JP4150201B2

JP4150201B2 - Gene chip preparation method

Info

Publication number: JP4150201B2
Application number: JP2002088789A
Authority: JP
Inventors: 徹郎浜藤; 孫平山田; 建夫本田
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2002-03-27
Filing date: 2002-03-27
Publication date: 2008-09-17
Anticipated expiration: 2022-03-27
Also published as: JP2003286289A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定のシランカップリング剤を用いた遺伝子チップの調製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
シランコート剤は、無機材料と有機材料を結合させるために用いられる。シランカップリング剤は水により加水分解されてシラノールとなり、部分的に縮合してオリゴマー状態になる。続いて、無機材料表面に水素結合的に吸着し、さらに脱水縮合により強固に結合する。このことにより、無機材料上にシランカップリング剤を介して有機材料と結合する官能基、例えばアミノ基、COOH基等を導入することができる。
これまでのシランカップリング剤は、１分子に１つの官能基しか持っていなかった。このため、官能基の単位面積当たりの導入密度は低く、無機材料上に結合させることのできる有機材料の量には限界があった。
（従来のシランカップリング剤）
【化２】

「ここでＸは-NH₂,-OH、Ｒは低級アルキルをそれぞれ意味する」
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、特定のシランカップリング剤を用いることによって、官能基の単位面積当たりの導入密度を高くし、無機材料上に結合させることのできる有機材料の量を大幅に上昇させた遺伝子チップの調製方法を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、1分子に複数の官能基をもつシランカップリング剤を用いることによって、
無機材料上への官能基の導入密度を高めた遺伝子チップの調製方法を開発し、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち、本発明は、
１．遺伝子チップの調製方法において、下記式で示されるシランカップリング剤によって無機材料に官能基を導入する工程を含む、遺伝子チップの調製方法。
【化１】

「式中、Ｙは-O-,-NH-,NR-を、；Ｘは-NH₂ ,-OHを、；ａとｄは１〜１００、ｂとｃは０〜１００の整数を、；ｎは１〜１００の整数を、；Ｒは低級アルキルをそれぞれ意味する。」
２．ａとｄは１〜１０、ｂとｃは０〜１０の整数であり、ｎが１〜１０である請求項１の遺伝子チップの調製方法。
３．無機材料上にオリゴヌクレオチドプローブを官能基を介して固定化する工程をさらに含む、請求項１又は２の遺伝子チップの調製方法。
からなる。
【０００６】
本発明の、シランカップリング剤のイメージ図は、以下である。
【化４】

「ここでＸは-NH₂,-OH、Ｒは低級アルキルをそれぞれ意味する」
Ｘを-NH₂にすることで無限に官能基が増えていく可能性がある。
【０００７】
本発明のシランカップリング剤の一般式は以下である。
【化５】

式中、式中、Ｙは-O-,-NH-,NR-を意味し、好適には、-NH-が例示される。Rは低級アルキル基を意味し、炭素数１〜３である。Ｘは、有機材料例えば塩基配列等と結合する官能基（アミノ基、COOH基）の末端であり、-NH₂,-OHを意味する。ａ，ｂ，ｃ，ｄは各１〜１００の整数を意味するが（ｂとｃは０でもよい）、一般的には各１〜１０の整数である。より一般的には１〜５の整数である。ｎは２〜１００の整数を意味するが、一般的には２〜１０の整数である。より一般的には２〜５の整数である。
【０００８】
本発明のシランカップリング剤の調製は、自体公知方法に準じて達成できる。複数の官能基を有するシランカップリング剤は、例えば以下のようにして合成出来る。
(CH₃O)₃Si(CH₂)₃Cl ＋ N(CH₂CH₂NH₂)₃
オートクレーブ
―――――――→ (CH₃O)₃Si(CH₂)₃NHCH₂CH₂N(CH₂CH₂NH₂)₂
100℃ 20hrs
【０００９】
かくして提供されるシランカップリング剤は、公知の方法で例えば水により加水分解されてシラノールとなり、オリゴーマー状態から、無機材料表面に水素結合的に吸着し、さらに脱水縮合されて固着され、無機材料への官能基の導入の方法が提供される。導入された官能基は無機材料との結合１に対して少なくとも２つ以上の官能基を保有しており、極めて官能基密度の高い材料を提供する。この材料に、種々遺伝子情報を担持する有機材料を官能基を介して固定化すれば、極めて密度の高い効率的な例えば遺伝子チップの調製方法を提供する。
【実施例】
【００１０】
実施例１シランカップリング剤の合成
以下の反応式で処理を行った。
(CH₃O)₃Si(CH₂)₃Cl ＋ N(CH₂CH₂NH₂)₃
――――――――→ (CH₃O)₃Si(CH₂)₃NHCH₂CH₂N(CH₂CH₂NH₂)₂
オートクレーブ（100℃ 20hrs）
【００１１】
合成例として上記反応式で官能基の枝が2つあるものの合成を示す。
合成法：
(3-Chloropropyl)trimethoxysilane 2.0g(0.01mole)をメタノール20mlにとかし、tri(2-aminoethyl)amine 3.0g(0.02mole)を加える、オートクレーブ中で100℃、20時間攪拌反応させる。反応液を水に投入し、苛性ソーダ水溶液でアルカリ性にした後、エーテル抽出する。エ-テル層をボウ硝で乾燥後、溶媒を留去する。得られた油状物をカラムクロマトで溶出し、目的物を単離した。目的物は以下にように元素分析により確認された。
Anal. Calcd.for C₁₂SiH₃₂O₃N₄； C:46.75 Si:9.09 H:10.39 N:18.18
Found C ；47.09 Si:9.03 H:10.01 N:17.69
【００１２】
官能基の枝が１個のものはN(CH₂ CH₂ NH₂ )₃の代わりにNH₂ CH₂ CH₂ NHCH₂ CH₂ NH₂ 3g(0.03mole)を用い10時間反応で行った（その他の操作は同様）。得られたものは(CH₃ O)₃Si(CH₂ )₃ NHCH₂ CH₂ NHCH₂ CH₂ NH₂ である。（従来品レベル）
【００１３】
実施例２無機材料への固定化
実施例１で合成した分子式
【化６】

のシランカップリング剤を2％水溶液とし1時間攪拌後、これに顕微鏡用スライドガラスを浸漬した。１時間後スライドガラスを洗浄し、余剰なシランカップリング剤を除去した後、110℃で10分間焼いて、固定化した。
【００１４】
実施例３有機材料の導入
このスライドガラスに5'末端にヒドロキシスクシンイミド基を、鎖内にCy5導入した0.5mMのオリゴヌクレオチドプローブを1μlずつ滴下し、１時間静置することによってスライドガラス上にオリゴヌクレオチドプローブを固定化した。また対照として、従来のシランカップリング剤(▲１▼KBM-603:N-β(アミノエチル）γ-アミノプロピルトリメトキシシラン、▲２▼KBM-903：γ-アミノプロピルトリメトキシシラン）で処理したスライドガラスを用いても行った。
未反応の余剰のプローブを洗浄除去し、有機材料の導入を完了した。
【００１５】
実施例４評価
実施例３で得た、スライドガラス上に固定化されているCy5標識プローブの密度を蛍光強度によって評価した。その結果を図１に示す。本発明のシランカップリング剤で処理することにより、従来のシランカップリング剤に比べて、約1.8倍の蛍光強度が観察された。すなわち、スライドガラス上に導入された官能基の密度が増したことが明らかとなった。
【発明の効果】
本発明は、従来のシランカップリング剤に比べて、スライドガラス上に導入された官能基の密度が増した試薬を提供することに成功した。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例４のスライドガラス上に固定化されているCy5標識プローブの密度の蛍光強度で表した比較図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for preparing a gene chip using a specific silane coupling agent .
[0002]
[Prior art]
The silane coating agent is used for bonding an inorganic material and an organic material. The silane coupling agent is hydrolyzed with water to form silanol and partially condensed to an oligomer state. Subsequently, it is adsorbed on the surface of the inorganic material by hydrogen bonding, and further firmly bonded by dehydration condensation. This makes it possible to introduce a functional group, such as an amino group or a COOH group, bonded to the organic material via the silane coupling agent on the inorganic material.
Conventional silane coupling agents have only one functional group per molecule. For this reason, the introduction density of functional groups per unit area is low, and there is a limit to the amount of organic material that can be bonded onto the inorganic material.
(Conventional silane coupling agent)
[Chemical 2]

“Where X represents —NH ₂ , —OH, and R represents lower alkyl.”
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention, by using a specific silane coupling agent, to increase the introduction density per unit area of the functional groups were significantly increased the amount of organic material that can be attached on the inorganic material Gene It is to provide a method for preparing a chip .
[0004]
[Means for Solving the Problems]
The present invention, by using the silane coupling agent having a plurality of functional groups in one molecule,
A method for preparing a gene chip with increased functional group introduction density onto an inorganic material was developed, and the present invention was completed.
[0005]
That is, the present invention
1. A method for preparing a gene chip, comprising the step of introducing a functional group into an inorganic material by a silane coupling agent represented by the following formula in the method for preparing a gene chip .
[Chemical 1]

“Wherein Y is —O—, —NH—, NR—; X is —NH ₂ , —OH; a and d are 1 to 100, b and c are integers from 0 to 100; n represents an integer of 1 to 100; R represents lower alkyl.
2. The method for preparing a gene chip according to claim 1, wherein a and d are 1 to 10, b and c are integers of 0 to 10, and n is 1 to 10.
3. The method for preparing a gene chip according to claim 1 or 2, further comprising a step of immobilizing an oligonucleotide probe on an inorganic material via a functional group .
Consists of.
[0006]
The image of the silane coupling agent of the present invention is as follows.
[Formula 4]

“Where X represents —NH ₂ , —OH, and R represents lower alkyl.”
There is a possibility that the functional group will increase infinitely by changing X to —NH ₂ .
[0007]
The general formula of the silane coupling agent of the present invention is as follows.
[Chemical formula 5]

In the formula, Y represents —O—, —NH—, or NR—, preferably —NH—. R means a lower alkyl group and has 1 to 3 carbon atoms. X is a functional group (amino group, COOH group) that binds to the organic material for example the nucleotide sequence such as a terminus of, -NH _2, it refers to -OH. a, b, c, and d each mean an integer of 1 to 100 (b and c may be 0), but are generally integers of 1 to 10 each. More generally, it is an integer of 1-5. n means an integer of 2 to 100, but is generally an integer of 2 to 10. More generally, it is an integer of 2-5.
[0008]
Preparation of the silane coupling agent of this invention can be achieved according to a method known per se. A silane coupling agent having a plurality of functional groups can be synthesized, for example, as follows.
(CH ₃ O) ₃ Si (CH ₂ ) ₃ Cl + N (CH ₂ CH ₂ NH ₂ ) ₃
Autoclave ―――――――― → (CH ₃ O) ₃ Si (CH ₂ ) ₃ NHCH ₂ CH ₂ N (CH ₂ CH ₂ NH ₂ ) ₂
100 ℃ 20hrs
[0009]
The silane coupling agent thus provided is hydrolyzed with, for example, water to form silanol by a known method, adsorbed on the surface of the inorganic material by hydrogen bonding from the oligomer state, and further dehydrated and condensed to be fixed to the inorganic material. A method for the introduction of functional groups is provided. The introduced functional group has at least two or more functional groups with respect to the bond 1 with the inorganic material, and provides a material having a very high functional group density. If an organic material carrying various gene information is immobilized on this material via a functional group, an extremely high density and efficient method for preparing a gene chip, for example, is provided.
【Example】
[0010]
Example 1 Synthesis of Silane Coupling Agent The treatment was performed according to the following reaction formula.
(CH ₃ O) ₃ Si (CH ₂ ) ₃ Cl + N (CH ₂ CH ₂ NH ₂ ) ₃
―――――――― → (CH ₃ O) ₃ Si (CH ₂ ) ₃ NHCH ₂ CH ₂ N (CH ₂ CH ₂ NH ₂ ) ₂
Autoclave (100 ℃ 20hrs)
[0011]
As a synthesis example, a synthesis of two functional group branches in the above reaction formula is shown.
Synthesis method:
Dissolve (3-Chloropropyl) trimethoxysilane 2.0 g (0.01 mole) in 20 ml of methanol, add 3.0 g (0.02 mole) of tri (2-aminoethyl) amine, and stir reaction in an autoclave at 100 ° C. for 20 hours. The reaction solution is poured into water, made alkaline with an aqueous caustic soda solution, and extracted with ether. After drying the ether layer with bow glass, the solvent is distilled off. The obtained oil was eluted by column chromatography to isolate the desired product. The target product was confirmed by elemental analysis as follows.
Anal. Calcd. For C ₁₂ SiH ₃₂ O ₃ N ₄ ; C: 46.75 Si: 9.09 H: 10.39 N: 18.18
Found C ； 47.09 Si: 9.03 H: 10.01 N: 17.69
[0012]
Branch functional groups was carried out in 10 hours with _{_{_{N (CH 2 CH 2 NH 2}}} ) 3 in instead _{_{_{_{NH 2 CH 2 CH 2 NHCH 2}}}} CH 2 NH 2 3g (0.03mole) 1 one in which (other The operation of is the same). Those obtained is _{_{(CH 3 O) 3 Si (}} CH 2) 3 NHCH 2 CH 2 N H CH 2 CH 2 NH 2. (Conventional product level)
[0013]
Example 2 Immobilization to an inorganic material Molecular formula synthesized in Example 1

The silane coupling agent was made into a 2% aqueous solution and stirred for 1 hour, and then a microscope slide glass was immersed therein. After 1 hour, the slide glass was washed to remove excess silane coupling agent, and then baked at 110 ° C. for 10 minutes to be fixed.
[0014]
Example 3 Introduction of organic material To this slide glass, 1 μl of a 0.5 mM oligonucleotide probe having a hydroxysuccinimide group at the 5 ′ end and Cy5 introduced into the chain was dropped and allowed to stand for 1 hour. Nucleotide probes were immobilized. As a control, treated with a conventional silane coupling agent (1) KBM-603: N-β (aminoethyl) γ-aminopropyltrimethoxysilane, 2) KBM-903: γ-aminopropyltrimethoxysilane This was also performed using a slide glass.
Unreacted excess probe was washed away, and the introduction of the organic material was completed.
[0015]
Example 4 Evaluation The density of the Cy5-labeled probe immobilized on the slide glass obtained in Evaluation Example 3 was evaluated by the fluorescence intensity. The result is shown in FIG. By treating with the silane coupling agent of the present invention, a fluorescence intensity about 1.8 times that of the conventional silane coupling agent was observed. That is, it became clear that the density of the functional group introduced on the slide glass increased.
【The invention's effect】
The present invention has succeeded in providing a reagent having an increased density of functional groups introduced on a slide glass as compared with a conventional silane coupling agent.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a comparative diagram showing the density of fluorescence intensity of a Cy5-labeled probe immobilized on a slide glass of Example 4.

Claims

A method for preparing a gene chip, comprising the step of introducing a functional group into an inorganic material by a silane coupling agent represented by the following formula in the method for preparing a gene chip .

“Wherein Y is —O—, —NH—, NR—; X is —NH ₂ , —OH; a and d are 1 to 100, b and c are integers from 0 to 100; n represents an integer of 1 to 100; R represents lower alkyl.

The method for preparing a gene chip according to claim 1, wherein a and d are 1 to 10, b and c are integers of 0 to 10, and n is 1 to 10.

The method for preparing a gene chip according to claim 1 or 2, further comprising a step of immobilizing an oligonucleotide probe on an inorganic material via a functional group .