JP4167403B2 - Nucleic acid ligands that specifically bind to translation initiation factors - Google Patents
Nucleic acid ligands that specifically bind to translation initiation factors Download PDFInfo
- Publication number
- JP4167403B2 JP4167403B2 JP2001107735A JP2001107735A JP4167403B2 JP 4167403 B2 JP4167403 B2 JP 4167403B2 JP 2001107735 A JP2001107735 A JP 2001107735A JP 2001107735 A JP2001107735 A JP 2001107735A JP 4167403 B2 JP4167403 B2 JP 4167403B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rna
- seq
- sequence
- selection
- template
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 title claims description 41
- 102000005877 Peptide Initiation Factors Human genes 0.000 title claims description 38
- 108010044843 Peptide Initiation Factors Proteins 0.000 title claims description 38
- 239000003446 ligand Substances 0.000 title description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title description 3
- 108091008103 RNA aptamers Proteins 0.000 claims description 145
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 80
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 36
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 20
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 14
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 13
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 10
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 claims description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims 2
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 claims 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 43
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 42
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 35
- 101710091919 Eukaryotic translation initiation factor 4G Proteins 0.000 description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 23
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 14
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 13
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 13
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 11
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 11
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 10
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 10
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 8
- 102000002241 Eukaryotic Initiation Factors Human genes 0.000 description 7
- 108010014863 Eukaryotic Initiation Factors Proteins 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 7
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical group O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 5
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 5
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 5
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 5
- 102100033132 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit E Human genes 0.000 description 4
- 101000851079 Homo sapiens Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit E Proteins 0.000 description 4
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 4
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 4
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 4
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 101100232687 Drosophila melanogaster eIF4A gene Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 102000008016 Eukaryotic Initiation Factor-3 Human genes 0.000 description 3
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 3
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 3
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- -1 nucleoside triphosphates Chemical class 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 101000810330 Arabidopsis thaliana Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit E Proteins 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 101100072149 Drosophila melanogaster eIF2alpha gene Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 2
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 2
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 2
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 108090000944 RNA Helicases Proteins 0.000 description 2
- 102000004409 RNA Helicases Human genes 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000010365 information processing Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 101001082110 Acanthamoeba polyphaga mimivirus Eukaryotic translation initiation factor 4E homolog Proteins 0.000 description 1
- 108010024878 Adenovirus E1A Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020005098 Anticodon Proteins 0.000 description 1
- MEBONNVPKOBPEA-UHFFFAOYSA-N CC1C(C)(C)CCCC1 Chemical compound CC1C(C)(C)CCCC1 MEBONNVPKOBPEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000007120 DEAD-box RNA Helicases Human genes 0.000 description 1
- 108010033333 DEAD-box RNA Helicases Proteins 0.000 description 1
- 101000678286 Danio rerio Eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 3-like Proteins 0.000 description 1
- 101100011399 Danio rerio eif3ea gene Proteins 0.000 description 1
- 101000800913 Dictyostelium discoideum Eukaryotic translation initiation factor 4E-1A-binding protein homolog Proteins 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000800906 Drosophila melanogaster Eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 108010089790 Eukaryotic Initiation Factor-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000005289 Eukaryotic Initiation Factor-4A Human genes 0.000 description 1
- 108010056472 Eukaryotic Initiation Factor-4A Proteins 0.000 description 1
- 102000013446 GTP Phosphohydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108091006109 GTPases Proteins 0.000 description 1
- 108091006054 His-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150008815 INT6 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 208000035346 Margins of Excision Diseases 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 102100032139 Neuroguidin Human genes 0.000 description 1
- 101710203741 Neuroguidin Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108010046983 Ribonuclease T1 Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] dihydroxyphosphoryl hydrogen phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)O[32P](O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 201000000488 breast squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 102000010982 eIF-2 Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010037623 eIF-2 Kinase Proteins 0.000 description 1
- 108010091649 eIF-4gamma Proteins 0.000 description 1
- 101150048015 eIF1A gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000004265 eukaryotic small ribosome subunit Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 201000005243 lung squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000009790 rate-determining step (RDS) Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 208000013274 squamous cell breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、翻訳開始因子に特異的に結合する核酸（ＲＮＡアプタマー）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質の生合成は大多数の遺伝情報発現の最終段階であり、極めて重要な反応である。遺伝子からタンパク質への翻訳はmRNAの示す情報に従い、その翻訳開始コドンの位置でリボソーム、メチオニン-tRNA複合体(Met-tRNA)を含む開始複合体を作ることにより開始される。この翻訳開始複合体の形成の反応は幾つかのステップにより成り立っており、数々のタンパク質因子が逐次的に関与する複雑な反応である。真核細胞翻訳開始因子（eIF）は現在１２種類知られており、それらを構成するサブユニットや関連因子を含むと30種類以上のタンパク質が同定されている。40SリボソームサブユニットはeIF3とeIF1Aが結合した後、Met-tRNA・eIF2・GTP複合体が結合し43S 複合体を形成する。一方で、mRNA上では幾つかのeIFが翻訳開始の準備を行っている。eIF4FはeIF4E、eIF4A、eIF4Gからなる複合体の総称で、eIF4EはmRNAのcap構造に対し結合能を持ち、複合体をmRNAの5'末端に導く。eIF4GはeIF4E、 eIF4Aをまとめる骨格の役割を持つ。 eIF4AはATPase活性を有するRNA helicase でmRNAの5'末端非翻訳領域（5' UTR）に存在する2次構造をほどくことにより43S複合体が結合する部位を提示する。43S複合体がmRNAと結合し翻訳開始部位に到達すると、eIF5によりeIF2のGTPase活性が促進され、これにより複合体に結合していたeIFが解離し、その後60Sサブユニットが結合し、ポリペプチド伸長反応が始まる。これらのeIFのうち、eIF2α、eIF2B、eIF4E及びこれに結合してeIF4Eの機能を抑制するeIF4E binding protein (4E-BP)は細胞外のシグナルによりリン酸化・脱リン酸化が行われ、その活性が調節されている。しかし、多くのeIFを構成するサブユニットや関連因子の作用機序はよくわかっていない。
【０００３】
近年、癌や遺伝性疾患の中には、タンパク質への翻訳異常によるものが報告されていて、とくに癌化に関する情報が蓄積しつつある。eIF4Eは細胞内でその発現量は少なく、さらに細胞外シグナルによる機能発現調整が行われており、翻訳開始の律速段階といわれている。このeIF4EをNIH3T3やCHOなどの培養細胞中に過剰発現させると細胞の癌化が引き起こされる（L-Karatzas A., et al., Malignant transformation by a eukaryotic initiation factor subunit that binds to mRNA 5' cap, Nature, 345:544-547, 1990、De Benedetti A., et al., CHO cells transformed by the translation factor eIF4E display increased c-myc expression, but require overexpression of Max for tumorigenicity, Mol. Cell Diff., 2:347-371, 1994）。また実際、eIF4Eはヒトの乳癌や扁平上皮癌においてその発現量が上昇していることが報告されている（Kerekatte K. et al., The proto-oncogene/translation factor eIF4E: a survey of its expression in breast carcinomas, Int. J. cancer, 64:27-31, 1995、Nathan C. A. et al., Detection of the protooncogene eIF4E in surgical margins may predict recurrence in head and neck cancer, Oncogene, 15:579-584, 1997）。他のeIF4グループのタンパク質のeIF4Gでも、NIH3T3で過剰発現させることにより細胞の癌化が起ることが知られている（Shimogori T. F., et al., Malignant transformation by overproduction of translation intiation factor eIF4G, Cancer Res., 57:5041-5044, 1997）。さらに、肺癌の細胞中でeIF4G遺伝子の増幅が見られる（Brass N., et al., Translation initiaion factor eIF-4gamma is encoded by an amplified gene and induces an immune response in squamous cell lung carcinoma, Human Mol. Genet., 6:33-39, 1997）。また、 eIF4A1のmRNA量がヒト黒色腫において上昇している（Eberle J., et al., Translation initiation factor eIF-4A1 mRNA is consistently overexpressed in human melanoma cells in vitro, Int. J. Cancer, 71:396-401, 1997）。以上のようにeIF4グループの過剰発現によるeIF4F複合体量の増加と細胞の癌化は密接に関わっていることが報告されてきている。このeIF4F複合体量の増加が癌遺伝子などの病原遺伝子の翻訳量を上昇させ、癌化につながると考えられる。
【０００４】
さらに他のeIFも癌化との関係が示されており、eIF2αのリン酸化されない変異体や、eIF2αキナーゼの変異によって細胞が癌化する（Koromilas A. E., et al., Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase, Science, 257:1685-1689, 1992、Donze O., et al., Abrogation of translation initiation factor eIF-2 phosphorylation causes malignant transformation of NIH 3T3 cells, EMBO J., 14:3828-3834, 1995）。さらにeIF3のサブユニットの１つであるp48をコードする遺伝子はマウス乳腫瘍ウイルスの組込み部位で、仮想的な癌抑制遺伝子として知られていたint6と同一であることが報告され（Asano K., et al., The translation initiation factor eIF3-p48 subunit is encoded by int-6, a site of frequent integration by the mouse mammary tumor virus genome, J. Biol. Chem. 272:23477-23480, 1997）、さらに、最近になりヒトの肺癌と乳癌でのeIF3-p48の染色体部位のヘテロ染色体欠失(LOH)とeIF3-p48サブユニットの発現量の低下に相関関係があることが報告されている(Marchetti A., et al., Reduced expression of INT-6/eIF3-p48 in human tumors, Int. J. Oncol., 18:175-179, 2001)。このように、タンパク質の翻訳と癌化がより密接に関係していることが示されてきているが、そのメカニズムはまだよく分かっていない。現在明らかになっている遺伝子異常による癌患者は全体の数%でしかない。残り9割以上の原因を明らかにするためには、翻訳異常により引き起こされる癌化メカニズムの解明は重要な課題である。翻訳開始因子と特異的に結合する物質、生理活性を阻害する物質が得られれば、上記のような発症メカニズムの解明に役立つばかりでなく、その診断、治療薬として有望であるが、現在、この様なアプローチが行われているという報告はない。
【０００５】
ところで、in vitroにおいてある標的物質と特異的に結合するRNAを選択・濃縮する手法として、SELEX法と呼ばれる新たな手法が開発されている(C. Tuerk & L. Gold, Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase, Science 249:505-510, 1990)。SELEX法は、PCRプライマー用の配列（一方にはT7ポリメラーゼの配列を含む）を両端に含む適当な長さのランダム配列を持つRNAを合成し、これを標的タンパク質と会合させ固相化する。結合しなかったRNAを洗浄後、結合したRNAを回収し、RT-PCRで増幅後、次のラウンドで用いるRNAのテンプレートとする。これを１０ラウンド前後繰り返すことにより、標的タンパク質と特異的に結合するRNAアプタマーを取得する。この方法では、標的タンパク質と特異的に結合するRNA配列を明らかにできるだけでなく、標的タンパク質の機能を促進あるいは阻害するような生理活性を持つRNAを取得することが可能である。このことは病原タンパク質をターゲットにしてSELEXを行うことにより、得られたアプタマーを医薬品として応用できることを示唆している。従来の創薬に比べこのSELEX法を用いた創薬の優れている点として、（１）従来の化学物質のスクリーニングより大規模の母集団よりスクリーニングをシステマティックに行えること、（２）試験管内で容易に大量合成することができること、（３）免疫排除がないこと、（４）容易に合目的に改良を行えること、（５）保存性が高く抗体を作ることが困難なタンパク質を標的にできることなどがあげられる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、翻訳異常により引き起こされる疾患の発症機構の解明、診断および治療に利用可能な物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、この様な物質の候補として種々のeIFに対してSELEX法によるRNAアプタマーを作成した。すなわち、翻訳開始因子eIF4A1と、eIF4GのeIF4A1結合領域を含むペプチド（アミノ酸番号672-970；以下eIF4G(672-970)と記す）を標的タンパク質としてSELEXを行い、得られたアプタマーの標的タンパク質との結合活性、標的タンパク質の作用に与える影響を調べ、その有用性を示した。本発明は、これらの知見に基づいて、完成されたものである。
【０００７】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）配列番号１６〜３３、３８〜４３、５７および５８の塩基配列からなる群より選択される塩基配列を有するＲＮＡ。
（２）下記の塩基配列(I)〜(IV)の少なくとも１つを含み、翻訳開始因子に特異的に結合することができるＲＮＡ。
（３）下記の二次構造(A)〜(D)のいずれかをとることができるヌクレオチド配列を含み、翻訳開始因子に特異的に結合することができるＲＮＡ。
【０００８】
【化９】
【０００９】
【化１０】
【００１０】
【化１１】
【００１１】
【化１２】
（４）二次構造(A)が下記の二次構造(A1)、(A2)または(A3)のいずれかであり、二次構造(B)が下記の二次構造(B1)であり、二次構造(C)が下記の二次構造(C1)であり、二次構造(D)が下記の二次構造(D1)である（３）記載のＲＮＡ。
【００１２】
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載のＲＮＡの塩基配列に変異を導入したＲＮＡ。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載のＲＮＡの塩基配列中の少なくとも１個の塩基が修飾されているＲＮＡ。
（７）ＲＮＡが標識化されている（１）〜（６）のいずれかに記載のＲＮＡ。
（８）（１）〜（６）のいずれかに記載の少なくとも１つのＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ。
（９）（８）記載のＤＮＡが挿入されたベクター。
（１０）（１）〜（７）のいずれかに記載のＲＮＡを用いて、翻訳開始因子を検出および／または定量する方法。
（１１）配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
（１２）配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
（１３）（１１）記載のオリゴヌクレオチドおよび請求項１２記載のオリゴヌクレオチドからなる一対のプライマー。
【００１７】
（１）のＲＮＡ（ＲＮＡアプタマー）は、翻訳開始因子（例えば、翻訳開始因子eIF4A1またはeIF4G、特に、ヒト由来のもの）に特異的に結合することができる。本明細書において、「翻訳開始因子に特異的に結合する」とは、セレクションの最初に用いるランダム配列RNAと比較して翻訳開始因子との結合活性が有意に上昇していることをいう。ＲＮＡアプタマーと翻訳開始因子との結合活性は、以下のようにして調べることができる。1nM以下の32P標識したRNAアプタマーを様々な濃度の翻訳開始因子と、20 mM Tris-HCl (pH7.6), 80 mM K-acetate, 2.5 mM Mg-acetate, 1 mM DTT, 100 U/ml RNase Inhibitor, 10 μg/ml tRNA, 5 % glycerolの条件下で25℃で30分間インキュベーションした後、ニトロセルロース膜にRNAアプタマーと翻訳開始因子の複合体を吸着させ、非特異的に結合しているRNAアプタマーを洗浄後、膜に吸着した32Pのカウントを測定し、結合活性を定量する。
（１）のＲＮＡは、後述のSELEX法により取得することができる。
（１）のＲＮＡのうち、配列番号１６〜３３および３８〜４４の塩基配列からなる群より選択される塩基配列を有するＲＮＡは、ヒト翻訳開始因子eIF4A1に特異的に結合することができる（eIF4A1に対するRNAアプタマー）。eIF4A1に対するRNAアプタマーはeIF4A1のATPase活性を抑制することで過剰量のeIF4Fの機能を阻害し、腫瘍細胞の増殖を抑えることができると考える。また、（１）のＲＮＡのうち、配列番号５７および５８の塩基配列からなる群より選択される塩基配列を有するＲＮＡは、ヒト翻訳開始因子eIF4Gに特異的に結合することができる（eIF4Gに対するRNAアプタマー）。eIF4G(672-970)に対するRNAアプタマーは、eIF複合体の機能解析に有用であり、翻訳異常による疾患に対する診断薬として、また翻訳亢進による疾患に対する治療薬としての機能を持ちうると期待できる。
【００１８】
（２）のＲＮＡは、配列番号１６〜３３および３８〜４４の塩基配列中で保存されている配列（図４のBoxIで囲まれている配列（塩基配列(I))および図４のBoxIIで囲まれている配列（塩基配列(II)）または後述のselection2の方法で得られたRNAアプタマーの二次構造（コンピューターにより予測したもの）中に見出されたstem-loop構造の塩基配列（図８の二次構造において陰影をつけた部分の塩基配列(塩基配列(III)および(IV)）を含み、翻訳開始因子に特異的に結合することができるＲＮＡである。翻訳開始因子は、例えば、翻訳開始因子eIF4A1およびeIF4Gであり、特に、ヒト由来のものであるとよい。
（２）のＲＮＡは既知の化学合成法により取得することができる。また、化学合成を宝酒造などの企業に委託することもできる。
【００１９】
（３）のＲＮＡは、上記の二次構造(A)〜(D)のいずれかをとることができるヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
二次構造(A)には、後述のselection 1で取得されたGroup 2 clone no. -1、+42および+11の予測される二次構造（二次構造(A1)、(A2)および(A3)）（図５参照）が含まれる。
【００２１】
二次構造(A)において、N１は1個以上の核酸塩基であり、好ましくは6〜8個の核酸塩基である。N１は全ての核酸塩基を取りうる。N2aおよびN2bは相補的塩基対形成が可能な少なくとも１対の核酸塩基であり、好ましくは1〜4対の相補的塩基対形成が可能な核酸塩基である。N2aおよびN2bは全ての核酸塩基を取りうる。N3は４〜１１個の核酸塩基であり、好ましくは4〜6個の核酸塩基である。N3は全て核酸塩基を取りうる。N4はUまたはCであるが、N4がCの場合は塩基対を形成しない。N5aおよびN5bは相補的塩基対形成が可能な少なくとも２対の核酸塩基であり、好ましくは3〜6対の相補的塩基対形成が可能な核酸塩基である。N5aおよびN5bの好ましい核酸塩基対としては、C-Gを挙げることができる。N6は４〜１２個の核酸塩基であり、好ましくは4〜6個の核酸塩基である。N3は全ての塩基配列を取りうる。
【００２２】
二次構造(A)の構造の特徴として２つのstem-loop構造が挙げられる。生物界においてRNAがタンパク質の立体構造をまねて機能を有する「分子擬態」という概念が提出されている（Ito K., et al., A tripeptide 'anticodon' deciphers stop codons in messenger RNA, Nature, 403:680-684, 2000、Nakamura Y., et al., Mimicry grasps reality in translation termination, Cell, 101:349-352, 2000）。この概念は、RNAがstem-loop構造、シュードノット構造や分子内四重鎖構造(G-カルテット)などの安定な高次構造を作りタンパク質のような機能を発揮する可能性を示している。実際、このような高次構造を持つRNAの中にはタンパク質の機能ドメインと結合し、生理活性を有するものがある。二次構造(A)の２つのstem-loop構造もこのような安定な高次構造を作り、生理機能を与えていると考えられる。
【００２３】
二次構造(B)には、後述のselection 1で取得されたGroup 3 clone no. -14の予測される二次構造（二次構造(B1)）（図５参照）が含まれる。
【００２４】
二次構造(B)において、N11は1個以上の核酸塩基であり、好ましくは8〜12個の核酸塩基である。N11は全ての核酸塩基を取りうる。N12aおよびN12bは相補的塩基対形成が可能な少なくとも4対の核酸塩基であり、好ましくは5〜9対の相補的塩基対形成が可能な核酸塩基である。N12aおよびN12bの好ましい核酸塩基対としては、C-Gを挙げることができる。N13は４〜１１個の核酸塩基であり、好ましくは４〜7個の核酸塩基である。N13は全ての塩基配列を取りうる。
【００２５】
二次構造(B)の構造の特徴はstem-loop構造にある。これは二次構造(A)と同様に、安定な高次構造を作り生理機能を与えていると考えられる。
【００２６】
二次構造(C)には、後述のselection 2で取得された40merのclone no. 25の予測される二次構造（二次構造(C1)）（図８参照）が含まれる。
【００２７】
二次構造(C)において、N21aおよびN21bは相補的塩基形成が可能な少なくとも5対の核酸塩基対であり、好ましくは5〜７対の相補的塩基対形成が可能な核酸塩基である。N21aおよびN21bは全ての塩基対合を取りうる。N22は10〜20個の核酸塩基であり、好ましくは12〜14個の核酸塩基である。N22は全ての塩基配列を取りうる。N23およびN25は、それぞれ独立に、1〜5個の核酸塩基であり、好ましくは2または3個の核酸塩基である。N23およびN25の好ましい核酸塩基としては、Aを挙げることができる。N24aおよびN24bは相補的塩基形成が可能な少なくとも3対の核酸塩基対であり、好ましくは3〜5対の相補的塩基対形成が可能な核酸塩基である。N24aおよびN24bの好ましい核酸塩基対としては、C−Gを挙げることができる。N26aおよびN26bは相補的塩基形成が可能な少なくとも3対の核酸塩基対であり、好ましくは4〜8対の相補的塩基対形成が可能な核酸塩基である。N26aおよびN26bは全ての塩基対合を取りうる。N27は20〜30個の核酸塩基であり、好ましくは25〜28個の核酸塩基である。N27は全ての核酸塩基を取りうる。R21、R22およびR23は、それぞれ独立に、1個のプリン塩基であり、好ましいプリン塩基としては、R21はA、R22はG、R23はGを挙げることができる。Y21およびY22は、それぞれ独立に、1個のピリミジン塩基であり、好ましいピリミジン塩基としては、どちらもCを挙げることができる。
【００２８】
二次構造(C)の構造の特徴はやはりstem-loop構造にあり、二次構造(A)と同様に、安定な高次構造を作り生理機能を与えていると考えられる。
【００２９】
二次構造(D)には、後述のselection 2で取得された30merのclone no. 2の予測される二次構造（二次構造(D1)）（図８参照）が含まれる。
【００３０】
二次構造(D)において、N31aおよびN31bは相補的塩基形成が可能な少なくとも5対の核酸塩基対であり、好ましくは5〜8対の相補的塩基対形成が可能な核酸塩基である。N31aおよびN31bは全ての塩基配列を取りうる。N32およびN34は、それぞれ独立に、5〜15個の核酸塩基であり、好ましくは5〜７個の核酸塩基である。N32およびN34は全ての核酸塩基を取りうる。N33aおよびN33bは相補的塩基形成が可能な少なくとも3対の核酸塩基対であり、好ましくは3〜6対の相補的塩基対形成が可能な核酸塩基である。N33aおよびN33bの好ましい核酸塩基対としてはG-Cを挙げることができる。R31、R32およびR33は、それぞれ独立に、1個のプリン塩基であり、好ましいプリン塩基としては、 R31はA、R32およびR33はGを挙げることができる。Y31およびY32は、それぞれ独立に、1個のピリミジン塩基であり、好ましいピリミジン塩基としては、Y31はU、Y32はCを挙げることができる。
【００３１】
二次構造(D)の構造の特徴もstem-loop構造で、二次構造(A)と同様に、安定な高次構造を作り生理機能を与えていると考えられる。
【００３２】
ヌクレオチド配列の二次構造は、一般の遺伝情報処理ソフトウェア(GENETYX-MAC: ソフトウェア開発社製、DNASIS: 日立ソフトウェアエンジニアリング社製など)に塩基配列を入力して予測することができ、このような方法で、あるヌクレオチド配列が二次構造(A)〜(D)のいずれかをとることが予測された場合に、そのヌクレオチド配列は二次構造(A)〜(D)のいずれかをとることができるものとする。あるいはまた、ヌクレオチド配列の二次構造は、二本鎖RNAを特異的に切断するRNase V1や、一本鎖RNAを特異的に切断するRNase T1やRNase Aなどを用いてmapするような実験的な手法で確認してもよい。
（３）のＲＮＡは既知の化学合成法により取得することができる。また、化学合成を宝酒造などの企業に委託することもできる。
【００３３】
（１）〜（４）のＲＮＡは、30〜120 merの長さであるとよく、好ましくは、60〜90 merの長さである。
【００３４】
（５）の変異を導入したＲＮＡは、以下のようにして作製することができる。
（１）〜（４）のいずれかに記載のRNAアプタマーに対するテンプレートDNA配列に対して任意のプライマーを用いて高塩濃度やMnCl2の存在下でmutagenesis PCRを行うか、あるいはsite directed mutagenesis法で変異の入ったテンプレートDNAを作製し、これをRNAポリメラーゼの下流にクローン化し、in vitroで転写、精製することにより得ることができる。
（５）の変異を導入したＲＮＡは、より結合活性が高い、および／または生理活性の阻害効果が強いという利点を有しうる。
【００３５】
（２）〜（５）のＲＮＡは、（１）のＲＮＡと同様に、翻訳開始因子に特異的に結合し、その生理活性を阻害することができる。従って、これらのＲＮＡは、腫瘍細胞の増殖抑制あるいはeIF複合体の機能解析に有用であり、翻訳異常による疾患に対する診断薬として、また翻訳亢進による疾患に対する治療薬としての機能を持ちうる。
【００３６】
（６）のＲＮＡは、以下のようにして作製することができる。
In vitroでRNAアプタマーをテンプレートよりRNAポリメラーゼで転写する時に、ある塩基のヌクレオシド三リン酸の代わりに、その塩基に修飾の入ったヌクレオシド三リン酸を用いて転写を行い、転写産物を精製する。
【００３７】
本明細書において、「修飾塩基」とは、天然の核酸に見られる通常の塩基以外の塩基誘導体をいう。
【００３８】
修飾塩基を導入したＲＮＡアプタマーは、翻訳開始因子の機能解析に用いることができる。例えば、ＲＮＡアプタマーにBr-dUTPなどの修飾塩基を導入し、タンパク質と結合させたのちに紫外線を当ててアプタマーとタンパク質を共有結合させる。アプタマー、タンパク質を加水分解した後、高速液体クロマトグラフィーでアミノ酸分析を行うと、アプタマーとタンパク質の結合していた部分が分かる。
あるいはまた、RNA合成時に2'-fluoro UTP, 2'-fluoro CTP, 2'-amino UTP, 2'-amino CTP, 2'-hydroxy UTP, 2'-hydroxy CTPのうちの1種類または複数種類を導入することにより、RNAアプタマーの安定を高くすることができる。
【００３９】
（７）の標識化したＲＮＡは、以下のようにして作製することができる。
RNAアプタマーを5'-Oligolabelling Kit for Fluorescence(アマシャム・ファルマシア社製)により蛍光物質(fluorescein)で標識することができる。またRNAアプタマーのテンプレートを用いてRNA合成時に32Pラベルしたヌクレオチドを取り込ませることにより放射性同位体で標識することが、DIG RNA Labeling Kit(ロッシュ・ダイアグノスティック社製)の使用によりジゴキシゲニンで標識化することができる。
（７）の標識化したＲＮＡは、翻訳開始因子の検出・定量に用いることができる。例えば、蛍光物質で標識化したＲＮＡアプタマーと翻訳開始因子との結合をMulti-well plate reader(ABI社製)により確認することができる。修飾塩基を導入したアプタマーを標識化することにより、さらに感度を上げることができる。
【００４０】
（８）のＤＮＡは、（１）〜（６）のいずれかに記載の一つまたは複数のＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列を有する。
（８）のＤＮＡは、既知の化学合成法により作製することができる。また、化学合成を宝酒造などの企業に委託することもできる。
【００４１】
（９）のベクターは、以下のようにして作製することができる。
（１）〜（６）のいずれかに記載のRNAに対して配列番号1,2もしくは配列番号4,5をプライマーとしてRT-PCRを行い、これを後述のpUC-tRRなどのベクターにサブクローニングすることにより、作製することができる。また、化学合成により作製したDNA断片をベクターにサブクローニングすることにより作製できる。
【００４２】
（８）のＤＮＡおよび（９）のベクターは、癌などの翻訳異常による疾患の遺伝子治療に用いることができる。
【００４３】
（１）〜（７）のいずれかに記載のＲＮＡを用いて、翻訳開始因子を検出および／または定量することができる。これにより発症機構の分かっていない疾患が翻訳調節異常を伴うかどうかを明らかにすることができる。具体的な検出および／または定量方法の一例を以下に記載する。翻訳開始因子を含む溶液を96-well multi plate(コーニング社製)に分注、洗浄の後、蛍光物質で標識したRNAアプタマーを結合させる。洗浄の後、プレートリーダー(ABI社製など)で蛍光強度を測定することにより翻訳開始因子を定量することができる。
【００４４】
（１１）および（１２）のオリゴヌクレオチドは既知の化学合成法により製造することができる。また化学合成を宝酒造等の企業に委託することができる。
（１１）および（１２）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてSELEX法を行うことにより、翻訳開始因子に特異的に結合するＲＮＡアプタマーを取得することができる。
【００４５】
【発明の実施の形態】
本発明において用いたSELEX法の概略を図１に示す。
【００４６】
本発明ではランダム配列を含むテンプレートは2種類（ランダム配列が30merのものと40merのもの（図１参照））を用い、標的タンパク質の固相化、洗浄は3種類の方法(図２)でSELEXを行った。すなわち、i)のNi-agaroseによる固相化では、His-tagのついたタンパク質をNi-agaroseに結合させ、会合したRNA分子と伴にイミダゾールで溶出した。ii)のニトロセルロース膜による固相化、強い洗浄では、タンパク質-ＲＮＡ複合体をカートリッジに入ったニトロセルロース膜に吸着させ、注射筒を用いて洗浄したのち、フェノール／尿素溶液で溶出した。iii)のニトロセルロース膜による固相化、弱い洗浄では、タンパク質-ＲＮＡ複合体をニトロセルロース膜に吸着させ、洗浄液を入れたペトリ皿に移して５分２回、洗浄したのち、フェノール／尿素溶液で溶出した。i)は非特異的結合が少なくなる傾向があり、洗浄と抽出条件が緩やかで、ii)は洗浄条件が厳しいため強い結合力を持つものを選択できる可能性があり、iii)は比較的弱い結合力を持つものでも選択できる可能性がある。このうちii)、iii)は非特異的結合が多くなる傾向がある。eIF4A1に対するSELEXは40merの配列を用いた図２ i)の方法(selection 1)、40merの配列を用いた図２ ii)の方法(selection 2/40mer)、30merの配列を用いた図２ ii)の方法(selection 2/30mer) で行い、eIF4G(672-970)に対しては40merの配列(selection 3/40mer)と30merの配列(selection 3/30mer)を用いて、図２ i), ii)及びiii)の方法で行った。
【００４７】
selection 1; このselectionはHis-tagの付いたeIF4A1をNi2+-NTA agaroseに固相化し、40 merのランダム配列を持つRNAプールに対して行った。in vitroの実験よりeIF4A1はATP存在下でmRNAと結合し、ATPaseとhelicase活性を発揮することが知られている（Rogers G., et al., Biochemical and kinetic characterization of the RNA helicase activity of eukaryotic initiation factor 4A, J. Biol. Chem., 274:12236-12244, 1999）。このselectionでは得られたアプタマーがeIF4A1の natural targetとそうでないものに分別するためにselectionを1 mM ATP 存在と非存在下の２つの異なった条件で行った。9ラウンドまでselectionのサイクルを回した後、濃縮されてきたRNAアプタマープールを32Pでラベルし、eIF4A1に対する結合活性を測定した。その結果、ランダム配列のRNAプールに比べて結合活性の上昇が見られた（図３A）。これをクローン化し、ATP存在下でのselectionより４６クローン、ATP非存在下でのselection より４０クローンの塩基配列を決定した。その結果、いくつかの共通配列及び共通の二次構造が認められ、その共通配列に基づいて３つのグループに分類することができた（図４、５）。得られたRNAアプタマーはATP存在、非存在下での選択による特異的な配列は存在しなかった。それぞれのグループより幾つかのクローンの結合活性を調べた結果、グループ1のクローンno. +22ではランダム配列のRNAと同様で特異的な結合は見られなかったが、グループ２と３のクローンno. -1, no. -14, no. +11, no. +42では、ランダムRNAに比べ結合活性が上昇しており、その解離定数（Kd）は〜5μM程度であると思われた（図３B）。
【００４８】
結合活性が見られたグループ２、３のアプタマーでは共通配列（図４box I and II ; box IIは両グループに共通）が見られるが、これら共通配列はプライマー由来の配列と相補的で、stem構造を取ることが予想された。このことから、この塩基配列自体にはそれ程重要性はなく、stem構造を取ることが重要なのではないかと考えられる。また、それぞれのアプタマーの予想される二次構造でstem部分の配列と長さに多様性が見られ（図５）、これらにより結合能に差が見られることが期待されたが、顕著な差は見られなかった。
【００４９】
selection 2; 次に30 mer、40 merの2種類のランダムRNAプールに対して、30 merは12ラウンド、40 merは14ラウンドまでニトロセルロース膜を用いた固相化の方法でselectionを行った。40 merは15ラウンドのみ、Ni2+-NTA agaroseを用いた方法で行った。15ラウンド目にそれまでとは異なるselection法を採用したことにより、selection後のRNAプールの結合能が飛躍的に上昇した。これは、ニトロセルロース膜や、そのハウジングユニットなどに結合しているRNA分子が異なる系を用いることにより排除されたものと考えられる。それぞれの濃縮されたRNAプールの結合活性を調べたところ、30 mer、40 merともにランダム配列より強い結合が見られた(図６)。これらをクローン化し、それぞれ48クローンの塩基配列を決定した。30 merでは約1/3が、40 merでは約4/5が数カ所の塩基置換が見られるのみであり、相同配列であると考えられる。両者からいくつかのクローンを選び、結合活性を調べた(図７)。その結果、30 merのクローンより40 merのクローンの方が結合活性が高く、no.25が最も高い結合能を示した(Kd=〜3nM)。この結合活性は、平均的な抗原と抗体の結合活性（〜50nM）よりも一桁高いものであった。一方、この方法で得られた2種類のRNAアプタマー(30 mer no. 2、40 mer no.25)の二次構造をコンピューターで予測させたところ、ループ部分が1塩基だけ異なる共通のstem-loop構造が見出された(図８)。これは、この配列がeIF4A1に対する結合に直接関与している可能性を示している。そこで、この配列を持つ14 merと24 merの短いRNAを作成し、eIF4A1との結合能を調べたところ、特異的な結合活性は得られなかった（図９）。一方、30 merアプタマーの結合活性(Kd=〜100nM)は40 merアプタマーに比べると1/30程度であることから、後者の高い結合活性には共通配列以外の部分も重要と考えられる。そこで、得られたRNAアプタマーのeIF4A1との結合領域を調べるために結合活性の高かったRNAアプタマー(40 mer no.2)に対しmutagenesis PCRを行い、数塩基置換した変異アプタマーを作成し、これらのeIF4A1に対する結合活性を調べた。その結果、結合能を失わせる塩基置換の位置は、保存されていた配列だけではなくRNAアプタマー全体に渡ることがわかった（図１０）。以上から、これらのRNAアプタマーはその全領域でeIF4A1と結合していることが示唆された。
【００５０】
次にselection 1及びselection 2で得られたRNAアプタマーがeIF4A1のATPase活性を阻害するかを調べた。その結果、eIF4A1と結合活性があるRNAアプタマーは、ATPase活性を阻害したが、結合活性の見られなかったselection 1 no. +22では阻害効果が見られなかった（図１１）。阻害の強さはselection 2/40 merのアプタマーはselection 1のアプタマーよりも強いという、結合活性を反映する結果になった。selection 2/40 merでは１〜３倍量のRNAアプタマーでATPase活性をほぼ完全に抑えることができた。一方、selection 1のアプタマーでも１０倍量で５０〜８０％の活性阻害が見られた。これは結合活性の強さに比べて非常に高い阻害効果と言える。このことから、これらのRNAアプタマーはeIF4A1の生理機能に対する阻害効果を持つと考えられる。
【００５１】
selection 3；さらにeIF4G(672-970)に対しても、30 merと40 merの2種類のテンプレートを用い図２のi)、ii)の方法でselectionを12ラウンド行ったが、RNAプールの結合能はランダム配列と差が見られなかった。この原因として、固相化および洗浄の条件が厳しすぎた可能性があったのでiii)のより緩やかな条件でselectionを8ラウンド行った。その結果、30 mer、40 mer両方のRNAプールの結合活性が高くなっていた（図１２A）。これらをクローン化し塩基配列を決定した（図１２C）。幾つかのクローンを選び結合活性を測定した結果、40 mer no. 1及び40 mer no.4のクローンでKd=〜30nMという結合能を得た（図１２B）。
【００５２】
以上のように本発明ではeIF4A1及びeIF4Gに対するRNAアプタマーを取得した。本発明において幾つかの固相化・洗浄条件を検討したことにより、他のタンパク質に対してSELEXを行う場合のselection方法、RNAのランダム配列の長さの調節等の技術知識は十分に蓄積されたと考える。これに従えば、他のeIFに対してもRNAアプタマーを取得することできる。今後、より治療薬として適したRNAアプタマーを取得することが可能である。これらアプタマーのうち細胞内での翻訳阻害活性を持つものは、多くの癌遺伝子の発現抑制を行うことが可能である。また、腫瘍細胞に対して特異的に働かせる系を確立すれば、原因遺伝子に関わらず癌細胞の増殖を抑制する万能な治療薬となりうることも考えられる。
【００５３】
これら、eIFに対するRNAアプタマーを利用して以下の（１）〜（３）が可能となる。
（１）翻訳開始因子の機能解析: あるeIFを構成するタンパク質に対するアプタマーがそのタンパク質の生理機能を阻害したとき、タンパク質のどの部分がその生理機能を担っているかを明らかにすることができる。すなわち、アプタマーにBr-dUTP(Sigma社製)などの修飾塩基を導入し、タンパク質と結合させたのちに紫外線を当ててアプタマーとタンパク質を共有結合させる。アプタマー、タンパク質を加水分解した後、高速液体クロマトグラフィーでアミノ酸分析を行うと、アプタマーとタンパク質の結合していた部分が分かる。また、個々のeIFサブユニットからeIF複合体を再構成することが可能である。この系にタンパク質との結合部位が明らかとなっているRNAアプタマーを加えることにより、複合体形成を形成する際の個々のタンパク質同士の結合部位を明らかにすることができる。In vitro だけではなく、in vivo における機能解析も行うことができる。アプタマーを既知の遺伝子導入方法、Lipofection(GibcoBRL社製)を用いたリポフェクションや、GenePulser(BioRad社製)を用いたエレクトロポーレーションにより培養細胞に導入することができる。また、pUC-tRR(H. Kawasaki, et al. Selection of the best target site for ribozyme-mediated cleavage within a fusion gene for adenovirus E1A-associated 300 kDa protein (p300) and luciferase, Nucl. Acid. Res. 24:3010-3016, 1996)などの発現ベクターにアプタマーを組み込み、同様に培養細胞に導入することにより、アプタマーを細胞内で発現させることができる。これにより、アプタマーに培養細胞の癌化を抑制する作用があるかどうかを確かめることができる。
（２）治療薬としての応用: in vitro, in vivo で作用のあったアプタマーが治療薬として有効であるかどうかを調べることができる。既知の方法で癌を発症させた実験動物に培養細胞と同様の方法でアプタマーを血中、もしくは直接患部に投与して癌組織に変化が起これば、そのアプタマーは治療薬として有望である。このとき、アプタマーをより安定化させて効果を上げるために、既知の方法で修飾塩基を導入することができる。たとえば、RNA合成時に2'-fluoro UTP, 2'-fluoro CTP, 2'-amino UTP, 2'-amino CTP, 2'-hydroxy UTP, 2'-hydroxy CTP(JBL Scientific 社製など)のうち1種類、または複数種類を導入するとRNAアプタマーの安定を高くすることができる。
（３）診断薬としての応用: RNAアプタマーは抗体の特徴を有しているが、これはRNAアプタマーを抗体の変わりに「RNA抗体」として用いることができることを意味する。これまで抗体を用いて行われていた免疫染色・ELISAなどでこのRNA抗体を用いた新規の検出系が構築できる。すでにRNAアプタマーの5'末端を市販のキット(Amersham Pharmacia社製)により蛍光ラベルしたものとeIF4A1の結合をMulti-well plate reader(ABI社製)により確認している。修飾塩基を導入したアプタマーをラベルすることにより、さらに感度を上げることができる。すなわち、種々のアプタマーを用いた翻訳開始因子の定量的測定が可能である。これにより発症機構の分かっていない疾患が翻訳調節異常を伴うかどうかを明らかにすることができる。また、前述のように腫瘍細胞では正常細胞に比べeIFの発現量に異常が見られるという報告がある。さらに、ラットにおいて種々の癌細胞でeIF4EのmRNA量が異なっていることが報告されている（Miyagi Y., et al., Elevated levels of eukaryotic translation initiation factor eIF-4E, mRNA in a broad spectrum of transformed cell lines, Cancer Lett., 91:247-252, 1995）。このように腫瘍細胞の良性・悪性、さらには転移性の強さなどでeIFの発現パターンに違いがあることが予想される。アプタマーを用いてeIFの発現量の差を認識できる系をELISAやアプタマーのチップ化により確立することにより、安価で簡便でな癌診断が可能となる。さらに、種々のeIFに対してアプタマーを取得しカタログ化し、eIFの発現パターンを調べることにより、腫瘍の種類を識別できる診断法を開発することができる。
【００５４】
【実施例】
以下、本発明の実験の手法を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５５】
［実施例１］ タンパク質の精製
ヒトeIF4A1とヒトeIF４G(672-970)のサブクローンはカナダ・マクギル大学のNahum Sonenberg教授より提供された（Pause A. and Sonenberg N., Mutational analysis of a DEAD box RNA helicase: the mammalian translation initiation factor eIF-4A, EMBO J., 17: 7480-7489, 1998、 MorinoS., et al., Eukaryotic translation nitiation factor 4E (eIF4E) binding site and the middle one-third of the eIF4G constiturte the core domain for cap-dependent translation, and the C-terminal one-third functions as a modulatory region, Mol. Cell. Biol., 20: 468-477, 2000）。ヒトeIF4A1とヒトeIF4G(672-970)をコードするDNAをpET15bベクター(Novagen社製)にサブクローニングし、大腸菌BL21(DE3)株(Novagen社製)に形質転換した。BL21(DE3)株はT7RNAポリメラーゼをIPTG(Sigma社製など)の培地への添加により発現誘導でき、pET15bのクローニングサイト上流のT7プロモーターを稼働させ、目的遺伝子をヒスチジンのタグのついた融合タンパク質として大腸菌内で過剰発現させることができる。得られた形質転換体をLB/アンピシリン液体培地中で培養し、増殖速度が最大の時にIPTGを終濃度0.5mMになるように加えてヒトeIFの発現誘導をかけた。大腸菌を遠心回収し、超音波破砕後、ヒスチジンに対して結合能を持つNi2+-NTA agarose（Qiagen社製）を用いて粗精製し、さらに陰イオン交換カラムResuroce Q（Amercham Pharmacia biotech社製）により精製分離した。
【００５６】
［実施例２］ RNAアプタマーの取得
SELEX法を用いたin vitro RNA selectionはEllingtonらの方法（Ellington A.D. and Szostak J.W., In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands, Nature, 346:818-22, 1990）及びTuerkらの方法（Tuerk C. and Gold L., Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase, Science, 249:505-510, 1990）を改良して行った。in vitro selectionに用いたRNA poolは化学合成した以下のプライマー及びランダム配列テンプレート(グライナー・ジャパン社に合成依頼)より作成した。PCRで増幅させたランダム配列のDNA断片を転写のテンプレートとし、プライマーP1、P1'に含まれるT7RNAポリメラーゼのプロモーターより、in vitroでT7RNAポリメラーゼにより転写し、フェノール抽出とゲル濾過により精製した。
８〜１５ラウンドselectionを行った後、PCR産物はpGEM-T vector（Promega社製）にサブクローニング後、大腸菌株NovaBlue（Novagen社製）に形質転換し、単一クローンを得た。これらは、plasmidを抽出後DNA sequencer（model 377, ABI社製）で、以下のsequence primerを用いて塩基配列を決定した。
【００５７】
［実施例３］ RNA結合活性の測定
得られたRNAアプタマーの結合活性はニトロセルロース膜を用いて測定した。RNAアプタマーは［α-32P］CTP存在化で転写を行いRIラベルした。ラベルされたRNAアプタマーは種々の濃度のeIF4A1とbinding buffer中で混合し、25℃で30分間インキュベートした後、吸引ろ過装置で10 μg/ml tRNA存在下のbinding bufferで処理されたニトロセルロース膜を透過させ、１mlのbinding bufferで洗浄、乾燥後、膜に吸着した32Pのカウントをシンチレータ（Beckman社製）で測定した。系に加えた総RNAのラベルのカウントに対する、膜に吸着したカウントの相対量を結合効率としてグラフにプロットした。
【００５８】
共通ステム構造部分の短い配列は２つのオリゴヌクレオチド、T7-proとP-14あるいはP-24をアニーリングさせ、これをテンプレートとしてin vitroにおいてT7ポリメラーゼにより転写させ、精製してきた。
［実施例４］ ATPase活性の阻害効果の確認
eIF4A1はRNA存在下でATPase活性を示す。RNAアプタマー^によりATPase活性が上昇することが予備実験で示されたので、アッセイ系に過剰量のpoly(A)を加えることで影響が出ないようにして活性測定を行った。1 μM（最終濃度）のeIF4A1と0、0.1、0.3、1、3、10 μM（最終濃度）のRNAアプタマーをbinding buffer中で混合し、室温で15分間インキュベートした後、A260=25（最終濃度）のpoly(A)、0.1mM（最終濃度）のATP、0.125μCi（最終放射線量）の[γ-32P] ATP(6000 Ci/mmol)を加え、37℃で60分インキュベートした。遊離した無機リン酸をGrifoらの方法（Grifo J. A., et al., RNA-stimulated ATPase activity of eukaryotic initiation factors, J. Biol. Chem., 259:8648-8654, 1984）に従い抽出し、32Pカウントをシンチレータで測定した。RNAアプタマーを加えていない反応でのカウントに対する、相対量をグラフにプロットした。
【００６０】
［実施例５］ RNAアプタマー変異体の作成
pGEM-T vectorにクローン化してある40 mer no.2をテンプレートとし、プライマーP1とP2を用いて、PCR反応液中に0.75mMのMnCl2を加えPCR反応を行った。このPCR産物をpGEM-T vectorにクローン化し、塩基配列を確認した。得られたクローンをRNAに転写後、結合活性を測定した。
【００６１】
【発明の効果】
本発明により、翻訳開始因子に特異的に結合するＲＮＡアプタマーが提供された。本発明のＲＮＡアプタマーは、翻訳異常により引き起こされる疾患の発症機構の解明、診断および治療に利用可能である。
【００６２】
【配列表】
【配列番号１】
配列番号１は、プライマーP1の塩基配列を示す。
【００６３】
【配列番号２】
配列番号２は、プライマーP2の塩基配列を示す。
【００６４】
【配列番号３】
配列番号３は、40merランダム配列テンプレートの塩基配列を示す。
【００６５】
【配列番号４】
配列番号４は、プライマーP1'の塩基配列を示す。
【００６６】
【配列番号５】
配列番号５は、プライマーP2'の塩基配列を示す。
【００６７】
【配列番号６】
配列番号６は、30merランダム配列テンプレートの塩基配列を示す。
【００６８】
【配列番号７】
配列番号７は、sequence primerの塩基配列を示す。
【００６９】
【配列番号８】
配列番号８は、Group 1 clone no.+13 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００７０】
【配列番号９】
配列番号９は、Group 1 clone no.+7 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００７１】
【配列番号１０】
配列番号１０は、Group 1 clone no.+1 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００７２】
【配列番号１１】
配列番号１１は、Group 1 clone no.+45 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００７３】
【配列番号１２】
配列番号１２は、Group 1 clone no.+20 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００７４】
【配列番号１３】
配列番号１３は、Group 1 clone no.+2 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００７５】
【配列番号１４】
配列番号１４は、Group 1 clone no.+48 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００７６】
【配列番号１５】
配列番号１５は、Group 1 clone no.+22 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００７７】
【配列番号１６】
配列番号１６は、Group 2 clone no.+27 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００７８】
【配列番号１７】
配列番号１７は、Group 2 clone no.+31 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００７９】
【配列番号１８】
配列番号１８は、Group 2 clone no.+33 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００８０】
【配列番号１９】
配列番号１９は、Group 2 clone no.+41 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００８１】
【配列番号２０】
配列番号２０は、Group 2 clone no.+42 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００８２】
【配列番号２１】
配列番号２１は、Group 2 clone no.+38 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００８３】
【配列番号２２】
配列番号２２は、Group 2 clone no.+47 (selection 1の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００８４】
【配列番号２３】
配列番号２３は、Group 2 clone no.+11 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００８５】
【配列番号２４】
配列番号２４は、Group 2 clone no.-1 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００８６】
【配列番号２５】
配列番号２５は、Group 2 clone no.-2 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００８７】
【配列番号２６】
配列番号２６は、Group 3 clone no.+10 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００８８】
【配列番号２７】
配列番号２７は、Group 3 clone no.+15 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００８９】
【配列番号２８】
配列番号２８は、Group 3 clone no.+6 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００９０】
【配列番号２９】
配列番号２９は、Group 3 clone no.+46 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００９１】
【配列番号３０】
配列番号３０は、Group 3 clone no.+44 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００９２】
【配列番号３１】
配列番号３１は、Group 3 clone no.-13 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００９３】
【配列番号３２】
配列番号３２は、Group 3 clone no.-14 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００９４】
【配列番号３３】
配列番号３３は、Group 3 clone no.-18 (selection 1)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００９５】
【配列番号３４】
配列番号３４は、Group 2 clone no.-1の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００９６】
【配列番号３５】
配列番号３５は、Group 2 clone no.+11の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００９７】
【配列番号３６】
配列番号３６は、Group 2 clone no.+42の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００９８】
【配列番号３７】
配列番号３７は、Group 3 clone no.-14の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【００９９】
【配列番号３８】
配列番号３８は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 2 (selection 2)の塩基配列（40merのテンプレートに相補的な部分）を示す。
【０１００】
【配列番号３９】
配列番号３９は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 9 (selection 2)の塩基配列（40merのテンプレートに相補的な部分）を示す。
【０１０１】
【配列番号４０】
配列番号４０は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 15 (selection 2)の塩基配列（40merのテンプレートに相補的な部分）を示す。
【０１０２】
【配列番号４１】
配列番号４１は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 25 (selection 2)の塩基配列（40merのテンプレートに相補的な部分）を示す。
【０１０３】
【配列番号４２】
配列番号４２は、eIF4A1をターゲットにして、30merのテンプレートを出発点にSELEXを12ラウンド回した結果とれてきたclone no. 2 (selection 2)の塩基配列（30merのテンプレートに相補的な部分）を示す。
【０１０４】
【配列番号４３】
配列番号４３は、eIF4A1をターゲットにして、30merのテンプレートを出発点にSELEXを12ラウンド回した結果とれてきたclone no. 5 (selection 2)の塩基配列（30merのテンプレートに相補的な部分）を示す。
【０１０５】
【配列番号４４】
配列番号４４は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 25 (selection 2)の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【０１０６】
【配列番号４５】
配列番号４５は、eIF4A1をターゲットにして、30merのテンプレートを出発点にSELEXを12ラウンド回した結果とれてきたclone no. 2 (selection 2)の塩基配列（プライマーの配列と30merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【０１０７】
【配列番号４６】
配列番号４６は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 25 (selection 2)の保存領域の塩基配列を示す。
【０１０８】
【配列番号４７】
配列番号４７は、eIF4A1をターゲットにして、30merのテンプレートを出発点にSELEXを12ラウンド回した結果とれてきたclone no. 2 (selection 2)の保存領域の塩基配列を示す。
【０１０９】
【配列番号４８】
配列番号４８は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 2 (selection 2)の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を元に変異を導入した配列の塩基配列を示す。
【０１１０】
【配列番号４９】
配列番号４９は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 2 (selection 2)の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を元に変異を導入した配列の塩基配列を示す。
【０１１１】
【配列番号５０】
配列番号５０は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 2 (selection 2)の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を元に変異を導入した配列の塩基配列を示す。
【０１１２】
【配列番号５１】
配列番号５１は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 2 (selection 2)の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を元に変異を導入した配列の塩基配列を示す。
【０１１３】
【配列番号５２】
配列番号５２は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 2 (selection 2)の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を元に変異を導入した配列の塩基配列を示す。
【０１１４】
【配列番号５３】
配列番号５３は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 2 (selection 2)の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を元に変異を導入した配列の塩基配列を示す。
【０１１５】
【配列番号５４】
配列番号５４は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 2 (selection 2)の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を元に変異を導入した配列の塩基配列を示す。
【０１１６】
【配列番号５５】
配列番号５５は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 2 (selection 2)の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を元に変異を導入した配列の塩基配列を示す。
【０１１７】
【配列番号５６】
配列番号５６は、eIF4A1をターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを15ラウンド回した結果とれてきたclone no. 2 (selection 2)の塩基配列（プライマーの配列と40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を元に変異を導入した配列の塩基配列を示す。
【０１１８】
【配列番号５７】
配列番号５７は、eIF4Gをターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを8ラウンド回した結果とれてきたclone no. 1 (selection 3)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【０１１９】
【配列番号５８】
配列番号５８は、eIF4Gをターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを8ラウンド回した結果とれてきたclone no. 4 (selection 3)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【０１２０】
【配列番号５９】
配列番号５９は、eIF4Gをターゲットにして、40merのテンプレートを出発点にSELEXを8ラウンド回した結果とれてきたclone no. 7 (selection 3)の塩基配列（40merランダム配列テンプレートに相補的な部分）を示す。
【０１２１】
【配列番号６０】
配列番号６０は、塩基配列(IV)の塩基配列を示す。
【０１２２】
【配列番号６１】
配列番号６１は、T7-proの塩基配列を示す。
【０１２３】
【配列番号６２】
配列番号６２は、P-14の塩基配列を示す。
【０１２４】
【配列番号６３】
配列番号６３は、P-24の塩基配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】 SELEX法の概略。T7RNAポリメラーゼプロモーター配列とランダム領域を含むDNAを合成し、P1, P2をプライマーとしてPCRを行いテンプレートを得る。これから合成したRNAを標的物質と会合させ、結合したRNAを回収する。回収したRNAからRT-PCRにより次のラウンドへのテンプレートを得る。これを8〜15ラウンドを繰り返す。最終ラウンドでのRTーPCR産物ををクローニング、シークエンスに回す。特に楕円で示した複合体の固相化、洗浄、RNAの抽出の条件設定が重要である。
【図２】固相化、洗浄法。本発明で用いたアプタマーselection時の固相化と洗浄方法を模式的に示す。
【図３】 selection1で得られたRNAアプタマーのeIF4A1との結合活性。(A)ではselection後のRNAプールに対して、(B)ではそれらをクローン化し単一のRNAとして転写したものに対してアッセイを行った。タンパク質と結合し膜にトラップされた32PでラベルされているRNAのカウントを計測し、系に加えた総RNAのカウント数に対する相対比率を結合活性とし縦軸にプロットした。横軸は系に加えたeIF4A1の濃度を示す。
【図４】 selection 1で得られたRNAアプタマーの塩基配列。配列の相同性により便宜上３つのグループに分けられた。Boxで囲ってある配列がそれぞれで保存されていた配列を示す。グループ2と3では共通の配列（boxII）が見られた。矢印はその向きに相補的な配列を示す。
【図５】 selection 1で得られたRNAアプタマーの予想される二次構造。グループ2より-1、+11、+42の、グループ3より-14のアプタマーの二次構造を示す。グループ1ではグループ内で保存されている二次構造は見られなかった。小文字はプライマー由来の配列、大文字がSELEXで得られた配列を示す。グループ２、３で保存されている配列は（box IとII）プライマー由来の配列と相補鎖を形成する。図４で矢印で示した配列はstem構造をとる。しかし、stemの長さやbulgeの有無はクローンにより差があった。
【図６】 selection 2で得られたRNAアプタマーのeIF4A1との結合活性。(A)ではselection後のRNAプールに対して、(B)ではそれらをクローン化し単一のRNAとして転写したものに対しての結合活性を示す。
【図７】 selection 2で得られたRNAアプタマーの塩基配列。
【図８】 selection 2で得られたRNAアプタマーの予想される二次構造。
【図９】 RNAアプタマー保存領域とeIF4A1との結合活性。selection 2/30 merと40 merで見られた保存領域のみのRNAを作成し、eIF4A1との結合活性を測定した。(A)は転写産物の予想される二次構造を示す。（B）はニトロセルロース膜を用いたeIF4A1との結合活性の測定結果を示す。
【図１０】 eIF4A1との結合活性を失った変異の位置。selection 2 no. 2のアプタマーに対して変異を導入した。no. 2 のRNAアプタマーの二次構造に対して、変異の導入された位置と置換された塩基をその外側に記した。変異体は基本的に図に示された位置での一塩基置換であるが、四角で囲まれた塩基はその組み合わせで複数個置換が導入されていることを示す。
【図１１】 SELEXで得られたeIF4A1に対するアプタマーのeIF4A1のATPase活性への影響。(A)ではselection 1のアプタマーを(B)ではselection 2/40 merのアプタマーの結果を示している。縦軸には、RNAアプタマーを加えていない時の遊離リン酸のカウント数を100とした時の相対量をとり、横軸には加えたRNAアプタマーの量を示している。
【図１２】 selection 3で得られたeIF4G(672-970)に対するRNAプールの結合活性(A)、40mer RNAプールより得たクローンの結合活性(B)とその塩基配列(C)。
図１２Ａにおいて、40mer, 8thとは、eIF4G(672-970)をターゲットにして40merのテンプレートを出発点にSELEXを8ラウンド回した結果とれてきたRNAプールであり、30mer, 8thとは、eIF4G(672-970)をターゲットにして30merのテンプレートを出発点にSELEXを8ラウンド回した結果とれてきたRNAプールである。
図１２Bにおいて、40mer, 8th, no.1, 4, 7とは、eIF4G(672-970)をターゲットにして40merのテンプレートを出発点にSELEXを8ラウンド回した結果とれてきたRNA clone no.1, 4, 7である。
図１２Cにおいて、eIF4G, 40mer, 8th round, no.1, 4, 7とは、eIF4G(672-970)をターゲットにして40merのテンプレートを出発点にSELEXを8ラウンド回した結果とれてきたRNA clone no.1, 4, 7である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a nucleic acid (RNA aptamer) that specifically binds to a translation initiation factor.
[0002]
[Prior art]
Protein biosynthesis is the final stage of expression of the majority of genetic information and is an extremely important reaction. Translation from a gene to a protein is started by making an initiation complex containing a ribosome and a methionine-tRNA complex (Met-tRNA) at the position of the translation initiation codon according to the information indicated by the mRNA. The reaction for forming the translation initiation complex is composed of several steps, and is a complex reaction in which a number of protein factors are sequentially involved. Twelve types of eukaryotic translation initiation factor (eIF) are currently known, and more than 30 types of proteins have been identified including the subunits constituting them and related factors. The 40S ribosomal subunit binds to MIF-tRNA / eIF2 / GTP complex after eIF3 and eIF1A bind to form a 43S complex. On the other hand, several eIFs are preparing to start translation on mRNA. eIF4F is a general term for a complex consisting of eIF4E, eIF4A, and eIF4G. eIF4E has a binding ability to the cap structure of mRNA and guides the complex to the 5 ′ end of mRNA. eIF4G has a skeleton role to organize eIF4E and eIF4A. eIF4A is an RNA helicase with ATPase activity that presents a site to which the 43S complex binds by unraveling the secondary structure present in the 5 'end untranslated region (5' UTR) of mRNA. When the 43S complex binds to the mRNA and reaches the translation start site, eIF5 promotes the GTPase activity of eIF2, which dissociates the eIF that was bound to the complex, and then the 60S subunit binds to extend the polypeptide. The reaction starts. Among these eIFs, eIF2α, eIF2B, eIF4E and eIF4E binding protein (4E-BP), which binds to this and suppresses the function of eIF4E, are phosphorylated and dephosphorylated by extracellular signals, and its activity is It has been adjusted. However, the mechanism of action of the subunits and related factors that make up many eIF is not well understood.
[0003]
In recent years, some cancers and hereditary diseases have been reported due to abnormal translation into proteins, and information on canceration in particular is accumulating. The expression level of eIF4E is small in cells, and the function expression is regulated by extracellular signals, which is said to be the rate-determining step of translation initiation. When this eIF4E is overexpressed in cultured cells such as NIH3T3 and CHO, cell transformation is induced (L-Karatzas A., et al., Malignant transformation by a eukaryotic initiation factor subunit that binds to mRNA 5 'cap, Nature, 345: 544-547, 1990, De Benedetti A., et al., CHO cells transformed by the translation factor eIF4E display increased c-myc expression, but require overexpression of Max for tumorigenicity, Mol.Cell Diff., 2: 347-371, 1994). In fact, eIF4E has been reported to increase in human breast cancer and squamous cell carcinoma (Kerekatte K. et al., The proto-oncogene / translation factor eIF4E: a survey of its expression in breast carcinomas, Int. J. cancer, 64: 27-31, 1995, Nathan CA et al., Detection of the protooncogene eIF4E in surgical margins may predict recurrence in head and neck cancer, Oncogene, 15: 579-584, 1997) . Other eIF4 group proteins, eIF4G, are known to cause canceration of cells by overexpression with NIH3T3 (Shimogori TF, et al., Malignant transformation by overproduction of translation intiation factor eIF4G, Cancer Res ., 57: 5041-5044, 1997). Furthermore, amplification of eIF4G gene is seen in lung cancer cells (Brass N., et al., Translation initiaion factor eIF-4gamma is encoded by an amplified gene and induces an immune response in squamous cell lung carcinoma, Human Mol. Genet ., 6: 33-39, 1997). In addition, the mRNA level of eIF4A1 is increased in human melanoma (Eberle J., et al., Translation initiation factor eIF-4A1 mRNA is consistently overexpressed in human melanoma cells in vitro, Int. J. Cancer, 71: 396. -401, 1997). As described above, it has been reported that the increase in the amount of eIF4F complex due to overexpression of the eIF4 group and the canceration of cells are closely related. This increase in the amount of eIF4F complex is thought to increase the translation amount of pathogenic genes such as oncogenes, leading to canceration.
[0004]
In addition, other eIFs have been shown to be involved in carcinogenesis, and mutants that are not phosphorylated on eIF2α and eIF2α kinase mutations cause canceration of cells (Koromilas AE, et al., Malignant transformation by a mutant of the mutant IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase, Science, 257: 1685-1689, 1992, Donze O., et al., Abrogation of translation initiation factor eIF-2 phosphorylation causes malignant transformation of NIH 3T3 cells, EMBO J., 14: 3828-3834, 1995). Furthermore, the gene encoding p48, one of the subunits of eIF3, has been reported to be the integration site of mouse mammary tumor virus and is identical to int6 known as a hypothetical tumor suppressor gene (Asano K., et al., The translation initiation factor eIF3-p48 subunit is encoded by int-6, a site of frequent integration by the mouse mammary tumor virus genome, J. Biol. Chem. 272: 23477-23480, 1997), and more recently It has been reported that there is a correlation between heterochromosomal deletion (LOH) at the chromosomal site of eIF3-p48 and decreased expression level of eIF3-p48 subunit in human lung cancer and breast cancer (Marchetti A., et al., Reduced expression of INT-6 / eIF3-p48 in human tumors, Int. J. Oncol., 18: 175-179, 2001). Thus, it has been shown that protein translation and canceration are more closely related, but the mechanism is not well understood. Only a few percent of cancer patients with genetic abnormalities have been identified. In order to clarify the cause of the remaining 90% or more, elucidation of the mechanism of canceration caused by translational abnormality is an important issue. If a substance that specifically binds to a translation initiation factor or a substance that inhibits physiological activity is obtained, it not only helps to elucidate the onset mechanism as described above, but it is also promising as a diagnostic or therapeutic agent. There is no report that such an approach is taken.
[0005]
By the way, a new method called SELEX method has been developed as a method to select and concentrate RNA that specifically binds to a target substance in vitro (C. Tuerk & L. Gold, Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase, Science 249: 505-510, 1990). In the SELEX method, RNA having a random sequence of an appropriate length including a PCR primer sequence (including a T7 polymerase sequence at one end) is synthesized, and this is associated with a target protein and immobilized. After washing the unbound RNA, the bound RNA is recovered, amplified by RT-PCR, and used as an RNA template to be used in the next round. By repeating this around 10 rounds, an RNA aptamer that specifically binds to the target protein is obtained. In this method, it is possible not only to clarify the RNA sequence that specifically binds to the target protein, but also to obtain RNA having a physiological activity that promotes or inhibits the function of the target protein. This suggests that the aptamers obtained can be applied as pharmaceuticals by performing SELEX targeting pathogenic proteins. The advantages of drug discovery using this SELEX method compared to conventional drug discovery include: (1) screening systematically from a larger population than conventional chemical screening, and (2) in vitro. Be able to synthesize easily in large quantities, (3) No immune exclusion, (4) Easily improve for the purpose, (5) Be able to target proteins that are highly conserved and difficult to make antibodies Etc.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of this invention is to provide the substance which can be utilized for elucidation, diagnosis, and treatment of the onset mechanism of the disease caused by translational abnormality.
[Means for Solving the Problems]
Therefore, the present inventors created RNA aptamers by SELEX method for various eIFs as candidates for such substances. That is, SELEX was performed using the translation initiation factor eIF4A1 and a peptide containing the eIF4A1 binding region of eIF4G (amino acid number 672-970; hereinafter referred to as eIF4G (672-970)) as the target protein, and the obtained aptamer target protein The effects on the binding activity and the action of the target protein were investigated and their usefulness was demonstrated. The present invention has been completed based on these findings.
[0007]
The gist of the present invention is as follows.
(1) RNA having a base sequence selected from the group consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 16 to 33, 38 to 43, 57 and 58.
(2) RNA comprising at least one of the following base sequences (I) to (IV) and capable of specifically binding to a translation initiation factor.
(3) RNA comprising a nucleotide sequence that can take any of the following secondary structures (A) to (D) and capable of specifically binding to a translation initiation factor.
[0008]
[Chemical 9]
[0009]
Embedded image
[0010]
Embedded image
[0011]
Embedded image
(4) The secondary structure (A) is any of the following secondary structures (A1), (A2) or (A3), the secondary structure (B) is the following secondary structure (B1), The RNA according to (3), wherein the secondary structure (C) is the following secondary structure (C1) and the secondary structure (D) is the following secondary structure (D1).
[0012]
Embedded image
Embedded image
Embedded image
Embedded image
(5) RNA obtained by introducing a mutation into the base sequence of the RNA according to any one of (1) to (4).
(6) RNA in which at least one base in the base sequence of the RNA according to any one of (1) to (5) is modified.
(7) The RNA according to any one of (1) to (6), wherein the RNA is labeled.
(8) DNA having a base sequence complementary to the base sequence of at least one RNA according to any one of (1) to (6).
(9) A vector into which the DNA according to (8) is inserted.
(10) A method for detecting and / or quantifying a translation initiation factor using the RNA according to any one of (1) to (7).
(11) An oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 4.
(12) An oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 5.
(13) A pair of primers comprising the oligonucleotide according to (11) and the oligonucleotide according to claim 12.
[0017]
The RNA (RNA aptamer) of (1) can specifically bind to a translation initiation factor (for example, translation initiation factor eIF4A1 or eIF4G, particularly human-derived). In the present specification, “specifically binds to a translation initiation factor” means that the binding activity to the translation initiation factor is significantly increased as compared to the random sequence RNA used at the beginning of selection. The binding activity between the RNA aptamer and the translation initiation factor can be examined as follows. 1nM or less 32 P-labeled RNA aptamers with various concentrations of translation initiation factors, 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 80 mM K-acetate, 2.5 mM Mg-acetate, 1 mM DTT, 100 U / ml RNase Inhibitor, 10 After incubation for 30 minutes at 25 ° C under conditions of μg / ml tRNA and 5% glycerol, the complex of RNA aptamer and translation initiation factor is adsorbed to the nitrocellulose membrane, and the non-specifically bound RNA aptamer is washed After adsorbed on the membrane 32 Measure P count and quantify binding activity.
The RNA of (1) can be obtained by the SELEX method described later.
Among RNAs of (1), RNA having a base sequence selected from the group consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 16 to 33 and 38 to 44 can specifically bind to human translation initiation factor eIF4A1 (eIF4A1 RNA aptamer against). The RNA aptamer for eIF4A1 is thought to inhibit the function of an excessive amount of eIF4F by suppressing the ATPase activity of eIF4A1 and suppress the growth of tumor cells. In addition, RNA having a base sequence selected from the group consisting of the base sequences of SEQ ID NOS: 57 and 58 among RNAs of (1) can specifically bind to human translation initiation factor eIF4G (RNA against eIF4G Aptamer). The RNA aptamer for eIF4G (672-970) is useful for functional analysis of the eIF complex, and can be expected to have a function as a diagnostic agent for diseases caused by translational abnormalities and a therapeutic agent for diseases caused by enhanced translation.
[0018]
The RNA of (2) is a sequence conserved among the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 16 to 33 and 38 to 44 (sequence surrounded by BoxI in FIG. 4 (base sequence (I)) and BoxII in FIG. The base sequence of the stem-loop structure found in the enclosed sequence (base sequence (II)) or the secondary structure of RNA aptamer (predicted by computer) obtained by the method of selection2 described later (Fig. The RNA includes a shaded portion of the base sequence (base sequences (III) and (IV)) in the secondary structure of 8, and can specifically bind to a translation initiation factor. , Translation initiation factors eIF4A1 and eIF4G, and particularly preferably human-derived ones.
The RNA of (2) can be obtained by a known chemical synthesis method. In addition, chemical synthesis can be outsourced to companies such as Takara Shuzo.
[0019]
The RNA of (3) includes a nucleotide sequence that can take any of the secondary structures (A) to (D).
[0020]
Secondary structure (A) includes the predicted secondary structures of
[0021]
In secondary structure (A), N 1 Is one or more nucleobases, preferably 6-8 nucleobases. N 1 Can take all nucleobases. N 2a And N 2b Is at least one pair of nucleobases capable of forming complementary base pairs, and preferably 1 to 4 pairs of nucleobases capable of forming complementary base pairs. N 2a And N 2b Can take all nucleobases. N Three Is 4 to 11 nucleobases, preferably 4 to 6 nucleobases. N Three Can all take nucleobases. N Four Is U or C, but N Four When is C, it does not form a base pair. N 5a And N 5b Are at least two pairs of nucleobases capable of forming complementary base pairs, and preferably 3-6 pairs of nucleobases capable of forming complementary base pairs. N 5a And N 5b Preferred nucleobase pairs include CG. N 6 Is 4-12 nucleobases, preferably 4-6 nucleobases. N Three Can take all nucleotide sequences.
[0022]
Two stem-loop structures can be cited as a feature of the structure of the secondary structure (A). In the biological world, the concept of “molecular mimicry” in which RNA mimics the three-dimensional structure of a protein has been submitted (Ito K., et al., A tripeptide 'anticodon' deciphers stop codons in messenger RNA, Nature, 403 : 680-684, 2000, Nakamura Y., et al., Mimicry grasps reality in translation termination, Cell, 101: 349-352, 2000). This concept indicates the possibility that RNA may produce protein-like functions by creating stable higher-order structures such as stem-loop structures, pseudoknot structures, and intramolecular quadruplex structures (G-quartets). In fact, some RNAs having such a higher-order structure bind to the functional domain of the protein and have physiological activity. It is considered that the two stem-loop structures of the secondary structure (A) also create such a stable higher-order structure and provide physiological functions.
[0023]
The secondary structure (B) includes a predicted secondary structure (secondary structure (B1)) (see FIG. 5) of
[0024]
In secondary structure (B), N 11 Is one or more nucleobases, preferably 8-12 nucleobases. N 11 Can take all nucleobases. N 12a And N 12b Are at least 4 pairs of nucleobases capable of forming complementary base pairs, and preferably 5-9 pairs of nucleobases capable of forming complementary base pairs. N 12a And N 12b Preferred nucleobase pairs include CG. N 13 Is 4 to 11 nucleobases, preferably 4 to 7 nucleobases. N 13 Can take all nucleotide sequences.
[0025]
The feature of the secondary structure (B) is the stem-loop structure. Like the secondary structure (A), this is considered to provide a stable higher-order structure and impart physiological functions.
[0026]
The secondary structure (C) includes a predicted secondary structure (secondary structure (C1)) (see FIG. 8) of 40mer clone no. 25 obtained in
[0027]
In secondary structure (C), N 21a And N 21b Is at least 5 nucleobase pairs capable of forming complementary bases, and preferably 5-7 pairs of nucleobases capable of forming complementary base pairs. N 21a And N 21b Can take all base pairs. N twenty two Is 10 to 20 nucleobases, preferably 12 to 14 nucleobases. N twenty two Can take all nucleotide sequences. N twenty three And N twenty five Are each independently 1 to 5 nucleobases, preferably 2 or 3 nucleobases. N twenty three And N twenty five A preferred nucleobase is A. N 24a And N 24b Is at least 3 nucleobase pairs capable of forming complementary bases, and preferably 3-5 pairs of nucleobases capable of forming complementary base pairs. N 24a And N 24b As preferred nucleobase pairs, CG can be mentioned. N 26a And N 26b Are at least 3 nucleobase pairs capable of forming complementary bases, and preferably 4-8 pairs of nucleobases capable of forming complementary base pairs. N 26a And N 26b Can take all base pairs. N 27 Is 20-30 nucleobases, preferably 25-28 nucleobases. N 27 Can take all nucleobases. R twenty one , R twenty two And R twenty three Each independently represents one purine base, and preferred purine bases include R twenty one A, R twenty two G, R twenty three Can mention G. Y twenty one And Y twenty two Each independently represents one pyrimidine base, and preferable pyrimidine bases may include C for both.
[0028]
The structure of the secondary structure (C) is still in the stem-loop structure, and it is considered that, like the secondary structure (A), a stable higher-order structure is created and a physiological function is given.
[0029]
The secondary structure (D) includes a predicted secondary structure (secondary structure (D1)) of 30mer clone no. 2 (see FIG. 8) obtained in
[0030]
In secondary structure (D), N 31a And N 31b Are at least 5 nucleobase pairs capable of forming complementary bases, and preferably 5-8 pairs of nucleobases capable of forming complementary base pairs. N 31a And N 31b Can take all nucleotide sequences. N 32 And N 34 Are each independently 5 to 15 nucleobases, preferably 5 to 7 nucleobases. N 32 And N 34 Can take all nucleobases. N 33a And N 33b Is at least 3 nucleobase pairs capable of forming complementary bases, and preferably 3-6 pairs of nucleobases capable of forming complementary base pairs. N 33a And N 33b Preferred nucleobase pairs include GC. R 31 , R 32 And R 33 Each independently represents one purine base, and preferred purine bases include R 31 A, R 32 And R 33 Can mention G. Y 31 And Y 32 Each independently represents one pyrimidine base, and preferred pyrimidine bases include Y 31 Is U, Y 32 Can mention C.
[0031]
The structure of the secondary structure (D) is also stem-loop structure, and it is considered that, like the secondary structure (A), a stable higher-order structure is created and physiological functions are given.
[0032]
The secondary structure of the nucleotide sequence can be predicted by inputting the base sequence into general genetic information processing software (GENETYX-MAC: Software Development, DNASIS: Hitachi Software Engineering, etc.). When a nucleotide sequence is predicted to have any of secondary structures (A) to (D), the nucleotide sequence may have any of secondary structures (A) to (D). It shall be possible. Alternatively, the secondary structure of the nucleotide sequence can be experimentally mapped using RNase V1 that specifically cleaves double-stranded RNA or RNase T1 or RNase A that specifically cleaves single-stranded RNA. It may be confirmed by various methods.
The RNA of (3) can be obtained by a known chemical synthesis method. In addition, chemical synthesis can be outsourced to companies such as Takara Shuzo.
[0033]
The RNA of (1) to (4) may be 30 to 120 mer in length, and preferably 60 to 90 mer in length.
[0034]
RNA into which the mutation of (5) is introduced can be prepared as follows.
A high salt concentration or MnCl using any primer for the template DNA sequence for the RNA aptamer according to any one of (1) to (4) 2 Mutagenesis PCR can be performed in the presence of, or a template DNA containing a mutation can be prepared by site directed mutagenesis, cloned downstream of RNA polymerase, and transcribed and purified in vitro.
The RNA into which the mutation of (5) has been introduced may have the advantage that it has a higher binding activity and / or a stronger inhibitory effect on physiological activity.
[0035]
Like the RNA of (1), the RNAs of (2) to (5) can specifically bind to a translation initiation factor and inhibit its physiological activity. Therefore, these RNAs are useful for tumor cell growth inhibition or eIF complex functional analysis, and may function as diagnostic agents for diseases caused by translational abnormalities and as therapeutic agents for diseases caused by enhanced translation.
[0036]
The RNA of (6) can be prepared as follows.
When RNA aptamers are transcribed with RNA polymerase from a template in vitro, transcription is performed using nucleoside triphosphates with modifications to the bases instead of nucleoside triphosphates, and the transcripts are purified.
[0037]
In the present specification, “modified base” refers to a base derivative other than a normal base found in natural nucleic acids.
[0038]
RNA aptamers into which modified bases are introduced can be used for functional analysis of translation initiation factors. For example, a modified base such as Br-dUTP is introduced into an RNA aptamer, and after binding to the protein, ultraviolet light is applied to covalently bond the aptamer and the protein. When amino acids are analyzed by high performance liquid chromatography after hydrolysis of the aptamer and protein, the portion where the aptamer and protein are bonded can be found.
Alternatively, one or more of 2'-fluoro UTP, 2'-fluoro CTP, 2'-amino UTP, 2'-amino CTP, 2'-hydroxy UTP, and 2'-hydroxy CTP are used during RNA synthesis. By introducing, the stability of the RNA aptamer can be increased.
[0039]
The labeled RNA of (7) can be prepared as follows.
RNA aptamers can be labeled with a fluorescent substance (fluorescein) using 5'-Oligolabelling Kit for Fluorescence (manufactured by Amersham Pharmacia). In addition, RNA synthesis using RNA aptamer templates 32 Labeling with a radioisotope by incorporating a P-labeled nucleotide can be performed with digoxigenin by using a DIG RNA Labeling Kit (Roche Diagnostics).
The labeled RNA of (7) can be used for detection / quantification of a translation initiation factor. For example, the binding between an RNA aptamer labeled with a fluorescent substance and a translation initiation factor can be confirmed with a Multi-well plate reader (manufactured by ABI). By labeling the aptamer into which the modified base has been introduced, the sensitivity can be further increased.
[0040]
The DNA of (8) has a base sequence complementary to the base sequence of one or more RNAs described in any one of (1) to (6).
The DNA of (8) can be prepared by a known chemical synthesis method. In addition, chemical synthesis can be outsourced to companies such as Takara Shuzo.
[0041]
The vector of (9) can be prepared as follows.
RT-PCR is performed on the RNA according to any one of (1) to (6) using SEQ ID NO: 1, 2 or SEQ ID NO: 4, 5 as a primer, and this is subcloned into a vector such as pUC-tRR described later. Thus, it can be manufactured. Alternatively, it can be prepared by subcloning a DNA fragment prepared by chemical synthesis into a vector.
[0042]
The DNA of (8) and the vector of (9) can be used for gene therapy of diseases caused by translational abnormalities such as cancer.
[0043]
Using the RNA according to any one of (1) to (7), a translation initiation factor can be detected and / or quantified. Thereby, it is possible to clarify whether a disease whose onset mechanism is unknown is accompanied by abnormal translational regulation. An example of a specific detection and / or quantification method is described below. A solution containing a translation initiation factor is dispensed onto a 96-well multi plate (Corning), washed, and then bound with an RNA aptamer labeled with a fluorescent substance. After washing, the translation initiation factor can be quantified by measuring the fluorescence intensity with a plate reader (ABI, etc.).
[0044]
The oligonucleotides (11) and (12) can be produced by known chemical synthesis methods. Chemical synthesis can be outsourced to companies such as Takara Shuzo.
By performing the SELEX method using the oligonucleotides (11) and (12) as primers, an RNA aptamer that specifically binds to a translation initiation factor can be obtained.
[0045]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
An outline of the SELEX method used in the present invention is shown in FIG.
[0046]
In the present invention, two types of templates containing random sequences are used (random sequences of 30 mer and 40 mer (see Fig. 1)), and the target protein is immobilized and washed using three methods (Fig. 2). Went. That is, in i) immobilization with Ni-agarose, a His-tagged protein was bound to Ni-agarose and eluted with associated RNA molecules with imidazole. In solid phase immobilization with nitrocellulose membrane and strong washing in ii), the protein-RNA complex was adsorbed on the nitrocellulose membrane contained in the cartridge, washed with a syringe, and then eluted with a phenol / urea solution. In the case of solid phase immobilization with nitrocellulose membrane and weak washing in iii), the protein-RNA complex is adsorbed on the nitrocellulose membrane, transferred to a Petri dish containing the washing solution, washed twice for 5 minutes, and then the phenol / urea solution. Eluted with. i) tends to reduce non-specific binding, washing and extraction conditions are mild, ii) may be able to select one with strong binding force due to severe washing conditions, and iii) is relatively weak There is a possibility that you can choose even those with binding power. Of these, ii) and iii) tend to increase non-specific binding. SELEX for eIF4A1 is the method of Fig. 2 i) using the 40mer sequence (selection 1), the method of Fig. 2 ii) using the 40mer sequence (
[0047]
[0048]
The aptamers of
[0049]
[0050]
Next, it was examined whether the RNA aptamers obtained by
[0051]
[0052]
As described above, RNA aptamers for eIF4A1 and eIF4G were obtained in the present invention. By examining several solid-phase and washing conditions in the present invention, technical knowledge such as the selection method when adjusting SELEX to other proteins and the adjustment of the length of the random sequence of RNA are sufficiently accumulated. I think. If this is followed, RNA aptamers can be obtained for other eIFs. In the future, it is possible to obtain RNA aptamers more suitable as therapeutic agents. Among these aptamers, those having an intracellular translation inhibitory activity can suppress the expression of many oncogenes. In addition, if a system that specifically acts on tumor cells is established, it may be a versatile therapeutic agent that suppresses the growth of cancer cells regardless of the causative gene.
[0053]
The following (1) to (3) are possible using these RNA aptamers for eIF.
(1) Functional analysis of translation initiation factor: When an aptamer to a protein constituting a certain eIF inhibits the physiological function of the protein, it is possible to clarify which part of the protein is responsible for the physiological function. That is, a modified base such as Br-dUTP (manufactured by Sigma) is introduced into the aptamer, and after binding to the protein, the aptamer and the protein are covalently bonded by applying ultraviolet light. When amino acids are analyzed by high performance liquid chromatography after hydrolysis of the aptamer and protein, the portion where the aptamer and protein are bonded can be found. It is also possible to reconstitute an eIF complex from individual eIF subunits. By adding an RNA aptamer whose protein binding site has been clarified to this system, it is possible to clarify the binding site between individual proteins when forming a complex. Functional analysis not only in vitro but also in vivo can be performed. Aptamers can be introduced into cultured cells by known gene transfer methods, lipofection using Lipofection (GibcoBRL) or electroporation using GenePulser (BioRad). PUC-tRR (H. Kawasaki, et al. Selection of the best target site for ribozyme-mediated cleavage within a fusion gene for adenovirus E1A-associated 300 kDa protein (p300) and luciferase, Nucl. Acid. Res. 24: The aptamer can be expressed in cells by incorporating the aptamer into an expression vector such as 3010-3016, 1996) and similarly introducing it into cultured cells. Thereby, it can be confirmed whether an aptamer has the effect | action which suppresses the canceration of a cultured cell.
(2) Application as a therapeutic agent: It is possible to examine whether aptamers that acted in vitro and in vivo are effective as therapeutic agents. If an aptamer is administered to a laboratory animal that has developed cancer by a known method in the blood or directly to the affected area in the same manner as cultured cells, the aptamer is promising as a therapeutic agent. At this time, in order to stabilize the aptamer and increase the effect, a modified base can be introduced by a known method. For example, during RNA synthesis, 1 of 2'-fluoro UTP, 2'-fluoro CTP, 2'-amino UTP, 2'-amino CTP, 2'-hydroxy UTP, 2'-hydroxy CTP (JBL Scientific, etc.) If one or more types are introduced, the stability of the RNA aptamer can be increased.
(3) Application as a diagnostic agent: RNA aptamers have the characteristics of antibodies, which means that RNA aptamers can be used as “RNA antibodies” instead of antibodies. A novel detection system using this RNA antibody can be constructed by immunostaining, ELISA, etc. that have been carried out using antibodies. The binding between eIF4A1 and a fluorescently labeled RNA aptamer with a commercially available kit (manufactured by Amersham Pharmacia) has already been confirmed using a multi-well plate reader (manufactured by ABI). The sensitivity can be further increased by labeling the aptamer into which the modified base is introduced. That is, it is possible to quantitatively measure a translation initiation factor using various aptamers. Thereby, it is possible to clarify whether a disease whose onset mechanism is unknown is accompanied by abnormal translational regulation. In addition, as described above, there is a report that tumor cells have an abnormality in the expression level of eIF compared to normal cells. Furthermore, it has been reported that mRNA levels of eIF4E are different in various cancer cells in rats (Miyagi Y., et al., Elevated levels of eukaryotic translation initiation factor eIF-4E, mRNA in a broad spectrum of transformed cell lines, Cancer Lett., 91: 247-252, 1995). Thus, it is expected that eIF expression patterns differ depending on benign / malignant tumor cells and metastatic potential. Establishing a system capable of recognizing the difference in the expression level of eIF using an aptamer by means of ELISA or aptamer chip formation enables inexpensive and simple cancer diagnosis. Furthermore, by obtaining aptamers for various eIFs, cataloging them, and examining the expression pattern of eIF, a diagnostic method capable of identifying the type of tumor can be developed.
[0054]
【Example】
Hereinafter, the method of the experiment of the present invention will be specifically described with reference to examples. These examples are for explaining the present invention, and do not limit the scope of the present invention.
[0055]
[Example 1] Purification of protein
Human eIF4A1 and human eIF4G (672-970) subclones were provided by Professor Nahum Sonenberg, McGill University, Canada (Pause A. and Sonenberg N., Mutational analysis of a DEAD box RNA helicase: the mammalian translation initiation factor eIF -4A, EMBO J., 17: 7480-7489, 1998, MorinoS., Et al., Eukaryotic translation nitiation factor 4E (eIF4E) binding site and the middle one-third of the eIF4G constiturte the core domain for cap-dependent translation , and the C-terminal one-third functions as a modulatory region, Mol. Cell. Biol., 20: 468-477, 2000). DNAs encoding human eIF4A1 and human eIF4G (672-970) were subcloned into the pET15b vector (Novagen) and transformed into E. coli BL21 (DE3) (Novagen). The BL21 (DE3) strain can induce expression by adding T7 RNA polymerase to the medium of IPTG (such as Sigma), operates the T7 promoter upstream of the cloning site of pET15b, and turns the target gene into a fusion protein with a histidine tag. It can be overexpressed in E. coli. The obtained transformant was cultured in LB / ampicillin liquid medium. When the growth rate was maximum, IPTG was added to a final concentration of 0.5 mM to induce expression of human eIF. Ni that has the ability to bind to histidine after centrifugal recovery of E. coli and sonication 2+ -Roughly purified using NTA agarose (Qiagen), and further purified and separated by an anion exchange column Resuroce Q (Amercham Pharmacia biotech).
[0056]
[Example 2] Acquisition of RNA aptamer
In vitro RNA selection using the SELEX method was performed by Ellington et al. (Ellington AD and Szostak JW, In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands, Nature, 346: 818-22, 1990) and Tuerk et al. (Tuerk C and Gold L., Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase, Science, 249: 505-510, 1990). The RNA pool used for in vitro selection was prepared from the following chemically synthesized primers and a random sequence template (commissioned from Greiner Japan). A random DNA fragment amplified by PCR was used as a template for transcription, transcribed with T7 RNA polymerase in vitro from the T7 RNA polymerase promoter contained in primers P1 and P1 ′, and purified by phenol extraction and gel filtration.
After 8-15 rounds of selection, the PCR product was subcloned into pGEM-T vector (Promega) and then transformed into E. coli strain NovaBlue (Novagen) to obtain a single clone. After extracting the plasmid, the DNA sequencer (model 377, manufactured by ABI) was used, and the nucleotide sequence was determined using the following sequence primer.
[0057]
[Example 3] Measurement of RNA binding activity
The binding activity of the obtained RNA aptamer was measured using a nitrocellulose membrane. RNA aptamers are [α- 32 Transcription was performed in the presence of P] CTP, and RI was labeled. The labeled RNA aptamer was mixed with various concentrations of eIF4A1 in binding buffer, incubated at 25 ° C for 30 minutes, and then filtered with a suction filter to remove the nitrocellulose membrane treated with binding buffer in the presence of 10 μg / ml tRNA. Permeated, washed with 1 ml of binding buffer, dried and adsorbed on the membrane 32 The count of P was measured with a scintillator (Beckman). The relative amount of count adsorbed to the membrane relative to the count of total RNA label added to the system was plotted on the graph as binding efficiency.
[0058]
The short sequence of the common stem structure has been purified by annealing two oligonucleotides, T7-pro and P-14 or P-24, and using this as a template for transcription with T7 polymerase in vitro.
[Example 4] Confirmation of inhibitory effect of ATPase activity
eIF4A1 exhibits ATPase activity in the presence of RNA. Preliminary experiments showed that ATPase activity was increased by RNA aptamer ^. Therefore, activity was measured in such a way that an excessive amount of poly (A) was not added to the assay system.
[0060]
[Example 5] Preparation of RNA aptamer mutant
Using 40 mer no.2 cloned in pGEM-T vector as a template and primers P1 and P2, add 0.75 mM MnCl in the PCR reaction solution. 2 The PCR reaction was performed. This PCR product was cloned into pGEM-T vector and the nucleotide sequence was confirmed. The obtained clone was transcribed into RNA, and the binding activity was measured.
[0061]
【The invention's effect】
The present invention provides an RNA aptamer that specifically binds to a translation initiation factor. The RNA aptamer of the present invention can be used for elucidation, diagnosis and treatment of the onset mechanism of diseases caused by translational abnormalities.
[0062]
[Sequence Listing]
[SEQ ID NO: 1]
SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of primer P1.
[0063]
[SEQ ID NO: 2]
SEQ ID NO: 2 shows the base sequence of primer P2.
[0064]
[SEQ ID NO: 3]
SEQ ID NO: 3 shows the base sequence of 40mer random sequence template.
[0065]
[SEQ ID NO: 4]
SEQ ID NO: 4 shows the base sequence of primer P1 ′.
[0066]
[SEQ ID NO: 5]
SEQ ID NO: 5 shows the base sequence of primer P2 ′.
[0067]
[SEQ ID NO: 6]
SEQ ID NO: 6 shows the base sequence of 30mer random sequence template.
[0068]
[SEQ ID NO: 7]
SEQ ID NO: 7 shows the base sequence of sequence primer.
[0069]
[SEQ ID NO: 8]
SEQ ID NO: 8 shows the base sequence of
[0070]
[SEQ ID NO: 9]
SEQ ID NO: 9 shows the base sequence of
[0071]
[SEQ ID NO: 10]
SEQ ID NO: 10 shows the base sequence of
[0072]
[SEQ ID NO: 11]
SEQ ID NO: 11 shows the base sequence of
[0073]
[SEQ ID NO: 12]
SEQ ID NO: 12 shows the base sequence of
[0074]
[SEQ ID NO: 13]
SEQ ID NO: 13 shows the base sequence of
[0075]
[SEQ ID NO: 14]
SEQ ID NO: 14 shows the base sequence of
[0076]
[SEQ ID NO: 15]
SEQ ID NO: 15 shows the base sequence of
[0077]
[SEQ ID NO: 16]
SEQ ID NO: 16 shows the base sequence of
[0078]
[SEQ ID NO: 17]
SEQ ID NO: 17 shows the base sequence of
[0079]
[SEQ ID NO: 18]
SEQ ID NO: 18 shows the base sequence of
[0080]
[SEQ ID NO: 19]
SEQ ID NO: 19 shows the base sequence of
[0081]
[SEQ ID NO: 20]
SEQ ID NO: 20 shows the base sequence of
[0082]
[SEQ ID NO: 21]
SEQ ID NO: 21 shows the base sequence of
[0083]
[SEQ ID NO: 22]
SEQ ID NO: 22 shows
[0084]
[SEQ ID NO: 23]
SEQ ID NO: 23 shows the base sequence of
[0085]
[SEQ ID NO: 24]
SEQ ID NO: 24 shows the base sequence of
[0086]
[SEQ ID NO: 25]
SEQ ID NO: 25 shows the base sequence of
[0087]
[SEQ ID NO: 26]
SEQ ID NO: 26 shows the base sequence of
[0088]
[SEQ ID NO: 27]
SEQ ID NO: 27 shows the base sequence of
[0089]
[SEQ ID NO: 28]
SEQ ID NO: 28 shows the base sequence of
[0090]
[SEQ ID NO: 29]
SEQ ID NO: 29 is the base sequence of
[0091]
[SEQ ID NO: 30]
SEQ ID NO: 30 shows the base sequence of
[0092]
[SEQ ID NO: 31]
SEQ ID NO: 31 shows the base sequence of
[0093]
[SEQ ID NO: 32]
SEQ ID NO: 32 shows the base sequence of
[0094]
[SEQ ID NO: 33]
SEQ ID NO: 33 is the base sequence of
[0095]
[SEQ ID NO: 34]
SEQ ID NO: 34 shows the base sequence of
[0096]
[SEQ ID NO: 35]
SEQ ID NO: 35 shows the base sequence of
[0097]
[SEQ ID NO: 36]
SEQ ID NO: 36 is the base sequence of
[0098]
[SEQ ID NO: 37]
SEQ ID NO: 37 is the base sequence of
[0099]
[SEQ ID NO: 38]
SEQ ID NO: 38 is the clone no. 2 (selection 2) base sequence (part complementary to the 40mer template) that was obtained as a result of 15 rounds of SELEX starting from the 40mer template and targeting eIF4A1. Show.
[0100]
[SEQ ID NO: 39]
SEQ ID NO: 39 is the base sequence of clone no. 9 (selection 2) (part complementary to the 40mer template) that has been obtained as a result of 15 rounds of SELEX starting from the 40mer template and targeting eIF4A1. Show.
[0101]
[SEQ ID NO: 40]
SEQ ID NO: 40 is the clone no. 15 (selection 2) base sequence (part complementary to the 40mer template) that has been obtained as a result of 15 rounds of SELEX starting from the 40mer template using eIF4A1 as a target. Show.
[0102]
[SEQ ID NO: 41]
SEQ ID NO: 41 is the base sequence of clone no. 25 (selection 2) (part complementary to the 40mer template) that was obtained as a result of 15 rounds of SELEX starting from the 40mer template and targeting eIF4A1. Show.
[0103]
[SEQ ID NO: 42]
SEQ ID NO: 42 is the clone no. 2 (selection 2) base sequence (part complementary to the 30mer template) that has been obtained as a result of 12 rounds of SELEX starting from the 30mer template and targeting eIF4A1. Show.
[0104]
[SEQ ID NO: 43]
SEQ ID NO: 43 is the base sequence of clone no. 5 (selection 2) (part complementary to the 30mer template) that has been obtained as a result of twelve rounds of SELEX starting from the 30mer template and targeting eIF4A1. Show.
[0105]
[SEQ ID NO: 44]
SEQ ID NO: 44 is the base sequence of clone no. 25 (selection 2), which was obtained as a result of 15 rounds of SELEX starting from a 40mer template, targeting eIF4A1, and complementary to the primer sequence and the 40mer random sequence template The specific part).
[0106]
[SEQ ID NO: 45]
SEQ ID NO: 45 is the base sequence of clone no. 2 (selection 2), which was obtained as a result of 12 rounds of SELEX starting from the 30mer template and targeting eIF4A1, and complementary to the primer sequence and the 30mer random sequence template The specific part).
[0107]
[SEQ ID NO: 46]
SEQ ID NO: 46 shows the nucleotide sequence of the conserved region of clone no. 25 (selection 2), which was taken as a result of 15 rounds of SELEX using eIF4A1 as a target and a 40mer template as a starting point.
[0108]
[SEQ ID NO: 47]
SEQ ID NO: 47 shows the nucleotide sequence of the conserved region of clone no. 2 (selection 2) obtained as a result of twelve rounds of SELEX using eIF4A1 as a target and a 30-mer template as a starting point.
[0109]
[SEQ ID NO: 48]
SEQ ID NO: 48 is the base sequence of clone no. 2 (selection 2) that has been obtained as a result of 15 rounds of SELEX starting from a 40mer template, targeting eIF4A1, and complementary to the primer sequence and the 40mer random sequence template The base sequence of the sequence into which the mutation has been introduced based on
[0110]
[SEQ ID NO: 49]
SEQ ID NO: 49 is the base sequence of clone no. 2 (selection 2), which was obtained as a result of 15 rounds of SELEX starting from a 40mer template, targeting eIF4A1, and complementary to the primer sequence and 40mer random sequence template The base sequence of the sequence into which the mutation has been introduced based on
[0111]
[SEQ ID NO: 50]
SEQ ID NO: 50 is the base sequence of clone no. 2 (selection 2), which has been obtained as a result of 15 rounds of SELEX starting from a 40mer template, targeting eIF4A1, and complementary to the primer sequence and the 40mer random sequence template The base sequence of the sequence into which the mutation has been introduced based on
[0112]
[SEQ ID NO: 51]
SEQ ID NO: 51 is the base sequence of clone no. 2 (selection 2), which has been obtained as a result of 15 rounds of SELEX starting from a 40mer template, targeting eIF4A1, and complementary to the primer sequence and the 40mer random sequence template The base sequence of the sequence into which the mutation has been introduced based on
[0113]
[SEQ ID NO: 52]
SEQ ID NO: 52 is the base sequence of clone no. 2 (selection 2), which is the result of 15 rounds of SELEX starting with a 40mer template and targeting 40m1 template (complementary to the primer sequence and 40mer random sequence template) The base sequence of the sequence into which the mutation has been introduced based on
[0114]
[SEQ ID NO: 53]
SEQ ID NO: 53 is the base sequence of clone no. 2 (selection 2), which has been obtained as a result of 15 rounds of SELEX starting from the 40mer template and targeting eIF4A1, and complementary to the primer sequence and the 40mer random sequence template The base sequence of the sequence into which the mutation has been introduced based on
[0115]
[SEQ ID NO: 54]
SEQ ID NO: 54 is the base sequence of clone no. 2 (selection 2) that has been obtained as a result of 15 rounds of SELEX starting from a 40mer template and targeting eIF4A1 (complementary to the primer sequence and 40mer random sequence template) The base sequence of the sequence into which the mutation has been introduced based on
[0116]
[SEQ ID NO: 55]
SEQ ID NO: 55 is the base sequence of clone no. 2 (selection 2) that has been obtained as a result of 15 rounds of SELEX starting from a 40mer template, targeting eIF4A1, and complementary to the primer sequence and the 40mer random sequence template The base sequence of the sequence into which the mutation has been introduced based on
[0117]
[SEQ ID NO: 56]
SEQ ID NO: 56 is the base sequence of clone no. 2 (selection 2), which is the result of 15 rounds of SELEX starting from the 40mer template and targeting 40m1 template (complementary to the primer sequence and 40mer random sequence template) The base sequence of the sequence into which the mutation has been introduced based on
[0118]
[SEQ ID NO: 57]
SEQ ID NO: 57 is the base sequence of clone no. 1 (selection 3), which was obtained as a result of eight rounds of SELEX starting from the 40mer template and targeting eIF4G (part complementary to the 40mer random sequence template) Indicates.
[0119]
[SEQ ID NO: 58]
SEQ ID NO: 58 is the base sequence of clone no. 4 (selection 3) that has been obtained as a result of eight rounds of SELEX starting from the 40mer template and targeting eIF4G (part complementary to the 40mer random sequence template) Indicates.
[0120]
[SEQ ID NO: 59]
SEQ ID NO: 59 is the base sequence of clone no. 7 (selection 3) that has been obtained as a result of 8 rounds of SELEX starting from the 40mer template and targeting eIF4G (part complementary to the 40mer random sequence template) Indicates.
[0121]
[SEQ ID NO: 60]
SEQ ID NO: 60 shows the base sequence of base sequence (IV).
[0122]
[SEQ ID NO: 61]
SEQ ID NO: 61 shows the base sequence of T7-pro.
[0123]
[SEQ ID NO: 62]
SEQ ID NO: 62 shows the base sequence of P-14.
[0124]
[SEQ ID NO: 63]
SEQ ID NO: 63 is the base sequence of P-24.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 Outline of SELEX method. DNA containing T7 RNA polymerase promoter sequence and random region is synthesized, and PCR is performed using P1 and P2 as primers to obtain a template. The synthesized RNA is associated with the target substance, and the bound RNA is recovered. A template for the next round is obtained from the recovered RNA by RT-PCR. Repeat this for 8-15 rounds. The RT-PCR product from the final round is cloned and turned into a sequence. In particular, it is important to set the conditions for immobilization, washing, and RNA extraction of the complex indicated by an ellipse.
FIG. 2 shows a solid phase and washing method. The immobilization and washing method during aptamer selection used in the present invention is schematically shown.
FIG. 3 shows the binding activity of the RNA aptamer obtained in
FIG. 4 shows the nucleotide sequence of the RNA aptamer obtained in
FIG. 5: Expected secondary structure of RNA aptamer obtained in
FIG. 6 shows the binding activity of the RNA aptamer obtained in
FIG. 7 shows the nucleotide sequence of the RNA aptamer obtained in
FIG. 8: Expected secondary structure of RNA aptamer obtained in
FIG. 9 shows the binding activity between the RNA aptamer storage region and eIF4A1. RNA of only the conserved region seen in
FIG. 10 shows the position of the mutation that lost the binding activity to eIF4A1. A mutation was introduced into the aptamer of
FIG. 11 shows the effect of aptamer against eIF4A1 obtained by SELEX on the ATPase activity of eIF4A1. (A) shows the
FIG. 12 shows the binding activity (A) of the RNA pool to eIF4G (672-970) obtained in
In FIG. 12A, 40mer and 8th are RNA pools obtained as a result of eight rounds of SELEX starting from a 40mer template targeting eIF4G (672-970), and 30mer and 8th are eIF4G ( 672-970) is the RNA pool that has been obtained as a result of eight rounds of SELEX starting from a 30mer template.
In FIG. 12B, 40mer, 8th, no.1, 4, and 7 are RNA clone no.1 that has been obtained as a result of eight rounds of SELEX starting from a 40mer template targeting eIF4G (672-970). , 4 and 7.
In FIG. 12C, eIF4G, 40mer, 8th round, no.1, 4, 7 are RNA clones that have been obtained as a result of 8 rounds of SELEX starting from 40mer template targeting eIF4G (672-970) no.1, 4, 7.
Claims (9)
（ａ）配列番号１６〜３３、３８〜４２及び４３の塩基配列からなる群より選択される塩基配列を有するＲＮＡ。
（ｂ）下記の二次構造（Ａ１）〜（Ａ３）、（Ｂ１）、（Ｃ１）および（Ｄ１）からなる群から選択されるいずれかの構造をとることができるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ。
(A) RNA having a base sequence selected from the group consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 16 to 33, 38 to 42 and 43.
(B) RNA comprising a nucleotide sequence that can take any structure selected from the group consisting of the following secondary structures (A1) to (A3), (B1), (C1), and (D1) .
請求項１に記載のＲＮＡアプタマーに対するテンプレートＤＮＡ配列に対して任意のプ ライマーを用いて高塩濃度やＭｎＣｌ ２ の存在下でｍｕｔａｇｅｎｉｃ ＰＣＲを行うか、あるいはｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法で変異の入ったテンプレートＤＮＡを作製し、これをＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流にクローン化し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写、精製する A RNA obtained by introducing mutation to the nucleotide sequence of the RNA according to claim 1, RNA having a binding activity to the translation initiation factor eIF4A1 obtained by the following method.
Whether to claim 1 to mutagenic PCR in the presence of high salt concentrations and MnCl 2 with any primer to the template DNA sequence for the RNA aptamer according, or site directed mutagenesis method by containing the mutated template DNA Is cloned downstream of the RNA polymerase promoter and transcribed and purified in vitro.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001107735A JP4167403B2 (en) | 2001-04-05 | 2001-04-05 | Nucleic acid ligands that specifically bind to translation initiation factors |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001107735A JP4167403B2 (en) | 2001-04-05 | 2001-04-05 | Nucleic acid ligands that specifically bind to translation initiation factors |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002300885A JP2002300885A (en) | 2002-10-15 |
| JP4167403B2 true JP4167403B2 (en) | 2008-10-15 |
Family
ID=18960005
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001107735A Expired - Fee Related JP4167403B2 (en) | 2001-04-05 | 2001-04-05 | Nucleic acid ligands that specifically bind to translation initiation factors |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4167403B2 (en) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4910195B2 (en) * | 2005-07-05 | 2012-04-04 | 株式会社リボミック | Nucleic acids that bind to immunoglobulin G and methods of use thereof |
| CA2614145A1 (en) | 2005-07-05 | 2007-01-11 | Ribomic Inc. | Nucleic acid capable of binding to immunoglobulin g and use thereof |
| CN120210216B (en) * | 2025-04-09 | 2025-09-19 | 广东海洋大学 | An RNA aptamer and its application in improving salt tolerance of rice |
-
2001
- 2001-04-05 JP JP2001107735A patent/JP4167403B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2002300885A (en) | 2002-10-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pereira‐Castro et al. | On the function and relevance of alternative 3′‐UTRs in gene expression regulation | |
| Bernard et al. | A long nuclear-retained non-coding RNA regulates synaptogenesis by modulating gene expression | |
| US9422554B2 (en) | MicroRNAome | |
| WO2013012921A2 (en) | Nucleic acid aptamers | |
| Darnell | RNA regulation in neurologic disease and cancer | |
| JP4658936B2 (en) | Compositions and methods for treating lung cancer | |
| JP2008526213A (en) | Compositions and methods for modulating gene expression using self-protecting oligonucleotides | |
| CA2487427A1 (en) | Methods and compositions for treating neoplasia relating to hnrnp a1 and a2 nucleic acid molecules | |
| JP4167403B2 (en) | Nucleic acid ligands that specifically bind to translation initiation factors | |
| US12421266B2 (en) | Diverse and flexible chemical modification of nucleic acids | |
| JP3940097B2 (en) | Ligand binding to translation initiation factor eIF4E | |
| JP2007043917A (en) | NUCLEIC ACID LIGAND BINDABLE TO TUMOR GROWTH FACTOR beta-RECEPTOR III TYPE | |
| US20250340946A1 (en) | Method of prognosing and treating glioma | |
| Esenkaya | Investigation of Mcl-1 alternative splicing regulation by GQC-05, a putative G–quadruplex ligand | |
| CN102274501A (en) | Medicine for treating and preventing cancers | |
| KR101665165B1 (en) | Novel RNA aptamers and the Uses thereof | |
| Tušup et al. | Immunomodulation by RNA | |
| WO2004046356A1 (en) | EXON 1β OF PDGF RECEPTOR α GENE AND UTILIZATION THEREOF | |
| CN102435750A (en) | Method for screening medicine for treating or preventing cancer | |
| CN102359954A (en) | Method for screening drug for treating or preventing cancer | |
| Kelly | Distinguishing Features of Guide and Substrate RNA Regognition by H/ACA snoRNPs | |
| JP2007028932A (en) | RIBONUCLEIC ACID BINDING TO TRANSLATION INITIATION FACTOR eIF1A | |
| Liu | Development of ss DNA aptamers for c-Myc: Max by SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) | |
| Wang | The molecular basis of RNA recognition and transcriptional regulation by FUS and PRC2 | |
| CN102274506A (en) | Medicine for treating and preventing cancer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050221 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050314 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20050830 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20050830 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20050830 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20051107 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20061102 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20061102 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20061115 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20061102 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080422 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080623 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080715 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080801 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110808 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130808 Year of fee payment: 5 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |