JP4172281B2

JP4172281B2 - Method for producing DNA-degrading enzyme and method for producing deoxynucleoside using the same

Info

Publication number: JP4172281B2
Application number: JP2003027554A
Authority: JP
Inventors: 豪近松; 治知関戸
Original assignee: Maruha Nichiro Foods Inc
Current assignee: Maruha Nichiro Corp
Priority date: 2003-02-04
Filing date: 2003-02-04
Publication date: 2008-10-29
Anticipated expiration: 2023-02-04
Also published as: JP2004236539A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、微生物由来の新規なヌクレアーゼと新規なホスファターゼの両者を含む新規なＤＮＡ分解酵素として見出すとともに、当該新規なＤＮＡ分解酵素の製造方法と、この新規なＤＮＡ分解酵素を用いてデオキシヌクレオシドを製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来よりデオキシヌクレオシドは、遺伝子解析用試薬、アンチセンス医薬等の種々の医薬品原料として用いられている。一般的に、デオキシヌクレオシドは、魚介類精巣から抽出されるＤＮＡをヌクレアーゼで分解してデオキシヌクレオチドとし、更にホスファターゼでリン酸基を除くことにより得られることが知られている。
【０００３】
これに対して、近年ＤＮＡ分解酵素を用いてデオキシヌクレオシドを製造する方法が開発された。具体的には、魚類精巣をアルカリ処理することによりＤＮＡを加水分解するなどして抽出し、ヌクレアーゼとホスファターゼを順または同時に酵素処理し、反応液からクロマトグラフィー法にてデオキシヌクレオシドを分離、取得する方法である（特願平11−548064号「精巣からのデオキシヌクレオシドの直接製造法」）。
【０００４】
しかし、当該デオキシヌクレオシドの直接製造法は、異種微生物により産生されたヌクレアーゼとホスファターゼなどの精製酵素を用意し、これを利用する方法である。そのために異種微生物を培養し、それからヌクレアーゼやホスファターゼなどの酵素を個別に抽出したり精製したりする必要がある。
【０００５】
具体的には、例えば、ヌクレア−ゼP1の一般的な製造法は、ぺニシリウムシトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｉｔｒｉｎｕｍ）をふすま培養し、培地より水抽出等で酵素を抽出した後、これをＵＦ膜、アセトン沈殿、硫酸アンモニウム沈殿等で酵素を濃縮・回収する。そのうえで陰イオン交換クロマトグラフィー等で精製する方法である。また、酸性ホスファターゼの一般的な製造法は、小麦胚芽から抽出した後、ＵＦ膜、アセトン沈殿、硫酸アンモニウム沈殿等で酵素を濃縮・回収する。そのうえで陰イオン交換クロマトグラフィー等で精製する方法である。更に、アルカリホスファターゼの一般的製造法は、アルカリホスファターゼ高生産性大腸菌を培養し、菌体を破砕し、酵素を抽出した後、ＵＦ膜、アセトン沈殿、硫酸アンモニウム沈殿等で酵素を濃縮・回収する。そのうえで陰イオン交換クロマトグラフィー等で精製する方法である。上記のように、ヌクレアーゼやホスファターゼを製造する方法は、その手間が煩雑で大変であり、コスト的に満足できるものではなかった。
【０００６】
また、ヌクレオシドをデオキシ化したり、デオキシヌクレオシドの塩基部分を置き換える等の酵素的製造法（特開平7−157496号、特開2001−46097号、特開2002−17393号、特開2002−51781号）が報告されている。これらも酵素を菌体内から抽出したり精製するなどの工程が必要であり、その操作が煩雑であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
前述のように、近年開発されたＤＮＡ分解酵素を用いてデオキシヌクレオシドを製造する方法は、いずれもコスト的に高かったり、製造工程が煩雑であったりして、必ずしも満足できるものでなかった。
【０００８】
本発明者は、このような従来技術の課題を解決せんとして高効率でＤＮＡをデオキシヌクレオシドに分解することのできるヌクレア−ゼやホスファターゼを産生する微生物を探索する研究をした。その結果、先ず、微生物の培地抽出液又は培養液をＤＮＡに反応させると高効率でデオキシヌクレオシドが生産されるぺニシリウムジアストリボラス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｇｅａｓｔｒｉｖｏｒｕｓ）に属する微生物を見出し、当該ぺニシリウム属の微生物を単離することに成功した。そこで、この新たに発見されたぺニシリウム属の微生物については、本特許出願人によって独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭＰ−１８９９５として寄託した。
【０００９】
その上で、更に、新たに見出されたぺニシリウム属の微生物受託番号ＦＥＲＭＰ−１８９９５）の培地抽出液又は培養液を、魚介類精巣、牛胸腺又は微生物菌体から抽出されたＤＮＡに反応させると、デオキシヌクレオシドを得ることが出来ることや、当該微生物（菌）の培地抽出液又は培養液を、加熱処理したうえでＤＮＡに反応させると、簡単にデオキシヌクレオチドを得ることができるなどの新たな技術的知見を得た。
【００１０】
本発明者は、このような新たな技術的知見に基づいて、本件発明を完成した。本件発明の目的は、新たに見出されたぺニシリウム属の微生物（受託番号ＦＥＲＭＰ−１８９９５）により産生される新規なヌクレアーゼと新規なホスファターゼの両者を含む新規で有効なＤＮＡ分解酵素を提供し、これを用いて第１に、その新規なＤＮＡ分解酵素を製造する方法を開発せんとするものであり、第２は、この新規なＤＮＡ分解酵素を用いてデオキシヌクレオシドを簡便で且つ安価に製造する方法を具体化することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
ぺニシリウムジアストリボラスに属する菌体（受託番号ＦＥＲＭＰ−１８９９５）により産生されたヌクレアーゼとホスファターゼを含む新規なＤＮＡ分解酵素である。
【００１２】
当該微生物由来の新規なＤＮＡ分解酵素であるヌクレア−ゼやホスファターゼの性質は、次の通りである。
【００１３】
＜粗酵素液中のヌクレア−ゼの理化学的性質＞
至適ｐＨ：３．０〜４．０（３７℃で酵素活性測定）
ｐＨ安定性：ｐＨ６〜７．５で８０％以上活性保持（５０℃で３０分加温後、ｐＨ４、３７℃で酵素活性測定）
至適温度：６５〜８０℃（ｐＨ４で酵素活性測定）
温度安定性：６０℃以下で９０％以上活性保持（ｐＨ７で３０分加温後、ｐＨ４、３７℃で酵素活性測定）
金属イオン要求性：亜鉛イオンが必須
基質特異性：ＲＮＡ（13）＞一本鎖ＤＮＡ（１）＞二本鎖ＤＮＡ（０．０８）（カッコ内は活性比率）
生成物：モノデオキシヌクレオチド−５‘−リン酸（５’−ホスホジエステラーゼ活性による）
分子量：約４４，４００（４４．４ｋDa）（ゲル濾過法（Sephacryl S200）による）
【００１４】
＜粗酵素液中のホスファターゼの理化学的性質＞
至適ｐＨ：９（３７℃で酵素活性測定）
ｐＨ安定性：ｐＨ７．５〜８で８０％以上活性保持（５０℃で３０分加温後、３７℃で酵素活性測定）
至適温度：４０〜５５℃（ｐＨ９で酵素活性測定）
温度安定性：５０℃以下で９０％以上活性保持（ｐＨ７で３０分加温後、ｐＨ９、３７℃で酵素活性測定）
金属イオン要求性：特に無し
基質特異性：モノデオキシヌクレオチド−５‘−リン酸、パラニトロフェノールのリン酸基を加水分解
分子量：試験未実施
【００１５】
本発明に係るヌクレアーゼおよびホスファターゼは、生産菌ぺニシリウムジアストリボラスに属する菌体（受託番号ＦＥＲＭＰ−１８９９５）によって産生されるが、それは上記のような理化学的性質を有している。このようにして得たＤＮＡ分解酵素の特性を調べたところ、従来のヌクレアーゼやホスファターゼよりも高効率にＤＮＡを分解・精製する特性を有するものであり、微生物由来の新規なヌクレア−ゼや新規なホスファターゼである。
【００１６】
また、本件発明の対象となるＤＮＡとは、魚介類精巣だけではなく、牛胸腺又は微生物菌体から抽出されたものでよいことは勿論である。
【００１７】
特許を受けようとする第１発明は、ぺニシリウムジアストリボラスに属する菌体（受託番号ＦＥＲＭＰ−１８９９５）を培養し、その培地より前記のような理化学的性質をもったヌクレアーゼおよび／またはホスファターゼを含むＤＮＡ分解酵素を、抽出若しくは濃縮・回収又は精製するなどの手段により得るようにしたことを特徴とする新規なＤＮＡ分解酵素の製造方法である。
【００１８】
当該第１発明は、新規なＤＮＡ分解酵素であるヌクレアーゼおよびホスファターゼの製造方法である。当該ヌクレアーゼおよびホスファターゼは、ぺニシリウムジアストリボラスに属する微生物によって生産されるのである。その生産用微生物である菌体は、本発明者が土壌中より新規に単離した菌株である。本菌株について、形態観察及びｒＤＮＡ解析を行った結果、以下の根拠により帰属分類群をペニシリンジアストリボラス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｇｅａｓｔｒｉｖｏｒｕｓ）に属すると同定された。即ち、本菌株の28SrＤＮＡ（D1,D2）塩基配列（571ベース）をクエリー配列としてＧｅｎＢａｎｋに対してＢＬＡＳＴ検索を行ったところ、ぺニシリウムジアストリポラス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｇｅａｓｔｒｉｖｏｒｕｓ）の28SrＤＮＡの当該部分と完全に一致したことにより、当該菌分類群に含まれる可能性が推定された。そこで、本発明者は、本菌株について、工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭＰ−１８９９５として寄託した。尚、本発明に用いることができる微生物は、本菌体（受託番号ＦＥＲＭＰ−１８９９５）とその変種、及び変異体でもよい。
【００１９】
本発明に係る新規なＤＮＡ分解酵素を用いたデオキシヌクレオシドの製造法は、従来の異種微生物が産生したヌクレアーゼやホスファターゼを用いた場合より高効率に製造することが出来た。
【００２０】
特許を受けようとする第２発明は、ぺニシリウムジアストリボラスに属する菌体（受託番号ＦＥＲＭＰ−１８９９５）、その変種又は変異体の培地抽出液および／または培養液を、ＤＮＡに反応させることを特徴とするＤＮＡからデオキシヌクレオシドを製造する方法である。
【００２１】
当該第２発明は、ぺニシリウムジアストリボラスに属する微生物（受託番号ＦＥＲＭＰ−１８９９５）の培地抽出液または培養液を直接ＤＮＡに反応させるだけで、簡単にＤＮＡからデオキシヌクレオシドを製造する方法である。
【００２２】
ぺニシリウムジアストリボラスに属する微生物（受託番号ＦＥＲＭＰ−１８９９５）の培養方法には、固体培養、液体培養などがある。固体培地を使用する場合、水抽出、熱水抽出、界面活性剤による抽出等により培地抽出液が得られる。液体培養の場合には、遠心分離、ろ過等により培養液を得ることが出来る。この培地抽出液又は培養液をそのまま酵素溶液として使用しても良いし、ＵＦ膜、硫安沈殿、陰イオン交換樹脂等により濃縮・回収したものを酵素溶液として使用しても良い。このように回収した酵素溶液を、微生物や牛胸腺や魚介類精巣から酸、アルカリ、界面活性剤、プロテアーゼ等により抽出したＤＮＡに作用させると、デオキシヌクレオシドが生成され、公知の技術により４種のデオキシヌクレオシドに分離することにより、デオキシヌクレオシドが得られる。
【００２３】
特許を受けようとする第３発明は、ぺニシリウムジアストリボラスに属する菌体（受託番号ＦＥＲＭＰ−１８９９５）の培地抽出液又は培養液を熱処理してホスファターゼを失活させた後、ＤＮＡに反応させることを特徴とするＤＮＡからデオキシヌクレオチドを製造する方法である。
【００２４】
当該第３発明は、ぺニシリウムジアストリボラスに属する微生物（受託番号ＦＥＲＭＰ−１８９９５）の培地抽出液または培養液を直接ＤＮＡに反応させるだけで、ＤＮＡからデオキシヌクレオチドを製造する方法である。
【００２５】
本発明は、前記第２発明と同様に、ぺニシリウムジアストリボラスに属する微生物（受託番号ＦＥＲＭＰ−１８９９５）を固体培養または液体培養するが、固体培養をした場合、水抽出、熱水抽出、界面活性剤による抽出等により培地抽出液が得られるのに対し、液体培養した場合は、遠心分離、ろ過等により培養液を得ることが出来る。この培地抽出液又は培養液をそのまま酵素溶液として使用しても良いが、ＵＦ膜、硫安沈殿、陰イオン交換樹脂等により濃縮・回収したものを酵素溶液として使用しても良い。本発明は、このようにして得た酵素溶液を６０〜８０℃で熱処理することによりホスファターゼを失活させ、微生物、牛胸腺または魚介類精巣から酸、アルカリ、界面活性剤、プロテアーゼ等により抽出したＤＮＡに作用させるとデオキシヌクレオチドが生成され、公知の技術により４種類のデオキシヌクレオチドに分離することにより、デオキシヌクレオチドを単離して得られる。
【００２６】
【実施例】
以下本件発明を実施例に基づいて詳細に説明する。
先ず、本件発明に係るペニシリウムジアストリボラス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｇｅａｓｔｒｉｖｏｒｕｓ）に属する微生物（受託番号ＦＥＲＭＰ−１８９９５）の培養方法について具体的に述べる。
【００２７】
前培養：グルコース、ペプトン、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムを組成物とする平地培地（ｐＨ６．５）に白金耳で菌を接種し、２５℃で５〜８日間静置培養する。
【００２８】
固体培養：三角フラスコに入ったふすま培地（小麦ふすま：水（バッファー）＝７：４）に平板培地に形成された分生子を接種する。ふすま培地１０ｇに対し、平板培地１ｃｍ²分を接種する。２５℃で５〜８日間静置培養する。ふすま培地が１００ｇ以下であればこの方法でよいが、１００ｇより多い場合は、１００ｇに対しふすま培養物を約１５ｇ接種する。
【００２９】
液体培養：グルコース、ペプトン、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムを組成物とする液体培地（ｐＨ６．５）１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに入れ、滅菌する。そこに平地培地に形成された分生子を接種する（１ｃｍ²）。２５℃で３〜５日間培養する。同培地のグルコースの替わりに１０％（ｗ/ｖ）の小麦ふすまを添加しても良い。
【００３０】
＜実施例１＞デオキシヌクレオシドの製造法
ペニシリウムジアストリボラス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｇｅａｓｔｒｉｖｏｒｕｓ）に属する微生物を１００ｇのふすま培地（ふすま：水＝７:４）に接種し、２５℃で６日間培養した。その培地より水抽出により酵素溶液５００ｍｌを得た。当該酵素溶液５００ｍｌ、鮭精巣から酸及びアルカリで抽出したＤＮＡ２ｇ、バッファー（ｐＨ４．５）、０．３ｍＭ亜鉛を混合して２リットルとし、５０℃で３時間加熱した。その結果、０．７ｇのデオキシヌクレオシドが得られた。
【００３１】
＜実施例２＞デオキシヌクレオチドの製造法
ペニシリウムジアストリボラス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｇｅａｓｔｒｉｖｏｒｕｓ）に属する微生物（菌体）を１００ｇのふすま培地（ふすま：水＝７:４）に接種し、２５℃で６日間培養した。その培地より水抽出により酵素溶液５００ｍｌを得た。当該酵素溶液に最終１ｍＭの亜鉛を添加し、６５℃で１時間熱した。ＵＦ膜で４倍に濃縮した酵素溶液５００ｍｌ、鮭精巣から酸及びアルカリで抽出したＤＮＡ２ｇ、バッファー（ｐＨ４．５）、０．３ｍＭ亜鉛イオンを混合して２リットルとし、５０℃で３時間加熱した。その結果、１．１ｇのデオキシヌクレオチドが得られた。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention finds a novel DNA-degrading enzyme containing both a novel nuclease derived from microorganisms and a novel phosphatase, a method for producing the novel DNA-degrading enzyme, and deoxynucleoside using the novel DNA-degrading enzyme. It relates to a method of manufacturing.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, deoxynucleosides have been used as various pharmaceutical raw materials such as genetic analysis reagents and antisense drugs. In general, deoxynucleosides are known to be obtained by degrading DNA extracted from seafood testis with nucleases to form deoxynucleotides, and further removing phosphate groups with phosphatases.
[0003]
On the other hand, in recent years, a method for producing deoxynucleosides using a DNA degrading enzyme has been developed. Specifically, fish is extracted by hydrolyzing DNA, for example, by treating the testis with alkali, and then treating the nuclease and phosphatase sequentially or simultaneously, and separating and obtaining deoxynucleosides from the reaction mixture by chromatography. (Japanese Patent Application No. 11-548064 “Direct production of deoxynucleoside from testis”).
[0004]
However, the direct production method of deoxynucleoside is a method in which a purified enzyme such as nuclease and phosphatase produced by a heterologous microorganism is prepared and used. For this purpose, it is necessary to culture heterologous microorganisms, and then individually extract or purify enzymes such as nucleases and phosphatases.
[0005]
Specifically, for example, a general method for producing nuclease P1 is to cultivate Penicillium citrinum by bran and extract the enzyme from the medium by water extraction or the like. Concentrate and collect the enzyme by ammonium sulfate precipitation. Then, it is a method of purification by anion exchange chromatography or the like. In general, acid phosphatase is extracted from wheat germ, and then concentrated and recovered with a UF membrane, acetone precipitation, ammonium sulfate precipitation, or the like. Then, it is a method of purification by anion exchange chromatography or the like. Furthermore, the general production method of alkaline phosphatase is to cultivate Escherichia coli having high productivity of alkaline phosphatase, crush the cells, extract the enzyme, and then concentrate and collect the enzyme by UF membrane, acetone precipitation, ammonium sulfate precipitation or the like. Then, it is a method of purification by anion exchange chromatography or the like. As described above, the methods for producing nucleases and phosphatases are complicated and troublesome, and are not satisfactory in terms of cost.
[0006]
Also, enzymatic production methods such as deoxylation of nucleosides and replacement of the base portion of deoxynucleosides (JP-A-7-1557496, JP-A-2001-46097, JP-A-2002-17393, JP-A-2002-51781) Has been reported. These also require steps such as extraction and purification of the enzyme from the cells, and the operation is complicated.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, the methods for producing deoxynucleosides using recently developed DNA-degrading enzymes are not always satisfactory because of high cost and complicated production processes.
[0008]
The present inventor conducted research to search for microorganisms that produce nuclease and phosphatase capable of decomposing DNA into deoxynucleosides with high efficiency in order to solve such problems of the prior art. As a result, firstly, a microorganism belonging to Penicillium geastriborus, which produces deoxynucleosides with high efficiency when a medium extract or culture solution of microorganism is reacted with DNA, is found, and a microorganism belonging to the genus Penicillium is identified. Successfully isolated. Therefore, this newly discovered microorganism belonging to the genus Penicillium was deposited by the applicant of the present patent application at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the accession number FERM P-18895 .
[0009]
Furthermore, the newly extracted medium extract or culture solution of Penicillium microorganism accession number FERM P-18895) is reacted with DNA extracted from seafood testis, bovine thymus or microbial cells. In that case, deoxynucleosides can be obtained, and if the culture medium extract or culture solution of the microorganism (fungus) is heated and reacted with DNA, deoxynucleotides can be easily obtained. Obtained technical knowledge.
[0010]
The present inventor has completed the present invention based on such new technical knowledge. The purpose of the present invention to provide an effective DNA degrading enzymes in novel containing novel nuclease and both the novel phosphatase produced by microorganisms of the newly found Bae Nishiriumu genus (Accession No. FERM P-18995) First , we will develop a method for producing the novel DNA-degrading enzyme using this, and the second is to produce deoxynucleoside easily and inexpensively using this novel DNA-degrading enzyme. It is to embody the method to do.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
It is a novel DNA-degrading enzyme containing a nuclease and a phosphatase produced by a cell belonging to Penicillium diastriborus ( Accession No. FERM P-18895) .
[0012]
Nuclease is a novel DNA-degrading enzymes derived from the microorganism - Properties of peptidase and phosphatase are as follows.
[0013]
<Physicochemical properties of nuclease in crude enzyme solution>
Optimum pH: 3.0-4.0 (measurement of enzyme activity at 37 ° C.)
pH stability: 80% or more of activity at pH 6-7.5 (enzyme activity measurement at pH 4, 37 ° C. after heating at 50 ° C. for 30 minutes)
Optimum temperature: 65 to 80 ° C. (measurement of enzyme activity at pH 4)
Temperature stability: 90% or more of activity at 60 ° C or less (measurement of enzyme activity at pH 4, 37 ° C after heating for 30 minutes at pH 7)
Metal ion requirement: Zinc ion is essential. Substrate specificity: RNA (13)> single-stranded DNA (1)> double-stranded DNA (0.08) (activity ratios in parentheses)
Product: Monodeoxynucleotide-5′-phosphate (due to 5′-phosphodiesterase activity)
Molecular weight: about 44,400 (44.4 kDa) (according to gel filtration method (Sephacryl S200))
[0014]
<Physicochemical properties of phosphatase in crude enzyme solution>
Optimal pH: 9 (measurement of enzyme activity at 37 ° C)
pH stability: 80% or more of activity maintained at pH 7.5-8 (enzyme activity measurement at 37 ° C. after heating at 50 ° C. for 30 minutes)
Optimum temperature: 40-55 ° C (measurement of enzyme activity at pH 9)
Temperature stability: 90% or more of activity at 50 ° C or less (enzyme activity measurement at 37 ° C at pH 9 after heating at pH 7 for 30 minutes)
Metal ion requirement: None Substrate specificity: Monodeoxynucleotide-5′-phosphate, phosphate group of paranitrophenol hydrolyzed Molecular weight: Not tested
The nuclease and phosphatase according to the present invention are produced by cells belonging to the producing bacterium Penicillium diastriborus ( Accession No. FERM P-18895) , which have the above physicochemical properties . The characteristics of the DNA-degrading enzyme thus obtained were examined. As a result, the DNA-degrading enzyme has the ability to decompose and purify DNA more efficiently than conventional nucleases and phosphatases. Phosphatase.
[0016]
Of course, the DNA that is the subject of the present invention may be extracted from bovine thymus or microbial cells, as well as from the seafood testis.
[0017]
The first invention to be patented is to cultivate cells belonging to Penicillium diastriborus ( Accession No. FERM P-18895) and nuclease and / or phosphatase having the above physicochemical properties from the medium. A novel method for producing a DNA-degrading enzyme, characterized in that it is obtained by means such as extraction, concentration, recovery or purification.
[0018]
The first invention is a method for producing nucleases and phosphatases, which are novel DNA-degrading enzymes. The nuclease and phosphatase are produced by microorganisms belonging to Penicillium diastriborus. The microbial cell which is the production microorganism is a strain newly isolated from soil by the present inventors. As a result of morphological observation and rDNA analysis of this strain, the belonging taxon was identified as belonging to Penicillium geastriborus on the basis of the following. That is, when a BLAST search was performed on GenBank using the 28SrDNA (D1, D2) base sequence (571 base) of this strain as a query sequence, it completely matched the relevant part of the 28SrDNA of Penicillium geastriborus. As a result, the possibility of being included in the bacteria taxonomic group was estimated. Then, this inventor deposited this strain with the accession number FERM P-1895 in the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. The microorganism that can be used in the present invention may be the present bacterial cell ( Accession No. FERM P-18895) , its variants, and mutants.
[0019]
The method for producing deoxynucleosides using the novel DNA-degrading enzyme according to the present invention was able to be produced more efficiently than when using nucleases and phosphatases produced by conventional heterologous microorganisms.
[0020]
The second invention to be patented is to react a bacterial cell belonging to Penicillium diastriborus ( Accession No. FERM P-18895) , a variant or mutant thereof, and a medium extract and / or a culture solution with DNA. Is a method for producing deoxynucleosides from DNA.
[0021]
The second invention is a method for producing deoxynucleoside from DNA simply by directly reacting a medium extract or culture solution of a microorganism belonging to Penicillium diastriborus ( Accession No. FERM P-18895) with DNA. .
[0022]
Examples of the method for culturing a microorganism belonging to Penicillium diastrivolus ( accession number FERM P-18895) include solid culture and liquid culture. When a solid medium is used, a medium extract is obtained by water extraction, hot water extraction, extraction with a surfactant, or the like. In the case of liquid culture, a culture solution can be obtained by centrifugation, filtration or the like. This culture medium extract or culture solution may be used as it is as an enzyme solution, or a concentrated and recovered UF membrane, ammonium sulfate precipitate, anion exchange resin or the like may be used as an enzyme solution. When the enzyme solution collected in this manner is allowed to act on DNA extracted from microorganisms, bovine thymus gland or seafood testis with acid, alkali, surfactant, protease, etc., deoxynucleosides are produced, and four kinds of them are produced by known techniques. By separating into deoxynucleosides, deoxynucleosides are obtained.
[0023]
The third invention to be patented is to react with DNA after heat-treating the medium extract or culture solution of cells belonging to Penicillium diastriborus ( Accession No. FERM P-18895) to inactivate phosphatase. A method for producing deoxynucleotides from DNA.
[0024]
The third invention is simply reacted directly to DNA Media extract or culture medium of a microorganism belonging to peptidyl Nishiriumu Zia string bolus (Accession No. FERM P-18995), a process for producing deoxynucleotides from DNA.
[0025]
In the present invention, similarly to the second invention, a microorganism belonging to Penicillium diastriborus ( Accession No. FERM P-18895) is subjected to solid culture or liquid culture. When solid culture is performed, water extraction, hot water extraction, Whereas a culture medium extract is obtained by extraction with a surfactant or the like, in the case of liquid culture, the culture solution can be obtained by centrifugation, filtration or the like. This medium extract or culture solution may be used as an enzyme solution as it is, but what is concentrated and recovered with a UF membrane, ammonium sulfate precipitation, an anion exchange resin or the like may be used as the enzyme solution. In the present invention, the phosphatase is inactivated by heat-treating the enzyme solution thus obtained at 60 to 80 ° C., and extracted from microorganisms, bovine thymus or seafood testis with acid, alkali, surfactant, protease, etc. When acting on DNA, deoxynucleotides are produced, and the deoxynucleotides are isolated and obtained by separating them into four types of deoxynucleotides by a known technique.
[0026]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail based on examples.
First, a method for culturing a microorganism ( accession number FERM P-18895) belonging to Penicillium geastriborus according to the present invention will be specifically described.
[0027]
Pre-culture: Inoculated with a platinum loop on a flat medium (pH 6.5) containing glucose, peptone, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, magnesium sulfate, calcium chloride, and 5 to 25 ° C. Incubate statically for 8 days.
[0028]
Solid culture: Inoculate bran medium (wheat bran: water (buffer) = 7: 4) in conical flasks with conidia formed on a plate medium. 10 g of bran medium is inoculated with 1 cm ^{2 of} plate medium. Incubate at 25 ° C for 5-8 days. This method is sufficient if the bran medium is 100 g or less, but if it is more than 100 g, about 15 g of bran culture is inoculated per 100 g.
[0029]
Liquid culture: 100 ml of a liquid medium (pH 6.5) containing glucose, peptone, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, magnesium sulfate and calcium chloride is placed in a 500 ml Sakaguchi flask and sterilized. The conidia formed on the flat medium are inoculated there (1 cm ² ). Incubate at 25 ° C. for 3-5 days. Instead of glucose in the same medium, 10% (w / v) wheat bran may be added.
[0030]
<Example 1> Production method of deoxynucleoside A microorganism belonging to Penicillium geastriborus was inoculated into 100 g of bran medium (brain: water = 7: 4) and cultured at 25 ° C for 6 days. 500 ml of enzyme solution was obtained from the medium by water extraction. 500 ml of the enzyme solution, 2 g of DNA extracted from the testis with acid and alkali, buffer (pH 4.5) and 0.3 mM zinc were mixed to make 2 liters, and heated at 50 ° C. for 3 hours. As a result, 0.7 g of deoxynucleoside was obtained.
[0031]
<Example 2> Production method of deoxynucleotide A microorganism (bacteria) belonging to Penicillium diastrivorus was inoculated into 100 g of bran medium (brain: water = 7: 4) and cultured at 25 ° C. for 6 days. . 500 ml of enzyme solution was obtained from the medium by water extraction. The final 1 mM zinc was added to the enzyme solution and heated at 65 ° C. for 1 hour. 500 ml of enzyme solution concentrated 4 times with UF membrane, 2 g of DNA extracted from testis with acid and alkali, buffer (pH 4.5), 0.3 mM zinc ion to make 2 liters, heated at 50 ° C. for 3 hours . As a result, 1.1 g of deoxynucleotide was obtained.

Claims

A cell belonging to Penicillium diastriborus ( Accession No. FERM P-18895) is cultured, and a novel DNA-degrading enzyme containing nuclease and phosphatase having physicochemical properties as shown in (1) and ( 2 ) below is cultured from the medium. And a method for producing a novel DNA-degrading enzyme, which is obtained by means such as extraction, concentration, recovery or purification.
(1) Physicochemical properties of nuclease in crude enzyme solution
* Optimal pH: 3.0 to 4.0 (measurement of enzyme activity at 37 ° C)
* PH stability: 80% or more of activity maintained at pH 6 to 7.5 (measurement of enzyme activity at pH 4 and 37 ° C after heating at 50 ° C for 30 minutes)
* Optimum temperature: 65-80 ° C (measurement of enzyme activity at pH 4)
* Temperature stability: 90% or more of activity at 60 ° C or less (enzyme activity measurement at pH 4, 37 ° C after 30 minutes of pH 7)
* Metal ion requirement: Zinc ion is essential
* Substrate specificity: RNA ( 13 )> single-stranded DNA (1)> double-stranded DNA (0.08) (activity ratios in parentheses)
* Product: Monodeoxynucleotide-5'-phosphate (due to 5'-phosphodiesterase activity)
* Molecular weight: about 44,400 (44.4k Da) (gel filtration (Sephacryl S200 )))
(2) Physicochemical properties of phosphatase in crude enzyme solution
* Optimal pH: 9 (measurement of enzyme activity at 37 ° C)
* PH stability: 80% or more of activity maintained at pH 7.5-8 (enzyme activity measurement at 37 ° C after heating for 30 minutes at 50 ° C)
* Optimal temperature: 40-55 ° C (measurement of enzyme activity at pH 9)
* Temperature stability: 90% or more of activity at 50 ° C or less (enzyme activity measurement at 37 ° C at pH 9, after 30 minutes warming at pH 7)
* Metal ion requirement: None in particular
* Substrate specificity: Monodeoxynucleotide-5'-phosphate, phosphate group of paranitrophenol is hydrolyzed

A method for producing a deoxynucleoside from DNA, which comprises reacting a medium extract and / or culture solution of a cell belonging to Penicillium diastriborus ( Accession No. FERM P-18895) with DNA.

Deoxynucleotide derived from DNA, characterized by heat-treating a medium extract or culture of a cell belonging to Penicillium diastrivolus ( accession number FERM P-18895) to inactivate phosphatase and then reacting with DNA How to manufacture.