JP4178514B2

JP4178514B2 - 抗体のスクリーニング方法

Info

Publication number: JP4178514B2
Application number: JP2003183869A
Authority: JP
Inventors: 基樹京; 和生梶谷
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2003-06-27
Filing date: 2003-06-27
Publication date: 2008-11-12
Anticipated expiration: 2023-06-27
Also published as: JP2005017154A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アフィニティの高い抗体、もしくは抗体の組み合わせを抗体のアレイを用い、表面プラズモン共鳴法によって選び出す方法に関する
【０００２】
【従来の技術】
モノクローナル抗体は極めて広範囲に用いられており、基礎研究から医薬品にまで応用されている。モノクローナル抗体は、抗原を免疫したマウスの脾細胞とミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマ細胞を作製し、その培養上清から精製することにより、一般的に得られている。ハイブリドーマ細胞の樹立に際して、アフィニティの高い優れた抗体を産生する株を選択するため、各々のクローンにより産生されるモノクローナル抗体をアッセイすることによりスクリーニングする必要がある。
【０００３】
従来の方法としてはＥＬＩＳＡ法が多く使われてきた。この手法はすでに確立されているが、操作は煩雑であり、抗体の濃度を変えて、多くのサンプル評価するとなると、測定数が極めて多くなり、非常に手間がかかっていた。
【０００４】
一方、金属基板表面に固定した抗体を用い、ラベル不要な分析技術である表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法、エリプソメトリ法によって抗原抗体反応を測定する方法は開示されており既知である（例えば、特許文献１および２参照）。しかし、これらの開示は、個々の抗原抗体反応に関してＳＰＲ法が用いられることを示しているのみであり、抗原に対してアフィニティの高い抗体をどのようにして効率良く選び出すかは示されていない。すなわち、本発明にあるような、抗原が同一である抗体を複数種類用意し、その抗体を金属基板上に固定化したアレイを使って抗体のスクリーニングを行った例は開示されていない。本発明は金属基板上に作製した抗体のアレイを用いて、抗体をスクリーニングする方法を開示する。
【０００５】
【特許文献１】
米国特許第５６２９２１３号明細書
【特許文献２】
国際公開第ＷＯ００／０４３８２号パンフレット
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、抗体を金属基板上に固定化したアレイを用い、ＳＰＲ法によってスクリーニングしてアフィニティの高い抗体を効率よく選び出すことにあり、この技術はモノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ株を樹立する際などに利用することが出来る。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出した。
１．抗原となる分子が同一である複数の抗体のアミノ基を、金薄層に覆われた平面ガラス基板上の官能基と反応させて該抗体を表面に固定化し、残存する該官能基にアミノ基末端ポリエチレングリコールを反応させブロッキング反応を行ったアレイを用い、
抗原を１μｇ／ｍｌから８μｇ／ｍｌまで濃度（Ｃ）を段階的に倍増させていき、各々の濃度における平衡時のシグナル（Ｒｅｑ）を表面プラズモン共鳴イメージング法によって測定し、
Ｒｅｑ／ＣとＣをプロット（スキャッチャ−ドプロット法）した直線の傾きから抗原抗体反応の結合平衡定数を算出し、
アフィニティの高い抗体を選び出すことを特徴とする抗体のスクリーニング方法。
２．抗体がモノクローナル抗体もしくは、複数のモノクローナル抗体の混合物であることを特徴とする１に記載の抗体のスクリーニング方法。
３．アミノ基末端ポリエチレングリコールが、分子量２，０００のアミノ基末端ポリエチレングリコールであることを特徴とする１又は２に記載の抗体のスクリーニング方法。
４．官能基がスクシンイミド基であり、アミンカップリング法により、抗体を表面に固定化することを特徴とする１〜３のいずれかに記載の抗体のスクリーニング方法。
５．金薄層に覆われた平面ガラス基板上に以下（ｉ）〜（ｉｖ）の方法によりスクシンイミド基を導入すること特徴とする４に記載の抗体のスクリーニング方法。
（ｉ）金薄層に覆われた平面ガラス基板上全体に、末端にチオール基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧチオール）を結合させる工程
（ｉｉ）フォトマスクを載せ、超高圧水銀ランプで照射し、照射された部分のＰＥＧチオールを除去する工程
（ｉｉｉ）照射部にカルボキシル基を導入する工程
（ｉｖ）カルボキシル基をスクシンイミドエステルとして活性化する工程
６．ＰＥＧチオールの末端がメトキシ基であることを特徴とする５に記載の抗体のスクリーニング方法。
７．ＰＥＧチオールの分子量が５，０００であることを特徴とする請求項５又は６に記載の抗体のスクリーニング方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、複数の抗体を同一金属基板上に固定化したアレイを用いて抗体のスクリーニングを行う方法を開示している。
【０００９】
本発明において、スクリーニングの対象となる抗体は複数であり、抗原となる分子は同一である。ただし、エピトープは単一とも同一とも限定されない。すなわち、抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、エピトープの異なるモノクローナル抗体の組み合わせであってもよい。組み合わせ／配合率が異なる場合も、アフィニティが異なるため、異なる抗体として扱う。複数の抗体は一つの金属基板に固定化され、アレイが形成される。
【００１０】
スクリーニングの際の測定には、抗原を含んだ溶液が基板上に曝露され、抗原抗体反応によって、抗原がトラップされ、このトラップされた状態を観察する。
表面に抗原が吸着するのを観察する手段としてはＳＰＲ法が好ましい。ＳＰＲはラベルフリーの相互作用解析方法であり、抗原を蛍光物質や放射線同位体でラベルする必要がないため好ましい。また、リアルタイムでＳＰＲシグナルを観察できるため、相互作用が飽和するまで抗原を含む溶液をセンサー表面に流し続けることができる。また、半定量的な検出方法であるため、シグナルの変化が吸着した量に対応するため、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ解析が可能であり好ましい。
Ｋｉｎｅｔｉｃｓ解析によって抗原抗体反応の平衡定数が得られ、アフィニティの高い抗体を選ぶことが可能となる。
【００１１】
一度に行えるスクリーニングの件数は、ＳＰＲで観察できる数、すなわちアレイのスポット数が上限である。アレイのスポット数としては、好ましくは６個以上、より好ましくは１２個以上、さらに好ましくは２０個以上である。また、スポット数の上限としては観察が行える限り限定はされないが、概ね１００００個である。
これらのアレイに複数種、好ましくは４種以上、さらに好ましくは６種以上のの抗体をスポットする。スポットは抗体１種に対して１箇所でも良いし、複数箇所にスポットしてデータのｎ数を増やすことも好ましい。
【００１２】
金属基板の金属としては金が好ましい。金はＳＰＲによる観察が可能であることと、金−硫黄結合によって、表面に官能基を導入するのが容易であるからである。金属基板としては金薄層にコーティングされた平面ガラス基板であることが好ましい。ガラスはさまざまな屈折率を有するものが揃っており、切り出すことで容易にスライドを得ることができるため好ましい。また、平面基板である方が成形は容易かつアレイ作製が容易であり好ましい。
【００１３】
ＳＰＲ法としては、広範囲にＳＰＲシグナル変化を観察することのできるＳＰＲイメージング法が好ましい。ＳＰＲイメージング法は偏光とした光束が金属薄層をコーティングしたガラス基板に照射され、その反射像を波長フィルターで通した上で、ＣＣＤカメラ等で撮影する方法である。
【００１４】
こうして抗原抗体反応が観察され、そのＫｉｎｅｔｉｃｓ値はＳＰＲシグナル変化から解析される。アフィニティの低い相互作用の場合、相互作用させた後に、緩衝液を流すことで解離が観察され、解離の速度から解離速度定数が算出できる。しかし、抗原抗体反応の場合、アフィニティが高く、解離を解析するのは困難である。そこで、平衡定数はスキャッチャードプロット法によって計算されるのが好ましい。この方法においては、濃度（Ｃ）を段階的に上昇させていき、その濃度におけるシグナルの平衡値Ｒｅｑを求める。Ｒｅｑ／ＣとＲｅｑとプロットし、その傾きから平衡定数が求まる。
【００１５】
抗体を固定化する手段としては、さまざまな手段が挙げられる。表面のカルボキシル基を水溶性カルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドによって活性化し、抗体中のアミノ基と反応させるアミノカップリング法が容易であり、好ましい。また、抗体をペプシン消化によってＦ（ａｂ’）₂とし、還元することでＦａｂ’として、チオールカップリングにより、表面に形成したマレイミド基、ジスルフィド基と反応させることができる。また、抗体に含まれる糖鎖を用いて、固定化する手段も考えられる。
【実施例】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００１６】
［実施例］
末端にチオール基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧチオール：日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴＭＥＳＨ−５０Ｈ）を1ｍＭの濃度で７ｍｌのエタノール：水＝６：１の混合溶液に溶解させた。ＰＥＧチオールの分子量は５，０００であり、親水性が非常に高い。また、ＰＥＧの末端はメトキシ基であり、反応性をほとんど有さない。
【００１７】
１８ｍｍ四方、１ｍｍ厚のＬａｋ１０ガラススライドにクロムを３ｎｍ蒸着し、金を４５ｎｍ蒸着した金蒸着スライドを、上記ＰＥＧチオール溶液に３時間浸漬させ、金基板全体にＰＥＧチオールを結合させた。
【００１８】
スライドをミリＱ水とエタノールで洗浄し、空気噴霧により乾燥させたのち、このスライドの上に図１に示すフォトマスクを載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプ（ウシオ電機製）で２時間照射し、照射された部分のＰＥＧチオールを除去した。フォトマスクのパターンは５００μｍ×５００μｍの四角形が９６個並んだものである。
【００１９】
ミリＱ水とエタノールで洗浄したのち、７−カルボキシル−１−ヘプタンチオール（７−ＣＨＴ：同仁化学研究所）の１ｍＭ溶液中にスライドを１時間浸漬し、紫外線照射部にカルボキシル基を導入した。
【００２０】
３００μＬの０．２Ｍ１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（水溶性カルボジイミド）／０．０５ＭＮ−ヒドロキシスクシンイミドＰＢＳ(−)溶液をスライドの上に滴下して一時間反応させ、ＣＯＯＨ基をスクシンイミドエステルとして活性化した。
【００２１】
スライドを水洗後、空気噴霧により乾燥させ、自動スポッターに装着した。１３種類の抗ヤギＩｇＧモノクローナル抗体を１００μｇ／ｍｌの濃度に調整し（ＰＢＳ（−））、１０μｌを９６穴プレートのＡ１〜１２、Ｂ１のウェルに用意した。自動スポッターの内部湿度を８１±２％、温度２５℃に保ち、ｎ＝４でスポッティングを行った。湿度はアズワン社ＮＴ−１８００デジタル温湿度計をチップ置場横に置いて測定した。
【００２２】
スポッティングのパターンを図２に示す。このように、９６穴プレートに入れたサンプルの入れ方を反映した形でスポッティングを行った。Ｂ２〜１２のウェルにはモノクローナル抗体サンプルは入っていないため、ブランクのスポットとなる。
【００２３】
スポッティングに用いたピンの先端の図を図３に示す。ピンの直径は４８７μｍであり、２００μｍの幅の溝が入っている。従って、面積は０．０９ｍｍ²である。また、ピンが取り付けられたヘッド部分の内部構造の概略図を図４に示す。ピンはガイドを通して内部のピン固定治具に取り付けられており、ピン固定治具は上下方向に移動可能となっている。ピン固定治具の上には緩衝材として軟質ウレタンフォームが設けられ、ピンが基板に押し付けられた時には、ピンが上方に移動し、緩衝材が圧縮され、衝撃を緩和すると共にピンに適度な応力を与える。
【００２４】
スポッティングは自動的に行われる。図５に使用した自動スポッターの内部の配置の概略を示す。ピンは９６穴プレートに浸漬され、ウェル内のサンプルを保持し、スライド上へと移動し、スポッティングを行う。実施例の場合はｎ＝４であるため、９６穴プレートとスライドの間を３回往復する。４回目のスポッティングが終わった段階でピンは洗浄浴へと移動し、ミリＱ水で２回洗浄される。洗浄後にドライヤー内にて上下運動が３０ｍｍの振り幅で３回行われ、ピンが乾燥される。次のウェルにてサンプルと採取し、同様の動作は付属したコンピュータで制御されて自動的に行われる。
湿度の調整は超音波により発生した霧をスポッター内に吹き込む方式とし、内部湿度はチップ置き場周辺での湿度を測定し、このデータを元に超音波のＯＮ／ＯＦＦを切り替えて調整した。
【００２５】
スポッティング終了後、スポッターからスライドを取り出し、直ちに加湿チャンバー内にスライドを移し、２時間保持してスライド上の官能基と抗体のアミノ基を反応させ、抗体を表面に固定化した。加湿チャンバーは、容器の底部に水を張り、中段にスライドを置ける構造となったものであり、密閉が可能であるため、長時間乾燥させることなく反応の進行を続けることが出来る。内部の湿度はほば１００％である。
反応終了後のチップをミリＱ水で数回洗浄した上で、空気噴霧により水を取り除き、分子量２，０００のアミノ基末端ポリエチレングリコール水溶液を２ｍｇ／ｍｌの濃度でｐＨ８．５に調製し、３００μｌをスライド上に注ぎ、残存するスクシンイミド基にポリエチレングリコールを反応させ、ブロッキング反応を行った。表面固定化の反応スキームを図５に示す。
【００２６】
抗体を固定化したスライドを３回水洗した後、空気噴霧により乾燥させ、ＳＰＲイメージング装置（東洋紡績製）にセットした。緩衝液としてＰＢＳ（−）を２５０μｌ／ｍｌの流速で３０分通液し、１００μｌ／ｍｌの流速で３０分通液して安定化させた。その際のＳＰＲイメージング像を図７に示す。白くなっているスポット部分には抗体が固定化されており、その他の部分には固定化されていない。ピンが接触してサンプル液がスポットされた部分には全く傷は見当たらなかった。
【００２７】
次に抗原であるヤギＩｇＧを１μｇ／ｍｌから８μｇ／ｍｌまで濃度（Ｃ）を段階的に倍増させて流し、各々の濃度における平衡時のシグナル（Ｒｅｑ）を得た。この際のＳＰＲシグナルの変化を図８に示す。
【００２８】
Ｒｅｑ／ＣとＣをプロットした(スキャッチャードプロット)結果を図９に示す。いずれもほぼ直線関係が得られている。図９の直線の傾きから結合平衡定数を算出し、表１に示す。ただし、シグナルが低いために相関係数が０．８未満となったデータは省いている。
このように金属基板上に抗体を固定化し、アフィニティの高い抗体を選び出すことができた。
【００２９】
【表１】

【００３０】
【発明の効果】
本発明により、簡便に抗体をスクリーニングして、アフィニティの高い抗体を選択することが可能である。同一の抗原に対する複数の抗体は金属基板上に固定されてアレイが作製され、表面プラズモン共鳴法によってラベルフリーに抗原への結合挙動が観察され、平衡定数が容易に得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例に使用したフォトマスクパターン。黒色部分にクロムがコーティングされ光を遮断する。
【図２】実施例１で使用したスポッティングのパターン。上図がスライド上を表し、下図が９６穴プレートを示す。９６穴プレートのＡ１〜Ｂ１２のウェル内のサンプルを、上図のパターンでスポットした。実施例１ではＢ２〜１２はブランクとした。
【図３】実施例で使用したピンの先端の概略図
【図４】実施例で使用したピンの取り付けヘッド内部の概略図
【図５】実施例の自動スポッターの内部構造概略
【図６】実施例でのスライド上の反応スキーム
【図７】実施例での抗体を固定化したスライドのＳＰＲイメージング像
【図８】実施例での抗原の濃度を段階的に増加させた場合のＳＰＲシグナル変化
【図９】図８のデータから作成したスキャッチャードプロット

Claims

抗原となる分子が同一である複数の抗体のアミノ基を、金薄層に覆われた平面ガラス基板上の官能基と反応させて該抗体を表面に固定化し、残存する該官能基にアミノ基末端ポリエチレングリコールを反応させブロッキング反応を行ったアレイを用い、
抗原を１μｇ／ｍｌから８μｇ／ｍｌまで濃度（Ｃ）を段階的に倍増させていき、各々の濃度における平衡時のシグナル（Ｒｅｑ）を表面プラズモン共鳴イメージング法によって測定し、
Ｒｅｑ／ＣとＣをプロット（スキャッチャ−ドプロット法）した直線の傾きから抗原抗体反応の結合平衡定数を算出し、
アフィニティの高い抗体を選び出すことを特徴とする抗体のスクリーニング方法。
抗体がモノクローナル抗体もしくは、複数のモノクローナル抗体の混合物であることを特徴とする請求項１に記載の抗体のスクリーニング方法。
アミノ基末端ポリエチレングリコールが、分子量２，０００のアミノ基末端ポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項１又は２に記載の抗体のスクリーニング方法。
官能基がスクシンイミド基であり、アミンカップリング法により、抗体を表面に固定化することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の抗体のスクリーニング方法。
金薄層に覆われた平面ガラス基板上に以下（ｉ）〜（ｉｖ）の方法によりスクシンイミド基を導入すること特徴とする請求項４に記載の抗体のスクリーニング方法。
（ｉ）金薄層に覆われた平面ガラス基板上全体に、末端にチオール基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧチオール）を結合させる工程
（ｉｉ）フォトマスクを載せ、超高圧水銀ランプで照射し、照射された部分のＰＥＧチオールを除去する工程
（ｉｉｉ）照射部にカルボキシル基を導入する工程
（ｉｖ）カルボキシル基をスクシンイミドエステルとして活性化する工程
ＰＥＧチオールの末端がメトキシ基であることを特徴とする請求項５に記載の抗体のスクリーニング方法。
ＰＥＧチオールの分子量が５，０００であることを特徴とする請求項５又は６に記載の抗体のスクリーニング方法。