JP4151901B2

JP4151901B2 - 液体クロマトグラフィーによる分離方法。

Info

Publication number: JP4151901B2
Application number: JP2003344071A
Authority: JP
Inventors: 賢宮下
Original assignee: Nippon Soda Co Ltd
Current assignee: Nippon Soda Co Ltd
Priority date: 2003-10-02
Filing date: 2003-10-02
Publication date: 2008-09-17
Anticipated expiration: 2023-10-02
Also published as: JP2005106760A

Description

本発明は、多糖誘導体を有効成分とする分離剤を用いる液体クロマトグラフィーによる有機混合物の分離方法に関する。

従来、多糖誘導体あるいはこれをシリカゲルなどの担体に坦持した分離剤は、液体クロマトグラフィー用固定相として優れた特色を示すことから、光学異性体をはじめとする様々の構造的に類似した化合物群（以下、「有機混合物」ということがある。）の分離に多用されている。

また、この分離剤を使用する液体クロマトグラフィーにおいては、分離したい化合物の種類によっては、溶離曲線のピーク形状が異常に幅広くなり、分離が不十分となる場合があるため、分離が困難な化合物群の分離を改善する方法がいくつか提案されている。

例えば、特許文献１には、多糖誘導体を有効成分とする分離剤を用いて液体クロマトグラフィーを行うとき、移動相として水と水溶性有機溶剤の１００：０〜０：１００の混液に、過塩素酸ナトリウム等のカチオトロピック性が強い塩類を添加した液を用いることを特徴とする液体クロマトグラフィーによる分離方法が提案されている。
特許文献２には、多糖誘導体を有効成分とする分離剤を用いて液体クロマトグラフィーを行うとき、順相移動相中に各種の塩を添加することを特徴とする液体クロマトグラフィーによる分離方法が提案されている。
また、特許文献３には、多糖誘導体を有効成分とする分離剤を用いた液体クロマトグラフィーによる光学異性体の分離において、逆相条件下で塩基性移動相を用いる光学異性体分離方法が開示されている。

しかしながら、上記特許文献１〜３に記載の技術を適用しても、アデニン誘導体のような塩基性化合物を順相移動相により分離する場合においては、分離が不可能もしくは分離が不十分であることが多く問題となっていた。

特開平５−８５９４７号公報特開平５−１８０８１８号公報特開平１１−１８９５５１号公報

本発明は、上述した問題に鑑みてなされたものであり、多糖誘導体を有効成分とする分離剤を用いた液体クロマトグラフィーによる有機混合物の分離方法において、特にアデニン誘導体のような塩基性化合物を確実に分離できる液体クロマトグラフィーによる有機混合物の分離方法を提供することを課題とする。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、多糖誘導体を有効成分とする分離剤を用いた液体クロマトグラフィーにより分離するに際し、順相移動相に僅かに水を添加すると、これまで分離することができなかったアデニン誘導体の光学異性体混合物の分離を改善することができ、よりシャープな溶離曲線のピークを得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。

かくして本発明によれば、多糖誘導体を有効成分とする分離剤を用いる液体クロマトグラフィーによる分離方法であって、有機溶媒からなる順相移動相中に、５００〜５０００ｐｐｍの濃度となる水を添加することを特徴とする有機混合物の液体クロマトグラフィーによる分離方法が提供される。
本発明の分離方法においては、前記有機混合物が、塩基性有機化合物の光学異性体混合物であるのが好ましい。

本発明によれば、多糖誘導体を有効成分とする分離剤を用いる液体クロマトグラフィーによる分離方法において、順相移動相中に少量の水を添加する簡便な方法により、従来分離困難あるいは分離不可能であった有機混合物を確実に分離することができる。

本発明の詳細な作用機構は不明であるが、（ｉ）充填剤表面の極性が増し、アデニン誘導体の吸着が起こりにくくなる、(ii)光学活性カラムの充填剤担体であるシリカゲル中の微量な金属にアデニン誘導体が配位してテーリングしていた場合に、移動相に水を添加することで、シリカゲル表面を水の分子が覆い、配位を防ぎピーク形状が改善される、などの理由が考えられる。

従来の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析においては、移動相中の水量の変化はリテンションタイムの変動原因となるため、移動相ボトルヘシリカゲル塔を設置するなどして外気中の水蒸気による移動相の吸湿を防いでいた。また、これと同様に、順相系のキラルカラムを用いた分離においても、移動相中の水は分離度に悪影響を与えることが知られている。影響を与える水の量は１００ｐｐｍ〜７００ｐｐｍ程度であり、５００ｐｐｍを超える場合に急激に分離度が低下し、分離ができなくなる例もあるため、分離状態の厳しい分析条件では、移動相中の水分量もコントロールしなければならないというのが一般的であった。

これに対し、本発明の分離方法は、順相移動相へ水を濃度が５００ｐｐｍ〜５０００ｐｐｍとなるように添加することにより、溶離曲線のピーク形状を鋭くして、従来分離困難であった有機化合物の分離を可能とするものである。

本発明の有機混合物の液体クロマトグラフィーによる分離方法は、多糖誘導体を有効成分とする分離剤を用いるものであって、有機溶媒からなる順相移動相中に、５００〜５０００ｐｐｍの濃度となる水を添加することを特徴とする。

本発明に用いる分離剤は多糖誘導体を有効成分とする。
用いる多糖誘導体は、多糖の有する水酸基上の水素原子の一部あるいは全部、好ましくは８５％以上を置換基で置換したものである。
前記多糖誘導体の原料となる多糖は、合成多糖、天然多糖、及び天然変性多糖のいずれかを問わず、光学活性であればいかなるものでもよいが、好ましいのは、高純度の多糖が容易に得られるセルロース、アミロース、β−１，４−キトサン、キチン、β−１，４−マンナン、β−１，４−キシラン、イヌリン、α−１，３−グルカン、β−１，３−グルカンである。これら多糖の数平均重合度（一分子中に含まれるピラノース環またはフラノース環の平均数）は５以上であり、特に上限はないが、取り扱い性の観点から、５００以下であることが好ましい。

本発明に用いる多糖誘導体としては、上記多糖のエステル誘導体、カルバメート誘導体、エーテル誘導体等が挙げられる。なかでも、カルバメート誘導体又はエステル誘導体が好ましく、芳香族カルバメート誘導体または芳香族エステル誘導体が特に好ましい。
本発明に用いる多糖誘導体の好ましい具体例としては、下記に示すものが挙げられる。

（式中、ｎは任意の自然数を表し、Ｒ’はメチル基等のアルキル基、メトキシ基等のアルコキシ基、塩素等のハロゲン原子等の置換基を表し、ｍは０から５の整数を表す。また、ｍが２以上のとき、Ｒ’は同一でも相異なっていてもよい。）

これらの中でも、本発明においては、アミローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）、セルローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）、セルローストリス（ベンゾエート）、またはセルローストリス（４−メチルベンゾエート）の使用が特に好ましい。

上記の多糖誘導体を分離剤として用いるには、そのものを粒子状にするか、またはシリカゲルなどの担体に担持する。通常、担体に担持されたものが多く使用される。また、光学異性体分割剤として市販されているものをそのまま使用することもできる。

本発明においては、液体クロマトグラフィーの展開溶媒として、順相系の移動相（順相移動相）を用いる。順相系とは、固定相（多糖誘導体を有効成分とする分離剤）よりも極性の低い移動相を用いることをいう。順相移動相の有機溶媒成分としては、例えば、ｎ−ヘキサンなどの非極性溶媒とこれと相溶する極性溶媒、好ましくはアルコール類を一成分あるいは多成分混合した液を用いることができる。

本発明の分離方法は、順相移動相として、上述した有機溶媒成分に、５００〜５０００ｐｐｍ、好ましくは１０００〜５０００ｐｐｍの濃度となるように水を添加した混合溶媒を用いることを特徴とする。
有機溶媒成分に添加する水は特に制限されないが、不純物の少ない蒸留水や脱イオン水の使用が好ましい。

本発明によれば、移動相へ水を所定量添加するという簡便な方法により、溶離曲線のピーク形状を改善することができ、従来分離が不可能又は分離が困難であった有機混合物を確実に分離することが可能となる。

本発明の方法によれば、メモリー効果の心配がない。メモリー効果とは、酸性化合物をキラルカラムにより、順相移動相を用いて分離する場合に、溶離曲線のピーク形状を改善する目的で移動相へ有機酸（ＴＦＡなど）を添加して分析した後に、中性化合物の分析をＴＦＡなどの入っていない移動相を用いて分析すると、溶離曲線のピーク形状および分離度が悪化し、再現性が得られなくなる現象である。順相系のキラルカラムでは、しばしば「メモリー効果」が問題となるが、本発明の方法によれば、このようなメモリー効果は生じない。したがって、本発明の方法を実施した後に、水を含まない順相移動相を用いても、分離能が低下することはない。

また、本発明の方法によれば、低波長側のみにＵＶ吸収を持つ化合物であっても十分に検出可能であり、高い検出感度を得ることができる。すなわち、溶離曲線のピーク形状を改善する目的で移動相へ有機酸あるいは有機塩基を添加し、ＵＶ検出器により分析を行う場合には、有機酸あるいは有機塩基の添加によるＵＶカットオフの問題がある。つまり、移動相へ有機酸・有機塩基を添加することにより、バックグラウンドが上昇し、測定可能ＵＶ波長が高波長側に制限されてしまうためである。例えば、ｎ−ヘキサン／エタノール系の移動相を用いる際に、移動相へＤＥＡを０．１％添加した場合は、本来ＵＶ２３０ｎｍでの分析が可能であるはずが、ＤＥＡの添加により２５０ｎｍ以上としないとバックグラウンドが高くなり、分析困難となる。分析対象化合物が全て高波長側にＵＶ吸収を持っていれば問題ないが、現実には低波長側のみに吸収をもつ化合物も珍しくない。

一方、本発明の方法は順相移動相に少量の水を添加するものである。水は１８５ｎｍ以下の波長のＵＶを吸収するものの、実質的にＵＶ吸収がないため、低波長側のみにＵＶ吸収を持つ化合物であっても充分に検出可能であり、検出感度を高めることができる。
また、移動相へ添加しているのは微量な水であるため、分取などを行う際の後処理も有利である。

なお、移動相への水の添加による分析用カラムヘの影響については、水添加移動相を１５０時間連続通液後に、水を添加していない移動相に切り替え、アデニン誘導体を分析し、リテンションタイムおよびテーリングした溶離曲線のピーク形状が水添加前の状態と同一であったことから、このような影響はないと考えられる。

本発明の分離方法の対象とする有機混合物は、化学構造や、物理的性質、化学的性質が近似する有機化合物の混合物である。例えば、光学異性体混合物、ジアステレオマーなどの立体異性体混合物、位置異性体混合物、幾何異性体混合物、不飽和度の異なる化合物の混合物、ホモローグに属する化合物群などが挙げられる。

これらの中でも、本発明の分離方法は、好ましくは、塩基性有機化合物の光学異性体混合物をそれぞれの光学異性体に分離する場合に、より好ましくは、アデニン誘導体の混合異性体混合物をそれぞれの光学異性体に分離する場合に適用することができる。

本発明を実施するには、通常の液体クロマトグラフィーの手法をそのまま用いればよい。すなわち、多糖誘導体を有効成分とする分離剤をカラムに充填し、分離したい有機混合物を該カラム上部にチャージングし、有機混合物を充填剤に完全に吸着させた後、上部から一定速度で順相移動相を流下させることで実施できる。

本発明の分離方法は、順相移動相として、５００〜５０００ｐｐｍの水を含む混合溶媒を用いることにより、有機物の溶離曲線のピーク形状をシャープにして、分離能を高める点にあるが、順相移動相の組成や、その流下速度を変化させることにより、分離能をより高めることができる場合がある。

次に本発明を実施例および比較例により更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

（１）分離対象化合物
下記に示す（Ｒ）−９−（２’−ヒドロキシプロピル）アデニン（化合物（１Ｒ））、および（Ｓ）−９−（２’−ヒドロキシプロピル）アデニン（化合物（１Ｓ））の混合試料溶液を用いて分析を行った。試料は、化合物（１Ｒ）及び化合物（１Ｓ）のそれぞれを約０．５ｍｇずつ量り取り、エタノール５ｍｌに溶解させ、０．２μｍミリポアフィルターにより濾過した後に、それぞれ約１ｍｌを秤取し、混合して調製した。

（２）キラルカラム
キラルカラムについては、次のものを使用した。
・キラルカラム（Ａ）：セルローストリス（３，５−ジメチルフェニルカーバメート）（商品名：Ｏｐｔｉ−ＰａｋＸＣ、ダイセル化学（株）製）
・キラルカラム（Ｂ）：セルローストリス（４−メチルベンゾエート）（商品名：ＣＨＲＡＬＣＥＬＯＪ−Ｈ、ダイセル化学（株）製）

（３）分離条件
(i)分析用カラム：上記キラルカラム（Ａ）または（Ｂ）
平均粒子径：１０μｍ
カラムの大きさ：３．９ｍｍφ×３００ｍｍ（Ｓ／ＮＣ８４２０３７１）
(ii)流量：０．４ｍｌ／ｍｉｎ
(iii)カラムオーブン：４０℃
(iv)検出波長：ＵＶ２５４ｎｍ
(v)検出感度：０．０３２ＡＵＦＳ（検出器インティグレーダー出力：ｌＶ／ＡＵ）

実施例１
キラルカラム（Ａ）を使用し、移動相組成をｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝８００／２００（体積比）として移動相へ、濃度が１０００ｐｐｍとなる量の水を添加した。相溶溶媒である２−プロパノールを添加することにより、ｎ−ヘキサンと水の均一化を図った。移動相へ水を１０００ｐｐｍ添加した際の溶離曲線を図１に示す。図１中、横軸はリテンションタイム（分）、縦軸はピーク強度をそれぞれ示す（以下の図にて同じである。）。図１より、通常の順相移動相に水を添加したことにより、化合物（１Ｒ）と化合物（１Ｓ）とを分離することができた。

比較例１
実施例１において、移動相組成をｎ−ヘキサン／エタノール＝１０００／１００（体積比）とした以外は実施例１と同様に操作した。溶離曲線を図２に示す。
図２から明らかなように、水を添加しない通常の順相移動相では、化合物（１Ｒ）と化合物（１Ｓ）とを分離することができなかった。

比較例２
比較例１において、順相移動相ヘジエチルアミンを０．１体積％添加してピーク形状の変化を観察した。溶離曲線を図３（ａ）、（ｂ）に示す。図３（ａ）と（ｂ）から明らかなように、比較例１の順相移動相へジエチルアミンを０．１体積％添加しても、溶離曲線のピーク形状はシャープにならなかった（ピーク形状は改善されなかった）。

また、図示を省略しているが、比較例１において、順相移動相ヘジエチルアミンを０．５体積％添加してピーク形状の変化を観察したが、溶離曲線のピーク形状はシャープにならなかった。

実施例２
実施例１において、キラルカラム（Ｂ）を使用し、移動相組成をｎ−ヘキサン／２−プロパノール／水＝９００／１００／２（体積比）として、液体クロマトグラフィーによる分離を実施した。溶離曲線を図４に示す。
図４より、通常の順相移動相に水を添加したことにより、化合物（１Ｒ）と化合物（１Ｓ）とを分離することができた。

比較例３
実施例２において、移動相組成をｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝９００／１００（体積比）とした以外は実施例２と同様に操作した。溶離曲線を図５に示す。
図５から明らかなように、水を添加しない通常の順相移動相では、化合物（１Ｒ）と化合物（１Ｓ）とを分離することができなかった。

キラルカラムヘのダメージ確認
実施例１及び２で、移動相へ水を添加することにより、溶離曲線のピーク形状を改善できることを見出し、化合物（１Ｒ）と化合物（１Ｓ）とを分離することができたが、本来順相系の分析用カラムの移動相中の水は分離状態の悪化や分析カラムヘダメージを与える可能性がある。そこで、移動相に水を添加したキラルカラム（Ａ）及び（Ｂ）に、ｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝８００／２００（体積比）の移動相を十分に通液し、充填剤表面の水を取り除いた後に、ｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝９００／１５０（体積比）の移動相へ切り替え、アデニン誘導体を分析し、キラルカラムのダメージ状況を確認した。

検討した結果、移動相へ水を添加する前のように、Ｒ体、Ｓ体の何れもピークのテーリングが激しく、全く分離しておらず、検討を開始した時の状態が再現された。すなわち、キラルカラム（Ａ）及び（Ｂ）ヘのダメージはないことが確認された。また、水添加による効果が明確となった。

本発明は、液体クロマトグラフィーにより化合物と化合物を分離する方法に関するものであり、研究・製造管理などにおける分析や分取による精製の目的に用いることができる。

実施例１における試料の溶離曲線を表す図である。比較例１における試料の溶離曲線を表す図である。比較例２における試料の溶離曲線を表す図である。実施例２における試料の溶離曲線を表す図である。比較例３における試料の溶離曲線を表す図である。

Claims

多糖誘導体を有効成分とする分離剤を用いる液体クロマトグラフィーによる分離方法であって、有機溶媒からなる順相移動相中に、５００〜５０００ｐｐｍの濃度となる水を添加することを特徴とする液体クロマトグラフィーによる有機混合物の分離方法。
前記有機混合物が、塩基性有機化合物の光学異性体混合物であることを特徴とする請求項１記載の分離方法。