JP4146512B2 - Small protein - Google Patents

Abstract

The present invention relates to libraries of display phage which display various mutant epitopic peptides or protein domains with potential to bind to a target material of interest. Site-specific protease cleavable linkers may be incorporated into these phages to overcome the problem of irreversible binding to target materials. When the displayed insert is a mini-protein, a reagent which cleaves the crosslink may be used to facilitate release of a tightly bound display phage. The invention also relates to providing a more balanced library of epitopic peptide display phage.

Description

既知のタンパク質に関する研究をもとに、アルファヘリックス、ベータストランド、
もしくはインメルマン反応に見いだされる特殊残留基、もしくは特殊ジプペチドまたはトリペプチドの性向を計算することができる。これらの二次的構造の中のアミノ酸残留基の通常の発生回数がCREI84の表６−４に記載されている。アミノ酸配列からの二次的構造の予想についての詳細な取扱に関しては、SCHU79の第６章を参照のこと。
適切なヘヤピン構造をデザインするためには、三次元配座が知られているタンパク質から実際の構造をコピーすることができるし、発生回数データを利用してデザインすることもできるし、上記二つの方法を統合してデザインすることもできる。望ましくは、一つもしくはそれ以上の実際の構造をモデルとして用い、そして発生回数データはその構造の邪魔をすることなく製造できる構造を決定するのに使うのである。
望ましくは、３つ以下のアミノ酸がシステインとアルファヘリックスもしくはベータストランドの始めもしくは終わりの間に介在かることである。
もっと複雑な構造（ダブルヘヤピンのようなもの）も可能である。
クラスＩＩＩａミクロタンパク質は、二つのジスルフィドの結合を特徴としている。これらもまた、選択的に、上記クラスＩＩミクロタンパク質に関連して記述した二次的構造を特徴としている。二つのジスルフィド結合では三つの位相が可能である。お望みならば複数のジスルフィド結合可能の位相が、熱に対して安定性を示すエンテロトキシンＳＴ−ＩＡに存在する一群のシステインによって還元されるかも知れない。
クラスＩＩＩｂミクロタンパク質は、三つもしくはそれ以上のジスルフィド結合を特徴としている。そして望ましくは、前述したように、少なくともいつ群のシステインを持つことである。
金属フィンガーミニタンパク質。この発明はまた、ジスルフィド結合によるクロスリンク以外のミニタンパク質に関わるものである。すなわち、フィンガータンパク質のアナローダである。フィンガータンパク質は、フィンガー構造によって特徴ずけられている。その構造のに中で、金属イオンが四面体設置を形成している二つのＣｙｓと二つのＨｉｓ残留基によって調整されている。金属イオンは、亜鉛（ＩＩ）であることが主であるが、時として、鉄、銅、コバルト、その他であることもある。「フィンガー」は、多数の配列（ＰｈｅもしくはＴｙｒ）−（１ ＡＡ）−Ｃｙｓ−（２−４ ＡＡｓ）−Ｃｙｓ−（３ＡＡｓ）−Ｐｈｅ−（５ ＡＡｓ）−Ｌｅｕ−（２ ＡＡＳ）−Ｈｉｓ（３ ＡＡＳ）−Ｈｉｓ−（５ ＡＡＳ）である。（BERG88,GIBS88）。フィンガータンパク質は、典型的にフィンガーモチーフの多数の繰り返しを持っており、一つのフィンガーは亜鉛イオンの存在中に織り込まれていることが知られている。（FRAN87,PARR88）。二つのフィンガーがＤＮＡ結合に必要か否かはまだ議論の余地がある。この発明は、一つもしくは二つのフィンガーを持ったミニタンパク質に関わるものである。サイドグループの他の組み合わせは多価金属イオンに関連を持つクロスリンクの形成に導くものである。たとえば、Summers（SUMM91）は、一つの１８−アミノ酸ミニタンパク質がＨＩＶ−１−Ｆ１のカプシド（capsid）タンパク質で発見されたと報告している。それは亜鉛原子と結合している三つのシステインと一つのヒスチジンを持っていた。ターゲットは必ずしも核酸でなければならないことはないと言うことを理解すべきである。
Ｇ．調整されたＰＢＳｓ
下記のタンパク質のあ種のサイドグループを選択的に調整し得るいくつかの酵素と化学的試薬液がある。それらは、ａ）タンパク質−チロジンキナーゼ、EIImans試液、メチルトランスフェラーゼ（メチラートＧＬＵのサイドグループ）、セリンキナーゼ、プロリンヒドロキシアーゼ、ＧＬＵをＧＬＡに変換するビタミンＫ依存酵素、無水マレイン酸、そしてアルキル化剤を含んでいる。これらの酵素もしくは試薬液の一つをもったＧＰｓ（ＰＢＤ）の換えられた集団の取扱は、選ばれた酵素もしくは試薬液によって影響されたサイドグループを調整する。ＧＰを破壊しない酵素もしくは試薬液は、非常に望ましいものである。サイドグループのそのような調整は顕示されたＰＢＤｓの結合特性に直接影響を及ぼす。親和性分離の方法を利用して、予め定められたターゲットと結合する調整されたＧＰｓを我々は強化しようとしている。活性結合ドメインは、全部遺伝的に規定されているのではないから、各強化の場で形態発生後の調整を繰り返す必要がある。この方法は、これらのＳＢＤｓの化学的合成を心に描いているので、ミニタンパク質ＩＰＢＤｓにとっては特に適切である。
ＩＩＩ．変化戦術−−望ましい多様性を持ったポテンシャル結合ドメインを入手するための突然変異誘発
ＩＩＩ．Ａ．一般的事項
数個のドメインの突然変異によって入手し得る異なったアミノ酸配列が大きく、発見し得る量で顕示し得るいくつかの異なったドメインと比較された時、強制的進化の有効性は残留基が多様性を持つように注意深く選択することによっておおきく高められる。先ず、
結合活動（すなわち、表面にある残留基）に影響を及ぼす可能性のある既知のタンパク質の残留基そしてその安定性を不必要に低下させない既知のタンパク質の残留基は識別された。これらの残留基をコードしているコードンの全部もしくは一部は、
ＤＮＡの換えられた集団を作り出すために次々に換えられていく。次々に一つのターゲット分子に触れる表面に十分に近く存在する残留基のグループは、同時変化のために、用意されたセットである。ＤＮＡの換えられた集団は種々なポテンシャル結合ドメインを顕示するために利用される。そして興味のあるターゲットとの結合をなしとげる能力が評価される。
この発明による方法は、上記のようにして、さらに、生産され高度に換えられた集団の性格において、そして新規の結合タンパク質が択ばれると言うことからも、他の方法に比して傑出している。我々は、顕示されたポテンシャル結合ドメインが、効果的で組織だてられた方法で関連性を持った隣接しているアミノ酸配列の「配列スペース」を抜き取るよう強制する。四つのゴールが、ここで利用される様々な変化を導く。望ましくは、１）大多数（すなわち、１０⁷）の変形が利用可能となる、２）高い歩合の可能性変化が検出し得る量で現れる、３）望ましい変化の現れの頻度が相対的に一定している、そして４）変動が限られた数のアミノ酸残留基にのみ発生する。最も望ましくは、変動がポテンシャル結合ドメインの表面の共通領域方向に導かれたサイドグループを持つ残留基に発生することである。
この方法は、遺伝子を調整する放射線とヒドロキシルアミンのような無差別的突然変異誘発剤の単純な使用とは区別されるべきである。無差別突然変化誘発剤の使用では、突然変異の部位はコントロールされることもなく、非常に片寄っている。多くの突然変異は、結合ドメインの部分ではない残留基に影響を及ぼしている。化学的突然変異誘発物質がゲノム全体に導かれた場合ほとんどの突然変異は、ポテンシャル結合ドメインをコードしているそのものより他の遺伝子に発生する。さらに、合理的レベルの突然変異誘発においては、調整されたコードンが単一ベース変化によって特徴ずけられる可能性があるので、限られたそして片寄った可能性の領域のみが探求される。同様に、遠隔（remote）はランダムされない配列の突然変異誘発物質であるオリゴヌクレオチドを利用する特殊部位突然変異誘発技術の利用である。これらの専門技術は、多数の変形の生産と検査に関わってはいない。注意を集めているランダム突然変異誘発の専門技術は知られているが、変動分布をコントロールすることの重要性は見逃されている。
ポテンシャル結合ドメインは最初アミノ酸レベルでデザインされる。一度、どの残留基が突然変異誘発されるかを識別すれば、そしてどの突然変異がその部位で行われるかを識別すれば、種々のＰＢＤ_Sをコードしている換えられたＤＮＡをデザインすることができる。コードされたＰＢＤ_Sによって、ＰＢＤがターゲットに対する親和性を持っていればそれは検出されるという合理的な確率を保証する。勿論、数多くの入手した独立した形質転換物そして親和性分離専門技術は、変化の単一ラウンド内で可能な変化の度合いに制限を課すだろう。
タンパク質中に多様性を作り出すために様々な方法がある。（RICH86、CARU85、そしてOLIP86参照のこと。）一つの極端は、出来るかぎり多数のタンパク質の中のほんの少数の残留基を換えているとである。（なかんずく、CARU85、CARU87、RICH86、そしてWHAR86参照のこと。）この方法を「集束突然変異誘発」（Focused Mutagenesis）と呼ぶことにする。典型的な「集束突然変異誘発」戦略は、一セット５から７までの残留基を取り出し、１３から２０までの可能性で各々を変える。突然変異誘発の他のプラン（「拡散突然変異誘発」）は、より制限された選択のセットをとうしてより多数の残留基を替えることである。（VERS86aとPAKU86を参照のこと。）採用した変化（variegation）のパターンはこれらの極端な例の中間に存在する。すなわち、２０のアミノ酸をとうして二つの残留基が替えられ、たった二つの可能性をとうしてあと二つが替えられ、そして５番目は２０のアミノ酸の１０が換えられた。
同時に換えられるコードンの数は制限されない。しかしながら、可能なＰＢＤ配列が、すくなくとも一つの遺伝子パッケージによって真実に顕示されると言う合理的な確立を生み出す突然変異誘発戦略を採用することが望ましい。のぞましくは、ｖｇＤＮＡによってコードされたミューテイン（mutein）そして各替えられた部位における最も好まれないアミノ酸から成っているミューテインがライブラリー中で少なくとも独立した形質変換物によって顕示される確率は、少なくとも０．５０であり、望ましくは０．９０である。（より好まれているアミノ酸から成るミューテインは、勿論、その同じライブラリー中に発生する可能性がある。）
望ましくは、変化は、１０褶曲以下の異なったＤＮＡ配列（さらに望ましくは、３褶曲以下の）による異なった１０⁶−１０⁷のアミノ酸配列を顕示する典型的な形質転換物集団をもたらすことである。
アルファヘリス（helices）とベータストランド（strands）を持っていないクラスＩミクロタンパク質に関しては、いかなる突然変異の場においても、望ましくは、各々が４から８の非システインコードンを替え、それによって、それらの各々がポシブルな２０のアモノ酸の中少なくとも８をコードすることである。各コードンの変化はその部位に特別に替えられ得る。望ましくは、システインがポテンシャル代替物の一つではない、たとえシステインがその中に含まれていたとしても。
ミニタンパク質が金属フィンガータンパク質である場合には、典型的な変化戦術においては、二つのＣｙｓと二つのＨｉｓ残留基、そしてオプションとしての前述のＰｈｅ／Ｔｙｒ、ＰｈｅとＬｅｕ残留基は不変であり、そして複数（普通５から１０）の他の残留基は換えられる。
ミクロタンパク質が、一つもしくはそれ以上のアルファヘリスとベータストランドを特徴としているタイプである場合には、いかなる与えられた部位においてもポテンシャルなアミノ酸調整のセットは、その部位における第二次的構造を破壊しないものを取り入れることが望ましい。各可変のアミノ酸における可能性の数は限られているので、可変アミノ酸の全数は選択過程における抜粋有効性を替えることなく大きくなるであろう。
クラスＩＩＩミクロタンパク質にとって、のぞましくは、２０以下、さらに望ましくは５から１０のコードンが変化することである。しかしながら、拡散誘発物質が利用される場合には、変化させられたコードンの数は多くなり得る。
変化が通常指定された可変コードンにおいて一つのアミノ酸が他との代替に関係するような場合には、アミノ酸の挿入もしくは消滅に関連する可能性もある。
ＩＩＩ．Ｂ．換えられる残留基の識別
さて、換えられるＩＰＢＤの残留基の選択を助ける原理について考えよう。礎になる理論は、構成されたタンパク質のみが特殊結合を顕示すると言うことである。すなわち、上記のタンパク質が、他の大多数を除外して特殊な化学的物質と結合することができる。このようにして、換えられる残留基は、基礎的なＩＰＢＤ構造の保存と言う目的をもって選択される。褶曲構造からＰＢＤをしめだす代替物質は、ＧＰｓが無差別に結合する遺伝子を担動する原因となるので、それらは簡単に集団から取り去ることができる。溶液に晒されたアミノ酸代替物質は、内部座にある代替物質である三次元構造に影響を及ぼすことはあまりない。（PAKU86、REID88a、EISE85、SCHU79、169-171ページ、そしてCREJ84、239-245、314-315ページを参照のこと）。内部残留基は往々にして保存され、そしてアミノ酸タイプは、タンパク質構造が破壊されるかも知れないリスクなしに意義ある異なったタイプに換えることは不可能である。しかしながら、ＩからＬにもしくはＦからＹへのような内的残留基の保守的変化は見逃される。そのような保守的変化は、隣接タンパク質残留基の配置ならびに原動力に微妙に影響し、そしてそのような「繊細な調節」はＳＢＤが一度見いだされると有用となる。挿入および削除はどこよりもループ内でより容易に許容される。（THOR88）。
ＩＰＢＤに関するデータならびに変化サイクルにおいて変化する残留基を決定するのに役に立つターゲットに関するデータは次を含む。すなわち、１）構造、もしくは少なくともＩＰＢＤ表面にある残留基のリスト、２）ＩＰＢＤにホモローグの配列のリスト、そして３）ターゲット分子のモデルもしくはターゲットのスタンドイン、である。
ＩＩＩ．Ｃ．各親残留基のための代替物セットの決定
換えるための残留基を選択してから、各可変残留基に許容するアミノ酸の領域が決定される。全レベルの変化は、各変化した残留基における変形体の数である。各変形した残留基は、２から２０の異なった可能性物質を産出し、変化の異なったスキームを持っている。特定の変化されたコードンによってポテンシャルにコードされたアミノ酸セットは、「代替セット」と呼ばれる。
Milligen7500のようなＤＮＡ合成剤をコントロールしているコンピュータは、いくらかのｎｔ基剤（すなわち、ｎｔホスホラミジット−−phorphoram-idites）を利用して、二つもしくはそれ以上のリザーバ（reservoir）からｎｔｓ配分の役割を持ったオリゴｎｔのベースを合成することができる。あるいは、ｎｔ基剤は他の比率で混合され、「汚れたビン」と呼ばれる合成のためのリザーバの一つに入れられる。コードンの各ヌクレオチド部位にある基剤の「混合物」は、そのコードンによってコードされた異なったアミノ酸の相対的発生頻度を決定する。
簡単に変化されたコードンは、ヌクレオチド部位が退化でありものであり、等モル比で混合された二つもしくはそれ以上の基の混合から入手されるものである。これらの混合は基準化された「あいまいなヌクレオチド」コードによってこの明細書に記述されている。このコードの中に、たとえば、退化コードン「ＳＮＴ」の中の、「Ｓ」はＧとＢ基の等モルの混合物であり、「Ｎ」は全四基の等モルの混合物であり、「Ｔ」は単一の不変基チミジンである。
複雑に変化させられたコードンは、二つもしくはそれ以上の基剤の等モルの混合ではない一つの基剤によって、少なくとも、三つの部位の中の一つが充たされたものである。
簡単に変化されたコードンでも複雑に変化されたものでも、望ましい代替セットを作ることができる。特殊アミノ酸もしくはアミノ酸のクラスが適切であることを表示している情報がない場合には、発見し得るレベル以上のミニタンパク質の表示は不経済なので、同等の確率をもった全アミノ酸を代替するよう努力している。一つのコードン（ＮＮＮ）の各部位にある四つのｎｔｓの同等量は、各アミノ酸がコードしているコードンの数に比例して存在するアミノ酸分布を産出する。この分布は、一つの酸の残留基に対して二つの基本的残留基を与えると言う不利な点を持っている。さらに、ＷもしくはＭの６倍ものＲ、Ｓ、そしてＬが発生する。五つのコードンがこの分布で合成されたら、Ｌ、Ｒ、そしてＳのいくつかの組み合わせをコードしている２４３配列の各々は、ＷとＭのいくつかの組み合わせをコードしている３２配列の各々より７７７６倍豊富である。発見し得るレベルで五つのＷｓプレゼントを持つためには、７７７６以上の折りたたみで、各（Ｌ、Ｒ、Ｓ）配列プレゼントを持たなければならない。
特殊なアミノ酸残留基は、いくつかの方法で定義されたポリペプチドの三次元構造に影響を及ぼすことができる。すなわち、
ａ）ポリペプチドの主鎖の柔軟性に影響を及ぼす、
ｂ）疎水性グループを加える、
ｃ）電荷グループを加える、
ｄ）原子結合を許す、
ｅ）ジスルフィド、金属イオンとのキレーション、もしくは生体代行機器グループとの結合などのクロスリンクを形成する。
Lundeen（LUND86）は、三次元構造として知られているタンパク質に存在するヘリス、ベータストランド、ターン、そしてコイルのアミノ酸の頻度の表を作成し、遊離チオールグループを持っているＣＹＳｓと半シスチンを区別した。遊離ＣＹＳはヘリックスに最も数多く発見され、半シスチンはベータシートに最も数多く発見されたと報告している。しかしながら、半シスチンはヘリスに定期的に発見されている。Peaseら（PEAS90）は、二つのシスチンを持つペプチドを構造した。各々の一つの端は真実に安定したアルファヘリックスにある。アパアミンは同様な構造を持っている。（WEMM83,PEAS88）。
柔軟性：
ＧＬＹは二つの水素がＣ_アルファに付着した最も小さいアミノ酸である。ＧＬＹはＣ_ベータを持っていないので、ＧＬＹは主鎖に最大柔軟性を委ねる。このようにして、ＧＬＹはインメルマン反転に頻繁に発生する。ＰＲＯ、ＡＳＰ、ＳＥＲ、そしてＴＨＲに特に頻繁に発生する。
ＡＬＡ、ＳＥＲ、ＣＹＳ、ＡＳＰ、ＡＳＮ、ＬＥＵ、ＭＥＴ、ＰＨＥ、ＴＹＲ、ＴＲＰ、ＡＲＧ、ＨＩＳ、ＧＬＵ、ＧＬＮそしてＬＹＳ等のアミノ酸は、枝なしベータを持っている。勿論、サイドグループであるＳＥＲ、ＡＳＰそしてＡＳＮは、主鎖と水素結合を頻繁に行い、それによって、勢力的に他に望ましくない配座を主鎖に付けることができる。ＶＡＬ、ＩＬＥそしてＴＨＲは、延長された主鎖配座をより望ましいものとしている枝分かれベータカーボンを持っている。このようにして、ＶＡＬとＩＬＥはベータシートの中に最も頻繁に見られる。ＴＨＲのサイドグループが容易に主鎖と水素結合を形成することができるので、ベータシートに存在する傾向は少ない。
プロリン主鎖は巡回サイドグループによって特に制約される。ファイ角度は、常に６０度に近い。大多数のプロリンはタンパク質の表面で発見される。
電荷：
ＬＹＳとＡＲＧは、各々１０．４もしくは１２．０以下のｐＨにおいて単一正電荷を保持する。いかなる場合でも、各々４と５のアミノ酸を持ったメチレングループは、疎水性相互作用が可能である。ＡＲＧのグアニジニュームグループは、ＬＹＳのアミノ酸グループがたった三つの水素を同時に寄与できないのに、五つの水素を同時に寄与することができる。さらにまた、これらのグループの幾何学は異なっているので、これらのグループは時として交換され得ない。
ＡＳＰとＧＬＵは、各々−４．５と４．６以上のｐＨにおいて単一負電荷を保持する。ＡＳＰが一つのメチレングループしか持っていないので、いくつかの疎水相互作用が可能である。ＡＳＰの幾何学は主鎖窒素と水素結合を形成する役を演ずる。その窒素はインメルマン反転の中に頻繁に発見されるＡＳＰと一貫しており、ヘリスの初頭にある。ＧＬＵは、アルファヘリスの中に頻繁に発見され、特にこれらヘリスのアミノ酸末端位置に発見される。その理由は、サイドグループの負電荷がヘリックス双極子と安定化のための相互作用を持つためである。（NICH88、SALI88）。
ＨＩＳは、生理学的領域、ｖｉｚ．６．２におけるイオン化パッケージを持っている。このパッケージは、電荷されたグループの近接位置で、もしくは水素授与者もしくは受納者の近接位置で換えられる得る。ＨＩＳは亜鉛、銅、そして鉄のような金属イオンと結合することができる。
水素結合：
電荷されたアミノ酸の他に、ＳＥＲ、ＴＨＲ、ＡＳＮ、ＧＬＮ、ＴＹＲそしてＴＲＰは水素結合に参与することができる。
クロスリンク：
最も重要なクロスリンク形式は、チオールのＣＹＳ残留基間で形式されたジスルフィド結合である。適切な酸化環境の中で、これらの結合は自然に形式される。これらの結合はタンパク質もしくはミニタンパク質の特殊な配座を非常に安定したものとすることができる。酸化されたチオール試薬液と還元されたチオール試薬液の混合液が存在する場合、最も安定した配座の支配を許容する変換作用が行われる。タンパク質とペプチドの中のジスルフィドに関しては、KATZ90、MATS89、PERR84、PERR86、SAUE86、WELL86、JANA89、HORV89、KISH85、そしてSCHN86を参照すること。
特殊な酵素を必要としないで形成される他のクロスリンクは下記のとうりである。すなわち、
１）（ＣＹＳ）₄：Ｆｅ ルブレドキシン（CREI84、376ページ）
２）（ＣＹＳ）₄：Ｚｎ アスパルテート トランスカルバミラーゼ（CREI84、376ページ）とＺｎ−フィンガー（HARD90）
３）（ＨＩＳ）₂（ＭＥＴ）（ＣＹＳ）：Ｃｕ アズリン（CREI84、376ページと基本「ブルー」Ｃｕキューカンバータンパク質（GUSS88）
４）（ＨＩＳ）₄：Ｃｕ ＣｕＺｎ過酸化ジスムターゼ
５）（ＣＹＳ）₄：（Ｆｅ₄Ｓ₄） フェレドキシン（CREI84、376ページ）
６）（ＣＹＳ）₂（ＨＩＳ）₂：Ｚｎ アエンーフィンガー（GIBS88、SUMM91）
７）（ＣＹＳ）₃（ＨＩＳ）：Ｚｎ アエンーフィンガー（GAUS87、GIBS88）
（ＨＩＳ）₂（ＭＥＴ）（ＣＹＳ）：Ｃｕを持っているクロスリンクは、ＨＩＳとＭＥＴがＣｕなしにクロスリンクを形成できないと言うポテンシャルな優位性を持っている。
簡単に換えられたコードン
次の簡単に換えられたコードンは、それらがアミノ酸の相対的にバランスのとれたセットをコードするので有用である。すなわち、
１）ＳＮＴは次のセット（Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｇ）をコードする、すなわち
ａ）一つの酸性物質（Ｄ）と一つのベース（Ｒ）
ｂ）脂肪族（Ｌ、Ｖ）と芳香疎水族（Ｈ）の両方
ｃ）大型（Ｌ、Ｒ、Ｈ）と小型（Ｇ、Ａ）サイドグループ
ｄ）堅固（Ｐ）と柔軟（Ｇ）アミノ酸
ｅ）一度コードされたアミノ酸
２）ＲＮＧは次のセット（Ｍ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｇ）をコードする、すなわち
ａ）一つの酸性物質と二つのベース（最適のものではなく許容されるもの）
ｂ）親水性物と疎水性物
ｃ）一度コードされたアミノ酸
３）ＲＭＧは次のセット（Ｔ、Ｋ、Ａ、Ｅ）をコードする、すなわち
ａ）一つの酸性、一つのベース、一つの中性の親水性物
ｂ）三つの希望されたアルファヘリス
ｃ）一度コードされたアミノ酸
４）ＶＮＴは次のセット（Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｇ）をコードする、すなわち、
ａ）一つの酸性物質と一つのベース
ｂ）全クラス：電荷物、中性親水性物、疎水性物、堅固物と柔軟物、その他
ｃ）一度コードされたアミノ酸
５）ＲＲＳは次のセット（Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｇ²）をコードする、すなわち
ａ）二つの酸性物質と二つのベース
ｂ）二つの中性親水性物質
ｃ）二度コードされた単一グリシン
６）ＮＮＴは次のセット（Ｆ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｇ）をコードする、すなわち
ａ）１５の異なったアミノ酸を提供する１６のＤＮＡ配列。セリーンのみが繰り返され、他は同じ量で存在する。（これはライブラリーの極度に有効な抜き取りを許容する。）
ｂ）これらは同数の酸とベースのアミノ酸である（ＤとＲ一つ宛）
ｃ）アミノ酸の全主要クラスが存在する。すなわち、酸性、ベース、脂肪性疎水性物質、芳香疎水性物質、そして中性疎水性物質
７）ＮＮＧは次のセット（Ｌ²、Ｒ²、Ｓ、Ｗ、Ｐ、Ｑ、Ｍ、Ｔ、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｇ、ストップ）をコードする、すなわち
ａ）アルファヘリス（Ｌ、Ｍ、Ａ、Ｑ、Ｋ、Ｅ、そして、Ｓ、Ｒ、Ｔに対してより少ない程度で）の配座を好む残留基の公正で優位なもの
ｂ）１３の異なったアミノ酸をコードする。（ＶＨＧは、ＮＮＧによってコードされたセットのサブセットをコードする。それは、同等の酸とベースを持った、９つの中で５つがアルファヘリックスを好む、９つの異なったＤＮＡの中にある９つのあみノ酸をコードする。）
初期変化のために、ＮＮＴが、大多数の場合、好まれる。しかしながら、アミノ酸がアルファヘリックスに組み込まれるのをコードンがコードする場合には、ＮＮＧがＮＮＴより好まれる。
下記に、効率に関して数個の簡単な変化を分析する。それによって、ライブラリーは抜き取りを行うことができる。
（ＮＮＫ）⁶によってコードされたランダムヘキサペプチドのライブラリーが報告されている。（SCOT90、CWIR90）。表１３０は、そのようなライブラリーの期待された行為を示している。ＮＮＫは、ＰＨＥ、ＴＹＲ、ＣＹＳ、ＴＲＰ、ＨＩＳ、ＧＬＮ、ＩＬＥ、ＭＥＴ、ＡＳＮ、ＬＹＳ、ＡＳＰ、そしてＧＬＵ（アールファセット）のために単一コードンを作成し、ＶＡＬ、ＡＬＡ、ＰＲＯ、ＴＨＲ、そしてＧＬＹ（ファイセット）の各々のために二つのコードンを作成し、ＬＥＵ、ＡＲＧ、とＳＥＲ（オメガセット）の各々のために三つのコードンを作成する。表１３０Ａに示されているように、これらのセット各々からのアミノ酸の数に従って、64、000、000の可能配列を２８のクラスに分割した。最大クラスは、１４．６パーセントにほぼ等しい可能配列を持ったファイオメガ四つのアルファである。選択は別として、一クラスの全配列は、生産される同一の可能性を持っている。表１３０Ｂは、（ＮＮＫ）⁶ライブラリーから取られた任意ＤＮＡ配列が、定義されたクラスの一つに属しているヘキサペプチドをコードする確率を示している。たったの６．３パーセントにほぼ等しいＤＮＡ配列がこのファイオメガ四つのアルファクラスに属していることに注意して下さい。
表１３０Ｃ、は数個の独立した配座（すなわち、１０⁶、３・１０⁶、１０⁷、３・１０⁷、１０⁸、３・１０⁸、１０⁹、３・１０⁹）を持っているライブラリーのために各クラスにある期待された数の配列を示している。１０⁶独立した配座（ＩＴｓ）では６つのオメガクラスの５６パーセントを見ることを期待しているが、６つのアルファクラスのたったの０．１パーセントにすぎない。見られた大多数の配列は、１０パーセント以下がサンプルされたクラスから来ている。たとえば、二つのファイ二つのオメガ二つのアルファのクラスからのペプチドが、ターゲットと結合するためにライブラリーを分割することによって単離されることを考えてください。単離配列に関連ずけられているペプチドに関してどの位の知識を持っているか考えてください。たった４パーセントの二つのファイ二つのオメガ二つのアルファのクラスがサンプルされただけなので、オメガセットからのアミノ酸が事実オメガセットからの中で最上だと結論を下すことはできない。ポジション２にＬＥＵがあるかも知れないが、ＡＲＧもしくはＳＥＲのほうがいいのかも知れない。オメガ６つのクラスのペプチドを単離したとしても、より良いクラスのメンバーがライブラリーにはなかったと言う注意をひくチャンスがある。
１０⁷ＩＴｓのライブラリーで、数クラス完全にサンプルされたのを見たことがある。しかし、アルファ６つのクラスは、たったの１．１パーセントしかサンプルされていない。７．６・１０⁷ＩＴｓで，全アミノ酸配列の５０パーセントの顕示を期待している。しかし、三つもしくはそれ以上のアミノ酸のアルファセットを持っているクラスは、あまり沢山サンプルされていない。（ＮＮＫ）⁶ライブラリーのサンプリングを完成するためには、およそ３．１０⁹ＩＴｓ、今までに報告されている最大の（ＮＮＫ）⁶ライブラリーの１０倍のものが必要とされる。
表１３１は、（ＮＮＴ）⁴（ＮＮＧ）²によってコードされたライブラリーの期待値を示している。存在度の期待値は、コードンの順とは関係なく、もしくは不変化コードンをグループ別集団にすることにも関係がない。ライブラリーは、０．１３３倍のアミノ酸配列をコードしているが、そこにはたった０．０１６５倍のＤＮＡ配列しかない。このようにして、５．０・１０⁷ＩＴｓ（すなわち、（ＮＮＫ）⁶のために必要とされるものより６０倍も少ない）はライブラリーのほとんど完全に近いサンプリングをしている。その結果は（ＮＮＴ）⁶のものは幾分か良いものであり、そして（ＮＮＧ）⁶のものは、幾分かではあるが、それ程悪いものでもない。制御因子は、アミノ酸配列に対するＤＮＡ配列の比率である。
表１３２は、コードンＮＮＫ、ＮＮＴ、そしてＮＮＧのための＃ＤＮＡ配列／＃ＡＡ配列の比率を示している。ＮＮＫとＮＮＧのためには、Ｐｆファージの中の遺伝子ＩＩＩが「ストップ減失と推測される」と言う語句によって示されているように、ＰＢＤが重要な遺伝子の部分として顕示されていると推測している。そのように重要な遺伝子が利用されることはいかなる場合においても必要とはされていない。重要でない遺伝子が利用される場合には、分析方法は少し換えられるだろう。ＮＮＴとＮＮＧをサンプルすることは幾分か効果的ではなくなるであろう。（ＮＮＴ）⁶が（ＮＮＫ）⁵より３．６倍多数のアミノ酸配列を提供し、１．７倍少ないＤＮＡ配列を必要としていることを見て下さい。（ＮＮＴ）⁷が（ＮＮＫ）⁶の二倍ものアミノ酸配列を提供しているが、ＤＮＡ配列は３．３倍少ないものとなっていることを見て下さい。
このようにして、特別な部位で、全２０のアミノ酸を入手するために簡単な混合を利用することは可能であるが、これらの簡単な混合はコードされたアミノ酸のセットが非常に歪められたものとなる。この問題は複雑に変化されたコードンを利用して解決することができる。
複雑に変化されたコードン
全２０のアミノ酸を許容し、最も好まれているアミノ酸（ｍｆａａ）の存在度の比率に対する最小限に好まれているアミノ酸（ｌｆａａ）の存在度の最大比率を産出しているコードン内のｎｔ分布（「ｆｘｓ」）は、酸性そしてベースのアミノ酸の同等に存在する拘束があるとしても、できるだけ少数のストップコードン、そして、便宜上、第三のベースがＴもしくはＧであり、表１０Ａに示されておるように、そして存在度が示されているアミノ酸の各タイプをコードしているＤＮＡ分子を産出する。他の複雑な変化されたコードンは一つもしくはそれ以上の配座を緩和することによって入手し得る。
この化学作用は、等概然的である酸性とベースのアミノ酸を持った全２０のアミノ酸をコードし、最も好まれたアミノ酸（セリン）は、最小限に好まれるアミノ酸（トリプトファン）と同じ頻度で、たったの２．４５４回コードされている。「ｆｘｓ」ｖｇコードンは、ＮＮＫもしくはＮＮＳがたった一つのコードンを提供しているアミノ酸［Ｆ、Ｙ、Ｃ、Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｅ］の中のいくつかを持っているペプチドに対してサンプリングを最大に改善する。そのサンプリングの利点は、ライブラリーが相対的に小さい場合に最大に顕著なものとなる。酸性とベースの同等性の条件を見逃し、ストップコードンを過小評価する結果は表１０Ｂに示されている。
ＮＮＴコードンの利点は、この特許登録のどこでても論議されている。最適化されないＮＮＴはたった１６のＤＮＡ配列によってコードされた１５のアミノ酸を提供している。表１０Ｃに示されている分布をもってＮＮＴを改善することができる。それはほとんど同等量で５つのアミノ酸（ＳＥＲ、ＬＥＵ、ＨＩＳ、ＶＡＬ、ＡＳＰ）を提供する。さらに８つのアミノ酸（ＰＨＥ、ＴＹＲ、ＩＬＥ、ＡＳＮ、ＰＲＯ、ＡＬＡ、ＡＲＧ、ＧＬＹ）は、ＳＥＲの存在度７８パーセントで存在している。ＴＨＲとＣＹＳはＳＥＲの存在度の半分に存続している。ジスルフィド結合ミクロタンパク質のためのＤＮＡを変化させる場合、ＣＹＳの普及度を減少することが望ましい。この分布は高いレベルで見られる１３のアミノ酸を許容し、ストップを付与しない。最適化されたｆｘｓ分布は高い普及度でたった１１のアミノ酸を許容する。
ＮＮＧコードンもまた最適化され得る。表１０Ｄはほぼ最適化された（「ＡＬＡ」は［ＡＲＧ］とほぼ等しい）ＮＮＧコードンを示している。この変化の下に、四つの同等に最も好まれているアミノ酸：ＬＥＵ、ＡＲＧ、ＡＬＡ、とＧＬＵがある。このセットの中には一つの酸性と一つのベースがあることに注意して下さい。二つの同等に最も好まれていないアミノ酸：ＴＲＰとＭＥＴがある。ｉｆａａとｍｆａａの比率は０．５２５８である。このコードンが６回繰り返された場合、ＴＲＰとＭＥＴで全体を作られたペプチドは最も好まれたアミノ酸で全体を作られたペプチドと２パーセントの共通性を持っている。これを「最適化されたＮＮＧ ｖｇＤＮＡにおける（ＴＲＰ／ＭＥＴ）⁶の普及度」と呼ぶことにしている。
「汚れたビン」方法でｖｇＤＮＡを合成する場合には、限られた数の混合のみを利用するのが時として望ましい。一つの非常に有益な混合物は「最適化されたＮＮＳ混合」と呼ばれている。その中で、ｆｘｓ混合の最初の二つのポジション：Ｔ₁＝０．２４、Ｃ₁＝０．１７、Ａ₁＝０．３３、Ｇ₁＝０．２６を平均し、第二ポジションは第１ポジションと同一で、Ｃ₃＝Ｇ₃＝０．５である。この分布は、５パーセント以上のアミノ酸 ＡＲＧ、ＳＥＲ、ＬＥＵ、ＧＬＹ、ＶＡＬ、ＴＨＲ、ＡＳＮ、とＬＹＳを提供し、さらに４パーセント以上のアミノ酸 ＡＬＡ、ＡＳＰ、ＧＬＵ、ＩＬＥ、ＭＥＴとＴＹＲを提供している。
さらに複雑さを増して換えられたコードンは、興味あるものである。このコードンは、最初の二つのポジションの最適化されたＮＮＴコードンと同一であり、第三ポジションではＴ：Ｇ：：９０：１０を持っている。このコードンは５．５パーセント以上のアミノ酸（ＡＬＡ、ＩＬＥ、ＡＲＧ、ＳＥＲ、ＡＳＰ、ＬＥＵ、ＶＡＬ、ＰＨＥ、ＡＳＮ、ＧＬＹ、ＰＲＯ、ＴＹＲ、とＨＩＳ）を提供する。４．３パーセントのＴＨＲと３．９パーセントのＣＹＳは、ＮＮＫ（３．１２５パーセント）のＬＦＡＡｓよりさらに一般的である。残り５つのアミノ酸は、１パーセント以下で存在している。このコードンは、全アミノ酸が存在していると言う特徴を持っていて、二つ以上の低存在度のアミノ酸を持っている配列は希少である。このコードンを利用してＳＢＤを単離する場合には、最初の１３のアミノ酸が各ポジションでテストされることは理論的に確かである。最適化されたＮＮＧを基とした、同様なコードンが利用され得る。
表１０Ｅは、最適化されたＮＮＳ（もしくはＮＮＫ）コードンのいくつかの特性を示している。三つの同等に最も好まれているアミノ酸：ＡＥＲＧ、ＬＥＵ、とＳＥＲがあることに注意して下さい。１２の同等に最も好まれていないアミノ酸：ＰＨＥ、ＩＬＥ、ＭＥＴ、ＴＹＲ、ＨＩＳ、ＧＬＮ、ＡＳＮ、ＬＹＳ、ＡＳＰ、ＧＬＵ、ＣＹＳとＴＲＰも存在する。五つのアミノ酸（ＰＲＯ、ＴＨＲ、ＡＬＳ、ＶＡＬ、ＧＬＹ）がその間にある。ＮＮＳの６回の繰り返しは、［ＡＲＧ、ＬＥＵ、とＳＥＲ］からなる配列とたったの０．１パーセント前後同相のアミノ酸［ＰＨＥ、ＩＬＥ、ＭＥＴ、ＴＹＲ、ＨＩＳ、ＧＬＮ、ＡＳＮ、ＬＹＳ、ＡＳＰ、ＧＬＵ、ＣＹＳ、ソシテＴＲＰ］からなる配列を提供する。これは、最適化されたＮＮＧ⁶ ｖｇＤＮＡにおける（ＴＲＰ／ＭＥＴ）⁶の普遍度よりほぼ２０倍低いのみならず、この低普遍度は１２のアミノ酸に適用する。
拡散誘発
拡散誘発は、タンパク質のいかなる部位にも、またいかなる場合にも利用し得るが、ターゲットに結合しようとする物質が設定された場合が最も適切である。拡散誘発は、少量の一つもしくはそれ以上の他の活性化されたｎｔｓを持ったＤＮＡ合成（すなわち、ｎｔホスホラミジット−−ｎｔ−phosphoramidites）のために活性化された各々の純粋なｎｔｓをスパイクする（無効にする）ことによって遂行され得る。望ましくは、スパイクのレベルは、最終製品のほんの少量の部分が（たとえば、０．０００１パーセントの１パーセント）最初のＤＮＡ配列を含むくらいの量にする。これは、単一の、ダブルの、三重の、そしてそれ以上の誘発の発生を確かなものとするが、根本となる配列の回収は可能性のある成果である。
ＩＩＩ．Ｄ．重要なシステインを持ったミクロタンパク質の変化に関連している特殊考察
いくつかの望ましい簡単なもしくは複雑な変化されたコードンが、システインを含むアミノ酸セットをコードする。これは、数個のコードされた結合ドメインが、不変のジスルフィド結合システイン以外に、一つもしくはそれ以上のシステインを特徴とすることを意味している。例えば、各ＮＮＴコードされたポジションには、１６チャンスの内一回、システインを入手できる可能性がある。六つのコードンが換えられる場合には、付加システインを含むドメインの分数値は０．３３である。奇数のシステインが複雑化された状態を引き起こす。PerryとWetzel（PERR84）を参照のこと。一方、多数のジスルフィドを含んでいるタンパク質は、ジスルフィド、すなわち、トリプシンを形成しないシステインを含んでいる。一対になっていないシステインの可能性は、いくつかの方法で取り扱かうことができる。すなわち、
第一に、変化させられたファージ集団は、スルホリンク（SulfoLink）（Pierce Chemical Company,Rockford,Illinois,61105からのカタログ番号は44895 H）のような遊離したチオールを強固に結合している不動試液を無視される可能性がある。Pierceからのもう一つの製品は、TNB-Thiol Agarose（カタログ番号は20409 H）。BioRadはこの目的のためにAffi-Gel 401（カタログ番号153-4599）を販売している。
第二に、下記のようなシステインを除外している変化を利用することができる。すなわち、
ＮＨＴ−−［Ｆ、Ｓ、Ｙ、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｄ］を提供する
ＶＮＳ−−［Ｌ²、Ｐ²、Ｈ、Ｑ、Ｒ³、Ｉ、Ｍ、Ｔ²、Ｎ、Ｋ、Ｓ、Ｖ²、Ａ²、Ｅ、Ｄ、Ｇ²］を提供する
ＮＮＧ−−［Ｌ²、Ｓ、Ｗ、Ｐ、Ｗ、Ｒ²、Ｍ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｖ、Ａ、Ｆ、Ｇ、ストップ］を提供する
ＳＮＴ−−［Ｌ，Ｐ，Ｈ，Ｒ，Ｖ，Ａ，Ｄ，Ｇ］を提供する
ＲＮＧ−−［Ｍ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｇ］を提供する
ＲＭＧ−−［Ｔ、Ｋ、Ａ、Ｅ］を提供する
ＶＮＴ−−［Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｇ］を提供する、
もしくは
ＲＲＳ−−［Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｇ²］を提供する。しかしながら、これらのスキームの各々は、ＮＮＴと比較して、一つもしくはそれ以上の不利なものを持っている。すなわち、ａ）より少数のアミノ酸が許容される、ｂ）アミノ酸は平均して提供されていない、ｃ）酸性とベースのアミノ酸は恐らく同等ではあり得ない、もしくは、ｄ）ストップコードンが発生する。しかしながら、ＮＮＧ、ＮＨＴ、そしてＶＮＴはＮＮＴと同様有用である。ＮＮＧは１３の異なったアミノ酸と一つのストップシグナルをコードする。たった二つのアミノ酸が１６回の混合の中に二度現れる。
第三に、予め定められたターゲットに結合する集団を豊かにすることができ、そして余分のシステインのために、選択された配列（のpost hoc−−前後即因果関係）を評価できる。配座を拘束するために提供されているシステインよ多数のシステインを含んでいるものは、完全に有用である。デザインされた以外のジスルフィドのつながりが発生する可能性がある。単離されたＤＮＡ配列によって定義された結合ドメインは、いずれにせよ適切ではないと言うのではない。単離されたドメインの適切性は化学的に合成されたペプチドの化学的そして生物化学的な評価によって最善に決定される。
最後に、Ellmanの試液、ヨードアセテート、もしくはヨウ化メチルのような試液で遊離チオールをブロックすることができる。その試液は特に遊離チオールと結合し、そしてジスルフィドとは作用しない、そして集団中の調整されたファージをそのままにしておく。ブロックするための薬剤はミクロタンパク質の結合特質を換えてしまう可能性があることを知るべきである。このようにして、異なった結合ドメインが発見されるかも知れないと言う期待を持ってブロックするための種々の薬剤を利用しても良い。チオールをブロックされた遺伝子パッケージの換えられた集団は結合のためには画分される。単離された結合ミクロタンパク質のＤＮＡ配列が奇数のシステインを含んでいる場合、合成手段は奇数のチオールが適切にブロックされている、各ポシブルなつながりを持っているミクロタンパク質を提供するために利用されている。ニシウチ（NISH82、NISH86、そしてここに引用されている論文）は、各チオールが異なった型のブロックしているグループで保護されている、複数のシステインを含んでいるペプチド合成の方法を開示している。これらのグループは、選択的に除去することができるので、ジスルフィドの対合が統御され得る。一つのチオールがブロックされたままで残るか、もしくはブロックから解かれて異なった試液と再びブロックされるという改変したスキームの利用を考えている。
ＩＩＩ．Ｅ．第二番目そして後続の変化のラウンドの計画
この発明による方法は、予め定められたターゲットに対する高い親和性を持っている結合ドメインのアミノ酸配列に関する情報の効果的収集を許容する。単一ラウンドの変化や親和性濃縮化から非常に有用な結合ドメインが入手できたとしても、最高で可能な親和性と特殊性を勝ち取るためには、多数のラウンドが必要であると考えている。
初めての変化のラウンドでターゲットとのなんらかの結合をしたとしても、ターゲットに対する親和性はまだ低すぎ、ＳＢＤｓの変化によってさらに改善が成されるだろう。望ましくは、工程は進歩的であることである。すなわち、各変化のサイクルは、前のサイクルが生産したものより、次の変化サイクルのためにより良い出発点を作り出す。変化のレベルをそうなるようにセットして、ｐｐｂｄそしてｐｐｂｄ配列に関連した多数の配列が検出可能な量で存在していて、進歩的な工程を確かなものとしている。
変化のレベルがそのように高く、ｐｐｂｄ配列がそのように低いレベルで存在しているので、ＰＰＢＤを顕示する変換体がないと言うような識別可能な機会がある、また次のラウンドの最高ＳＢＤはＰＰＢＤより悪いものが出てくる可能性もある。必要以上に高い変化レベルでは、各誘発のラウンドは前のラウンドから独立していて、進歩の保証はない。この方法は、価値ある結合タンパク質まで導いてくれる可能性がある。しかしこのレベルの変化での実験の繰り返しは進歩的な結果をもたらさない。過多の変動は望ましいものではない。
進歩性は全部もしくは無と言う性質のものではない。前の変化サイクルから得たデータのほとんどが保持され、ＰＰＢＤ表面に関連した多数の異なった表面が生産される時、その工程が進歩的なのである。
先の変化サイクルにおける変化のレベルが正しく選ばれれば、正しく換えられた残留基に存在するために選択されたアミノ酸が、最善に決定されるものである。他の残留基に環境は変わるので、それらを再び変えることは適切である。同時に変えられるものよりもっと多くの興味ある残留基があるので、今だかつて変えられたことのないもの（優位性が最も高い）、もしくは、一つまたはそれ以上のサイクルのために変えられなかったもののいずれかの残留基の選出を続けていくかも知れない。
ＮＮＴもしくはＮＮＧの換えられたコードンの利用は、換えられたライブラリーのきわめて有効なサンプリングにつうじている。その理由は、（異なったアミノ酸配列）と（異なったＤＮＡ配列）比率が、ＮＮＫに対するそれよりも、もしくは最適化されたｖｇコードン（ｆｘｓ）に対するそれよりも、ずっとユニティに近いものであるから。いずれにせよ数個のアミノ酸は各ケースで省略される。ＮＮＴそしてＮＮＧ両方ともアミノ酸の重要なクラス（疎水性、親水性、酸性、ベース、中性の疎水性、小型、大型）のメンバーを許容する。結合ドメインを選択した後、後続の変化そして選択は高度の親和性もしくは特殊性を達成することが望ましいことであろう。この第二の変化の間、先の変化によって見逃されたアミノ酸の可能性が検討されるであろう。
いくつかの例が役に立つことと思う。ＮＮＴを利用して、ＰＲＯを入手したと仮定しよう。このアミノ酸は、ＮＮＴでもＮＮＧでも使用可能である。ＰＲＯはセット［ＰＲＯ、ＬＥＵ、ＶＡＬ、ＴＨＲ、ＡＬＡ、ＡＲＧ、ＧＬＹ、ＰＨＥ、ＴＹＲ、ＣＹＳ、ＨＩＳ、ＩＬＥ、ＡＳＮ、ＡＳＰ、ＳＥＲ］からの最高のアミノ酸であると言うことは理論的に確かである。［ＰＲＯ、ＴＲＰ、ＧＬＮ、ＭＥＴ、ＬＹＳ、ＧＬＵ］を含んだセットを次に試してみよう。ＮＮＧによって許容されたこのセットは望ましいセットである。
目的物質の代わりにＨＩＳを入手したとしたらどう言うことになるのだろう。ヒスチジンは芳香族であり、かなり疎水性であり、そとてイミダゾールリングと結合し、またイミダゾールリングから水素結合を形成することができる。トリプトファンは疎水性であり、そして芳香族であり、そして適当なアクセプタに水素を授与することができ、またＮＮＴコードンによって除外される。メチオニンもまた除外され、そして疎水性である。このようにして、一つの望ましいコースは、［ＨＩＳ、ＧＬＮ、ＡＳＮ、ＬＹＳ、ＴＹＲ、ＣＹＳ、ＴＲＰ、ＡＲＧ、ＳＥＲ、ＧＬＹ、＜ストップ＞］を許容する変化されたコードンＨＤＳを利用することである。
変化の第一ラウンドが完全に不成功に終わる場合には、異なったパターンの変化が利用されるべきである。たとえば、一つ以上の相互作用がドメイン内で定義され得る場合には変化の次のラウンドにある換えられた残留基が、最初の変化内で確定されたセット以外のセットからでなければならない。故障が繰り返されるような場合には、異なったＩＰＢＤに変えることもできる。
ＩＶ．顕示戦略：「遺伝子パッケージ」の表面に異種結合ドメインを顕示する
ＩＶ．Ａ．遺伝子パッケージに対する一般必要条件
多数の異なってはいるが関連を持ったポテンシャル結合ドメインの顕示を手に入れるためには、複製し得る遺伝子パッケージの不均一パッケージを生成することである。この遺伝子パッケージの各々は、興味あるターゲットのためにポテンシャルな結合ドメインをコードしている第一ＤＮＡ配列と顕示方法をコードしている第二ＤＮＡ配列を含んでいるハイブリッド遺伝子から成っている。このようにして、外表面のタンパク質は、遺伝子パッケージにとって天然のものではあるが、ポテンシャル結合ドメイン（もしくは、それが関連している親結合ドメイン）とは自然に関連を持たない。そのポテンシャル結合ドメインは、キメラタンパク質相当物質（もしくは、その処理された形）をその外表面に顕示する遺伝子パッケージの基である。
望ましい結合特性を具現している集団の構成要素は非常に小型なもの、たとえば１０⁶より小さいものであるかも知れない。この集団の構成要素が一度、非結合構成要素から切り離されると、それは増幅されることが可能でなければならない。可変の細胞を培養することは、遺伝子物質の最も勢力的に増幅されたもの、そして望ましいものである。遺伝子メッセージは試験管内、すなわち、ＰＣＲによって増幅される。しかしながら、これは最も望ましい方法ではない。
望ましくは、ＧＰが下記のものであることである。すなわち、１）ポテンシャル結合ドメインをコードしている理論的機構で遺伝子的に変えられたもの、２）培養で保持され増幅されたもの、３）親和性分離中、ターゲット物質と相互作用を行うことの出来るポテンシャルな結合タンパク質ドメインを顕示するよう操作されたもの、そして４）親和性は分離されているが、回収し得る形で顕示された結合ドメインをコードしている遺伝子情報を持っているもの。望ましくは、ＧＰが親和性分離の後も可変性を持っていることである。望ましいＧＰｓは栄養バクテリア細胞、バクテリア胞子、そして特にバクテリアＤＮＡウイルスである。真核生物（eukaryote）のウイルスは遺伝子パッケージとして利用され得るだろう。しかしそれらは望ましいものではない。遺伝子パッケージがバクテリア細胞である場合、もしくはペリプラズム的に組み立てられたファージである場合、顕示の手段は二つの要素を持っている。第一要素は、最初の発現物質を細胞（パッケジがファージの場合には宿主細胞）の内被膜に導く分泌シグナルである。この分泌シグナルは、処理された、成熟した、ポテンシャルな結合タンパク質を作り出すためにシグナル ペプチドによって分割される。第二要素は、パッケージがその外表面に処理されたタンパク質を収集するよう導いている外表面運搬シグナルである。望ましくは、この外表面運搬シグナルが遺伝子パッケージに天然にある表面タンパク質から誘導されることである。
たとえば、望ましい実験例において、ハイブリッド遺伝子は、一つのシグナル配列（すなわち、バクテリアｐｈｏＡもしくはｂｌａ遺伝子のシグナル配列、もしくはＭ１３ファージ遺伝子ＩＩＩのシグナル配列）に操作可能につながっているか、また、繊状ファージ（すなわち、Ｍ１３）のコートタンパク質（すなわち、Ｍ１３遺伝子ＩＩＩもしくは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質）をコードしているＤＮＡに操作可能につながっているポテンシャルな結合ドメインをコードしているＤＮＡから成っている。発現物質は、宿主細胞の内皮膜（リピッド二重膜）まで運搬される。そこでシグナル ペプチドは処理されたハイブリッドタンパク質を去るよう分割される。このハイブリッドタンパク質のコートタンパク質のような要素のＣ−終端は、リピッド二重膜に捕らえられてしまう。それ故ハイブリッドタンパク質はペリプラズムの部分から逃れない。（これは、野生タイプコートタンパク質の典型的なものである。）未完成ファージ粒子の単一ストランドＤＮＡは、ペリプラズムの部分に入っていき、それは、野生タイプのコートタンパク質とハイブリッドタンパク質をリピド二重膜から収集する。ハイブリッドタンパク質は、このようにして、その外表面に晒されたポテンシャルな結合ドメインを去り、繊状ファージの表面被覆に組み込まれる。（このようにして、宿主バクテリア細胞ではなく、繊状ファージが、この実験例で「複製可能な遺伝子パッケジ」である。）
分泌シグナルがポテンシャル結合ドメインの顕示のために必要である場合には、特別に望ましい実験例においては、ハイブリッド遺伝子が発現されたバクテリア細胞は「分泌許容」系統の細胞である。
遺伝子パッケージがバクテリア胞子、もしくはコートが細胞内で組み立てられたファージ（ファイＸ１７４もしくはラムダのような）である場合には、宿主バクテリア細胞の内皮膜に発現物質を導いている分泌シグナルは必要ではない。この場合には、発現手段は、単なる外表面運搬シグナルであり、典型的には胞子もしくはファージコートタンパク質の誘導物である。
数個のＧＰｓのための望ましいＯＳＰｓは、表２に示されている。このセクションのｏｓｐ−ｉｐｂｄの溶融に関しては、必要な変更を加えて、ｏｓｐ−ｐｂｄとｏｓｐ−ｓｂｄ溶融ににも適用されるべきである。
ＩＶ．Ｂ．ＧＰｓとしてのファージの利用：
ＩＰＢＤがジスルフィド結合ミクロタンパク質である場合には、ＩＰＢＤｓは細胞内に折りたたまれないので（これらのタンパク質は、ファージが細胞から解放された後これらのタンパク質は細胞内に折りたたまれる可能性がある）、ペリプラズム的に組み立てられたファージが望ましいものとされている。ＩＰＢＤが大型もしくは溶解し得ない配合団（Ｆｅ₄Ｓ₄群のような）を必要とする場合には、細胞内で組み立てられたファージが望ましいものとされている。その理由は、配合団はペリプラズムに欠けているので、分泌されるとＩＰＢＤが折りたたまれないかも知れないから。変化が導入される場合には、多数の汚染が、それらの表面に異なったＰＢＤの少なくとも数個のコピーを持っている一つのＰＢＤのための遺伝子を担っているハイブリッドＧＰｓを生成することができる。それは、低い多数の汚染（ＭＯＩ）をもたらした状態下でファージを持った汚染細胞によってこの可能性を最小限度に食い止めることが望ましい。
損なわれない成熟したファージとの関連を持つ酵素活動がほとんどないので、そして代謝的に不活性な成熟したファージ粒子を示している、遺伝子はバクテリア宿主外では不活性なので、バクテリオファージは優れた候補である。
与えられたバクテリオファージのために、望ましいＯＳＰは、普通、大多数のコピーのファージ表面に存在している一つである。それにも関わらず、Ｍ１３ ｇＩＩＩタンパク質（一つのファージに対して５のコピー）のようなＯＳＰは、ＰＢＤの顕示の原因となるＯＳＰとして優れた選択であるかも知れない。
野生タイプのｏｓｐ遺伝子が保存されることは望ましいことである。ｉｐｂｄ遺伝子断片は、第二コピーの受容体ｏｓｐ遺伝子に挿入されるか、もしくは新規に操作されたｏｓｐ遺伝子に挿入され可能性がある。ｏｓｐ−ｉｐｂｄ遺伝子は調整されたプロモータの統御の下に置かれることが望ましい。
ｉｐｂｄ遺伝子の断片を挿入するために、ユーザーは候補ＯＳＰ遺伝子の中にサイトを選択しなければならない。大多数のバクテリオファージのコートは、高度に規制されている。このようなバクテリオファージにおいては、ウイルス粒子（virion）の中の他のタンパク質と相互作用をする親ＯＳＰの残留基を、操作されたＯＳＰ−ＩＰＢＤ溶融の中に保持することは重要なことである。Ｍ１３ ｇＩＩＩのために、最後の１００の残留基（BASS90）（もしくは、たとえそれより少ない数としても）を保持すれば十分であるかも知れないが、Ｍ１３ ｇＶＩＩＩのために、全部の成熟したタンパク質を保持することは望ましい。そのような打ち切られたｇＩＩＩタンパク質は、ｇＩＩＩタンパク質がファージ汚染性に対して必要とされるように、完全なｇＩＩＩタンパク質と並んで発現されるであろう。
Ｍ１３、ｆ１、ｆｄ、Ｉｆ１、Ｉｋｅ、Ｘｆ、Ｐｆ１、そしてＰｆ３を含んでいる繊状ファージは、特別に興味をひくものである。主要なコートタンパク質は、遺伝子ＩＩＩによってコードされている。５０アミノ酸成熟遺伝子ＶＩＩＩコートタンパク質は、７３アミノ酸プリコート（ITOK79）として合成されている。第一２３アミノ酸は、未完成ポリペプチドが細胞内皮膜に挿入される原因となっている典型的な単一配列を構成している。
一つのE.Coliシグナルペプチド（ＳＰ−Ｉ）は、アミノ酸１８、２１、そして２３を承認し、幾分か少ない程度ではあるが、残留基２２、そしてプリコート（KUHN85a、KUHN85b、OLIV87）の残留基２３と２４との間のカットを承認している。シグナル配列を取り除いた後で、成熟したコートのアミノ終端は、内皮膜のペリプラスム側に位置させられる。カルボキシ終端は細胞質側に存在する。成熟した５０アミノ酸コートタンパク質のおよそ３０００コピーが内皮膜に並行して参加している。
遺伝子ＶＩＩＩの配列は知られており、アミノ酸の配列は，ｌａｃＵＶ５プロモータを利用して、そしてＬａｃＩ^q抑制体とともに利用されて、合成遺伝子にコードされ得る。ｌａｃＵＶ５プロモータはＩＰＴＧに誘発される。成熟した遺伝子ＩＩＩタンパク質は、円形ｓｓＤＮＡの周囲の被覆を形成する。三次元構造のｆ１ウイルス粒子は、中程度の解像度で知られている。遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のアミノ終端はウイルス粒子の表面にあり、そしてそのために、ポテンシャル結合ドメインの望ましい接続サイトである。遺伝子ＶＩＩＩのいくつかの調整が行われた、そしてそれらは下記に記載されている。Ｍ１３コートの二次元構造は、三次元構造に含蓄的である。成熟したＭ１３遺伝子ＶＩＩＩタンパク質はたった一つのドメインを持っている。
下記から成る三点遺伝子を構造した。すなわち、
１）内皮膜をとうして分泌の部分（２）と（３）を導いているシグナル配列をコードしているＤＮＡ、
２）成熟したＢＰＴＩ配列をコードしているＤＮＡ、そして
３）成熟したＭ１３ ｇＶＩＩＩをコードしているＤＮＡ。
この遺伝子はＭ１３ファージの表面に活力ある形でＢＰＴＩが現れる原因となる。
Ｍ１３プリコート（ＳＣＨＡ７８）のアミノ酸配列はＡＡ＿ｓｅｑ１と呼ばれ、下記のとうりである。すなわち、

Ｍ１３ＣＰに新規のタンパク質ドメインを挿入する最善のサイトは、矢印で示してあるように、Ａ２３の後である。その理由は、ＳＰ−ＩがＡ２３の後プリコートされたタンパク質を裂開するからである。分泌され得るタンパク質は、そのアミノ終端で成熟したＭ１３ＣＰと連結されて出現する。成熟したＭ１３ＣＰのアミノ終端はウイルス粒子の外表面に位置されているから、導入されたドメインは、ウイルス粒子の外側に顕示されるであろう。Ｍ１３ＣＰが資質２重膜に出現する機構が今だ解明されていないと言うことは、ｂｐｔｉの直接遺伝子ＶＩＩＩへの挿入が機能的溶融タンパク質を生成しないのかも知れないと言う可能性を提起する。溶融のシグナル配列を他に、たとえば、ｐｈｏＡ配列（ＭＫＱＳＴＩＡＬＡＬＬＰＬＬＦＴＰＶＴＫＡ........）（MARK91）に変えることが必要なのかも知れない。Marksら（MARK86）は、ｐｈｏＡシグナル ペプチドが成熟したＢＰＴＩをE.coliペリプラズムに導くことができることを示した。
ＩＰＢＤを顕示するもう一つの方法は、一部もしくは全部の遺伝子ＩＩＩを含んでいるキメラ遺伝子のドメインとしてそれを顕示することである。この遺伝子はＭ１３のマイナーコートタンパク質の一つをコードする。遺伝子ＶＩ、ＶＩＩ、とＩＸもまたマイナーコートタンパク質をコードする。これらのマイナータンパク質の各々は、一つの完全な成熟ウイルス粒子につきおよそ五つのコピーの中に存在する。そしてそれらは形態発生もしくは汚染に関係している。これにひき比べてメージャーコートタンパク質は、一つに完全な成熟したウイルス粒子につき２５００以上のコピーの中に存在する。遺伝子ＶＩ、ＶＩＩ、とＩＸタンパク質は、完熟したウイルス粒子の末端に存在する。これら三つのタンパク質は、後転移的に操作されない。（RASC86）。
単一ストランドの円形ファージＤＮＡは、遺伝子ＩＩタンパク質のおよそ五つのコピーと関連を持ち、ＤＮＡがらせん形被覆のタンパク質の中に閉じ込められうような方法で皮膜と関連を持ったコートタンパク質のパッチを通って押し出される。（WEBS78）。ＤＮＡは一対を基礎にはしていない（それはウイルスゲノムに厳めしい厳格は制限を課すことになる）。むしろベースは配列から独立して互いに挿入する。
Smith（SMIT85）とdelaCruzら（DELA88）は、遺伝子ＩＩＩへの挿入は新規なタンパク質ドメインが完全に成熟したウイルス粒子の外表面に発現する原因となることを示している。ミニタンパク質の遺伝子は、SmithとdelaCruzらによって利用されたサイトの遺伝子ＩＩＩ、他のドメインの境界線に対応している、もしくはタンパク質の表面ループに対応している一つのコードンにある遺伝子ＩＩＩ、もしくは成熟したタンパク質のアミノ終端にある遺伝子ＩＩＩに溶融されるかも知れない。
全参考文献に記載されている実験では、単一の調整された遺伝子ＩＩＩのｆｄを含んでいるベクトルが利用されている。このようにして、ｇＩＩＩの全五つのコピーは同一の方法で調整される。遺伝子ＩＩＩは、かなり大型（1272b.p.もしくはファージゲノムの約２０パーセント）であり、そして遺伝子全体の複製はファージへ安定的に挿入されるかどうかは確かではない。さらに、ｇＩＩＩのタンパク質の全五つのコピーは完全に成熟したウイルス粒子の一つの端に存在している。二価のターゲット分子（抗体のような）が五価のファージと結合する場合には、結果としてもたらされた複雑性は逆に戻すことは不可能であろう。ターゲットに結合されたＧＰの逆戻りのできない場合は、ターゲットに対して最大の親和性を持っている新規なポリペプチドをコードしている遺伝子配列を担っているＧＰｓの親和性同位体濃縮に大幅に干渉する。
逆戻りのできない複雑性の発生の可能性を減少するために、ＩＩＩのカルボキシ末端部分をコードする第二の合成遺伝子を利用することができるかも知れない。遺伝子ＩＩＩタンパク質のカルボキシ末端部分は、ファージの中にそれを組み入れる原因となる。たとえば、（コードン３９８によって特定されたアルギニンからはじめて）最後の２９残留基はファージへ溶融タンパク質が組み込まれる原因となるに十分であるかも知れない。代替的に、成熟したｇＩＩＩタンパク質、すなわち、遺伝子ＩＩＩの最後の１５０から１６０までのアミノ酸の最後の胞子ドメインを含むかも知れない。たとえば、下記からなる（５フィートから３フィートまで）一つの遺伝子を操作できるかも知れない。すなわち、
１）プロモータ（望ましくは制御されたもの）、
２）リボゾーム結合のサイト、
３）イニシエーション コードン、
４）分泌の（５）と（６）の部分を内皮膜をとうして導いている機能的シグナル ペプチド、
５）ＩＰＢＤをコードしているＤＮＡ、
６）Ｍ１３タンパク質の残留基２７５から４２４までをコードしているＤＮＡ、
７）変換ストップコードン、そして、
８）（任意に）転写ストップシグナル。
野生タイプの遺伝子ＩＩＩを残しておくので、いくつかの変換されない遺伝子ＩＩＩが存在するであろう。代替的に、ＯＳＰとして遺伝子ＶＩＩＩタンパク質を利用するかも知れない、そしてｏｓｐ：ｉｐｂｄ溶融を制御するかも知れないので、溶融タンパク質の一つもしくは数個のコピーがファージの上に発現する。
Ｍ１３遺伝子ＶＩ、ＶＩＩ、とＩＸタンパク質は、変換後は操作されない。これらのタンパク質がファージの中に組み込まれるルートは、今だ報告されていない。これらのタンパク質は普通の形態生成そしてファージの感染性のために必要である。これらの分子（遺伝子ＶＩタンパク質、遺伝子ＶＩＩタンパク質、そして遺伝子ＩＸタンパク質）が：ａ）細胞質から、ｂ）ペリプラズムから、もしくはｃ）脂質二重膜の内部から、ファージに接続しているかどうかは、知られていない。下記の一つを利用してファージ表面にＩＰＢＤを導入するためにこれらのタンパク質の一つを利用し得る。すなわち、
１）ｉｐｂｄ：：ｐｍｃｐ、
２）ｐｍｃｐ：：ｉｐｂｄ、
３）シグナル：：ｉｐｂｄ：：ｐｍｃｐ、そして
４）シグナル：：ｐｍｃｐ：：ｉｐｂｄ。
そこでｉｐｂｄは、最初のポテンシャル結合ドメインのための発現にコードしているＤＮＡを表示しており、ｐｍｃｐは、ファージマイナーコートタンパク質ＶＩ、ＶＩＩそしてＩＸの一つのためにコードしているＤＮＡを表示しており、シグナルは、ｐｈｏＡシグナル（ＭＫＱＳＴＩＡＬＡＬＬＰＬＬＦＴＰＶＴＫＡ）のような機能的分泌シグナルペプチドを表示しており、そして「：：」は、枠内遺伝子溶融を表示している。表示された溶融は、知られたプロモータ、望ましくは、ｌａｃＵＶ５、ｔａｃ、もしくはｔｒｐのような規制されたプロモータの下流に置かれる。溶融（１）と（２）は、マイナーコートタンパク質が細胞質からファージに接続される場合、もしくは脂質二重膜への自律的挿入によって接続される場合が適切である。溶融（１）は、マイナーコートタンパク質のアミノ終端が遊離している場合に適切であり、溶融（２）は、カルボキシ終端が遊離している場合に適切である。溶融（３）と（４）は、マイナーコートタンパク質がペリプラズムからファージに接続する場合、もしくは脂質二重膜の内部からファージに接続する場合に適切である。溶融（３）は、マイナーコートタンパク質が遊離している場合に適切であり、溶融（４）は、カルボキシ端末が遊離している場合に適切である。
同様な構造が他の線状ファージと建造可能である。Ｐｆ３は、ＩｎｃＰ−１プラスミドをかくまっているシュードモナス アエルゲノサ（Pseudomonas aerugenosa）細胞を感染する良く知られた線状ファージである。ＰＦ３のメージャーコートタンパク質は、その分泌を導くシグナルペプチドを持たないのが通常である。その配列は残留基ＡＳＰ₇、ＡＲＧ₃₇、ＬＹＳ₄₀、そしてＰＨＥ₄₄−ＣＯＯを電荷する。その配列は晒されているアミノ終端と一貫している。このようにして、Ｐｆ３の表面にＩＰＢＤＴの発現をもたらすために、下記よりなる三点遺伝子を構成した。すなわち、
１）枠内で（３）に溶融しているシュードモナス アエルゲノサ（ＩＰＢＤの分泌をもたらすととして望ましく知られている）における分泌をもたらすものとして知られているシグナル配列、
２）枠内で（３）に溶融している、ＩＰＢＤをコードしている一つの遺伝子断片、
３）成熟したＰｆ３コートタンパク質をコードしているＤＮＡ。
任意的に、１から１０までのアミノ酸のフレキシブルなつながりをコードしているＤＮＡもしくは一つの特殊なプロテアーゼ（すなわち、因子Ｘａ）のために承認サイトを形成しているアミノ酸は、ｉｐｂｄ遺伝子断片とＰｆ３コートタンパク質遺伝子の間に導入される。この三点遺伝子は、Ｐｆ３に導入されるために、他のＰｆ３遺伝子の発現を干渉しない。遺伝子組み換えの可能性を削減するために、第（３）部分は野生タイプの遺伝子に相対的な多数の沈黙の突然変異を持つようデザインされている。シグナル配列が分裂されるとしても、ＩＰＢＤはペリプラズムの中にあり、そして成熟したコートタンパク質はアンカーとしてまたファージ組立てシグナルとして作用する。この溶融タンパク質が、野生タイプのコートタンパク質によって許容されたルートとは別のルートによって脂質二重膜の中で休息をとることは問題ではない。
WO90/02809に記載されているように、バクテリオファージファイ Ｘ１７４のようなファージ、ラムダもしくはＴ４のような大型ＤＮＡファージ、そしてＲＮＡファージでさえ、適切な適応と調整をもってＧＰｓとして利用されるかも知れない。
ＩＶ．Ｃ．遺伝子パッケージとしてのバクテリア細胞
下記の良く特徴ずけられたバクテリア系統の一つを選択しても良い。すなわち、１）培養で育てられたもの、２）その表面にＰＢＤｓを顕示するために操作されたもの、そして３）親和性選択と相容性であるもの。
バクテリア細胞の内での望ましい遺伝子パッケージは、Salmonella typhimurium、Bacillus subtilis、Pseudomonas aeruginosa、Vibrio choleae、Klebsiella pneumonia、Neisseria gonorrhoese、Neisseria meningitidis、Bacteroides nodosus、Moraxella bovisそして特にEscyerichia coliである。ポテンシャル結合ミニタンパク質はキメラバクテリアの外表面タンパク質（ＯＳＰ）への挿入物として発現されるかも知れない。全バクテリアはそれらの外表面にタンパク質を展示する。E.coliは、望ましいバクテリアＧＰであり、そしてそのためにｆ、ＬａｍＢが望ましいＯＳＰである。
大多数のバクテリアタンパク質は、細胞質の中に存在するが、他は、ペリプラズムの場（プラズマ皮膜とグラムーマイナスバクテリアの細胞壁間に存在する）に運搬される、もしくは、細胞の外表面に送られるかそこに固定される。さらにその他のバクテリアタンパク質は細胞を取り巻いている媒体の中に出される（分泌される）。細胞によって認識されるタンパク質、そしてそれが細胞質の外に搬出される原因となり、細胞表面に顕現される原因となるタンパク質の特質は、「外表面運搬シグナル」と呼ぶこととする。グラムーマイナスのバクテリアはＯＳＰｓのサブセットを形成する外皮膜タンパク質（ＯＭＰ）を持っている。多数のＯＭＰｓには皮膜の一倍もしくはそれ以上のスパンがある。ＯＭＰｓを外皮膜に局在させるシグナルは、成熟したタンパク質のアミノ酸配列の中にコードされる。バクテリアの外皮膜タンパク質は、シグナル ペプチドと呼ばれているものを含んだ前駆物質形態で最初発現される。前駆物質タンパク質は内皮膜に運搬され、そしてシグナル ペプチド部分（moiety）はペリプラズムの場の中に押出される。そこで、それは「シグナル ペプチダーゼ」によって裂開され、そして残余の「成熟」したタンパク質はペリプラズムに入ることができる。そこで一度、他の細胞内機構が成熟したタンパク質の中の構造を認識し、その適切な部位は外皮膜にあると言うことを表示し、そしてそれをその部位に運搬する。
リーダーもしくは一つのタンパク質からのシグナル ペプチドのためにコードするＤＮＡは、キメラ遺伝子を形成するために、他のタンパク質、タンパク質ＸのためにコードしているＤＮＡ配列に接続され、そのキメラ遺伝子の顕示は、タンパク質Ｘがペリプラズムにおいて遊離して発現する原因となっていることは良く知られている。バクテリア系統（LISS85、STAD89）輸出許容の利用は、シグナル配列溶融が望ましいタンパク質を細胞表面に導く確率性を増大する。
ＯＳＰ−ＩＰＢＤ溶融タンパク質は、外皮膜の部分が高度に規制されていないので、グラムーマイナーのバクテリアの外皮膜の中で構造化の役割をする必要はない。大型ＯＳＰｓのために一つもしくはそれ以上のサイトが存在するだろう。そしてそのサイトでｏｓｐが打ち切られ、そしてｉｐｂｄに溶融されるので、溶融を発現している細胞は細胞表面のＩＰＢＤｓを顕示するだろう。ｏｍｐ遺伝子の断片と一つのｘ遺伝子の断片との溶融は、外皮膜に発現しているＸまで導いて行く。（CHAR88bとc、BENS84、CLEM81）。そのような溶融が形成される場合には、ＤＮＡ配列の中のｘのためにｉｐｂｄを代替することによって一つのｏｓｐ−ｉｐｂｄをデザインすることができる。さもなければ、成功したＯＭＰ−ＩＰＢＤ溶融が、溶融した遺伝子を発現しながら、そしてＩＰＢＤ顕示の表現型のための終結体ＧＰｓをテストしながら、最高のｏｍｐの断片を一つのｉｐｂｄに溶融することによって、望ましくさがしもとめられる。ＩＰＢＤが顕示される可能性を最大限にするために、ｏｍｐとｉｐｂｄ間の溶融のポイントもしくは二つ以上のポイントを取るために、ＯＭＰに関する使用可能データを利用する。（可橈性のあるリンカーをコードしているスペサーＤＮＡは、（リンカーは、ＧＬＹ、ＳＥＲ、とＡＳＮからなる）顕示を容易ならしめるためにｏｓｐとｉｐｂｄから誘導された断片間に設置されることができる。代替的に、数ケ所のサイトでｏｓｐを打ちきり、もしくは可変の長さのｏｓｐ断片を生産する方法で、そしてｏｓｐ断片をｉｐｂｄに溶融し、溶融を発現している細胞はふるい分けられもしくは選択されて、細胞の表面にはＩＰＢＤｓが顕示する。Freudlら（FREU89）は、あるサイズ以上のＯＳＰｓ（ＯｍｐＡのような）の断片が外皮膜に組み込まれていることを示した。もう一つの代替方法は、ｏｍｐ断片とｉｐｂｄの溶融におけるランダムＤＮＡの短いセグメントを含むことである、そしてＩＰＢＤ顕示の表現型を表示しているメンバーのために結果としてもたらされた変化された集団を篩い分けるか、選択する。
E.coliにおいては、ＬａｍＢタンパク質は良く理解されたＯＳＰであり、利用され得る。E.coli ＬａｍＢタンパク質は、S.typhimurium、V.cholerae、とK.pneumoniaに機能的な形で発現されているので、E.coli ＬａｍＢへの一つの溶融としてこれらの種属のいずれにもＰＢＤｓの集団を顕示することができる。K.pneumoniaは、ＬａｍＢと同様なマルトポリン（maltoporin）を発現する（WEHM89）、そしてこれもまた利用し得る。P.aeruginosaでは、Ｄ１タンパク質（ＬａｍＢの一つの同族体）が利用し得る。（TRIA88）。
ＬａｍＢは、機能的なＮ−ターミナル配列が存在している場合には、外皮膜まで運搬される。さらに、成熟した配列の最初の４９アミノ酸が成功をもたらす運搬のために必要とされる。（BENS84）。他のＯＳＰｓに関しては、E.coliのＬａｍＢは、後に除外される典型的なシグナル配列で合成される。ＬａｍＢタンパク質と他の外皮膜タンパク質ＯｍｐＣ、ＯｍｐＦそしてＰｈｏＥの部分間の同相は、ＬａｍＢアミノ酸（３９から４９まで）と他のタンパク質の配列間の同相を含めて、検出されている。（NIKA84）。これらのサブ配列は外皮膜に運搬されるタンパク質と名ずけられるかもしれない。
ＬａｍＢのアミノ酸配列は知られている。（CLEM81）。そして一つのモデルは、それがどのような方法で他の皮膜にそれ自体を固定するかを開発したものである。（他も含めて、BENZ88bによって調査された。）モルトース（麦芽糖）とファージ結合ドメインの部位もまた知られている。（HEIN88）。この情報を利用して、バクテリアの外皮膜に顕示するキメラのＯＳＰを提供してＬａｍＢに組み込まれるかも知れないＰＢＤ挿入によっていくつかの戦略が識別されるかも知れない。
ＰＢＤｓがＬａｍＢのようなキメラのトランス皮膜タンパク質によって顕示されなければならない場合、ＰＢＤは細胞の表面に通常発見されるループに挿入され得る。（BECK83、MANO86比較のこと）。代替的に、一つの５フィートセグメントのｏｓｐ遺伝子をｉｐｂｄ遺伝子断片に溶融するかも知れない。溶融部位はＯＳＰの表面に晒されたループに相当する場所を選択し、そしてＯＳＰのカルボキシ終端のタンパク質は除外される。ＬａｍＢにおいては、６０までのアミノ酸が結果としての異形のエピトープ（epitope）の顕示を持って挿入されているのかも知れない。（CHAR88bとc）。ＯｍｐＣ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＥ、とＰｈｏＥの構造特徴が非常に似ているので、これらのタンパク質から同様な働きを期待する。
ＬａｍＢは、結合タンパク質として特徴ずけられるかも知れないが、この発明の中では一つのＯＳＴＳを提供するために利用されると言うことに注意してください。その結合ドメインは変化されていない。
ＯｍｐＡ、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＦ、ＰｈｏＥとピリンのような他のバクテリアの外表面タンパク質は、ＬａｍＢとその同族体の場合に利用されるかも知れない。ＯｍｐＡは、それが非常に豊富に存在しているので、そしてその同族体が広範なグラム−マイナス バクテリア種属の中で知られているので、特別に興味のあるものである。Bakerら（BAKE87）は、E.coliの外皮膜の中のタンパク質組み込みを調査し、そして残留基１９−３２、６２−７３、１０５−１１８、と１４７−１５８が細胞表面に晒されていることを予告しているＯｍｐＡ位相的モデルを引用している。（VOGE86）。およそコードン１１１で、もしくはおよそコードン１５２で断片をコードしている一つのｉｐｂｄの挿入は、細胞表面にＩＰＢＤが顕示される原因となっているようだ。ＯｍｐＡに関しては、MACI88とMANO88も参照のこと。シュードモナス アエルゲノサのポリンタンパク質Ｆは、クローンされ、E.coliのＯｍｐＡに配列ホモロジイを持っている。（DUCH88）。このホモロジイはプロリンタンパク質Ｆに表面を晒した。残留基の予測を許容するには十分ではないけれど、ＯｍｐＡの位相モデルを決定するために利用された方法がポリンタンパク質Ｆにも利用されるかも知れない。一つのＯＳＰのようにＯｍｐＡを利用することに関連した研究はBECK80とMACI88に含まれている。
MisraとBenson（MISR88a、MISR88b）は、残留基ＧＬＹ₁₆₄とＬＥＵ₂₅₀は細胞表面に晒されている、またその他も含めて、と言うことを予告しているE.coli ＯｍｐＣの位相モデルを開示している。このようにして、E.coli ｏｍｐＣ細胞のおよそコードン１６４での、もしくはおよそコードンの２５０での、もしくはS.thyphimurium ｏｍｐＣ遺伝子の同位のコードンでの、一つのｉｐｂｄ遺伝子断片の挿入は、ＩＰＢＤが細胞表面に発現する原因となるかも知れない。他のバクテリア種属のｏｍｐＣ遺伝子が利用されるかも知れない。ＯｍｐＣに関連した研究はCATR87とCLIC88を含まれている。
E.coliのＯｍｐＦは、一つの極めて豊富なＯＳＰ、１０⁴コピーに等しいかまたは大きい細胞である。Pagesら（PAGE90）は、七つの表面を晒したセグメントを表示しているＯｍｐＦのモデルを発表している。一つのｉｐｂｄ遺伝子断片の溶融は、一つの挿入として、もしくはｏｍｐＦの３フィート部分を代替するものとしても、表示された領域の一つには機能的なｏｍｐＦ：ｉｐｂｄ遺伝子を生成する可能性がある。そしてその発現は細胞の表面にＩＰＢＤを顕示するように導いている。特に、約コードン１１１、１７７、２１７、もしくは２４５での溶融は機能的なｏｍｐＦ：：ｉｐｂｄ遺伝子を導くに違いない。ＯｍｐＦに関しては、REID88b、PAGE88、BENS88、TOMM82、とSODE85を合わせて参照のこと。
ピリ繊毛タンパク質は、ピリエートされた（piliated）細胞はこれらのタンパク質の多数のコピーを発現するので、またいくつかの他種（N.gonorrhoeae、P.aeruginosa、Moraxella bovis、Bacteroides、nodosus、とE.coli）は関連したピリンを発現するので特に興味深いものである。Getzoffとその協力者たち（GETZ88、PAGE87、SOME85）は、淋菌性ピリ繊毛のモデルを構造し、そしてその淋菌性ピリ繊毛のタンパク質は、タバコ モザイクウイルス タンパク質とミオヘムエリトリンに機構が似ている四つのらせん束を形成すると予告している。このモデルでは、アミノ終端とカルボキシ終端との両方が晒されている。アミノ終端はメチル化されている。Elleman（ELLE88）は、Bacteroides nodosusと他の種のピリンを調査し、抗原型の差異はピリンタンパク質の差異関係があるのかも知れない、そして最大変動はＣ終端領域に発生していると述べている。ピリンタンパク質のアミノ終端部分は高度に保存されている。Jenningsら（JENN89）は、口蹄病（アフトーザ）（残留基１４４−１５９）のウイルスの断片を、淋菌性ピリンと高度に同相のB.nodosus型４線毛タンパク質に接種した。P.aerubinosaの中の３フィート終端溶融の発現が、生物菌種の中に導かれ、溶融タンパク質の検出可能な量を生成していると言うことを彼等は発見した。Jenningsらは、異種エピトープを変化させなかった。また彼等はいかなる変動も示唆していない、彼等は、最後のピリン残留基と「柔軟性のあるリンカー」を提供している異種エピトープの最初の残留基との間に一つのＧＬＹ−ＧＬＹリンカーを挿入した。このようにして、ＩＰＢＤを接着するのぞましい部位は、カルボキシ終端であることが分かった。Jenningsらによってテストされた特殊な内部溶融（JENN89）は、P.aeruginosaに致死的であるように見えたけれども、その束の晒されたループもまた利用され得るだろう。ピリンに関しては、MCKE85とORND85も参照すること。
Judd（JUDD86、JUDD85）は、N.gonorrhoeaeのタンパク質ＩＡを研究し、そしてアミノ終端が晒されていることを発見した。このようにして、N.gonorrhoeae表面にＩＰＢＤを顕示する手段として成熟したＰ．ＩＡのアミノ終端にもしくは近隣にＩＰＢＤを接着することができる。
E.coliのＰｈｏＥ位相の一つのモデルは、van del Leyら（VAND86）によって開示されている。このモデルは、八つのループが晒されていることを予告している。これらループの１つへのＩＰＢＤの挿入は、細胞表面にＩＰＢＤが顕示される結果を導くらしい。残留基１５８、２０１、２３８、そして２７５は、ＩＰＢＤの挿入のための望ましい部位である。
他の利用し得るＯＳＰｓは、通常少量で発見される栄養素の受容物質であるE.coli BtuB、FepA、FHuA、IutA、FecAそしてFhuE（GUDM89）を含んでいる。これら全タンパク質の遺伝子は、配列されているが、位相モデルはまだ利用可能ではない。Gudmunsdottirら（GUDM89）は、ＢｔｕＢ面のある種の残留基、ペリプラズムを開示することにより、そしてウイルスＢｔｕｂ：：ＦｅｐＡ溶融の機能性を決定することによってＢｔｕＢとＦｅｐＡのためのそのようなモデルの構造をはじめた。Carmelら（CARM90）は、ＦｈｕＡに対する同様な性質の研究を報告している。全ナイセリア属は、すでに識別されている。そして多数の場合にはクローンされている鉄分運搬のための外表面タンパク質を発現している。MORS87とMORS88も参照のこと。
多数のグラムーマイナスバクテリアは、一つもしくはそれ以上の燐酸リパーゼ（ph-ospholipase）を発現している。E.coli燐酸リパーゼＡ、ｐｌｄＡ遺伝子の産物は、de Geusら（DEGE84）によってクローンされ配列された。彼等はタンパク質が後移転的処理なしに細胞表面に発現していることを発見した。一つのｉｐｂｄ遺伝子断片は、終端に接続することもできるし、タンパク質の中でループをコードしていると思われている部位で挿入され得る。その燐酸リパーゼＡは、シグナル配列を除去することなく外表面に到着し、そのシグナル配列は、このルートを許容するＰｌｄＡ：：ＩＰＢＤ溶融タンパク質を承認しない。このようにして、一つのＰｌｄＡ：：ＩＰＢＤもしくはＩＰＢＤ：：ＰｌｄＡ溶融が適切なシグナル配列を付加することによってペリプラズムの中に分泌される原因となるかも知れない。このようにして、一つのｉＰｂｄ断片が一つのＰｌｄＡの終端に単純な二元溶融をしたことに加えて、下記の構造はテストされるべきである。すなわち、
１）ｓｓ：：ｉｐｂｄ：：ｐｌｄＡ
２）ｓｓ：：ｐｌｄＡ：：ｉｐｂｄ
ＰｌｄＡ：：ｉＰＢＤタンパク質が一度ペリプラズムの中で遊離すると、それがどのようにしてそこに行ったか覚えていないし、そしてそれが他の表面に位置される結果となったＰｌｄＡの構造特徴は同じ目的部位への溶融を導くであろう。
ＩＶ．Ｄ．遺伝子パッケージとしてのバクテリア胞子：
バクテリア胞子はＧＰ候補として望ましい特徴を持っている。胞子は、化学的そして物理的エージェントに対して、栄養バクテリア細胞もしくはファージより以上に抵抗力がある。そしてそのために多種の親和性選択状態の利用を許容する。また、バチルス（桿状菌Bacillus）胞子は活性的に代謝しないし、その表面のタンパク質を換えることもない。バチルス胞子、そしてさらに特殊に、B.subtilis胞子は、それ故に、望ましいスポロイダル（sporoidal）ＧＰｓである。WO90/02809に詳細にわたって説明してあるように、異種の結合ドメインは、B.subtilis cotCもしくはcotD遺伝子によってコードされているような外表面タンパク質に導入されるかも知れない。
通常、遺伝子パッケージとして細胞、胞子、もしくはウイルスを利用することが望ましいこととされている、そのために外表面タンパク質は、すでに識別されたＩＰＢＤを顕示するよう操作され得る。しかしながら、WO90/02809に説明したように、この発明はそのような遺伝子パッケージに限られることなく、外表面運搬シグナルとして、変化と選択技術によって生成されるかも知れない。
Ｖ．Ｅ 遺伝子構造と発現の考察
（ｉ）ｐｂｄ−ｏｓｐ遺伝子は下記のものであろう。すなわち、ａ）完全に合成されたもの、ｂ）天然と合成ＤＮＡの複合、もしくはｃ）天然ＤＮＡ断片の複合。重要な点は、ｐｂｄセグメントが、前述のように、多数のそして多様なＰＢＤｓ家族をコードするために容易に変化されたと言うことである。合成されたｉｐｂｄセグメントは、それが制限サイトの設置に関して最大のコントロールを許容されているので望ましいものである。その３フィートの側面にあるｏｓｐ−ｉｐｂｄ遺伝子に隣接している領域に補足として存在する核分子、そして換えられないｏｓｐ−ｉｐｂｄの部分に補足として存在する核分子は、配列作りのために必要とされる。
遺伝子の規制を行う部分の配列は天然の規制要素の配列から取られている。すなわち、ａ）プロモーター、ｂ）Shine-Dalgarno配列、そしてｃ）転写のターミネーター。規制要素は天然の規制領域の交感配列の知識からもデザインされ得る。これらの規制要素の配列はコードを行う領域に接続されている。規制部位はまた都合の良い調整を許容する規制領域に挿入されているか、もしくは隣接して存在する。
親和性分離の重要な機能は、ターゲットのために高度の親和性を持っているＰＢＤｓ（ＩＰＢＤから誘導された）を支えているＧＰｓを、ターゲットのために低い親和性を持っているＰＢＤｓを支えているＧＰｓから分離することである。ＧＰの溶出量がＧＰ表面のＰＢＤｓの数に依存している場合には、低い親和性、ＧＰ（ＰＢＤ_W）を持った多数のＰＢＤｓを支えている一つのＧＰは、高度の親和性、ＰＢＤｓ（ＰＢＤ_Z）を持った少数のＰＢＤｓを支えている一つのＧＰとともに溶出するかも知れない。ｏｓｐ−ｐｂｄ遺伝子の規制は、望ましくは、大多数のパッケージが親和性に従って良い分離に影響を及ぼすために十分なＰＢＤを顕示すようにすることである。ｏｓｐ−ｐｂｄの発現のレベルをコントロールする規制し得るプロモーターの利用は、変化された集団の特徴的な働きを細心に調整することを許容する。
栄養バクテリア細胞における操作された遺伝子合成誘発は、ｌａｃＵＶ５、ｔｒｐＰ、もしくはｔａｃ（MANI82）のような規制されたプロモーターの利用をとうして行われてきた。合成されたタンパク質の量を規制する要素は、十分に良く理解されているので、広範な種類の不均一なタンパク質がE.coli、B.subtilisそして他の宿主細胞の中に、すくなくとも適度の量で、生成され得る。（BETT88）。望ましくは、ｏｓｐ−ｉｐｂｄ遺伝子のためのプロモーターは、一つの小さい化学的誘発物による規制に従うことである。たとえば、ｌａｃプロモーター、そしてハイブリッド ｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）プロモーターはイソプロピルチオガラクトシド（isopropylthiogalactoside（ＩＰＴＧ）で規制し得る。構成された遺伝子のためのプロモーターは、天然ｏｓｐ遺伝子からはくる必要はない。いかなる規制し得るバクテリアのプロモーターでも利用できる。非漏洩性のプロモーターが望ましい。
この発明は、遺伝子デザインの単一の方法に限られたものではない。ｏｓｐ−ｉｐｂｄ遺伝子は全体（in toto）を合成する必要はない。遺伝子の部分は天然のものから入手できるかも知れない。突然変化をｐｂｄ ＤＮＡ配列の特定なサイトに容易にそして正確に導いて行くかぎり、正確な遺伝子溶融を生成するためにいかなる操作方法を利用してもかまわない。
合成される遺伝子のコードしてある部分は、タンパク質のレベルでデザインされ、それからＤＮＡでコードされる。遺伝子コードの暖昧な表現は、変化されたコードンにおけるアミノ酸の様々な分布を生成するために、組み替えの可能性を最小限にするために、そして宿主細胞においてのコードンの利用が下手に変換されるのを減少するために、限定されたサイトの最適な配置を許容するように操作される。
Ｖ．Ｆ 構造の考察
ｉｐｂｄ−ｏｓｐ遺伝子をコードするたるのアミノ酸配列のデザインは、いくつかの構造の考察と関係している。デザインは各型のＧＰによって幾分か変換する。バクテリアにおいては、ＯＳＰｓは重要な要素ではなく、従って、ＯＳＰドメインの溶融は、その親としての機能のいずれをも、外皮膜に宿らせること以外は要求事項は何もない。
ＯＳＰがＰＢＤドメインのオリエンテーションを規制しないことが望ましい。これはＰＢＤ内に規制がないと言うことと間違えて考えてはいけない。Cwirlaら（CWIR90）、ScottとSmith（SCOT90）、そしてDevlinら（DEVL90）は、ファージが顕示されているランダムペプチドの中の可変残留基はファージＯＳＰからの影響を受けてはいけないと説いている。中程度から高度の配座制限を持っている結合ドメインは、高度の特殊性を開示するだろう、そして高度の親和性もまた可能であると説いている。このようにして、良く定義された枠内に発現するアミノ酸を特定する変化のためのコードンの選択は規制されている。サイドグループの性質は、数多いアミノ酸の組み合わせの置替によって極度に広範な領域をとうして換えられる。与えられたクラスの大多数のＰＢＤｓの主鎖配座は、極めて似たものである。しかしながら、ＯＳＰに関連したＰＢＤの動きは規制されてはいけない。このようにして、ＰＢＤとＯＳＰの間に柔軟性のあるリンカーを入れることは往々にして適切である。このような柔軟性のあるリンカーは、柔軟性のある領域を持っていることが知られているし、天然に存在しているタンパク質から取ることができる。たとえば、Ｍ１３のｇＩＩＩタンパク質は、アミノ終端ドメインに高度の自由を許容すると考えられているし、グリシンを豊かに含んでいる領域を持っている。そのような柔軟性のあるリンカーもまたデザインし得るかも知れない。アミノ酸ＧＬＹ、ＡＮＡ、ＳＥＲとＡＳＰが豊かに含まれているポリペプチドのセグメントは柔軟性が増大するようにできるかも知れない。多数のグリシンは特に望ましい。
ＬａｍＢ、ＯｍｐＡ、もしくはＭ１３ ｇＩＩＩタンパク質のようなＯＳＰの表面ループにＰＢＤを挿入することを選択した場合には、ＰＢＤがＯＳＰの終端に接続される時には発生しないいくつかの考察をする。このようなケースにおいては、ＯＳＰはＰＢＤにいくつかの制限的影響を及ぼしている。ＰＢＤの終端はある程度固定された位置に置かれている。高度に変化されたＤＮＡ配列を、表面を晒されたループをコードしているコードンに、そして特殊結合表現型を持っている細胞のために選択されたコードンにｏｓｐ遺伝子に挿入し得る。識別されたアミノ酸配列が（いかなる方法によってでも）合成される場合には、ＯＳＰの拘束は失われ、そしてペプチドは、ターゲットに対してより低い親和性を持ち、そしてより低い特殊性を持つようになる。TanとKaiser（TANN77）は、ＢＰＴＩの全アミノ酸を含んでいるＢＰＴＩの合成モデルを発見した、そしてそのモデルは、ＢＰＴＩよりほぼ１０⁷くらい高いトリプシンのための一つのＫ_dを持っているトリプシンと接触している。このようにして、変化されたアミノ酸は、構造的制約がＰＢＤによって提供されている一つのＰＢＤの部分であることが最も望ましい。
ＬａｍＢに挿入された異物エピトープに隣接しているアミノ酸はこれらのエピトープの免疫特質に影響を及ぼすことが知られている。（VAND90）。ＬａｍＢ、ＯｍｐＡ、もしくは同様なＯＳＰｓのループに挿入されているＰＢＤｓがループのアミノ酸によって、また一般的にＯＳＰによって影響されるだろうということを期待している。ＰＢＤの適切な顕示を入手するためには、ＯＳＰとＰＢＤの間に一つもしくはそれ以上のリンカーアミノ酸を加える必要があるかも知れない。そのようなリンカーは、天然タンパク質から獲得しえるし、もしくはアミノ酸の構成行動の知識を基にしてデザインし得るかも知れない。ＧＬＹ、ＳＥＲ、ＡＳＮ、ＡＳＰ、ＡＲＧ、そしてＴＨＲを豊かに持った配列が適切である。いずれの接合部位にもある一つから五つのアミノ酸は、ＯＳＰとＰＢＤ間の望ましい柔軟性を分与するだろう。
ｉｐｂｄ遺伝子のファージｏｓｐ遺伝子への挿入の望ましいサイトは、下記の中の一つである。すなわち、ａ）ＩＰＢＤが元の形に折り畳まれるところ、ｂ）ＯＳＰドメインがその元の形に折り畳まれるところ、そしてｃ）二つのドメイン間に干渉がないところ。
一つのＯＳＰのアミノもしくはカルボキシ終端を表示しているファージのモデルが溶液に晒されているような場合には、成熟したＯＳＰの晒された終端は、ｉｐｂｄ遺伝子の挿入のための良い候補となる。低い解像度の三次元モデルで十分である。
三次元モデルがない場合には、成熟したＯＳＰのアミノとカルボキシ終端がｉｐｂｄ遺伝子の挿入のための最善の候補である。構造的溶融は、ドメイン間の望ましくない相互作用を回避するために、ＩＰＢＤそしてＯＳＰドメイン間の付加的残留基を必要とするかも知れない。ＩＰＢＤもしくはＯＳＰに対するタンパク質同族体の特殊配列をコードしているランダムＤＮＡもしくはＤＮＡは、もし必要ならば、ｏｓｐ断片とｉｐｂｄ断片間に挿入され得る。
ＯＳＰ内のドメイン境界にある溶融は、機能的な溶融を入手するための良い方法でもある。Ｓｍｉｔｈは、不均質ＤＮＡをｆ１の遺伝子ＩＩＩにサブークローンしている時、そのような境界を研究した。（SMIT85）。
ＩＰＢＤの顕示を促すために適当なＯＳＰドメインを識別する基準は、ＩＰＢＤを識別するために利用されたものとは幾分か異なっている。一つのＯＳＰを識別する場合、最小限のサイズはそれほど重要ではない。なぜならば、ＯＳＰドメインは最後の結合分子の中には出現しないし、各変化ラウンドに繰り返して遺伝子を合成することは必要ではないから。主なデザインに関する懸念は下記のものを含んでいる。すなわち、ａ）ＯＳＰ：：ＩＰＢＤ溶融はＩＰＢＤの顕示を促す、ｂ）最初の遺伝子の構造は合理的に便宜であること、そして、ｃ）ｏｓｐ：：ｉｐｂｄ遺伝子は遺伝的に安定しており、そして安易に操作できること。ドメインを識別するためにいくつかの方法がある。原子を利用した調整に依存する方法は、JaninとChothia（JANI85）によって研究された。これらの方法は、アルファとカーボン（Ｃ_a）間の距離、平面の分割（ROSE85と比較のこと）、もしくは埋められた表面（RASH84）のマトリックスを利用する。Cho-thiaとその協力者達は、ドメイン構造（彼等の定義に従った）を持った多数の天然タンパク質の働きの相関関係を研究した。Rashinは、テルモリシン（thermo-lysin）の残留基２０６から３１６までからなるドメインの安定性を正しく予告した（VITA84、RASH84）。
多数の研究者は、安定したドメインを隔離し、そして確認するために部分的なタンパク質分解とタンパク質配列の分析を利用した。（たとえば、VITA84、POTE83、SCOT87a、とPABO79を参照のこと）。Paboらは、コリファージ ラムダからのｃＩ抑制体が二つのドメインを含んでいる一つの表示として熱量測定を利用した。彼等は、ドメイン境界の場所を決定するのに部分的タンパク質分解を利用した。
たった一つの利用し得る構造に関するデータが候補ＯＳＰのアミノ酸配列である場合には、ターンとループを予測する配列を利用することができる。いくつかのループとターンが正しく予告される高度の確率性がある。（ChouとFasman、（CHOU74）と比較のこと）。これらの部位はまたｉｐｂｄ遺伝子断片の挿入のための候補でもある。
バクテリアＯＳＰｓにおける、主要な考察は下記を含む。すなわち、ＰＢＤが顕示されること、そしてｂ）キメラのタンパク質に毒性がないこと。
ＯＳＰｓの位相的モデルから、ＯＳＰのアミノもしくはカルボキシ終端が晒されているかどうかを決定することができる。その場合には、これらはｏｓｐ断片のｉｐｂｄ断片への溶融のための優れた選択である。
ｌａｍＢ遺伝子は配列され、そして様々なプラスミドに利用し得る。（CLEM81、CHAR88aとb）。ｌａｍＢ断片と他の多数の遺伝子との多数の溶融は、E.coliのタンパク質の輸出の研究に利用されている。様々な研究から、Charbitら（CHAR88aとb）は、ｌａｍＢの残留基が下記であることを特定する一つのモデルを提案している。すなわち、ａ）皮膜に着床されている、ｂ）ペリプラズムと直面している、そしてｃ）細胞表面と直面している。成熟したタンパク質のアミノ酸のためのモデルの番号付けを我々は取り入れている。このモデルによると、外表面のループのいくつかが定義されている。それらは下記のとうりである。すなわち、１）８８から１１１までの残留基、２）１４５から１６５までの残留基、そして３）２３６から２５１までの残留基。
ＬａｍＢに着床されたミニタンパク質について考えてください。たとえば、Ｇ₁ＮＸＣＸ₅ＸＸＸＣＸ₁₀ＳＧ₁₂をコードしているＤＮＡをｌａｍＢのコードン１５３と１５４間に挿入することは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の表面に発現されている様々なｌａｍＢに導くであろう。Ｇ₁、Ｎ₂、Ｓ₁₁そしてＧ₁₂は、ミニタンパク質に十分なオリエンテーションの自由を許容するよう供給される、そしてそれはターゲットと最大限に相互作用がし得る。親和性の同位体濃縮を利用して（たとえば、蛍光的にラベルを貼られたターゲット経由でＦＡＣＳと関係して、多分数ラウンドの濃縮化をとうして）、予め定められたターゲットに対する高度の親和性を示している一つの特殊なＬａｍＢ誘導物を発現している一つのストランド（たとえば、ＢＥＳＴと名ずけられた）を入手できるかも知れない。ＢＥＳＴからの３から１０までの挿入された残留基の配列を持っている一つのオクタペプチドは、ＢＥＳＴで見られたものと似ている親和性を特殊性を持っているに違いない。その理由は、オクタペプチドは、ＬａｍＢ誘導物と分離されたミニタンパク質に非常に似ている配座の中にアミノ酸を保持している内部構造を持っているから。
一つもしくはそれ以上の新らしいドメインをタンパク質に溶融することは、親タンパク質の能力と異なった細胞から輸出される新らしいタンパク質の能力を生成するかも知れない。野生タイプコートタンパク質のシグナルペプチドは、真正のペプチドのために機能するかも知れないが、溶融を直接輸出することは不可能である。Ｓｅｃ依存のパスウエイを利用するためには、異なったシグナルペプチドが必要かも知れない。このようにしてキメラのＢＰＴＩ／Ｍ１３遺伝子ＶＩＩＩタンパク質を発現し、そして顕示すするためには、異種構造のシグナルペプチド（ｐｈｏＡのそれ）を利用する必要があることを発見した。
ターゲットに対する高度の親和性を持っているペプチドを顕々示するＧＰｓは、ターゲットから、特に多原子価のターゲットから溶出することは非常に困難なことであるかも知れない。（堅固に結合されたバクテリアは現場で容易に増殖することができる。）ファージに関しては、特殊なプロテアーゼのための裂開のサイト（血液凝固要素Ｘａのような）を溶融ＯＳＰタンパク質の中に導入することができるので、結合ドメインは遺伝子パッケージから裂開されることができる。そのような裂開は、全てのそれに起因しているファージが同一のＯＳＰｓを持ち、それによって同様に汚染的であり、ポリペプチド顕示ファージさえも、裂開なしに親和性マトリックスから溶出され得るという利点を持っている。この段階は、そうしない限り失われてしまったかも知れない価値ある遺伝子の回収を許容している。知っている限りにおいて、情報を持っている遺伝子パッケージを回収する手段として、特殊なプロテアーゼを利用すること、もしくは汚染度合いの異なったファージの集団を同一の汚染度を持ったファージの中に変換することについて開示したものはいないし、示唆した人もいない。
ＩＶ．Ｇ．遺伝子挿入の合成
この発明は、特殊なＤＮＡ合成もしくは構成の方法もしくは戦略に限られたものではない。従来のＤＮＡ合成は、変化されたＤＮＡ（混成プローブの生産のために現在利用されているものと似ている）の生成のための適切な試液調整で利用されるかも知れない。
ｏｓｐ−ｐｂｄ遺伝子は、適当に変換したＧＰによって顕示され得るように示されているｏｓｐ−ｉｐｂｄのようなｖｇＤＮＡが存在している親遺伝子の中に挿入することによって創造されるかもしれない。この発明は、特殊なｖｇＤＮＡ導入方法、たとえば、カセット誘発もしくは単一ストランドのオリゴヌクレオチドで導かれた誘発、に限られたものではない。
ＩＶ．Ｈ．操作できるクローニング ベクトル
操作できるクローニングベクトル（ＯＣＶ）は、キレラのｉｐｂｄ−ｏｓｐもしくはｉｐｂｄ−ｏｓｐ遺伝子を遺伝子パッケージの中に導入するために利用される複製核酸である。遺伝子パッケージがウイルスである場合には、それはそれ自体ＯＣＶとして働くかも知れない。細胞や胞子のためには、ＯＣＶはプラスミド、ウイルス、ファージミド、もしくは染色体であるかも知れない。
ＩＶ．Ｉ．細胞の変換：
ＧＰが細胞の場合には、ＧＰｓの集団は適当なＯＣＶｓで細胞を変換することによって生成される。ＧＰがファージの場合には、ファージは遺伝子的に操作され、そして増幅のために適当な宿主細胞に感染（tramsfect）する。ＧＰが胞子の場合には、胞子形成可能な細胞が通常の代謝の状態でＯＣＶと変形される、そして胞子形成が誘発され、それによってＯＳＰ−ＰＢＤｓが顕示されるようになる。この発明はＤＮＡとともに細胞変換をする１つの方法に限られてはいない。
変形された細胞は、最初、プラスミド遺伝子の発現を許容している非選択的状態の下で成長する。それから変形しなかった細胞を殺すために選択される。変形した細胞は、誘発の適切なレベルでｏｓｐ−ｐｂｄ遺伝子を発現するよう誘発される。ＩＰＢＤもしくはＰＢＤｓ担っているＧＰｓは、手近のＧＰに適当な方法で収穫される、一般的には、ＧＰｓを造粒する遠心分離の方法と、不妊の媒体（細胞）もしくは緩衝剤（胞子もしくはファージ）の中での再懸濁の方法である。顕示戦略が成功したか否か（ＧＰｓ全体が「テスト」ＩＰＢＤをそこに顕示する）、もしくは親和性選択が成功したか否か（ＧＰｓ様々な異なったＰＢＤｓをそこに顕示する）の確認のために、それらの準備は整った。
ＩＶ．Ｊ．顕示戦略の確認：
収穫されたパッケージは、ＩＰＢＤが表面に存在するか否かを決定するためにテストされる。ＧＰ表面にあるＩＰＢＤの存在を調べるいかなるＧＰｓテストにおいても、イオンもしくはＩＰＢＤの安定性のために重要であると知られている補足因子もしくはＡｆＭ（ＩＰＢＤ）が適当なレベルで含まれているかを調べる。テストは、下記によって行われる。すなわち、ａ）親和性のラベルを付すことによって、ｂ）酵素応用で、ｃ）分光光度的に、ｄ）親和性分離で、もしくはｅ）親和性沈降反応によって行われる。この段階でのＡｆＭ（ＩＰＢＤ）は、ＩＰＢＤ分子に対する強度の親和性（望ましくはＫ_d＜１０^-11Ｍ）そしてｗｔＧＰに対する少量の親和性もしくは無親和性を持っているものを取り上げる。
Ｖ．ーゲット結合突然変異体の親和性選択
Ｖ．Ａ．一般的な親和性分離技術
親和性分離は、顕示機構が働いているか否かを確認するために初めてこの発明で利用された。すなわち、キメラの外表面タンパク質が発現されて、そして遺伝子パッケージの表面に運搬されたか否かを調べるもので、挿入された結合ドメインがターゲット物質に受容され得るように方向ずけられている。この目的のために利用された場合には、結合ドメインは特別なターゲットのための既知の結合ドメインであり、そのターゲットは親和性分離工程において利用される親和性分子である。たとえば、一つの顕示機構は、挿入される遺伝子パッケージの外表面タンパク質をコードしている遺伝子の中にＢＰＴＩをコードするＤＮＡを挿入することにより確認し得るかも知れないし、通常ＢＰＴＩによって結合されている無水トリプシンとの結合をテストすることによって確認され得るかも知れない。
遺伝子パッケージがターゲットと結合している場合には、対応結合ドメインが遺伝子パッケージによってたしかに顕示されているという確認を持つことができる。結合ドメインを顕示しているパッケージ（そしてそこでターゲットと結合している）は、結合していないものから分離される。
一度、顕示機構が確認されると、様々な異なったポテンシャル結合ドメインを顕示している遺伝子パッケージの変化された集団を利用することが可能となり、そして一つもしくはそれ以上のターゲットとの結合がうまく行われているか否かを決定するための親和性分離技術を利用することが可能となる。このターゲットは、顕示された結合ドメイン、すなわち、一つの新しいターゲットとの結合のために選ばれ得るもの、に対して親である既知の結合ドメインによって結合されたものである必要はない。
「親和性分離手段」という言葉は、下記に限られることなく、下記を含むものである。すなわち、ａ）親和性コラムクロマトグラフィ、ｂ）親和性マトリックス物質からの一括溶出、ｃ）一つのプレートに接着された親和性物質からの一括溶出、ｄ）細胞選別を活性化した螢光、そしてｅ）ターゲット物質の存在下における電気泳動、を含む。「親和性物質」とは、浄化されるべき物質、「検体」（analyte）と呼ばれる物質に対する親和性を持った物質を意味することに使われた。大多数の場合には、親和性物質を検体との関係は逆に戻すことができるので、検体は一度不純物が洗い去られると親和性物質から遊離され得るものである。
Ｖ．Ｂ．一般親和性クロマトグラフィ
親和性コラム クロマトグラフィ、なにかの容器に保管された親和性マトリックス物質からの一括溶出、そしてプレートからの一括溶出は、非常に類似しているので、これらは今後、「親和性クロマトグラフィ」として取り扱うこととする。
親和性クロマトグラフィが利用されると、
１）ターゲット物質の分子は、適当に大きいサイズでなければならない、そして親和性分離のために適当な堅固な支持に対して利用される化学的反応性がなければならない、
２）マトリックスへのアップリケーションの後、ターゲット物質は水と反応しないことがのぞましい、
３）マトリックスへのアップリケーションの後、ターゲット物質は特殊ではない方法でタンパク質と結合したり劣化したりしてはいけない、そして
４）ターゲット物質の分子は、ターゲット結合のための十分な、変化されない表面（リンカーに接続されている原子を除いて、普通、少なくとも５００Ųの）を許容する一つのマトリックスに対する物質を接続するために十分に大きくなければならない。
親和性クロマトグラフィは、望ましい分離手段ではあるが、ＦＡＣＳ、電気泳動法、もしくはその他の方法も利用され得る。
この発明は、望ましい結合特質を持ったタンパク質をコードする細胞もしくはウイルスを担っている遺伝子のために集団を濃縮するバクテリア参媒、もしくはバクテリア ウイルス（もしくは他の遺伝子パッケージ）の親和性分離に利用するためのものである。
Ｖ．Ｃ．ターゲット物質
この発明は、一つもしくはそれ以上のターゲット物質と結合する結合ドメイン、または一つもしくはそれ以上のターゲット物質との結合に失敗する結合ドメインのための選択に利用され得る。もちろん、特殊性は、結合分子がターゲット物質の限られたセットに強固に結合するための能力であるが、識別されなければならない最初のセットからターゲット物質の他のセットにより微弱に結合したり、全然結合しない場合もある。
ターゲット物質は、ポリペプチド、脂肪質、ポリヌクレア酸、そして多糖類のような有機高分子であるが、それらに限られることはない。しかしながら、この発明は上述の識別されたターゲット物質のいずれにも限られてはいない。ただ一つの限定は、ターゲット物質が親和性分離に適当であるということである。このようにして、水溶液の中で安定しているほとんど全ての分子はターゲットとして利用し得る。
ヒト好中球（neutrophil）エラスターゼ（ＨＮＥ）のようなセリンプロテアーゼは、ポテンシャルターゲット物質でも特に興味をひくクラスである。セリンプロテアーゼは生きている有機物の中で［ウビキトース］（ubiquitous）であり、消化、血液凝固、フィブリノリシス（fibrinolysis）、免疫反応、生殖、そしてペプチド ホルモンの後移行操作のような工程で重要な役割を演じるものである。これらの酵素が演じる役割は重要であるが、制御されない、もしくは適当でないタンパク質分解活動は時として非常な破壊力を持つものである。
Ｖ．Ｄ．固定化もしくはターゲット物質へのラベル付け
クロマトグラフィ、ＦＡＣＳ，もしくは電気泳動に関しては、ターゲット物質を第二の化学構成要素に共有的に結合させる必要があるかも知れない。クロマトグラフィにとっては、第二の構成要素はヒトのマトリックスであり、ＦＡＣＳにとって第二の構成要素は螢光色素であり、そして電気泳動にとっては、第二の構成要素は強力に電荷された分子である。多くの場合には、ターゲット物質はすでに下記の望ましい性質を持っているのでカップリングは必要ではない。すなわち、ａ）固定化、ｂ）螢光、もしくはｃ）電荷。その他の場合には、化学的もしくは物理的カップリングが必要である。
親和性分離において利用される固定されたもしくはラベルを貼られた類似体を準備するために利用される実際上のターゲット物質は必要ではない。むしろ、ターゲット物質の中の適当に反応する類似体がより以上に便利かも知れない。反応する機能的グループを持っていないところのターゲット物質は、ハロゲンのような強力な試薬液の利用をとうして一つの反応する機能グループをまず生成することによって固定化することができるかも知れない。ある場合には、事実上のターゲット物質の反応的グループが、乱されることなく存在させられたターゲット分子の一部を占領しているかも知れない。その場合には、付加の機能的なグループが合成化学によって導入されるかも知れない。
固定化の一般的な方法として、二つの方法が広範に利用されている。第一の方法は、興味ある化合物をバイオティニレート（biotinylate）することである。それからバイオティニレートされた誘導物を固定化されたアビディンに結合する。第二の方法は、ターゲット物質に抗体を生成し、様々な方法で抗体を固定化し、それからターゲット物質を固定化された抗体に結合することである。抗体の利用はより大型のターゲット物質のために適当である。小型ターゲット（たとえば、１０もしくはそれ以下の非水素原子からなるもの）は、抗体によって完全に覆没されてしまうので、ほんの少量のターゲットがターゲット抗体合成物に晒される。
抗体に依存しない疎水性分子の非共有固定化もまた利用され得かも知れない。２、３、３−トリメチールデカンのような化合物は、アルギン酸ナトリウムのようなマトリックス前駆物質と混合され、そしてその混合物は硬化用の溶液まで押し出される。その結果として生成されたビーズは、2、3、3-トリメチールデカンを全体に散布され、そして表面に晒されている。
他の固定化の方法は、特殊化学的機能性の存在に依存している。一つのポリペプチドは−ＮＨ₂ Ｎ-terminal;Lysines）、−ＣＯＯＨ Ｃ-terminal; Aspartic Acids; Glutamic Acids、−ＯＨ（Serines;Threonines;Tyrosines）、そして−ＳＨ（Cysteines）を表示する。アミノ酸のサイド鎖の反応性に関しては、CREI84参照のこと。１つの多糖類は、糖のバックボーンを持っているＤＮＡがそうであるように、遊離した−ＯＨグループを持っている。
支持物質として利用される適当なマトリックスには、ポリスチレン、ガラス、アガローズ、そしてその他のクロマトグラフィの支持物が含まれ、そしてそれらはビーズ、シート、コラム，ウエル、そしてその他の望ましい形態に生成される。
選択工程の初期の段階で、ターゲット物質の比較的高度の集中が結合を容易にするためにマトリックスに利用され、ターゲット集中は、後に削減されて、より高度の親和性ＳＢＤｓが選ばれる。
Ｖ．Ｅ．より低い親和性のＰＢＤを支えている遺伝子パッケージの溶出
ＧＰｓ集団は、タンパク質結合のために利用される予定だったものと互換され得る状態の下で親和性マトリックスに適用される、そしてその集団は、カラム上いくらかの溶質のグラジエントの推移によって画分される。ターゲットに対する親和性を持っているＰＢＤｓのためにプロセスは濃縮され、そしてそのために、ターゲットに対する親和性が、利用された溶質によってより少なく影響される。濃縮された画分は、溶出物がより大きく集中されてカラムから溶出する可変のＧＰｓを含んでいるものである。
溶出物は、顕示されたＰＢＤｓと固定化されたターゲット物質間の非共有相互作用を弱めることができる。のぞましくは、溶出物が遺伝子パッケージを破壊しないこと、そして成功裡のミニタンパク質を対応している遺伝子メッセージが、ＰＣＲのような試験管内の方法によるよりもむしろ遺伝子パッケージを再生産することによって最も都合よく増幅されることである。ポテンシャルな溶出物のリストには、塩（Ｎａ＋、ＮＨ₄＋、Ｒｂ＋、ＳＯ₄−−、Ｈ₂ＰＯ₄−、クエン酸塩、Ｋ＋、Ｌｉ＋、Ｃｓ＋、ＨＳＯ₄−、ＣＯ₃−−、Ｃａ＋＋、Ｓｒ＋＋、Ｃ１−、ＰＯ₄−−−、ＨＣＯ₃−、Ｍｇ＋＋、Ｂａ＋＋、Ｂｒ−、ＨＰＯ₄−−そして酢酸塩）、酸、熱、ターゲットと結合すると知られている化合物、そして水溶性ターゲット物質（もしくはその類似物質）が含まれている。非溶出の遺伝子パッケージは、溶出状態に抵抗するターゲット物質のために十分に高い親和性を持っている結合ドメインをコードしているＤＮＡを含んでいる。そのような成功裡の結合ドメインをコードしているＤＮＡは、様々な方法で回収し得る。望ましくは、結合遺伝子パッケージは、溶出状態の変化によって容易に溶出される。代替的に、現場で遺伝子パッケージを培養することができるかも知れない。もしくはフェノール（もしくは他の適当な溶剤）を持ったマトリックスでターゲットに含まれているものを抽出し、そしてＰＣＲによるＤＮＡもしくは組み替え型ＤＮＡ技術によるＤＮＡを増幅することができるかも知れない。さらに、特定のプロテアーゼのためのサイトが顕示ベクトルの中に操作されている場合には、特定のプロテアーゼはＧＰからの結合ドメインを裂開するために利用される。
マトリックスその他に対する非特定の結合は、親和性分離技術の中でよく知られている技術によって識別され、もしくは還元されるかも知れない。
Ｖ．Ｆ．パッケージの回収
親和性カラムへの結合を顕示しているパッケージの回収は、いくつかの方法で成し遂げることができるだろう。すなわち、
１）上記のようにグラジエントでカラムから溶出した画分を集めること。カラムに対する高度の親和性を持ったＰＢＤｓをコードしている遺伝子のためにより濃縮されたＧＰｓを含んでいるグラジエントの中に後で溶出している画分を集めること。
２）水溶液の形でターゲット物質をカラムを溶出する。
３）栄養媒体を持ったマトリックスを水に浸し、そして現場で望ましいパッケージを育てる。
４）マトリックスの部分を削除し、そして成長媒体を接種するためにそれらを利用する。５）ターゲットをマトリックスに接着しているつながりを化学的もしくは酵素的に劣化するので、ターゲットに結合しているＧＰｓはさらに溶出する、もしくは
６）パッケージを劣化し、そしてフェノールもしくは他の適当な溶剤でＤＮＡを回収する。回収されたＤＮＡはＧＰｓを再生する細胞を変換するために利用される。
上述の方法を組み合わせて利用することができる。親和性マトリックスから回収したいものは、ＧＰｓそのものではなく、その中にある情報である。生存能力を持ったＧＰｓの回収が強く望まれるが、遺伝子物質の回収が重要なのである。細胞、胞子、もしくはビリオンが逆戻り出来ないようにマトリックスと結合しているが、破壊されていない場合には現場の細胞分割、萌芽、もしくは感染をとうして情報を回収することができる。パッケージのタンパク質分解退化とＤＮＡ回収はのぞましくない。
Ｖ．Ｇ．濃縮されたパッケージの増幅
選択された結合形質を持った生命力のあるＧＰｓは、適当な媒体での培養によって増幅される、もしくは、ファージの場合には、そのように培養された宿主に感染する。ＧＰｓがクロマトグラフィによって不活性化された場合には、ｏｓｐ−ｐｂｄ遺伝子を担っているＯＣＶは、ＧＰから回収され、そして新しい、生命力を持った宿主に導入される。
Ｖ．Ｈ．推定ＳＢＤｓの特徴：
一つのもしくはそれ以上のクローンの分離されたもののために、ｏｓｐ断片なしに、各々のＳＢＤが一つの遊離したタンパク質として生産され得るような発現ベクトルの中にｓｂｄ遺伝子断片をサブクローンするかも知れない。結合の強さの物理的測定は、適当な方法によって各々遊離したＳＢＤタンパク質のためにできるかも知れない。
結合がまだ十分ではないと分かった場合には、次を変換するＳＢＤ（新しいＰＰＢＤ）の残留基を決定する。結合が十分である場合には、新規の望ましい結合タンパク質をコードしている遺伝子を支えている発現ベクトルをもとことになる。
Ｖ．Ｉ．合同選択：
物質Ａと結合するが物質Ｂとは結合しない分子、もしくは物質ＡとＢ両方に結合する分子、どちらでも代替的にもしくは同時に結合する分子の選択に関して記述した方法の親和性分離を調整しても良い。
Ｖ．Ｊ．敵対するものの操作
一つの酵素もしくは受容者に対する敵対者を用意することはのぞましいことだろう。天然の基剤もしくは作用物質か、活性サイトに達することを妨げている分子を生成することによって成し遂げられる。活性サイトに直接結合する分子は、作用物質か敵対物質であるだろう。このようにして、下記の戦略を採用した。酵素と受容者を指定物質ＴＥＲ（ターゲット酵素もしくは受容者）の下であると考えている。
大多数のＴＥＲｓのために活性サイトを封鎖する科学的インヒビターが存在する。通常これらの化学薬剤は、高度な毒性のために研究の道具としてのみ有用である。二つの親和性マトリックスを用意した。すなわち、一つは活性ＴＥＲを、他の一つは封鎖されたＴＥＲを利用した。変化されたＧＰ（ＰＢＤ）ｓの集団をつくり、酵素の両方の型に結合するＳＢＰｓを選択し、それによって、活性サイトと結合しないＳＤＰｓを入手した。ＳＢＤｓは酵素表面の異なった部位との結合を発見するだろうと期待している。一対のｓｂｄ遺伝子は一つの介入しているペプチド セグメントと溶融している。たとえば、ＳＢＤ−１とＳＢＤ−２はターゲット酵素に対して高度の親和性を示している結合ドメインであり、そしてそのために結合は競争的ではなく、その遺伝子 ｓｂｄ−１：：ｌｉｎｋｅｒ：：ｓｂｄ−２は、ターゲットに対して高度の親和制示すだろう一つの２−ドメインをコードしている。様々なＳＢＤｓと様々なリンカーを持っているいくつかの溶融を生成する。そのような化合物は、ターゲット酵素に対して一つの敵対物質であるという理論的な確率性を持っている。
ＶＩ．成功する結合ドメイン対応ＤＮＡの開発
ＳＢＤは組替型ＤＮＡ技術で生成し得るが、一つのＩＰＢＤとしてミニ タンパク質利用から本来付与されている利点は、誘導されたＳＢＤがまたミニ タンパク質のように行動するだろう、そして科学的合成に手段で入手し得だろうということである。（「化学的合成」という言葉は、ここで使われているように、細胞なしの環境での酵素剤の使用も含まれている。）
この発明の方法を利用することによって得られるミニ タンパク質は、天然には発生していないアミノ酸そしてアミノ酸以外のグループを含んでいる一連の同族体のための先導化合物として考えられることを理解しなければならない。たとえば、一連のメンバーの各々は、そのＤ鏡像異性体によって置換された一つのアミノ酸を持っている一連の同族体を合成することができる。また、ベータ アラニン、アミノ酪酸、３−ヒドロキシプロリン、２−アミノアジピン酸、Ｎ−エチルアスーラジン、ノルバリン、その他のような構成要素を含んでいる同族体を生成することができる、そしてそれらは、安定性や毒性などのような興味ある結合そして他の特質のためにテストされ得るだろう。
ペプチドは、溶液もしくは支持物質の中で化学的に合成されるかも知れない。段階的な合成を断片縮合の様々な組み合わせが利用され得るだろう。
合成作用中は、アミノ酸サイド鎖は分枝を回避するよう保護することが望ましい。いくつかの異なった保護グループが、システインのチオールグループの保護のために有用である。それらは下記を含む。すなわち、
１）４−メトキシベンジル（ＭＢ_z１；Ｍｏｂ）（NISH82；ZAFA88）、ＨＦで除去し得る。
２）アセタミドメチル（Ａｃｍ）（NISH82；NISH86；BECK89c）、ヨードで除去し得る。水銀イオン（すなわち、水銀アセテート）。硝酸銀。そして
３）Ｓ−ｐａｒａ−メトキシベンジル（HOUG84）。
他のチオール保護グループは、Greeneの「有機合成における保護グループ」（1981）のような標準の文献著作の中で見つけられる。
ポリペプチド鎖が一度合成されると、ジスルフィド結合も形成されなければならない。可能な酸性可剤は、空気（HOUGH84；NISH86）、フェリシアン化合物（NISH82；HOUG84）、ヨード（NISH82）、そして過ギ酸（HOUG84）である。温度、ｐＨ、溶液、そしてカオトロピーの化学物質は、酸化工程に影響を及ぼすかも知れない。
複数のジスルフィド結合を持った大多数のミクロタンパク質は、生物学的に活性のある形で化学的に合成されている。それらは下記を含む。すなわち、コノトキシンＧ１（１３ＡＡ、４−Ｃｙｓ）（NISH82）、熱安定エンテロトマシンＳＴ（１８ＡＡ、６ Ｃｙｓ）（HOUG84）、ＳＴの類似体（BHAT86）、オメガーコノトキシンＧＶＩＡ（２７ＡＡ、６Ｃｙｓ）（NISH86；RIVI87b）、オメガーコノトキシンＭＶＩＩＡ（２７ＡＡ、６Ｃｙｓ）（OLIV87b）、アルファーコノトキシンＳＩ（１３ＡＡ、４ＣｙＳ）（ZAFA88）、ミュー コノトキシン ＩＩＩａ（２２ＡＡ、６Ｃｙｓ）（BECK89c、CRUZ89、HATA90）を含む。時として、ポリペプチドは自然に折り畳まれているので、正しいジスルフィド結合を形成する。他の時には、各一対のシステインのために、異なった除去可能な保護グループの利用によって助力しなければならない。
この発明による成功裡の結合のドメインは、大型タンパク質を単独でもしくは部分として、ターゲット物質の単離もしくは検出を含んだ目的、結合タンパク質が適当であることを確かめるための目的のために利用される。この目的をさらに助長するためには、新規な結合タンパク質が直接的にもしくは間接的に共有的に、もしくは非共有的に、ラベルに、担体に、もしくは支持体に結合され得るかも知れない。
薬剤として利用される場合には、新規な結合タンパク質は、適当な担体、もしくは補助剤と混合されても良い。
例 １
Ａクラスミクロタンパク質のデザインおよび突然変異誘発物質
単一のジスルフィドによって配座が拘束された結合ドメインのライブラリーを入手するためには、下記のミクロタンパク質属ヲコードしているＤＮＡを適当なＯＳＰをコードしている遺伝子に挿入する。すなわち、

部分がジスルフィド結合を表示している。ジスルフィドは通常ポリペプチド鎖に連続しているシステイン間には形成されない。上記にＸ_nで表示された残留基の一つもしくはそれ以上は新規な結合を手に入れるために大きく換えられている。Ｘ₁を前置する、もしくはＸ₆に従う一つもしくはそれ以上のアミノ酸がある、しかしながら、Ｘ₁の前もしくはＸ₆の後の残留基は、図表に表されたジスルフィド橋によって意義深くは拘束されない、そしてこれらの遠隔の橋のない残留基を換えることは有利ではない。最後のＸ残留基は、遺伝子パッケージのＯＳＰと連結されている。
Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₃、Ｘ₄、Ｘ₅、そしてＸ₆は独立して変換され得る、すなわち、変化の一つの異なったスキームが各部位で利用されることができる。Ｘ₁そしてＸ₆は最小限に拘束された残留基であり、他の部位より変化が少ない。
Ｘ₁とＸ₆は、たとえば、アミノ酸（Ｅ、Ｋ、Ｔ、そしてＡ）の一つになることができ、このセットのアミノ酸は下記の理由のために望ましいものである。すなわち、
ａ）正電荷の、負電荷の、そして中性のアミノ酸の可能性が供給されている、
ｂ）これらのアミノ酸は、コードンＲＭＧ（Ｒ＝等モルのＡとＧ、Ｍ＝等モルのＡとＣ）
そして
ｃ）これらのアミノ酸はシグナル ペプチダーゼによって適切な工程が許容される。
一つの望ましい実験例では、Ｘ₂、Ｘ₃、Ｘ₄そしてＸ₅は、代替セット（Ｆ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｄ、そしてＧ）をコードしているコードンＮＮＴによって各々コードされることにより初めて変化される。
ＮＮＫコードンよりＮＮＴコードンのほうが有利であることは、換えられたコードンの数が増加するに従って徐々にはっきりしてくるからである。五つのコードンがＮＮＴコードンかＮＮＫコードンかのいずれかによって換えられたライブラリーを表１０と表１３０で比較してある。ＮＮＴは１５の異なったアミノ酸をコードし、たった１６のＤＮＡ配列をコードしている。このようにして、１．１３９・１０⁷のアミノ酸配列、ストップなし、そしてたった１．６７８・１０⁷のＤＮＡ配列がある。１０⁸の独立した変換体のライブラリーは、全可能性配列の９９パーセントを含んでいる。ＮＮＫライブラリーは、６．４・１０⁷配列を含んでいるが、完全なサンプリングはもっと多数の独立した変換体を必要とする。
この配列は、天然のＭ１３遺伝子ＩＩＩプロモーターとシグナル配刺を利用してＭ１３の遺伝子ＩＩＩタンパク質との溶融として顕示される。残留基１６から２３までのＭ１３遺伝子ＩＩＩタンパク質の配列は、Ｓ₁₆ＨＳＡＥＴＶＥ₂₃であり、シグナル ペプチダーゼーＩがＳ₁₆の後を裂開する。このセグメントは下記と置換される。すなわち、
Ｓ₁₆ＧＡ₁₈ＡＥＧＸ₁ＣＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＣＸ₆ＳＹＩＥＧＲＶＩＥＴＶＥ。
Ｈ₁₇Ｓ₁₈がＧＡと換えられていることは感染のためのファージを拘束していないということに注意してください。ＰＢＤと成熟したＩＩＩタンパク質間に一つのボビンＦ．Ｘａ認識／裂開サイト（ＹＩＥＧＲ／ＶＩ）を挿入することは有用である。これはＰＢＤに対する位置決めの自由を許容するのみならず、ＧＰからのＰＢＤの裂開をも許容する。
Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₅、そしてＸ₆が、ＮＮＴ（Ｆ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｖ、Ｔ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｄ、そしてＧを許容している）によってコードされている一つのファージ ライブラリー、そしてＸ₃とＸ₄が、ＮＮＧ（Ｌ、Ｓ、Ｗ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｍ、Ｔ、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、そしてＧを許容している）によってコードされている一つのファージ ライブラリーは、ＴＮ２と名付けられている。このライブラリーは、およそ１．５ｘ１０⁷ＤＮＡ配列によってコードされている およそ８．５５×１０⁶ミクロタンパク質を顕示する。ＮＮＧは、これらの第三と第四の部位で少なくとも部分的にシステイン可能性を排除するために、第三と第四の可変部位（ジスルフィドが閉じ込められたループの中央部位）で利用される。
Devlinらは１０⁷変換体を篩い分けた。その各々は、ストレプトアビジンを持った親和性のための１０¹²ランダムペンタデカペプチドを顕示すし得る。そして彼等は、八つのユニークな配列（「Ａ」−「Ｉ」）を持った２０のストレプトアビジン結合ファージ単離物質を発見した。全単離物質はＨＰ；１５／２０、ＨＰＱ；そして６／２０、ＨＰＱＦを含んでいたが、それらはペンタデカペプチド内の異なった部位にあった。最も頻繁に出合った単離物質は、システインが完全に欠けているＤ（５）、Ｉ（４）、そしてＡ（３）であった。しかしながら、二つのプラスの単離物質、「Ｅ」（１）と「Ｆ」（２）は、一対の配置されたシステインが含まれていたので、ジスルフィド結合の形成が可能であった。これらの単離物質の配列は、表８２０に示されている。
ＴＮ２ライブラリーは、ストレプト アビジン結合活動発現の可能性を持っているために、Devlinの「Ｅ」そして「Ｆ」に極めて類似している一つの推定のミクロタンパク質、ＨＰＱを入れるべきだったことを認識している。ＨＰＱは、ＴＮ２ライブラリーの全メンバーに共通のＡＥＧアミノ酸終端配列から成っており、四つのスパンでジスルフィド橋を形成し得る可能性を持っている配列ＰＣＨＰＱＦＣＱによって随従され、一つのセリン（Ｓ）と一つのボビン因子Ｘａ認識サイトによって随従される。（ＹＩＥＧＲ／ＩＶ）（表８２０参照のこと）。パイロット実験は、ストレプトアビジンとＨＰＱを担っているファージとの結合がDevilinの「Ｆ」単離物質のそれと比べ得るものであり、両方ともそのマージンはバックグラウンド（１．７×）の上にあった。したがって、固定されたストレプトアビジンに対するＴＮ２のライブラリーを篩にかけた。
ストレプトアビジンは、１mgにつき、特殊な活動１４．６ユニット（１ユニットは、１ミューｇのバイオチンを結合する）を持った遊離タンパク質（Pierce）として利用し得る。０．０１パーセントのアジ化物を含んでいるＰＢＳにおいて１ミリリットルに付き１mgのストック溶液が作られる。ＳｔｒＡｖストックの１００ミューＬが、１m-mulon（＃４）プレートの２５０ミューＬ容積のウエルに付加され、摂氏４度で一晩培養される。ストックは除去され、そして１mg／mLの濃度でＢＳＡを含んでいるＰＢＳの２５０ミューＬと置換され、そしてさらに１時間摂氏４度で保たれる。ファージ結合アッセイの中で利用する前に、ウエルは、０．１パーセントのツイーン（tween）を含んででいるＰＢＳの２５０ミューＬで５回手早く洗浄する。
各ＳｔｒＡｖが塗布されたウエルに、一つの知られた量（Ｔｎ２ライブラリーの１０¹¹ｐｆｕ’ｓ）のファージを含んだ１００ミューＬの結合緩衝液を加える。室温で１時間培養を続け、その後、非結合ファージを除去し、ＰＢＳ ０．１パーセントのツイーンで手早く１０回洗浄する。それからさらに、ｐＨが７、６、と５のシトラートで洗浄して、非特殊な結合を除去する。結合ファージは、ｍＬ ＢＳＡに付き１mgと１MトリスｐＨ８の６０ミューＬを持った中和剤とを含んでいる２５０ミューＬのｐＨ２シトラート緩衝液で溶出させる。溶出物は、結合、洗浄、そして溶出のその後のラウンドに利用される新規のファージストックを生成するバクテリア細胞に感染させるために利用された。能力強化サイクルは、さらに二度繰り返され（全部で三度）、その後多数の個々のファージはクローンの単離物として配列に加えられ、またテストされた。各ステップに存在するファージの数は、適当に希釈され、E.coliを含んでいるＦ’のローンにプレートされて、プラック形成ユニット（ｐｆｕ’ｓ）として決定される。
表８３８は、ＳｔｒＡｖに結合するために発見されたペプチベド配列と最後の（ラウンド３）ファージ プールから取られたランダムピックの頻繁度を示している。
検査された全推定ミクロタンパク質のインターシステインセグメントは、ＨＰＱモチーフを含んでいた。最初のシステイン前の可変残留基は、｛Ｆ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｇ｝のいずれかを含むことができた。選択された残留基は｛Ｙ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｎ｝であった、そしてファージＨＰＱはＰを持っている。第二システイン後の可変残留基もまた｛Ｆ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｇ｝を持つことができた。選択された残留基は｛Ｐ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、Ｖ｝であった、そしてファージＨＰＱはＱを持っている。比較的よくない結合ファージＨＰＱは多分Ｐ₄もしくはＱ₁₃もしくはその両方のためかも知れない。
対照実験にあいて、ＴＮ２ライブラリーは、上記に示された同一の方法でスクリーンされた、そしてそれは、封鎖エージェントＢＳＡであるターゲットタンパク質を持っている。結合、溶融、そして増幅の三つのラウンドの後、１６のランダムファージプラックが選取され、配列された。半数のクローンには挿入（８／１６）が見られなかった。そして残余のものには、表８３９に示されている配列があった。このコレクションにはなんのコンセンサスもない。
ファージに関連性を持ったミクロ タンパク質、ＨＰＱ６を顕示した。ＣＨＰＱＦＣのＣＨＰＱＦＰＲＣとの交替を除いては、それはＨＰＱと同一である。（表８２０を参照のこと）。顕示された場合、ＨＰＱ６は、ＨＰＱもしくはDevlinの「Ｆ」単離体のいずれよりもストレプトアビジンに対するより実質的に強力な親和性を持っていた。（Devilinの「Ｅ」単離体は研究されなかった。）ジチオスレイトル（dithio-threitol）（ＤＴＴ）での操作は、ストレプトアビジンとのＨＰＱ６ファージ結合（しかしファージをコントロールしていない）を著しく減少した、そしてそれは顕示されたペプチドの中に存在する一つのジスルフィド橋は、良い結合に必要であるということを示唆している。ＴＮ２ライブラリーのスクリーニングの結果を検討して、ファージＨＰＱ６の結合は、Ｐ₄を｛Ｙ、Ｈ、Ｌ、Ｄ、Ｎ｝の一つと代替することによって、もしくはＱ₁₃を｛Ｐ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、Ｖ｝の一つと代替することによってさらに改善され得るだろう。
例 ＩＩ
Ａ ＣＨＳ：：ＨＥＬＩＸ：：ＴＵＲＮ：：ＳＴＲＡＮＤ：：ＣＹＳ ＵＮＩＴ
親クラス２ミクロタンパク質は、多分天然に発生しているクラス２ミクロタンパク質である。それはまた、クラス２のミクロ タンパク質の基準を満足させるために、その構造が満足し、もしくは一部変更されるかも知れない一つの大型タンパク質のドメインであるかもしれない。一部変更は、一つのシステイン（もしくは一対のシステインを）ヘアピン構造のベースに導入するような簡単なものかも知れない、そしてそうすることによって、ヘアピンはジスルフィド結合で閉鎖されるであろう。もしくは、ヘアピン構造を達成するために、中間残留基の一部変更に関して、もっと手の込んだ方法で閉鎖されるであろう。その親クラス２のミクタンパク質もまた二つもしくはそれ以上の天然に発生しているタンパク質、すなわち、一つのタンパク質のアルファヘリックスと第二のタンパク質のベータストランドからの構造の混成となるであろう。
一つのポテンシャルな利用法のミクロタンパク質モチーフは、各一つのヘリックス、ターン、リターンのストランドを取り囲んでいるジスルフィドのループ構成することである。そのような構造はデザインされ得るし、もしくは既知の三次元構造のタンパク質から入手することができるだろう。サソリの神経毒素、変形物質３、（ALMA83a、ALMA83b）（以後ＳｃｏｒｐＴｘと称する）は、図１に示されている構造を含んでいる、そしてそれは一つのヘリックス（残留基Ｎ２２からＮ３３まで）、一つのターン（残留基３３から３５まで）、そして一つのリターン（残留基３６から４１まで）から成っている。ＳｃｏｒｐＴｘは、残留基１２−６５、１６−４１、２５−４６、そして２９−４８を接続するジスルフィドを含んでいる。ＣＹＳ₂₅そしてＣＹＳ₄₁は、非常に近く、主鎖を乱すことなくジスルフィドによって結合され得る。図１はＣＹＳ₂₅とＣＹＳ₄₁との結合を示している。さらに、ＣＹＳ₂₉は、ＧＬＮに換えられている。一つのジスルフィドは、２５から４１までの間を形成し、そして示されているヘリックスは形成すると期待している。示されているアミノ酸配列は、この構造と高度な適合性を持っている。ＧＬＹ₃₅、ＧＬＹ₃₆、そしてＧＬＹ₃₉の存在は、ジスルフィド形成のためにＣＹＳ₄₁の周りで必要である変化の便宜を図るために、ターンそして引き伸ばされたストランドに十分な可橈性を与えている。
この構造の検査から（Brookhaven Protein Data Bankの1SN3に見いだされるように）、下記の残留基のセットは変化のために望ましいものであろうと考える。即ち、

ポジション２７、２８、３１、３２、２４、そして２３は，ヘリックスの一面を構成している。これらの各々の部位において、下記の変化しているコードンを拾いあげた。すなわち、ａ）親のアミノ酸を含んでいるもの、ｂ）ヘリックスが望ましくしている残留基の優位性を持っている残留基のセットを含んでいるもの、ｃ）広範な種類のアミノ酸を提供しているもの、そしてｄ）できるだけ平均した分布に導くもの。ポジション３４は、ターンの部分である。残留基３４のサイドグループは、残留基２７、２８、３１、３２、２４そして２３のサイドグループと接触する分子と相互作用し得る．このようにして、ここに変化を許容し、そしてターンと適合性のあるアミノ酸を提供する。示された変化は、８．８５・１０⁶ＤＮＡ配列によってコードされた６．６５・１０⁶３アミノ酸配列に導く。

ポジション２６、２７、３０、３１、そして３２は、集団の中のヘリックス好意的アミノ酸の能力強化を図るために換えられる。残留基３７と３８は、リターン ストランドの中にあるので、他の変化コードンを採用する。この変化は４．４３・１０⁶３アミノ酸配列と７．０８・１０⁶ＤＮＡ配列を許容するこのようにして、このスキームを具体化する一つのライブラリーは、すこぶる効果的にサンプルを取ることができる。
例 III
クラス３ミクロタンパク質のデザインと突然変異誘発物質
二つのジスルフィド結合を持った親ミクロタンパク質
二つのジスルフィド結合を持ったミクロ タンパク質は、アルファコノトキシン、すなわち、ＧＩ、ＧＩＡ、ＧＩＩ、ＭＩ、そしてＳＩをモデルとすることができるかも知れない。これらは、下記の保存された構造を持っている。すなわち、

橋本ら（ＨＡＳＨ８５）は、アルファコノトキシンＧＩ、ＧＩＩ、そしてＭＩの２４の類似体の合成について報告している。ＧＩ（ポジション２、３、７、そして１３にあるＣＹＳ）のための番号付けのスキームを利用して、橋本らは、タンパク質が毒性になることを許容する４、８、１０、そして１２での改変を報告している。Almquistら（ALMQ89）は、（ｄｅｓ−ＧＬＵ₁）アルファコノトキシンＧＩと２０の類似体を合成した。彼等は、ＰＲＯ₅の代わりにＧＬＹを代替して、二つの異性体、多分異なったジスルフィド結合に関連しているもの、を立ち上がらせたと報告した。彼等は、タンパク質が毒性であることを許容したいくつかの代替物質を残留基８から１１までの間で発見した。Zafarallaら8ZAFA88）は、ポジション９におけるＰＲＯ代替は活性タンパク質を提供するということを発見した。引用された各々のグループは化学反応のためにアッセイとして生体内毒性飲みを利用した。そのような研究から、活性タンパク質は親の三次元構造を持っているということは推論できるが、不活性のタンパク質親の三次元構造に欠けているということは推論できない。
Pardiら（PARD89）は、アルファ コノトキシンＧＩはＮＭＲによってベノム（venom）から入手てせきると断定した。小林ら（KOBA89）は，ＭＭＲからの合成アルファコノトキシンＧＩ三次元構造を報告した、このデータはPARD89のデータを合致している。Pardiらの図５を引用している。
残留基ＧＬＵ₁は、既知の類似体もしくは同族体のＧＬＵ、ＡＲＧ、そしてＩＬＥの便宜を図ることで知られている。望ましい変化コードンは、アミノ酸セット（Ｌ²Ｒ²ＭＶＳＰＴＡＱＫＥＷＧ＜ストップ＞）を許容するＮＮＧである。Pardiらの図５から、ＧＬＵ₁のサイドグループは、残留基９から１２までから成るストランドとして同一の領域に投影するということが分かる。残留基２と３はシステインであり、変化されることはない。残留基４のサイドグループは、残留基９から１２までから（point away）（注意をそらせる）する。このようにして、後続のラウンドまでこの残留基変換を据え置く。ＰＲＯ₅は、適切なジスルフィドが形成されるための原因になる必要があるかも知れない。ＧＬＹが代替された場合には、ペプチドはここで二つの形態に織り込まれるが、いずれにも毒性はない。ＰＲＯ₅が変換することを許容されるが、第一ラウンドではのぞましく考えられない。
ＡＬＡ₆における代替物質は報告されていない。一つの望ましいコードンはＡＬＡ、ＴＨＲ、ＬＹＳ、そしてＧＬＵ（小型疎水性物質、小型親水性物質、プラス、そしてマイナス）を生じるＲＭＧである。ＣＹＳ₇は変換しない。ＡＬＡ₈を持っている同族体タンパク質には毒性があるが、ＧＬＹ₈はそのまま残しておくことを望む。ポジション９の種々アミノ酸を持っている同族体タンパク質には毒性がある。このようにして、ＦＳ²ＹＣＬＰＨＲＩＴＮＶＺＤＧを許容する一つのＮＮＴ変化コードンを利用する。第四ＣＹＳの後ポジション１４で、ＡＬＡ、ＴＨＲ、ＬＹＳ、もしくはＧＬＵ（ＲＭＧコードン経由で）を許容する。この変化は、１．６８・１０⁷ＤＮＡ配列によってコードされた１．０５３・１０⁷アミノ酸配列を許容する。２．０・１０⁷、３．０・１０⁷、そして５．０・１０⁷の独立した変換体を持っているライブラリーは、各々許容された配列のほぼ７０パーセント、ほぼ８３パーセント、そしてほぼ９５パーセントを顕示するだろう。他の変化もまた適当である。アルファコノトキシンに関しては、特にALMQ89、CRUZ85、GRAY83、GRAY84、そしてPARD89を参照のこと。
親のミクロ タンパク質は、Peaseら（PEAS90）によって指定された「ハイブリッドＩ」そして「ハイブリッドＩＩ」のタンパク質の一つを代替し得るかも知れない。PEAS90の図４と比較すること。いずれのタンパク質のためにも変わる残留基の望ましいセットの一つは、下記から成るものである。すなわち、

これは、１．２６・１０⁷ＤＮＡ配列によってコードされた９．５５・１０⁶アミノ酸配列を提供する。５．０・１０⁷変換体から成っている一つのライブラリーは、全可能配列の９８．２パーセントの発現を許容する。各々の部位において、親アミノ酸は許容される。
ポジション５で、一つのターンと互換性を持つアミノ酸を提供する。ポジション６で、ＩＬＥとＶＡＬは枝分かれしたベータ炭素を持て、そして鎖をうねにしている理由から、ＩＬＥとＶＡＬを許容する。ポジション７で、ヘリックスのアミノ酸終端でしばしば発現するＡＳＰ、ＡＳＮ。そしてＳＥＲを許容する。ポジション８と９で、ヘリックス固有のの部分であるという理由で、異なっている電荷と疎水生物（hydrophobicities）を持っているいくつかのヘリックス友好アミノ酸（ＡＬＡ、ＬＥＵ、ＭＥＴ、ＧＬＮ、ＧＬＵ、そしてＬＹＳ）を許容する。ポジション１０はヘリックスのずっと離れた端にあるので、小型セット（ＡＬＡ、ＴＨＲ、ＬＹＳ、そしてＧＬＵ）を許容する。このセットは、三つのヘリックス友好アミノ酸、並びに、きわめてよく許容されているが、プラス、マイナス、中性の親和性を許容するＴＨＲを含んでいる。１２と１６のサイドグループは、既に記述された残留基として同一の領域の中に投射する。これらの部位において、ヘリックスに友好的なアミノ酸に対してゆがみを持っている多種多様なアミノ酸を許容する。
親のミクロ タンパク質は、残留基９−２４そして３１−４０のアプロチニン（aprotinin）から成り、そして二つのジスルフィド（Ｃｙｓ９−Ｃｙｓ２２そしてＣｙｓ１４−Ｃｙｓ３８）を持っている一つのポリペプチドと代替されても良いだろう。そのようなポリペプチドは、アルファ コノトキシンのような同じジスルフィド結合位相を持っており、そしてその二つの橋は各々１２と１７のスパンを持っているものである。
残留基２３、２４、そして３１は、アミノ酸残留基セット（Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｈ、Ｒ、Ｔ、Ａ）をコードするために変化されるので、必要な幾何学のターンをこのむ一つの配列が発見される。Ｐ１領域におけるＢＰＴＩに類似した安定した構造の中に折り畳まれているミクロタンパク質を顕示しているＧＰｓを豊かにする親和性分子をしてトリプシンもしくは無水性トリプシンを利用する。
三つのジスルフィド結合親ミクロタンパク質
コーンかたつむり（Conus）は、長さが１０−３０アミノ酸で、そしてジスルフィド結合が特に豊かである毒性コノトキシン（Conotoxins）を生成する、それらは、従って、原形のミクロ タンパク質である。三つのジスルフィド結合を持った新規なミクロ タンパク質は、ミュー（ＧＩＩＩＡ、ＧＩＩＩＢ、ＧＩＩＩＣ）もしくはオメガー（ＧＶＩＡ、ＧＶＩＢ、ＧＶＩＣ、ＧＶＩＩＡ、ＧＶＩＩＢ、ＭＶＩＩＡ、ＭＶＩＩＧその他）コノトキシンをモデルにすることができるだろう。ミューコノトキシンは下記の保存された構造を持っている、すなわち、

ミューコノトキシンの非三次元構造はすでに開示されている。日高ら（HIDA90）は、ジスルフィドの関連性を樹立した。下記のダイアグラムは、ジオグラフトキシンＩ（geograph-toxin I）（ミューコノトキシンＧＩＩＩＡとしても知られている）を描いている。

Ｒ１９からＣ２０までの接続はＱ１４からＣ１５までのストランドにいくことができる。一つの望ましい変化の形態は一つのループの残留基を換えることである。最も長いループが五つのアミノ酸のみを含んでいるので、ループを形成しているシステインと接続している残留基を換えることも適切である。たとえば、残留基５から９、それに２、１１、１９、そして２２を加えて換えることができるかも知れない。もう一つの有用な変化は、残留基１１−１４そして１６−１９を、８つのアミノ酸をとうして、換えることであろう。ミューコノトキシンに関しては、BECK89b、BECK89c、CRUZ89、そしてHIDA90を参照のこと。
オメガコノトキシンは下記のように表示されるであろう。すなわち、

キングコング ペプチドは、オメガコノトキシンと同じジスルフィドの取り合わせを持っているが異なった生物学的活動を持っている。Woodwardら（WOOD90）は、C.textileから三つの同族体タンパク質の配列を報告している。成熟した毒素ドメイン内でシステインのみが保存されている。システインの面間隔は完全に保存されているが、他のポジションは三つの全配列の同一のアミノ酸を持っていない、そしてほんの少数のポジションが一対のようなものを示している。このようにして、全ポジションは（システインを除いて）一つの安定したジスルフィド構造を形成するだろうところの高い可能性を持って自由に代替されるだろうと結論している。オメガコノトキシンに関しては、HILL89とSUNX87を参照のこと。
親の結合ドメインとして利用し得るかも知れない他のミクロ タンパク質は、とうなすマキシマ（Cucurbit maxima）トリプシン阻害物質Ｉ（ＣＭＴＩ−Ｉ）である。ＣＭＴＩ−ＩＩＩもまた適当である。これらは夏南瓜、ズキーニ、そしてキュウリからの阻害物質を含んでいるカボチャ属のセリン プロテアーゼ阻害物質のメンバーである。（WIEC85）。McWherterら（MCWG89）は、ヒトロイコサイト（leukocyte）エラスターゼとカテプシンＧ．に対する親和性を持っているカボチャ種属プロテアーゼ阻害物質の合成配列された変形物質について記述している。勿論、この属のいかなるメンバーも利用され得るだろう。
ＣＭＴＩ−Ｉは、三つのジスルフィド結合によって固定された配座の中に保持されている、たった２９のアミノ酸から成っていることが知られている最小タンパク質の一つである。その構造は、Ｘ線回折（BODE89）とＮＭＲ（HOLA89aとb）の両方を利用して、Bodeとその協力者達によって研究されている。ＣＭＴＩ−Ｉは俵状をしており、それはヘリックスもしくはベータシートを持っていない、しかしそれはターンから成り、そして短いポリペプチドの延長で接続している。ジスルフィドのペアリングは、Ｃｙｓ３−Ｃｙｓ２０、Ｃｙｓ１０−Ｃｙｓ２２、そしてＣｙｓ１６−Ｃｙｓ２８である。Bodeらによって研究されたＣＭＴＩ−Ｉ：trypsin合成物の中で、２９の阻害物質残留基のうち１３は、トリプシンと直接的な関連を持っている。それらの大多数は、化学反応サイト結合Ａｒｇ５（Ｐ１−）ＩＩｅ６を含んでいる重要な結合セグメントＶａｌ２（Ｐ４）−Ｇｌｕ９（Ｐ４’）の中に存在している、そして他のスリン プロテイナーゼ阻害物質にも見られた一つの配座一座の中に存在している。
ＣＭＴＩ−Ｉは、ほぼ１．５・１０^-12Ｍのトリプシンのための一つのＫ₁を持っている。McWherterらは、ＨＬＥ特殊性を授与するためにＰ１における「中程度に量の多い疎水性グループ」の代替物質を示唆した。彼等は、ＨＬＥに対する検出可能な結合を与える残留基（ＨＡＬ、ＩＬＥ、ＬＥＵ、ＡＬＡ、ＰＨＥ、ＭＥＴ、そしてＧＬＹ）の広範なセットを発見した。カテプシンＧに関しては、彼等は、真に望ましい量の多い（特に芳香属Ｋ）サイドグループを予期していた。彼等は、ＰＨＥ、ＬＥＵ、ＭＥＴ、そしてＡＬＡがそれらの基準に従って機能的であることを発見した。彼等は、ＴＲＰ、ＴＬＲ、もしくはＨＩＳをテストしていない。（ＡＬＡは第二に小さい利用可能なサイドグループを持っているということに注意してください。）
最初の望ましい変化戦略は、残留基ＡＲＧ₁、ＶＡＬ₂、ＰＲＯ₄、ＡＲＧ₅、ＩＬＥ、ＬＥＵ₇、ＭＥＴ₈、ＧＬＵ₉、ＬＹＳ₁₁、ＨＩＳ₂₅、ＧＬＹ₂₆、ＴＬＹ₂₇、そしてＧＬＹ₂₉の一部もしくは全部を換えることである。たとえば、ターゲットがＨＮＥである場合には、下記の可能性を持っているＤＮＡを合成することができる。すなわち、

これは、およそ１．０３・１０⁷ＤＮＡ配列によってコードされたほぼ５．８１・１０⁶アミノ酸を許容する。５．０・１０⁷の独立した変換体から成る一つのライブラリーは、可能性のある配列のほぼ９９パーセントを提供する。他の変化スキームもまた利用され得る。
これに属する他の阻害物質は下記を含んでいる。すなわち、
Citrullus vulgarisからのトリプシン阻害物質Ｉ（OTLE87）、
Bryonia dioicaからのトリプシン阻害物質ＩＩ（OTLE87）、
Cucurbita maximaからのトリプシン阻害物質Ｉ（OTLE87の）、
Cucurbita maximaからのトリプシン阻害物質III（OTLE87の）、
Cucurbita maximaからのトリプシン阻害物質IV(OTLE87）、
Cucurbita pepoからのトリプシン阻害物質II（OTLE87の）、
Cucurbita pepoからのトリプシン阻害物質III（OTLE87の）、
Cucumis sativusからのトリプシン阻害物質IIb（OTLE87の）、
Cucumis sativusからのトリプシン阻害物質IV（OTLE87の）、
Ecballiumelaterriumからのトリプシン阻害物質II（FAVE89）そして
Momordica repensからの阻害物質CM-1（OTLE87の）
初期ポテンシャル結合ドメインとして利用され得る他のミクロ タンパク質は、いくらかの腸内毒素誘発物質のE.coli、Citrobacter freundii、そしてその他のバクテリアから誘発された熱安定性をもった腸内毒素である。これらのミクロ タンパク質は、E.coliから分泌されることが知られており、十分な安定性を持っている。これらのタンパク質の合成、クローニング、発現、そして特質に関しては、下記を参照すること。すなわち、BHAT86、SEKI85、SHIM87、TAKA85、THOM85aとb、YOSH85、DALL90、DWAR89、GARI87、GUZM89、GUZM90、HOUG84、KUBO89、KUPE90、緒か87、OKAM88、そしてOKAM90。
例 ＩＶ
ＣＵ（ＩＩ）、一つのシステイン、二つのヒスチジン、そして一つのメチオニンから成る一つのクロスリンクを持っているミニタンパク質
下記のような配列は、すなわち、ＨＩＳ−ＡＳＮ−ＧＬＹ−ＭＥＴ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−ＨＩＳ−ＡＳＮ−ＧＬＹ−ＣＹＳそしてＣＹＳ−ＡＳＮ−ＧＬＹ−ＭＥＴ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−ＨＩＳ−ＡＳＮ−ＧＬＹ−ＨＩＳは、ダイアグラムに示してあるような構造を形成するためにＣｕ（ＩＩ）との結合を容易にする。

鎖に沿ってＨＩＳ、ＭＥＴ、ＨＩＳ、そしてＣＹＳの他の取り合わせもまた同様な構造を形成するようである。ポジション２と３そしてポジション１２と１３にあるアミノ酸ＡＳＮ−ＧＬＹは、それらが一緒になり、そして金属と結合するために十分な柔軟性を持った金属結合配位子を担っているアミノ酸を授与する。他の接続配列も利用し得るかも知れない、すなわち、ＧＬＹ−ＡＳＮ、ＳＥＲ−ＧＬＹ、ＧＬＹ−ＰＲＯ、ＧＬＹ−ＰＲＯ−ＧＬＹ、もしくはＰＲＯ−ＧＬＹ−ＡＳＮ利用し得るかもしれない。また、第一と第二もしくは第三と第四の金属結合残留期を結ぶループの中に一つもしくはそれ以上の残留基を換えることも可能である。例えば、

Ｘａａ４で種々アミノ酸のためにダイアグラムされた構造を形成するに違いない。それはサイドグループのＸａａ４とＸａａ６が一緒に近在し、ミニ タンパク質の表面に存在していることが期待できる。
変化したアミノ酸は、保持されているので、それらの柔軟性は限られている。このクロスリンクは、ジスルフィドリンケージからは幾分か異なっている。Ｃアルファ₄とＣアルファ₁₁間の分離は、一つのシステインのＣアルファｓの分離より大きいものである。さらに、金属イオンを持った残留基１から４そして１１から１４までの相互作用は、残留基４から１１までのジスルフィドより、残留基５から１０までの動きをより以上に規制することが期待されている。単一のジスルフィド結合は、結合した残留基のアルファ炭素に強力な遠隔拘束を働かすが、たとえば、主鎖のおけるＮからＣまでのベクトルにはきわめて少量の方向的拘束しか働かせない。
望ましい配列にとって、残留基５から１０までのサイドグループは、ターゲットと特殊な相互作用を形成する。他の可変アミノ酸、たとえば、４、５、７、もしくは３などは適当である。大きなスパンは、次の場合に利用され得るかも知れない。すなわち、包括された配列が、ポリペプチド主鎖の配座の自由を規制しているアルファ ヘリックスもしくは他の第二義的は構造を形成するための高度のポテンシャルを持っているセグメントを含んでいる場合である。四つのＣＹＳｓを持っているミニ タンパク質は三つの特殊なベアリングを形成することができるが、二つのＨＩＳｓ、一つのＭＥＴ、そして一つのＣＹＳを持っているミニ タンパク質は、Ｃｕとたった二つの特殊な合成物しか形成できない。これら二つの構造は、Ｃｕをとうしての鏡面対称によって関係ずけられている。二つのＨＩＳｓは識別可能であるので、構造は異なっている。
そのような金属含有のミニ タンパク質が線状ファージに顕示される場合には、ファージを生成している細胞は適切な金属イオンの存在する中で成長し得る、もしくはファージは、それらが細胞から分離された後にのみ金属に晒され得る。
ＺＮ（ＩＩ）と四つのシステインから成る一つのクロスリンクを持っているミニタンパク質
例 Ｖ
例ＸＶに示されているものに類似したクロスリンクは、亜鉛フィンガー タンパク質
（GIBS88、GAUS87、PARR88、FRAN87、CHOW87、そしてHARD90）によって例示されている。亜鉛フィンガーの一属は、Ｚｎ₊₊（PARR88、FRAN87、CHOW87、EVAN88、BERG88、CHAV88）を結合する保持されたポジションの中に二つのＣＹＳと二つのＨＩＳ残留基を持っている。Gibsonら（GIBS88）は、亜鉛フィンガーを形成すると考えられているいくつかの配列を研究し、これらの化合物のための三次元モデルを提案している。これらの配列の大部分は保持されたポジションに二つのＣＹＳと二つのＨＩＳ残留基をもっているが、あるものは三つのＣＹＳと一つのＨＩＳ残留基をもっている。Gaussら（GAUS87）もまた亜鉛を結合している三つのＣＹＳと一つのＨＩＳ残留基を持っている亜鉛フィンガータンパク質を報告している。Hardら（HARD90）は、各々が四つのＣＹＳ残留基を持っている二つの亜鉛フィンガーから成る一つのタンパク質の三次元構造を報告している。これらの亜鉛結合タンパク質の全ては、還元細胞内環境の中で安定している。 一つのＣＹＳ：：亜鉛クロスリンク ミニタンパク質の一つの望ましい例は、HARD90の図１に示されている配列の残留基４４０から４６１で成っている。残留基４４４から４５６は変化され得るかも知れない。そのような一つの変化は下記のとうりである。

これは、同数のアミノ酸配列をコードしている３．７７・１０⁷ＤＮＡ配列に導く。１．０・１０⁸独立変換体を持っている一つのライブラリーは許容された配列の９３パーセントを顕示するだろう。２．０・１０⁸独立変換体は、許容された配列の９９．５パーセントを顕示するだろう。

文献

Background of the Invention
[Field of the Invention]
The present invention relates to the development of novel small binding proteins, and in particular to the development of novel binding proteins by repeating the steps of mutagenesis, expression, affinity selection, and amplification of microproteins. is there. In this process, the gene encoding the small protein binding region, the gene obtained by chance mutagenesis of a predetermined limited number of codons, is fused with the genetic elements. The genetic element produces a mixture as a result of virus (especially filamentous phage) or cell population expression displayed on the outer surface of the cell. Affinity selection has been used to identify genomes in which viruses or cells contain fused cells. Melted cells code for proteins that bind to chromatographic targets.
[Description of related technology]
The amino acid sequence of a protein determines its three-dimensional (3D) structure. This also determines the function of the protein. Some residues of the polypeptide chain (residues, hereinafter the same) play an important role in determining the three-dimensional structure of proteins. Therefore, its binding ability is not a covalent bond but a tight bond and is specific and binds to the target molecular characteristic. “Protein engineering” is a technique that manipulates the order of protein sequences. That is, changing the characteristics of the coupling. While factors affecting protein binding are known, new surface designs have proven difficult. Quiocho et al. (QUI087) suggests: That is, with current protein engineering methods, it will be difficult to produce a protein with excellent binding properties that naturally occurring proteins have.
However, there are some isolated successes. For example, Wilkinson et al. (WILK84) ₅₁ -Mutants of Bacillus ste-arothermophilus tyrosine transfer RNA synthetase with Pro have been reported to show a 100-fold increase in affinity for ATP.
With the development of recombinant DNA technology, it has become possible to make mutants of proteins by mutating natural proteins with gene codes and expressing the mutated genes. Several methods of mutagenesis are known. One is “protein surgery” (DILL87), which introduces one or more predetermined mutations into a selected gene. Only one polypeptide of the fully planned sequence has been expressed and its binding properties have been evaluated.
Another extreme method is to generate mutants at random using relatively unspecified mutagens such as radiation and various scientific substances. Ho and others (see HOCJ85 and Lehtovaars, EP Appln.285, 123).
Predetermined nucleotides can be randomly changed using a mixture of various groups in an appropriate cycle of the nucleic acid synthesis means. (OLIP86 and OLP87). The frequency of the mixing ratio of the group in the mixture is determined according to the position of each cordon. At that frequency, each amino acid occurs in a polypeptide expressed from a degenerate DNA solid group. (REUD88a, VERS86a, VERS86b). No mention is made of the different abundance of different amino acids encoding DNA.
Ferenci and his collaborators have published a series of papers on the chromatographic isolation of E. Coli's maltose carrying protein LamB. (FERE82a, Fere82b, Fere83, Fere84, CLUN84, HEIN87, and the above article) Mutants were generated spontaneously or inducibly with unspecified chemical mutagens. The level of mutagenesis is chosen to define a single point mutation or a single insertion of a binary residue. Multiple mutations were not sought or discovered.
While the degree of affinity for the traditional LamB substrates maltose and starch varies, there was no choice of affinity for the molecule as a target not bound by native LamB, and multiple mutations are explored and discovered There was not. Reference FERE84 shows that affinity chromatographic selection techniques can be applied to the generation of mutants similar to other “surface important bacterial enzymes”, and intracellular bacterial proteins are placed on the cell surface. We believe we can select mutations to convert. However, the mutant surface protein referred to by Ferenci was a chimera with an exogenous or non-identical binding region of the bacterial surface protein.
Ferenci also argues that there is no need to clone structural genes or know the protein structure, active site or sequence. However, the method according to the invention consists in particular using the cloned structural gene. It cannot be constructed and expressed without cloning the gene that codes for the potential binding protein defined on the outer surface of the chimera.
Ferenci did not limit the mutation to a special locus. Substitution is not limited by the desire for a specific amino acid type at a specific site, but rather by the nature of the mutagen. In this invention, knowledge of protein structure, active site and sequence is used for proper prediction. That knowledge assists in predicting which residues have the greatest effect on binding activity without unduly destabilizing the protein, and mutagenesis is concentrated at these sites. Ferenci does not suggest that the surface residue should be changed preferably. Therefore, Ferenci's selection mechanism is less effective than the method disclosed here.
Several researchers have located an epitope of a heterologous antigen that has not been mutated on the surface of a bacterium or phage and melted it to the surface protein of a native bacterium or phage, demonstrating that the epitope was found on the antibody. Thus, Charbit et al. (CHAR86a, b) genetically inserted the C3 epitope of a protein coated with poliovirus VP1 into the LamB outer coat protein of E. coli, and the C3 epitope was exposed to the bacterial cell surface. Was determined from an immunological point of view. Similarly, Charbit et al. (CHAR87) generated an A (or B) epitope of the LamB chimera and the hepatitis B virus preS2 region.
The chimeric LacZ / OmpB protein is expressed in E. Coli and is located in the outer coat or periplasm depending on melting (SJLH77). A chimeric LacZ / OmpA surface protein has also been expressed and displayed on the surface of E. coli cells (WEIN83). Others are expressed and displayed on the surface of cell chimeras of other bacterial surface proteins such as E. coli type 1 pili (HEDE89) and bacteroid nodule type 1 pili (JENN89). In the above example, the genetic trait in which the mutation has been induced is not inserted.
DulbeccoDULB86) suggests a processing method for incorporating heterologous antigenic epitopes into viral surface proteins. The chimeric protein expressed thereby is displayed on the surface of the virus in such a way that different epitopes can approach the antibody. In 1985, Smith (SMIT85) reported that a non-functional segment of the EcoRI endonuclease gene was inserted “in phase” into gene III of bacteriophage F1. The gene III protein is a minor coat protein required for infection. Smith demonstrates that the recombinant phage can be adsorbed by an immobile antibody produced against EcoRI endonuclease and extracted with acid. De la Cruz et al. (DELA88) state that a fragment of the repeat region of circumsporozo-ite protein from Plasmodium Falciparum is expressed on the surface of M13 as an insert into the gene II protein. They have shown that recombinant phages are both antigens and immunogens in rabbits and that such recombinant phages can be used for B epitope genetic mapping. Researchers have suggested that similar recombinant phage can be used for T-epitope genetic mapping and vaccine development.
These researchers do not suggest mutagenesis of the inserted material, and confer to the chimeric protein the ability of the inserted material to specifically bind to receptors other than the antibody's antigen binding site. It is not a perfect binding domain.
McCafferty et al. (MCCA90) show that Fv fragments of antibodies express melting to the N-terminus of pIII protein. The Fv fragment is not mutated.
Parmley and Smith (PARMS88) suggest that the epitope library can build all the hexapeptides that can be displayed and has separated the epitope that binds to the antibody. In the discussion of epitope libraries, the authors do not suggest that it is desirable to balance representatives of heterologous amino acids. They also say that the insertion should encode the complete domain of the exogenous protein. Not discussed. Epitopes are thought to be unstructured peptides for structured proteins.
Scott and Smith (SCOT90) and Cwirla et al. (CWIR90) created an epitope library. Among them, the potential hexapeptide epitope for the target antibody encodes the epitope and expresses the fused gene in the phage-contaminated cell along with the gene III of the fd phage, and is randomly generated by melting of the degenerate oligonucleotide. It is supposed to be mutated. These cells produced fused phage displaying epitopes on the surface. Phage bound to the immobilized antibody were eluted with acid. In these two studies, the fused gene formed a segment encoding a spacer region to distinguish the variable region from the wild-type pIII sequence. The amino acid changed thereby is not constrained by the neighboring pIII sequence. Devlin et al. (DEVL90) similarly screened for a random 15 residue epitope recognized by streptavidin using M13 phage. Again, spacers were utilized to remove random peptides from the remainder of the chimeric phage protein. Thus, these documents do not argue that they are constraining the conformational repertoire of mutated residue groups (residues, hereinafter the same).
Another problem with Scott, Smith, Cwirla et al., And Delin et al. Is that they have created a library where the collection of amino acid data at each position is highly offset. Their greatest interest in designing degenerate oligonucleotides encoding variable regions was to ensure that all 20 amino acids could be encoded at each position. Their second concern was to minimize the number of stop signals. Thus, Scott and Smith and Cwirla et al. Used NNK (N = G, A, T, C equivalent formulation, K = C and G equivalent formulation), Devlin et al. NNS (S = G and C Of the same composition). He did not try to reduce the ratio of the most preferred and least preferred amino acids, and did not try to equalize the incidence of acidic and basic amino acids.
Devlin et al. Characterized streptavidin-binding peptides with several affinity choices, but did not measure the affinity factor for these peptides. Cwirla et al. Determined the affinity factor of the peptide, but was disappointed to discover that the best hexapeptide was affinity (350-300 nM). Its affinity, ie its “approximate value”, was weaker than that of the natural methoenkephalin epitope (7 nM) recognized by the target antibody. Cwirla et al. Speculate that a high affinity phage-supporting peptide still exists in the acid-eluted fold. The reason may be due to the multivalent interaction of the phage (which carries about 4 copies of pIII) and the bivalent target IgG. Scott and Smith were able to find a peptide with an affinity (A2) for the target antibody equivalent to that of the reference myohemerythrin epitope (50 nM). However, Scott and Smith have raised concerns about the loss of some high affinity peptides, possibly due to irreversible binding to the target of the molten phage.
Lam et al. (LAM91) built a pentapeptide library by non-biological synthesis on solid support. While teaching to obtain a world of approximately equimolar proportions of Randum Pentapeptide, they deliberately excluded cysteine to eliminate disulfide bridge formation.
Ladner, Glick and Bird have published the binding region of a single chain antibody in WO88 / 0633 (published September 7, 1988, further commissioned to Genex Corp with priority to US patent application 07 / 021,046) (LGB). By changing the encoding DNA, subcloning the SCAD gene into the gpV gene of lambda phage so that the SCAD / gpV chimera is visible on the outer surface of the phage, and selecting the phage that binds to the antigen by affinity chromatography, It states that various single chain antibody domains (SCAD) may be screened to bind to specific antigens. The only antigen mentioned there is bovine growth hormone. Other binding substances, targets, carrier organics and other external proteins are not discussed. No mention is made of the degree or method of mutation. Furthermore, it does not discuss the exact structure of the melt, nor does it mention how to determine a successful melt or what to take if SCAD is not revealed.
Ladner and Bird are WO88 / 0661 (publication September 7, 1988), where a single-stranded “pseudo-dimerization” repressor (DNA-binding protein) mutates a putative linker peptide and subsequently fails. It suggests that mutations and selections may be used to create a recognition element dictionary for the design of the seisai repressor, which may be generated by in vivo selection. The repressor is not visible on the outer surface of the organism.
Methods for identifying residual groups in proteins that can be replaced by cysteines to promote the formation of disulfide bonds that stabilize proteins are described in US Patent Nos. 4,903,773 (PANT90) and Pantolino and Ladner (PANT87) by Pantolino and Ladner. , Pabo and Suchenek (PABO86), MAT89, and SAUE86.
Ladner et al., WO90 / 02809 is known for semi-random mutagenesis ("change") of known proteins that are manifested as regions of semi-artificial outer surface proteins in bacteria, phage, or spores, and suddenly with ideal binding properties. Describes affinity selection of mutants. Particularly small proteins mentioned in WO90 / 02809 include the third region of crumbine (3:40, 4:32, 16:26 disulfide; 46 AAs) ovomucoid (8:38, 16:35 and 24:56). Disulfide; 56 AAs) and BPTI (5:55, 14:38, 30:51 disulfide; 58 AAs). WO90 / 02809 also describes a method for “change” chordons in which a mixture of all 20 amino acids at that position can be obtained in approximately equal proportions.
Bass et al. (BASS90) melted human growth hormone into the gene III protein of M13 phage. He suggests that hGH and other “large proteins” may be mutated and “binding selection” may be available.
[Summary of Invention]
A polypeptide is a polymer consisting of a single chain of homologous or heterogeneous amino acids joined by peptide bonds. Linear peptides can take up the majority of different conformations through an internal rotation around the major single chain bond of each alpha carbon. These rotations are prevented to a different extent by side groups with minimally interfering glycine and maximally interfering valine, isoleucine, especially proline. Polypeptides with 20 residual groups are determined by various internal rotations. ²⁰ May have a heterogeneous conformation.
A protein is a polypeptide that is folded into a well-defined conformation as a result of a stable interaction of amino acids that are not necessarily in a position adjacent to the chain. This fold structure is usually essential for its biological activity.
For polypeptides with 40 to 60 residual groups or longer, non-covalent forces such as hydrogen bonds, salt bridges, and hydrophobic interactions are sufficient to stabilize specific folds or conformations. . A polypeptide component is retained in at least its conformation unless disturbed by denaturing agents such as high temperature or low or high pH. The polypeptide then resolves the curvature and [melts]. The smaller the peptide, the more likely its conformation is determined by the environment. If a peptide that is less subject to small constraints has biological activity, the peptide ligand is in its essence in a random coil until it is close to its receptor. Receptors accept peptides only in one or several conformations because non-friendly alternative conformations are alienated by van der Waa-ls and other non-covalent interactions.
Small polypeptides are advantageous to potential when used as therapeutic agents or diagnostic agents compared to large peptides, including (but not limited to): Ie
a) Good tissue penetration
b) Fast elimination from the circulatory system (important for contrast media)
c) low antibodygenicity, and
d) Many activities are high
In addition, polypeptides, particularly those having fewer than 40 residual groups, have the advantage that they can be obtained through chemical synthesis. Polypeptides of 30 or less are particularly preferred. In this way, it is preferable to be able to utilize a combination of mutation and affinity selection to identify small polypeptides that bind a favorite target.
However, the majority of polypeptides of this size have no advantage as binding molecules. According to Olivera et al. (OLIV90a): “Peptides of this size are usually classified as balanced among many conformations (proteins usually have to be larger to have a fixed conformation). The special binding of the peptide to the target molecule requires a peptide that takes up a conformation that complements the binding position. For a decapeptide with three isoenergetic conformations (ie beta strand, alpha helix, and isomerman inversion) in one residual group, approximately 6 · 10 ^Four There are overall possible conformations. Assuming that these conformations are equally probable for unconstrained decapeptides, if only one possible conformation is bound to the binding site, the peptide against the target Is about 6 · 10 if it is constrained to a single effective conformation. ^Four Expect to be higher. In this way, decapeptides that are not constrained to decapeptides that are constrained to the correct conformation are expected to exhibit low affinity. Since one of the other conformations of the unconstrained decapeptide may be one that is tightly bound to a substance other than the intended target, it may reveal low specificity. Since it may provide a binding site for proteases, it may be reduced in resistance to degradation by proteases through a collaborative system.
This invention overcomes the various problems described above and retains the advantages of small polypeptides by identifying novel miniproteins with desirable binding properties. A miniprotein is a small polypeptide that is too small to have a stable conformation as a result of noncovalent forces alone, but covalently forms a crosslink in a stable conformation (ie, by a disulfide bond). , Thereby having a more typical biological activity of a protein molecule that is larger than an unrestrained equivalent size polypeptide. The miniproteins with which this invention is of particular concern are divided into two types. That is, a) a disulfide-bonded microprotein with amino acid 40 or less, and b) a miniprotein with amino acid arrangement of amino acid 60 or less.
This invention relates to the structure, expression, and selection of mutant genes that identify novel proteins with the desired binding properties, as well as the miniproteins themselves, and reveals miniproteins to potential “target” substances. It relates to a “library” of mutant “gene packages” used to The “target” is often a protein, but need not be a protein. The target may be other biological or synthetic polymers as well as organic and inorganic substances.
The aforementioned patent application, WO90 / 02809, generally states that the stable protein may have been mutated to identify novel proteins with favorable binding properties. Suitable “parent” proteins that have been specifically identified as useful for this purpose include three proteins. BPTI (58 residues) (residue, the same applies hereinafter), ovomucoid third domain (56 residues), and crumbine (46 residues). These proteins have 40 to 60 residual groups, where noncovalent interactions between non-neighboring amino acids become significant. These three proteins also have three disulfide bonds that serve to increase the stability of the molecule.
Nowhere in the patent application, WO90 / 02809, for polypeptides with 40 or fewer residual groups, and in particular, polypeptides with one or two disulfide bonds serve as "scaffolds" for mutation variation No special approval has been found for sufficient stability. These “mini-proteins” are of great utility value, at least as pointed out earlier.
The patent application WO 90/02809 also suggests the use of azurin, a protein with different cross-linking (Cu: CYS, HIS, HIS, MET). However, since azurin has 128 amino acids, it is not considered a miniprotein. The present invention relates to the use of a miniprotein having 60 or less amino acids, which is characterized by the formation of cross-links regulated by metal ions.
According to the present invention, a protein that can specifically bind to a target other than the antigen-binding site of an antibody is provided. Proteins cannot be considered simply “binding proteins” because they can be bound by antibodies. (See the definition of “binding protein” below.) The majority of amino acid sequences with 6 to more than 8 amino acids, but when combined with a single immunogenic carrier, elicits an immune response, and any random polypeptide has minimal affinity and specificity for its substrate It can satisfy the strict definition of “binding protein” for sex. It is only possible by testing a large number of random polypeptides one after the other (and usually controlling the extent and nature of sequence variation, i.e. potential binding to domains with a stable structure). This problem is solved only by restricting it to residual groups for the selected residual group to affect the bond rather than the stability). The matters described in “Claims” following the above items are incorporated in this specification to constitute preferred embodiments.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the main chain of scorpion toxicity (Brookhaven Protein Data Bank Registry ISN3) residual groups 20 to 42. CYS _{twenty five} And CYS ₄₁ Indicates disulfide formation. In natural proteins, these groups form disulfides on other cysteines, but the main chain motion is obliged to bring gamma sulfur into an acceptable geometry. Residual groups other than GLY are labeled on the beta carbon with a one-letter code.
Detailed Description of the Preferred Embodiment
1. preface
The basic principle of this invention is one of the forced evolutions. In nature, evolution occurs as a result of genetic variation, beneficial traits, and the combination of individual reproductions selected for it, which enriches the population. This invention relates to random mutagenesis ("change") of controlled DNA creating a mixture of DNA molecules that encode heterogeneous but related potential binding domains that are mutants of microproteins. ) (Variegation) to achieve genetic variation. This invention isolates mutated genes that reveal novel proteins with desirable binding characteristics and takes the following method. That is, 1) do so so that the product of each mutated gene is revealed on the exterior of the replicating gene package (GP) (cell, spore, or virus) containing the gene, and 2) affinity selection The package population for packages containing genes that specify proteins with improved binding properties to the target substance, i.e. using selection to bind to the target substance To make it happen. Finally, the increase is achieved by allowing only the packages containing the gene bound to the target for reproductive purposes by the revealed protein. Evolution is “forced” in that the selection is provided for the target substance, and “forced” in that the special chordon mutates more frequently than it naturally occurs.
The revealing strategy is primarily that affinity molecules (which may be antibodies) are available. It is completed by changing the genetic package to reveal a stable, structured domain (“Initial Potential Binding Domain”, IPBD). Whether the change is successful is simply measured by determining whether the altered gene package binds to the affinity molecule.
IPBD was chosen because it allows extensive mutagenesis. It is known that the IPBD is revealed on the surface of the package and is subject to affinity selection, and the IPBD encoding the gene is subject to numerous special patterns of mutagenesis. As used herein, "variegation" leads to the production of a population of genetic packages that reveal each single potential binding domain (IPBD mutant). However, although the “change” is heterogeneous, it has a structurally related potential binding domain (PBD). _S ) To reveal the entire group. Each gene package carries a version of the pbd gene that encodes the PBD revealed on the surface of that special package. Affinity selection can be utilized to identify gene packages that carry PBDs with the desired binding properties, and these gene packages can be amplified. After one or several cycles of isotope enrichment by affinity selection and amplification, a successful binding domain (SBD) _s ) Is recovered from the selected package.
Optionally, DNA from the SBD support package can be used to generate PBD using the last round of SBD as the “parent potential binding domain” (PPBD). _s "Change" to the next generation. The operation is continued until satisfactory results are obtained. IPBD and PBD _s Because of the structural and evolutionary relationships between the first generation of IPBD, IPBD is also considered a “parental potential binding domain” (PPBD).
When the microprotein is changed, the residual group covalently crosslinked to the parent molecule is not changed, thereby stabilizing the conformation. For example, in the form of changes in disulfides associated with microproteins, certain cysteines are invariant, so under the conditions of expression and manifestation, a covalently crosslinked form (ie, between one or several pairs of cysteines) And is well constrained by the conformation taken up by the highly variable linear intermediate amino acids. In other words, the constrained scaffold is incorporated into a widely randomized polypeptide.
Once a microprotein with the desired binding properties has been characterized, it can be regenerated not only by recombinant DNA technology but also by non-biological synthesis methods.
For the purposes of the above claims, protein P is a “binding protein” and has a dissociation constant K per at least one molecule and ion or atomic species A other than the variable domain of the antibody. _D (P, A) <10 ^-6 moles / liter (preferably <10 ^-7 moles / liter).
The “antibody variable domain” of (1) above is intended for clarity, and one protein is not considered a “binding protein” only because it is an antigen.
The largest type of protein is incorporated into an identifiable spore called a domain (ROSS81). Protein domains have been defined in various ways. The definition of “domain”, which places importance on stability, is rather favorable, keeping the whole structure in a table of perturbations such as high temperature or chaotropic agents, The in-phase between atomic coordinates and protein sequences is not completely ignored.
If a protein domain is primarily responsible for the protein's ability to specifically bind to a selected target, it will be referred to herein as a “binding domain” (BD).
“Varied DNA” (vgDNA) is a mixture of DNA molecules of equal or similar length, and when aligned, different amino acids are assigned to each codon. It varies with several codons that code, but it encodes only a single amino acid at the position of the other codon. In the converted DNA, the codon is variable, and it is known that the region and frequency of occurrence of different amino acids encoded by a given variable codon are determined in advance by the DNA synthesizer. Even if one does not allow others to know the synthesis method in order to know the individual DNA molecule sequences in the mix, one priori. The number of designated variable codons of the replaced DNA is preferably no more than 20, and the most desirable number is 5 to 10. The mixture of amino acids encoded by each variable coden varies from coden to coden.
It can be said that a group of genetic packages into which a changed DNA has been introduced is “changed”.
For the purposes of this invention, “potential binding protein” (PBP) refers to a protein encoded by one species of DNA molecule in a population of DNA that has been replaced. A region of variation therein appears when one or more subsequent encodings of one or more segments of a polypeptide that have the potential to act as a binding domain for a target substance.
A “chimeric protein” defines a domain in which the first amino acid sequence has a domain that is different from the domain of the first protein and is not sufficiently homologous to the first protein. Melting with the second amino acid sequence. A chimeric protein may represent a heterologous domain found in one organism that reveals the first protein (although it can be found in a heterologous protein). Or it may be “in-terspecies”, “intergeneric” or other melting of the protein structure revealed by heterogeneous organic matter.
One amino acid sequence of a chimeric protein according to the present invention is typically derived from the outer protein of a “gene package” (GP) as defined herein. One that reveals PBD on its surface is GP (PBD). When revealed alone, the second amino acid sequence has the characteristics of a protein (or domain) but is one of those incorporated into a chimeric protein as an identifiable domain. It appears at the amino or carboxy terminal of the first amino acid sequence (with or without intervening spacers) or interrupts the first amino acid sequence. The first amino acid sequence reliably corresponds to the surface protein of the genetic package or is regulated. That is, it is for facilitating the revealing of the binding domain.
II. Micro and other miniproteins
In this invention, the disulfide-bonded microprotein and the metal-containing miniprotein are the initial potential binding domain (IPBD) that validates the display strategy. _S ) And PPBD that actually wants to obtain a BD with the desired target binding characteristics _S Used as IPBD unless specified otherwise or as required by context _S The citation for applies to mutatis mutandis and PPBD _S Is the same.
For the purposes of the “claims” that follow the above, the microprotein has approximately 6 to 40 residual groups. Microproteins are a subset of miniproteins, which have approximately 60 or fewer residual groups. Because microproteins constitute a subset of miniproteins, the term miniprotein is referred to as needed for both disulfide-bonded microproteins as well as metal-modified miniproteins for convenience. IPBD is a miniprotein with known binding activity, or does not have known binding activity, but has a second or higher structure that contributes to binding activity (tears, grooves, etc.) One of things. If the IPBD has a known binding activity, it need not have a special affinity for the target substance. IPBD does not have to be identical in sequence to a naturally occurring miniprotein. It may be an amino acid sequence “cognate” with a sequence of a known miniprotein, or it may be completely artificial.
To determine whether an array is considered “sufficiently equivalent”, the following matters need to be considered. That is, the degree of similarity of the sequence when the sequence is adjusted to best fit according to the standard rules of operation, similarity in the connectivity pattern of the bridge (ie disulfide bond), displayed by X-ray diffraction analysis or NMR If so, the degree to which the protein has a similar three-dimensional configuration and the degree to which the protein being sequenced has similar biological activity. In the context of this context, among serine protease inhibitors there is a group of proteins that have been certified as homologous with a set of members that are 30 percent homologous in sequence.
IPBD candidates must satisfy the following criteria: That is,
1) The domain exists stably under the intended state of use (the domain encompasses all of the inserted protein, ie alpha conotoxin GI (OLIV90a) or CMTI-III (MCWH89 ),
2) knowledge of amino acid sequences can be obtained, and
3) A molecule with special and high affinity for IPBD can be obtained. This is abbreviated as AfM (IPBD).
If a single species of molecule with affinity for IPBD (AfM (IPBD)) is available, it will be used for: A) detection of IPBD on the GP surface, b) optimization of the visibility level and density of affinity molecules on the matrix, and c) determination of the efficiency and sensitivity of the affinity separation operation. If two races of AfM (IPBD) are available, one chooses affinity for the high and the other for intermediate IPBD. High affinity species will be used for initial detection and to determine efficiency and sensitivity. And species with intermediate affinity will be used to know the optimization.
If IPBD itself is not a known binding protein, or if its natural target is not cleared, antibodies made against IPBD may be used as affinity molecules. The use of antibodies for this purpose should not be considered as the last target.
There are many IPBD candidates, but all of the above information is available for that candidate, and it is reasonably practical to obtain it. For example, CMTI-III (29 residual groups) (CMTI-type inhibitors are described in OTLE87, FAVE89, WIEC85, WIEC85, MCWH89, BODE89, HOLA89a and b), heat-stable enterotoxins (ST-la of E. coli) (18 residual groups) (GUAR89, BHAT86, SEKI85, SHIM87, TAKA85, TAKE90, THOM85a and b, YOSH85, DALL90, DWAR89, GARI87, GUZM89, GUZM90, HOUG84, KUBO89, KUPE90, OKAM87 , OKAM88, and OKAM90), alphaconotoxin GI (13 residues) (HASH85, ALMQ89), muconotoxin GIII (22 residues) (HIDO90), and Conas King Kong microprotein (27 residues) (WOOD90) Is included. Information about the composition is X-ray or neutron diffraction studies, NMR, chemical drug crosslinking or labels, models from known structures of related proteins, or logical calculations. X-ray diffraction, neutron diffraction or NMR can be recommended for 3D configuration information. The reason is that these methods can place almost all of the atoms within defined limits. Some IPBDs where Table 50 is desired _S Cite.
Mutations may reduce the safety of PBD. Therefore, if possible, the chosen IPBD should preferably have a high dissolution temperature, ie at least 50 degrees Celsius, and be stable over a wide pH range. That is, it is preferably between 8.0 and 3.0, and most preferably between 11.0 and 2.0. Thereby, SBDs are drawn from the selected IPBD by mutation, and selection via binding retains sufficient stability. Desirably, various PBDs _S An alternative to the IPBD that is creating the domain is to not lower the melting point of the domain below about 40 degrees Celsius. Miniproteins can benefit from having one or more disulfide-like covalent crosslinks, which will ensure sufficient stability.
In vitro, disulfide bridges can form spontaneously in the polypeptide as a result of air oxidation. Of course, it is more complicated in vivo. Very few intracellular proteins have disulfide bridges, probably because a strong reduction environment is retained by the glutathione system. Dyslide bridges are commonly found in moving proteins, or snake toxins and other toxins (eg, conotoxins, charybdotoxin bacterial enterotoxins), peptide hormones, digestive enzymes, supplemental proteins, immunoglobulins , Lysozyme, protease inhibitors (BPTI and its homoloda, CMTI-III (tocosin [cucurbita maxima] trypsin inhibitor III) and its homologues, hirudin, etc.) and intracellular proteins such as milk proteins Exists in proteins that are moving in the field.
Disulfide bonds that close the loops of strong intracellular chains have been found in pepsin, thioredoxin, insulin A chain, silk fibroin, and lipoamide dehydrogenase. The bridging cysteine residue groups are separated by one to four residue groups along the polypeptide chain. Model building, X-ray diffraction analysis, and NMR studies show that the alpha carbon path of such loops is usually flat and robust.
There are two types of disulfide bridges in immunoglobulins. One is a conserved intracellular bridge with 60 to 70 amino acid residues and is found repeatedly in almost all immunoglobulin domains. These bridges deeply buried between competing beta sheets are protected from solvents and can usually be reduced only in the presence of modifiers. Other disulfide bridges are primarily intracellular bonds and are present on the surface of the molecule. These bridges are accessible to the solvent and are reduced relatively easily. (STEI85). The microprotein disulfide bridge according to this invention is an internal chain link between cysteines with smaller chain spacing.
When the microprotein has a plurality of disulfide bonds, it is preferably a group of at least two cysteines. That is, they are preferably directly adjacent to the chain or separated by a single amino acid (—C—X—C—). In either case, the group of two cysteines cannot be paired with each other because of steric hindrance. And some feasible phases are reduced.
It can be said that one inner-chain disulfide bridge connecting 3 to 8 amino acids of a polypeptide having 16 residual periods has 4 spans. If 4 to 12 amino acids are disulfide bonded, they form 7 second spans. In both, four cysteines divide the polypeptide into four intracysteine segments (1-2, 5-7, 9-11, and 13-16). (Observe that there is no segment between Cys3 and Cys4.) The pattern of linking of cross-linked microproteins is simply the relative position of the end of the cross-link. For example, for a microprotein having two disulfide bonds, the linkage pattern “1-3, 2-4” means the following. That is, the first cross-linked cysteine is a disulfide linked to the third cross-linked cysteine (in the first sequence), and the second cross-linked cysteine is linked to the fourth.
The degree to which the crosslinks constrain the freedom of conformation of the miniprotein, and the degree to which it stabilizes the miniprotein, can be estimated in various ways. They include the following methods. Absorption spectroscopy (detects whether amino acids are buried or exposed), circular dichroism (provides a general view of protein helix content), nuclear magnetic resonance imaging (in a special chemical environment) Such as X-ray or neutron diffraction analysis of protein crystals. Miniprotein stability could be ensured by monitoring changes in absorption at various wavelengths as a function of temperature, pH, and others. The buried residual group will be exposed when the protein is released from incorporation. Similarly, release of the miniprotein as a result of the denatured state results in a change in NMR line position and width. Circular dichroism (CD) spectra are extremely sensitive to conformation.
Altered disulfide-bonded microproteins according to this invention fall into several classes. That is,
Class I milliloproteins are characterized by a set of cysteines that can interact to form disulfide bonds, which have a span of residual groups of approximately 9 or less. This disulfide bridge desirably has a span of at least two residual groups, which is the geometric function of the disulfide. If the spacing is two or three residual groups, the one residual group is preferably glycine to reduce the tension of the residual group that is bridged. The upper limit of the spacing may not be as precise, but usually the larger the spacing, the fewer conformational constraints imposed on linear intermediate amino acid residues by disulfide bonds.
While the freedom to allow such a peptide's main chain is extremely low, there is no tension. The free energy released when the disulfide is formed exceeds the free energy lost by the main chain when trapped in a conformation that brings together cysteine. Due to the loss of free energy during disulfide formation, the proximal ends of the side groups maintain a fixed relationship with each other. When bound to a target, the domain need not consume free energy to enter the correct conformation. Domains cannot jump to other conformations and join with non-targets.
A disulfide bridge with a span of 4 to 5 is particularly desirable. When the span becomes 6, the influence of restraint decreases. In this case, it is desirable that at least one of the blocked residual groups is an amino acid that imposes a restriction on the geometry of the main chain. Proline can impose maximum limitations. Valine and isoleucine can impose less restrictions on the backbone. The preferred position of the non-cysteine residue group imposing this constraint is adjacent to one of the invariant cysteines. However, it may be one of the remaining groups that bridges your bridge. When the span is 7, it is desirable to add two amino acids that limit the backbone conformation. These amino acids can be in any of the seven positions. Preferably, however, it is a residual group that bridges two bridges directly adjacent to cysteine. When the span is 8 or 9, the number of constrained amino acids may be increased.
Even though a class I microprotein can hold up to 40 amino acids, the number of amino acids is preferably 20 or less.
Disulfide bonded class I microproteins are exposed to solvents. To that end, it must be avoided to expose a population of changed GPs. The altered population of GPs reveals class I microproteins in reagent solutions that destroy disulfides.
Class II microproteins are characterized by a single disulfide bond with a span of 9 or more amino acids. The bridged amino acids form secondary structures that help stabilize the conformation. Desirably, these intermediate amino acids form a hairpin supersecondary structure as outlined below.

Based on research on known proteins, alpha helices, beta strands,
Alternatively, it is possible to calculate the propensity of a special residual group or special dipeptide or tripeptide found in the Inmelman reaction. The normal number of occurrences of amino acid residues in these secondary structures is listed in Table 6-4 of CREI84. See chapter 6 of SCHU79 for a detailed treatment of secondary structure predictions from amino acid sequences.
In order to design an appropriate hairpin structure, the actual structure can be copied from a protein with a known three-dimensional conformation, or it can be designed using the occurrence frequency data. It is also possible to design by integrating methods. Preferably, one or more actual structures are used as a model, and the occurrence data is used to determine a structure that can be manufactured without interfering with the structure.
Desirably, no more than 3 amino acids intervene between cysteine and the beginning or end of the alpha helix or beta strand.
More complex structures (like double hairpins) are possible.
Class IIIa microproteins are characterized by the linkage of two disulfides. These are also optionally characterized by the secondary structure described in relation to the class II microproteins. Three phases are possible with two disulfide bonds. If desired, multiple disulfide-bondable phases may be reduced by a group of cysteines present in enterotoxin ST-IA that are heat-stable.
Class IIIb microproteins are characterized by three or more disulfide bonds. And preferably, as mentioned above, at least when it has a group of cysteines.
Metal finger miniprotein. The invention also relates to miniproteins other than crosslinks by disulfide bonds. That is, it is a finger protein analoda. Finger proteins are characterized by finger structures. In that structure, metal ions are coordinated by two Cys and two His residual groups forming a tetrahedral arrangement. The metal ion is mainly zinc (II), but sometimes it can be iron, copper, cobalt, and others. “Fingers” are a number of sequences (Phe or Tyr)-(1 AA) -Cys- (2-4 AAs) -Cys- (3 AAs) -Phe- (5 AAs) -Leu- (2 AAS) -His ( 3 AAS) -His- (5 AAS). (BERG88, GIBS88). Finger proteins typically have multiple repeats of finger motifs, and one finger is known to be woven in the presence of zinc ions. (FRAN87, PARR88). Whether two fingers are necessary for DNA binding is still controversial. This invention relates to a miniprotein having one or two fingers. Other combinations of side groups lead to the formation of crosslinks related to polyvalent metal ions. For example, Summers (SUMM91) reports that an 18-amino acid miniprotein was found in the capsid protein of HIV-1-F1. It had three cysteines and one histidine attached to the zinc atom. It should be understood that the target does not necessarily have to be a nucleic acid.
G. Adjusted PBSs
There are several enzyme and chemical reagent solutions that can selectively regulate certain side groups of the following proteins: They include: a) protein-tyrosin kinase, EIImans reagent, methyltransferase (methylate GLU side group), serine kinase, proline hydroxylase, vitamin K-dependent enzyme that converts GLU to GLA, maleic anhydride, and alkylating agents. Contains. The handling of the altered population of GPs (PBD) with one of these enzymes or reagent solutions regulates the side groups affected by the chosen enzyme or reagent solution. Enzyme or reagent solutions that do not destroy the GP are highly desirable. Such adjustment of the side group directly affects the binding properties of the revealed PBDs. Using affinity separation methods, we are trying to enhance tailored GPs that bind to a predetermined target. Since all active binding domains are not genetically defined, it is necessary to repeat adjustments after morphogenesis at each strengthening site. This method is particularly suitable for the miniprotein IPBDs because it envisions the chemical synthesis of these SBDs.
III. Change tactics--mutagenesis to obtain potential binding domains with desirable diversity
III. A. General matters
When different amino acid sequences available by mutation of several domains are large and compared to several different domains that can be revealed in detectable amounts, the effectiveness of forced evolution is diverse in the residual groups It is greatly enhanced by carefully choosing to have. First,
Known protein residual groups that may affect binding activity (ie, residual groups on the surface) and known protein residual groups that do not unnecessarily reduce its stability have been identified. All or part of the coden encoding these residual groups
It is changed one after another to create a changed population of DNA. The group of residual groups that are present sufficiently close to the surface that in turn touches one target molecule is a set prepared for simultaneous change. The altered population of DNA is used to reveal various potential binding domains. The ability to connect with the target of interest is evaluated.
As described above, the method according to the present invention is further distinguished from other methods in that it is produced in the character of a highly converted population and that a new binding protein is selected. Yes. We force the revealed potential binding domain to extract the “sequence space” of related amino acid sequences that are related in an effective and organized way. Four goals lead to the various changes used here. Preferably 1) the majority (ie 10 ⁷ ) Deformation is available 2) High commission rate changes appear in detectable amounts 3) The frequency of the desired change appears relatively constant, and 4) Limited variation It occurs only in a few amino acid residues. Most desirably, the fluctuations occur in residual groups having side groups directed in the common region direction of the surface of the potential binding domain.
This method should be distinguished from radiation that modulates genes and the simple use of promiscuous mutagens such as hydroxylamine. With the use of promiscuous sudden change agents, the site of the mutation is not controlled and is very offset. Many mutations affect residual groups that are not part of the binding domain. When chemical mutagens are introduced throughout the genome, most mutations occur in other genes than themselves, which encode the potential binding domain. In addition, at a reasonable level of mutagenesis, only a limited and unbalanced potential area is explored, as a coordinated chordon may be characterized by a single base change. Similarly, remote is the use of special site mutagenesis techniques that utilize oligonucleotides that are non-random sequence mutagens. These expertise is not involved in the production and inspection of numerous variants. Although random mutagenesis expertise has attracted attention, the importance of controlling the distribution of fluctuations has been overlooked.
The potential binding domain is initially designed at the amino acid level. Once you identify which residual groups are mutagenized, and identify which mutations are made at that site, _S An altered DNA encoding can be designed. Coded PBD _S Ensures a reasonable probability that if the PBD has an affinity for the target, it will be detected. Of course, a large number of independent transformants and affinity separation expertise obtained will impose limits on the degree of change possible within a single round of change.
There are various ways to create diversity in proteins. (See RICH86, CARU85, and OLIP86.) One extreme is changing only a few residual groups in as many proteins as possible. (See, inter alia, CARU85, CARU87, RICH86, and WHAR86.) This method will be referred to as “Focused Mutagenesis”. A typical “focused mutagenesis” strategy takes a set of 5 to 7 residual groups and varies each with 13 to 20 possibilities. Another plan for mutagenesis (“diffusion mutagenesis”) is to replace a larger number of residual groups through a more limited set of choices. (See VERS86a and PAKU86.) The variation pattern adopted is in the middle of these extreme examples. That is, two residual groups were changed through 20 amino acids, the other two were changed through only two possibilities, and the fifth was changed from 10 of the 20 amino acids.
The number of cordons that can be changed simultaneously is not limited. However, it is desirable to employ a mutagenesis strategy that produces a reasonable establishment that possible PBD sequences are truly manifested by at least one genetic package. Preferably, the probability that a mutein consisting of the vgDNA-encoded mutein and the least preferred amino acid at each altered site is manifested in the library by at least an independent transformant is At least 0.50, desirably 0.90. (Muteins consisting of more preferred amino acids can of course occur in the same library.)
Desirably, the change is different by different DNA sequences of 10 folds or less (more desirably 3 folds or less). ⁶ -10 ⁷ Resulting in a typical transformant population that reveals the amino acid sequence of.
For class I microproteins that do not have alpha helices and beta strands, preferably in each mutation field, each replaces 4 to 8 non-cysteine codons, thereby Each of them encodes at least 8 of the 20 possible ammono acids. Each chordon change can be specifically replaced by that site. Desirably, cysteine is not one of potential alternatives, even if it is contained in it.
If the miniprotein is a metal finger protein, in a typical change strategy, the two Cys and two His residues, and optionally the aforementioned Phe / Tyr, Phe and Leu residues are unchanged, And several (usually 5 to 10) other residual groups are replaced.
If the microprotein is of a type characterized by one or more alpha helices and beta strands, the set of potential amino acid adjustments at any given site is the secondary structure at that site. It is desirable to incorporate something that does not destroy Since the number of possibilities at each variable amino acid is limited, the total number of variable amino acids will increase without changing the excerpt effectiveness in the selection process.
For class III microproteins, preferably, 20 or less, more preferably 5 to 10 codons vary. However, if diffusion inducers are utilized, the number of chordons changed can be large.
It may also be related to amino acid insertions or deletions, where changes are usually related to alternatives in one of the specified variable codons.
III. B. Identification of residual groups to be replaced
Now consider the principle that helps to select the IPBD residue to be replaced. The underlying theory is that only the constructed protein reveals special bonds. That is, the above proteins can be combined with special chemicals, excluding the majority of others. In this way, the residual group to be replaced is selected with the goal of preserving the basic IPBD structure. Alternative substances that shed PBD from the fold structure cause GPs to drive genes that bind indiscriminately, so they can be easily removed from the population. Amino acid substitutes exposed to the solution do not significantly affect the three-dimensional structure, which is the substitute substance in the interior locus. (See PAKU86, REID88a, EISE85, SCHU79, pages 169-171 and CREJ84, 239-245, pages 314-315). Internal residue groups are often conserved, and amino acid types cannot be changed to meaningful different types without the risk that protein structure may be destroyed. However, conservative changes in internal residual groups such as from I to L or from F to Y are missed. Such conservative changes subtly affect the placement and dynamics of neighboring protein residues, and such “fine tuning” becomes useful once the SBD is found. Insertions and deletions are more easily tolerated within the loop than anywhere else. (THOR88).
Data regarding IPBD as well as data regarding targets useful for determining residual groups that change in the change cycle include: That is, 1) a list of structures, or at least residual groups on the IPBD surface, 2) a list of homologues in the IPBD, and 3) a model of the target molecule or a stand-in of the target.
III. C. Determining an alternative set for each parent residue
After selecting the residual group for replacement, the region of amino acids allowed for each variable residual group is determined. The total level change is the number of deformations in each changed residual group. Each deformed residual group yields 2 to 20 different potential materials and has a different scheme of change. The set of amino acids encoded in the potential by a particular altered codon is called an “alternative set”.
A computer controlling a DNA synthesizer, such as the Milligen7500, uses some nt base (ie, nt phosphoramid--phorphoram-idites) to distribute nts from two or more reservoirs. A base of oligont with a role can be synthesized. Alternatively, the nt base is mixed in other ratios and placed in one of the reservoirs for synthesis called “dirty bottles”. A “mixture” of bases at each nucleotide site of a codon determines the relative frequency of the different amino acids encoded by that codon.
An easily altered codon is one in which the nucleotide site is degenerate and obtained from a mixture of two or more groups mixed in equimolar ratio. These mixtures are described in this specification by a standardized “ambiguous nucleotide” code. In this code, for example, in the degenerated cordon “SNT”, “S” is an equimolar mixture of G and B groups, “N” is an equimolar mixture of all four groups, and “T "Is a single invariant group thymidine.
A complexly modified cordon is one in which at least one of the three sites is filled with one base that is not an equimolar mixture of two or more bases.
Whether it is an easily changed or complex change, a desirable alternative set can be created. If there is no information indicating that a special amino acid or class of amino acid is appropriate, it is uneconomical to display miniproteins above the level that can be found, so replace all amino acids with the same probability. I'm working hard. Equivalent amounts of four nts at each site of one codon (NNN) yield an amino acid distribution that exists in proportion to the number of codons encoded by each amino acid. This distribution has the disadvantage of giving two basic residues for one acid residue. Further, R, S, and L that are six times as large as W or M are generated. If five codons were synthesized with this distribution, each of the 243 sequences encoding several combinations of L, R, and S would each of 32 sequences encoding several combinations of W and M More than 7776 times more abundant. In order to have five Ws presents at a level that can be discovered, each (L, R, S) array present must be held in more than 7776 folds.
Special amino acid residue groups can affect the three-dimensional structure of a polypeptide as defined in several ways. That is,
a) affects the flexibility of the polypeptide backbone,
b) adding a hydrophobic group,
c) add charge groups;
d) allow atomic bonds,
e) Form cross-links such as disulfides, chelation with metal ions, or binding to bio-substitute equipment groups.
Lundeen (LUND86) creates a table of the amino acid frequencies of helices, beta strands, turns, and coils present in proteins known as three-dimensional structures to distinguish CYSs and half-cystines that have free thiol groups did. It is reported that free CYS was found most frequently in the helix and half-cystine was found most frequently in the beta sheet. However, half-cystine is regularly found in helices. Pease et al. (PEAS90) constructed a peptide with two cystines. One end of each is in a truly stable alpha helix. Apaamine has a similar structure. (WEMM83, PEAS88).
Flexibility:
GLY has two hydrogens as C _alpha Is the smallest amino acid attached to GLY is C _beta GLY leaves maximum flexibility to the main chain. In this way, GLY frequently occurs in Inmelman inversion. It occurs particularly frequently in PRO, ASP, SER, and THR.
Amino acids such as ALA, SER, CYS, ASP, ASN, LEU, MET, PHE, TYR, TRP, ARG, HIS, GLU, GLN and LYS have branchless beta. Of course, the side groups, SER, ASP and ASN, frequently hydrogen bond with the main chain, which can force other main conformations to the main chain. VAL, ILE and THR have branched beta carbons that make extended backbone conformation more desirable. In this way, VAL and ILE are most frequently found in beta sheets. Since the THR side group can easily form a hydrogen bond with the main chain, there is little tendency to exist in the beta sheet.
The proline backbone is particularly restricted by the cyclic side group. The phi angle is always close to 60 degrees. The majority of prolines are found on the surface of proteins.
charge:
LYS and ARG retain a single positive charge at a pH of 10.4 or 12.0 or less, respectively. In any case, methylene groups with 4 and 5 amino acids each are capable of hydrophobic interaction. The ARG guanidinium group can contribute 5 hydrogens simultaneously, while the LYS amino acid group cannot contribute only 3 hydrogens simultaneously. Furthermore, because these groups have different geometries, these groups sometimes cannot be exchanged.
ASP and GLU retain a single negative charge at pH above -4.5 and 4.6, respectively. Since ASP has only one methylene group, several hydrophobic interactions are possible. The geometry of ASP plays a role in forming hydrogen bonds with main chain nitrogen. The nitrogen is consistent with the ASP frequently found during the Inmelman reversal and is at the beginning of the Helis. GLU is frequently found in alpha helices, particularly at the amino acid terminal position of these helices. The reason is that the negative charge of the side group has a stabilizing interaction with the helix dipole. (NICH88, SALI88).
HIS is a physiological domain, viz. I have an ionization package in 6.2. The package can be replaced in the proximity of the charged group or in the proximity of the hydrogen donor or recipient. HIS can bind to metal ions such as zinc, copper, and iron.
Hydrogen bond:
In addition to charged amino acids, SER, THR, ASN, GLN, TYR and TRP can participate in hydrogen bonding.
Cross link:
The most important cross-link format is a disulfide bond formalized between thiol CYS residual groups. In a suitable oxidizing environment, these bonds are naturally formed. These bonds can make the special conformation of the protein or miniprotein very stable. When there is a mixture of an oxidized thiol reagent solution and a reduced thiol reagent solution, a conversion action that allows the most stable conformational control is performed. For disulfides in proteins and peptides, see KATZ90, MATS89, PERR84, PERR86, SAUE86, WELL86, JANA89, HORV89, KISH85, and SCHN86.
Other crosslinks that are formed without the need for special enzymes are: That is,
1) (CYS) _Four : Fe rubredoxin (CREI84, page 376)
2) (CYS) _Four : Zn aspartate transcarbamylase (CREI84, page 376) and Zn-finger (HARD90)
3) (HIS) ₂ (MET) (CYS): Cu azurin (CREI 84, page 376 and basic “blue” Cu cucumber protein (GUSS88)
4) (HIS) _Four : Cu CuZn peroxide dismutase
5) (CYS) _Four : (Fe _Four S _Four ) Ferredoxin (CREI84, page 376)
6) (CYS) ₂ (HIS) ₂ : Zn Aen-finger (GIBS88, SUMM91)
7) (CYS) _Three (HIS): Zn Aen-finger (GAUS87, GIBS88)
(HIS) ₂ (MET) (CYS): A crosslink having Cu has a potential advantage that HIS and MET cannot form a crosslink without Cu.
Easily changed coden
The following easily altered codons are useful because they encode a relatively balanced set of amino acids. That is,
1) SNT encodes the next set (L, P, H, R, V, A, D, G), ie
a) One acidic substance (D) and one base (R)
b) Both aliphatic (L, V) and aromatic and hydrophobic (H)
c) Large (L, R, H) and Small (G, A) side groups
d) Firm (P) and flexible (G) amino acids
e) Amino acid encoded once
2) RNG encodes the next set (M, T, K, R, V, A, E, G), ie
a) One acidic substance and two bases (those that are acceptable, not optimal)
b) Hydrophilic and hydrophobic materials
c) Amino acid encoded once
3) RMG encodes the next set (T, K, A, E), ie
a) One acidic, one base, one neutral hydrophilic
b) Three desired alpha helices
c) Amino acid encoded once
4) VNT encodes the next set (L, P, H, R, I, T, N, S, V, A, D, G), ie
a) One acidic substance and one base
b) All classes: Charged materials, neutral hydrophilic materials, hydrophobic materials, rigid and flexible materials, etc.
c) Amino acid encoded once
5) RRS is the next set (N, S, K, R, D, E, G ² ), Ie
a) Two acidic substances and two bases
b) Two neutral hydrophilic substances
c) Twice encoded single glycine
6) NNT encodes the next set (F, S, Y, C, L, P, H, R, I, T, N, V, A, D, G), ie
a) 16 DNA sequences providing 15 different amino acids. Only Serene is repeated, others are present in the same amount. (This allows extremely effective extraction of the library.)
b) These are the same number of acids and base amino acids (to D and R)
c) There are all major classes of amino acids. That is, acidic, base, fatty hydrophobic substance, aromatic hydrophobic substance, and neutral hydrophobic substance
7) NNG is the next set (L ² , R ² , S, W, P, Q, M, T, K, V, A, E, G, stop), i.e.
a) Fair and predominate of residual groups that prefer the conformation of alpha helices (to a lesser extent than L, M, A, Q, K, E, and S, R, T)
b) encodes 13 different amino acids. (VHG encodes a subset of the NNG-encoded set. It has 9 acids in 9 different DNAs, 5 of 9 prefering alpha helices, with equivalent acid and base. Codes noic acid.)
Because of initial changes, NNT is preferred in the majority of cases. However, NNG is preferred over NNT if the coden encodes an amino acid to be incorporated into the alpha helix.
Below, several simple changes in efficiency are analyzed. The library can then be extracted.
(NNK) ⁶ A library of random hexapeptides encoded by has been reported. (SCOT90, CWIR90). Table 130 shows the expected behavior of such a library. NNK creates a single coden for PHE, TYR, CYS, TRP, HIS, GLN, ILE, MET, ASN, LYS, ASP, and GLU (Earl Facet), VAL, ALA, PRO, THR, and Create two chordons for each of GLY (Phiset) and three chordons for each of LEU, ARG, and SER (Omegaset). As shown in Table 130A, according to the number of amino acids from each of these sets, 64,000,000 possible sequences were divided into 28 classes. The largest class is four phiomega alphas with possible sequences approximately equal to 14.6 percent. Aside from the choice, all sequences in a class have the same chance of being produced. Table 130B is (NNK) ⁶ It shows the probability that any DNA sequence taken from the library encodes a hexapeptide belonging to one of the defined classes. Note that a DNA sequence approximately equal to only 6.3 percent belongs to the four omega megaalpha classes.
Table 130C has several independent conformations (ie, 10 ⁶ 3, 10 ⁶ 10 ⁷ 3, 10 ⁷ 10 ⁸ 3, 10 ⁸ 10 ⁹ 3, 10 ⁹ ) Shows the expected number of arrays in each class for libraries that have 10 ⁶ Independent conformations (ITs) expect to see 56 percent of the six omega classes, but only 0.1 percent of the six alpha classes. The majority of sequences seen are from less than 10 percent sampled classes. For example, consider that peptides from two phi, two omega, two alpha classes are isolated by splitting the library to bind to the target. Consider how much knowledge you have about the peptide associated with the isolated sequence. Since only 4 percent of two phis, two omegas, and two alpha classes have been sampled, it cannot be concluded that the amino acids from the omega set are in fact the best from the omega set. There may be a LEU at position 2, but ARG or SER may be better. Even if the omega 6 class of peptides is isolated, there is a chance to draw attention that there were no better class members in the library.
10 ⁷ I've seen a few classes completely sampled in the ITs library. However, only 1.1 percent of the Alpha 6 class has been sampled. 7.6 / 10 ⁷ ITs are expected to reveal 50 percent of the entire amino acid sequence. However, many classes that have an alpha set of three or more amino acids are not well sampled. (NNK) ⁶ To complete library sampling, approximately 3.10 ⁹ ITs, the largest reported so far (NNK) ⁶ Ten times the library is required.
Table 131 shows (NNT) ^Four (NNG) ² Shows the expected value of the library coded by. The expected value of the abundance has nothing to do with the order of the chordons or to make the unchanged chordons a grouped group. The library encodes a 0.133-fold amino acid sequence, but there is only a 0.0165-fold DNA sequence. In this way, 5.0 · 10 ⁷ ITs (ie (NNK) ⁶ (Sixty times less than what is needed for) is sampling almost the complete library. The result is (NNT) ⁶ Is somewhat better and (NNG) ⁶ Things are somewhat bad, but not so bad. The control factor is the ratio of the DNA sequence to the amino acid sequence.
Table 132 shows the ratio of #DNA sequence / # AA sequence for cordons NNK, NNT, and NNG. For NNK and NNG, I suspect that PBD has been revealed as part of an important gene, as indicated by the phrase "presumed to be a loss of stop" in gene III in Pf phage is doing. It is not required in any case that such an important gene be utilized. If unimportant genes are used, the analysis method will be slightly changed. Sampling NNT and NNG would be somewhat less effective. (NNT) ⁶ Is (NNK) ^Five See that 3.6 times more amino acid sequences and 1.7 times fewer DNA sequences are needed. (NNT) ⁷ Is (NNK) ⁶ See that the amino acid sequence is twice as large as the DNA sequence, but the DNA sequence is 3.3 times less.
In this way, it is possible to use simple mixing to obtain all 20 amino acids at a particular site, but these simple mixings greatly distorted the set of encoded amino acids. It will be a thing. This problem can be solved by using a complex changed coden.
Complexly changed cordons
The nt distribution within the codon that tolerates all 20 amino acids and yields the maximum ratio of the least preferred amino acid (lfaa) abundance to the ratio of the most preferred amino acid (mfaa) abundance (“Fxs”) is as few as possible stop codons, even if there are equivalent constraints of acidic and base amino acids, and for convenience, the third base is T or G and is shown in Table 10A As such, DNA molecules are generated that encode each type of amino acid whose abundance is indicated. Other complex altered chordons can be obtained by relaxing one or more conformations.
This chemistry encodes a total of 20 amino acids with acidic and base amino acids that are general, and the most preferred amino acid (serine) is the same frequency as the least preferred amino acid (tryptophan). It has been coded only 2.454 times. The “fxs” vg codon is the number of amino acids [F, Y, C, W, H, Q, I, M, N, K, D, E] that NNK or NNS provides only one codon. Sampling is maximized for peptides that have The sampling advantage is most noticeable when the library is relatively small. The results of overlooking the conditions of acidity and base equivalence and underestimating the stop cordon are shown in Table 10B.
The benefits of NNT cordon are discussed everywhere in this patent registration. Non-optimized NNT provides 15 amino acids encoded by only 16 DNA sequences. NNT can be improved with the distribution shown in Table 10C. It provides 5 amino acids (SER, LEU, HIS, VAL, ASP) in almost equivalent amounts. An additional 8 amino acids (PHE, TYR, ILE, ASN, PRO, ALA, ARG, GLY) are present at 78 percent abundance of SER. THR and CYS remain at half the abundance of SER. When changing the DNA for disulfide-linked microproteins, it is desirable to reduce the prevalence of CYS. This distribution allows for 13 amino acids found at high levels and gives no stop. The optimized fxs distribution allows only 11 amino acids with high prevalence.
The NNG coden can also be optimized. Table 10D shows NNG codons that are nearly optimized ("ALA" is approximately equal to [ARG]). Under this change are the four equally most preferred amino acids: LEU, ARG, ALA, and GLU. Please note that there is one acid and one base in this set. There are two equally least preferred amino acids: TRP and MET. The ratio of ifaa and mfaa is 0.5258. If this coden is repeated 6 times, the peptide made entirely with TRP and MET has 2 percent commonality with the peptide made entirely with the most preferred amino acids. This is referred to as “TRG / MET in optimized NNG vgDNA. ⁶ It is called “the degree of spread”.
When synthesizing vgDNA by the “dirty bottle” method, it is sometimes desirable to use only a limited number of mixes. One very useful mixture is called “optimized NNS mixing”. Among them, the first two positions of fxs mixing: T ₁ = 0.24, C ₁ = 0.17, A ₁ = 0.33, G ₁ = 0.26, the second position is the same as the first position, C _Three = G _Three = 0.5. This distribution provides more than 5 percent amino acids ARG, SER, LEU, GLY, VAL, THR, ASN, and LYS, and more than 4 percent amino acids ALA, ASP, GLU, ILE, MET and TYR Yes.
The chordons that have been replaced with increasing complexity are of interest. This chordon is identical to the optimized NNT chordon of the first two positions and has T: G :: 90: 10 in the third position. This codon provides more than 5.5 percent amino acids (ALA, ILE, ARG, SER, ASP, LEU, VAL, PHE, ASN, GLY, PRO, TYR, and HIS). 4.3 percent THR and 3.9 percent CYS are more common than NNK (3.125 percent) LFAAs. The remaining 5 amino acids are present in 1 percent or less. This codon has a feature that all amino acids are present, and a sequence having two or more low-abundance amino acids is rare. When isolating SBD using this codon, it is theoretically certain that the first 13 amino acids are tested at each position. Similar codons based on optimized NNG can be used.
Table 10E shows some properties of the optimized NNS (or NNK) coden. Note that there are three equally preferred amino acids: AERG, LEU, and SER. There are also 12 equally least preferred amino acids: PHE, ILE, MET, TYR, HIS, GLN, ASN, LYS, ASP, GLU, CYS and TRP. There are five amino acids (PRO, THR, ALS, VAL, GLY) in between. Six iterations of NNS were performed with a sequence consisting of [ARG, LEU, and SER] and only about 0.1 percent in-phase amino acids [PHE, ILE, MET, TYR, HIS, GLN, ASN, LYS, ASP, GLU , CYS, Socite TRP]. This is an optimized NNG ⁶ (TRP / MET) in vgDNA ⁶ This low universality applies to 12 amino acids as well as almost 20 times lower than the universality of.
Diffusion induction
Diffusion induction can be used at any part of the protein and in any case, but is most appropriate when a substance is set to bind to the target. Diffusion induction spikes each pure nts activated for DNA synthesis with a small amount of one or more other activated nts (ie nt phosphoramidites--nt-phosphoramidites) Can be accomplished by (invalidating). Desirably, the level of spike is such that only a small portion of the final product (eg, 1 percent of 0.0001 percent) contains the initial DNA sequence. This ensures the occurrence of single, double, triple and further triggers, but recovery of the underlying sequence is a possible outcome.
III. D. Special considerations related to changes in microproteins with important cysteines
Some desirable simple or complex altered codons code for amino acid sets that contain cysteine. This means that several encoded binding domains are characterized by one or more cysteines in addition to the invariant disulfide bond cysteines. For example, for each NNT-coded position, cysteine may be available once out of 16 chances. If six codons are changed, the fractional value of the domain containing the additional cysteine is 0.33. An odd number of cysteines causes a complex condition. See Perry and Wetzel (PERR84). On the other hand, proteins containing a large number of disulfides contain disulfides, ie cysteines that do not form trypsin. The possibility of unpaired cysteines can be handled in several ways. That is,
First, the altered phage population is an immobilization reagent that is tightly bound to a free thiol, such as SulfoLink (catalog number 44895 H from Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, 61105). May be ignored. Another product from Pierce is TNB-Thiol Agarose (catalog number 20409 H). BioRad sells Affi-Gel 401 (catalog number 153-4599) for this purpose.
Second, changes that exclude cysteines can be used, such as: That is,
Provide NHT-[F, S, Y, L, P, H, I, T, N, V, A, D]
VNS-[L ² , P ² , H, Q, R ^Three , I, M, T ² , N, K, S, V ² , A ² , E, D, G ² ]I will provide a
NNG-[L ² , S, W, P, W, R ² , M, T, K, R, V, A, F, G, Stop]
SNT--Provides [L, P, H, R, V, A, D, G]
RNG--provides [M, T, K, R, V, A, E, G]
RMG--provides [T, K, A, E]
VNT—provides [L, P, H, R, I, T, N, S, V, A, D, G],
Or
RRS-[N, S, K, R, D, E, G ² ]I will provide a. However, each of these schemes has one or more disadvantages compared to NNT. Ie, a) fewer amino acids are allowed, b) amino acids are not provided on average, c) acidic and base amino acids are probably not equivalent, or d) stop codons are generated . However, NNG, NHT, and VNT are as useful as NNT. NNG encodes 13 different amino acids and one stop signal. Only two amino acids appear twice in 16 mixes.
Third, the population that binds to the predetermined target can be enriched, and the selected sequence (post hoc—before and after causal relationship) can be evaluated for extra cysteines. Those containing many cysteines than those provided to constrain the conformation are completely useful. Disulfide linkages other than those designed may occur. The binding domain defined by the isolated DNA sequence is not unsuitable anyway. The suitability of the isolated domain is best determined by chemical and biochemical evaluation of chemically synthesized peptides.
Finally, free thiols can be blocked with reagents such as Ellman's reagent, iodoacetate, or methyl iodide. The reagent specifically binds free thiols and does not act on disulfides and leaves the conditioned phage in the population intact. It should be noted that blocking agents can alter the binding properties of microproteins. In this way, various agents may be utilized to block with the expectation that different binding domains may be discovered. The altered population of thiol blocked gene packages is fractionated for binding. If the DNA sequence of the isolated bound microprotein contains an odd number of cysteines, the synthetic means can be used to provide a microprotein with each possible linkage, where the odd number of thiols is appropriately blocked Has been. Nishiuchi (NISH82, NISH86, and the paper cited herein) discloses a method for synthesizing peptides containing multiple cysteines, where each thiol is protected by a different type of blocking group. Yes. These groups can be selectively removed so that disulfide pairing can be controlled. We are considering the use of a modified scheme in which one thiol remains blocked or unblocked and reblocked with a different reagent.
III. E. Second and subsequent change round plan
The method according to the invention allows an effective collection of information about the amino acid sequence of the binding domain that has a high affinity for a predetermined target. Even if a very useful binding domain is available from a single round of change or affinity enrichment, we believe that multiple rounds are needed to win the highest possible affinity and specificity .
Even if there is any binding to the target in the first round of change, the affinity for the target is still too low and further improvements will be made by changes in SBDs. Desirably, the process is progressive. That is, each change cycle creates a better starting point for the next change cycle than the previous cycle produced. Setting the level of change to be so, a number of sequences associated with the ppbd and ppbd sequences are present in detectable amounts, ensuring a progressive process.
Since the level of change is so high and the ppbd sequence is present at such a low level, there is an identifiable opportunity to say that there is no transformant revealing PPBD, and the highest SBD of the next round May be worse than PPBD. At a higher level of change than necessary, each triggered round is independent of the previous round and there is no guarantee of progress. This method can lead to valuable binding proteins. However, repeated experiments at this level of change do not yield progressive results. Excessive variability is undesirable.
Inventive step is not all or nothing. The process is progressive when most of the data from the previous change cycle is retained and many different surfaces associated with the PPBD surface are produced.
If the level of change in the previous change cycle is chosen correctly, the amino acid chosen to be present in the correctly replaced residue is the best determined. Since the environment changes to other residual groups, it is appropriate to change them again. There are more residues of interest than those that can be changed at the same time, so they have never been changed (the most dominant), or have not been changed for one or more cycles You may continue to select any residual group of things.
The use of NNT or NNG's altered coden leads to highly efficient sampling of the altered library. The reason is that the (different amino acid sequence) and (different DNA sequence) ratios are much closer to unity than to NNK or to the optimized vg codon (fxs). In any case, several amino acids are omitted in each case. Both NNT and NNG allow members of an important class of amino acids (hydrophobic, hydrophilic, acidic, base, neutral hydrophobic, small, large). After selecting the binding domain, subsequent changes and selections may be desirable to achieve a high degree of affinity or specificity. During this second change, the possibility of amino acids missed by previous changes will be considered.
I think some examples will help. Let's assume that you have obtained PRO using NNT. This amino acid can be used with either NNT or NNG. It is theoretically certain to say that PRO is the best amino acid from the set [PRO, LEU, VAL, THR, ALA, ARG, GLY, PHE, TYR, CYS, HIS, ILE, ASN, ASP, SER]. is there. Next, try a set that includes [PRO, TRP, GLN, MET, LYS, GLU]. This set allowed by NNG is the desired set.
What would you say if you got HIS instead of the target substance? Histidine is aromatic and fairly hydrophobic and can bind to imidazole rings and form hydrogen bonds from imidazole rings. Tryptophan is hydrophobic and aromatic and can donate hydrogen to a suitable acceptor and is excluded by the NNT coden. Methionine is also excluded and is hydrophobic. Thus, one desirable course is to utilize a modified coden HDS that allows [HIS, GLN, ASN, LYS, TYR, CYS, TRP, ARG, SER, GLY, <stop>]. .
If the first round of change ends completely unsuccessfully, a different pattern of change should be used. For example, if more than one interaction can be defined within a domain, the replaced residual group in the next round of change must be from a set other than the set established within the first change. If the failure is repeated, it can be changed to a different IPBD.
IV. Revealing strategy: revealing heterologous binding domains on the surface of the "gene package"
IV. A. General requirements for genetic packages
In order to obtain a manifestation of a large number of different but related potential binding domains, it is necessary to create a heterogeneous package of gene packages that can replicate. Each of the gene packages consists of a hybrid gene containing a first DNA sequence encoding a potential binding domain for a target of interest and a second DNA sequence encoding a revealing method. In this way, the outer surface protein is natural to the genetic package, but is not naturally associated with the potential binding domain (or the parent binding domain with which it is associated). The potential binding domain is the basis of the genetic package that reveals the chimeric protein equivalent (or its processed form) on its outer surface.
The components of the population that implement the desired binding characteristics are very small, for example 10 ⁶ It may be smaller. Once a member of this population has been detached from an unbound component, it must be able to be amplified. Culturing variable cells is the most powerful and desirable of genetic material. The genetic message is amplified in vitro, ie by PCR. However, this is not the most desirable method.
Desirably, the GP is as follows. 1) genetically altered by the theoretical mechanism encoding the potential binding domain, 2) retained and amplified in culture, 3) interacting with the target substance during affinity separation. That have been engineered to reveal potential binding protein domains, and 4) those that have genetic information that encodes the binding domain revealed in a recoverable form, although the affinity is separated . Desirably, the GP remains variable after affinity separation. Desirable GPs are vegetative bacterial cells, bacterial spores, and especially bacterial DNA viruses. Eukaryote viruses could be used as genetic packages. But they are not desirable. If the genetic package is a bacterial cell or a periplasmically assembled phage, the revealing means has two elements. The first element is a secretion signal that directs the first expressed substance to the inner capsule of the cell (or host cell if the package is a phage). This secretory signal is divided by the signal peptide to create a processed, mature, potential binding protein. The second element is an outer surface transport signal that guides the package to collect processed protein on its outer surface. Desirably, this outer surface transport signal is derived from surface proteins that are naturally present in the genetic package.
For example, in the preferred experimental example, the hybrid gene is operably linked to one signal sequence (ie, the signal sequence of the bacterial phoA or bla gene, or the signal sequence of the M13 phage gene III), or the filamentous phage ( That is, it consists of DNA encoding a potential binding domain operably linked to DNA encoding M13) coat protein (ie, M13 gene III or gene VIII protein). The expressed substance is transported to the inner cell membrane (lipid bilayer) of the host cell. The signal peptide is then split away leaving the processed hybrid protein. The C-terminus of an element such as the coat protein of this hybrid protein is trapped in the lipid bilayer. Therefore, the hybrid protein cannot escape from the periplasmic part. (This is typical of wild-type coat proteins.) Single-stranded DNA of unfinished phage particles enters the periplasm part, which doubles the wild-type coat protein and the hybrid protein. Collect from membrane. The hybrid protein thus leaves the potential binding domain exposed to its outer surface and is incorporated into the surface coating of the filamentous phage. (Thus, filamentous phage, not host bacterial cells, are “replicatable gene packages” in this example.)
In cases where a secretion signal is required for revealing the potential binding domain, in a particularly desirable experimental example, the bacterial cell in which the hybrid gene is expressed is a cell of the “secretory permissive” lineage.
If the genetic package is a bacterial spore, or the coat is a phage assembled in the cell (such as Phi X174 or lambda), a secretion signal that directs the expressed substance to the inner membrane of the host bacterial cell is not required . In this case, the expression means is simply an outer surface transport signal, typically a spore or phage coat protein derivative.
The preferred OSPs for several GPs are shown in Table 2. The melting of osp-ipbd in this section should be applied to osp-pbd and osp-sbd melting, with the necessary changes.
IV. B. Use of phage as GPs:
If IPBD is a disulfide-bonded microprotein, IPBDs will not fold into cells (these proteins may fold into cells after the phage is released from the cells) Periplasmically assembled phages are considered desirable. IPBD is large or cannot be dissolved (Fe _Four S _Four In cases where a group (such as a group) is required, phage assembled in cells is desirable. The reason is that the combination is lacking in the periplasm, so when secreted, the IPBD may not fold. If changes are introduced, multiple contaminations can generate hybrid GPs carrying genes for one PBD that has at least several copies of different PBDs on their surface. . It is desirable to minimize this possibility by contaminating cells with phage under conditions that have resulted in low multiple contamination (MOI).
Bacteriophage is an excellent candidate because there is little enzymatic activity associated with intact phage that is intact and represents a metabolically inactive mature phage particle, because the gene is inactive outside the bacterial host It is.
For a given bacteriophage, the desired OSP is usually one that is present on the majority of the phage surface. Nevertheless, an OSP such as the M13 gIII protein (5 copies per phage) may be an excellent choice as an OSP responsible for the display of PBD.
It is desirable to preserve the wild type osp gene. The ipbd gene fragment may be inserted into the second copy of the receptor osp gene or inserted into a newly engineered osp gene. The osp-ipbd gene is preferably placed under the control of a regulated promoter.
In order to insert a fragment of the ipbd gene, the user must select a site in the candidate OSP gene. The majority of bacteriophage coats are highly regulated. In such bacteriophages, it is important to retain the residual groups of the parent OSP that interact with other proteins in the virion in the engineered OSP-IPBD melt. . For M13 gIII it may be sufficient to retain the last 100 residual groups (BASS90) (or even less), but for M13 gVIII all mature proteins It is desirable to hold. Such truncated gIII protein will be expressed alongside the complete gIII protein so that the gIII protein is required for phage fouling.
Of particular interest are filamentous phages containing M13, f1, fd, If1, Ike, Xf, Pf1, and Pf3. The major coat protein is encoded by gene III. The 50 amino acid mature gene VIII coat protein is synthesized as a 73 amino acid precoat (ITOK79). The first 23 amino acids constitute a typical single sequence that causes the unfinished polypeptide to be inserted into the intracellular membrane.
One E. Coli signal peptide (SP-I) recognizes amino acids 18, 21, and 23, to a lesser extent, residual group 22, and the residual group of the precoat (KUHN85a, KUHN85b, OLIV87) Approves cuts between 23 and 24. After removal of the signal sequence, the amino terminus of the mature coat is located on the periplasmic side of the inner coat. The carboxy terminus is on the cytoplasmic side. Approximately 3000 copies of the mature 50 amino acid coat protein participate in parallel to the inner capsule.
The sequence of gene VIII is known, the amino acid sequence utilizes the lacUV5 promoter, and LacI ^q It can be used with a suppressor and encoded by a synthetic gene. The lacUV5 promoter is induced by IPTG. Mature gene III protein forms a coating around circular ssDNA. Three-dimensional f1 virus particles are known with moderate resolution. The amino terminus of the gene VIII protein is on the surface of the virus particle and is therefore a desirable connection site for the potential binding domain. Several adjustments of gene VIII have been made and are described below. The two-dimensional structure of the M13 coat is implicit in the three-dimensional structure. The mature M13 gene VIII protein has only one domain.
A three-point gene consisting of: That is,
1) DNA encoding a signal sequence that leads the secretory parts (2) and (3) through the inner membrane,
2) DNA encoding the mature BPTI sequence, and
3) DNA encoding mature M13 gVIII.
This gene causes BPTI to appear in a vibrant form on the surface of M13 phage.
The amino acid sequence of the M13 precoat (SCHA78) is called AA_seq1 and is as follows. That is,

The best site for inserting a new protein domain into M13CP is after A23, as indicated by the arrow. The reason is that SP-I cleaves the protein pre-coated after A23. A protein that can be secreted appears linked to mature M13CP at its amino terminus. Since the amino terminus of mature M13CP is located on the outer surface of the virus particle, the introduced domain will be revealed on the outside of the virus particle. The fact that the mechanism by which M13CP appears in the qualitative bilayer has not yet been elucidated raises the possibility that insertion of bpti directly into gene VIII may not produce a functional molten protein. It may be necessary to change the melting signal sequence to other, for example, phoA sequence (MKQSTIALALLPLTPVTKA ...) (MARK91). Marks et al. (MARK86) showed that the phoA signal peptide can direct mature BPTI to the E. coli periplasm.
Another way to reveal IPBD is to reveal it as a domain of a chimeric gene containing some or all of gene III. This gene encodes one of the minor coat proteins of M13. Genes VI, VII, and IX also encode minor coat proteins. Each of these minor proteins is present in approximately 5 copies per complete mature virus particle. And they are related to morphogenesis or contamination. In contrast, major coat proteins are present in more than 2500 copies per complete mature viral particle. Genes VI, VII, and IX proteins are present at the ends of the mature virions. These three proteins are not manipulated post-transitionally. (RASC86).
Single-strand circular phage DNA is associated with approximately five copies of the gene II protein, and coat protein patches associated with the membrane in such a way that the DNA is trapped within the helically coated protein. Extruded through. (WEBS78). DNA is not based on a pair (it is a severe strictness imposed on the viral genome). Rather, the bases insert into each other independently of the sequence.
Smith (SMIT85) and delaCruz et al. (DELA88) show that insertion into gene III causes the novel protein domain to be expressed on the outer surface of fully mature virus particles. The gene for the miniprotein is gene III at the site used by Smith and delaCruz et al., Gene III in one codon corresponding to the boundary of other domains or corresponding to the surface loop of the protein, or It may be melted into gene III at the amino terminus of the mature protein.
In the experiments described in all references, vectors containing a single regulated gene III fd are utilized. In this way, all five copies of gIII are adjusted in the same way. Gene III is quite large (1272b.p. Or about 20 percent of the phage genome), and it is uncertain whether the entire gene copy is stably inserted into the phage. In addition, all five copies of the gIII protein are present at one end of a fully mature virus particle. If a bivalent target molecule (such as an antibody) binds to a pentavalent phage, the resulting complexity may not be reversed. If the GP bound to the target cannot be reversed, the affinity isotope enrichment of GPs carrying the gene sequence encoding a novel polypeptide having the greatest affinity for the target is greatly increased. have a finger in the pie.
A second synthetic gene encoding the carboxy-terminal part of III may be utilized to reduce the possibility of developing irreversible complexity. The carboxy-terminal part of the gene III protein is responsible for its incorporation into the phage. For example, the last 29 residual groups (starting with the arginine identified by cordon 398) may be sufficient to cause the molten protein to be incorporated into the phage. Alternatively, it may contain a mature gIII protein, ie the last spore domain of the last 150 to 160 amino acids of gene III. For example, you might be able to manipulate one gene (from 5 feet to 3 feet) consisting of: That is,
1) Promoter (preferably controlled),
2) Ribosome binding site,
3) Initiation Coden,
4) a functional signal peptide that guides the secretion (5) and (6) through the inner membrane,
5) DNA encoding IPBD,
6) DNA encoding the residual groups 275 to 424 of the M13 protein,
7) Conversion stop coden, and
8) (Optional) Transcription stop signal.
There will be some unconverted genes III, leaving the wild type gene III. Alternatively, the gene VIII protein may be utilized as an OSP and may control osp: ipbd melting so that one or several copies of the molten protein are expressed on the phage.
M13 genes VI, VII, and IX proteins are not manipulated after conversion. The route by which these proteins are incorporated into phage has not yet been reported. These proteins are necessary for normal morphogenesis and phage infectivity. It is known whether these molecules (gene VI protein, gene VII protein, and gene IX protein) are connected to phage: a) from the cytoplasm, b) from the periplasm, or c) from inside the lipid bilayer. It is not done. One of these proteins can be used to introduce IPBD onto the phage surface using one of the following: That is,
1) ipbd :: pmcp,
2) pmcp :: ipbd,
3) Signal :: ipbd :: pmcp, and
4) Signal :: pmcp :: ipbd.
Thus ipbd displays the DNA encoding for expression for the first potential binding domain, and pmcp displays the DNA encoding for one of the phage minor coat proteins VI, VII and IX. The signal indicates a functional secretion signal peptide such as the phoA signal (MKQSTIALALLPLFTPVTKA), and “::” indicates in-frame gene melting. The indicated melt is placed downstream of a known promoter, preferably a regulated promoter such as lacUV5, tac, or trp. Melting (1) and (2) is appropriate when the minor coat protein is connected from the cytoplasm to the phage or by autonomous insertion into the lipid bilayer. Melting (1) is appropriate when the amino terminus of the minor coat protein is free, and melting (2) is appropriate when the carboxy terminus is free. Melting (3) and (4) is appropriate when the minor coat protein connects to the phage from the periplasm or from the inside of the lipid bilayer membrane. Melting (3) is appropriate when the minor coat protein is free and melting (4) is appropriate when the carboxy terminal is free.
Similar structures can be built with other filamentous phages. Pf3 is a well-known linear phage that infects Pseudomonas aerugenosa cells harboring the IncP-1 plasmid. The major coat protein of PF3 usually does not have a signal peptide that directs its secretion. Its sequence is the residual group ASP ₇ , ARG ₃₇ , LYS ₄₀ And PHE ₄₄ -Charge COO. The sequence is consistent with the exposed amino terminus. Thus, in order to bring about the expression of IPBDT on the surface of Pf3, the following three-point gene was constructed. That is,
1) a signal sequence known to cause secretion in Pseudomonas aeruginosa (desirably known to result in the secretion of IPBD) melted in frame to (3);
2) One gene fragment encoding IPBD, melted in (3) within the frame,
3) DNA encoding mature Pf3 coat protein.
Optionally, the DNA encoding a flexible linkage of 1 to 10 amino acids or the amino acid forming an authorization site for one special protease (ie, factor Xa) is the ipbd gene fragment and Pf3 Introduced between coat protein genes. Since this three-point gene is introduced into Pf3, it does not interfere with the expression of other Pf3 genes. In order to reduce the possibility of genetic recombination, the third (3) part is designed to have a large number of silent mutations relative to the wild type gene. Even if the signal sequence is disrupted, IPBD is in the periplasm and the mature coat protein acts as an anchor and as a phage assembly signal. It is not a problem for this molten protein to rest in the lipid bilayer by a different route than that allowed by the wild type coat protein.
As described in WO90 / 02809, phages such as bacteriophage X174, large DNA phages such as lambda or T4, and even RNA phages may be used as GPs with appropriate adaptation and adjustment .
IV. C. Bacterial cells as genetic packages
One of the following well-characterized bacterial strains may be selected. 1) grown in culture, 2) engineered to reveal PBDs on its surface, and 3) compatible with affinity selection.
Desirable gene packages within bacterial cells are Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio choleae, Klebsiella pneumonia, Neisseria gonorrhoese, Neisseria meningitidis, Bacteroides nodosus, Moraxella bovis and Escherichia coli. Potential binding miniproteins may be expressed as inserts into the outer surface protein (OSP) of chimeric bacteria. All bacteria display proteins on their outer surface. E. coli is a desirable bacterial GP, and therefore f, LamB is a desirable OSP.
The majority of bacterial proteins are present in the cytoplasm, but others are transported to the periplasmic field (which exists between the plasma membrane and Gram minus the bacterial cell wall) or sent to the outer surface of the cell Or fixed there. In addition, other bacterial proteins are released (secreted) into the medium surrounding the cell. The protein recognized by the cell and the nature of the protein that causes it to be transported out of the cytoplasm and manifested on the cell surface will be referred to as the “outer surface transport signal”. Gram-minus bacteria have outer membrane proteins (OMPs) that form a subset of OSPs. Many OMPs have a span of one or more times the coating. Signals that localize OMPs to the outer membrane are encoded in the amino acid sequence of the mature protein. Bacterial outer membrane proteins are first expressed in precursor forms, including what are called signal peptides. The precursor protein is delivered to the inner membrane and the signal peptide moiety is extruded into the periplasmic field. There it is cleaved by a “signal peptidase” and the remaining “mature” protein can enter the periplasm. There once, other intracellular mechanisms recognize the structure in the mature protein, indicate that the appropriate site is in the outer membrane, and transport it to that site.
The DNA encoding for the signal peptide from the leader or one protein is connected to the DNA sequence encoding for another protein, protein X, to form a chimeric gene, and the representation of the chimeric gene is It is well known that protein X causes free expression in the periplasm. Utilization of bacterial strains (LISS85, STAD89) export allowance increases the probability that signal sequence melting will lead the desired protein to the cell surface.
The OSP-IPBD melt protein does not need to play a structuring role in the outer coat of Gram-minor bacteria because the outer coat portion is not highly regulated. There will be one or more sites for large OSPs. The osp is then cleaved at that site and melted to ipbd, so that cells expressing melting will reveal cell surface IPBDs. Melting of the omp gene fragment and one x gene fragment leads to X expressed in the outer membrane. (CHAR88b and c, BENS84, CLEM81). If such a melt is formed, one osp-ipbd can be designed by substituting ipbd for x in the DNA sequence. Otherwise, successful OMP-IPBD melting will melt the highest omp fragment into a single ipbd while expressing the fused gene and testing terminator GPs for the IPBD manifestation phenotype To find the desired. To maximize the likelihood that an IPBD will be revealed, use the available data on the OMP to take a melting point or more than two points between the omp and ipbd. (Sperser DNA encoding a flexible linker (linker consists of GLY, SER, and ASN) must be placed between fragments derived from osp and ipbd to facilitate revelation. Alternatively, a method that beats osp at several sites or produces a variable length osp fragment, and melts the osp fragment into ipbd and the cells expressing the melt are screened or Once selected, IPBDs are revealed on the cell surface, Freudl et al. (FREU89) have shown that fragments of OSPs (such as OmpA) over a certain size are incorporated into the outer membrane. An alternative method is to include short segments of random DNA in the melting of the omp fragment and ipbd, and displaying the IPBD revealing phenotype Or sieving change population was brought as a result for the members, to choose.
In E. coli, LamB protein is a well-understood OSP and can be utilized. Since E. coli LamB protein is expressed in a functional form in S. typhimurium, V. cholerae, and K. pneumonia, PBDs in any of these species as a single melt to E. coli LamB Can be revealed. K. pneumonia expresses maltoporin similar to LamB (WEHM89), and this can also be utilized. In P. aeruginosa, D1 protein (one homologue of LamB) can be used. (TRIA88).
LamB is transported to the outer skin if a functional N-terminal array is present. In addition, the first 49 amino acids of the mature sequence are required for delivery that results in success. (BENS84). For other OSPs, E. coli LamB is synthesized with a typical signal sequence that is later excluded. In-phase between portions of the LamB protein and other outer membrane proteins OmpC, OmpF and PhoE has been detected, including in-phase between LamB amino acids (39 to 49) and the sequence of other proteins. (NIKA84). These subsequences may be termed proteins that are transported to the outer membrane.
The amino acid sequence of LamB is known. (CLEM81). And one model has developed how it fixes itself to other coatings. (Researched by BENZ88b, including others.) Sites of maltose and maltose are also known. (HEIN88). Using this information, several strategies may be identified by PBD insertion that may be incorporated into LamB, providing a chimeric OSP that manifests in the bacterial outer coat.
If PBDs must be revealed by a chimeric trans-membrane protein such as LamB, PBDs can be inserted into loops normally found on the surface of cells. (Compare BECK83 and MANO86). Alternatively, a single 5 foot segment of the osp gene may be melted into an ipbd gene fragment. The melting site is chosen to correspond to the loop exposed to the surface of OSP, and the carboxy-terminal protein of OSP is excluded. In LamB, up to 60 amino acids may have been inserted with the manifestation of the resulting epitope. (CHAR88b and c). Since the structural features of OmpC, OmpA, OmpE, and PhoE are very similar, we expect similar work from these proteins.
Note that LamB may be characterized as a binding protein, but is used in this invention to provide a single OSTS. Its binding domain is not changed.
Other bacterial outer surface proteins such as OmpA, OmpC, OmpF, PhoE and pilin may be utilized in the case of LamB and its homologs. OmpA is of particular interest because it is so abundant and its homologs are known among a wide range of Gram-minus bacterial species. Baker et al. (BAKE87) investigated protein incorporation in the outer coat of E. coli and that residual groups 19-32, 62-73, 105-118, and 147-158 were exposed to the cell surface. The OmpA topological model is quoted. (VOGE86). Insertion of one ipbd encoding a fragment at approximately chordon 111 or approximately at chordon 152 appears to cause IPBD to appear on the cell surface. See also MACI88 and MANO88 for OmpA. Pseudomonas aeruginosa porin protein F has been cloned and has sequence homology in E. coli OmpA. (DUCH88). This homology exposed the surface to proline protein F. Although not sufficient to allow residual group prediction, the method used to determine the OmpA phase model may also be used for porin protein F. Studies related to using OmpA as an OSP are included in BECK80 and MACI88.
Misra and Benson (MISR88a, MISR88b) ₁₆₄ And LEU ₂₅₀ Discloses an E. coli OmpC topological model that is exposed to the cell surface, including others. Thus, the insertion of one ipbd gene fragment at approximately coden 164 of an E. coli ompC cell, or approximately 250 of the coden, or at the isotope of the S. thyphimurium ompC gene is It may cause the surface to develop. The ompC gene of other bacterial species may be utilized. Studies related to OmpC include CATR87 and CLIC88.
E.coli OmpF is one extremely rich OSP, 10 ^Four A cell that is equal to or larger than the copy. Pages et al. (PAGE90) have published a model of OmpF that displays segments with seven exposed surfaces. Melting of a single ipbd gene fragment may generate a functional ompF: ipbd gene in one of the displayed regions, either as an insertion or as a replacement for the 3 foot portion of ompF . And its expression leads to reveal IPBD on the cell surface. In particular, melting at about codons 111, 177, 217, or 245 must lead to a functional ompF :: ipbd gene. For OmpF, see REID88b, PAGE88, BENS88, TOMM82, and SODE85.
Pili ciliated proteins are also found in several other species (N. gonorrhoeae, P. aeruginosa, Moraxella bovis, Bacteroides, nodosus, and E. piliated cells express multiple copies of these proteins. coli) is of particular interest because it expresses the relevant pilin. Getzoff and his collaborators (GETZ88, PAGE87, SOME85) structured a model of gonococcal pili, and the gonococcal pili protein is similar in mechanism to tobacco mosaic virus protein and myohemerythrin It is predicted that four helix bundles will be formed. In this model, both the amino and carboxy termini are exposed. The amino terminus is methylated. Elleman (ELLE88) investigated Bacteroides nodosus and other species of pilin, stating that serotype differences may be related to pilin proteins, and that the maximum variation occurs in the C-terminal region. Yes. The amino terminal portion of the pilin protein is highly conserved. Jennings et al. (JENN89) inoculated a fragment of the virus of foot-and-mouth disease (Afutoza) (residual groups 144-159) into a B. nodosus type 4 pilus protein highly in phase with gonococcal pilin. They found that the expression of a three-foot terminal melt in P. aerubinosa was guided into the organism species and produced a detectable amount of molten protein. Jennings et al. Did not change the heterologous epitope. Also, they do not suggest any variation, they have a single GLY-GLY between the last pilin residue and the first residue of a heterologous epitope providing a “flexible linker”. A linker was inserted. In this way, it was found that the preferred site for adhering IPBD is the carboxy terminus. Although the special internal melting tested by Jennings et al. (JENN89) appeared to be lethal to P. aeruginosa, that bundle of exposed loops could also be used. See also MCKE85 and ORND85 for pilin.
Judd (JUDD86, JUDD85) studied N. gonorrhoeae protein IA and found that the amino terminus was exposed. In this way, mature P. aeruginosa as a means of revealing IPBD on the surface of N. gonorrhoeae. IPBD can be attached at or near the amino terminus of IA.
One model of E. coli's PhoE phase is disclosed by van del Ley et al. (VAND86). This model foretells that eight loops are exposed. Insertion of IPBD into one of these loops appears to lead to the manifestation of IPBD on the cell surface. Residual groups 158, 201, 238, and 275 are desirable sites for insertion of IPBD.
Other available OSPs include E. coli BtuB, FepA, FHuA, IutA, FecA and FhuE (GUDM89), which are nutrient receptors normally found in small amounts. Although the genes for all these proteins are sequenced, a topological model is not yet available. Gudmunsdottir et al. (GUDM89) described the structure of such a model for BtuB and FepA by disclosing certain residual groups on the BtuB surface, the periplasm, and by determining the functionality of the virus Btub :: FepA melting. Began. Carmel et al. (CARM90) report a study of similar properties for FhuA. All Neisseria genera have already been identified. In many cases, it expresses cloned outer surface proteins for transporting iron. See also MORS87 and MORS88.
Many Gram-minus bacteria express one or more ph-ospholipases. The product of the E. coli phosphate lipase A, pldA gene was cloned and sequenced by de Geus et al. (DEGE84). They found that the protein was expressed on the cell surface without post-transfer treatment. A single ipbd gene fragment can be connected to the terminal end, or can be inserted in the protein at a site that appears to encode a loop. The phosphate lipase A arrives on the outer surface without removing the signal sequence, and the signal sequence does not approve the PldA :: IPBD melt protein that allows this route. In this way, a single PldA :: IPBD or IPBD :: PldA fusion may be secreted into the periplasm by adding an appropriate signal sequence. Thus, in addition to the simple binary melting of one iPbd fragment at the end of one PldA, the following structure should be tested. That is,
1) ss :: ipbd :: pldA
2) ss :: pldA :: ipbd
Once the PldA :: iPBD protein is released in the periplasm, it does not remember how it went there, and the structural features of PldA that resulted in it being located on the other surface are the same target site Will lead to melting.
IV. D. Bacterial spores as genetic packages:
Bacterial spores have desirable characteristics as GP candidates. Spores are more resistant to chemical and physical agents than vegetative bacterial cells or phages. Therefore, the use of various affinity selection states is permitted. Also, Bacillus spores do not metabolize actively and do not change the surface proteins. Bacillus spores, and more particularly B. subtilis spores, are therefore desirable sporoidal GPs. As explained in detail in WO90 / 02809, the heterologous binding domain may be introduced into an outer surface protein such as that encoded by the B. subtilis cotC or cotD gene.
It is usually desirable to utilize cells, spores, or viruses as a genetic package, so that outer surface proteins can be engineered to reveal already identified IPBDs. However, as explained in WO90 / 02809, the present invention is not limited to such a gene package, but may be generated by change and selection techniques as an outer surface transport signal.
V. E Consideration of gene structure and expression
(I) The pbd-osp gene would be That is, a) completely synthesized, b) natural and synthetic DNA, or c) natural DNA fragment. The important point is that the pbd segment was easily altered to encode a large and diverse family of PBDs, as described above. The synthesized ipbd segment is desirable because it allows maximum control over the installation of the restriction site. A nuclear molecule present as a supplement in the region adjacent to the osp-ipbd gene on the 3 foot side, and a nuclear molecule present as a supplement in the part of the non-replaceable osp-ipbd are required for sequencing Is done.
The sequence of the gene regulatory part is taken from the sequence of the natural regulatory elements. A) promoter, b) Shine-Dalgarno sequence, and c) transcription terminator. Regulatory elements can also be designed from knowledge of sympathetic sequences in the natural regulatory domain. These arrays of regulatory elements are connected to the area where the code is performed. The restriction sites are also inserted in or adjacent to a restriction area that allows convenient adjustment.
An important function of affinity separation is to support GPs that support high-affinity PBDs (derived from IPBD) for the target, and PBDs that have low affinity for the target. Is to separate from existing GPs. When the elution amount of GP depends on the number of PBDs on the GP surface, the low affinity, GP (PBD _W A single GP supporting a large number of PBDs with a high affinity, PBDs (PBD _Z May elute with a single GP supporting a small number of PBDs. Regulation of the osp-pbd gene is desirably to ensure that the majority of packages exhibit sufficient PBD to affect good separation according to affinity. The use of a regulatable promoter that controls the level of expression of osp-pbd allows to fine-tune the characteristic behavior of the altered population.
Engineered gene synthesis induction in vegetative bacterial cells has been accomplished through the use of regulated promoters such as lacUV5, trpP, or tac (MANI82). The factors that regulate the amount of protein synthesized are well understood so that a wide variety of heterogeneous proteins can be present in E. coli, B. subtilis and other host cells at least in moderate amounts. Can be generated. (BETT88). Desirably, the promoter for the osp-ipbd gene is subject to regulation by one small chemical inducer. For example, the lac promoter and the hybrid trp-lac (tac) promoter can be regulated with isopropylthiogalactoside (IPTG) .The promoter for the constructed gene need not come from the native osp gene. Possible bacterial promoters are also available, preferably non-leakable promoters.
The present invention is not limited to a single method of gene design. The osp-ipbd gene need not be synthesized in whole. The gene part may be obtained from natural sources. Any method of manipulation can be used to generate accurate gene melting as long as the sudden changes are easily and accurately directed to a specific site in the pbd DNA sequence.
The encoded portion of the gene to be synthesized is designed at the protein level and then encoded with DNA. A generous expression of the genetic code is transformed to produce different distributions of amino acids in the altered codon, to minimize the possibility of recombination, and to make use of the codon in the host cell poorly. In order to reduce this, it is manipulated to allow optimal placement of limited sites.
V. F Consideration of structure
The design of the amino acid sequence encoding the ipbd-osp gene has been linked to several structural considerations. The design transforms somewhat with each type of GP. In bacteria, OSPs are not an important element, and therefore melting of the OSP domain has no requirement other than having any of its parent functions in the outer membrane.
It is desirable for the OSP not to regulate the orientation of the PBD domain. This should not be mistaken for saying that there is no restriction in the PBD. Cwirla et al. (CWIR90), Scott and Smith (SCOT90), and Devlin et al. (DEVL90) argue that variable residues in random peptides in which phage are revealed must not be affected by phage OSP. . A binding domain with a moderate to high degree of conformational restriction will disclose a high degree of specificity and argues that a high degree of affinity is also possible. In this way, the selection of codons for changes that specify amino acids expressed within a well-defined frame is regulated. The nature of the side group can be changed over an extremely wide area by replacing many amino acid combinations. The backbone conformations of the majority of PBDs in a given class are very similar. However, PBD movements related to OSP should not be restricted. Thus, it is often appropriate to put a flexible linker between PBD and OSP. Such flexible linkers are known to have flexible regions and can be taken from naturally occurring proteins. For example, the M13 gIII protein is thought to allow a high degree of freedom in the amino-terminal domain and has a region rich in glycine. Such flexible linkers may also be designed. Polypeptide segments rich in the amino acids GLY, ANA, SER and ASP may be made more flexible. A number of glycines are particularly desirable.
If one chooses to insert the PBD into the surface loop of an OSP, such as LamB, OmpA, or M13 gIII protein, there are some considerations that do not occur when the PBD is connected to the OSP end. In such cases, OSP has some limiting impact on PBD. The end of the PBD is placed at a fixed position to some extent. Highly altered DNA sequences can be inserted into the osp gene in the coden encoding the surface exposed loop and in the coden selected for cells with a special binding phenotype. If the identified amino acid sequence is synthesized (by any method), OSP constraints are lost and the peptide has a lower affinity for the target and a lower specificity. Become. Tan and Kaiser (TANN77) have discovered a synthetic model of BPTI that includes all amino acids of BPTI, and that model is about 10 times more than BPTI. ⁷ One K for as high trypsin _d In contact with trypsin. In this way, the altered amino acid is most preferably part of one PBD where structural constraints are provided by the PBD.
Amino acids adjacent to foreign epitopes inserted into LamB are known to affect the immunological properties of these epitopes. (VAND90). We expect that PBDs inserted into a loop of LamB, OmpA, or similar OSPs will be affected by the amino acids of the loop and generally by OSP. It may be necessary to add one or more linker amino acids between OSP and PBD in order to obtain a proper representation of PBD. Such linkers may be obtained from natural proteins or may be designed based on knowledge of amino acid constitutive behavior. A sequence rich in GLY, SER, ASN, ASP, ARG, and THR is appropriate. One to five amino acids at any junction site will share the desired flexibility between OSP and PBD.
A desirable site for insertion of the ipbd gene into the phage osp gene is one of the following. A) where the IPBD is folded into its original form, b) where the OSP domain is folded into its original form, and c) where there is no interference between the two domains.
In cases where a phage model displaying the amino or carboxy terminus of one OSP is exposed to solution, the exposed terminus of mature OSP is a good candidate for ipbd gene insertion. . A low resolution 3D model is sufficient.
In the absence of a three-dimensional model, the amino and carboxy termini of mature OSP are the best candidates for ipbd gene insertion. Structural melting may require additional residual groups between the IPBD and OSP domains to avoid undesirable interactions between the domains. Random DNA or DNA encoding a specialized sequence of a protein homologue for IPBD or OSP can be inserted between the osp and ipbd fragments, if necessary.
Melting at domain boundaries within the OSP is also a good way to obtain functional melting. Smith studied such a boundary when subcloning heterogeneous DNA into gene III of f1. (SMIT85).
The criteria for identifying the appropriate OSP domain to facilitate IPBD disclosure is somewhat different from that used to identify the IPBD. When identifying a single OSP, the minimum size is not as important. This is because the OSP domain does not appear in the last binding molecule and it is not necessary to synthesize the gene repeatedly in each round of change. Major design concerns include: A) OSP :: IPBD melting facilitates the manifestation of IPBD, b) the structure of the first gene is reasonably convenient, and c) the osp :: ipbd gene is genetically stable, And it can be operated easily. There are several ways to identify a domain. A method that relies on coordination using atoms was studied by Janin and Chothia (JANI85). These methods use alpha and carbon (C _a ), Distances between planes (compared to ROSE85), or a matrix of embedded surfaces (RASH84). Cho-thia and his collaborators studied the correlation of the actions of many natural proteins with domain structure (according to their definition). Rashin correctly foretold the stability of the domain consisting of thermolysine residual groups 206 to 316 (VITA84, RASH84).
Many researchers have used partial proteolysis and protein sequence analysis to isolate and confirm stable domains. (For example, see VITA84, POTE83, SCOT87a, and PABO79). Pabo et al. Used calorimetry as an indication that the cI inhibitor from coliphage lambda contains two domains. They used partial proteolysis to determine the location of domain boundaries.
If the data regarding only one available structure is the amino acid sequence of a candidate OSP, a sequence that predicts turns and loops can be used. There is a high degree of probability that several loops and turns will be correctly foretold. (Compare Chou and Fasman, (CHOU74)). These sites are also candidates for insertion of the ipbd gene fragment.
Key considerations in bacterial OSPs include: That is, PBD is manifested, and b) the chimeric protein is not toxic.
From the topological model of OSPs, it can be determined whether the amino or carboxy terminus of OSP is exposed. In that case, these are excellent choices for melting the osp fragment into the ipbd fragment.
The lamB gene is sequenced and is available for various plasmids. (CLEM81, CHAR88a and b). Numerous melts of the lamB fragment and numerous other genes have been used to study the export of E. coli proteins. From various studies, Charbit et al. (CHAR88a and b) have proposed a model that specifies that the residual groups of lamB are: That is: a) Implanted in the coating, b) facing the periplasm, and c) facing the cell surface. We incorporate model numbering for the amino acids of the mature protein. According to this model, some of the outer surface loops are defined. They are as follows. 1) residual group from 88 to 111, 2) residual group from 145 to 165, and 3) residual group from 236 to 251.
Think about miniproteins implanted in LamB. For example, G ₁ NXCX _Five XXXCX _Ten SG ₁₂ Inserting DNA encoding lamB between codons 153 and 154 of E. coli. will lead to various lamBs expressed on the surface of E. coli cells. G ₁ , N ₂ , S ₁₁ And G ₁₂ Is supplied to allow sufficient orientation freedom for the miniprotein, and it can interact to the maximum with the target. Utilizing affinity isotope enrichment (eg, via FACS via a fluorescently labeled target, possibly through a few rounds of enrichment), One strand (eg, named BEST) may be available that expresses one special LamB derivative that exhibits affinity. One octapeptide with a sequence of 3 to 10 inserted residual groups from BEST must have an affinity similar to that seen with BEST. The reason is that the octapeptide has an internal structure that holds amino acids in a conformation that is very similar to the miniprotein separated from the LamB derivative.
Melting one or more new domains into a protein may create the ability of a new protein to be exported from a cell different from the parent protein's ability. The signal peptide of the wild type coat protein may function for the authentic peptide, but it is impossible to export the melt directly. Different signal peptides may be required to take advantage of Sec-dependent pathways. In this way, it was discovered that in order to express and reveal the chimeric BPTI / M13 gene VIII protein, it was necessary to utilize a heterologous signal peptide (that of phoA).
GPs that manifest peptides with a high affinity for the target may be very difficult to elute from the target, especially from multivalent targets. (Tightly bound bacteria can easily grow in situ.) For phage, a cleavage site for a special protease (such as blood clotting element Xa) is introduced into the molten OSP protein. The binding domain can be cleaved from the genetic package. Such cleavage is such that all the resulting phage have the same OSPs and are therefore also contaminating, and even polypeptide-displayed phage can be eluted from the affinity matrix without cleavage. Have advantages. This step allows for the recovery of valuable genes that might otherwise have been lost. To the best of our knowledge, we use special proteases as a means of recovering gene packages with information, or convert phage populations with different degrees of contamination into phages with the same degree of contamination. Nothing has been disclosed or suggested by anyone.
IV. G. Gene insertion synthesis
The invention is not limited to special DNA synthesis or construction methods or strategies. Conventional DNA synthesis may be utilized with appropriate reagent preparation for the production of altered DNA (similar to that currently used for the production of hybrid probes).
The osp-pbd gene may be created by insertion into a parent gene in which vgDNA, such as osp-ipbd, is shown that can be revealed by appropriately converted GPs. The invention is not limited to special vgDNA introduction methods, such as cassette induction or induction induced by single strand oligonucleotides.
IV. H. Cloning vector that can be manipulated
An operable cloning vector (OCV) is a replicating nucleic acid used to introduce the Kirera ipbd-osp or ipbd-osp gene into a gene package. If the genetic package is a virus, it may itself act as an OCV. For cells and spores, the OCV may be a plasmid, virus, phagemid, or chromosome.
IV. I. Cell transformation:
If the GP is a cell, a population of GPs is generated by transforming the cell with the appropriate OCVs. If GP is a phage, the phage is genetically engineered and infects an appropriate host cell for amplification. When GP is a spore, a spore-forming cell is transformed into OCV under normal metabolic conditions and sporulation is induced, thereby revealing OSP-PBDs. This invention is not limited to one method of cell conversion with DNA.
The deformed cells initially grow under non-selective conditions that allow expression of the plasmid gene. Then selected to kill the cells that did not deform. The deformed cells are induced to express the osp-pbd gene at the appropriate level of induction. GPs carried by IPBD or PBDs are harvested by a method suitable for the GP at hand. In general, a centrifugation method for granulating GPs and a fertile medium (cell) or buffer (spore or phage) are used. ) In the resuspension method. To confirm whether the reveal strategy was successful (the whole GPs reveals a “test” IPBD there) or whether the affinity selection was successful (GPs reveals various different PBDs there) And they are ready.
IV. J. et al. Confirmation of revealing strategy:
The harvested package is tested to determine if IPBD is present on the surface. In any GPs test that examines the presence of IPBD on the GP surface, check for the appropriate level of supplemental factors or AfM (IPBD) known to be important for the stability of ions or IPBD . The test is performed as follows. That is, a) by labeling affinity, b) by enzyme application, c) spectrophotometrically, d) by affinity separation, or e) by affinity precipitation. At this stage, AfM (IPBD) is a strong affinity for IPBD molecules (preferably K _d <10 ^-11 M) and pick up those with a small amount of affinity or non-affinity for wtGP.
V. Affinity selection of target binding mutants
V. A. General affinity separation technology
Affinity separation was used in this invention for the first time to confirm whether the revealing mechanism is working. That is, whether the chimeric outer surface protein is expressed and transported to the surface of the gene package is oriented so that the inserted binding domain can be received by the target substance. When utilized for this purpose, a binding domain is a known binding domain for a particular target, which is an affinity molecule that is utilized in an affinity separation process. For example, one revealing mechanism may be confirmed by inserting DNA encoding BPTI into the gene encoding the outer surface protein of the inserted gene package, and is usually bound by BPTI. It may be confirmed by testing binding with anhydrous trypsin.
If a gene package is bound to a target, it can be confirmed that the corresponding binding domain is indeed revealed by the gene package. Packages that reveal binding domains (and are bound to targets there) are separated from those that are not bound.
Once the revealing mechanism has been confirmed, it is possible to take advantage of altered populations of genetic packages revealing a variety of different potential binding domains and successfully bind to one or more targets. It is possible to use an affinity separation technique to determine whether or not it is done. This target need not be bound by a known binding domain that is a parent to the revealed binding domain, ie, one that can be chosen for binding to one new target.
The term “affinity separation means” is not limited to the following, but includes the following. A) affinity column chromatography, b) batch elution from affinity matrix material, c) batch elution from affinity material adhered to one plate, d) fluorescence activated cell sorting, and e ) Electrophoresis in the presence of the target substance. “Affinity substance” was used to mean a substance that has an affinity for a substance to be purified, a substance called “analyte”. In most cases, the affinity substance can be reversed in relation to the analyte, so that the analyte can be released from the affinity substance once the impurities are washed away.
V. B. General affinity chromatography
Affinity column chromatography, batch elution from affinity matrix material stored in some container, and batch elution from plates are very similar, so they will be treated as “affinity chromatography” in the future. To do.
When affinity chromatography is used,
1) The molecule of the target material must be of a reasonably large size and must have chemical reactivity utilized for a suitable solid support for affinity separation,
2) The target substance should not react with water after application to the matrix.
3) After application to the matrix, the target material must not bind or degrade with protein in a non-special way, and
4) The molecules of the target material are usually at least 500 な い, except for an unaltered surface (excluding atoms connected to the linker) that is sufficient for target binding. ² It must be large enough to connect the material to one matrix that allows).
Affinity chromatography is a desirable separation means, but FACS, electrophoresis, or other methods may also be utilized.
This invention is used for affinity separation of bacterial media, or bacterial viruses (or other gene packages) that enrich the population for genes carrying cells or viruses that encode proteins with desirable binding characteristics Is for.
V. C. Target material
The invention can be used to select for binding domains that bind to one or more target substances, or binding domains that fail to bind to one or more target substances. Of course, peculiarity is the ability of the binding molecule to bind tightly to a limited set of target substances, but weakly bind to other sets of target substances from the first set that must be identified, Sometimes it doesn't combine at all.
The target substance is an organic polymer such as polypeptide, fat, polynucleic acid, and polysaccharide, but is not limited thereto. However, the present invention is not limited to any of the identified target materials described above. The only limitation is that the target material is suitable for affinity separation. In this way, almost any molecule that is stable in an aqueous solution can be used as a target.
Serine proteases such as human neutrophil elastase (HNE) are also a class of particular interest for potential target substances. Serine proteases are ubiquitous in living organisms and are important in processes such as digestion, blood clotting, fibrinolysis, immune reaction, reproduction, and post-translational operations of peptide hormones It plays a role. Although the role played by these enzymes is important, uncontrolled or inappropriate proteolytic activity is sometimes very destructive.
V. D. Immobilization or labeling of target material
For chromatography, FACS, or electrophoresis, it may be necessary to covalently bind the target material to the second chemical component. For chromatography, the second component is a human matrix, for FACS, the second component is a fluorescent dye, and for electrophoresis, the second component is a strongly charged molecule. . In many cases, coupling is not necessary because the target material already has the following desirable properties: That is, a) immobilization, b) fluorescence, or c) charge. In other cases, chemical or physical coupling is required.
There is no need for the actual target material utilized to prepare the immobilized or labeled analog utilized in affinity separation. Rather, a suitably reactive analog in the target material may be more convenient. Target substances that do not have a functional group to react may be immobilized by first generating a functional group that reacts through the use of a strong reagent solution such as halogen. . In some cases, a reactive group of de facto target materials may occupy some of the target molecules that were present undisturbed. In that case, additional functional groups may be introduced by synthetic chemistry.
As a general method of immobilization, two methods are widely used. The first method is to biotinylate the compound of interest. The biotinylated derivative is then bound to the immobilized avidin. The second method is to generate an antibody on the target substance, immobilize the antibody by various methods, and then bind the target substance to the immobilized antibody. The use of antibodies is appropriate for larger target materials. Since small targets (eg, those consisting of 10 or fewer non-hydrogen atoms) are completely obscured by the antibody, only a small amount of target is exposed to the target antibody composition.
Non-covalent immobilization of hydrophobic molecules independent of antibodies may also be utilized. A compound such as 2,3,3-trimethyl decane is mixed with a matrix precursor such as sodium alginate and the mixture is extruded into a curing solution. The resulting beads are sprinkled throughout with 2,3,3-trimethyldecane and exposed to the surface.
Other immobilization methods rely on the presence of special chemical functionality. One polypeptide is -NH ₂ N-terminal; Lysines), -COOH C-terminal; Aspartic Acids; Glutamic Acids, -OH (Serines; Threonines; Tyrosines), and -SH (Cysteines). See CREI 84 for amino acid side chain reactivity. One polysaccharide has a free -OH group, as does a DNA with a sugar backbone.
Suitable matrices utilized as support materials include polystyrene, glass, agarose, and other chromatographic supports, which are produced in beads, sheets, columns, wells, and other desirable forms.
In the early stages of the selection process, a relatively high concentration of target material is utilized in the matrix to facilitate binding, and the target concentration is later reduced to select higher affinity SBDs.
V. E. Elution of gene packages supporting lower affinity PBDs
The GPs population is applied to the affinity matrix under conditions that can be interchanged with what was intended for protein binding, and the population is fractionated by the transition of some solute gradient on the column. The The process is enriched for PBDs that have affinity for the target, and therefore the affinity for the target is less affected by the solute utilized. The concentrated fraction contains variable GPs that are more concentrated in the eluate and elute from the column.
The eluate can weaken non-covalent interactions between the revealed PBDs and the immobilized target material. Preferably, the eluate does not destroy the genetic package, and the genetic message corresponding to a successful miniprotein reproduces the genetic package rather than by in vitro methods such as PCR. Is most conveniently amplified. The list of potential eluates includes salts (Na +, NH _Four +, Rb +, SO _Four --- H ₂ PO _Four -, Citrate, K +, Li +, Cs +, HSO _Four -CO _Three -, Ca ++, Sr ++, C1-, PO _Four --- HCO _Three -, Mg ++, Ba ++, Br-, HPO _Four --And acetate), acids, heat, compounds known to bind to the target, and water-soluble target substances (or similar substances). The non-eluting gene package contains DNA encoding a binding domain that has a sufficiently high affinity for a target material that resists elution. DNA encoding such a successful binding domain can be recovered in a variety of ways. Desirably, the binding gene package is easily eluted by a change in elution state. Alternatively, it may be possible to culture the genetic package in the field. Alternatively, it may be possible to extract the matrix contained in the target with phenol (or other suitable solvent) and amplify the DNA by PCR or by recombinant DNA technology. Furthermore, if the site for a particular protease has been manipulated into the reveal vector, the particular protease is utilized to cleave the binding domain from the GP.
Nonspecific binding to the matrix or the like may be identified or reduced by techniques well known in affinity separation techniques.
V. F. Package collection
The collection of packages demonstrating binding to the affinity column could be accomplished in several ways. That is,
1) Collect the fraction eluted from the column with a gradient as described above. Collect the later eluting fraction in a gradient containing GPs that are more concentrated for genes encoding PBDs with a high affinity for the column.
2) Elute the column with the target substance in the form of an aqueous solution.
3) Soak the matrix with nutrient media in water and grow the desired package in the field.
4) Delete portions of the matrix and utilize them to inoculate the growth medium. 5) Since the bond bonding the target to the matrix is chemically or enzymatically degraded, the GPs bound to the target further elute, or
6) Deteriorate the package and recover the DNA with phenol or other suitable solvent. The recovered DNA is used to convert cells that regenerate GPs.
A combination of the above methods can be used. What you want to recover from the affinity matrix is not the GPs themselves, but the information in them. Recovery of viable GPs is strongly desired, but recovery of genetic material is important. Cells, spores, or virions are attached to the matrix so that they cannot be reversed, but if they are not destroyed, information can be collected through in situ cell division, sprouting, or infection. Proteolytic degradation of the package and DNA recovery are not desirable.
V. G. Amplification of concentrated packages
Viable GPs with a selected binding trait are amplified by culturing in a suitable medium, or in the case of phage, infecting the host so cultured. When GPs are inactivated by chromatography, the OCV carrying the osp-pbd gene is recovered from the GP and introduced into a new, vital host.
V. H. Features of estimated SBDs:
For isolated one or more clones, the sbd gene fragment may be subcloned into an expression vector such that each SBD can be produced as one free protein without the osp fragment. . Physical measurements of binding strength may be possible for each released SBD protein by a suitable method.
If it is found that the bond is not yet sufficient, the residual group of SBD (new PPBD) to convert the next is determined. If the binding is sufficient, it will be based on the expression vector that supports the gene encoding the new desired binding protein.
V. I. Joint selection:
Adjusting the affinity separation of the method described for the selection of molecules that bind to substance A but not to substance B, or molecules that bind to both substances A and B, either alternatively or simultaneously. good.
V. J. et al. Operation of the hostile
It would be a good idea to have an adversary against an enzyme or recipient. This is accomplished by creating a natural base or agent or a molecule that prevents it from reaching the active site. Molecules that bind directly to the active site may be agonists or hostile substances. In this way, the following strategy was adopted. Enzymes and recipients are considered to be under the designated substance TER (target enzyme or recipient).
There are scientific inhibitors that block active sites for the majority of TERs. Usually these chemicals are only useful as research tools because of their high toxicity. Two affinity matrices were prepared. That is, one utilized active TER and the other utilized blocked TER. A population of altered GP (PBD) s was created and SBPs that bind to both types of enzymes were selected, thereby obtaining SDPs that did not bind to the active site. We expect SBDs to discover binding to different sites on the enzyme surface. A pair of sbd genes is fused with one intervening peptide segment. For example, SBD-1 and SBD-2 are binding domains that exhibit a high degree of affinity for the target enzyme, and so binding is not competitive and the genes sbd-1 :: linker :: sbd- 2 encodes one 2-domain that will show a high degree of affinity for the target. Generate several melts with different SBDs and different linkers. Such compounds have a theoretical probability of being one hostile substance to the target enzyme.
VI. Successful development of DNA for binding domains
Although SBD can be generated by recombinant DNA technology, the inherent advantage of miniprotein utilization as an IPBD is that the derived SBD will also behave like a miniprotein, and for scientific synthesis. It can be obtained by means. (The term “chemical synthesis” includes the use of enzyme agents in a cell-free environment, as used here.)
It should be understood that the miniprotein obtained by utilizing the method of this invention can be considered as a lead compound for a series of congeners that contain non-naturally occurring amino acids and groups other than amino acids. Don't be. For example, each of a series of members can synthesize a series of homologs with one amino acid substituted by its D enantiomer. It can also produce homologues containing components such as beta-alanine, aminobutyric acid, 3-hydroxyproline, 2-aminoadipic acid, N-ethylasrazine, norvaline, and the like, It could be tested for interesting binding and other attributes such as stability and toxicity.
Peptides may be chemically synthesized in solution or support material. Various combinations of stepwise synthesis and fragment condensation could be utilized.
During the synthetic action, it is desirable to protect the amino acid side chains to avoid branching. Several different protection groups are useful for the protection of the cysteine thiol group. They include: That is,
1) 4-methoxybenzyl (MB _z 1; Mob) (NISH82; ZAFA88), which can be removed with HF.
2) Acetamide methyl (Acm) (NISH82; NISH86; BECK89c) can be removed with iodine. Mercury ions (ie mercury acetate). silver nitrate. And
3) S-para-methoxybenzyl (HOUG84).
Other thiol protection groups are found in standard literature works such as Greene's “Protection Groups in Organic Synthesis” (1981).
Once the polypeptide chain is synthesized, disulfide bonds must also be formed. Possible acidic agents are air (HOUGH84; NISH86), ferricyan compounds (NISH82; HOUG84), iodine (NISH82), and performic acid (HOUG84). Temperature, pH, solution, and chaotropic chemicals may affect the oxidation process.
The majority of microproteins with multiple disulfide bonds are chemically synthesized in a biologically active form. They include: That is, conotoxin G1 (13AA, 4-Cys) (NISH82), thermostable enterotomachine ST (18AA, 6 Cys) (HOUG84), an analog of ST (BHAT86), omega-conotoxin GVIA (27AA, 6Cys) (NISH86; RIVI87b), omega-conotoxin MVIIA (27AA, 6Cys) (OLIV87b), alpha-conotoxin SI (13AA, 4CyS) (ZAFA88), muconotoxin IIIa (22AA, 6Cys) (BECK89c, CRUZ89, HATA90). Occasionally, the polypeptide folds naturally, forming the correct disulfide bond. At other times, each pair of cysteines must be aided by the use of a different removable protection group.
Successful binding domains according to this invention are used for purposes including isolation or detection of a target substance, or for the purpose of confirming that the binding protein is suitable, alone or in part by a large protein. . To further facilitate this purpose, the novel binding protein may be bound directly or indirectly covalently or non-covalently to the label, to the carrier, or to the support.
When used as a drug, the novel binding protein may be mixed with a suitable carrier or adjuvant.
Example 1
A class microprotein design and mutagen
In order to obtain a library of binding domains whose conformation is constrained by a single disulfide, the DNA encoding the following microprotein genus is inserted into the gene encoding the appropriate OSP. That is,

The portion indicates a disulfide bond. Disulfides are not usually formed between cysteines that are contiguous to the polypeptide chain. X above _n One or more of the residual groups indicated by has been greatly changed to obtain new bonds. X ₁ Or X ₆ There is one or more amino acids according to ₁ Before or X ₆ Subsequent residual groups are not significantly bound by the disulfide bridges represented in the chart, and it is not advantageous to replace these remote bridgeless residual groups. The last X residual group is linked to the OSP of the gene package.
X ₁ , X ₂ , X _Three , X _Four , X _Five And X ₆ Can be converted independently, ie one different scheme of change can be utilized at each site. X ₁ And X ₆ Is a minimally constrained residual group that changes less than other sites.
X ₁ And X ₆ Can be, for example, one of the amino acids (E, K, T, and A), and this set of amino acids is desirable for the following reasons. That is,
a) the possibility of positively charged, negatively charged and neutral amino acids is provided;
b) These amino acids are coden RMG (R = equimolar A and G, M = equimolar A and C)
And
c) These amino acids are allowed to undergo appropriate steps by signal peptidases.
In one desirable experimental example, X ₂ , X _Three , X _Four And X _Five Are each encoded by a coden NNT encoding an alternative set (F, S, Y, C, L, P, H, R, I, T, N, V, A, D, and G). Changed for the first time.
The advantage of the NNT coden over the NNK coden is that it gradually becomes clear as the number of replaced codeons increases. Tables 10 and 130 compare libraries in which five codeons have been replaced by either NNT or NNK codeons. NNT encodes 15 different amino acids and encodes only 16 DNA sequences. In this way, 1.139 · 10 ⁷ Amino acid sequence, no stop, and only 1.678 · 10 ⁷ There are DNA sequences. 10 ⁸ The library of independent transformants contains 99 percent of all possible sequences. NNK library is 6.4 / 10 ⁷ Although it contains an array, complete sampling requires more independent transforms.
This sequence is manifested as a fusion with the M13 gene III protein using the native M13 gene III promoter and signal puncture. The sequence of the M13 gene III protein from residual groups 16 to 23 is S ₁₆ HSAETVE _{twenty three} And signal peptidase I is S ₁₆ Cleave after. This segment is replaced with: That is,
S ₁₆ GA ₁₈ AEGX ₁ CX ₂ X _Three X _Four X _Five CX ₆ SYIEGRVIETVE.
H ₁₇ S ₁₈ Note that is replaced by GA does not restrain the phage for infection. One bobbin F.P. between PBD and mature III protein. It is useful to insert a Xa recognition / cleavage site (YIEGR / VI). This not only allows freedom of positioning with respect to the PBD, but also allows cleavage of the PBD from the GP.
X ₁ , X ₂ , X _Five And X ₆ Phage library encoded by NNT (allowing F, S, Y, C, L, P, H, R, V, T, N, V, A, D, and G) And X _Three And X _Four Is a phage library encoded by NNG (allowing L, S, W, P, Q, R, M, T, K, V, A, E, and G) It is named. This library is approximately 1.5x10 ⁷ Approximately 8.55 × 10 encoded by DNA sequence ⁶ Reveal microproteins. NNG is utilized at the third and fourth variable sites (the central site of the disulfide trapped loop) to at least partially eliminate the possibility of cysteine at these third and fourth sites.
Devlin et al. 10 ⁷ The conversion body was sieved. Each of them has 10 for affinity with streptavidin. ¹² Random pentadecapeptide may be revealed. They found 20 streptavidin-binding phage isolates with 8 unique sequences (“A”-“I”). All isolates contained HP; 15/20, HPQ; and 6/20, HPQF, which were at different sites within the pentadecapeptide. The most frequently encountered isolated materials were D (5), I (4), and A (3), which are completely devoid of cysteine. However, the two positive isolates, “E” (1) and “F” (2), were able to form disulfide bonds because they contained a pair of arranged cysteines. The sequences of these isolated materials are shown in Table 820.
Because the TN2 library has the potential to develop streptavidin binding activity, it should have included one putative microprotein, HPQ, very similar to Devlin's “E” and “F” It has recognized. HPQ consists of an AEG amino acid terminal sequence common to all members of the TN2 library, followed by the sequence PCHPQFCQ, which has the potential to form disulfide bridges in four spans, and a single serine (S) and Followed by one bobbin factor Xa recognition site. (YIEGR / IV) (See Table 820). Pilot experiments show that the binding of streptavidin to the phage carrying HPQ can be compared to that of the Devillin “F” isolate, both of which have a margin above the background (1.7 ×). It was. Therefore, a library of TN2 against immobilized streptavidin was sieved.
Streptavidin is available as a free protein (Pierce) with a specific activity of 14.6 units per mg (one unit binds 1 mug biotin). A 1 mg stock solution is made per milliliter in PBS containing 0.01 percent azide. 100 mu L of StrAv stock is added to a 250 mu L volume well of a 1 m-mulon (# 4) plate and incubated overnight at 4 degrees Celsius. The stock is removed and replaced with 250 mu L of PBS containing BSA at a concentration of 1 mg / mL and kept at 4 degrees Celsius for an additional hour. Prior to use in the phage binding assay, the wells are quickly washed 5 times with 250 mu L of PBS containing 0.1 percent tween.
In each StrAv-coated well, one known amount (10 of Tn2 library) was added. ¹¹ Add 100 mu L of binding buffer containing pfu's) phage. Incubation is continued for 1 hour at room temperature, after which unbound phage is removed and washed quickly 10 times with PBS 0.1 percent Tween. It is then further washed with citrate having a pH of 7, 6, and 5 to remove non-specific bonds. Bound phage is eluted with 250 mu L of pH 2 citrate buffer containing 1 mg per mL BSA and a neutralizing agent with 60 mu L of 1 M Tris pH 8. The eluate was utilized to infect bacterial cells producing a new phage stock that was utilized for subsequent rounds of binding, washing, and elution. The capacity-enhancement cycle was repeated twice more (total three times), after which a number of individual phages were added to the sequence as clone isolates and tested. The number of phage present in each step is determined as plaque forming units (pfu's), appropriately diluted and plated on F'lawn containing E. coli.
Table 838 shows the peptidobe sequences found to bind to StrAv and the frequency of random picks taken from the last (round 3) phage pool.
The intercysteine segment of all putative microproteins examined included the HPQ motif. The variable residual group before the first cysteine could contain any of {F, S, Y, C, L, P, H, R, I, T, N, V, A, D, G}. . The selected residual groups were {Y, H, K, D, N} and the phage HPQ has P. The variable residual group after the second cysteine could also have {F, S, Y, C, L, P, H, R, I, T, N, V, A, D, G}. The selected residual groups were {P, S, G, R, V} and the phage HPQ has a Q. The relatively poor binding phage HPQ is probably P _Four Or Q ₁₃ Or maybe both.
In a control experiment, the TN2 library was screened in the same way as shown above, and it has a target protein that is a blocking agent BSA. After three rounds of binding, melting, and amplification, 16 random phage plaques were picked and sequenced. Insertion (8/16) was not seen in half of the clones. And the rest were the sequences shown in Table 839. There is no consensus on this collection.
HPQ6, a microprotein related to phage, was revealed. It is identical to HPQ except for the replacement of CHPQFC with CHPQFPRC. (See Table 820). When revealed, HPQ6 had a substantially stronger affinity for streptavidin than either the HPQ or Devlin "F" isolates. (Devilin's “E” isolate was not studied.) Manipulation with dithio-threitol (DTT) markedly affected HPQ6 phage binding (but not controlling phage) with streptavidin. Reduced, suggesting that one disulfide bridge present in the revealed peptide is required for good binding. Examining the results of the TN2 library screening, the binding of phage HPQ6 is _Four By substituting one of {Y, H, L, D, N} or Q ₁₃ Could be further improved by substituting for one of {P, S, G, R, V}.
Example II
A CHS :: HELIX :: TURN :: STRAND :: CYS UNIT
The parent class 2 microprotein is probably a naturally occurring class 2 microprotein. It may also be a domain of one large protein whose structure may be satisfied or partially altered to meet Class 2 microprotein criteria. Some modifications may be as simple as introducing one cysteine (or a pair of cysteines) into the base of the hairpin structure, and by doing so the hairpin will be closed with a disulfide bond. Or, to achieve a hairpin structure, it will be closed in a more elaborate manner with respect to partial modification of the intermediate residual group. The parent class 2 miku protein will also be a hybrid of structures from two or more naturally occurring proteins, ie, the alpha helix of one protein and the beta strand of a second protein.
One potential use of microprotein motifs is to construct disulfide loops that surround each strand of helix, turn, and return. Such structures can be designed or obtained from proteins of known three dimensional structure. The scorpion neurotoxin, variant 3, (ALMA83a, ALMA83b) (hereinafter referred to as ScorpTx) contains the structure shown in FIG. 1, and it contains one helix (residual groups N22 to N33), one It consists of one turn (residual groups 33 to 35) and one return (residual groups 36 to 41). ScorpTx contains disulfides that connect residual groups 12-65, 16-41, 25-46, and 29-48. CYS _{twenty five} And CYS ₄₁ Are very close and can be bound by disulfides without disturbing the main chain. Figure 1 shows CYS _{twenty five} And CYS ₄₁ And shows the bond. In addition, CYS ₂₉ Has been replaced with GLN. One disulfide forms between 25 and 41, and the helix shown is expected to form. The amino acid sequence shown is highly compatible with this structure. GLY ₃₅ , GLY ₃₆ And GLY ₃₉ Presence of CYS due to disulfide formation ₄₁ It gives enough flexibility to the turns and stretched strands to facilitate the changes needed around.
From examination of this structure (as found in Brookhaven Protein Data Bank 1SN3), we consider the following set of residual groups to be desirable for change. That is,

Positions 27, 28, 31, 32, 24, and 23 constitute one side of the helix. At each of these sites, the following changing chordons were picked up. A) containing a parent amino acid, b) containing a set of residual groups in which the helix has the desired residual group advantage, c) providing a wide variety of amino acids. And d) leading to an averaged distribution as much as possible. Position 34 is a turn part. The side groups of the residual groups 34 can interact with molecules in contact with the side groups of the residual groups 27, 28, 31, 32, 24 and 23. In this way, amino acids that allow for changes and are compatible with the turn are provided here. The change shown is 8.85 · 10 ⁶ 6.65 · 10 encoded by DNA sequence ⁶ Leads to a three amino acid sequence.

Positions 26, 27, 30, 31, and 32 are changed to enhance the ability of helix-friendly amino acids in the population. Since the residual groups 37 and 38 are in the return strand, other change codeons are employed. This change is 4.43 · 10 ⁶ 3 amino acid sequences and 7.08 / 10 ⁶ Thus, one library that embodies this scheme, which allows DNA sequences, can be sampled quite effectively.
Example III
Class 3 microprotein design and mutagen
Parent microprotein with two disulfide bonds
Microproteins with two disulfide bonds may be modeled on alpha conotoxins, namely GI, GIA, GII, MI, and SI. These have the following conserved structure: That is,

Hashimoto et al. (HASH85) report the synthesis of 24 analogs of alphaconotoxins GI, GII, and MI. Using a numbering scheme for GI (CYS at positions 2, 3, 7, and 13), Hashimoto et al. At 4, 8, 10, and 12 that allow proteins to become toxic. Report changes. Almquist et al. (ALMQ89) is (des-GLU ₁ ) Alpha conotoxin GI and 20 analogs were synthesized. They are PRO _Five Instead of GLY, it was reported that two isomers, possibly related to different disulfide bonds, were launched. They found several alternatives between residues 8-11 that allowed the protein to be toxic. Zafaralla et al. 8ZAFA88) found that the PRO replacement in position 9 provides an active protein. Each group quoted utilized a biotoxic drink as an assay for chemical reactions. From such studies, it can be inferred that the active protein has the three-dimensional structure of the parent, but it cannot be inferred that it lacks the three-dimensional structure of the inactive protein parent.
Pardi et al. (PARD89) determined that alpha conotoxin GI could be obtained from venom by NMR. Kobayashi et al. (KOBA89) reported a synthetic alpha-conotoxin GI three-dimensional structure from MMR, which is consistent with that of PARD89. Figure 5 from Pardi et al.
Residual group GLU ₁ Is known for the convenience of known analogues or homologs of GLU, ARG, and ILE. The preferred change codon is the amino acid set (L ² R ² MVSPTAQKEWG <stop>) is an NNG that allows. GLU from Figure 5 of Pardi et al. ₁ It can be seen that these side groups project onto the same region as strands of residual groups 9-12. Residual groups 2 and 3 are cysteines and are not changed. The side group of residual group 4 points away (distracts) from residual groups 9-12. In this way, this residual group transformation is deferred until subsequent rounds. PRO _Five May need to be responsible for proper disulfide formation. If GLY is replaced, the peptide is now woven into two forms, but neither is toxic. PRO _Five Is allowed to convert, but is not thoughtful in the first round.
ALA ₆ No alternative substances have been reported in One desirable cordon is RMG that produces ALA, THR, LYS, and GLU (small hydrophobic materials, small hydrophilic materials, plus and minus). CYS ₇ Does not convert. ALA ₈ Homologous proteins with toxic properties are toxic, but GLY ₈ Wants to leave it as it is. Homologous proteins with various amino acids at position 9 are toxic. In this way, FS ² Use one NNT change coden that allows YCLPHRITNVZDG. Allow ALA, THR, LYS, or GLU (via RMG coden) at position 14 after the fourth CYS. This change is 1.68 · 10 ⁷ 1.053 · 10 encoded by DNA sequence ⁷ Allow amino acid sequence. 2.0.10 ⁷ , 3.0 / 10 ⁷ And 5.0 · 10 ⁷ A library with two independent transformants will reveal approximately 70 percent, approximately 83 percent, and approximately 95 percent of each accepted sequence. Other changes are also appropriate. See especially ALMQ89, CRUZ85, GRAY83, GRAY84, and PARD89 for alphaconotoxins.
The parent microprotein may replace one of the “hybrid I” and “hybrid II” proteins specified by Pease et al. (PEAS90). Compare with Figure 4 of PEAS90. One desirable set of residual groups that will vary for any protein consists of: That is,

This is 1.26 · 10 ⁷ 9.55 · 10 encoded by DNA sequence ⁶ Amino acid sequence is provided. 5.0 / 10 ⁷ One library of converters allows 98.2 percent expression of all possible sequences. At each site, the parent amino acid is tolerated.
Position 5 provides an amino acid that is compatible with one turn. At position 6, ILE and VAL have a branched beta carbon and allow ILE and VAL for reasons of undulating chains. ASP, ASN, often expressed at the amino acid terminus of the helix at position 7. And SER is permitted. At positions 8 and 9, several helix-friendly amino acids (ALA, LEU, MET, GLN, GLU, and LYS) that have different charges and hydrophobicities because they are unique to the helix. ) Is allowed. Since position 10 is at the far end of the helix, it allows small sets (ALA, THR, LYS, and GLU). This set includes three helix-friendly amino acids, as well as a THR that is very well tolerated but allows for plus, minus and neutral affinities. The 12 and 16 side groups project into the same area as the residual groups already described. At these sites, a wide variety of amino acids that are distorted with respect to helix-friendly amino acids are tolerated.
The parent microprotein may consist of a single polypeptide consisting of aprotinin with residual groups 9-24 and 31-40 and having two disulfides (Cys9-Cys22 and Cys14-Cys38). right. Such a polypeptide has the same disulfide bond phase as alpha conotoxin, and the two bridges have 12 and 17 spans, respectively.
Residues 23, 24, and 31 are changed to encode the amino acid residue set (G, S, R, D, N, H, R, T, A), so the necessary geometric turns This single sequence is found. Trypsin or anhydrous trypsin is used as an affinity molecule that enriches GPs revealing microproteins folded into a stable structure similar to BPTI in the P1 region.
Three disulfide-bonded parent microproteins
Cone snails (Conus) produce toxic Conotoxins that are 10-30 amino acids in length and are particularly rich in disulfide bonds, and therefore are intact microproteins. Novel microproteins with three disulfide bonds could model muto (GIIIA, GIIIB, GIIIC) or omega (GVIA, GVIB, GVIIC, GVIIA, GVIIB, MVIIA, MVIIG and others) conotoxins. Muconotoxin has the following conserved structure:

The non-three-dimensional structure of muconotoxin has already been disclosed. Hidaka et al. (HIDA90) established an association of disulfides. The diagram below depicts geograftoxin I (also known as muconotoxin GIIIA).

The connection from R19 to C20 can go to the strand from Q14 to C15. One desirable form of change is to replace the residual group of one loop. Since the longest loop contains only five amino acids, it is also appropriate to change the residual group attached to the cysteine forming the loop. For example, it may be possible to change by adding residual groups 5 to 9, and 2, 11, 19, and 22. Another useful change would be to replace the residual groups 11-14 and 16-19 through 8 amino acids. For muconotoxins, see BECK89b, BECK89c, CRUZ89, and HIDA90.
Omega conotoxin will be displayed as follows: That is,

King Kong peptide has the same disulfide combination as omega conotoxin, but has different biological activities. Woodward et al. (WOOD90) report sequences of three homologous proteins from C.textile. Only cysteine is conserved within the mature toxin domain. Although the cysteine spacing is perfectly conserved, the other positions do not have the same amino acid in all three sequences, and only a few positions are indicative of a pair. In this way, we conclude that all positions (with the exception of cysteine) will be freely substituted with a high probability of forming a single stable disulfide structure. For omega conotoxins, see HILL89 and SUNX87.
Another microprotein that may be utilized as the parental binding domain is Cucurbit maxima trypsin inhibitor I (CMTI-I). CMTI-III is also suitable. These are members of the pumpkin serine protease inhibitor, which contains inhibitors from summer noodles, zucchini, and cucumber. (WIEC85). McWherter et al. (MCWG89) have described human leukocyte elastase and cathepsin G. et al. A synthetic sequence variant of a pumpkin species protease inhibitor having an affinity for is described. Of course, any member of this genus could be used.
CMTI-I is one of the smallest proteins known to consist of only 29 amino acids, held in a conformation fixed by three disulfide bonds. Its structure has been studied by Bode and his collaborators using both X-ray diffraction (BODE89) and NMR (HOLA89a and b). CMTI-I is saddle-shaped, it does not have a helix or beta sheet, but it consists of turns and is connected by a short polypeptide extension. The disulfide pairings are Cys3-Cys20, Cys10-Cys22, and Cys16-Cys28. Among the CMTI-I: trypsin compounds studied by Bode et al., 13 of 29 inhibitor residues are directly related to trypsin. The majority of them are present in the critical binding segment Val2 (P4) -Glu9 (P4 ′) containing the chemical reaction site binding Arg5 (P1-) IIe6, and to other slin proteinase inhibitors. Is also present in a single conformational troupe.
CMTI-I is approximately 1.5 · 10 ^-12 One K for M trypsin ₁ have. McWherter et al. Suggested an alternative to the “moderately high hydrophobic group” in P1 to confer HLE specificity. They found a broad set of residual groups (HAL, ILE, LEU, ALA, PHE, MET, and GLY) that gave detectable binding to HLE. For cathepsin G, they anticipated a truly desirable high amount (especially aromatic K) side group. They found that PHE, LEU, MET, and ALA are functional according to their standards. They have not tested TRP, TLR, or HIS. (Note that ALA has a second small available side group.)
The first desirable change strategy is the residual group ARG ₁ , VAL ₂ , PRO _Four , ARG _Five , ILE, LEU ₇ , MET ₈ , GLU ₉ , LYS ₁₁ , HIS _{twenty five} , GLY ₂₆ , TLY ₂₇ And GLY ₂₉ It is to change part or all of. For example, when the target is HNE, DNA having the following possibilities can be synthesized. That is,

This is approximately 1.03 · 10 ⁷ Approximately 5.81 · 10 encoded by DNA sequence ⁶ Tolerates amino acids. 5.0 / 10 ⁷ One library of independent transforms provides nearly 99 percent of potential sequences. Other change schemes can also be utilized.
Other inhibitors belonging to this include: That is,
Trypsin inhibitor I (OTLE87) from Citrullus vulgaris,
Trypsin inhibitor II (OTLE87) from Bryonia dioica,
Trypsin inhibitor I (OTLE87) from Cucurbita maxima,
Trypsin inhibitor III (OTLE87) from Cucurbita maxima,
Trypsin inhibitor IV (OTLE87) from Cucurbita maxima,
Trypsin inhibitor II (OTLE87) from Cucurbita pepo,
Trypsin inhibitor III (OTLE87) from Cucurbita pepo,
Trypsin inhibitor IIb (OTLE87) from Cucumis sativus,
Trypsin inhibitor IV (OTLE87) from Cucumis sativus,
Trypsin inhibitor II from Ecballiumelaterrium (FAVE89) and
CM-1 (OTLE87) inhibitor from Momordica repens
Other microproteins that can be utilized as an initial potential binding domain are enterotoxins with heat stability induced from some enterotoxin inducers E. coli, Citrobacter freundii, and other bacteria. These microproteins are known to be secreted from E. coli and have sufficient stability. See below for the synthesis, cloning, expression, and properties of these proteins. BHAT86, SEKI85, SHIM87, TAKA85, THOM85a and b, YOSH85, DALL90, DWAR89, GARI87, GUZM89, GUZM90, HOUG84, KUBO89, KUPE90, Oka87, OKAM88, and OKAM90.
Example IV
Mini protein with one crosslink consisting of CU (II), one cysteine, two histidines, and one methionine
The sequences as described below are: HIS-ASN-GLY-MET-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-HIS-ASN-GLY-CYS and CYS-ASN-GLY-MET-Xaa-Xaa-Xaa -Xaa-Xaa-Xaa-HIS-ASN-GLY-HIS facilitates binding with Cu (II) to form a structure as shown in the diagram.

Other combinations of HIS, MET, HIS, and CYS along the chain also appear to form similar structures. The amino acids ASN-GLY at positions 2 and 3 and positions 12 and 13 confer amino acids carrying metal binding ligands that are flexible enough to join together and bind to metals. . Other connection arrangements may also be used, i.e. GLY-ASN, SER-GLY, GLY-PRO, GLY-PRO-GLY, or PRO-GLY-ASN. It is also possible to replace one or more residual groups in a loop connecting the first and second or third and fourth metal bond residual periods. For example,

Xaa4 must form the structure diagrammed for various amino acids. It can be expected that side groups Xaa4 and Xaa6 are close together and present on the surface of the miniprotein.
Since the altered amino acids are retained, their flexibility is limited. This crosslink is somewhat different from the disulfide linkage. C alpha _Four And C alpha ₁₁ The separation between is greater than the separation of Calphas of one cysteine. Furthermore, the interaction from residual groups 1 to 4 and 11 to 14 with metal ions is expected to more restrict the movement of residual groups 5 to 10 than the disulfides of residual groups 4 to 11. ing. A single disulfide bond exerts a strong remote constraint on the alpha carbon of the attached residual group, but for example, only a very small amount of directional constraint is exerted on the N to C vector in the main chain.
For the desired arrangement, the side groups 5 to 10 of the residual groups form a special interaction with the target. Other variable amino acids, such as 4, 5, 7, or 3, are suitable. A large span may be used in the following cases: That is, the inclusive sequence contains an alpha helix that regulates the conformational freedom of the polypeptide backbone or other segments with a high degree of potential to form secondary structures. Is the case. A miniprotein with four CYSs can form three special bearings, while a miniprotein with two HISs, one MET, and one CYS has only two special Only composites can be formed. These two structures are related by mirror symmetry through Cu. Since the two HISs are distinguishable, the structure is different.
When such metal-containing miniproteins are displayed on filamentous phage, the cells producing the phage can grow in the presence of the appropriate metal ion, or the phage can be separated from the cells. It can be exposed to the metal only after being done.
A miniprotein with one crosslink consisting of ZN (II) and four cysteines
Example V
Crosslinks similar to those shown in Example XV are zinc finger proteins
(GIBS88, GAUS87, PARR88, FRAN87, CHOW87, and HARD90). One genus of zinc fingers is Zn ₊₊ It has two CYS and two HIS residues in the retained positions that bind (PARR88, FRAN87, CHOW87, EVAN88, BERG88, CHAV88). Gibson et al. (GIBS88) studied several sequences that are thought to form zinc fingers and proposed a three-dimensional model for these compounds. Most of these sequences have two CYS and two HIS residues in their retained positions, while some have three CYS and one HIS residue. Gauss et al. (GAUS87) also reported a zinc finger protein with three CYS binding zinc and one HIS residual group. Hard et al. (HARD90) report the three-dimensional structure of a protein consisting of two zinc fingers, each with four CYS residual groups. All of these zinc binding proteins are stable in the reduced intracellular environment. One desirable example of a single CYS :: Zinc Crosslink Miniprotein consists of residual groups 440-461 of the sequence shown in FIG. 1 of HARD90. Residual groups 444 to 456 may be varied. One such change is as follows.

This encodes the same number of amino acid sequences 3.77 · 10 ⁷ Lead to DNA sequence. 1.0.10 ⁸ One library with independent transforms will reveal 93 percent of the accepted sequences. 2.0.10 ⁸ Independent converters will reveal 99.5 percent of the accepted sequence.

Literature

Claims (19)

A library of chimeric proteins, wherein each chimeric protein comprises a single disulfide bond formed between a pair of cysteines, consisting of more than 6 amino acids and less than 40 amino acids, and the span of the disulfide bonds Is a microprotein having 4 amino acid residues or more and 9 amino acid residues or less, and a) at least a part of the outer surface protein of the gene package,
A library of chimeric proteins, wherein the chimeric protein is presented on the outer surface of the gene package. The library according to claim 1, wherein the span of the disulfide bond is 4 amino acids. The library according to claim 1, wherein the span of the disulfide bond is 5 amino acids. The library according to claim 1, wherein the span of the disulfide bond is 6 amino acids. The library according to claim 1, wherein the span of the disulfide bond is 7-9 amino acids. The library according to claim 4 or 5, characterized in that in some microproteins of the library, at least one amino acid selected from proline, valine and isoleucine is contained in the span of disulfide bonds. The library according to claim 4 or 5, wherein all the microproteins of the library contain at least one amino acid selected from proline, valine, and isoleucine within a span of disulfide bonds. The library according to claim 6, wherein the amino acid is proline. The library according to any one of claims 1 to 8, wherein the microprotein comprises an amino acid sequence consisting of 20 or less amino acids. The micro-protein sequence _{X 1 -C-X 2 -X 3} -X 4 -X 5 -C-X 6
The library according to claim 2, wherein cysteine (C) forms a disulfide bond, and X ₁ -X ₆ are amino acids that vary independently of each other. In the microprotein, at least one amino acid of the span of the disulfide bond is encoded by one of diversification codes selected from NNT, NNG, RNG, VNT, RRS, SNT. Item 11. The library according to any one of Items 1-10. The library according to any one of claims 1 to 11, wherein none of the amino acids in the span of the disulfide bond is encoded by any of NNN, NNK, or NNS in the microprotein. The library according to any one of claims 1 to 12, characterized in that a microprotein is directly bound to at least part of the outer surface protein. The library according to claim 1, wherein the gene package is a filamentous phage. The library according to any one of claims 1 to 14, wherein the outer surface protein is a main coat protein of filamentous phage. The library according to any one of claims 1 to 15, wherein the outer surface protein is a gene III protein of filamentous phage. A method for identifying a protein having a desired binding activity to a target, comprising:
A) screening the library of chimeric proteins according to any one of claims 1-16;
A) Identify chimeric proteins
Comprising a method. A mixture of nucleic acids encoding the library according to any of claims 1-16. 19. A mixture of nucleic acids according to claim 18, characterized in that each nucleic acid is cloned in an expression vector.

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