, and the total reaction volume was adjusted to 25 μl with distilled water. In the PCR reaction, a cycle of 50 ° C. for 2 minutes and 95 ° C. for 10 minutes was followed by 40 cycles of 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 1 minute. The mRNA expression level of GPR7 ligand in the various rat tissues obtained was poly (A). + The number of copies per 1 ng of RNA was calculated (FIG. 12).
[0143]
Example 10 Purification of endogenous GPR7 ligand from bovine hypothalamus
Since human GPR7 ligand precursor mRNA was found to be highly expressed in the hypothalamus and spinal cord, purification of endogenous GPR7 ligand was carried out using human GPR7-expressing CHO cells starting from bovine hypothalamus. The measurement was performed using cAMP production inhibitory activity (measured using cAMP-Screen System (ABI)) as an index.
First, 1.0 kg of cryopreserved bovine hypothalamus was boiled in Milli-Q water, and after cooling, acetic acid was added to 1M and homogenized with Polytron. After stirring overnight, a supernatant was obtained by centrifugation. Trifluoroacetic acid (TFA) was added to the supernatant to 0.05% and applied to a C18 column (Prep C18 125Å; Waters). The peptide bound to the column was eluted stepwise with 10, 40, 60% acetonitrile containing 0.5% TFA. The 40% acetonitrile fraction was diluted with twice the amount of 20 mM ammonium acetate (pH 4.7) and applied to an ion exchange column HiPrep CM-Sepharose FF (Pharmacia). Elute with a gradient of 0-0.5 M NaCl in 20 mM ammonium acetate (pH 4.7) containing 10% acetonitrile peptide bound to the ion exchange column. Two times the amount of cold acetone was added to the NaCl fraction (0.3 to 0.35 M) containing the most active substance, the precipitate was removed by centrifugation, and the supernatant was concentrated by evaporation. TFA was added to the concentrated supernatant to 0.1%, and further separation was performed with a reverse phase HPLC column RESOURCE RPC (Pharmacia). The RESOURCE RPC separation was performed with a gradient of 20-30% acetonitrile, and the main activity was eluted with approximately 22% acetonitrile. Three times the amount of cold acetone was added to this active fraction, the precipitate was removed by centrifugation, and the supernatant was concentrated by evaporation. TFA was added to the concentrated supernatant to 0.1%, and further separation was performed on a reverse phase HPLC column Vydac C18 218TP5415 (Vydac). Separation of Vydac C18 218TP5415 was performed with a gradient of 20-30% acetonitrile, and the main activity was eluted with approximately 25% acetonitrile. This active fraction was added to a cation exchange column TSK-gel CM-2SW (Toso-sodium) using a concentration gradient of 0.3 to 0.5 M NaCl in 20 mM ammonium acetate (pH 4.7) containing 10% acetonitrile. ), The main activity eluted at approximately 0.5M NaCl. TFA was added to the fraction of CM-2SW column containing activity to 0.1%, and finally purified with a reverse phase column μRPC C2 / C18 SC2.1 / 10 using a concentration gradient of 16-24% acetonitrile, A single peak consistent with activity was obtained (FIG. 13).
[0144]
Example 11 N-terminal amino acid sequence analysis of final purified sample and molecular weight measurement by mass spectrum
About half amount of the final purified sample obtained in Example 10 was analyzed by N-terminal amino acid with a protein sequencer (model 491cLC; Applied Biosystems), and the other half amount was analyzed by ESIMS (Thermoquest).
As a result of N-terminal sequence analysis, the sequence corresponding to positions 26 to 49 of the bovine GPR7 ligand precursor could be read from the 2nd cycle to the 25th cycle (FIG. 14). Since cycle 1 could not be identified (x), it was presumed to have undergone post-translational modification. From the second cycle onward, the sequence was clearly identified.
In the ESIMS measurement (upper part of FIG. 15), a value of 3241.5 was obtained from the measurement in the full mass scan mode. From the molecular weight calculated from the mass spectrum and the analysis results of the MS / MS spectrum (lower part of FIG. 15), it was estimated that any of the N-terminal 2 residues was post-translationally modified. Considering the results of N-terminal sequence analysis, it was estimated that the 1-position Trp was modified.
Considering the isotope profile of the trivalent molecular ion measured in the zoom scan mode (FIG. 16), it was estimated that this substance is a 29-residue GPR7 ligand and the 1-position tryptophan residue is brominated.
In order to confirm this estimation, PTH standards were prepared from DL-5-bromotryptophan (Aldrich) and DL-6-bromotryptophan (Biosynth) and analyzed. DL-5-bromotryptophan or DL-6-bromotryptophan (200 nmol) was added ethanol: triethyamine: DW: phenylisothiocyanate (sigma) = 7: 1: 1: 1 20 ul and reacted at room temperature for 20 minutes. After drying, 50 ul of TFA was added to 50 ul. The mixture was reacted at 10 ° C. for 10 minutes, dried and then added with 50 ul of 2N HCl: methane = 1: 1, reacted at 50 ° C. for 10 minutes, and purified by reverse phase HPLC to obtain 5-bromotryptophan or 6-bromotryptophan PTH derivative. The final product was confirmed using a protein sequencer (FIGS. 17 and 18). These PTH derivatives were mixed with a 20 amino acid PTH standard (ABI), a protocol for separating them was prepared (Tables 1 and 2), and endogenous bovine GPR7 ligands were analyzed. The amino acid at position 1 was PTH-6- It coincided with the peak of bromotryptophan (FIG. 19).
From these analysis results, the final purified preparation from the bovine hypothalamus is a peptide consisting of 29 amino acids (SEQ ID NO: 67) corresponding to the 25th position Arp to the 53rd position Ala of the bovine GPR7 ligand precursor, and the 1st position Trp is translated. It was found to be 6-brominated by post-modification.
[0145]
[Table 1]
Figure 0004128030
Table 1 shows a comparison of the cycle and gradient of the normal peptide method (Pulsed-Liquid cLC) and the bromotryptophan method (BrTrp-liquid cLC).
[0146]
[Table 2]
Figure 0004128030
Table 2 shows a comparison of the 491cLC protein sequencer (ABI) gradients prepared for normal peptides (Normal 1 cLC) and bromotryptophan analysis (Normal for BrW cLC, BrTrp cLC).
[0147]
N-terminal sequence analysis was performed using a 491cLC protein sequencer (ABI), which was obtained by improving a normal peptide analysis method (Normal 1cLC) for bromotryptophan analysis (BrTrp-liquid cLC). Except for the above conditions, the manufacturer's manual was followed. Using an improved gradient (BrTrp cLC), it is possible to discriminate 5- / 6-bromotryptophan with different Br addition positions.
When analyzed using the improved method, BrTrp-liquid cLC, the gradient for 5- / 6-bromotryptophan analysis (BrTrp cLC) is applied only to the blank, standard and up to the second cycle, and a different gradient (Normal for BrW cLC) is applied.
[0148]
Example 12 Acquisition of bovine GPR7 ligand precursor gene from bovine hypothalamic cDNA by PCR
Using bovine hypothalamic cDNA as a template, PCR amplification was performed using the following two synthetic DNAs.
BF1: 5'-CCCATGGCCGGGCCCGCGATGCTGGTCGCC-3 '(SEQ ID NO: 82)
BR1: 5'-TCACTTGCGACAGTCCGAGGCGCTGAGCGA-3 '' (SEQ ID NO: 83)
PCR reaction solution is 1 μl of cDNA solution, 0.5 μl BF1 (10 μM), 0.5 μl BF2 (10 μM), 2.5 μl attached 10 x reaction solution, 2.5 μl dNTP (10 mM), 0.5 μl KlenTaq (clone Tech), 17.5 μl Otsuka distilled water was added to make a total of 25 μl. The reaction solution was subjected to PCR reaction using ThermalCycler 9600. PCR conditions were as follows: denaturation at 95 ° C for 2 minutes, followed by 35 cycles of 98 ° C for 10 seconds, 60 ° C for 20 seconds, and 72 ° C for 20 seconds. After confirming the amplification of a PCR product of about 400 bp by electrophoresis using a part of the PCR product, the PCR product was purified using the Quiagen PCR purification Kit and directly sequenced. As a result, the sequence shown in FIG. 20 was obtained. I was able to. The amino acid sequence predicted from the DNA sequence of FIG. 20 was as shown in FIG. Next, the PCR product collected from the gel was subcloned into E. coli JM109 using a TA cloning kit (Invitrogen) to obtain E. coli JM109 / pTAbGPR7L-1. Plasmid pTAbGPR7L-1 was extracted from Escherichia coli obtained by subcloning using a plasmid extractor (Kurabo), the base sequence of the inserted fragment was determined, and the sequence was confirmed to be bovine GPR7 ligand cDNA.
[0149]
Example 13 Synthesis of GPR7 ligand
GPR7 ligand (GPR7L) and GPR8 ligand (GPR8L) were synthesized on an ABI 433 peptide synthesizer using the Fmoc / DCC / HOBt protocol. DL-6-Bromotryptophan (Biosynth) was converted to Boc-DL-6-bromotryptophan-OMe and then chirally resolved, and each was used for peptide synthesis.
(1) DTrp (6Br) 1-human GPR7L (29) (obtained by bromination at position 6 of the N-terminal D-tryptophan in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4):
(D-Trp (6Br) -Tyr-Lys-Pro-Ala-Ala-Gly-His-Ser-Ser-Tyr-Ser-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Gly- Leu-Arg-Arg-Ser-Pro-Tyr-Ala),
(2) LTrp (6Br) 1-human GPR7L (29) (the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is brominated at position 6 of the N-terminal L-tryptophan):
(Trp (6Br) -Tyr-Lys-Pro-Ala-Ala-Gly-His-Ser-Ser-Tyr-Ser-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Gly-Leu- Arg-Arg-Ser-Pro-Tyr-Ala),
(3) Trp1-human GPR7L (29) (SEQ ID NO: 4):
(Trp-Tyr-Lys-Pro-Ala-Ala-Gly-His-Ser-Ser-Tyr-Ser-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Gly-Leu-Arg-Arg -Ser-Pro-Tyr-Ala),
(4) Trp1-human GPR7L (23) (SEQ ID NO: 1):
(Trp-Tyr-Lys-Pro-Ala-Ala-Gly-His-Ser-Ser-Tyr-Ser-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Gly-Leu),
(5) DTrp (6Br) 1-bovineGPR7L (29) (the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 67 is brominated at position 6 of the N-terminal D-tryptophan):
(D-Trp (6Br) -Tyr-Lys-Pro-Thr-Ala-Gly-Gln-Gly-Tyr-Tyr-Ser-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Gly- Phe-His-Arg-Ser-Pro-Tyr-Ala),
(6) LTrp (6Br) 1-bovineGPR7L (29) (the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 67 is brominated at position 6 of the N-terminal L-tryptophan):
(Trp (6Br) -Tyr-Lys-Pro-Thr-Ala-Gly-Gln-Gly-Tyr-Tyr-Ser-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Gly-Phe- His-Arg-Ser-Pro-Tyr-Ala),
(7) Trp1-bovineGPR7L (29) (SEQ ID NO: 67):
(Trp-Tyr-Lys-Pro-Thr-Ala-Gly-Gln-Gly-Tyr-Tyr-Ser-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Gly-Phe-His-Arg -Ser-Pro-Tyr-Ala),
(8) Trp1-ratGPR7L (29) (SEQ ID NO: 6):
(Trp-Tyr-Lys-Pro-Ala-Ala-Gly-Ser-HisI-His-Tyr-Ser-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Ser-Phe-His-Arg -Phe-Pro-Ser-Thr),
(9) Trp1-ratGPR7L (24) (SEQ ID NO: 3):
(Trp-Tyr-Lys-Pro-Ala-Ala-Gly-Ser-His-His-Tyr-Ser-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Ser-Phe-His)
(10) Trp1-human GPR8L (23) (SEQ ID NO: 100):
(Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu) (WO01 / 98494)
[0150]
Example 14 Effect of GPR7 Ligand on Food Intake by Rat Intraventricular Administration The effect of GPR7 ligand (GPR7L) on food intake by rat intracerebroventricular administration was examined. Rats were housed at a room temperature of 25 ° C. with a lighting time of 8 to 20 hours. Adult Wistar male rats (body weight 300 to 320 g at the time of surgery) were anesthetized by intraperitoneal administration of pentobarbital 50 mg / kg and fixed to a rat brain stereotaxic apparatus. The incisor bar was 3.3 mm lower than the interoral line. The skull was exposed and a hole was drilled in the bone using a dental drill to embed a guide cannula AG-8 (inner diameter 0.4 mm, outer diameter 0.5 mm, Aicom) in the lateral ventricle. In addition, anchor screws were buried in the three surrounding areas. A stainless steel guide cannula, AG-8, was inserted so that its tip was located above the lateral ventricle. The stereotaxic coordinates were AP: -0.8 mm, L: 1.5 mm, H: -4.5 mm from Bregma according to the atlas of Paxinos and Watson (1998). The guide cannula was fixed to the skull with dental cement and anchor screws. A stainless steel dummy cannula, AD-8 (outer diameter 0.35 mm, Aicom) was inserted into the guide cannula and fixed with a cap nut (Aicom). After surgery, rats were housed in individual cages.
After embedding the guide cannula for about one week, wait for postoperative recovery, remove the cap nut and dummy cannula attached to the rat skull, and replace them with a Teflon tube (length 50 cm, inner diameter 0.1 mm) A stainless steel microinjection cannula AMI-9 (inner diameter 0.17 mm, outer diameter 0.35 mm, Aicom) connected to an outer diameter 0.35 mm, Aicom) was inserted. The length of the microinjection cannula was adjusted so that its tip 1 mm was exposed from the guide cannula. One end of a Teflon (registered trademark) tube is connected to a micro syringe pump to dissolve sterilized distilled water (Otsuka Pharmaceutical) and unbrominated GPR7L synthesized in Example 13 (Trp1-bovineGPR7L (29), SEQ ID NO: 67). A total of 10 μl (10 nmol / rat) of the distilled water was injected into the lateral ventricle at a flow rate of 5 μl / min. After 2 minutes from the end of the injection, the microinjection cannula was removed, and the dummy cannula was again fixed with a cap nut. The injection was performed between 19:00 and 20:00, and the subsequent food intake was measured over time using a food intake measurement measure Feed-Scale (Columbus). As shown in FIG. 22, in the GPR7L administration group that was not brominated, a significant increase in food consumption was observed compared to the subject group 2 hours after administration.
[0151]
Example 15 FTMS measurement of bovine endogenous GPR7 ligand
Bovine endogenous GPR7L was subjected to ESIFTMS analysis using ApexII (Bruker Daltonics) (upper part of FIG. 23). [M + 5H] in the middle of FIG. 5+ Enlarged view of ions, 1M-added bovine GPR7L [M + 5H] 5+ The isotope theory profile of ion is shown. The modified product was identified as Br because the isotope profile and mass value were in good agreement.
[0152]
Example 16 Examination of tissue distribution in human of GPR7 ligand mRNA by RT-PCR
The mRNA expression level was determined in the same manner as in Example 9. However, as a template cDNA, one synthesized from polyA + RNA (Clontech) derived from various human tissues by the following method was used. Using 1 μg of RNA as a random primer and SuperScript II reverse transcriptase (GIBCO BRL) as a reverse transcriptase, the reaction was carried out at 42 ° C. according to the attached manual. After completion of the reaction, ethanol precipitation was performed and dissolved in 100 μl. The amount of expression was also quantified using Sequence Detection System Prism 7700 in the same manner as in Example 9. However, 5'-CGCTCCCAGCCCTACAGA-3 '(SEQ ID NO: 90), 5'-TCGCCTTGCACTGGTAGGTC-3' (SEQ ID NO: 91) as primers for amplification and detection, and 5 '-(Fam) AGCCTCGCTGTGTGCGTCCAGGAC- (Tamra) as TaqMan probe ) -3 ′ (SEQ ID NO: 92) was used.
The mRNA expression level of GPR7 in the obtained various human tissues is poly (A). + The number of copies per 1 ng of RNA was calculated (FIG. 24).
[0153]
Example 17 Examination of tissue distribution of rat GPR7 (rat TGR26) mRNA by RT-PCR
The mRNA expression level was determined in the same manner as in Example 9. Using the cDNA derived from various rat organs used in Example 9, the expression level of rat GPR7 mRNA was determined. However, 5′-TGCGTGCTATCCAGCTAGACAG-3 ′ (SEQ ID NO: 93), 5′-AGAGGAGGCACACAGCCAGAAT-3 ′ (SEQ ID NO: 94) and 5 ′-(Fam) CGTGCCAAGAAACGCGTGACCTTGTT- (Tamura) as TaqMan probe as primers for amplification and detection ) -3 ′ (SEQ ID NO: 95) was used.
The amount of GPR7 mRNA expression in the various rat tissues obtained was poly (A). + The number of copies per 1 ng of RNA was calculated (FIG. 25).
[0154]
Example 18 Acquisition of bovine GPR7 gene from bovine hypothalamic cDNA by PCR Using the bovine hypothalamic cDNA as a template, the following two types of synthetic DNA were used for PCR amplification.
BGPR7F: 5'-GTCGACCGAGTGTCTGTCCTCGCCAGGATG-3 '(SEQ ID NO: 96)
BGPR7R: 5'-GCTAGCTCCTTGTTATCGGGCTCAGGAGGTGGT-3 '(SEQ ID NO: 97)
PCR reaction solution is cDNA solution 1 microl, 0.5 microl BGPR7F (10 microM), 0.5 microl BGPR7R (10 microM), 2.5 microl attached 10 x reaction solution, 2.5 microl dNTP (10 mM), 0.5 microl KlenTaq (clone) Tech), 17.5 microl Otsuka distilled water was added to make a total of 25 microl. The reaction solution was subjected to PCR reaction using ThermalCycler 9600. PCR was performed at 95 ° C for 2 minutes, followed by 40 cycles of 98 ° C for 10 seconds, 60 ° C for 20 seconds, and 72 ° C for 60 seconds. After confirming amplification of a PCR product of about 1000 bp by electrophoresis using a part of the PCR product, the PCR product was purified using Quiagen PCR purification Kit (Qiagen) and directly sequenced. The sequence shown by is obtained. The amino acid sequence predicted from the DNA sequence of FIG. 26 was as shown in FIG. Next, the PCR product recovered from the gel was subcloned into E. coli JM109 using a TA cloning kit (Invitrogen) to obtain E. coli JM109 / pTAbGPR7. Plasmid pTAbGPR7 was extracted from Escherichia coli obtained by subcloning using a plasmid extractor (Kurabo), the base sequence of the inserted fragment was determined, and the sequence was confirmed to be bovine GPR7 receptor cDNA.
[0155]
Example 19 Acquisition of bovine GPR8 gene from bovine hypothalamic cDNA by PCR
Using bovine hypothalamic cDNA as a template, PCR amplification was performed using the following two synthetic DNAs.
BGPR8F: 5'-GTCGACCATGATGGAGGCCACTGGGCTGGAAGG-3 '(SEQ ID NO: 98)
BGPR8R: 5'-GCTAGCTTATGCCCCCTGGCACCGACATGCGGT-3 '(SEQ ID NO: 99)
The PCR reaction was performed in the same manner as in Example 18. The obtained PCR product was purified using a Quiagen PCR purification Kit and directly sequenced to obtain the sequence shown in FIG. The amino acid sequence predicted from the DNA sequence of FIG. 28 was as shown in FIG. Next, the PCR product recovered from the gel was subcloned into E. coli JM109 using a TA cloning kit to obtain E. coli JM109 / pTAbGPR8. Plasmid pTAbGPR8 was extracted from E. coli obtained by subcloning using a plasmid extractor, the nucleotide sequence of the inserted fragment was determined, and the sequence was confirmed to be bovine GPR8 cDNA.
[0156]
Example 20 Purification of GPR7 ligand from culture supernatant of CHO cells expressing human GPR7 ligand
2 L of the culture supernatant of human GPR7 ligand-expressing CHO cells constructed in Example 5 was collected and stored at −80 ° C. The culture supernatant was boiled with a hot water bath after thawing, and further centrifuged to obtain a supernatant. Trifluoroacetic acid (TFA) was added to the supernatant to 0.05%, and applied to a C18 column (Prep C18 125Å; Waters). The peptide bound to the column was eluted stepwise with 10, 40, 60% acetonitrile containing 0.5% TFA. The 40% acetonitrile fraction was diluted with three times the amount of 20 mM ammonium acetate (pH 4.7) and applied to an ion exchange column HiPrep CM-Sepharose FF (Pharmacia). Elution was performed with a concentration gradient of 0 M to 0.5 M NaCl in 20 mM ammonium acetate (pH 4.7) containing 10% acetonitrile peptide bound to the ion exchange column. A portion of each fraction was desalted using Sep-Pak plus C18 Cartridge (Waters), and then the intracellular cAMP production inhibitory activity specific to human GPR7-expressing CHO cells was measured. TFA was added to a CM-Sepharose fraction in which specific activity was found in human GPR7-expressing CHO cells to 0.1%, and further separation was performed using a reverse phase HPLC column RESOURCE RPC (Pharmacia). RESOURCE RPC separation was performed with a concentration gradient of 15-30% acetonitrile, and the intracellular cAMP production inhibitory activity specific to the main human GPR7-expressing CHO cells was eluted with approximately 22% acetonitrile. This active fraction was separated on a cation exchange column TSK gel CM-SW (Tosoh Corporation) using a concentration gradient of 0.2-0.5M NaCl in 20 mM ammonium acetate (pH 4.7) containing 10% acetonitrile. As a result, the main intracellular cAMP production inhibitory activity was eluted with approximately 0.3 M NaCl. TFA was added to 0.1% to this CM-2SW column fraction, and the final purification was performed with a reverse phase column μRPC C2 / C18 SC2.1 / 10 using a 15-22% acetonitrile concentration gradient. A peak was obtained, which was consistent with the inhibitory activity of intracellular cAMP production specific to human GPR7-expressing CHO cells (FIG. 30).
When the N-terminal amino acid of this final purified sample was analyzed with a protein sequencer (model 492; Applied Biosystems), the amino acid sequence shown in FIG. 31 was obtained.
Further, when the molecular weight of the final purified sample was measured using ESI-MS (ThermoQuest), a value of 2505.6 was obtained (FIG. 32).
From these analysis results, it was found that the final purified sample was a peptide consisting of 24 amino acids corresponding to the precursors Trp25 to Arg48.
[0157]
Example 21 Production of iodine-labeled human GPR7 ligand
hGPR7L-23 (SEQ ID NO: 1) (0.1 mM or 1 mM) 20 μl, lactoperoxidase (Sigma, 10 μg / mL prepared using 0.1 M HEPES-NaOH pH 7.0) 20 μl, Idoine-125 (Amersham, IMS-30, 74MBq) 20 μl, 0.005% hydrogen peroxide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 20 μl, mixed and allowed to stand at room temperature for 20-30 minutes, then 0.1% TFA 600 μl was added and separated by reverse phase HPLC. Two labeled peaks were separated by a tube containing 1 mL DMSO. Immediately stored on ice, a portion was diluted 1/100 and the radioactivity was measured with a γ-counter. The remaining samples were dispensed and stored at -30 ° C.
[0158]
Example 22 Preparation of CHO cell membrane fraction expressing human GPR7
Wash the flask containing human GPR7-expressing CHO cells with 5 mM EDTA / PBS, peel off the cells with 5 mM EDTA / PBS, collect the cells by centrifugation, and collect 25 mL of a gentle buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7. 5, 5 mM EDTA, 0.1% bovine serum albumin (manufactured by Sigma), 0.5 mM PMSF (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), 20 μg / mL leupeptin (manufactured by Peptide Institute), 0.1 μg / mL pepstatinA (manufactured by Peptide Institute), Suspended in 4 μg / mL E-64 (Peptide Institute) and homogenized on ice using polytron (12,000 rpm, 15 seconds × 3 times). This was centrifuged at 4 ° C. and 1,000 g for 10 minutes with a high-speed cooling centrifuge, and the supernatant was collected. 25 mL of a buffer for membrane fraction preparation was added to the precipitate, and the supernatant was recovered by the same operation. These supernatants were collected, applied to a cell strainer, dispensed into a tube for ultracentrifuge, and centrifuged at 4 ° C., 100,000 g for 1 hour. The pellet is collected, suspended in a small amount of membrane fraction preparation buffer, suspended using a Teflon (registered trademark) homogenizer, the amount of protein is measured using a portion, and the rest is dispensed. Stored at ° C.
[0159]
Example 23 Scatchard analysis using human GPR7-expressing CHO cell membrane fraction
Human GPR7-expressing CHO cell membrane fraction, [Tyr ( 125 I) 11 Scatchard analysis was performed using] -hGPR7L-23 (SEQ ID NO: 1). Buffer for assay (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM EDTA, 0.1% bovine serum albumin (Sigma), 0.5 mM PMSF (Wako Pure Chemical Industries), 20 μg / mL leupeptin (Peptide Institute), 0.1 Dilute the membrane fraction to a final concentration of 1 μg / well with μg / mL pepstatinA (Peptide Laboratories), 4 μg / mL E-64 (Peptide Laboratories)), and label the final concentration 400 pM, 200 pM, Dilute to 100 pM, 50 pM, 25 pM, and 10 pM. Using a 96-well polypropylene plate, dispense 50 μl each of assay buffer alone (total) and a final concentration of 2 μM hGPR7L-23 (NSB), add 25 μl of the labeling solution to each well, and then stir and dilute the membrane fraction. Mix and agitate 25 μl, incubate at room temperature for 1.5 hours, and filter unit (GF / C, polyethylene, pre-wetted with washing buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5) using a 96-well plate cell harvester. (Imine treatment) was adsorbed, washed 5 times with a washing buffer solution, and sufficiently dried. As an input, the labeled diluent was directly added to the filter unit (GF / C, treated with polyethyleneimine) and dried. 50 μl of liquid scintillator was dispensed into these, the radioactivity was measured with a top count (Packard), and the data was analyzed in triplicate (FIG. 33) to obtain values of Bmax = 1.28 pmol / mg protein, Kd = 35.5 pM It was.
[0160]
Example 24 Inhibition experiment of binding of various peptides to CHO cells expressing human GPR7
Using the assay buffer, the membrane fraction of human GPR7-expressing CHO cells was diluted to a final concentration of 1 μg / well, and hGPR7L-23 iodine labeled (SEQ ID NO: 1) was diluted to a final concentration of 100 pM. The peptides shown in Table 3 are 10 -2 M or 10 -3 M stock solution with a final concentration of 10 -Five M, 10 -6 M, 10 -7 M, 10 -8 M, 10 -9 M, 10 -Ten M, 10 -11 Diluted with assay buffer to M. Final concentration 10 as NBS -Five M hGPR7L-23 was prepared. Using a 96-well plate made of polypropylene, dispense 50 μl of the prepared sample solution, NSB, and assay buffer as a total, add 25 μl of iodine labeled diluent, stir, and then add 25 μl of human GPR7-expressing CHO cell membrane fraction solution. The solution was dispensed, stirred, and incubated at room temperature for 1.5 hours. Using a cell harvester for 96-well plates, this was adsorbed to a filter unit pre-wetted with washing buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5), washed 6 times with washing buffer, and then dried thoroughly. I let you. 50 μl of liquid scintillator was dispensed, radioactivity was measured with TopCount (Packard), and data was analyzed in triplicate. Table 3 shows the results of experiments for inhibiting the binding of various peptides to CHO cell membrane fractions expressing human GPR7. 50 Indicates the value.
[Table 3]
Figure 0004128030
[0161]
Example 25 Comparison of agonist activity of various peptides against GPR7 and GPR8 expressing CHO cells
The intracellular cAMP production inhibitory activity of various GPR7 ligand-related peptides against CHO cells expressing human GPR7, bovine GPR8, human GPR8, bovine GPR8, and rat GPR7 was examined. Each receptor-expressing cell is placed in a 96-well plate at 4 x 10 Four Passed in pieces / well, 37 ℃, 5% CO 2 Cultured for one day at 95% air. As an assay buffer, Hanks' Balanced Salt Solution (Gibco) was prepared by adding 20 mM HEPES pH 7.4, 0.1% bovine serum albumin, 0.2 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (Sigma). The plate cultured overnight was first washed twice with 150 μl of assay buffer, then replaced with 150 μl of assay buffer, and incubated for 30 minutes at 37 ° C. and 100% air. Prepare a sample dilution buffer with 4 μM forskolin added to the assay buffer. -2 M or 10 -3 M) is diluted to a final concentration of 10 -6 M, 10 -7 M, 10 -8 M, 10 -9 M, 10 -Ten A sample solution was prepared to be M. The plate cultured for 30 minutes in the assay buffer was taken out, washed twice with the assay buffer, and then added with 50 μl of the assay buffer and then 50 μl of the sample solution. Measurement was performed in triplicate for each sample. In addition, the same amount of assay buffer was added for basal level measurement, and forskolin was added for maximum level measurement. Plates are incubated for 30 minutes at 37 ° C, 100% air, and the amount of intracellular cAMP is determined by cAMP-Screen TM Using System (ABI), measurement was performed according to the protocol of this kit. The difference between the amount of cAMP at the Maximam level and the amount of cAMP when each sample was added was calculated, and the percentage of the amount of cAMP production promoted by forskolin was calculated. This was used as the inhibition rate of cAMP production. Table 4 shows the IC of each sample. 50 Indicates the value.
[Table 4]
Figure 0004128030
[0162]
Example 9 Examination of expression distribution in rat brain of GPR7 ligand mRNA by in situ hybridization method
Wistar rats were laparotomized under Nembutal anesthesia and perfused with 250 ml of 0.9% saline from the left ventricle followed by 250 ml of 4% paraformaldehyde solution. The removed brain was immersed in the same solution at 4 ° C. for 4 hours, then replaced with a 20% sucrose solution, and immersed at 4 ° C. for 3 days to obtain a brain sample for analysis.
GPR7 ligand antisense and sense probe were prepared by the following method.
First, rat type GPR7 ligand cDNA was inserted into the plasmid vector pBluescript II KS + (Stratagene) by a method known per se. This plasmid was treated with a restriction enzyme using BamHI or XbaI, inactivated, and then dissolved in TE so as to be 0.52 μg / ml and 0.47 μg / ml, respectively. 2 μl of BamHI-treated, T3 RNA polymerase (Roche) 40 U, supplemented 10X buffer 2 μl, RNase inhibitor (Roche) 20 U, DIG RNA Labeling Mix, 10 X (Roche) 2 μl in water to a final volume of 20 μl And reacted at 37 ° C. for 2 hours. After stopping the reaction by adding 2 μl of 0.2M EDTA, the riboprobe generated by ethanol precipitation was recovered and used as an antisense probe. In addition, 2 μl of the XbaI-treated product, T3 RNA polymerase (Roche) 40 U, supplemented 10X buffer 2 μl, RNase inhibitor (Roche) 20 U, DIG RNA Labeling Mix, 10 X (Roche) 2 μl to a final volume of 20 μl. Water was added and reacted at 37 ° C. for 2 hours. After stopping the reaction by adding 2 μl of 0.2M EDTA, the riboprobe generated by ethanol precipitation was recovered and used as a sense probe. Each concentration was measured and dissolved in RNase-free water so that the antisense probe concentration was 0.29 μg / ml and the sense probe concentration was 0.27 μg / ml.
In situ hybridization was performed by the following method. The brain sample prepared above was prepared with a cryostat CM3050 (Leica Co., Ltd.) to a thickness of 25 microns at a forehead. The generated sections were washed twice with 10 ml of 4XSSC for 5 minutes, and then Protenase K (Sigma) was added at a final concentration of 2.5 mg / kg in 10 ml of PK buffer (pH 7.4, 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA). Add to ml and react at 37 ° C. for 10 minutes. Wash twice with 10 ml 4X SSC for 5 minutes. Acetic anhydride was added to 10 ml of acetylation buffer (pH 7.5, 100 mM triethanolamine) so as to be 0.25%, and the mixture was reacted at room temperature for 10 minutes. Wash with 10 ml of 4XSSC for 5 minutes. After performing this operation twice, a hybrid buffer (pH 7.4, 60% formamide, 10 mM Tris-HCl, 200 μg / ml yeast t-RNA, 1 × Denhardt, 10% dextran sulfate, 600 mM NaCl, 0.25% SDS, A section was added to a solution in which the antisense and sense probes were added to 1 ml of 1 mM EDTA (0.2 μg / ml) and hybridized at 55 ° C. for 13 hours. Washed twice with 10 ml wash buffer (2XSSC, 50% formamide) at 55 ° C. for 15 minutes. RNase A (Sigma) was added to RNase buffer (pH 8.0, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.5 M NaCl) so that the concentration was 2.5 μg / ml, and the sections were transferred and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. Washed for 15 minutes at 55 ° C. with 10 ml wash buffer. This operation was repeated twice and then washed with 0.4XSSC at 55 ° C. for 15 minutes. The section is transferred to a solution obtained by dissolving 0.1 g of blocking solution (Roche) in 10 ml of buffer A (pH 7.5, 100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl), and allowed to react at room temperature for 1 hour. Sections were transferred to 1 ml of Buffer A containing 0.1% Triton X-100 and 0.75 U of anti-digoxigenin-AP and Fab fragments (Roche) were added, and reacted at 4 ° C. for 16 hours. Thereafter, it was washed with 10 ml of buffer A at room temperature for 15 minutes. This operation was repeated twice, and then washed with 10 ml of buffer B (pH 9.5, 100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl 2) at room temperature for 15 minutes. 40 μl of NBT solution (Roche) and 35 μl of X-phosphate solution were added to 10 ml of buffer B, and the sections were transferred to perform a color reaction. After 24 hours of reaction at room temperature, transfer to 50 ml of TE. The section is attached to a MAS-coated slide glass (Matsunami glass), air-dried, and then a cover glass is attached with a mounting medium (50% glycerol, 5% gelatin). Antisense probes were specifically colored in the medial preoptic area of the hypothalamus, lateral preoptic area, lateral hypothalamic area, hippocampal hippocampal pyramidal cells CA1-CA3, and midbrain aqueduct It was the ventral part. In these regions, color development by the sense probe was not detected.
[0163]
【The invention's effect】
The peptide of the present invention and its DNA, the bovine GPR7 and its DNA of the present invention, and the bovine GPR8 and its DNA of the present invention are useful, for example, as a preventive / therapeutic agent for anorexia and an appetite (feeding) enhancer. .
Furthermore, the peptides of the present invention are also useful for screening GPR7 agonists and antagonists.
[0164]
[Sequence Listing]
Figure 0004128030
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[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the DNA sequence of human GPR7 ligand precursor H.
FIG. 2 shows the amino acid sequence of human GPR7 ligand precursor H.
FIG. 3 shows the DNA sequence of mouse-type GPR7 ligand precursor H.
FIG. 4 shows the amino acid sequence of mouse-type GPR7 ligand precursor H.
FIG. 5 shows the DNA sequence of rat GPR7 ligand precursor H.
FIG. 6 shows the amino acid sequence of rat GPR7 ligand precursor H.
FIG. 7 shows a comparative view of human, rat and mouse GPR7 ligand precursor H. Matching amino acids are boxed. The arrow indicates the expected cleavage site of the secretion signal.
FIG. 8 shows a culture medium of CHO cells in which a ligand expression vector pAK-S64 and an empty expression vector (pAKKO-111H) are expressed, and a culture medium of CHO cells in which an expression plasmid into which GPR7 cDNA is inserted is transiently expressed. Shows the results of detecting the inhibition of luciferase activity by ligand stimulation when added together with forskolin (FSK).
FIG. 9 shows the results of detecting the suppression of luciferase activity when the culture supernatant of CHO cells in which S64 was transiently expressed was added to the medium of CHO cells in which TGR26 was transiently expressed together with FSK. Show.
FIG. 10 shows the results of examining the suppression reaction of GAMP7-expressing CHO cell-specific cAMP production by the transiently expressed cell supernatant of S64.
FIG. 11 shows the results of examining the suppression reaction of mockCHO cAMP production by the transiently expressed cell supernatant of S64.
FIG. 12 shows the results of determining the tissue distribution and expression level of GPR7 ligand mRNA in rats by RT-PCR.
FIG. 13 shows the chromatogram of the final purification of endogenous GPR7 ligand from bovine hypothalamus. The chromatographic pattern of μRPC C2 / C18 SC 2.1 / 10 and each fraction in the final purification stage were reacted with human GPR7-expressing CHO cells, and the amount of cAMP produced measured using the cAMP-Screen System (ABI) is shown. The chromatographic chart shows the absorbance at 215 nm and the elution concentration of acetonitrile.
FIG. 14 shows the results of N-terminal sequence analysis of endogenous GPR7 ligand purified from bovine hypothalamus.
FIG. 15 shows ESIMS spectrum (upper) and MS / MS spectrum (lower) of endogenous GPR7 ligand purified from bovine hypothalamus.
FIG. 16 shows a zoom scan spectrum of a trivalent molecular ion.
[Fig. 17] Standard analysis of PTH-5-bromotryptophan (5BrW) and PTH-6-bromotryptophan (6BrW) mixed with 20 amino acid PTH standard (peak indicated by *) analysis. The result of having confirmed that overlap is shown.
FIG. 18: PTH-5-bromotryptophan (5BrW) and PTH-6-bromotryptophan (6BrW) were mixed with a 20 amino acid PTH standard (peak indicated by *) standard analysis, and standard 6BrW was an unknown sample. And the results of confirming that the peaks overlap.
FIG. 19 shows the results of N-terminal sequence analysis of GPR7L purified from bovine hypothalamus. The amino acids in the standard analysis and chromatogram cycle 1 up to the second cycle coincide with the peak of 6-bromotryptophan.
FIG. 20 shows the DNA sequence of bovine GPR7 ligand precursor H.
FIG. 21 shows the amino acid sequence of bovine GPR7 ligand precursor H.
FIG. 22 shows changes in food intake over time after administration of non-brominated GPR7L or distilled water into the rat ventricle. Vehicle in the figure indicates distilled water, and bGPR7L (Br−) indicates an unbrominated bovine GPR7 ligand.
FIG. 23 shows an FTMS spectrum of endogenous GPR7 ligand.
FIG. 24 shows the results of obtaining the tissue distribution and expression level of GPR7 ligand mRNA in humans by the RT-PCR method.
FIG. 25 shows the results of determining the tissue distribution and expression level of rat GPR7 (rat TGR26) mRNA by RT-PCR.
FIG. 26 shows the cDNA sequence of bovine GPR7.
FIG. 27 shows the amino acid sequence of bovine GPR7.
FIG. 28 shows the cDNA sequence of bovine GPR8.
FIG. 29 shows the bovine GPR8 amino acid sequence.
FIG. 30 shows the result of final purification of human GPR7 ligand from the culture supernatant of CHO cells expressing human GPR7 ligand. The specific intracellular cAMP production inhibitory activity obtained by making the chromatin pattern of μRPC C2 / C18 SC 2.1 / 10 in the final purification stage and each fraction react with CHO cells expressing human GPR7 is shown. The chromatographic chart shows the absorbance at 215 nm and the elution concentration of acetonitrile.
FIG. 31 shows the results of N-terminal sequence analysis of GPR7 ligand purified from the culture supernatant of human GPR7 ligand-expressing CHO cells.
FIG. 32 shows an ESI-MS spectrum of GPR7 ligand purified from the culture supernatant of human-type GPR7 ligand-expressing CHO cells.
FIG. 33 shows the results of Scatchard analysis using a human GPR7-expressing CHO cell membrane fraction.

Claims (32)

Ｎ末端アミノ酸残基がブロモ化されていてもよい、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチド、それらのアミド、それらのエステル、またはそれらの塩。N-terminal amino acid residue may be brominated, SEQ ID NO: peptide having the amino acid sequence represented by 1, its these amides, their esters or salts thereof. 配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有することを特徴とする請求項１記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。SEQ ID NO: claim 1, wherein the peptide is characterized by containing an amino acid sequence represented by 1, its amide or ester, or a salt thereof. 配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：６６で表わされるアミノ酸配列からなる請求項１記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。The peptide, its amide, its ester, or its salt of Claim 1 which consists of an amino acid sequence represented by sequence number: 1, sequence number: 2, sequence number: 3 or sequence number: 66. Ｎ末端のトリプトファン残基が６−ブロモ化されている、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：６６で表わされるアミノ酸配列からなる請求項１記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。The peptide according to claim 1, comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 66, wherein the N-terminal tryptophan residue is 6-brominated. Or an ester or a salt thereof. Ｎ末端アミノ酸残基がブロモ化されていてもよい、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチド、それらのアミド、それらのエステル、またはそれらの塩。N-terminal amino acid residue may be brominated, SEQ ID NO: peptide having the amino acid sequence represented by 4, its these amides, their esters or salts thereof. 配列番号：４で表わされるアミノ酸配列を含有することを特徴とする請求項５記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。SEQ ID NO: Peptide according to claim 5, characterized in that it contains the amino acid sequence represented by 4, its amide or ester, or a salt thereof. 配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６または配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列からなる請求項５記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。The peptide, its amide, its ester, or its salt of Claim 5 which consists of an amino acid sequence represented by sequence number: 4, sequence number: 5, sequence number: 6 or sequence number: 67. Ｎ末端のトリプトファン残基が６−ブロモ化されている、配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列からなる請求項５記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。The peptide, its amide, its ester, or its salt of Claim 5 which consists of an amino acid sequence represented by sequence number: 67 whose N-terminal tryptophan residue is 6-brominated. Ｎ末端のトリプトファン残基が６−ブロモ化されている、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６または配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列からなる請求項５記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。6. The peptide according to claim 5, comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 67, wherein the N-terminal tryptophan residue is 6-brominated. Or an ester or a salt thereof. 請求項１〜９のいずれかに記載のペプチドの前駆体ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。Precursor peptide of a peptide according to any one of claims 1 to 9 its amide or ester, or a salt thereof. 配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有することを特徴とする請求項１０記載の前駆体ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。SEQ ID NO: 19 precursor peptide of claim 10, wherein the having the amino acid sequence represented by, its amide or ester, or a salt thereof. 配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１または配列番号：７２で表わされるアミノ酸配列からなる請求項１１記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。The peptide, its amide, its ester, or its salt of Claim 11 which consists of an amino acid sequence represented by sequence number: 19, sequence number: 20, sequence number: 21 or sequence number: 72. 配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列を含有することを特徴とする請求項１０記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。SEQ ID NO: claim 10, wherein the peptide is characterized by containing an amino acid sequence represented by 22, its amide or ester, or a salt thereof. 配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４または配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列からなる請求項１３記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。The peptide, its amide, its ester, or its salt of Claim 13 which consists of an amino acid sequence represented by sequence number: 22, sequence number: 23, sequence number: 24 or sequence number: 73. 請求項１〜９のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding the peptide according to any one of claims 1 to 9 . 配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：７４、または配列番号：７５で表わされる塩基配列からなる請求項１５記載のポリヌクレオチド。SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 74 or SEQ ID NO: claim 15 consisting of the base sequence represented by 75 The polynucleotide described. 請求項１０記載の前駆体ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding the precursor peptide according to claim 10 . 配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：８０または配列番号：８１で表わされる塩基配列からなる請求項１７記載のポリヌクレオチド。SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 80 or SEQ ID NO: 81 consisting of the base sequence represented by claim 17, wherein Polynucleotides. ＤＮＡである請求項１５〜１８のいずれかに記載のポリヌクレオチド。The polynucleotide according to any one of claims 15 to 18 , which is DNA. 請求項１５〜１９のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。A recombinant vector containing the polynucleotide according to any one of claims 15 to 19 . 請求項２０記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体。A transformant transformed with the recombinant vector according to claim 20 . 請求項２１記載の形質転換体を培養し、請求項１〜１２のいずれかに記載のペプチド、またはその前駆体ペプチドを生成せしめることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のペプチド、もしくはその前駆体ペプチドまたはその塩の製造法。The peptide according to any one of claims 1 to 9 , wherein the transformant according to claim 21 is cultured to produce the peptide according to any one of claims 1 to 12, or a precursor peptide thereof. Or a precursor peptide thereof or a salt thereof. 請求項１〜９のいずれかに記載のペプチド、もしくはその前駆体ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体。Peptide according to any one of claims 1 to 9 or its precursor peptide, an antibody to its amide or ester, or a salt thereof. 請求項１〜９のいずれかに記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩の活性を不活性化する中和抗体である請求項２７記載の抗体。The antibody according to claim 27, which is a neutralizing antibody that inactivates the activity of the peptide according to any one of claims 1 to 9 , its amide, an ester thereof, or a salt thereof. 請求項１〜９のいずれかに記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる医薬。A medicament comprising the peptide according to any one of claims 1 to 9, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof. 拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤である請求項２５記載の医薬。26. The medicament according to claim 25 , which is a preventive / therapeutic agent for anorexia nervosa or an appetite enhancer. 請求項１〜９のいずれかに記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と、配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列を含有するＧＰＲ７蛋白質またはその塩とを用いることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列を含有するＧＰＲ７蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。Peptide according to any one of claims 1 to 9 its amide or its ester, or a salt thereof, SEQ ID NO: characterized by using a GPR7 protein or its salt containing the amino acid sequence represented by 49 a peptide according to any one of claims 1 to 9 its amide or SEQ ID NO: its ester or a salt thereof,: GPR7 protein containing the amino acid sequence represented by 49 or compound that alters the binding property between a salt thereof Or a screening method for the salt thereof. 請求項１〜９のいずれかに記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と、配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列を含有するＧＰＲ７蛋白質またはその塩とを含有することを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列を含有するＧＰＲ７蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。Peptide according to any one of claims 1 to 9 its amide or its ester, or a salt thereof, SEQ ID NO: and wherein GPR7 protein containing the amino acid sequence represented by 49 or that contains a salt thereof to peptide according to any one of claims 1 to 9 its amide, or its ester, or a salt thereof and SEQ ID NO: alter the binding property between GPR7 protein or its salt containing the amino acid sequence represented by 49 A screening kit for a compound or a salt thereof. 請求項１〜９のいずれかに記載のペプチドまたはその前駆体ペプチドをコードするＤＮＡを用いることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のペプチドまたはその前駆体ペプチドの発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。The DNA encoding the peptide according to any one of claims 1 to 9 or a precursor peptide thereof is used, and the expression level of the peptide according to any one of claims 1 to 9 or a precursor peptide thereof is changed. For screening a compound or a salt thereof. 請求項１〜９のいずれかに記載のペプチドまたはその前駆体ペプチドをコードするＤＮＡを含有することを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のペプチドまたはその前駆体ペプチドの発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。Peptides or expression level of the peptide or its precursor peptide according to any one of claims 1 to 9, characterized in that it contains the DNA encoding the precursor peptide of any of claims 1-9 A kit for screening a compound to be changed or a salt thereof. 請求項１〜９のいずれかに記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と、配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩とを用いることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。Peptide according to any one of claims 1 to 9 its amide or its ester, or a salt thereof, SEQ ID NO: characterized by using a 86 protein or its salt containing the amino acid sequence represented by, peptide according to any one of claims 1 to 9 its amide or ester, or a salt thereof and SEQ ID NO: protein comprising the amino acid sequence represented by 86 or a compound that alters the binding property between a salt thereof or Salt screening method. 請求項１〜９のいずれかに記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩とを含有することを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。Peptide according to any one of claims 1 to 9 its amide or SEQ ID NO: and its ester, or a salt thereof: characterized by containing a protein or its salt containing the amino acid sequence represented by 86, peptide according to any one of claims 1 to 9 its amide or ester, or a salt thereof and SEQ ID NO: protein comprising the amino acid sequence represented by 86 or a compound that alters the binding property between a salt thereof or Salt screening kit.
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