JP4129546B2 - ウシの軟骨異形成性矮小体躯症の遺伝子診断法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウシの軟骨異形成性矮小体躯症の遺伝子診断法に関する。
【０００２】
【発明に関わる語句の定義】
本明細書において、「ＬＩＭＢＩＮ」はＬＩＭＢＩＮ遺伝子が転写され翻訳されて生成するタンパク質を意味し、「ＬＩＭＢＩＮ遺伝子」はＬＩＭＢＩＮをコードしている翻訳領域及び非翻訳領域を含むエクソンと、それらに介在するイントロンとを含む転写領域、及びこの転写領域の発現の制御に関わる制御領域を含むＤＮＡの領域を意味する。軟骨異形成性矮小体躯症とは、ＬＩＭＢＩＮ遺伝子に変異があることからくる表現型の異常を意味する。「変異遺伝子」とは、変異を起こした対立遺伝子のことを意味する。「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」とは、一般的に、米国特許第4683195号明細書に記載されたような方法を指し、目的のヌクレオチド配列をインビトロで酵素的に増幅するための方法を指している。即ち、ＰＣＲ法は、鋳型核酸と優先的にハイブリダイズすることのできる２個のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プライマー伸長合成を行う過程を繰り返し行うことを含む。
【０００３】
【背景となる技術】
軟骨異形成性矮小体躯症は、褐毛和種牛において1983年以降発生が認められており、軟骨形成不全を主な症状とする常染色体性劣性遺伝病である。すなわち、原因となる変異遺伝子のホモ接合体のウシにおいて、生後0〜6カ月で四肢短小が観察されるが、その変異遺伝子のヘテロ接合体のウシは、外見的な異常がなく、軟骨異形成性矮小体躯症の遺伝的キャリアとして生存する。したがって、外見上は異常の認められないウシ同士を交配させた場合でも、ヘテロ接合体同士の交配であれば２５％の確率で、生まれてくる子牛に異常が現れるため、本疾患の発生を予防する上での問題点となっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ウシの軟骨異形成性矮小体躯症を予防する手段の一つとして、変異遺伝子のヘテロ接合体同士の交配を避けるという方法が考えられる。そのためにはウシの軟骨異形成性矮小体躯症の診断を遺伝子レベルで行い、原因となる変異遺伝子のヘテロ接合体を見つけだす必要がある。つまり、軟骨異形成性矮小体躯症の原因である遺伝子を同定し、軟骨異形成性矮小体躯症のウシにおいて、その遺伝子がどのように変異しているかを明らかにすれば、その変異を容易に検出できる手段を得ることができ、軟骨異形成性矮小体躯症の遺伝子診断法を確立することができる。
【０００５】
本発明の目的は、このような原理の基に、ウシの軟骨異形成性矮小体躯症の遺伝子診断法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記目的を達成するために研究を重ねた結果、軟骨異形成性矮小体躯症と密接に関連するＬＩＭＢＩＮ遺伝子を同定することに成功した。さらに、本発明者らは、軟骨異形成性矮小体躯症の個体から得られたＬＩＭＢＩＮ遺伝子の翻訳領域に変異を検出した。そして、これらの変異のため、ＬＩＭＢＩＮの正常な機能が損なわれたことが本疾患の原因であることを見出した。従って、ＬＩＭＢＩＮ遺伝子に変異が起き、ＬＩＭＢＩＮの正常な機能が損なわれると、軟骨異形成性矮小体躯症を発症するようになることが明らかになった。
【０００７】
そこで、本発明の遺伝子診断法は、ウシの核酸試料を得るステップと、ウシＬＩＭＢＩＮ遺伝子内の配列番号：１に示される塩基配列中にあって、ウシの軟骨異形成性矮小体躯症の原因である塩基を含む核酸断片を、該核酸試料から遺伝子増幅反応によって得るステップと、該塩基における変異の有無を調べるステップと、を含むことを特徴とする。これにより、ＬＩＭＢＩＮ遺伝子の翻訳領域内に変異を起こしたＬＩＭＢＩＮ変異遺伝子を持つ個体を検出することができ、軟骨異形成性矮小体躯症の遺伝的キャリアを見つけることができるようになる。
【０００８】
また、前記塩基が、前記ＬＩＭＢＩＮ遺伝子の塩基配列中、配列番号：１に示される塩基配列に含まれることを特徴としてもよい。これにより、ＬＩＭＢＩＮ遺伝子の翻訳領域内での変異を遺伝子診断の対象とすることができる。
【０００９】
また、前記遺伝子増幅反応が、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を含むことを特徴としてもよい。これにより、遺伝子増幅反応を簡便に行うことができるようになる。
【００１０】
また、前記軟骨異形成性矮小体躯症の原因である塩基の変異の有無を調べるステップが、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を含むことを特徴としてもよい。これにより、簡便に塩基の変異を検出できるようになる。
【００１１】
また、前記核酸試料が、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡを含む試料であることを特徴としてもよい。これにより、遺伝情報を実際に担っている分子を扱うことができるようになる。
【００１２】
さらに、配列番号：１に示された塩基配列に含まれる連続した塩基配列を有する第１のオリゴヌクレオチドと、配列番号：１に示された塩基配列と相補的な塩基配列に含まれる連続した塩基配列を有する第２のオリゴヌクレオチドと、を含み、配列番号：１に示された塩基配列において、前記第１のオリゴヌクレオチドの有する塩基配列の３’末端の塩基が、前記第２のオリゴヌクレオチドの有する塩基配列に相補的な塩基配列の５’末端の塩基より、５’末端側に存在することを特徴とする、軟骨異形成性矮小体躯症を検出するためのキットとしてもよい。これにより、ＬＩＭＢＩＮ遺伝子に変異を起こした核酸を持つ個体を検出する際、各試薬を別々に調整する手間を省くことができる。
【００１３】
また、前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドが、１５〜３５ヌクレオチドからなることを特徴としてもよい。これにより、遺伝子増幅反応、特にＰＣＲの効率が良くなる。
【００１４】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、配列番号：１０，１１，１２のオリゴヌクレオチドのうちのいずれかであることを特徴としてもよく、前記第２のオリゴヌクレオチドが、配列番号：８，９，１３のオリゴヌクレオチドのうちのいずれかであることを特徴としてもよい。これにより、遺伝子増幅反応、特にＰＣＲの効率がさらに良くなる。
【００１５】
以下の（ａ）〜（ｃ）の塩基配列を持つヌクレオチドを用いても良い。
（ａ）配列番号：１で示された塩基配列全体、またはその一部。
（ｂ）配列番号：１で示されている塩基配列と相補的な塩基配列全体、またはその一部。
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）のヌクレオチドにおいて、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、または付加されたヌクレオチドであって、ＬＩＭＢＩＮ遺伝子が有する塩基配列全体、またはその一部。
これにより、ＬＩＭＢＩＮ遺伝子における翻訳領域内での変異を遺伝子診断の対象とすることができる。
【００１６】
また、前記ヌクレオチド配列を持つヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、合成ヌクレオチド、または半合成ヌクレオチドのいずれかであることを特徴としてもよい。これにより、遺伝情報を実際に担うもしくは伝える分子を扱うことができるようになる。
【００１７】
また、以下の（ａ）〜（ｃ）の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてもよい。
（ａ）配列番号：１に示された塩基配列をもつヌクレオチド配列に含まれる連続したヌクレオチド配列。
（ｂ）配列番号：１に示された塩基配列と相補的な塩基配列をもつヌクレオチド配列に含まれる連続したヌクレオチド配列。
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）のヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、または付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＬＩＭＢＩＮ遺伝子の遺伝子増幅反応に使用可能なヌクレオチド。
このヌクレオチドをＬＩＭＢＩＮ遺伝子増幅の鋳型とすることにより、ＬＩＭＢＩＮ遺伝子翻訳領域特異的に、遺伝子増幅反応を行わせることができる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜正常ウシ及び軟骨異形成性矮小体躯症発症ウシのＬＩＭＢＩＮ遺伝子の解析＞
本発明者らは、まず、本疾患牛を含む家系のゲノム連鎖解析を行い、ポジショナルクローニング法を用いてウシＬＩＭＢＩＮ遺伝子を単離した。ＬＩＭＢＩＮ遺伝子が単離された例は、どの生物種においても、これまで報告されていない。遺伝子の変異と本疾患との関連を調べるために、正常ウシのＬＩＭＢＩＮをコードするｃＤＮＡを単離し、その塩基配列を明らかにした。得られた正常ウシのＬＩＭＢＩＮをコードするｃＤＮＡの全塩基配列を配列表の配列番号：１に示す。
【００１９】
次に、軟骨異形成性矮小体躯症の原因となる遺伝子の変異を、正常ウシ及び発症ウシのＬＩＭＢＩＮ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を比較することによって明らかにした。すなわち、正常ウシの場合と同様に発症ウシのＬＩＭＢＩＮ遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列を調べ、これを正常ウシ遺伝子のものと比較することにより、本疾患の原因である変異を特定した。軟骨異形成性矮小体躯症ウシのＬＩＭＢＩＮ遺伝子においては、翻訳領域の塩基配列中、１３５６位のＣからＴへの変異、あるいは２０５４〜２０５５位のＣＡからＧへの変異を見出した。これらは新たな停止コドンをもたらす変異であった（図１）。そこで、これらの変異が、軟骨異形成性矮小体躯症の原因となる遺伝子における変異であると結論した。
【００２０】
以下、実験例により、さらに詳細に説明する。以下の記載では、特に説明がない場合には、D. M. Glover & B. D. Hames (Ed.), DNA Cloning 1, Core Techniques (2nd edition), A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford (1995); J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); M. A. Innis, D. M. Gelfaud, J. J. Snindky & T. J. White (Ed.), ＰＣＲ protocols: a guide to methods and applications, Academic Press, Inc., New York (1990); M. J. McPherson, P. Quirke & G. R. Taylor (Ed.), ＰＣＲ: a practical approach, IRL Press, Oxford (1991)に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法が用いられている。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールが用いられている。
【００２１】
［実験例］
（１）正常ウシＬＩＭＢＩＮ遺伝子の塩基配列の決定
軟骨異形成性矮小体躯症の疾患牛（119頭）及びそれらの両親牛からなる家系について、多型性ＤＮＡマーカーを用いて軟骨異形成性矮小体躯症と連鎖するウシ染色体の領域を第６番染色体のテロメア部と決定した［文献 K. Yoneda et al., Mammalian Genome, 10, 597-600（1999年）］。軟骨異形成性矮小体躯症の原因遺伝子が存在すると考えられる領域を、多数の多型性ＤＮＡマーカーを用いてさらに狭めた。狭められた領域に存在し、実際に発現している遺伝子（ＥＳＴ）が、ＥＳＴ検索によって同定できたので、この遺伝子が、軟骨異形成性矮小体躯症の原因遺伝子の候補と考えられた。そのｃＤＮＡをクローニングするため、その配列AW345074から配列番号：２、３のＰＣＲプライマーを合成した。
ＬＩＭＢＩＮ-1： GAGAGAGGGTGATATTCTCTGG ［配列番号：２］
ＬＩＭＢＩＮ-2： GATAAAGAGCTTTTCACCCGTG ［配列番号：３］
【００２２】
ところで、原因遺伝子の異常による表現型の異常が軟骨に現れるため、原因遺伝子は軟骨で発現していることが予想された。そこで、正常ウシより採取した新鮮な長骨の骨端を材料とし、ＲＮＡ調製用試薬であるトリゾール（商品名、Gibco-BRL社製）を使用して全ＲＮＡを調製した。この全ＲＮＡを鋳型に用い、スーパースクリプトｃＤＮＡ合成キット（商品名、Gibco-BRL社製）を使用してｃＤＮＡを合成した。配列番号：２と３のプライマーを用い、合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、プライマー間の断片を増幅した。生成物についてBigDye Terminator Cycle Sequencing 試薬(商品名、PEバイオシステムズ社製)により、3700蛍光ＤＮＡシークエンサー（PEバイオシステムズ社製）を用いて塩基配列を決定した。この塩基配列は、ウシの上記ＥＳＴの塩基配列及びそれと対応するヒトのＥＳＴの塩基配列と高い相同性を示したので、目的であるウシのＬＩＭＢＩＮｃＤＮＡの一部であると結論した。
【００２３】
そこで、この断片をプローブに用いて、今度は、正常ウシ腎臓および長骨ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、より長いウシＬＩＭＢＩＮｃＤＮＡクローンを単離した。また、上記のウシＥＳＴ配列は、カリフォルニア大学ヒトゲノムプロジェクトがインターネット上で公開しているWorking Draft Genome Browser v5における予測遺伝子配列C4000113とC4000114 (と、上記染色体領域に位置するウシRPCI-42細菌人工染色体162M16および232M6クローンの塩基配列に高い相同性が認められたため、正常ウシ全ＲＮＡから作成したｃＤＮＡを鋳型として配列番号：４、５、６、７のＰＣＲプライマーで増幅させ、ｃＤＮＡクローンを得た。
【００２４】
これらｃＤＮＡの塩基配列を決定し、繋ぎ合わせて、全翻訳領域を含むＬＩＭＢＩＮｃＤＮＡの塩基配列を決定した。得られた塩基配列のうち翻訳領域の配列を配列表の配列番号：１に示す。
ＬＩＭＢＩＮ-3： GGAAGTATCTGGCCCATTTTGCC ［配列番号：４］
ＬＩＭＢＩＮ-4： CTCCAGCGAGGCTGTGTAGCTGAC ［配列番号：５］
ＬＩＭＢＩＮ-5： GGCTTTCAGGAAGAAGTTTCTGC ［配列番号：６］
ＬＩＭＢＩＮ-6： CTCCAGGAGCTTCTGACCCTTGC ［配列番号：７］
【００２５】
（２）ＬＩＭＢＩＮ遺伝子の発現
ｍＲＮＡ抽出用キット、FastTrack 2.0 (商品名、Invitrogen社製)を使用して、正常ウシの新鮮な組織からｍＲＮＡを調製し、スーパースクリプトｃＤＮＡ合成キット（商品名、Gibco-BRL社製）を使用してｃＤＮＡを合成し、ＬＩＭＢＩＮ遺伝子の発現について調べた。各組織のｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行ったところ、骨端、腎臓、肺、心臓、脾臓、脳など調べた組織すべてで発現しており、正常ウシと該疾患牛の骨端でほぼ同程度の強度で発現していることが明らかとなった。
【００２６】
（３）軟骨異形成性矮小体躯症ウシＬＩＭＢＩＮ遺伝子の塩基配列の決定
実験例（２）に述べたように、軟骨異形成性矮小体躯症ウシでもＬＩＭＢＩＮ遺伝子の転写が認められることから、異常は塩基配列自身にあるのではないかと予想されたため、その塩基配列を決定し、正常ウシのＬＩＭＢＩＮ遺伝子の塩基配列と比較した。その結果、２カ所に変異を検出した。変異１は１３５６位のCをTへ変異するという潜在的スプライシングドナーサイトの形成による新たな停止コドンをもたらし、変異２は２０５４〜２０５５位の塩基配列がCAからGへの変異による新たな停止コドンをもたらす。従って、軟骨異形成性矮小体躯症牛では、これらの変異のため、ＬＩＭＢＩＮの機能が損なわれ、軟骨異形成性矮小体躯症が発症すると考えられた。
【００２７】
（４）ウシのゲノムＤＮＡ上のＬＩＭＢＩＮ遺伝子の変異の検出
ＬＩＭＢＩＮ遺伝子の変異と軟骨異形成性矮小体躯症発症の相関を調べるため、正常ウシ、軟骨異形成性矮小体躯症ウシ、及びその両親ウシにおけるＬＩＭＢＩＮ遺伝子の変異１型部位及び変異２型部位の塩基を調べた。
【００２８】
まず、軟骨異形成性矮小体躯症ウシに認められた変異１型部位を含むＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーを合成した。ＬＩＭＢＩＮ-R1は正常な塩基配列に特異的に結合するアンチセンスプライマーであり、ＬＩＭＢＩＮ-R2は変異１型塩基配列に特異的に結合するアンチセンスプライマーである。これらのプライマーによるＰＣＲ生成物の長さに違いを持たせるため、ＬＩＭＢＩＮ-R2の5’末端に4個のイノシンを付加した。また、非特異的アニーリングを抑える目的で、アンチセンスプライマーは本来の配列とは異なる塩基を1つ有する。ＬＩＭＢＩＮ-F1は正常と変異2型に共通な塩基配列に結合するセンスプライマーで5’末端に蛍光色素FAMを付加した。
【００２９】
配列表の配列番号：８、９、１０にプライマーの塩基配列を示す。Iはイノシンを示す。
ＬＩＭＢＩＮ-R1: TTGCTGCCTCTGGCTTCAGCTGG ［配列番号：８］
ＬＩＭＢＩＮ-R2: IIIITTGCTGCCTCTGGCTTCAGGTCA ［配列番号：９］
ＬＩＭＢＩＮ-F1: [FAM]- TGTGTGCTCACATGTTGCGTGC ［配列番号：１０］
【００３０】
次に、軟骨異形成性矮小体躯症ウシに認められた変異２型部位を含むＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーを合成した。ＬＩＭＢＩＮ- F2は正常な塩基配列に特異的に結合するセンスプライマーであり、ＬＩＭＢＩＮ- F3は変異２型塩基配列に特異的に結合するセンスプライマーである。これらのプライマーによるＰＣＲ生成物の長さに違いを持たせるために、5’末端を1塩基削った。また、ＬＩＭＢＩＮ-R3は正常と変異2型に共通な塩基配列に結合するアンチセンスプライマーで5’末端に蛍光色素FAMを付加した。
【００３１】
配列表の配列番号：１１、１２、１３にぞれぞれプライマーの塩基配列を示す。
ＬＩＭＢＩＮ-F2: GAGCACAGCAGGGACCTGGCA ［配列番号：１１］
ＬＩＭＢＩＮ-F3: AGCACAGCAGGGACCTGGG ［配列番号：１２］
ＬＩＭＢＩＮ-R3: [FAM]- CGTGAAGATCAAGTGCTCCCAGTG ［配列番号：１３］
【００３２】
一方、正常ウシ、軟骨異形成性矮小体躯症ウシ、及びその両親ウシの血液（抗擬固剤としてEDTA、ヘパリンを含む）より、自動核酸分離装置NA-1000（商品名、クラボウ社製）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。これらのゲノムＤＮＡを鋳型とし、変異１型検出用のプライマーを用いたＰＣＲ ( Taq ＤＮＡ polymeraseを使用、94 ℃で20秒間、67 ℃で20秒間、72 ℃で30秒間からなる工程を1サイクルとし、27サイクル反応させた)及び、変異２型検出用のプライマーを用いたＰＣＲ ( Taq ＤＮＡ polymerase を使用、94 ℃で20秒間、65 ℃で20秒間、72 ℃で30秒間からなる工程を1サイクルとし、28サイクル反応させた)を行った。これらの反応液0.5マイクロリットルを3700蛍光ＤＮＡシークエンサー（商品名、PEバイオシステムズ社製）を用いて電気泳動し、増幅ＤＮＡ断片のサイズを、GENESCANとGenotyper software（商品名、PEバイオシステムズ社製）を用いて測定した。図2に示すように、変異１型検出用のプライマーでＰＣＲを行った場合、正常型では291 bpのＤＮＡ断片が生成するが、変異１型では295 bpのＤＮＡ断片が生成する。また、変異２型検出用のプライマーでＰＣＲを行った場合、正常型では168 bpのＤＮＡ断片が生成するが、変異２型では166 bpのＤＮＡ断片が生成する。
【００３３】
このようにして、軟骨異形成性矮小体躯症発症とＬＩＭＢＩＮ遺伝子の変異との相関関係を調べた結果、図２に示すように、軟骨異形成性矮小体躯症発症がＬＩＭＢＩＮ遺伝子の変異に因ることが明らかとなった。
【００３４】
＜ウシの軟骨異形成性矮小体躯症の遺伝子診断法の確立＞
以上のように、ウシの軟骨異形成性矮小体躯症の原因となる遺伝子上の変異が解明されたので（図1）、この変異を利用して該疾患の検出を行うことができる。以下、具体的なウシの軟骨異形成性矮小体躯症の遺伝子診断法の一例を詳細に述べる。
【００３５】
[実施例]
ウシの核酸試料を得るステップとして、ウシの血液（抗擬固剤としてEDTA、ヘパリンを含む）より、自動核酸分離装置NA-1000（商品名、クラボウ社製）を用いてゲノムＤＮＡを調製する。
【００３６】
変異１型及び変異２型が含まれ得る塩基を含む核酸断片を、遺伝子増幅反応によって得るステップとして、調整したゲノムＤＮＡを鋳型とし、変異１型検出用のプライマーを用いたＰＣＲ ( Taq ＤＮＡ polymerase を使用、94 ℃で20秒間、67 ℃で20秒間、72 ℃で30秒間からなる工程を1サイクルとした27サイクル反応)及び、変異２型検出用のプライマーを用いたＰＣＲ ( Taq ＤＮＡ polymerase を使用、94 ℃で20秒間、65 ℃で20秒間、72 ℃で30秒間からなる工程を1サイクルとした28サイクル反応)を行い、変異が含まれると考えられる遺伝子断片を増幅させる。ＰＣＲ法は、M. A. Innis, D. M. Gelfaud, J. J. Snindky, & T. J. White (Ed.), ＰＣＲ protocols: a guide to methods and applications, Academic Press, Inc., New York (1990); M. J. McPherson, P. Quirke & G. R. Taylor (Ed.), ＰＣＲ: a practical approach, IRL Press, Oxford (1991); R. K. Saiki et al., Science, 239, 487-491 (1988); M. A. Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988)などに記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法により行うことができる。また、ＰＣＲ法は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者により推奨されているプロトコールに従って実施することもできる。プライマーは、Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., Vol. 28, p. 716-734 (1989)に記載されているような既知の方法、例えば、トリエステル法、ホスファイト法、ホスホアミダイト法、ホスホネート法などの方法により化学合成されることができる。通常合成は、修飾された固体支持体上で合成を便利に行うことができることが知られている。例えば、合成反応は自動化された合成装置を用いて行うことができ、そのような装置は市販されている。
【００３７】
変異１型、あるいは変異２型の有無を調べるステップとして、これらの反応液0.5マイクロリットルを3700蛍光ＤＮＡシークエンサー（商品名、PEバイオシステムズ社製）を用いて電気泳動し、増幅ＤＮＡ断片のサイズを、GENESCANとGenotyper software（商品名、PEバイオシステムズ社製）を用いて測定する。
【００３８】
結果の判定方法を表に示す。
【表１】
【００３９】
変異１型検出用のプライマーでＰＣＲを行った場合、291 bpのＤＮＡ断片のみが検出されれば正常ウシであり、291 bpと295 bpの両方のＤＮＡ断片が検出されれば変異１型のヘテロ接合ウシであり、291 bpのＤＮＡ断片のみが検出されれば変異１型による軟骨異形成性矮小体躯症ウシである。
【００４０】
変異２型検出用のプライマーでＰＣＲを行った場合、168 bpのＤＮＡ断片のみが検出されれば正常ウシであり、166 bpと168 bpの両方のＤＮＡ断片が検出されれば変異２型のヘテロ接合ウシであり、166 bpのＤＮＡ断片のみが検出されれば変異２型による軟骨異形成性矮小体躯症ウシである。
【００４１】
[その他の実施例]
本発明に用いられる核酸試料の由来は、血液に限らず、例えばそれ以外の適当な細胞又は組織由来でもよい。核酸としては、ゲノムＤＮＡに限らず、例えばｍＲＮＡ等でもよい。ｍＲＮＡの場合は、逆転写酵素によって、ｃＤＮＡが合成され、その塩基配列が調べられることが好ましいが、ｍＲＮＡの塩基配列が直接解析されてもよい。ウシの核酸試料の調整は、例えばMolecular cloning, a laboratory manual (2nd edition)（J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)）に記載の方法により行うことができる。
【００４２】
ウシＬＩＭＢＩＮ遺伝子中で変異部位を含むと考えられる領域が増幅される際、遺伝子増幅反応としてＰＣＲ法を用いたが、それに限らず、例えばＲＮＡポリメラーゼを利用した核酸増幅法や鎖置換増幅法のような核酸増幅法を利用してもよい。
【００４３】
増幅の対象となる領域としては、ウシＬＩＭＢＩＮ遺伝子の塩基配列のうち、ウシの軟骨異形成性矮小体躯症の原因となる変異を含んでいる領域であれば特に限定されず、例えば、配列表の配列番号：1に示される塩基配列の中の全体でも構わない。
【００４４】
検出する変異として、１３５６位のＣからＴへの変異あるいは２０５４〜２０５５位のＣＡからＧへの変異を対象としたが、軟骨異形成性矮小体躯症を引きおこす変異であれば、これらに限らない。
【００４５】
ＰＣＲ法で用いるプライマーとしては、上記のプライマーに限定されず、（ａ）配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの連続した塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び（ｂ）配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの連続した相補塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで、配列番号：１に示された塩基配列において、ａのオリゴヌクレオチドに対応する塩基配列の３’末端の塩基が、ｂのオリゴヌクレオチドに相補的な配列に対応する塩基配列の５’末端の塩基より、５’末端側に存在すれば使用することができる。（ａ）配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの５’端に近い領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び（２）配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの３’端に近い領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用してもよい。プライマーの長さは、好ましくは１０〜５０個のヌクレオチドであり、より好ましくは１５〜３５個のヌクレオチドであるのがよい。また、オリゴヌクレオチドは、一つ又はそれ以上の修飾された塩基を含有していてもよく、例えば、イノシンなどの天然には存在しない塩基あるいはトリチル化された塩基などを含有していてもよい。
【００４６】
ＰＣＲの反応条件は上記の条件に限定されず、上記した文献の記載を参考に反応条件を選択することができる。ＰＣＲにおいては、ＤＮＡ鎖の熱変性、プライマーのアニーリング及びポリメラーゼによる相補鎖の合成からなる一つのサイクルが、例えば、１０〜５０回、好ましくは２０〜３５回、より好ましくは２５〜３０回繰り返して行われる。
【００４７】
軟骨異形成性矮小体躯症の原因となる変異の存在の検出方法としては、ＰＣＲ法により得られたＤＮＡ断片長を調べることにより検出されるとしたが、ハイブリダイゼーションや塩基配列の決定やＲＦＬＰ（restriction fragment length polymorphism）などによって検出してもよい。ＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、化学分解法（Maxam & Gilbert法）、チェーンターミネーター法（Sangerジデオキシ法）などにより行うことができる。また、軟骨異形成性矮小体躯症の原因となる塩基を含む遺伝子断片を一旦ＰＣＲで増幅した後、別のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、変異の有無を検出してもよい。
【００４８】
プライマーのラベル成分は、分光学的手段、光学的手段、生化学的手段、免疫学的手段、酵素化学的手段、放射化学的手段などにより検出できるものであってもよい。例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、３２Pなどの放射性ラベル、アイソトープ、ビオチン、ディゴキシジェニン、蛍光色素、発光物質、発色物質などが挙げられる。
【００４９】
本発明の目的、特徴、利点及びそのアイデアは、本明細書の記載により当業者には明らかであろう。以下の発明の実施の形態の項の記載及び具体的な実施例などの記載は、本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみここにおいて示されているものであることは理解されるべきであり、本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で様々な改変並びに修飾が、それらの記載に基づいて当業者に容易に明らかになるであろう。
【００５０】
【発明の効果】
本発明により軟骨異形成性矮小体躯症ウシおよびそのキャリアを簡便かつ迅速に検出し、診断することが可能となる。
【００５１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】軟骨異形成性矮小体躯症ウシ由来のウシＬＩＭＢＩＮ遺伝子の1356位のCからTへの変異（変異１：1356位のCを四角形で囲んでいる）および2054〜2055位の塩基配列がCAからGへの変異（変異２：2054〜2055位のCAを四角形で囲んでいる）を示す図である。→は、変異を検出するためのＰＣＲプライマーの位置を示す。
【図２】 ＬＩＭＢＩＮ遺伝子の変異１型および変異２型を検出するための検査法を示す。変異１型では、正常型は291 bpのＰＣＲ生成物が得られるが、変異型では295 bpのＰＣＲ生成物が得られる。また、変異２型では、正常型は168 bpのＰＣＲ生成物が得られるが、変異型では166 bpのＰＣＲ生成物が得られる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウシの軟骨異形成性矮小体躯症の遺伝子診断法に関する。
【０００２】
【発明に関わる語句の定義】
本明細書において、「ＬＩＭＢＩＮ」はＬＩＭＢＩＮ遺伝子が転写され翻訳されて生成するタンパク質を意味し、「ＬＩＭＢＩＮ遺伝子」はＬＩＭＢＩＮをコードしている翻訳領域及び非翻訳領域を含むエクソンと、それらに介在するイントロンとを含む転写領域、及びこの転写領域の発現の制御に関わる制御領域を含むＤＮＡの領域を意味する。軟骨異形成性矮小体躯症とは、ＬＩＭＢＩＮ遺伝子に変異があることからくる表現型の異常を意味する。「変異遺伝子」とは、変異を起こした対立遺伝子のことを意味する。「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」とは、一般的に、米国特許第4683195号明細書に記載されたような方法を指し、目的のヌクレオチド配列をインビトロで酵素的に増幅するための方法を指している。即ち、ＰＣＲ法は、鋳型核酸と優先的にハイブリダイズすることのできる２個のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プライマー伸長合成を行う過程を繰り返し行うことを含む。
【０００３】
【背景となる技術】
軟骨異形成性矮小体躯症は、褐毛和種牛において1983年以降発生が認められており、軟骨形成不全を主な症状とする常染色体性劣性遺伝病である。すなわち、原因となる変異遺伝子のホモ接合体のウシにおいて、生後0〜6カ月で四肢短小が観察されるが、その変異遺伝子のヘテロ接合体のウシは、外見的な異常がなく、軟骨異形成性矮小体躯症の遺伝的キャリアとして生存する。したがって、外見上は異常の認められないウシ同士を交配させた場合でも、ヘテロ接合体同士の交配であれば２５％の確率で、生まれてくる子牛に異常が現れるため、本疾患の発生を予防する上での問題点となっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ウシの軟骨異形成性矮小体躯症を予防する手段の一つとして、変異遺伝子のヘテロ接合体同士の交配を避けるという方法が考えられる。そのためにはウシの軟骨異形成性矮小体躯症の診断を遺伝子レベルで行い、原因となる変異遺伝子のヘテロ接合体を見つけだす必要がある。つまり、軟骨異形成性矮小体躯症の原因である遺伝子を同定し、軟骨異形成性矮小体躯症のウシにおいて、その遺伝子がどのように変異しているかを明らかにすれば、その変異を容易に検出できる手段を得ることができ、軟骨異形成性矮小体躯症の遺伝子診断法を確立することができる。
【０００５】
本発明の目的は、このような原理の基に、ウシの軟骨異形成性矮小体躯症の遺伝子診断法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記目的を達成するために研究を重ねた結果、軟骨異形成性矮小体躯症と密接に関連するＬＩＭＢＩＮ遺伝子を同定することに成功した。さらに、本発明者らは、軟骨異形成性矮小体躯症の個体から得られたＬＩＭＢＩＮ遺伝子の翻訳領域に変異を検出した。そして、これらの変異のため、ＬＩＭＢＩＮの正常な機能が損なわれたことが本疾患の原因であることを見出した。従って、ＬＩＭＢＩＮ遺伝子に変異が起き、ＬＩＭＢＩＮの正常な機能が損なわれると、軟骨異形成性矮小体躯症を発症するようになることが明らかになった。
【０００７】
そこで、本発明の遺伝子診断法は、ウシの核酸試料を得るステップと、ウシＬＩＭＢＩＮ遺伝子内の配列番号：１に示される塩基配列中にあって、ウシの軟骨異形成性矮小体躯症の原因である塩基を含む核酸断片を、該核酸試料から遺伝子増幅反応によって得るステップと、該塩基における変異の有無を調べるステップと、を含むことを特徴とする。これにより、ＬＩＭＢＩＮ遺伝子の翻訳領域内に変異を起こしたＬＩＭＢＩＮ変異遺伝子を持つ個体を検出することができ、軟骨異形成性矮小体躯症の遺伝的キャリアを見つけることができるようになる。
【０００８】
また、前記塩基が、前記ＬＩＭＢＩＮ遺伝子の塩基配列中、配列番号：１に示される塩基配列に含まれることを特徴としてもよい。これにより、ＬＩＭＢＩＮ遺伝子の翻訳領域内での変異を遺伝子診断の対象とすることができる。
【０００９】
また、前記遺伝子増幅反応が、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を含むことを特徴としてもよい。これにより、遺伝子増幅反応を簡便に行うことができるようになる。
【００１０】
また、前記軟骨異形成性矮小体躯症の原因である塩基の変異の有無を調べるステップが、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を含むことを特徴としてもよい。これにより、簡便に塩基の変異を検出できるようになる。
【００１１】
また、前記核酸試料が、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡを含む試料であることを特徴としてもよい。これにより、遺伝情報を実際に担っている分子を扱うことができるようになる。
【００１２】
さらに、配列番号：１に示された塩基配列に含まれる連続した塩基配列を有する第１のオリゴヌクレオチドと、配列番号：１に示された塩基配列と相補的な塩基配列に含まれる連続した塩基配列を有する第２のオリゴヌクレオチドと、を含み、配列番号：１に示された塩基配列において、前記第１のオリゴヌクレオチドの有する塩基配列の３’末端の塩基が、前記第２のオリゴヌクレオチドの有する塩基配列に相補的な塩基配列の５’末端の塩基より、５’末端側に存在することを特徴とする、軟骨異形成性矮小体躯症を検出するためのキットとしてもよい。これにより、ＬＩＭＢＩＮ遺伝子に変異を起こした核酸を持つ個体を検出する際、各試薬を別々に調整する手間を省くことができる。
【００１３】
また、前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドが、１５〜３５ヌクレオチドからなることを特徴としてもよい。これにより、遺伝子増幅反応、特にＰＣＲの効率が良くなる。
【００１４】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、配列番号：１０，１１，１２のオリゴヌクレオチドのうちのいずれかであることを特徴としてもよく、前記第２のオリゴヌクレオチドが、配列番号：８，９，１３のオリゴヌクレオチドのうちのいずれかであることを特徴としてもよい。これにより、遺伝子増幅反応、特にＰＣＲの効率がさらに良くなる。
【００１５】
以下の（ａ）〜（ｃ）の塩基配列を持つヌクレオチドを用いても良い。
（ａ）配列番号：１で示された塩基配列全体、またはその一部。
（ｂ）配列番号：１で示されている塩基配列と相補的な塩基配列全体、またはその一部。
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）のヌクレオチドにおいて、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、または付加されたヌクレオチドであって、ＬＩＭＢＩＮ遺伝子が有する塩基配列全体、またはその一部。
これにより、ＬＩＭＢＩＮ遺伝子における翻訳領域内での変異を遺伝子診断の対象とすることができる。
【００１６】
また、前記ヌクレオチド配列を持つヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、合成ヌクレオチド、または半合成ヌクレオチドのいずれかであることを特徴としてもよい。これにより、遺伝情報を実際に担うもしくは伝える分子を扱うことができるようになる。
【００１７】
また、以下の（ａ）〜（ｃ）の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてもよい。
（ａ）配列番号：１に示された塩基配列をもつヌクレオチド配列に含まれる連続したヌクレオチド配列。
（ｂ）配列番号：１に示された塩基配列と相補的な塩基配列をもつヌクレオチド配列に含まれる連続したヌクレオチド配列。
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）のヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、または付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＬＩＭＢＩＮ遺伝子の遺伝子増幅反応に使用可能なヌクレオチド。
このヌクレオチドをＬＩＭＢＩＮ遺伝子増幅の鋳型とすることにより、ＬＩＭＢＩＮ遺伝子翻訳領域特異的に、遺伝子増幅反応を行わせることができる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜正常ウシ及び軟骨異形成性矮小体躯症発症ウシのＬＩＭＢＩＮ遺伝子の解析＞
本発明者らは、まず、本疾患牛を含む家系のゲノム連鎖解析を行い、ポジショナルクローニング法を用いてウシＬＩＭＢＩＮ遺伝子を単離した。ＬＩＭＢＩＮ遺伝子が単離された例は、どの生物種においても、これまで報告されていない。遺伝子の変異と本疾患との関連を調べるために、正常ウシのＬＩＭＢＩＮをコードするｃＤＮＡを単離し、その塩基配列を明らかにした。得られた正常ウシのＬＩＭＢＩＮをコードするｃＤＮＡの全塩基配列を配列表の配列番号：１に示す。
【００１９】
次に、軟骨異形成性矮小体躯症の原因となる遺伝子の変異を、正常ウシ及び発症ウシのＬＩＭＢＩＮ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を比較することによって明らかにした。すなわち、正常ウシの場合と同様に発症ウシのＬＩＭＢＩＮ遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列を調べ、これを正常ウシ遺伝子のものと比較することにより、本疾患の原因である変異を特定した。軟骨異形成性矮小体躯症ウシのＬＩＭＢＩＮ遺伝子においては、翻訳領域の塩基配列中、１３５６位のＣからＴへの変異、あるいは２０５４〜２０５５位のＣＡからＧへの変異を見出した。これらは新たな停止コドンをもたらす変異であった（図１）。そこで、これらの変異が、軟骨異形成性矮小体躯症の原因となる遺伝子における変異であると結論した。
【００２０】
以下、実験例により、さらに詳細に説明する。以下の記載では、特に説明がない場合には、D. M. Glover & B. D. Hames (Ed.), DNA Cloning 1, Core Techniques (2nd edition), A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford (1995); J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); M. A. Innis, D. M. Gelfaud, J. J. Snindky & T. J. White (Ed.), ＰＣＲ protocols: a guide to methods and applications, Academic Press, Inc., New York (1990); M. J. McPherson, P. Quirke & G. R. Taylor (Ed.), ＰＣＲ: a practical approach, IRL Press, Oxford (1991)に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法が用いられている。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールが用いられている。
【００２１】
［実験例］
（１）正常ウシＬＩＭＢＩＮ遺伝子の塩基配列の決定
軟骨異形成性矮小体躯症の疾患牛（119頭）及びそれらの両親牛からなる家系について、多型性ＤＮＡマーカーを用いて軟骨異形成性矮小体躯症と連鎖するウシ染色体の領域を第６番染色体のテロメア部と決定した［文献 K. Yoneda et al., Mammalian Genome, 10, 597-600（1999年）］。軟骨異形成性矮小体躯症の原因遺伝子が存在すると考えられる領域を、多数の多型性ＤＮＡマーカーを用いてさらに狭めた。狭められた領域に存在し、実際に発現している遺伝子（ＥＳＴ）が、ＥＳＴ検索によって同定できたので、この遺伝子が、軟骨異形成性矮小体躯症の原因遺伝子の候補と考えられた。そのｃＤＮＡをクローニングするため、その配列AW345074から配列番号：２、３のＰＣＲプライマーを合成した。
ＬＩＭＢＩＮ-1： GAGAGAGGGTGATATTCTCTGG ［配列番号：２］
ＬＩＭＢＩＮ-2： GATAAAGAGCTTTTCACCCGTG ［配列番号：３］
【００２２】
ところで、原因遺伝子の異常による表現型の異常が軟骨に現れるため、原因遺伝子は軟骨で発現していることが予想された。そこで、正常ウシより採取した新鮮な長骨の骨端を材料とし、ＲＮＡ調製用試薬であるトリゾール（商品名、Gibco-BRL社製）を使用して全ＲＮＡを調製した。この全ＲＮＡを鋳型に用い、スーパースクリプトｃＤＮＡ合成キット（商品名、Gibco-BRL社製）を使用してｃＤＮＡを合成した。配列番号：２と３のプライマーを用い、合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、プライマー間の断片を増幅した。生成物についてBigDye Terminator Cycle Sequencing 試薬(商品名、PEバイオシステムズ社製)により、3700蛍光ＤＮＡシークエンサー（PEバイオシステムズ社製）を用いて塩基配列を決定した。この塩基配列は、ウシの上記ＥＳＴの塩基配列及びそれと対応するヒトのＥＳＴの塩基配列と高い相同性を示したので、目的であるウシのＬＩＭＢＩＮｃＤＮＡの一部であると結論した。
【００２３】
そこで、この断片をプローブに用いて、今度は、正常ウシ腎臓および長骨ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、より長いウシＬＩＭＢＩＮｃＤＮＡクローンを単離した。また、上記のウシＥＳＴ配列は、カリフォルニア大学ヒトゲノムプロジェクトがインターネット上で公開しているWorking Draft Genome Browser v5における予測遺伝子配列C4000113とC4000114 (と、上記染色体領域に位置するウシRPCI-42細菌人工染色体162M16および232M6クローンの塩基配列に高い相同性が認められたため、正常ウシ全ＲＮＡから作成したｃＤＮＡを鋳型として配列番号：４、５、６、７のＰＣＲプライマーで増幅させ、ｃＤＮＡクローンを得た。
【００２４】
これらｃＤＮＡの塩基配列を決定し、繋ぎ合わせて、全翻訳領域を含むＬＩＭＢＩＮｃＤＮＡの塩基配列を決定した。得られた塩基配列のうち翻訳領域の配列を配列表の配列番号：１に示す。
ＬＩＭＢＩＮ-3： GGAAGTATCTGGCCCATTTTGCC ［配列番号：４］
ＬＩＭＢＩＮ-4： CTCCAGCGAGGCTGTGTAGCTGAC ［配列番号：５］
ＬＩＭＢＩＮ-5： GGCTTTCAGGAAGAAGTTTCTGC ［配列番号：６］
ＬＩＭＢＩＮ-6： CTCCAGGAGCTTCTGACCCTTGC ［配列番号：７］
【００２５】
（２）ＬＩＭＢＩＮ遺伝子の発現
ｍＲＮＡ抽出用キット、FastTrack 2.0 (商品名、Invitrogen社製)を使用して、正常ウシの新鮮な組織からｍＲＮＡを調製し、スーパースクリプトｃＤＮＡ合成キット（商品名、Gibco-BRL社製）を使用してｃＤＮＡを合成し、ＬＩＭＢＩＮ遺伝子の発現について調べた。各組織のｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行ったところ、骨端、腎臓、肺、心臓、脾臓、脳など調べた組織すべてで発現しており、正常ウシと該疾患牛の骨端でほぼ同程度の強度で発現していることが明らかとなった。
【００２６】
（３）軟骨異形成性矮小体躯症ウシＬＩＭＢＩＮ遺伝子の塩基配列の決定
実験例（２）に述べたように、軟骨異形成性矮小体躯症ウシでもＬＩＭＢＩＮ遺伝子の転写が認められることから、異常は塩基配列自身にあるのではないかと予想されたため、その塩基配列を決定し、正常ウシのＬＩＭＢＩＮ遺伝子の塩基配列と比較した。その結果、２カ所に変異を検出した。変異１は１３５６位のCをTへ変異するという潜在的スプライシングドナーサイトの形成による新たな停止コドンをもたらし、変異２は２０５４〜２０５５位の塩基配列がCAからGへの変異による新たな停止コドンをもたらす。従って、軟骨異形成性矮小体躯症牛では、これらの変異のため、ＬＩＭＢＩＮの機能が損なわれ、軟骨異形成性矮小体躯症が発症すると考えられた。
【００２７】
（４）ウシのゲノムＤＮＡ上のＬＩＭＢＩＮ遺伝子の変異の検出
ＬＩＭＢＩＮ遺伝子の変異と軟骨異形成性矮小体躯症発症の相関を調べるため、正常ウシ、軟骨異形成性矮小体躯症ウシ、及びその両親ウシにおけるＬＩＭＢＩＮ遺伝子の変異１型部位及び変異２型部位の塩基を調べた。
【００２８】
まず、軟骨異形成性矮小体躯症ウシに認められた変異１型部位を含むＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーを合成した。ＬＩＭＢＩＮ-R1は正常な塩基配列に特異的に結合するアンチセンスプライマーであり、ＬＩＭＢＩＮ-R2は変異１型塩基配列に特異的に結合するアンチセンスプライマーである。これらのプライマーによるＰＣＲ生成物の長さに違いを持たせるため、ＬＩＭＢＩＮ-R2の5’末端に4個のイノシンを付加した。また、非特異的アニーリングを抑える目的で、アンチセンスプライマーは本来の配列とは異なる塩基を1つ有する。ＬＩＭＢＩＮ-F1は正常と変異2型に共通な塩基配列に結合するセンスプライマーで5’末端に蛍光色素FAMを付加した。
【００２９】
配列表の配列番号：８、９、１０にプライマーの塩基配列を示す。Iはイノシンを示す。
ＬＩＭＢＩＮ-R1: TTGCTGCCTCTGGCTTCAGCTGG ［配列番号：８］
ＬＩＭＢＩＮ-R2: IIIITTGCTGCCTCTGGCTTCAGGTCA ［配列番号：９］
ＬＩＭＢＩＮ-F1: [FAM]- TGTGTGCTCACATGTTGCGTGC ［配列番号：１０］
【００３０】
次に、軟骨異形成性矮小体躯症ウシに認められた変異２型部位を含むＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーを合成した。ＬＩＭＢＩＮ- F2は正常な塩基配列に特異的に結合するセンスプライマーであり、ＬＩＭＢＩＮ- F3は変異２型塩基配列に特異的に結合するセンスプライマーである。これらのプライマーによるＰＣＲ生成物の長さに違いを持たせるために、5’末端を1塩基削った。また、ＬＩＭＢＩＮ-R3は正常と変異2型に共通な塩基配列に結合するアンチセンスプライマーで5’末端に蛍光色素FAMを付加した。
【００３１】
配列表の配列番号：１１、１２、１３にぞれぞれプライマーの塩基配列を示す。
ＬＩＭＢＩＮ-F2: GAGCACAGCAGGGACCTGGCA ［配列番号：１１］
ＬＩＭＢＩＮ-F3: AGCACAGCAGGGACCTGGG ［配列番号：１２］
ＬＩＭＢＩＮ-R3: [FAM]- CGTGAAGATCAAGTGCTCCCAGTG ［配列番号：１３］
【００３２】
一方、正常ウシ、軟骨異形成性矮小体躯症ウシ、及びその両親ウシの血液（抗擬固剤としてEDTA、ヘパリンを含む）より、自動核酸分離装置NA-1000（商品名、クラボウ社製）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。これらのゲノムＤＮＡを鋳型とし、変異１型検出用のプライマーを用いたＰＣＲ ( Taq ＤＮＡ polymeraseを使用、94 ℃で20秒間、67 ℃で20秒間、72 ℃で30秒間からなる工程を1サイクルとし、27サイクル反応させた)及び、変異２型検出用のプライマーを用いたＰＣＲ ( Taq ＤＮＡ polymerase を使用、94 ℃で20秒間、65 ℃で20秒間、72 ℃で30秒間からなる工程を1サイクルとし、28サイクル反応させた)を行った。これらの反応液0.5マイクロリットルを3700蛍光ＤＮＡシークエンサー（商品名、PEバイオシステムズ社製）を用いて電気泳動し、増幅ＤＮＡ断片のサイズを、GENESCANとGenotyper software（商品名、PEバイオシステムズ社製）を用いて測定した。図2に示すように、変異１型検出用のプライマーでＰＣＲを行った場合、正常型では291 bpのＤＮＡ断片が生成するが、変異１型では295 bpのＤＮＡ断片が生成する。また、変異２型検出用のプライマーでＰＣＲを行った場合、正常型では168 bpのＤＮＡ断片が生成するが、変異２型では166 bpのＤＮＡ断片が生成する。
【００３３】
このようにして、軟骨異形成性矮小体躯症発症とＬＩＭＢＩＮ遺伝子の変異との相関関係を調べた結果、図２に示すように、軟骨異形成性矮小体躯症発症がＬＩＭＢＩＮ遺伝子の変異に因ることが明らかとなった。
【００３４】
＜ウシの軟骨異形成性矮小体躯症の遺伝子診断法の確立＞
以上のように、ウシの軟骨異形成性矮小体躯症の原因となる遺伝子上の変異が解明されたので（図1）、この変異を利用して該疾患の検出を行うことができる。以下、具体的なウシの軟骨異形成性矮小体躯症の遺伝子診断法の一例を詳細に述べる。
【００３５】
[実施例]
ウシの核酸試料を得るステップとして、ウシの血液（抗擬固剤としてEDTA、ヘパリンを含む）より、自動核酸分離装置NA-1000（商品名、クラボウ社製）を用いてゲノムＤＮＡを調製する。
【００３６】
変異１型及び変異２型が含まれ得る塩基を含む核酸断片を、遺伝子増幅反応によって得るステップとして、調整したゲノムＤＮＡを鋳型とし、変異１型検出用のプライマーを用いたＰＣＲ ( Taq ＤＮＡ polymerase を使用、94 ℃で20秒間、67 ℃で20秒間、72 ℃で30秒間からなる工程を1サイクルとした27サイクル反応)及び、変異２型検出用のプライマーを用いたＰＣＲ ( Taq ＤＮＡ polymerase を使用、94 ℃で20秒間、65 ℃で20秒間、72 ℃で30秒間からなる工程を1サイクルとした28サイクル反応)を行い、変異が含まれると考えられる遺伝子断片を増幅させる。ＰＣＲ法は、M. A. Innis, D. M. Gelfaud, J. J. Snindky, & T. J. White (Ed.), ＰＣＲ protocols: a guide to methods and applications, Academic Press, Inc., New York (1990); M. J. McPherson, P. Quirke & G. R. Taylor (Ed.), ＰＣＲ: a practical approach, IRL Press, Oxford (1991); R. K. Saiki et al., Science, 239, 487-491 (1988); M. A. Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988)などに記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法により行うことができる。また、ＰＣＲ法は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者により推奨されているプロトコールに従って実施することもできる。プライマーは、Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., Vol. 28, p. 716-734 (1989)に記載されているような既知の方法、例えば、トリエステル法、ホスファイト法、ホスホアミダイト法、ホスホネート法などの方法により化学合成されることができる。通常合成は、修飾された固体支持体上で合成を便利に行うことができることが知られている。例えば、合成反応は自動化された合成装置を用いて行うことができ、そのような装置は市販されている。
【００３７】
変異１型、あるいは変異２型の有無を調べるステップとして、これらの反応液0.5マイクロリットルを3700蛍光ＤＮＡシークエンサー（商品名、PEバイオシステムズ社製）を用いて電気泳動し、増幅ＤＮＡ断片のサイズを、GENESCANとGenotyper software（商品名、PEバイオシステムズ社製）を用いて測定する。
【００３８】
結果の判定方法を表に示す。
【表１】
変異１型検出用のプライマーでＰＣＲを行った場合、291 bpのＤＮＡ断片のみが検出されれば正常ウシであり、291 bpと295 bpの両方のＤＮＡ断片が検出されれば変異１型のヘテロ接合ウシであり、291 bpのＤＮＡ断片のみが検出されれば変異１型による軟骨異形成性矮小体躯症ウシである。
【００４０】
変異２型検出用のプライマーでＰＣＲを行った場合、168 bpのＤＮＡ断片のみが検出されれば正常ウシであり、166 bpと168 bpの両方のＤＮＡ断片が検出されれば変異２型のヘテロ接合ウシであり、166 bpのＤＮＡ断片のみが検出されれば変異２型による軟骨異形成性矮小体躯症ウシである。
【００４１】
[その他の実施例]
本発明に用いられる核酸試料の由来は、血液に限らず、例えばそれ以外の適当な細胞又は組織由来でもよい。核酸としては、ゲノムＤＮＡに限らず、例えばｍＲＮＡ等でもよい。ｍＲＮＡの場合は、逆転写酵素によって、ｃＤＮＡが合成され、その塩基配列が調べられることが好ましいが、ｍＲＮＡの塩基配列が直接解析されてもよい。ウシの核酸試料の調整は、例えばMolecular cloning, a laboratory manual (2nd edition)（J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)）に記載の方法により行うことができる。
【００４２】
ウシＬＩＭＢＩＮ遺伝子中で変異部位を含むと考えられる領域が増幅される際、遺伝子増幅反応としてＰＣＲ法を用いたが、それに限らず、例えばＲＮＡポリメラーゼを利用した核酸増幅法や鎖置換増幅法のような核酸増幅法を利用してもよい。
【００４３】
増幅の対象となる領域としては、ウシＬＩＭＢＩＮ遺伝子の塩基配列のうち、ウシの軟骨異形成性矮小体躯症の原因となる変異を含んでいる領域であれば特に限定されず、例えば、配列表の配列番号：1に示される塩基配列の中の全体でも構わない。
【００４４】
検出する変異として、１３５６位のＣからＴへの変異あるいは２０５４〜２０５５位のＣＡからＧへの変異を対象としたが、軟骨異形成性矮小体躯症を引きおこす変異であれば、これらに限らない。
【００４５】
ＰＣＲ法で用いるプライマーとしては、上記のプライマーに限定されず、（ａ）配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの連続した塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び（ｂ）配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの連続した相補塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで、配列番号：１に示された塩基配列において、ａのオリゴヌクレオチドに対応する塩基配列の３’末端の塩基が、ｂのオリゴヌクレオチドに相補的な配列に対応する塩基配列の５’末端の塩基より、５’末端側に存在すれば使用することができる。（ａ）配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの５’端に近い領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び（２）配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの３’端に近い領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用してもよい。プライマーの長さは、好ましくは１０〜５０個のヌクレオチドであり、より好ましくは１５〜３５個のヌクレオチドであるのがよい。また、オリゴヌクレオチドは、一つ又はそれ以上の修飾された塩基を含有していてもよく、例えば、イノシンなどの天然には存在しない塩基あるいはトリチル化された塩基などを含有していてもよい。
【００４６】
ＰＣＲの反応条件は上記の条件に限定されず、上記した文献の記載を参考に反応条件を選択することができる。ＰＣＲにおいては、ＤＮＡ鎖の熱変性、プライマーのアニーリング及びポリメラーゼによる相補鎖の合成からなる一つのサイクルが、例えば、１０〜５０回、好ましくは２０〜３５回、より好ましくは２５〜３０回繰り返して行われる。
【００４７】
軟骨異形成性矮小体躯症の原因となる変異の存在の検出方法としては、ＰＣＲ法により得られたＤＮＡ断片長を調べることにより検出されるとしたが、ハイブリダイゼーションや塩基配列の決定やＲＦＬＰ（restriction fragment length polymorphism）などによって検出してもよい。ＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、化学分解法（Maxam & Gilbert法）、チェーンターミネーター法（Sangerジデオキシ法）などにより行うことができる。また、軟骨異形成性矮小体躯症の原因となる塩基を含む遺伝子断片を一旦ＰＣＲで増幅した後、別のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、変異の有無を検出してもよい。
【００４８】
プライマーのラベル成分は、分光学的手段、光学的手段、生化学的手段、免疫学的手段、酵素化学的手段、放射化学的手段などにより検出できるものであってもよい。例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、３２Pなどの放射性ラベル、アイソトープ、ビオチン、ディゴキシジェニン、蛍光色素、発光物質、発色物質などが挙げられる。
【００４９】
本発明の目的、特徴、利点及びそのアイデアは、本明細書の記載により当業者には明らかであろう。以下の発明の実施の形態の項の記載及び具体的な実施例などの記載は、本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみここにおいて示されているものであることは理解されるべきであり、本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で様々な改変並びに修飾が、それらの記載に基づいて当業者に容易に明らかになるであろう。
【００５０】
【発明の効果】
本発明により軟骨異形成性矮小体躯症ウシおよびそのキャリアを簡便かつ迅速に検出し、診断することが可能となる。
【００５１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】軟骨異形成性矮小体躯症ウシ由来のウシＬＩＭＢＩＮ遺伝子の1356位のCからTへの変異（変異１：1356位のCを四角形で囲んでいる）および2054〜2055位の塩基配列がCAからGへの変異（変異２：2054〜2055位のCAを四角形で囲んでいる）を示す図である。→は、変異を検出するためのＰＣＲプライマーの位置を示す。
【図２】 ＬＩＭＢＩＮ遺伝子の変異１型および変異２型を検出するための検査法を示す。変異１型では、正常型は291 bpのＰＣＲ生成物が得られるが、変異型では295 bpのＰＣＲ生成物が得られる。また、変異２型では、正常型は168 bpのＰＣＲ生成物が得られるが、変異型では166 bpのＰＣＲ生成物が得られる。
Claims (7)
- ウシの核酸試料を得るステップと、
配列番号：１に示される塩基配列において１３５６位に相当する塩基を含み、配列番号：１に示される塩基配列を有する核酸断片と２０５４位及び２０５５位に相当する塩基を含み、配列番号：１に示される塩基配列を有する核酸断片のうち、少なくとも一方の核酸断片を、該核酸試料から遺伝子増幅反応によって得るステップと、
得られた前記核酸断片内の１３５６位に相当する塩基についてはＣとＴのいずれであるか、２０５４位及び２０５５位に相当する塩基についてはＣＡとＧのいずれであるか、を調べるステップと、
を含むことを特徴とする、ウシの軟骨形成性矮小体躯症の遺伝子診断法。 - 前記遺伝子増幅反応が、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を含むことを特徴とする、請求項１に記載のウシの軟骨形成性矮小体躯症の遺伝子診断法。
- 該塩基における変異の有無を調べるステップが、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を含むことを特徴とする、請求項１に記載のウシの軟骨形成性矮小体躯症の遺伝子診断法。
- 前記核酸試料が、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡを含む試料であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のウシの軟骨形成性矮小体躯症の遺伝子診断法。
- 配列番号：１に示される塩基配列において１３５６位に相当する塩基を含み、配列番号：１に示される塩基配列を有する核酸断片と２０５４位及び２０５５位に相当する塩基を含み、配列番号：１に示される塩基配列を有する核酸断片のうちの少なくとも一方を、ウシの核酸試料から遺伝子増幅反応によって得るためのプライマーとなる２つのオリゴヌクレオチドを含み、
前記オリゴヌクレオチドの一方は、配列番号：１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの相補鎖の一部からなる、
請求項１に記載の遺伝子診断法を用いてウシ軟骨形成性矮小体躯症を検定するためのキット。 - 前記２つのオリゴヌクレオチドが、１５〜３５ヌクレオチドからなることを特徴とする、請求項５に記載のキット。
- 前記２つのオリゴヌクレオチドが、配列番号：１０、１１、１２から選ばれるオリゴヌクレオチドと配列番号：８、９、１３から選ばれるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項６に記載のキット。
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